CN115279795A - 靶向抗cd19嵌合抗原受体的抗独特型抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了一种能够与抗CD19抗体FMC63的单链可变片段(scFv)结合的高亲和力抗体，该单链可变片段是例如作为嵌合抗原受体(CAR)的一部分在细胞表面表达的scFv。本文还提供了用于产生这样的抗scFv抗体的方法和使用本文披露的抗体检测例如表达抗CD19CAR的T细胞的方法，该抗CD19CAR包含该scFv作为细胞外结构域。

Description

靶向抗CD19嵌合抗原受体的抗独特型抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年2月11日提交的美国临时申请号62/972,750的提交日期的权益，其全部内容通过援引并入本文。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法已经在癌症治疗中显示出有前景的治疗效果。典型地，CAR-T细胞通过患者免疫细胞(自体)或来自人类供体的免疫细胞(同种异体)的基因工程而产生。高质量、临床级CAR-T细胞的制备是该技术广泛应用的先决条件。因此，非常感兴趣的是开发用于检测表达CAR的T细胞。
发明内容
本披露内容至少部分基于对小鼠抗人CD19抗体FMC63(SEQ ID NO:1)的单链可变片段(scFv)，特别是对在细胞表面表达的scFv具有高结合亲和力和特异性的抗体29E4B5的开发。例如，本文披露的抗体29E4B5(又名29E4B5-1)对表达抗CD19嵌合受体(抗CD19 CAR)的T细胞展示出高结合亲和力和特异性，该抗CD19嵌合受体具有SEQ ID NO:1的scFv作为细胞外结构域。与能够结合相同抗CD19 CAR T细胞的参考抗体(rec_mab3)相比，抗体29E4B5对抗CD19 CAR T细胞也展示出优异的结合亲和力。
因此，在一些方面，本披露内容提供了一种分离的抗体，该分离的抗体结合由SEQID NO:1的氨基酸序列组成的单链可变片段(scFv)(抗scFv抗体)。在一些情况下，抗scFv抗体与抗体29E4B5结合scFv的相同表位或与抗体29E4B5竞争结合scFv。在一些实施例中，分离的抗体与在细胞表面表达的scFv(例如，作为嵌合抗原受体的细胞外结构域)结合。
在一些实施例中，分离的抗体包含与示例性抗体29E4B5相同的重链互补决定区和相同的轻链互补决定区。例如，分离的抗体可以包含与抗体29E4B5相同的VH和相同的VL。
本文披露的任何抗scFv抗体可以是全长抗体。可替代地，抗scFv抗体可以是抗原结合片段。
另外，本披露内容的特征在于核酸或核酸组(两个单独的核酸分子)，该核酸或核酸组共同编码本文所述的任何抗scFv抗体。在一些实施例中，核酸或核酸组是载体或载体组，例如一种或多种表达载体。
本文还提供了包含编码本文披露的任何抗scFv抗体的核酸或核酸组的宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞。
在其他方面，本披露内容的特征在于一种用于检测或定量由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的单链可变片段(scFv)的方法。这样的方法可包括：(i)使如本文披露的抗scFv抗体(例如，具有与示例性抗体29E4B5相同的重链和轻链CDR或相同的VH和VL链的抗体)与怀疑含有SEQ ID NO:1的scFv的样品接触，以及(ii)检测该抗体与该scFv的结合。在一些实施例中，scFv是在细胞表面表达的抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的细胞外结构域。在一些实施例中，抗scFv抗体可以缀合至可检测标记。
在一些实施例中，样品可包含多个T细胞，这些T细胞被基因工程化以表达包含SEQID NO:1的scFv作为细胞外结构域的抗CD19 CAR。在一些实施例中，多个T细胞可以进一步包含被破坏的TRAC基因、被破坏的β2M基因或者两者。在一些实例中，多个T细胞由获得自一个或多个供体的T细胞制备。
在一些情况下，样品衍生自用于生产多个T细胞的制造工艺，这些T细胞被基因工程化以表达抗CD19 CAR。
在一些实例中，样品是从施用多个T细胞的受试者获得的生物样品，这些T细胞被基因工程化以表达抗CD19 CAR。在一些实施例中，样品是血液样品。受试者可以是人类癌症患者，例如患有复发性或难治性B细胞恶性肿瘤的人类癌症患者。示例性B细胞恶性肿瘤包括但不限于非霍奇金淋巴瘤或B细胞淋巴瘤。
此外，本披露内容提供了产生本文披露的任何抗scFv抗体的方法。该方法可以包括：(i)在允许与scFv结合的抗体表达的条件下培养本文所述的包含编码抗scFv抗体的一种或多种核酸的任何宿主细胞；以及(ii)收获由此从细胞培养物中产生的抗体。在一些实施例中，该方法可以进一步包括(iii)在步骤(ii)之后纯化抗体。
本发明的一个或多个实施例的细节在以下说明书中阐述。根据以下附图和对若干实施例的详细描述，并且还根据所附权利要求，本发明的其他特征或优点将变得清楚。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步证明本披露内容的某些方面，该某些方面通过参考附图并结合本文给出的具体实施例的详细描述可以更好地被理解。
图1A-1B是显示通过SDS-PAGE(图1A)和蛋白质印迹分析(图1B)分析的重组FMC63-ScFv蛋白的照片。泳道M1：蛋白标志物(宝生物工程美国公司(Takara Bio USA)，加利福尼亚州山景城市，目录号3452)。泳道M2：蛋白标志物(金斯瑞生物科技公司(GenScriptBiotech)，皮斯卡塔韦市，新泽西州，目录号M00521)。泳道1：还原条件。泳道2：非还原条件。泳道P：人IgG1，κ(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州，目录号I5154)作为阳性对照。一抗：小鼠抗His mAb(金斯瑞生物科技公司，皮斯卡塔韦市，新泽西州，目录号A00186)。
图2是显示抗体克隆29E4B5与抗CD19 CAR T细胞(表达含有抗FMC63-scFv的CAR的CAR T细胞)而不是抗BCMA CAR T细胞或抗CD70 CAR T细胞特异性结合的图。
具体实施方式
本文提供了能够与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的单链可变片段(scFv)结合的抗体(衍生自小鼠抗人CD19抗体FMC63)，例如能够与作为抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的细胞外结构域的、在细胞表面表达的scFv结合的抗体。因此，本文披露的抗体可用于检测样品(例如，从用于生产抗CD19 CAR-T细胞的制造工艺中获得的样品或从施用抗CD19 CAR-T细胞的患者获得的样品)中是否存在表达这样的抗CD19 CAR的细胞(例如，T细胞)。
I.与抗CD19单链可变片段(scFv)结合的抗体
本披露内容提供了与具有SEQ ID NO:1(下文提供)的氨基酸序列的单链可变片段(scFv)结合的抗体(例如，抗体29E4B5)，这些抗体包含衍生自小鼠抗人CD19抗体FMC63的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。因此，本文提供的抗体可称为抗scFv抗体或抗独特型(抗ID)抗体。在一些实施例中，本文披露的抗体能够与在细胞表面表达的scFv结合。在特定实例中，本文披露的抗体与细胞表面表达的抗CD19嵌合抗原受体(CAR)结合，该受体包含SEQ ID NO:1的scFv作为细胞外结构域。接头片段以黑体表示。
scFv抗原的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
Figure BDA0003835563190000041
抗体(以多种形式可互换使用)是一种免疫球蛋白分子，能够通过位于免疫球蛋白分子可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合至靶标，例如本申请中SEQ ID NO:1的scFv。如本文所用，术语“抗体”不仅涵盖完整的(例如，全长)多克隆或单克隆抗体，还涵盖其抗原结合片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链抗体(scFv)、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、单结构域抗体(例如，纳米抗体)、单结构域抗体(例如，仅VH抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和包含具有所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰的构型(包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体)。如本文披露的抗体包括任何类别的抗体，如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不必是任何特定类别。根据免疫球蛋白重链的恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。免疫球蛋白有五个主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单元结构和三维构型是熟知的。
典型的抗体分子包含通常与抗原结合有关的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。VH和VL可以进一步细分为超变区(也称为“互补决定区”(“CDR”))，穿插更保守区(称为“框架区”(“FR”))。每个VH和VL典型地由三个CDR及四个FR构成，其自氨基末端至羧基末端按下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可以使用本领域已知的方法，例如，通过Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和/或接触定义(所有这些在本领域中是熟知的)来精确地鉴定框架区和CDR的程度。参见，例如，Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest[有免疫学意义的蛋白质序列],第五版,美国卫生与人类服务部,NIH出版物号91-3242，Chothia等人,(1989)Nature[自然]342:877；Chothia,C.等人(1987)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917，Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]273:927-948；以及Almagro,J.Mol.Recognit.[分子识别杂志]17:132-143(2004)。还参见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs。
本文所述的抗scFv抗体可以是全长抗体，该全长抗体含有两条重链和两条轻链，每条链包括可变结构域和恒定结构域。可替代地，本文所述的抗scFv抗体可以是全长抗体的抗原结合片段。术语全长抗体的“抗原结合片段”内所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包括由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature[自然]341:544-546)；以及(vi)保留了功能性的分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过能够使它们形成为单条蛋白链的合成接头来相连，其中VL区和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)。参见例如,Bird等人(1988)Science[科学]242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883。
本文所述的抗scFv抗体可以具有合适的来源，例如鼠、大鼠或人。这样的抗体是非天然存在的，即在没有人类行为(例如，用所希望的抗原或其片段免疫这样的动物或从抗体文库中分离)的情况下不会在动物中产生。本文所述的任何抗scFv抗体，例如抗体29E4B5，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。“单克隆抗体”是指同源抗体群，并且“多克隆抗体”是指异源抗体群。这两个术语不限制抗体的来源或其制备方式。
在一些实施例中，本文所述的抗scFv抗体是人抗体，其可以从人抗体文库中分离或在转基因小鼠中产生。例如，完全人抗体可以通过使用已被工程化以表达特定人免疫球蛋白的市售小鼠获得。被设计为产生更理想的(例如，完全人抗体)或更强的免疫反应的转基因动物也可用于产生人源化抗体或人抗体。这样的技术的实例是来自美商安进公司(Amgen,Inc.)(费利蒙市，加利福尼亚州)的XenomouseTM以及来自梅达瑞克斯公司(Medarex,Inc.)(普林斯顿，新泽西州)的HuMAb-MouseTM和TC MouseTM。在另一个可替代实施例中，可以通过噬菌体展示或酵母技术重组制备抗体。参见例如，美国专利号5,565,332；5,580,717；5,733,743；和6,265,150；以及Winter等人,(1994)Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度综述]12:433-455。可替代地，抗体文库展示技术，例如，如本领域已知的噬菌体、酵母展示、哺乳动物细胞展示或mRNA展示技术可用于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库在体外产生人抗体和抗体片段。
在其他实施例中，本文所述的抗scFv抗体可以是人源化抗体或嵌合抗体。人源化抗体是指非人类(例如，鼠)抗体的形式，其是特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其抗原结合片段(这些片段含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列)。总体而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体CDR的残基被来自非人类物种如小鼠、大鼠或兔(供体抗体)的具有所希望的特异性、亲和力和能力的CDR残基替换。在一些情况下，一个或多个人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含如下残基，这些残基在受体抗体或导入的CDR或框架序列中均未发现，但被包括在内以进一步完善和优化抗体性能。在一些情况下，人源化抗体可包含至少一个、并且典型地两个可变结构域中的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR区相应于非人免疫球蛋白的那些区，并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些区。人源化抗体还最佳包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。抗体可以具有如WO 99/58572中所述经修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，也称为一个或多个CDR“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDR。人源化抗体也可涉及亲和力成熟。用于构建人源化抗体的方法也是本领域熟知的。参见，例如，Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:10029-10033(1989)。
在一些实施例中，本文所述的抗scFv抗体可以是嵌合抗体。嵌合抗体是指具有来自第一物种的可变区或可变区的一部分以及来自第二物种的恒定区的抗体。典型地，在这些嵌合抗体中，轻链和重链的可变区都模拟衍生自一个哺乳动物物种(例如，非人类哺乳动物(诸如小鼠、兔和大鼠))的抗体的可变区，而恒定部分与衍生自另一种哺乳动物(诸如人类)的抗体中的序列同源。在一些实施例中，可以在可变区和/或恒定区中进行氨基酸修饰。为产生“嵌合抗体”而开发的技术是本领域熟知的。参见，例如，Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81,6851；Neuberger等人(1984)Nature[自然]312,604；以及Takeda等人(1984)Nature[自然]314:452。
在一些实施例中，本文所述的抗scFv抗体与相应的靶抗原(即，SEQ ID NO:1的抗CD19 scFv或多肽，例如包含其的嵌合抗原受体)或其表位特异性结合。与抗原或表位“特异性结合”的抗体是本领域熟知的术语。如果分子与特定靶抗原的反应比与其他靶标的反应更频繁、更迅速、更持久、更具有亲合力和/或更具有亲和力，则该分子表现出“特异性结合”。如果抗体比结合其他物质更具有亲和力、更具有亲合力、更容易和/或更持久地结合靶抗原或表位，则该抗体“特异性结合”该靶抗原或表位。例如，与抗原或其中的抗原表位特异性(或优先)结合的抗体是以下抗体，相对于与其他抗原或相同抗原中的其他表位的结合，该抗体更具有亲和力、更具有亲合力、更容易和/或更持久地结合该靶抗原。通过该定义还应理解，例如，特异性结合第一靶抗原的抗体可以特异性结合或优先结合第二靶抗原，或可以不特异性结合或优先结合第二靶抗原。因此，“特异性结合”或“优先结合”并不一定要求(尽管可以包括)排他性结合。在一些实例中，与靶抗原或其表位“特异性结合”的抗体可能不与其他抗原或相同抗原中的其他表位结合(即，在常规方法中只能检测到基线结合活性)。
在一些实施例中，本文所述的抗scFv抗体(例如，抗体29E4B5)对靶抗原(即，SEQID NO:1的抗CD19 scFv或多肽，例如包含其的嵌合抗原受体)或其抗原表位具有合适的结合亲和力。如本文所用，“结合亲和力”是指表观缔合常数或KA。KA是解离常数(KD)的倒数。本文所述的抗体对来自抗体FMC63的scFv可以具有至少100mM、10mM、1mM、0.1mM、100μM、10μM、1μM、0.1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM或更低的结合亲和力(KD)。增加的结合亲和力对应于减少的KD。相对于第二抗原，抗体对第一抗原的更高亲和力结合可以通过与结合第二抗原的KA(或数值KD)相比更高的结合第一抗原的KA(或更小的数值KD)来指示。在这样的情况下，相对于第二抗原(例如，第二构象的相同第一蛋白质或其模拟物；或第二蛋白质)，抗体对第一抗原(例如，第一构象的第一蛋白质或其模拟物)具有特异性。结合亲和力的差异(例如，对于特异性或其他比较)可以是至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、90、100、500、1000、10,000或105倍。在一些实施例中，本文披露的任何抗体可以进一步亲和力成熟以增加抗体与靶抗原或其抗原表位的结合亲和力。
结合亲和力(或结合特异性)可以通过多种方法确定，这些方法包括平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子体共振或光谱学(例如，使用荧光测定法)。用于评估结合亲和力的示例性条件是在HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，0.005％(v/v)表面活性剂P20)中。这些技术可用于测量结合蛋白的结合浓度作为靶蛋白浓度的函数。结合蛋白的结合浓度([结合])通常与游离靶蛋白的浓度([游离])相关，公式如下：
[结合]＝[游离]/(Kd+[游离])
并不总是需要准确测定KA，因为有时获得与KA成正比的亲和力的定量测量(例如，使用如ELISA或FACS分析的方法确定)就足够了。因此，定量测量可用于比较，例如确定更高的亲和力是否例如高2倍，以便获得亲和力的定性测量，或获得亲和力的推断，例如通过功能测定(例如体外或体内测定)中的活性。
下文提供了示例性抗体29E4B5的结构信息(重链和轻链可变结构域)。重链CDR和轻链CDR(由Kabat方法确定；参见，例如，Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest[有免疫学意义的蛋白质序列],第五版,美国卫生与人类服务部,NIH出版物号91-3242，imgt.org/IMGTindex/V-QUEST.php和ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)以黑体标识。还参见以下表7。
表1.抗scFv抗体29E4B5的VH和VL序列。
Figure BDA0003835563190000081
Figure BDA0003835563190000091
在一些实施例中，本文所述的抗scFv抗体与示例性抗体29E4B5结合SEQ ID NO:1中相同的表位或与示例性抗体竞争结合scFv抗原(SEQ ID NO:1)。如本文所用，“表位”是指靶抗原上被抗体识别和结合的位点。该位点可以完全由氨基酸组分组成，完全由蛋白质的氨基酸的化学修饰(例如，糖基部分)组成，或由其组合组成。重叠表位包括至少一个共同氨基酸残基。表位可以是线性的，其长度典型地为6-15个氨基酸。可替代地，表位可以是构象的。抗体结合的表位可以通过常规技术确定，例如，表位作图方法(参见，例如，以下描述)。与本文所述的示例性抗体结合相同表位的抗体可以与示例性抗体结合完全相同的表位或基本上重叠的表位(例如，含有少于3个非重叠氨基酸残基、少于2个非重叠氨基酸残基，或仅1个非重叠氨基酸残基)。两种抗体是否相互竞争结合同源抗原可以通过竞争测定来确定，这是本领域所熟知的。
在一些实例中，本文披露的抗scFv抗体包含与示例性抗体29E4B5相同的VH和/或VLCDR。具有相同VH和/或VL CDR的两种抗体意指当通过相同的方法(例如，本领域已知的Kabat方法、Chothia方法、AbM方法、Contact方法或IMGT方法)确定时，它们的CDR是相同的。参见，例如，bioinf.org.uk/abs/。与本文所述的示例性抗体相比，这样的抗体可具有相同的VH、相同的VL或者两者。通过所述的各种方法确定的示例性抗体29E4B5的重链和轻链CDR在下表7中提供。
同样在本披露内容的范围内的是示例性抗体29E4B5的功能性变体。这样的功能性变体在结构和功能上与示例性抗体基本上相似。功能性变体包含与示例性抗体基本上相同的VH和VL CDR。例如，它在抗体的总CDR区中可仅包含多达8个(例如8、7、6、5、4、3、2或1个)氨基酸残基变异，并且以基本上相似的亲和力(例如，具有相同阶的KD值)结合SEQ ID NO:1中的相同表位。在一些情况下，功能性变体可以具有与示例性抗体相同的重链CDR3，并且任选地具有与示例性抗体相同的轻链CDR3。可替代地或另外，功能性变体可以具有与示例性抗体相同的重链CDR2。与示例性抗体的VH相比，这样的抗体可以包含仅在重链CDR1中具有CDR氨基酸残基变异的VH片段。在一些实例中，抗体可以进一步包含具有与示例性抗体相同的VLCDR3和任选地相同的VL CDR1或VL CDR2的VL片段。
在一些情况下，氨基酸残基变异(例如，在抗体29E4B5的重链和轻链CDR中的一个或多个中)可以是保守氨基酸残基取代。如本文所用，“保守氨基酸取代”是指不改变进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸取代。可以根据本领域的普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备变体，这些方法是例如在编译这样的方法的以下参考文献中可以找到：例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],J.Sambrook等人编辑,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor[冷泉港实验室出版社,冷泉港],纽约,1989，或Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学的当前方案],F.M.Ausubel等人编辑,John Wiley&Sons,Inc.[约翰威利父子出版社],纽约。氨基酸的保守取代包括在以下组内的氨基酸之间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。
在一些实施例中，本文披露的抗scFv抗体可以包含与示例性抗体29E4B5的VH CDR相比单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)同一性的重链CDR。可替代地或另外，本文披露的抗scFv抗体可以包含与示例性抗体29E4B5的VL CDR相比单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)同一性的轻链CDR。如本文所用，“单独”意指抗体的一个CDR享有相对于示例性抗体的相应CDR的指定序列同一性。“共同”意指抗体的三个VH或VL CDR组合享有相对于示例性抗体的相应三个VH或VL CDR组合的指定序列同一性。
用Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87:2264-68,1990的算法，如Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-77,1993中所修改，确定两个氨基酸序列的“百分比同一性”。这样的算法被并入Altschul等人.J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用XBLAST程序(分值＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白检索，以获得与目的蛋白分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在缺口的情况下，可以如Altschul等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25(17):3389-3402,1997中所述利用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在一些实施例中，如本文所述的任何抗scFv抗体的重链可以进一步包含重链恒定区(CH)或其一部分(例如，CH1、CH2、CH3或其组合)。重链恒定区可以是任何合适的来源，例如，人、小鼠、大鼠或兔。可替代地或另外，抗体的轻链可以进一步包含轻链恒定区(CL)，其可为本领域已知的任何CL。在一些实例中，CL是κ轻链。在其他实例中，CL是λ轻链。本领域熟知抗体重链和轻链恒定区，例如，IMGT数据库(www.imgt.org)或www.vbase2.org/vbstat.php.中提供的那些，两者均通过援引并入本文。
II.抗单链可变片段(scFv)抗体的制备
本文所述的抗scFv抗体(例如，抗体29E4B5)可以通过本领域已知的任何方法制备。参见例如，Harlow和Lane,(1998)Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],纽约。
在一些实施例中，抗scFv抗体可以通过常规杂交瘤技术产生。任选地与载体蛋白如KLH偶联的SEQ ID NO:1的全长抗CD19 scFv抗原或其片段可用于免疫宿主动物以产生与该抗原结合的抗体。如本文进一步描述的，宿主动物的免疫途径和时间表通常与用于抗体刺激和产生的已建立的和常规技术一致。用于产生小鼠、人源化和人抗体的通用技术是本领域已知的并且在本文中进行了描述。预期任何哺乳动物受试者(包括人)或来自其的产生抗体的细胞都可以被操纵以作为产生哺乳动物(包括人)杂交瘤细胞系的基础。典型地，宿主动物腹膜内、肌内、口服、皮下、足底内和/或皮内接种一定量的免疫原，包括如本文所述的免疫原。
使用Kohler,B.和Milstein,C.(1975)Nature[自然]256:495-497或如通过Buck,D.W.等人,In Vitro[体外],18:377-381(1982)所修改的通用体细胞杂交技术，可以从淋巴细胞和永生化骨髓瘤细胞中制备杂交瘤。可用的骨髓瘤系，包括但不限于X63-Ag8.653和来自美国加利福尼亚州圣地亚哥的细胞分布中心(Cell Distribution Center)索尔克研究所(Salk Institute)的那些，可用于杂交。一般地说，该技术涉及使用融合剂如聚乙二醇或通过本领域技术人员熟知的电学手段融合骨髓瘤细胞和淋巴样细胞。融合后，将细胞从融合培养基中分离并在选择性生长培养基(例如次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)培养基)中生长，以消除未杂交的亲本细胞。本文所述的任何培养基(补充或不补充血清)均可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一个可替代实施例，EBV永生化B细胞可用于产生本发明的抗scFv单克隆抗体。如果需要，将杂交瘤进行扩增和亚克隆，并通过常规免疫测定程序(例如，放射免疫测定、酶免疫测定或荧光免疫测定)测定上清液的抗免疫原活性。
可用作抗体来源的杂交瘤涵盖产生能够与SEQ ID NO:1结合的单克隆抗体的亲本杂交瘤的所有衍生物、子代细胞。可以使用已知程序使产生这样的抗体的杂交瘤在体外或体内生长。如果需要，可以通过常规免疫球蛋白纯化程序(例如，硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、层析和超滤)从培养基或体液中分离单克隆抗体。如果存在不希望的活性，可以例如通过使制备物在由附着于固相的免疫原制成的吸附剂上运行并从该免疫原洗脱或释放所希望的抗体来去除。使用双官能试剂或衍生化试剂，例如，马来酰亚胺基苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基缀合)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基基团)，用靶抗原或片段(含有靶氨基酸序列，其缀合到针对待免疫的物种具有免疫原性的蛋白质，例如，钥孔戚血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)对宿主动物进行免疫可以产生抗体群体(例如，单克隆抗体)。
如果需要，可以对目的抗体(单克隆或多克隆抗体)(例如，由杂交瘤细胞系产生)进行测序，然后可以将多核苷酸序列克隆到用于表达或增殖的载体中。编码目的抗体的序列可以维持在宿主细胞的载体中，并且可以扩增和冷冻该宿主细胞以备将来使用。在可替代实施例中，多核苷酸序列可用于基因操纵以例如使抗体人源化或提高抗体的亲和力(亲和力成熟)或其他特征。例如，如果抗体来自非人来源并且将用于人类的临床试验和治疗，则可以将恒定区工程化为更类似于人恒定区以避免免疫反应。可替代地或另外，可能需要对抗体序列进行基因操纵以获得对靶抗原的更大亲和力和/或特异性。对本领域技术人员显而易见的是，可以对抗体进行一个或多个多核苷酸改变并且仍然维持其对靶抗原的结合特异性。
完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段可以经由常规方法制备。例如，F(ab')2片段可以通过对抗体分子进行胃蛋白酶消化产生，并且Fab片段可以通过还原F(ab')2片段的二硫键产生。
基因工程化抗体，例如人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体和双特异性抗体，可以经由例如常规重组技术产生。在一个实例中，使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)可以容易地分离和测序编码对靶抗原具有特异性的单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞充当这样的DNA的优选来源。一旦被分离，可以将DNA置于一种或多种表达载体中，然后将这些载体转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。参见例如PCT公开号WO 87/04462。可以例如，通过将人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(Morrison等人,(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]81:6851)，或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价地连接至免疫球蛋白编码序列来修饰DNA。以这种方式，可以制备对靶抗原具有结合特异性的基因工程化抗体，例如“嵌合”或“杂合”抗体。
可以使用本领域熟知的方法对按照本领域已知的和本文所述的方法获得的抗体进行表征。例如，一种方法是识别抗原与其结合的表位，或“表位作图”。本领域中有许多已知的用于对蛋白质上表位的位置进行作图和表征的方法，包括解析抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定和基于合成肽的测定，如例如，在Harlow和Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual[使用抗体：实验室手册],Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约,1999的第11章中所述。在另外的实例中，表位作图可用于确定抗体与其结合的序列。表位可以是线性表位(即包含在单独的一段氨基酸中)，或者是由未必包含在单独的一段(一级结构线性序列)中的氨基酸的三维相互作用而形成的构象表位。可分离或合成(例如，通过重组)多种长度(例如，至少长4-6个氨基酸)的肽并用于与抗体的结合测定。在另一个实例中，可以通过使用衍生自靶抗原序列的重叠肽并测定与抗体的结合，在系统筛选中确定抗体所结合的表位。根据基因片段表达测定，将编码靶抗原的开放阅读框随机地或者通过特异性遗传构造分段，并且确定所表达的抗原片段与待测抗体的反应性。例如，可通过PCR产生基因片段，然后在体外转录并在放射性氨基酸存在下翻译成蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳确定抗体与放射性标记的抗原片段的结合。也可通过使用在噬菌体颗粒(噬菌体文库)表面上所展示的大量随机肽序列文库鉴定某些表位。可替代地，可在简单的结合测定中测试限定的重叠肽片段文库与测试抗体的结合。在另外的实例中，可进行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变以鉴定对于表位结合所需要的、充分的和/或必需的残基。例如，可使用靶抗原的突变体进行结构域交换实验，其中用紧密相关的但抗原性不同的蛋白质的序列来替换(交换)单链可变片段(scFv)蛋白的多个片段。通过评估抗体与突变体scFv多肽的结合，可评估特定抗原片段与抗体结合的重要性。
可替代地，可以使用已知与相同抗原结合的其他抗体进行竞争测定，以测定抗体是否与其他抗体结合相同的表位。竞争测定是本领域技术人员所熟知的。
在一些实施例中，本文披露的抗scFv抗体可以使用如下所例示的常规重组技术产生。
可以将编码本文所述的抗体的重链和轻链的核酸克隆到一个表达载体中，每个核苷酸序列与合适的启动子可操作地连接。在一个实例中，编码重链和轻链的每个核苷酸序列与不同的启动子可操作地连接。可替代地，编码重链和轻链的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链和轻链都由相同的启动子表达。必要时，可在重链和轻链编码序列之间插入内部核糖体进入位点(IRES)。
在一些实例中，将编码抗体两条链的核苷酸序列克隆到两个载体中，这两个载体可以被引入相同或不同的细胞中。当两条链在不同细胞中表达时，它们中的每一条都可以从表达它们的宿主细胞中分离出来，并且可以将分离的重链和轻链混合并在允许形成抗体的合适条件下温育。
一般地说，可以使用本领域已知的方法将编码抗体的一条或所有链的核酸序列克隆到合适的表达载体中与合适的启动子可操作地连接。例如，核苷酸序列和载体可以在合适的条件下与限制性酶接触，以在每个分子上产生互补末端，这些末端可以相互配对并用连接酶连接在一起。可替代地，合成的核酸接头可以连接到基因的末端。这些合成接头含有对应于载体中特定限制性位点的核酸序列。表达载体/启动子的选择将取决于用于在产生抗体中使用的宿主细胞的类型。
多种启动子可用于表达本文所述的抗体，包括但不限于巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子、病毒LTR例如劳斯肉瘤病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、大肠杆菌lac UV5启动子和单纯疱疹病毒tk病毒启动子。
也可以使用可调节启动子。这样的可调节启动子包括使用来自大肠杆菌的lac阻遏物作为转录调节子对携带lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录进行调节的那些启动子(Brown,M.等人,Cell[细胞],49:603-612(1987))，使用四环素阻遏物(tetR)的那些启动子(Gossen,M.和Bujard,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:5547-5551(1992)；Yao,F.等人,Human Gene Therapy[人基因疗法],9:1939-1950(1998)；Shockelt,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],92:6522-6526(1995))。其他系统包括FK506二聚体、使用雄二醇(astradiol)的VP16或p65、RU486、二元酚米乐甾酮(diphenol murislerone)或雷帕霉素(rapamycin)。诱导型系统可从英杰公司(Invitrogen)、Clontech公司和阿瑞雅德公司(Ariad)获得。
可以使用包括具有操纵子的阻遏物的可调节启动子。在一个实施例中，来自大肠杆菌的lac阻遏物可以用作转录调节子对携带lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子的转录进行调节(M.Brown等人,Cell[细胞],49:603-612(1987))；Gossen和Bujard(1992)；(M.Gossen等人,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],89:5547-5551(1992))，这些哺乳动物细胞启动子将四环素阻遏物(tetR)与转录激活子(VP 16)组合以产生tetR-哺乳动物细胞转录激活子融合蛋白tTa(tetR-VP 16)，与衍生自人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期启动子的、携带tetO的哺乳动物启动子组合以产生tetR-tet操纵子系统，从而控制哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施例中，使用四环素诱导型开关。当四环素操纵子适当地定位在CMVIE启动子的TATA元件下游时，四环素阻遏物(tetR)(而非tetR-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物)可以单独用作强效反式调节子来调节哺乳动物细胞中的基因表达(Yao等人,Human Gene Therapy[人基因疗法],10(11):1811-1818,1999)。该四环素诱导型开关的一个特别的优点是其不需要使用四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活子或阻遏物融合蛋白来实现其可调节作用，在一些情况下，四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活子或阻遏物融合蛋白可能对细胞有毒(Gossen等人,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],89:5547-5551(1992)；Shockett等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],92:6522-6526(1995))。
另外，载体可以含有例如以下中的一些或全部：可选择标志基因，如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平转录的来自人CMV的立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定的来自SV40的转录终止和RNA加工信号；用于适当的附加型复制的SV40多瘤复制起点和ColE1；内部核糖体结合位点(IRES)、通用多克隆位点；以及用于正义和反义RNA的体外转录的T7和SP6 RNA启动子。用于产生含有转基因的载体的合适的载体和方法是本领域熟知并且可获得的。
可用于实践本文所述的方法的多腺苷酸化信号的实例包括但不限于人胶原蛋白I多腺苷酸化信号、人胶原蛋白II多腺苷酸化信号和SV40多腺苷酸化信号。
可以将包含编码任何抗体的核酸的一个或多个载体(例如，表达载体)引入到合适的宿主细胞中用于产生抗体。可以在合适的条件下培养宿主细胞以表达抗体或其任何多肽链。可以经由常规方法(例如，亲和力纯化)通过培养的细胞(例如，来自细胞或培养上清液)来回收这样的抗体或其多肽链。如果有必要，抗体的多肽链可以在允许产生抗体的合适的条件下温育合适的时间段。
在一些实施例中，用于制备本文所述的抗体的方法涉及对本文所述的抗体的重链和轻链进行编码的重组表达载体。可以通过常规方法(例如，磷酸钙介导的转染)将重组表达载体引入到合适的宿主细胞(例如dhfr-CHO细胞)中。可以选择阳性转化体宿主细胞并在允许表达形成抗体的两条多肽链的合适条件下对其进行培养，这两条多肽链可以从细胞或从培养基中回收。在必要时，可以在允许形成抗体的合适条件下温育从宿主细胞回收的这两条链。
在一个实例中，提供了两种重组表达载体，一种重组表达载体编码本文所述的抗体(例如，抗体29E4B5)的重链，并且另一种重组表达载体编码本文所述的抗体(例如，抗体29E4B5)的轻链。可以通过常规方法(例如，磷酸钙介导的转染)将两种重组表达载体都引入到合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)中。可替代地，可以将每种表达载体引入到合适的宿主细胞中。可以选择阳性转化体并在允许表达抗体的多肽链的合适条件下对其进行培养。在将两种表达载体引入到同一宿主细胞中时，可以从宿主细胞或从培养基中回收其中产生的抗体。如果有必要，可以从宿主细胞或从培养基中回收多肽链，并且然后在允许形成抗体的合适条件下温育多肽链。当将两种表达载体引入到不同的宿主细胞中时，可以从对应的宿主细胞或从对应的培养基中回收两条多肽链中的每条多肽链。然后可以在合适的条件下温育这两条多肽链以形成抗体。
使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞并从培养基中回收抗体。例如，可以用蛋白A或蛋白G偶联基质通过亲和层析来分离一些抗体。
编码如本文所述的抗scFv抗体(例如，抗体29E4B5)的重链、轻链或两者的任何核酸、含有这些核酸的载体(例如，表达载体)和包含这些载体的宿主细胞均在本披露内容的范围内。
在其他实施例中，本文所述的抗scFv抗体可以是单链抗体片段(scFv)。单链抗体可以经由重组技术通过连接编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列来制备。优选地，在两个可变区之间掺入柔性接头。可替代地，用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778和4,704,692)可适用于产生对SEQ ID NO:1的单链可变片段(scFv)具有特异性的噬菌体或酵母scFv文库和scFv克隆，其可以按照常规程序从文库中进行鉴定。可以对阳性克隆进行进一步筛选以鉴定结合SEQ ID NO:1的scFv的那些克隆。
III.抗单链可变片段(scFv)抗体的应用
本披露内容还提供了使用如本文所述的任何抗scFv抗体(例如，抗体29E4B5)检测或定量样品中由SEQ ID NO:1的氨基酸序列(对CD19具有特异性)组成的单链可变片段(scFv)的方法。为了执行本文披露的方法，可以使任何抗scFv抗体与怀疑含有如本文披露的靶抗原—SEQ ID NO:1的抗CD19 scFv或多肽(例如包含其的CAR构建体)的样品接触。总体而言，术语“接触(contacting或in contact)”是指本文披露的抗scFv抗体与怀疑含有靶抗原的样品在足以使抗scFv抗体和样品中的靶抗原(如果有)之间形成复合物的合适条件下暴露合适的时间段。在一些实施例中，接触是通过毛细作用进行的，其中样品在支撑膜的表面上移动。如此形成的抗体-抗原复合物(如果有)可以经由常规方法测定。在温育后检测到这样的抗体-抗原复合物表明样品中存在靶抗原。需要时，可以对抗体-抗原复合物的量进行定量，这表明样品中靶抗原的水平。
在一些实施例中，可以使用本文披露的任何抗scFv抗体经由免疫测定对样品中本文披露的靶抗原(即，SEQ ID NO:1的抗CD19 scFv或包含其的多肽)进行检测或定量。免疫测定的实例包括但不限于免疫印迹测定(例如，蛋白质印迹)、免疫组织化学分析、流式细胞术测定、免疫荧光测定(IF)、酶联免疫吸附测定(ELISA)(例如，夹心ELISA)、放射免疫测定、基于电化学发光的检测测定、磁性免疫测定、侧向流测定和相关技术。用于检测样品中靶抗原的另外的合适的免疫测定对于本领域技术人员将是显而易见的。
在一些实例中，可以将如本文所述的抗scFv抗体(例如，包含与抗体29E4B5相同的重链和轻链CDR或包含相同VH和相同VL的抗体)缀合至可检测标记，该可检测标记可以是任何能够直接或间接释放可检测信号的试剂。这样的可检测信号或信号强度的存在表明样品中靶抗原的存在或数量。可替代地，可在本文披露的方法中使用对抗scFv抗体具有特异性或对靶抗原具有特异性的二抗。例如，当该方法中使用的抗scFv抗体是全长抗体时，二抗可以与抗scFv抗体的恒定区结合。在其他情况下，二抗可以与不同于抗scFv抗体的结合表位的靶抗原表位结合。本文披露的任何二抗可与可检测标记缀合。
本领域已知的任何合适的可检测标记可用于本文所述的测定方法。在一些实施例中，可检测标记可以是直接释放可检测信号的标记。实例包括荧光标记或染料。荧光标记包含荧光团，该荧光团是能够在光激发后再发射光的荧光化学化合物。荧光标记的实例包括但不限于，呫吨衍生物(例如，荧光素、罗丹明、俄勒冈绿(Oregon green)、曙红和德克萨斯红)、花青衍生物(例如，花青、吲哚碳菁、氧杂碳菁、硫杂碳菁和部花青)、方酸衍生物和环取代的方酸(例如，Seta和Square染料)、方酸轮烷衍生物(例如SeTau染料)、萘衍生物(例如，丹酰和prodan衍生物)、
香豆素衍生物、噁二唑衍生物(例如，吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑)、蒽衍生物(例如蒽醌，包括DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK橙)、芘衍生物(例如，瀑布蓝(cascadeblue))、噁嗪衍生物(例如，尼罗红(Nile red)、尼罗蓝(Nile blue)、甲酚紫和噁嗪170)、吖啶衍生物(例如，原黄素、吖啶橙和吖啶黄)、芳基次甲基衍生物(例如，金胺、结晶紫和孔雀石绿)和四吡咯衍生物(例如，卟吩、酞菁和胆红素)。染料可以是包含发色团的分子，该发色团负责染料的颜色。在一些实例中，可检测标记可以是异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、生物素、别藻蓝蛋白(APC)或Alexa
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488。
在一些实施例中，可检测标记可以是间接释放可检测信号的分子，例如，经由将试剂转化为直接释放可检测信号的产物。在一些实例中，这样的可检测标记可以是能够从无色底物产生有色产物的酶(例如，β-半乳糖苷酶、HRP或AP)。
本文披露的任何抗scFv抗体可用于检测和/或定量被基因工程化以表达包含SEQID NO:1的抗CD19 scFv的嵌合抗原受体的细胞(例如，免疫细胞，如T细胞)。如本文所用，嵌合抗原受体(CAR)是指人工免疫细胞受体，该人工免疫细胞受体经工程化以识别并结合不希望的细胞(例如，疾病细胞如癌细胞)表达的抗原。表达CAR多肽的T细胞被称为CAR T细胞。一般地说，CAR是融合多肽，其包含识别靶抗原的细胞外结构域(例如，抗体的单链可变片段(scFv)或其他抗体片段)和细胞内结构域，该胞内结构域包含T细胞受体(TCR)复合物的信号传导结构域(例如，CD3ζ)，并且在大多数情况下包含共刺激结构域。(Enblad等人,Human Gene Therapy[人基因疗法].2015；26(8):498-505)。CAR构建体可以进一步包含位于细胞外结构域与细胞内结构域之间的铰链和跨膜结构域，以及用于表面表达的N末端的信号肽。
要由本文披露的任何抗scFv抗体检测的抗CD19 CAR包含当该抗CD19 CAR在细胞表面表达时，可以作为细胞外结构域的SEQ ID NO:1的抗CD19 scFv。除了SEQ ID NO:1的抗CD19 scFv之外，本文披露的抗CD19 CAR可以包含细胞内结构域(例如，CD3ζ的信号传导结构域)和任选地一个或多个共刺激结构域(例如，CD28或4-1BB的共刺激结构域)。在一些情况下，这样的抗CD19 CAR可以进一步包含跨膜结构域(例如，CD8α的跨膜结构域)。任选地，抗CD19 CAR可进一步包含铰链结构域，其可包含多达300个氨基酸(例如，10至100个氨基酸，或5至20个氨基酸)。在一些实施例中，铰链结构域可以是CD8铰链结构域。可以使用其他铰链结构域。
包含SEQ ID NO:1的抗CD19 scFv的抗CD19 CAR的实例可在WO 2019/097305A2中找到，其相关披露内容通过援引并入本文以用于本文提及的目的和主题。在特定实例中，抗CD19 CAR可以包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(在下表6中提供)。
在一些实施例中，本文披露的任何抗scFv抗体可用于在生产这样的抗CD19 CAR T细胞的制造工艺(例如，生产CTX110细胞的制造工艺)期间测量表达抗CD19 CAR(包含SEQID NO:1作为细胞外结构域)的T细胞。参见，例如，于2019年11月13日提交的美国临时申请号62/934,991，其相关披露内容通过援引并入本文以用于本文提及的目的和主题。CTX110细胞是基因工程化T细胞的群体，其表达包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列并具有被破坏的内源性TRAC和β2M基因的抗CD19 CAR。
在一些情况下，用于生产表达抗CD19 CAR(包含SEQ ID NO:1的抗CD19 scFv)的基因修饰T细胞(例如，CTX110细胞)的制造工艺可涉及富集和激活T细胞(可获得自人供体)，将基因修饰引入由此激活的T细胞以产生T细胞(其中至少一部分表达抗CD19 CAR和其他所希望的基因编辑)，从由此产生的基因修饰的T细胞群体中消耗表达TCRαβ的T细胞，并收获所得的表达抗CD19 CAR的T细胞。参见，例如，于2019年11月13日提交的美国临时申请号62/934,991，其相关披露内容通过援引并入本文以用于本文提及的目的和主题。
为了监测用于产生表达所希望的抗CD19 CAR的T细胞的这样的制造工艺，可以在制造工艺的任何阶段期间，例如，在编码包含SEQ ID NO:1的scFv的抗CD19 CAR的核酸被引入T细胞之前或之后、或之前和之后，获得一个或多个样品，并且样品中表达抗CD19 CAR的T细胞的量可以根据本文所述的方法测量。例如，如本文披露的荧光染料缀合的抗scFv抗体可以在合适的条件下与一种或多种样品一起温育合适的时间段，以允许抗scFv抗体与细胞表面表达的抗CD19 CAR结合。然后可以经由常规方法确定表达抗CD19 CAR的T细胞水平的存在，例如通过荧光激活细胞分选(FACS)。
例如，在将T细胞与用于对T细胞进行基因修饰(包括将编码所希望的抗CD19 CAR的核酸引入细胞中)的组分一起温育后，可以获得含有所得T细胞的样品并且本文披露的抗scFv抗体可用于检测或定量样品中表达抗CD19 CAR的T细胞部分。可替代地，或除此之外，可以在用于去除TCRαβT细胞的消耗步骤之后、在基因操纵之后的任何体外扩增步骤之后和/或在收获所得的基因工程化T细胞之后获得包含基因修饰的T细胞的一个或多个样品。可以使用本文披露的抗scFv抗体来确定这些样品中表达抗CD19 CAR的T细胞的量。
在一些实例中，样品可获自被基因工程化以在冷冻保存之后和施用于患者之前表达本文披露的抗CD19 CAR的T细胞群体。可以使用本文披露的抗scFv抗体测量样品中表达抗CD19 CAR的T细胞(CAR+T细胞)的量，以确保向患者给予足够量的表达抗CD19 CAR的T细胞。
在一些实施例中，本文披露的任何抗scFv抗体可用于在将这样的CAR-T细胞施用于需要治疗的受试者后，对表达抗CD19 CAR(包含SEQ ID NO:1的抗CD19 scFv)的T细胞(例如，CTX110细胞)进行临床评估，例如，以评估抗CD19 CAR T细胞的体内药代动力学(PK)和/或药效学(PD)行为。
例如，一个或多个生物样品可获自人类患者，该人类患者在施用后的一个或多个时间点施用被基因工程化以表达抗CD19 CAR的T细胞(例如，CTX110细胞)。一个或多个生物样品中的CAR+T细胞水平可以通过本文披露的任何抗scFv抗体经由常规方法例如FACS来测量。这样的CAR+T细胞水平，例如，在施用后的不同时间点，可用于分析该人类患者中抗CD19CAR-T细胞的PK和/或PD特征。这样的CAR+T细胞水平也可用于评估该人类患者的潜在治疗功效。
如本文所用，“生物样品”是指包含来自受试者的组织，例如血液、血浆或蛋白质的组合物。生物样品可以是取自受试者的初始未加工样品或随后加工的样品，例如部分纯化或保存的形式。在一些实施例中，可以随时间推移或以特定时间间隔从受试者收集多个(例如，至少2、3、4、5或更多个)生物样品，例如以评估施用这样的T细胞的人类患者中表达抗CD19 CAR的T细胞的水平。
术语“患者”、“受试者”或“个体”可以互换使用并且是指需要如本文所述的分析的受试者。在一些实施例中，受试者是人类患者，其已施用多种T细胞，这些T细胞被基因工程化以表达抗CD19 CAR。在一些实施例中，人类患者是癌症患者，例如患有复发性或难治性B细胞恶性肿瘤，例如非霍奇金淋巴瘤或B细胞淋巴瘤的患者。
IV.用于检测SEQ ID NO:1的抗CD19 scFv和包含其的抗CD19 CAR的试剂盒
本披露内容还提供了用于在检测或定量样品(例如从生产抗CD19 CAR-T细胞的制造工艺中获得的样品或从施用抗CD19 CAR-T细胞的患者中获得的样品)中由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的单链可变片段(scFv)中使用的试剂盒。这样的试剂盒可包括一个或多个容器，这些容器包含抗scFv抗体，例如本文所述的那些抗体中的任何抗体，例如抗体29E4B5。
在一些实施例中，试剂盒可以包含根据本文所述的任何方法使用的说明书。所包括的说明书可包含如本文所述检测或定量样品中的scFv的描述。本发明的试剂盒中提供的说明书典型地是标签或包装插页(例如，试剂盒中包括的纸张)上的书面说明书，但是机器可读的说明书(例如，磁盘或光存储盘上携带的说明书，或可经由试剂盒中提供的互联网地址获得的说明书)也是可以接受的。
本发明的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、柔性包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。试剂盒可包含本文所述的抗scFv抗体的一个或多个等分试样。
试剂盒可以任选地提供另外组分，如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包含容器和在容器上或与容器关联的标签或一个或多个包装插页。在一些实施例中，本发明提供了包含上述试剂盒的内容物的制品。
通用技术
除非另有指示，否则本披露内容的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这样的技术在文献中有充分说明，如Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第二版(Sambrook等人,1989)Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社]；Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成](M.J.Gait编辑,1984)；Methods inMolecular Biology[分子生物学方法],Humana Press[哈玛纳出版社]；Cell Biology:ALaboratory Notebook[细胞生物学：实验室笔记本](J.E.Cellis编辑,1989)AcademicPress[学术出版社]；Animal Cell Culture[动物细胞培养](R.I.Freshney编辑1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture[细胞和组织培养导论](J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press[普莱纽姆出版社]；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures[细胞和组织培养：实验室操作](A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑1993-8)J.Wiley and Sons[威利父子出版社]；Methods in Enzymology[酶学方法](Academic Press,Inc.[学术出版社公司])；Handbook of ExperimentalImmunology[实验免疫学手册](D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)：Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells[哺乳动物细胞的基因转移载体](J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；Current Protocols in Molecular Biology[最新分子生物学实验方法汇编](F.M.Ausubel等人编辑1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶链反应](Mullis等人编辑1994)；Current Protocols in Immunology[免疫学现行方案](J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols in Molecular Biology[分子生物学简短方案](Wiley and Sons[威利父子出版社],1999)；Immunobiology[免疫生物学](C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies[抗体](P.Finch,1997)；Antibodies:apractice approach[抗体：实用方法](D.Catty.编辑,IRL Press[IRL出版社],1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach[单克隆抗体：实用方法](P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford University Press[牛津大学出版社],2000)；Usingantibodies:laboratory manual[使用抗体：实验室手册](E.Harlow和D.Lane(ColdSpring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],1999)；The Antibodies[抗体](M.Zanetti和J.D.Capra编辑Harwood Academic Publishers[哈伍德学术出版社],1995)；DNA Cloning:A practical Approach[DNA克隆：实用方法],第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；Nucleic Acid Hybridization[核酸杂交](B.D.Hames和S.J.Higgins编辑1985)；Transcription and Translation[转录和翻译](B.D.Hames和S.J.Higgins编辑1984)；Animal Cell Culture[动物细胞培养](R.I.Freshney编辑1986)；Immobilized Cells andEnzymes[固定化细胞和酶](lRL Press[lRL出版社],1986)；以及B.Perbal,ApracticalGuide To Molecular Cloning[分子克隆实用指南](1984)；F.M.Ausubel等人(编辑)。
无需进一步详细阐述，据信本领域的普通技术人员可以基于以上描述在其最大程度上利用本发明。因此以下具体实施例将被解释为仅是说明性的，并且无论如何并非以任何方式限制本披露内容的其余内容。本文引用的所有出版物均通过援引并入以用于本文提及的目的或主题。
实例
为了可以更充分地理解所述的本发明，阐述了以下实例。提供本申请中所述的实例以说明本文提供的方法和组合物，并且并非以任何方式解释为限制其范围。
实例1.抗原表达和纯化
本实例报告了小鼠抗人CD19单克隆抗体的带His标签的单链可变片段(FMC63-scFv)的表达和纯化，如实例2中所述，该片段随后用于产生针对FMC63-scFv的抗体。
FMC63-scFv蛋白从N末端到C末端包含N末端处的人工信号肽、由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的抗CD19 scFv片段和在C末端处的His标签。该FMC63-scFv蛋白的氨基酸序列和对应的核酸序列分别示于SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。对应于人工信号肽的序列标有下划线，带His标签的序列以粗体显示。
Figure BDA0003835563190000241
将对应于FMC63-scFv的DNA序列(SEQ ID NO:5)亚克隆到pcDNA3.4载体中，并将所得的FMC63-scFv DNA表达构建体转染到Expi293F细胞中。将一升Expi293F细胞在无血清Expi293FTM表达培养基(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，目录号A1435101)中悬浮培养，以瞬时表达重组FMC63-scFv蛋白。将细胞培养上清液过滤并加载到
Figure BDA0003835563190000251
FF Crude柱(通用医疗集团(GE Healthcare)，芝加哥，伊利诺伊州，目录号17-5286-01)上。将表达的重组FMC63-scFv蛋白纯化并缓冲液交换为PBS(pH7.2)。
在还原条件(图1A-1B中标记为1)和非还原条件(图1A-1B中标记为2)下，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹来分析重组FMC63-scFv蛋白。重组FMC63-scFv蛋白的估计分子量(MW)和纯度分别为大约27kDa和95％。基于Bradford蛋白测定，重组FMC63-scFv蛋白的估计浓度和产量分别为0.41mg/ml和11.67mg。质谱分析用于确定纯化的重组FMC63-scFv蛋白的实验平均MW。理论和实验平均MW分别为27324.4Da和27320.2Da。MALDI-TOF质谱用于验证表达的重组FMC63-scFv蛋白的氨基酸序列。
实例2.抗FMC63-scFv抗体生成
如本文所述进行小鼠免疫和血清抗体效价测定。五只BALB/c和五只C57BL/6小鼠用于生成抗FMC63-scFv抗体。按照表2中所示的时间表，用在适当佐剂中制备的FMC63-scFv蛋白经由腹膜内注射对小鼠进行免疫。
每次加强免疫后，从血液样品中分离血清，并通过间接ELISA测定抗体效价。包被抗原为：
A：重组FMC63-scFv蛋白；
B：TGSTSGSGKPGSGEGSTKG(FMC63-scFv接头肽)(SEQ ID NO:6)；
C：不相关的带His标签的蛋白；以及
D：总人IgG。
包被抗原在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)中，以1μg/ml和100μl/孔制备。二抗是过氧化物酶-AffiniPure山羊抗小鼠IgG(Fcγ片段特异性)(杰克森免疫研究公司(JacksonImmunoResearch)，宾夕法尼亚州西格罗夫，目录号115-035-071)。第三次免疫后，还通过流式细胞术评估来自每只小鼠的血清样品。
第三次免疫后，选择小鼠#B274进行细胞融合，但未获得阳性克隆。在第四次免疫后，使用标准杂交瘤方案选择小鼠#B279进行细胞融合。使用上述同组四种抗原对培养上清液进行ELISA筛选。从第二次融合中鉴定出总共六个ELISA阳性孔(克隆)。表3.
Figure BDA0003835563190000271
表3.杂交瘤亲本培养上清液的ELISA结果。
Figure BDA0003835563190000281
A：重组FMC63-scFv蛋白
B：TGSTSGSGKPGSGEGSTKG(FMC63-scFv接头肽)(SEQ ID NO:6)
C：带His标签的蛋白
D：总人IgG
一轮亚克隆后，获得28个ELISA阳性亚克隆，其代表了4个ELISA阳性克隆(17G2、29E4、33C9和45G2)。表4.
表4.原始四个克隆的亚克隆的ELISA结果。
Figure BDA0003835563190000282
Figure BDA0003835563190000291
A：重组FMC63-scFv蛋白
B：TGSTSGSGKPGSGEGSTKG(FMC63-scFv接头肽)(SEQ ID NO:6)
C：带His标签的蛋白
D：总人IgG
还通过流式细胞术评估28个ELISA阳性亚克隆的培养上清液与表达包含SEQ IDNO:1的抗CD19 scFv的抗CD19 CAR的CAR T细胞(抗CD19 CAR T细胞)的结合。该抗CD19 CAR(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列在表6中提供，并在WO/2019/097305中进行了描述，其相关披露内容通过援引并入本文以用于本文提及的目的和主题。
将亚克隆的培养上清液用作一抗。使用三种不同稀释度的对照抗FMC63-scFv抗体作为阳性对照。将阴性培养上清液(CS)用作阴性对照。将荧光标记的山羊抗小鼠IgG(杰克森免疫研究公司，宾夕法尼亚州西格罗夫，目录号115-605-008)用作二抗。
通过流式细胞术测试的28个亚克隆中，由29E4克隆产生的那些亚克隆与抗CD19CAR+T细胞具有优异的结合。参考抗FMC63-scFv抗体(rec_mab3)在三种不同稀释度和三个亚克隆(29E4A2、29E4B2和29E4B5)的培养上清液中的一组代表性流式细胞术谱的结果示于表5中。
表5.来自流式细胞术分析的％CAR+T细胞。
抗体 ％CAR<sup>+</sup>
仅二抗 6.42％
对照抗FMC63-scFv抗体(1:100) 73.4％
对照抗FMC63-scFv抗体(1:200) 68.5％
对照抗FMC63-scFv抗体(1:400) 66.7％
29E4A2 71.5％
29E4B2 71.4％
29E4B5 72.1％
阴性培养上清液(CS) 5.14％
来自亚克隆29E4B5的上清液的抗FMC63-scFv抗体以微量进行纯化，并通过流式细胞术分析与表达SEQ ID NO:7的抗CD19 CAR的CAR T细胞(抗CD19 CAR T细胞)的结合。将表达包含抗BCMA scFV的抗BCMA CAR(抗BCMA CAR T细胞)或包含抗CD70 scFV的抗CD70 CAR(抗CD70 CAR T细胞)的CAR T细胞用作阴性对照。在各种稀释度下分析抗FMC63-scFv抗体。
表6提供了抗BCMA CAR(SEQ ID NO:8)和抗CD70 CAR(SEQ ID NO:9)的序列，并在WO/2019/097305和WO 2019215500中进行了描述，其相关披露内容通过援引并入本文以用于本文提及的目的和主题。
表6.CAR序列
Figure BDA0003835563190000311
Figure BDA0003835563190000321
如图2中所示，来自亚克隆29E4B5的抗FMC63-scFv抗体与表达抗CD19 CAR的CAR T细胞特异性结合。在来自亚克隆29E4B5的抗FMC63-scFv抗体与表达抗BCMA CAR或抗CD70CAR的CAR T细胞之间没有观察到明显的结合。图2.
对小鼠抗FMC63-scFv单克隆抗体29E4B5的可变区进行测序。使用
Figure BDA0003835563190000322
试剂(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，目录号15596-026)从杂交瘤细胞中分离总RNA。使用总RNA作为模板和同种型特异性反义引物或通用引物通过逆转录产生cDNA。根据制造商的技术手册使用PrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒(宝生物工程美国公司，加利福尼亚州山景城市，目录号6215A)。使用cDNA末端快速扩增(RACE)(金斯瑞生物科技公司，皮斯卡塔韦市，新泽西州)来扩增重链和轻链序列。对扩增的抗体片段进行亚克隆。使用PCR以鉴定具有正确插入大小的克隆。使用在线工具注释重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域序列：美国国家生物技术信息中心(NCBI)核苷酸
Figure BDA0003835563190000323
IMGT/V Quest和NCBI
Figure BDA0003835563190000324
29E4B5抗体的同种型被确定为IgG1，κ。
小鼠抗FMC63-scFv单克隆抗体29E4B5的重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域序列提供于表7中。
表7.抗scFv抗体29E4B5的氨基酸序列。
Figure BDA0003835563190000325
Figure BDA0003835563190000331
Figure BDA0003835563190000341
总之，本文所述的结果证明产生了针对小鼠抗人CD19抗体(FMC63)的scFv的抗体，包括产生了小鼠抗FMC63-scFv单克隆抗体29E4B5。
实例3.大规模抗体生产。
使用两种不同的方法大规模制备29E4B5抗体。
在第一种(天然)方法中，将杂交瘤细胞(29E4B5)在滚瓶中的低IgG培养基中培养10天。收集上清液并纯化蛋白A以获得纯化的抗体。使用ELISA来分析纯化的抗体与FMC63-scFv蛋白和抗CD19 CAR T细胞结合的能力(表8)。针对重组FMC63-scFv蛋白的单克隆抗体29E4B5的效价估计为1:512,000(表8)。29E4B5抗体对FMC63-scFv接头肽、带His标签的蛋白或总人IgG显示出最低的交叉活性。
Figure BDA0003835563190000351
在第二种(重组)方法中，产生了具有29E4B5抗体的VH和VL序列的质粒并瞬时转染到HEK293 6E细胞中。转染的HEK293 6E细胞的上清液用于重组29E4B5抗体的大规模纯化。
使用流式细胞术，将用第一种或第二种方法产生的29E4B5抗体与参考抗FMC63-scFv抗体(rec_mab3)针对与抗CD19 CAR T细胞结合的能力进行比较。两种方法产生的29E4B5抗体对抗CD19细胞的亲和力均高于rec_mab3，即使在1:6,400稀释度下也显示出更高的CAR阳性百分比(表9)。
表9.来自流式细胞术分析的％CAR+T细胞。
Figure BDA0003835563190000361
Figure BDA0003835563190000371
参考抗FMC63-scFv抗体(rec_mab3)的VH和VL的氨基酸序列示于表10中。
表10.参考抗FMC63-scFv抗体(rec_mab3)的VH和VL。
Figure BDA0003835563190000372
总之，这些结果表明，在流式细胞术测定中，小鼠单克隆抗体(29E4B5)相比参考抗体(rec_mab3)，以更高的亲和力与表达包含FMC63-scFv的CAR的T细胞(抗CD19 CAR T细胞)结合。
实例4：与PBMC混合的表达抗CD19 CAR的细胞的测量。
将表达抗CD19 CAR的基因工程化T细胞与PBMC以0.0％、0.1％、1％、10％、25％、50％和100％稀释度混合。基因工程化T细胞表现出大约50％的CAR表达，因此当与PBMC混合时，预期的％CAR+T细胞为：0.0％、0.05％、0.5％、5％、12.5％、25％和50％。使用1:200稀释度的示例性抗CD19 CAR抗独特型抗体29E4B5-1，使用流式细胞术在技术重复中评估混合细胞群体中CAR+细胞的实际百分比。
如表11中所示，当在PBMC中混合时，通过流式测量的观察到的CAR+细胞百分比与表达抗CD19 CAR的T细胞的预期百分比高度相关，表明抗CD19 CAR抗独特型抗体允许检测并定量与PBMC混合时的CAR+细胞。即使在高度稀释(例如，1％)的情况下，抗独特型抗体也能有效检测和定量PMBC中表达抗CD19 CAR的细胞。这些结果表明本文披露的抗CD19 CAR独特型抗体可用于测量血液样品中表达抗CD19 CAR的细胞的水平。
表11.检测与PBMC混合的抗CD19 CAR+T细胞
Figure BDA0003835563190000381
其他实施例
在本说明书中披露的所有特征能以任意组合来组合。在本说明书中披露的每个特征可以由用于相同、等效或类似目的替代性特征替换。因此，除非另有明确规定，否则所披露的每个特征仅仅是等效或类似特征的通用系列的实例。
通过以上的说明，本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的基本特征并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明作不同变化和修改，以使其适应不同用途和条件。因此，其他实施例也在权利要求内。
等效方案
虽然本文已描述和说明了若干个本发明实施例，但本领域普通技术人员将容易地设想用于执行本文所述的功能和/或获得本文所述的结果和/或本文所述的一个或多个优点的多种其他装置和/或结构，并且这样的变型和/或修改中的每一个被认为是在本文所述的本发明实施例的范围内。更一般地说，本领域的技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料以及配置意在为示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于发明传授内容所用于的一种或多种具体应用。本领域的技术人员仅仅使用常规实验将认识到或能够确定本文所述的具体本发明实施例的许多等效方案。因此，应当理解，前述实施例是仅借助于实例来呈现，并且在所附权利要求和其等效方案的范围内，可以按与具体描述和要求保护不同的方式实践本发明实施例。本披露内容的本发明实施例涉及本文所述的每个单独特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果这样的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法并不相互矛盾，两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合包括在本披露内容的发明范围内。
如本文定义和使用的所有定义应当被理解成优先于所定义术语的字典定义、通过援引而并入的文件中的定义和/或普通含义。
本文披露的所有参考文献、专利和专利申请都相对于每个被引用的主题通过援引而并入，这在一些情况下可以涵盖文件的全部内容。
除非清楚地作相反指示，否则如本文在说明书中和在权利要求中所用的不定冠词“一个/种(a/an)”应理解为意指“至少一个(种)”。
如本文在说明书中和在权利要求中所用的短语“和/或”应理解为意指如此联合的要素中的“任一者或两者”，即，要素在一些情况下联合存在且在其他情况下不联合存在。用“和/或”列出的多个元素应当以相同的方式来解释，即，这样结合的元素中的“一个或多个”。除了由“和/或”子句具体标识的要素，其他要素可以任选地存在，无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当结合开放式语言诸如“包含”使用时，对“A和/或B”的提及可以在一个实施例中仅指A(任选地包括除了B的要素)；在另一个实施例中，仅指B(任选地包括除了A的要素)；在又一个实施例中，指A和B(任选地包括其他要素)；等等。
如本文在说明书中和在权利要求中所用的，“或”应理解为具有与如以上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应解释为包括性的，即，包括许多要素或要素列表中的至少一个(种)，还包括其中的多于一个(种)，并且任选地包括另外未列出的项目。仅清楚地作相反指示的术语，诸如“……中的仅一个(种)”或“……中的恰好一个(种)”，或者当用于权利要求中时，“由……组成”将是指恰好包括许多要素或要素列表中的恰好一个(种)要素。总体而言，如本文所用的术语“或”当前面加有排他性的术语，诸如“任何一个”、“……中一个”、“……中仅一个”或“……中只有一个”时，应当仅解释为指示排他性的替代形式(即，“一个或另一个，但非两者”)。“主要由……组成”当用于权利要求中时，应具有如在专利法领域中所用的其普通含义。
如本文在说明书中和在权利要求中所用，关于一个(种)或多个(种)要素的列表的短语“至少一个(种)”应理解为意指选自要素列表中的任何一个(种)或多个(种)要素的至少一个(种)要素，但不一定包括在要素列表内具体列出的每个(种)要素中的至少一个(种)，并且不排除要素列表中的要素的任意组合。此定义还允许可以任选地存在除了短语“至少一个(种)”所提及的要素列表内具体标识的要素外的要素，无论与具体标识的那些要素相关还是无关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个(种)”(或等效地，“A或B中的至少一个(种)”，或等效地“A和/或B中的至少一个(种)”)在一个实施例中可以是指至少一个(种)、任选地包括多于一个(种)A，而不存在B(并且任选地包括除了B的要素)；在另一个实施例中，可以是指至少一个(种)、任选地包括多于一个(种)B，而不存在A(并且任选地包括除了A的要素)；在又一个实施例中，可以是指至少一个(种)、任选地包括多于一个(种)A，以及至少一个(种)、任选地包括多于一个(种)B(并且任选地包括其他要素)；等等。
还应当理解，除非清楚地作相反指示，否则在包括多于一个步骤或动作的本文所要求保护的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于方法的步骤或动作被列举的顺序。
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<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
Glu Val Lys Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Leu Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Val Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Asp Tyr Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 4
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile
35 40 45
Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn
85 90 95
Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr
100 105 110
Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
145 150 155 160
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
165 170 175
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
180 185 190
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
195 200 205
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
210 215 220
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser His His His His His His
260 265 270
<210> 5
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
atgggctggt cctgcatcat tctgtttctg gtggccacag ccaccggcgt gcacagcgat 60
attcagatga cccagaccac cagcagcctg tctgcctctc tgggcgatag agtgaccatc 120
agctgtagag ccagccagga catcagcaag tacctgaact ggtatcagca gaaacccgac 180
ggcaccgtga agctgctgat ctaccacacc agcagactgc acagcggcgt gccaagcaga 240
ttttctggca gcggctctgg caccgactac agcctgacaa tcagcaacct ggaacaagag 300
gatatcgcta cctacttctg ccagcaaggc aacaccctgc cttacacctt tggcggaggc 360
accaagctgg aaatcaccgg ctctacaagc ggcagcggca aacctggatc tggcgaggga 420
tctaccaagg gcgaagtgaa actgcaagag tctggccctg gactggtggc cccatctcag 480
tctctgagcg tgacctgtac agtcagcgga gtgtccctgc ctgattacgg cgtgtcctgg 540
atcagacagc ctcctcggaa aggcctggaa tggctgggag tgatctgggg cagcgagaca 600
acctactaca acagcgccct gaagtcccgg ctgaccatca tcaaggacaa ctccaagagc 660
caggtgttcc tgaagatgaa cagcctgcag accgacgaca ccgccatcta ctattgcgcc 720
aagcactact actacggcgg cagctacgcc atggattatt ggggccaggg caccagcgtg 780
accgtgtcta gccatcacca ccaccatcac tga 813
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
1 5 10 15
Thr Lys Gly
<210> 7
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Phe Val
260 265 270
Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
275 280 285
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
290 295 300
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
305 310 315 320
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
325 330 335
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg
340 345 350
Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg
385 390 395 400
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
420 425 430
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
435 440 445
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
450 455 460
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
465 470 475 480
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
485 490 495
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 8
<211> 508
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn
35 40 45
Thr Leu Thr Asn Tyr Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50 55 60
Arg Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Leu Pro Tyr Asn Asp Leu Thr Lys
65 70 75 80
Tyr Ser Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Lys Ser
85 90 95
Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Trp Asp Trp Asp Gly Phe Phe Asp Pro
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Ser Ile Ser
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr His Leu
180 185 190
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
Ser Val Ser Asn Arg Phe Ser Glu Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ser Glu
225 230 235 240
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Thr Ser His Ile Pro Tyr Thr
245 250 255
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ala Ala Ala Phe Val
260 265 270
Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
275 280 285
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
290 295 300
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
305 310 315 320
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
325 330 335
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg
340 345 350
Asn Arg Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
355 360 365
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
370 375 380
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
385 390 395 400
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
405 410 415
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
420 425 430
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
435 440 445
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
450 455 460
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
465 470 475 480
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
485 490 495
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 9
<211> 508
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ala Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser
85 90 95
Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Val Met Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile
165 170 175
Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met
180 185 190
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu
225 230 235 240
Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr
245 250 255
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ala Ala Ala Phe Val
260 265 270
Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
275 280 285
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
290 295 300
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
305 310 315 320
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
325 330 335
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg
340 345 350
Asn Arg Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
355 360 365
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
370 375 380
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
385 390 395 400
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
405 410 415
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
420 425 430
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
435 440 445
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
450 455 460
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
465 470 475 480
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
485 490 495
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
Arg Tyr Trp Met Ser
1 5
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
Glu Ile Asn Leu Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
Asn Tyr Val Gly Met Asp Tyr
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
Ser Gly Ile Asp Phe Ser Arg Tyr
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
Asn Leu Asp Ser Ser Thr
1 5
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser Asp Tyr Thr Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val
1 5 10 15
Gln Cys
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 20
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val
1 5 10 15
Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser
35 40 45
Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Glu Ile Asn Leu Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Pro
65 70 75 80
Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Val Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Ser Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 21
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
35 40 45
Val Ser Ser Ser Asp Tyr Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 22
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val
1 5 10 15
Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser
35 40 45
Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Glu Ile Asn Leu Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Pro
65 70 75 80
Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Val Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180 185 190
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
195 200 205
Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
225 230 235 240
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
275 280 285
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
325 330 335
Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
340 345 350
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
355 360 365
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe
370 375 380
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe
405 410 415
Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
420 425 430
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
435 440 445
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 23
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
35 40 45
Val Ser Ser Ser Asp Tyr Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
165 170 175
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
195 200 205
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
210 215 220
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210> 24
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Leu Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Pro Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Asp Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (24)

1.一种分离的抗体，该分离的抗体结合由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的单链可变片段(scFv)，其中该抗体与抗体29E4B5结合该scFv的相同表位或与抗体29E4B5竞争结合该scFv。
2.如权利要求1所述的分离的抗体，其中该抗体与在细胞表面表达的该scFv结合。
3.如权利要求1或2所述的分离的抗体，该分离的抗体包含与抗体29E4B5相同的重链互补决定区和相同的轻链互补决定区。
4.如权利要求3所述的分离的抗体，该分离的抗体包含与抗体29E4B5相同的VH和相同的VL。
5.如权利要求1-4中任一项所述的分离的抗体，其中该抗体是全长抗体或其抗原结合片段。
6.一种核酸或核酸组，该核酸或核酸组共同编码如权利要求1-5中任一项所述的抗体。
7.如权利要求6所述的核酸或核酸组，该核酸或核酸组为载体或载体组。
8.如权利要求7所述的核酸或核酸组，其中该一种或多种载体是一种或多种表达载体。
9.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求6-8中任一项所述的核酸或核酸组。
10.如权利要求9所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是哺乳动物细胞。
11.一种用于检测或定量样品中由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的单链可变片段(scFv)的方法，该方法包括：
(i)使如权利要求1-5中任一项所述的抗体与怀疑含有该scFv的样品接触，以及
(ii)检测该抗体与该scFv的结合。
12.如权利要求11所述的方法，其中该抗体与可检测标记缀合。
13.如权利要求11或权利要求12所述的方法，其中该scFv是在细胞表面表达的抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的细胞外结构域。
14.如权利要求13所述的方法，其中该样品包含多个T细胞，这些T细胞被基因工程化以表达该抗CD19 CAR。
15.如权利要求14所述的方法，其中该多个T细胞由获得自一个或多个供体的T细胞制备。
16.如权利要求14或权利要求15所述的方法，其中该样品是从产生多个T细胞的工艺中获得的，这些T细胞被基因工程化以表达该抗CD19CAR。
17.如权利要求14或权利要求15所述的方法，其中该样品是从施用多个T细胞的受试者获得的生物样品，这些T细胞被基因工程化以表达该抗CD19 CAR。
18.如权利要求17所述的方法，其中该样品是血液样品。
19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中该受试者是人类癌症患者。
20.如权利要求19所述的方法，其中该人类癌症患者患有复发性或难治性B细胞恶性肿瘤。
21.如权利要求20所述的方法，其中该复发性或难治性B细胞恶性肿瘤为非霍奇金淋巴瘤或B细胞淋巴瘤。
22.如权利要求14-21中任一项所述的方法，其中该多个T细胞包含被破坏的TRAC基因、被破坏的β2M基因或者两者。
23.一种产生结合由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的单链可变片段(scFv)的抗体的方法，该方法包括：
(i)在允许与该scFv结合的该抗体表达的条件下培养如权利要求9或权利要求10所述的宿主细胞；以及
(ii)收获由此从细胞培养物中产生的该抗体。
24.如权利要求23所述的方法，该方法进一步包括(iii)在步骤(ii)之后纯化该抗体。
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