BR112021005669A2 - anticorpos contra bcma solúvel - Google Patents

Abstract

A presente invenção se relaciona com anticorpos que se ligam a BCMA solúvel (sBCMA). Além disso, a invenção se relaciona com um sistema de detecção compreendendo tais anticorpos. Os anticorpos ou o sistema de detecção podem ser usados para detectar ou quantificar sBCMA, para diagnosticar uma doença associada a sBCMA, para estratificação de pacientes, monitorização da progressão da doença e avaliação da resposta terapêutica.

Description

ANTICORPOS CONTRA BCMA SOLÚVEL ÁREA

[0001] A presente invenção se relaciona com anticorpos que se ligam a BCMA solúvel (sBCMA). Além disso, a invenção se relaciona com um sistema de detecção compreendendo tais anticorpos. Os anticorpos ou o sistema de detecção podem ser usados para detectar ou quantificar sBCMA, para diagnosticar uma doença associada a sBCMA, para estratificação de pacientes, monitorização da progressão da doença e avaliação da resposta terapêutica.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL SUBMETIDO ELETRONICAMENTE

[0002] É incorporada por referência em sua totalidade uma listagem de sequências de nucleotídeos/aminoácidos legível por computador submetida concomitantemente aqui e identificada como se segue: ficheiro ASCII (Texto) de 34.276 bytes chamado “53500A_Seqlisting.txt”; criado em 27 de setembro, 2019.

ANTECEDENTES

[0003] O mieloma múltiplo (MM) é uma disfunção neoplásica de células plasmáticas que é caracterizada por proliferação clonal de células plasmáticas malignas no microambiente da medula óssea, proteína monoclonal no sangue ou urina e disfunção orgânica associada. O Mieloma Múltiplo (MM) é responsável por quase 2% de todos os cânceres e 20% das malignidades hematológicas (SEER). O mieloma múltiplo permanece um câncer incurável, embora o recente entendimento melhorado da patogênese do mieloma tenha levado ao desenvolvimento de novos tratamentos e sobrevivência melhorada. Os tratamentos incluem terapias molecularmente visadas que são concebidas para inibir as vias de sinalização que suportam a sobrevivência e proliferação de células neoplásicas. Um tal alvo é o antígeno de maturação de células B que é largamente expresso a níveis relativamente mais elevados em células plasmáticas malignas do que em células plasmáticas normais e induz sinais proliferativos através da ligação de seus ligandos APRIL e BAFF.

[0004] O antígeno de maturação de células B (BCMA, TNFRSF17, CD269) é uma proteína transmembrana pertencendo à superfamília de receptores de TNF. A expressão de BCMA é seletivamente induzida durante a diferenciação de células plasmáticas de estágio final e está ausente nas células B ingênuas e de memória. Após ligação de BCMA aos seus ligandos, fator de ativação de células B (BAFF) e um ligando indutor da proliferação (APRIL), a sobrevivência das células plasmáticas da medula óssea e plasmablastos é promovida. BCMA não mantém a homeostase normal das células B, mas é requerido para a sobrevivência das células plasmáticas de longa vida. A expressão de mRNA de BCMA é altamente elevada em disfunções malignas de células plasmáticas. Em contraste, a expressão de mRNA de BCMA em tecidos normais é muito baixa e restrita a tecidos linfoides onde estão localizadas células plasmáticas de longa vida normais. A expressão da proteína BCMA é relatada como sendo restrita somente a células plasmáticas e confinada a blastos plasmáticos e células plasmáticas de longa vida e não pode ser detectada em outros tecidos humanos normais. BCMA é expresso a um nível relativamente mais elevado na maioria das células plasmáticas malignas em comparação com as células plasmáticas normais em pacientes com MM. Nem as células T nem as células mieloides ou as células-tronco hematopoiéticas CD34+ expressam BCMA. A expressão seletiva de BCMA na maioria das células plasmáticas malignas o torna um alvo muito atraente para terapias baseadas em anticorpos e baseadas em receptores de antígenos quiméricos (CAR). Existem relatos de perfis negativos para BCMA para pacientes com MM sugerindo que a seleção dos pacientes pode ser requerida para a terapia visada. A detecção de BCMA pode não estar limitada à expressão de proteínas. Estudos recentes mostraram que a mudança no BCMA sérico pode ser um biomarcador para a resposta terapêutica ou progressão da doença para pacientes com MM.

[0005] BCMA pode ser eliminado da superfície celular e foi encontrado em amostras de soro de pacientes com mieloma múltiplo bem como em sujeitos saudáveis. Uma publicação recente demonstrou que os níveis de BCMA solúvel (sBCMA) se correlacionaram com a proporção de células plasmáticas em biópsias de medula óssea, estado clínico, e podem ser rastreados com mudanças nos níveis de proteína-M. Em este estudo, os dadores saudáveistinham uma concentração sanguínea de sBCMA mediana similar aos níveis medianos observados em pacientes com resposta completa. Os pacientes com mieloma múltiplo latente tinham concentrações mais elevadas, ao passo que os pacientes com mieloma múltiplo não tratado ativo tinham níveis mais elevados. A sobrevivência isenta de progressão foi mais longa para pacientes com níveis de sBCMA abaixo da mediana em comparação com aqueles cujos níveis estavam acima da mediana. Mudanças nos níveis de sBCMA podem ser um indicador rápido e confiável da eficácia do tratamento para pacientes com MM. BCMA solúvel pode ser usado para prognosticar ou monitorizar o progresso da doença, pois este biomarcador pode ser detectado em pacientes com baixa carga tumoral com doença não secretora e é independente da função renal.

[0006] Existe consequentemente uma grande necessidade de proporcionar um sistema de detecção confiável para sBCMA em uma amostra biológica, tendo elevada sensibilidade, reprodutibilidade e idealmente proporcionando resultados estáveis na presença de moléculas de ligação a sBCMA terapêuticas potencialmente interferentes tais como anticorpos ou construtos de anticorpos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0007] As Fig. 1A-C ilustram a configuração dos ensaios levados a cabo de acordo com o Exemplo 1. A Fig. 1A mostra a configuração do ensaio para testar a potencial interferência de um ab anti-BCMA terapêutico com um estojo de ELISA de detecção/quantificação de BCMA. A Fig. 1B mostra três formatos de Octet diferentes para o uso de um anticorpo de captura e detecção no rastreamento de hibridomas anti- BCMA XenoMouse® quanto à ligação a BCMA na presença de um anticorpo anti-sBCMA terapêutico monoclonal. A Fig. 1C mostra a configuração do ensaio para rastrear soros de coelho quanto ao ensanduichamento com um ab anti-BCMA terapêutico.

[0008] A Fig. 2 mostra a caracterização de dois Abs anti- sBCMA monoclonais de coelho (sBCMA-mAb1 e sBCMA-mAb2) quanto ao ensanduichamento com um Ab anti-BCMA terapêutico (Ther- Ab2) em um ensaio Octet (ver Exemplo 2a).

[0009] A Fig. 3 mostra os resultados de um ensaio Octet demonstrando que o anti-sBCMA-mAb3 monoclonal de coelho é capaz de ensanduichar com sBCMA-mAb1 e anticorpo anti-BCMA terapêutico Ther-Ab2 (ver Exemplo 2c).

[0010] A Fig. 4 mostra os resultados de um ensaio Octet confirmando o resultado mostrado na Fig. 3 (ver Exemplo 2c).

[0011] A Fig. 5 mostra os resultados da determinação de afinidade de mAbs em sanduíche anti-sBCMA monoclonais de coelho (sBCMA-mAb1, -mAb2 e -mAb3) através de Biacore (ver Exemplo 3).

SUMÁRIO E DESCRIÇÃO DETALHADA

[0012] Em um esforço para gerar um par de anticorpos para detectar sBCMA, os presentes inventores rastrearam cerca de 400 hibridomas XenoMouse® que haviam sido gerados contra BCMA e testados positivos em um ensaio ELISA para ligação a BCMA. No entanto, o rastreamento destes hibridomas XenoMouse® na presença de um anticorpo monoclonal se ligando a sBCMA não identificou nenhum anticorpo em sanduíche, mesmo quando se testaram diferentes formatos do uso dos anticorpos de captura e detecção (ver Fig. 1B). De seguida, campanhas de imunização de coelho foram levadas a cabo, e os soros de coelho foram rastreados quanto ao ensanduichamento com o anticorpo monoclonal se ligando a sBCMA. As vantagens de usar coelhos para geração de anticorpos no presente caso são: - Repertório de anticorpos diferente, espaço de epítopos diferente (sem competição) - Resposta imunitária robusta - Sistema imunitário baseado na conversão gênica, taxas de hipermutação somática mais elevadas do que roedores, levando a elevadas afinidades

[0013] A existência de três anticorpos em sanduíche (de um número total de 226 anticorpos de coelho contra sBCMA)

pôde ser demonstrada. Foi mostrado que dois destes (sBCMA- mAb1 e sBCMA-mAb2) competem entre si pela ligação a sBCMA. Foram ambos capazes de se ligar a sBCMA na presença de um construto de anticorpo anti-BCMA terapêutico. Foi adicionalmente mostrado que o anticorpo sBCMA-mAb3 se ligou a sBCMA na presença tanto de sBCMA-mAb1 como de um construto de anticorpo anti-BCMA terapêutico.

[0014] Portanto, a presente invenção proporciona em um aspecto um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) que se liga a BCMA solúvel (sBCMA), em que a ligação do anticorpo (ou construto de anticorpo) a sBCMA ocorre na presença de um segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) se ligando a sBCMA. A presente invenção proporciona também um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) que se liga a BCMA solúvel (sBCMA) na presença de um segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) se ligando a sBCMA.

[0015] No que se segue, sempre que o termo “anticorpo monoclonal” é usado (i.e., anticorpo monoclonal que se liga a sBCMA), o termo se destina também a englobar “construtos de anticorpos” ou “fragmentos de anticorpos”, como serão definidos aqui em baixo. Além do mais, as definições e especificações proporcionadas em baixo do “anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo)” da presente invenção (i.e., anticorpo monoclonal ou construto de anticorpo que se liga a sBCMA) se aplicam similarmente a qualquer “primeiro anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo)” da invenção bem como qualquer “segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo)” da invenção.

[0016] Um “anticorpo” (por vezes também conhecido como uma imunoglobulina) é uma proteína que se liga imunoespecificamente ao seu alvo. O anticorpo reconhece um alvo único, chamado um antígeno, através de suas regiões variáveis. Um “anticorpo” pode ser de qualquer isótipo de imunoglobulina, incluindo IgG (incluindo os subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluindo os subtipos IgA1 e IgA2), IgM e IgE. O termo “anticorpo” pode incluir, por exemplo, anticorpos monoclonais, quiméricos, recombinantes, desimunizados, de afinidade maturada, humanizados e humanos, bem como anticorpos de outras espécies tais como roedor, coelho, camundongo, rato, hamster, cabra, etc. Os anticorpos podem ser derivados meramente de uma única fonte ou podem ser “quiméricos”, isto é, diferentes porções do anticorpo (tais como CDRs, regiões estruturais, região variável, região constante) podem ser derivadas de dois anticorpos diferentes. A definição de “anticorpo” de acordo com a invenção compreende anticorpos de comprimento total, incluindo também anticorpos de camelídeo, e outras imunoglobulinas geradas por métodos ou processos biotecnológicos ou de manipulação de proteínas. Um anticorpo pode ser também produzido em hibridomas.

[0017] Um anticorpo IgG intacto compreenderá geralmente duas cadeias pesadas de comprimento total e duas cadeias leves de comprimento total. Uma “cadeia leve” inclui uma região variável (“VL”) tendo um domínio e uma região constante (“CL”) tendo um domínio. A região variável da cadeia leve está no terminal amino do polipeptídeo. As cadeias leves incluem cadeias kappa e cadeias lambda. Uma “cadeia pesada” inclui uma região variável (“VH”) tendo um domínio e uma região constante ("CH”) tendo - no caso de um anticorpo IgG intacto - três domínios: CH1, CH2 e CH3. O VH está no terminal amino do polipeptídeo, e os domínios CH estão no terminal carboxila, com o CH3 estando mais próximo do terminal carbóxi do polipeptídeo.

[0018] Em uma imunoglobulina ou anticorpo de comprimento total clássico, cada cadeia leve (L) é ligada a uma cadeia pesada (H) por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H são ligadas entre si por uma ou mais ligações de dissulfeto dependendo do isótipo de cadeia H. O domínio constante de cadeia pesada (CH) mais próximo de VH é usualmente designado como CH1. Os domínios constantes (“C”) não estão diretamente envolvidos na ligação ao antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e ativação do complemento (citotoxicidade dependente do complemento, CDC). A região Fc de um anticorpo é a região de “cauda” de um anticorpo clássico que interage com os receptores da superfície celular chamados receptores Fc e algumas proteínas do sistema do complemento. Nos isótipos de anticorpos IgG, IgA e IgD, a região Fc é composta por dois fragmentos de proteína idênticos, derivados do segundo e terceiro domínios constantes (CH2 e CH3) das duas cadeias pesadas do anticorpo. As regiões Fc de IgM e IgE contêm três domínios constantes de cadeia pesada (CH2, CH3 e CH4) em cada cadeia de polipeptídeos. As regiões Fc contêm também parte da assim chamada região de “charneira” mantida unida por um ou mais dissulfetos e interações não covalentes. A região Fc de uma IgG ocorrendo naturalmente carrega um local de N-glicosilação altamente conservado. A glicosilação do fragmento Fc é essencial para a atividade mediada pelo receptor Fc.

[0019] É pretendido que o anticorpo monoclonal da presente invenção possa ser um anticorpo IgG, IgD, IgE, IgM ou IgA. De acordo com uma modalidade, o anticorpo monoclonal é um anticorpo IgG, tal como um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. O isótipo e a subclasse do anticorpo podem ser de coelho (p.ex., IgG de coelho, IgG1 de coelho, etc.).

[0020] No contexto da presente invenção, o termo “variável” se refere àquelas porções do anticorpo ou domínios de imunoglobulina que exibem variabilidade na sua sequência e que estão envolvidas na determinação da especificidade e afinidade de ligação de um anticorpo particular (i.e., a(s) “região(ões) variável(eis)”). Usualmente, o emparelhamento de uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cada leve (VL) em conjunto forma um local de ligação ao antígeno único.

[0021] A variabilidade não está uniformemente distribuída ao longo das regiões variáveis de anticorpos; está concentrada em subdomínios de cada uma das regiões variáveis de cadeia pesada e leve. Estes subdomínios são chamados “regiões hipervariáveis” ou “regiões determinantes da complementaridade” (CDRs). As porções mais conservadas (i.e., não hipervariáveis) das regiões variáveis são chamadas as regiões “estruturais” (FRM) e proporcionam um suporte para as seis CDRs em espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação ao antígeno. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves de anticorpo ocorrendo naturalmente compreendem cada uma quatro regiões FR (FR1, FR2, FR3 e FR4), adotando amplamente uma configuração em folha β. Em conjunto com as CDRs, elas formam a seguinte sequência dentro de uma cadeia pesada ou leve variável: FR1- CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade íntima pelas regiões estruturais e, usualmente em conjunto com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antígeno (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda, National Institute of Health. 1991).

[0022] Os termos “CDR”, e seu plural “CDRs”, se referem à região determinante da complementaridade da qual três constituem o caráter ligante de uma região variável de cadeia leve (CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3) e três constituem o caráter ligante de uma região variável de cadeia pesada (CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3). As CDRs contêm a maioria dos resíduos responsáveis por interações específicas do anticorpo (ou construto de anticorpo ou domínio de ligação) com o antígeno e consequentemente contribuem para a atividade funcional de uma molécula de anticorpo: são os principais determinantes da especificidade de antígeno. A definição exata de fronteiras e comprimentos de CDR está sujeita a sistemas de clarificação e numeração diferentes. As CDRs podem portanto ser referidas por Kabat, Chothia, contato ou quaisquer outras definições de fronteira, incluindo o sistema de numeração descrito aqui. Apesar das diferentes fronteiras, cada um destes sistemas tem algum grau de sobreposição no que constitui as assim chamadas “regiões hipervariáveis” dentro das sequências variáveis. As definições de CDR de acordo com estes sistemas podem portanto diferir em comprimento e áreas de fronteira no que diz respeito à região estrutural adjacente. Ver por exemplo Kabat (uma abordagem baseada em variabilidade de sequência entre espécies), Chothia (uma abordagem baseada em estudos cristalográficos de complexos antígeno-anticorpo) e/ou MacCallum (Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; e MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Ainda outro padrão para caracterizar o local de ligação ao antígeno é a definição AbM usada pelo software de modelação de anticorpos AbM da Oxford Molecular. Ver, p.ex., Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. Em: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. e Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberga). Na medida em que duas técnicas de identificação de resíduos definam regiões de sobreposição, mas não regiões idênticas, as mesmas podem ser combinadas para definir uma CDR híbrida. No entanto, a numeração de acordo com o assim chamado sistema de Kabat é preferencial.

[0023] Tipicamente, as CDRs formam uma estrutura em alça que pode ser classificada como uma estrutura canônica. O termo “estrutura canônica” se refere à conformação da cadeia principal que é adotada pelas laças de ligação ao antígeno (CDR). A partir de estudos estruturais comparativos foi descoberto que cinco das seis alças de ligação ao antígeno têm somente um repertório limitado de conformações disponíveis. Cada estrutura canônica pode ser caracterizada pelos ângulos de torção do esqueleto de polipeptídeo. As alças correspondentes entre anticorpos podem, portanto, ter estruturas tridimensionais muito similares, apesar da elevada variabilidade de sequências de aminoácidos na maioria das partes das alças (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol.,

1987, 196: 901; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877; Martin e Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Além do mais existe uma relação entre a estrutura em alça adotada e as sequências de aminoácidos circundando a mesma. A conformação de uma classe canônica particular é determinada pelo comprimento da alça e pelos resíduos de aminoácidos residindo em posições essenciais dentro da alça, bem como dentro da estrutura conservada (i.e., fora da alça). A atribuição a uma classe canônica particular pode portanto ser feita com base na presença destes resíduos de aminoácidos essenciais.

[0024] O termo “estrutura canônica” pode também incluir considerações quanto à sequência linear do anticorpo, por exemplo, como catalogado por Kabat (Kabat et al., loc. cit.). O esquema (sistema) de numeração de Kabat é um padrão amplamente adotado para numerar os resíduos de aminoácido de uma região variável de anticorpo de uma maneira consistente e é o esquema preferencial aplicado na presente invenção como também mencionado em outro lugar aqui. Considerações estruturais adicionais podem ser também usadas para determinar a estrutura canônica de um anticorpo. Por exemplo, aquelas diferenças não totalmente refletidas pela numeração de Kabat podem ser descritas pelo sistema de numeração de Chothia et al. e/ou reveladas por outras técnicas, por exemplo, cristalografia e modelação computacional bio ou tridimensional. Conformemente, uma dada sequência de anticorpos pode ser colocada em uma classe canônica que permite, entre outras coisas, identificar sequências de classe apropriadas (p.ex., com base em um desejo de incluir uma variedade de estruturas canônicas em uma biblioteca). A numeração de Kabat de sequências de aminoácidos de anticorpo e considerações estruturais como descrito por Chothia et al., loc. cit. e suas implicações para interpretar aspectos canônicos de estrutura de anticorpo, são descritos na literatura. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas na técnica. Para uma análise da estrutura de anticorpos ver Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988.

[0025] A CDR3 da cadeia leve e, particularmente, a CDR3 da cadeia pesada podem constituir os determinantes mais importantes na ligação ao antígeno dentro das regiões variáveis de cadeia leve e pesada. Em alguns anticorpos, construtos de anticorpos ou domínios de ligação, a CDR3 de cadeia pesada parece constituir a principal área de contato entre o antígeno e o anticorpo. Esquemas de seleção in vitro nos quais a CDR3 sozinha é variada podem ser usados para variar as propriedades de ligação de um anticorpo ou construto de anticorpo/domínio de ligação ou determinar que resíduos contribuem para a ligação de um antígeno. Consequentemente, a CDR3 é tipicamente a maior fonte de diversidade molecular dentro do local de ligação do anticorpo. A CDR-H3, por exemplo, pode ser tão curto quanto dois resíduos de aminoácido ou maior do que 26 aminoácidos.

[0026] A sequência de genes de anticorpo após montagem e mutação somática é altamente variada, e é estimado que estes genes variados codifiquem 1010 moléculas de anticorpo diferentes (Immunoglobulin Genes, 2a ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Conformemente, o sistema imunitário proporciona um repertório de imunoglobulinas. O termo “repertório” se refere a pelo menos uma sequência de nucleotídeos derivada totalmente ou parcialmente de pelo menos uma sequência codificando pelo menos uma imunoglobulina. A(s) sequência(s) pode(m) ser gerada(s) por rearranjo in vivo dos segmentos V, D e J de cadeias pesadas e dos segmentos V e J de cadeias leves. Alternativamente, a(s) sequência(s) pode(m) ser gerada(s) a partir de uma célula em resposta a que rearranjo ocorre, p.ex., estimulação in vitro. Alternativamente, parte da(s) ou toda(s) a(s) sequência(s) pode(m) ser obtida(s) por splicing de DNA, síntese de nucleotídeos, mutagênese e outros métodos, ver, p.ex., Patente dos EUA 5,565,332. Um repertório pode incluir somente uma sequência ou pode incluir uma pluralidade de sequências, incluindo aquelas em uma coleção geneticamente diversa.

[0027] Se prevê que os anticorpos (e construtos de anticorpos) da presente invenção sejam monoclonais. Como usado aqui, os anticorpos ou construtos de anticorpos que são denominados “monoclonais” (mAb) são obtidos de uma população de anticorpos/construtos de anticorpos substancialmente homogêneos, i.e., os anticorpos/construtos de anticorpos individuais compreendidos na população são idênticos (em particular no que diz respeito à sua sequência de aminoácidos) exceto quanto a possíveis mutações ocorrendo naturalmente e/ou modificações pós-translacionais (p.ex., isomerizações, amidações) que podem estar presentes em quantidades mínimas. Os anticorpos/construtos de anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um epítopo único dentro do antígeno, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que incluem tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (ou epítopos). Adicionalmente à sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que são sintetizados pela cultura de hibridoma, consequentemente não contaminados por outras imunoglobulinas. O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo/construto de anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos/construtos de anticorpos e não é para ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular.

[0028] Para a preparação de anticorpos monoclonais, qualquer técnica proporcionando anticorpos produzidos por culturas de linhas de células contínua pode ser usada. Por exemplo, os anticorpos monoclonais/construtos de anticorpos a serem usados podem ser preparados pelo método de hibridoma descrito em primeiro lugar por Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975) ou podem ser preparados por métodos de DNA recombinante (ver, p.ex., Patente dos E.U.A. No. 4,816,567). Exemplos de técnicas adicionais para produzir anticorpos monoclonais humanos incluem a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) e a técnica de EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).

[0029] Os hibridomas podem ser depois rastreados usando métodos padrão, tais como ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) e análise por ressonância de plasmon de superfície (BIACORE™), para identificar um ou mais hibridomas que produzem um anticorpo/construto de anticorpo que se liga imunoespecificamente a um antígeno especificado. Qualquer forma do antígeno relevante pode ser usada como o imunógeno, p.ex., antígeno recombinante, formas ocorrendo naturalmente, antígenos quiméricos, quaisquer variantes ou fragmentos do antígeno, bem como um seu peptídeo antigênico. A ressonância de plasmon de superfície como empregue no sistema BIAcore™ pode ser usada para aumentar a eficiência de anticorpos/construtos de anticorpos em fagos que se ligam a um epítopo de um antígeno alvo (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).

[0030] Outro método exemplificativo de preparação de anticorpos, construtos de anticorpos ou domínios de ligação inclui rastreamento de bibliotecas de expressão de proteínas, p.ex., bibliotecas de exibição em fagos ou exibição em ribossomos. A exibição em fagos é descrita, por exemplo, em Ladner et al., Patente dos E.U.A. No. 5,223,409; Smith (1985) Science 228: 1315-1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581- 597 (1991).

[0031] Adicionalmente ao uso de bibliotecas de exibição, o antígeno relevante pode ser usado para imunizar um animal não humano, p.ex., um roedor (tal como um camundongo, hamster, coelho ou rato). Em uma modalidade, o animal não humano inclui pelo menos uma parte de um gene de imunoglobulina humana. Por exemplo é possível manipular estirpes de camundongo deficientes em produção de anticorpos de camundongo com grandes fragmentos dos loci de Ig (imunoglobulina) humana. Usando a tecnologia de hibridoma, anticorpos monoclonais específicos do antígeno derivados dos genes com a especificidade desejada podem ser produzidos e selecionados. Ver, p.ex., Xenomouse™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096 e WO 96/33735.

[0032] Um anticorpo monoclonal pode ser também obtido de um animal não humano e, depois, modificado, p.ex., humanizado, desimunizado, tornado quimérico, etc., usando técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica. Exemplos de anticorpos, construtos de anticorpos ou domínios de ligação modificados incluem variantes humanizadas de anticorpos/construtos de anticorpos não humanos, anticorpos, construtos ou domínios de ligação “de afinidade maturada” (ver, p.ex., Hawkins et al., J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) e Lowman et al, Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) e variantes ou mutantes de anticorpos com função(ões) efetora(s) alterada(s) (ver, p.ex., Patente dos EUA 5,648,260, Kontermann e Dübel (2010), loc. cit. e Little (2009), loc. cit.).

[0033] Em imunologia, a maturação de afinidade é o processo pelo qual as células B produzem anticorpos com afinidade aumentada pelo antígeno durante o decurso de uma resposta imunitária. Com exposições repetidas ao mesmo antígeno, um hospedeiro produzirá anticorpos de afinidades sucessivamente maiores. Como o protótipo natural, a maturação de afinidade in vitro é baseada nos princípios de mutação e seleção. A maturação de afinidade in vitro tem sido usada com sucesso para otimizar anticorpos, construtos de anticorpos, variantes de anticorpos, construtos de anticorpos ou domínios de ligação. Mutações aleatórias dentro das CDRs são introduzidas usando radiação, mutagênese química ou PCR propensa a erros. Adicionalmente, a diversidade genética pode ser aumentada por embaralhamento de cadeias. Duas ou três rondas de mutação e seleção usando métodos de exibição como exibição em fagos resultam usualmente em anticorpos, fragmentos de anticorpos, variantes de anticorpos, construtos de anticorpos ou domínios de ligação com afinidades na baixa gama nanomolar.

[0034] Modificações de sequência de aminoácidos dos anticorpos (ou construtos de anticorpos) descritos aqui são também contempladas. Por exemplo pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de sequência de aminoácidos do anticorpo são preparados por síntese de peptídeos ou por introdução de mudanças de nucleotídeos apropriadas na molécula de ácido nucleico codificando os anticorpos. Todas as modificações das sequência de aminoácidos descritas em baixo devem resultar em anticorpos que retêm a atividade biológica desejada da molécula original não modificada (ligação a sBCMA).

[0035] O termo “aminoácido” ou “resíduo de aminoácido” se refere tipicamente a um aminoácido tendo sua definição reconhecida na técnica tal como um aminoácido selecionado do grupo consistindo em: alanina (Ala ou A); arginina (Arg ou R); asparagina (Asn ou N); ácido aspártico (Asp ou D); cisteína (Cys ou C); glutamina (GIn ou Q); ácido glutâmico (GIu ou E); glicina (GIy ou G); histidina (His ou H); isoleucina (He ou I): leucina (Leu ou L); lisina (Lys ou K); metionina (Met ou M); fenilalanina (Phe ou F); prolina (Pro ou P); serina (Ser ou S); treonina (Thr ou T); triptofano (Trp ou W); tirosina (Tyr ou Y); e valina (VaI ou V), embora aminoácidos modificados, sintéticos ou raros possam ser usados como desejado. Existem basicamente quatro classes diferentes de aminoácidos determinadas por diferentes cadeias laterais: (1) não polares e neutros (não carregados): Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Val (2) polares e neutros (não carregados): Asn, Cys (sendo somente ligeiramente polar), Gln, Ser, Thr, Trp (sendo somente ligeiramente polar), Tyr (3) ácidos e polares (negativamente carregados): Asp e Glu (4) básicos e polares (positivamente carregados): Arg, His, Lys

[0036] Os aminoácidos hidrofóbicos podem ser divididos de acordo com se têm cadeias laterais alifáticas ou aromáticas. Phe e Trp (sendo muito hidrofóbicos), Tyr e His (sendo menos hidrofóbicos) são classificados como aminoácidos aromáticos. Em rigor, alifático significa que a cadeia lateral contém somente átomos de hidrogênio e carbono. Por esta definição estrita, os aminoácidos com cadeias laterais alifáticas são alanina, isoleucina, leucina (também norleucina), prolina e valina. A cadeia lateral da alanina, sendo muito curta, significa que não é particularmente hidrofóbica, e a prolina tem uma geometria incomum que lhe dá papéis especiais nas proteínas. É frequentemente conveniente considerar a metionina na mesma categoria que a isoleucina, leucina e valina, embora contenha também um átomo de enxofre. O tema unificador é que estes aminoácidos contêm cadeias laterais amplamente não reativas e flexíveis. Os aminoácidos alanina, cisteína, glicina, prolina, serina e treonina são frequentemente agrupados em conjunto pela razão de serem todos pequenos em tamanho. Gly e Pro podem influenciar a orientação da cadeia.

[0037] As modificações de aminoácidos incluem, por exemplo, deleções de resíduos de, inserções de resíduos em e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos dos anticorpos monoclonais (construtos de anticorpos). Qualquer combinação de deleção, inserção e/ou substituição é feita para se chegar a um anticorpo monoclonal (construto de anticorpo) final, desde que o anticorpo final possua as características desejadas, p.ex., a atividade biológica da molécula parental não modificada (tal como ligação a sBCMA). As mudanças de aminoácidos podem também alterar processos pós-translacionais dos anticorpos, tais como mudança do número ou posição de locais de glicosilação.

[0038] Por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos podem ser inseridos, deletados e/ou substituídos em cada uma das CDRs (obviamente, dependendo do seu respectivo comprimento), enquanto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 25 aminoácidos podem ser inseridos, deletados e/ou substituídos em cada uma das FRs. As inserções de sequência de aminoácidos incluem também adições N- terminais e/ou C-terminais de aminoácidos variando em comprimento de, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos a polipeptídeos contendo mais do que 10, p.ex., cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequências de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos.

[0039] Os locais de maior interesse para modificações de aminoácidos, em particular para substituições de aminoácidos, incluem as regiões hipervariáveis, em particular as CDRs individuais da cadeia pesada e/ou leve,

mas alterações de FR na cadeia pesada e/ou leve são também contempladas aqui. As substituições podem ser substituições conservativas como descrito aqui. Preferencialmente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos podem estar substituídos em uma CDR, enquanto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 25 aminoácidos podem estar substituídos nas regiões estruturais (FRs), dependendo do comprimento da CDR ou FR, respectivamente. Por exemplo, se uma sequência de CDR englobar 6 aminoácidos, se prevê que um, dois ou três destes aminoácidos sejam substituídos. Similarmente, se uma sequência de CDR englobar 15 aminoácidos, se prevê que um, dois, três, quatro, cinco ou seis destes aminoácidos sejam substituídos.

[0040] Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões dentro do anticorpo monoclonal (construto de anticorpo) que são localizações preferenciais para mutagênese é chamado “mutagênese de rastreamento de alanina” e é descrito, p.ex., em Cunningham B.C. e Wells J.A. (Science. 2 jun 1989; 244 (4908): 1081-5). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos dentro do anticorpo é/são identificado(s) (p.ex., resíduos carregados tais como Arg, His, Lys, Asp e Glu) e substituído(s) por um aminoácido neutro ou não polar (o mais preferencialmente alanina ou polialanina) para afetar a interação do(s) aminoácido(s) respectivo(s) com o epítopo da proteína alvo. O rastreamento de alanina é uma técnica usada para determinar a contribuição de um resíduo específico para a estabilidade ou função de dada proteína. A alanina é usada devido a seu grupo funcional metila, quimicamente inerte, não volumoso que mimetiza todavia as preferências de estrutura secundária que muitos dos outros aminoácidos possuem. Por vezes, aminoácidos volumosos tais como valina ou leucina podem ser usados em casos onde a conservação do tamanho de resíduos mutados é necessária. Esta técnica pode ser também útil para determinar se a cadeia lateral de um resíduo específico desempenha um papel significativo na bioatividade. O rastreamento de alanina é usualmente alcançada por mutagênese sítio-dirigida ou aleatoriamente por criação de uma biblioteca de PCR. Além do mais, métodos computacionais para estimar parâmetros termodinâmicos com base em substituições teóricas de alanina foram desenvolvidos. Os dados podem ser testados por Espectroscopia de IR/RMN, métodos matemáticos, bioensaios, etc.

[0041] Aquelas localizações de aminoácido demonstrando sensibilidade funcional às substituições (como determinado, p.ex., por rastreamento de alanina) podem ser depois refinadas por introdução de variantes adicionais ou outras nos, ou para os, locais de substituição. Assim, enquanto o local ou região para introduzir uma variação de sequência de aminoácidos é predeterminada, a natureza da mutação per se não necessita de ser predeterminada. Por exemplo, para analisar ou otimizar o desempenho de uma mutação em um dado local, mutagênese por rastreamento de alanina ou aleatória pode ser conduzida em um códon ou região alvo, e as variantes do anticorpo monoclonal/construto de anticorpo expressas são rastreadas quanto à combinação ótima de atividade desejada. Técnicas para fazer mutações de substituição em locais predeterminados no DNA tendo uma sequência conhecida são bem conhecidas, por exemplo, mutagênese com iniciador M13 e mutagênese por PCR. O rastreamento dos mutantes é feito,

p.ex., usando ensaios de atividade de ligação ao antígeno (p.ex., sBCMA) como descrito aqui.

[0042] Em geral, se os aminoácidos forem substituídos em uma ou mais ou todas as CDRs da cadeia pesada e/ou leve/regiões variáveis, se prevê que a sequência “substituída” assim obtida seja pelo menos 60% ou 65%, mais preferencialmente 70% ou 75%, ainda mais preferencialmente 80% ou 85% e, particularmente preferencialmente, 90% ou 95% idêntica/homóloga/similar à sequência de CDR “original” ou “parental”. Isto significa que o grau de identidade/homologia/similaridade entre a sequência original e a substituída depende do comprimento da CDR. Por exemplo, uma CDR tendo 5 aminoácidos no total e compreendendo uma substituição de aminoácidos é 80% idêntica à sequência de CDR “original” ou “parental”, enquanto uma CDR tendo 10 aminoácidos no total e compreendendo uma substituição de aminoácido é 90% idêntica à sequência de CDR “original” ou “parental”. Conformemente, as CDRs substituídas do anticorpo monoclonal da invenção podem ter diferentes graus de identidade com suas sequências originais, p.ex., a CDRL1 pode ter 80%, enquanto a CDRL3 pode ter 90%, de homologia. As mesmas considerações se aplicam às regiões estruturais e às regiões VH e VL inteiras.

[0043] Uma “CDR variante” é uma CDR com uma homologia, similaridade ou identidade de sequências especificada com a CDR parental da invenção e partilha função biológica com a CDR parental, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da especificidade e/ou atividade da CDR parental.

Geralmente, a homologia, similaridade ou identidade de aminoácidos entre CDRs variantes individuais é pelo menos 60% em relação às sequências parentais ilustradas aqui e, mais tipicamente, com homologias, similaridades ou identidades crescentes de pelo menos 65% ou 70%, preferencialmente pelo menos 75% ou 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e, o mais preferencialmente, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e quase 100%. O mesmo se aplica a “VH variante” e “VL variante”. De acordo com uma modalidade, as variações de sequência dentro de uma “VH variante” e/ou uma “VL variante” não se prolongam às CDRs. A presente invenção está consequentemente dirigida a um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) como definido aqui, compreendendo as sequências de VH e VL tendo uma certa homologia/identidade/similaridade de sequências (ver acima) com as sequências específicas como definido aqui (as VH e VL “parentais”), em que as sequências de CDR são 100% idênticas às sequências de CDR específicas como definido aqui (as CDRs “parentais”).

[0044] Substituições (ou reposições) preferenciais são substituições conservativas. No entanto, qualquer substituição (incluindo substituições não conservativas ou uma ou mais das “substituições exemplificativas” listadas na Tabela 1, em baixo) é prevista, desde que o anticorpo monoclonal (construto de anticorpo) retenha sua capacidade de se ligar a sBCMA, e/ou contanto que suas sequências de CDRs, FRs, VH e/ou VL tenham um grau de identidade com a sequência original ou parental de pelo menos 60% ou 65%, mais preferencialmente pelo menos 70% ou 75%, ainda mais preferencialmente pelo menos 80% ou 85% e, particularmente preferencialmente, pelo menos 90% ou 95%.

[0045] Uma substituição conservativa (também chamada uma mutação conservativa ou uma substituição conservativa) é uma substituição de aminoácidos que muda um dado aminoácido para um aminoácido diferente com propriedades bioquímicas similares (p.ex., carga, hidrofobicidade, tamanho). As substituições conservativas em proteínas têm frequentemente um efeito mais pequeno na função da proteína do que substituições não conservativas. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 1. Substituições conservativas exemplificativas são mostradas como “substituições exemplificativas”. Se tais substituições resultarem em uma mudança na atividade biológica, então mudanças mais substanciais, como adicionalmente descrito aqui em referência a classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos rastreados quanto a uma característica desejada. Tabela 1: Substituições de aminoácidos (aa = aminoácido) AA Substituições Substituições original conservativas Exemplificativas Ala (A) AA pequenos Gly, Ser, Thr Arg (R) AA polares, em Lys, Gln, Asn particular Lys Asn (N) AA polares, em Asp, Gln, His, particular Asp Lys, Arg Asp (D) Glu ou outros aa Glu, Asn polares, em particular Asn Cys (C) AA pequenos Ser, Ala

Gln (Q) AA polares, em Glu, Asn particular Glu Glu (E) Asp ou outros aa Asp, Gln polares, em particular Gln Gly (G) AA pequenos, tais Ala como Ala His (H) Asn, Gln, Arg, Lys, Tyr Ile (I) AA hidrofóbicos, em Ala, Val, Met, particular Leu, Phe alifáticos Leu (L) AA hidrofóbicos, em Norleucina, Ile, particular Ala, Val, Met alifáticos Lys (K) AA polares, em Arg, Gln, Asn particular Arg Met (M) AA hidrofóbicos, em Leu, Ala, Ile, particular Val, Phe alifáticos Phe (F) Aa aromáticos ou Tyr, Trp, Leu, hidrofóbicos, em Val, Ile, Ala particular Tyr Pro (P) AA pequenos Ala Ser (S) AA polares ou Thr pequenos, em particular Thr Thr (T) AA polares, em Ser particular Ser Trp (W) AA aromáticos Tyr, Phe

Tyr (Y) AA aromáticos, em Phe, Trp, Thr, particular Phe Ser Val (V) AA hidrofóbicos, em Leu, Ile, Ala, particular Met, Phe alifáticos

[0046] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo monoclonal (construto de anticorpo) da presente invenção são alcançadas por seleção de substituições que diferem significativamente em seu efeito na manutenção (a) da estrutura do esqueleto de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo ou (c) do volume da cadeia lateral. As substituições não conservativas implicarão usualmente troca de um membro de uma das classes de aminoácidos definidas acima (tais como polares, neutros, ácidos, básicos, alifáticos, aromáticos, pequenos...) por outra classe. Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidante do anticorpo.

[0047] A identidade, homologia e/ou similaridade de sequências de sequências de aminoácidos é determinada por uso de técnicas padrão conhecidas na técnica, incluindo o, mas não se limitando ao, algoritmo de identidade de sequências local de Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2: 482, o algoritmo de alinhamento de identidade de sequências de Needleman ed Wunsch (J Mol Biol. Mar 1970; 48 (3): 443-53), o método de pesquisa por similaridade de Pearson e Lipman (Proc Natl Acad Sci USA. Abr 1988; 85 (8):

2444-8), implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), o programa de sequências Best Fit descrito por Devereux et al. (Nucleic Acids Res. 11 jan 1984; 12 (1 Pt 1): 387-95), preferencialmente usando as definições padrão, ou por inspeção. Se prevê que a percentagem de identidade seja calculada por FastDB com base nos seguintes parâmetros: penalidade de incompatibilidade de 1; penalidade de lacuna de 1; penalidade de tamanho de lacuna de 0,33; e penalidade de união de 30. Ver também “Current Methods in Sequence Comparison and Analysis”, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

[0048] Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. PILEUP cria um alinhamento de sequências múltiplas a partir de um grupo de sequências relacionadas usando alinhamentos par a par, progressivos. Pode também representar graficamente uma árvore mostrado as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle (J Mol Evol. 1987; 25 (4): 351-60); o método é similar àquele descrito por Higgins e Sharp (Comput Appl Biosci. 5 abr 1989; 5 (2): 151-3). Parâmetros de PILEUP úteis incluem um peso de lacuna padrão de 3,00, um comprimento de lacuna padrão de 0,10 e lacunas de extremidade ponderada.

[0049] Outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito em: Altschul et al. (J Mol Biol. 5 out 1990; 215 (3): 403-10.); Altschul et al., (Nucleic Acids Res. 1 set 1997; 25 (17): 3389-402); e Karlin e Altschul (Proc Natl

Acad Sci U S A. 15 jun 1993; 90 (12): 5873-7). Um programa BLAST particularmente útil é o programa WU-Blast-2 que foi obtido a partir de Altschul et al., (Methods Enzymol. 1996; 266: 460-80). WU-Blast-2 usa vários parâmetros de pesquisa, a maioria dos quais é definida nos valores padrão. Os parâmetros ajustáveis são definidos com os seguintes valores: período de sobreposição = 1, fração de sobreposição = 0,125, limite de palavra (T) = II. Os parâmetros HSP S e HSP S2 são valores dinâmicos e são estabelecidos pelo próprio programa dependendo da composição da sequência particular e composição da base de dados particular contra a qual a sequência de interesse está sendo pesquisada; no entanto, os valores podem ser ajustados para aumentar a sensibilidade.

[0050] Um algoritmo útil adicional é gapped BLAST como relatado por Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 1 set 1997; 25 (17): 3389-402). Gapped BLAST usa pontuações de substituição BLOSUM-62; parâmetro T limite definido para 9; o método de dois acertos para desencadear extensões sem lacuna, cobra a comprimentos de lacuna de k um custo de 10+k; Xu definido para 16 e Xg definido para 40 para estágio de pesquisa de bases de dados e para 67 para estágio de saída dos algoritmos. Os alinhamentos sem lacunas são desencadeados por uma pontuação correspondendo a cerca de 22 bits.

[0051] Em linha aqui, o termo “percentagem (%) de identidade/homologia/similaridade de sequências de ácidos nucleicos” no que diz respeito à sequência de ácidos nucleicos codificando os anticorpos monoclonais (construtos de anticorpos) identificados aqui é definido como a percentagem de resíduos de nucleotídeos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de nucleotídeos na sequência codificante do anticorpo. Um método para alinhar duas sequências e deste modo determinar sua homologia usa o módulo BLASTN de WU-Blast2 definido para os parâmetros padrão, com extensão de sobreposição e fração de sobreposição definidas para 1 e 0,125, respectivamente. Geralmente, a homologia, similaridade ou identidade de sequências de ácidos nucleicos entre as sequências de nucleotídeos codificando CDRs variantes individuais e as sequências de nucleotídeos ilustradas aqui são pelo menos 60% e, mais tipicamente, com homologias, similaridades ou identidades crescentes de pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% e quase 100%. Novamente, o mesmo se aplica à sequência de ácidos nucleicos codificando a “VH variante” e/ou “VL variante”.

[0052] O termo “construto de anticorpo” se refere a uma molécula na qual a estrutura e/ou função é/são baseada(s) na estrutura e/ou função de um anticorpo, p.ex., de uma molécula de imunoglobulina de comprimento total. Um construto de anticorpo se liga consequentemente imunoespecificamente ao seu alvo ou antígeno e/ou compreende a região variável de cadeia pesada (VH) e/ou a região variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo ou compreende domínios derivados deste. Um construto de anticorpo de acordo com a invenção compreende os requisitos estruturais mínimos de um anticorpo que permitem a ligação imunoespecífica ao alvo. Este requisito mínimo pode, p.ex., ser definido pela presença de pelo menos três CDRs de cadeia leve (i.e., CDR1, CDR2 e CDR3 da região VL) e/ou três CDRs de cadeia pesada (i.e., CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH), preferencialmente todas as seis CDRs. Um construto de anticorpo pode ser consequentemente caracterizado pela presença de três ou seis CDRs em um domínio de ligação, e o perito sabe onde (em que ordem) essas CDRs estão localizadas dentro do domínio de ligação.

[0053] O termo “construto de anticorpo” de acordo com a presente invenção podem também compreender fragmentos de anticorpos de comprimento total, tais como VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, cadeia leve (VL-CL), Fd (VH-CH1), cadeia pesada, Fab, Fab´, F(ab´)2 ou “r IgG” (“meio anticorpo” consistindo em uma cadeia pesada e uma cadeia leve). Um fragmento de anticorpo pode ser produzido por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Os construtos de anticorpos de acordo com a invenção podem também compreender fragmentos modificados de anticorpos, também chamados variantes de anticorpos ou derivados de anticorpos. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, scFv, di-scFv ou bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-fecho, scFab, Fab2, Fab3, diacorpos, diacorpos de cadeia única, diacorpos em tandem (Tandabs), di-scFv em tandem, tri-scFv em tandem, “minicorpos” exemplificados por uma estrutura que é como se segue: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2, ((scFv)2-CH3 + CH3), ((scFv)2-CH3) ou (scFv-CH3-scFv)2, multicorpos tais como triacorpos ou tetracorpos e anticorpos de domínio único tais como nanocorpos ou anticorpos de domínio variável único compreendendo meramente uma região variável, que poderia ser VHH, VH ou VL, que se liga especificamente a um antígeno ou alvo independentemente de outras regiões ou domínios variáveis. Formatos possíveis adicionais dos construtos de anticorpos de acordo com a invenção são corpos cruzados, maxicorpos, construtos de Fc heteros, construtos de Fc mono e construtos de scFc. Exemplos destes formatos serão descritos doravante.

[0054] Além do mais, a definição do termo “construto de anticorpo” inclui construtos bivalentes e polivalentes/multivalentes bem como construtos biespecíficos e poliespecíficos/multiespecíficos, que se ligam especificamente a duas, três ou mais estruturas antigênicas, através de domínios de ligação distintos. Um construto de anticorpo pode ter mais valências de ligação do que especificidades, p.ex., no caso onde tem dois domínios de ligação para um alvo e um domínio de ligação para outro alvo (tal como CD3), ou vice-versa, caso esse em que o construto é trivalente e biespecífico. Em geral, o termo “biespecífico” inclui o significado de que um construto de anticorpo se liga a (pelo menos) dois antígenos diferentes.

[0055] Além disso, a definição do termo “construto de anticorpo” inclui moléculas consistindo em somente uma cadeia de polipeptídeos bem como moléculas consistindo em duas, três, quatro ou mais cadeias de polipeptídeos, cadeias essas que podem ser idênticas (homodímeros, homotrímeros ou homo oligômeros) ou diferentes (heterodímero, heterotrímero ou hetero-oligômero). Exemplos dos anticorpos identificados acima e seus fragmentos, variantes, derivados e construtos de anticorpos derivados deles são descritos inter alia em Harlow e Lane, Antibodies: A laboratory manual, CSHL Press (1988); Kontermann e Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2ª ed. 2010; e Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.

[0056] O termo “domínio de ligação” ou “domínio que se liga a...” caracteriza em conexão com a presente invenção um domínio do anticorpo/construto de anticorpo que se liga imunoespecificamente a/interage com/reconhece um epítopo no alvo ou antígeno (aqui: sBCMA). A estrutura e função de um domínio de ligação é/são baseada(s) na estrutura e/ou função de um anticorpo, p.ex., de uma molécula de imunoglobulina de comprimento total. O “domínio de ligação” ou “domínio que se liga a...” pode consequentemente compreender os requisitos estruturais mínimos de um anticorpo que permitem a ligação imunoespecífica ao alvo. Este requisito estrutural mínimo de um domínio de ligação pode, p.ex., ser definido pela presença de pelo menos três CDRs de cadeia leve (i.e., CDR1, CDR2 e CDR3 da região VL) e/ou de três CDRs de cadeia pesada (i.e., CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH), preferencialmente todas as seis CDRs. Um “domínio que se liga a” (ou um “domínio de ligação”) pode compreender tipicamente uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH); no entanto, não tem de compreender ambas, mas pode compreender somente uma de VH ou VL. Os fragmentos Fd, por exemplo, retêm frequentemente alguma função de ligação ao antígeno do domínio de ligação ao antígeno intacto.

[0057] Exemplos do formato de um “domínio que se liga a” (ou um “domínio de ligação”) ou construtos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos de comprimento total, fragmentos de anticorpos de comprimento total (tais como VH, VHH, VL), (s)dAb, Fv, cadeia leve (VL-CL), Fd (VH- CH1), cadeia pesada, Fab, Fab´, F(ab´)2 ou “r IgG” (“meio anticorpo”)), variantes ou derivados de anticorpos tais como scFv, di-scFv ou bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-fecho, scFab, Fab2, Fab3, diacorpos, diacorpos de cadeia única, diacorpos em tandem (Tandabs), di-scFv em tandem, tri-scFv em tandem, “minicorpos” (selecionados de formatos tais como (VH-VL- CH3)2, (scFv-CH3)2, ((scFv)2-CH3 + CH3)), ((scFv)2-CH3) ou (scFv-CH3-scFv)2, multicorpos tais como triacorpos ou tetracorpos e anticorpos de domínio único tais como nanocorpos ou anticorpos de domínio variável único compreendendo meramente uma região variável, que poderia ser VHH, VH ou VL. Exemplos adicionais do formato de um “domínio que se liga a” (ou um “domínio de ligação”) incluem (1) um fragmento ou variante de anticorpo compreendendo VL, VH, CL e CH1 (tal como Fab); (2) um fragmento ou variante de anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab ligados (tal como um F(ab´)2); (3) um fragmento ou variante de anticorpo compreendendo VH e CH1 (tal como Fd); (4) um fragmento ou variante de anticorpo compreendendo VL e CL (tal como a cadeia leve); (5) um fragmento ou variante de anticorpo compreendendo VL e VH (tal como Fv); (5) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que tem um domínio VH; (6) uma variante de anticorpo compreendendo pelo menos três CDRs isolados da cadeia pesada e/ou leve; e (7) um Fv de cadeia única (scFv). Exemplos de modalidades de construtos de anticorpos ou domínios de ligação de acordo com a invenção são, p.ex., descritos em WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, WO2014/144722, WO 2014/151910 e WO 2015/048272.

[0058] Em um scFv, a região VH e a região VL estão arranjadas na ordem VH-VL ou VL-VH (do terminal N ao C). Se prevê que as regiões VH e VL sejam conectadas através de um ligante, preferencialmente um ligante de peptídeo. De acordo com uma modalidade, a região VH está posicionada N- terminalmente do ligante, e a região VL está posicionada C- terminalmente do ligante. É além do mais possível que dois domínios de scFv do construto de anticorpo estejam conectados através de um ligante, preferencialmente um ligante de peptídeo. O construto de anticorpo pode, p.ex., compreender os domínios na ordem (do terminal N ao terminal C) primeiro domínio - ligante - segundo domínio. A ordem inversa (segundo domínio - ligante - primeiro domínio) é também possível.

[0059] Os ligantes são preferencialmente ligantes de peptídeo, mais preferencialmente ligantes de peptídeo curtos. De acordo com a presente invenção, um “ligante de peptídeo” compreende uma sequência de aminoácidos que conecta as sequências de aminoácidos de um domínio com outro domínio (variável e/ou de ligação) (p.ex., um domínio variável ou um domínio de ligação) do construto de anticorpo. Uma característica técnica essencial de tal ligante de peptídeo é que não compreende qualquer atividade de polimerização. Entre os ligantes de peptídeo adequados estão aqueles descritos nas Patentes dos E.U.A. 4,751,180 e 4,935,233 ou WO 88/09344. Os ligantes de peptídeo podem ser também usados para anexar outros domínios ou módulos ou regiões (tais como domínios prolongadores da meia-vida) ao anticorpo/construto de anticorpo da invenção. No presente contexto, um ligante “curto” tem entre 2 e 50 aminoácidos, preferencialmente entre 3 e 35, entre 4 e 30, entre 5 e 25, entre 6 e 20 ou entre 6 e 17 aminoácidos. O ligante entre duas regiões variáveis de um domínio de ligação pode ter um comprimento diferente (p.ex., pode ser mais longo) do que o ligante entre os dois domínios de ligação. Por exemplo, o ligante entre duas regiões variáveis de um domínio de ligação pode ter um comprimento entre 7 e 15 aminoácidos, preferencialmente entre 9 e 13, e o ligante entre os dois domínios de ligação pode ter um comprimento entre 3 e 10 aminoácidos, preferencialmente entre 4 e 8. É adicionalmente previsto que os ligantes de peptídeo sejam ligantes de glicina/serina. A maioria dos aminoácidos em ligantes de glicina/serina é selecionada de glicina e serina.

[0060] No caso de ser usado um ligante para conectar dois domínios de ligação com diferentes especificidades de ligação, este ligante tem preferencialmente um comprimento e sequência suficientes para assegurar que cada um dos domínios possa, independentemente um do outro, reter suas especificidades de ligação diferenciais. Para ligantes de peptídeo que conectam pelo menos dois domínios de ligação (ou duas regiões variáveis formando um domínio de ligação) em um construto de anticorpo se preveem aqueles ligantes de peptídeo que compreendem somente um pequeno número de resíduos de aminoácidos, p.ex., 12 resíduos de aminoácidos ou menos. Assim, ligantes de peptídeo de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 resíduos de aminoácidos são preferenciais. Um ligante de peptídeo previsto com menos do que 5 aminoácidos compreende 4, 3, 2 ou um aminoácido(s), em que ligantes ricos em Gly são preferenciais. Um ligante de “aminoácido único” no contexto do referido “ligante de peptídeo” é Gly. Outra modalidade de um ligante de peptídeo é caracterizada pela sequência de aminoácidos Gly4Ser, ou seus polímeros, i.e., (Gly4Ser)x, em que x é um número inteiro de 1 ou maior (p.ex., 2 ou 3). As características dos referidos ligantes de peptídeo são conhecidas na técnica e são descritas, p.ex.,

em Dall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) e Raag e Whitlow (FASEB (1995) 9 (1), 73-80). Ligantes de peptídeo que não promovam quaisquer estruturas secundárias são preferenciais. A ligação dos referidos domínios entre si pode ser proporcionada, p.ex., por manipulação genética. Métodos para preparação de construtos de cadeia única biespecíficos fundidos e operacionalmente ligados e expressão dos mesmos em células de mamífero ou bactérias são bem conhecidos na técnica (p.ex., WO 99/54440 ou Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2001).

[0061] De acordo com uma modalidade da invenção, um construto de anticorpo da invenção que se liga a sBCMA pode ser um “construto de anticorpo de cadeia única”. Embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante artificial - como descrito anteriormente - que permite que eles sejam preparados como uma cadeia de proteína única na qual as regiões VL e VH emparelham para formar uma molécula monovalente; ver, p.ex., Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-

5883. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas dos peritos na técnica, e os fragmentos são avaliados quanto à função da mesma maneira como o são anticorpos de comprimento total ou IgGs. Um fragmento variável de cadeia única (scFv) é consequentemente uma proteína de fusão da região variável da cadeia pesada (VH) e da cadeia leve (VL) de imunoglobulinas, usualmente conectada com um curto ligante de peptídeo. O ligante é usualmente rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou também treonina para solubilidade, e pode conectar o terminal N do VH ao terminal C do VL ou vice-versa. Esta proteína retém a especificidade da imunoglobulina original, apesar da remoção das regiões constantes e introdução do ligante.

[0062] Os construtos de anticorpos denominados “anticorpos de domínio único” compreendem uma região variável de anticorpo (monomérica) que é capaz de se ligar seletivamente a um antígeno específico, independentemente de outras regiões variáveis. Os primeiros anticorpos de domínio único foram manipulados a partir de anticorpos de cadeia pesada encontrados em camelídeos, e estes são chamados fragmentos VHH. Peixes cartilaginosos têm também anticorpos de cadeia pesada (IgNAR) a dos quais anticorpos de domínio único chamados fragmentos VNAR podem ser obtidos. Uma abordagem alternativa é dividir as regiões variáveis diméricas de imunoglobulinas comuns em monômeros, consequentemente obtendo VH ou VL como um Ab de domínio único. Embora a maioria da investigação em anticorpos de domínio única seja correntemente baseada em regiões variáveis de cadeia pesada foi também mostrado que nanocorpos derivados de cadeias leves se ligam especificamente a epítopos alvo. Exemplos de anticorpos de domínio único são chamados sdAb, nanocorpos ou anticorpos de domínio variável único. Um (mAb de domínio único)2 é consequentemente um construto de anticorpo monoclonal composto por (pelo menos) dois construtos de anticorpos monoclonais de domínio único, que são individualmente selecionados do grupo compreendendo VH, VL, VHH e VNAR. O ligante está preferencialmente na forma de um ligante de peptídeo. Similarmente, um “scFv-mAb de domínio único” é um construto de anticorpo monoclonal composto por pelo menos um anticorpo de domínio único como descrito acima e uma molécula de scFv como descrito acima. Novamente, o ligante está preferencialmente na forma de um ligante de peptídeo.

[0063] De acordo com uma modalidade, o anticorpo ou construto de anticorpo que se liga a sBCMA está na forma de um ou mais polipeptídeos ou na forma de proteínas. Adicionalmente às partes proteináceas, tais polipeptídeos ou proteínas podem incluir partes não proteináceas (p.ex., ligantes químicos ou agente reticulantes químicos tais como glutaraldeído).

[0064] Os peptídeos são cadeias curtas de monômeros de aminoácidos ligados por ligações covalentes de peptídeo (amida). Consequentemente, os peptídeos se enquadram nas amplas classes químicas de oligômeros e polímeros biológicos. Os aminoácidos que são parte de uma cadeia de peptídeos ou polipeptídeos são denominados “resíduos” e podem ser consecutivamente numerados. Todos os peptídeos exceto peptídeos cíclicos têm um resíduo N-terminal em uma extremidade e um resíduo C-terminal na outra extremidade do peptídeo. Um oligopeptídeo consiste somente em alguns aminoácidos (usualmente entre dois e vinte). Um polipeptídeo é uma cadeia de peptídeos mais longa, contínua e não ramificada. Os péptidos são distinguidos das proteínas com base no tamanho e, como uma referência arbitrária, podem ser entendidos como contendo aproximadamente 50 ou menos aminoácidos. As proteínas consistem em um ou mais polipeptídeos, usualmente arranjados de um modo biologicamente funcional. Embora os aspectos das técnicas de lab aplicadas a peptídeos versus polipeptídeos e proteínas difiram (p.ex., os específicos de eletroforese, cromatografia, etc.), as fronteiras de tamanho que distinguem os peptídeos dos polipeptídeos e proteínas não são absolutas. Portanto, no contexto da presente invenção, os termos “peptídeo”, “polipeptídeo” e “proteína” podem ser usados indistintamente, e o termo “polipeptídeo” é frequentemente preferencial.

[0065] Os polipeptídeos podem adicionalmente formar multímeros tais como dímeros, trímeros e oligômeros superiores, i.e., que consistem em mais do que uma molécula de polipeptídeo. As moléculas de polipeptídeo formando tais dímeros, trímeros, etc. podem ser idênticas ou não idênticas. As estruturas correspondentes de ordem maior de tais multímeros são, consequentemente, denominadas homo- ou heterodímeros, homo- ou heterotrímeros, etc. Um exemplo de um heteromultímero é uma molécula de anticorpo ou imunoglobulina, que, em sua forma ocorrendo naturalmente, consiste em duas cadeias de polipeptídeos leves idênticas e duas cadeias de polipeptídeos pesadas idênticas. Os termos “peptídeo”, “polipeptídeo” e “proteína” se referem também a peptídeos/polipeptídeos/proteínas naturalmente modificados em que a modificação é alcançada, p.ex., por modificações pós-translacionais como glicosilação, acetilação, fosforilação e similares. Um “peptídeo”, “polipeptídeo” ou “proteína” quando referido aqui pode ser também quimicamente modificado tal como peguilado. Tais modificações são bem conhecidas na técnica e descritas doravante.

[0066] Os termos “se liga (especificamente ou imunoespecificamente) a”, reconhece (especificamente ou imunoespecificamente)” ou “reagente (especificamente ou imunoespecificamente) com” significa de acordo com esta invenção que um anticorpo, construto de anticorpo ou um domínio de ligação interage ou interage (imuno- )especificamente com um dado epítopo na molécula alvo (antígeno), aqui: sBCMA. Esta interação ou associação ocorre mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração, com maior afinidade ou com alguma combinação dos acima mencionados, para um epítopo no alvo específico do que para substâncias alternativas (moléculas não alvo). Devido à similaridade de sequências entre proteínas homólogas em espécies diferentes, um anticorpo, construto de anticorpo ou um domínio de ligação que se liga imunoespecificamente ao seu alvo (tal como um alvo humano) pode, no entanto, reagir de modo cruzado com moléculas alvo homólogas de espécies diferentes (tal como de primatas não humanos). O termo “ligação específica/imunoespecífica” pode consequentemente incluir a ligação de um anticorpo, construto de anticorpo ou domínio de ligação a epítopos ou epítopos estruturalmente relacionados em mais do que uma espécie.

[0067] No contexto da presente invenção, o termo “epítopo” se refere à parte ou região do antígeno que é reconhecida/imunoespecificamente reconhecida pelo domínio de ligação, anticorpo ou construto de anticorpo. Um “epítopo” é antigênico e, assim, o termo epítopo é por vezes também referido como “estrutura antigênica” ou “determinante antigênico”. A parte do domínio de ligação, anticorpo ou construto de anticorpo que se liga ao epítopo é chamada um parátopo. Se acredita que a ligação específica é alcançada por motivos específicos na sequência de aminoácidos do domínio de ligação, anticorpo ou construto de anticorpo e do antígeno. Assim, a ligação é alcançada em resultado de sua estrutura primária, secundária e/ou terciária bem como o resultado de modificações secundárias potenciais das referidas estruturas. A interação específica do parátopo com seu determinante antigênico pode resultar em uma ligação simples do referido local ao antígeno. Em alguns casos, a interação específica pode alternativamente ou adicionalmente resultar na iniciação de um sinal, p.ex., devido à indução de uma mudança da conformação do antígeno, uma oligomerização do antígeno, etc.

[0068] Os epítopos dos antígenos de proteínas são divididos em duas categorias, epítopos conformacionais e epítopos lineares, com base em sua estrutura e interação com o parátopo. Um epítopo conformacional é composto por seções descontínuas da sequência de aminoácidos do antígeno. Estes epítopos interagem com o parátopo com base nas características tridimensionais da superfície e forma ou estrutura terciária (dobramento) do antígeno. Os métodos de determinação da conformação de epítopos incluem, mas não estão limitados a, cristalografia de raios-X, espectroscopia por ressonância magnética nuclear bidimensional (2D-NMR) e espectroscopia por marcação giratória sítio-dirigida e ressonância paramagnética eletrônica (EPR). Em contraste, os epítopos lineares interagem com o parátopo com base em sua estrutura primária. Um epítopo linear é formado por uma sequência contínua de aminoácidos do antígeno e inclui tipicamente pelo menos 3 ou pelo menos 4 e, mais usualmente,

pelo menos 5 ou pelo menos 6 ou pelo menos 7, por exemplo, cerca de 8 a cerca de 10 aminoácidos em uma sequência exclusiva.

[0069] Um método para mapeamento de epítopos de BCMA é descrito no que se segue: Uma região predefinida (usualmente um trecho de aminoácidos contíguos) dentro do domínio extracelular da proteína BCMA humana é trocada/substituída por uma região correspondente de BCMA de outra espécie (tal como camundongo, mas outras espécies são também concebíveis, desde que o anticorpo não reaja de modo cruzado com a espécie). Estas quimeras BCMA humano/BCMA de camundongo (ou outra espécie) podem ser expressas na superfície de células hospedeiras (tais como células CHO). A ligação do anticorpo ou construto de anticorpo pode ser testada através de análise FACS. Quando a ligação do anticorpo ou construto de anticorpo à molécula quimérica é inteiramente abolida, ou quando uma diminuição significativa da ligação é observada, pode ser concluído que a região de BCMA humana que foi removida desta molécula quimérica é relevante para o reconhecimento imunoespecífico de epítopo-parátopo. A referida diminuição na ligação é preferencialmente pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%; mais preferencialmente pelo menos 60%, 70% ou 80% e, o mais preferencialmente, 90%, 95% ou mesmo 100% em comparação com a ligação à BCMA humana (de tipo selvagem), por meio do que a ligação à BCMA humana é definido como sendo 100%. Alternativamente, a análise de mapeamento de epítopos descrita acima pode ser modificada por introdução de uma ou mais mutações pontuais na sequência de BCMA. Estas mutações pontuais podem, p.ex., refletir as diferenças entre BCMA humano e BCMA de camundongo (ou outra espécie).

[0070] Um método adicional para determinar a contribuição de um resíduo específico de um antígeno alvo para o reconhecimento por um anticorpo, construto de anticorpo ou domínio de ligação é rastreamento de alanina (ver, p.ex., Morrison KL & Weiss GA. Curr Opin Chem Biol. Jun 2001; 5 (3): 302-7), em que cada resíduo a ser analisado é substituído por alanina, p.ex., através de mutagênese sítio- dirigida. A alanina é usada devido a seu grupo funcional metila, quimicamente inerte, não volumoso que mimetiza todavia as referências de estrutura secundária que muitos dos outros aminoácidos possuem. Por vezes, aminoácidos volumosos tais como valina ou leucina podem ser usados em casos onde a conservação do tamanho de resíduos mutados é desejada.

[0071] A interação entre o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) e o epítopo do antígeno alvo implica que as regiões variáveis exibem afinidade apreciável ou significativa pelo epítopo/pelo antígeno alvo (aqui: sBCMA) e, geralmente, não exibe afinidade significativa por proteínas ou antígenos sem ser o antígeno alvo (aqui: sBCMA) - não obstante a reatividade cruzada discutida acima com alvos homólogos, p.ex., de outras espécies. “Afinidade significativa” inclui ligação com uma afinidade (constante de dissociação, KD) de cerca de ≤10-6 M. Preferencialmente, a ligação é considerada específica quando a afinidade de ligação é cerca de ≤10-7 M, ≤10-8 M, ≤10-9 M ou ≤10-10 M. Se prevê adicionalmente que os anticorpos monoclonais (ou construtos de anticorpos) da presente invenção tenham uma afinidade (KD) por sBCMA de cerca de ≤10-7 M, ≤10-8 M, ≤10-9 M ou ≤10-10 M. Estes valores são preferencialmente medidos em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície, tal como um ensaio Biacore. Ver Exemplo 3.

[0072] Se um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) reage (imuno-)especificamente com ou se liga a um alvo pode ser testado prontamente, p.ex., por comparação da afinidade do referido anticorpo à sua proteína ou antígeno alvo desejado com a afinidade do referido anticorpo por proteínas ou antígenos não alvo (aqui: proteínas sem ser sBCMA). Preferencialmente, um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da invenção não se liga significativamente a proteínas ou antígenos sem ser sBCMA - a não ser que qualquer(quaisquer) domínio(s) de ligação adicional(ais) dirigido(s) contra um alvo adicional seja/sejam deliberadamente introduzido(s) no anticorpo/construto de anticorpo da invenção. O termo “não se liga significativamente” significa que um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da presente invenção não se liga a uma proteína ou antígeno sem ser sBCMA. O construto de anticorpo mostra consequentemente reatividade de ≤30%, preferencialmente ≤20%, mais preferencialmente ≤10%, particularmente preferencialmente ≤9%, ≤8%, ≤7%, ≤6%, ≤5%, ≤4%, ≤3 %, ≤2% ou ≤1% com proteínas ou antígenos sem ser sBCMA, por meio do que a ligação a sBCMA é definida como sendo 100%. A “reatividade” pode, p.ex., ser expressa em um valor de afinidade (ver acima). Se prevê que o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da invenção não se liga a ou não se liga significativamente a, interage com, reconhece, se liga imunoespecificamente a ou reage de modo cruzado com BAFF-R humano e/ou TACI humano.

[0073] O anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da presente invenção pode ser um “anticorpo/construto de anticorpo gerados in vitro” e/ou um “anticorpo/construto de anticorpo recombinante”. No contexto da presente invenção, o termo “gerado in vitro” se refere a um anticorpo/construto de anticorpo de acordo com a definição acima onde toda a ou parte da região variável (p.ex., pelo menos uma CDR) é gerada em uma seleção de células não imunitárias, por exemplo, em uma exibição de fagos in vitro, em um chip de proteínas ou em qualquer outro método no qual sequências de aminoácidos candidatas podem ser testadas quanto à sua capacidade de se ligarem a um antígeno. Este termo exclui assim preferencialmente sequências geradas meramente por rearranjo genômico em uma célula imunitária em um animal. Se prevê que o anticorpo (ou construto de anticorpo) seja produzido por ou obtenível por métodos de exibição em fagos ou rastreio de bibliotecas ou por enxerto de sequências de CDR de um anticorpo (monoclonal) pré-existente em um suporte. Um “anticorpo/construto de anticorpo recombinante” é um anticorpo/construto de anticorpo gerado ou produzido usando (inter alia) tecnologia de DNA recombinante ou manipulação genética.

[0074] Um tipo preferencial de uma variação de substituição de aminoácidos do anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da invenção envolve substituição de um ou mais resíduos dentro da região hipervariável de uma estrutura de anticorpo parental. Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimento adicional terá(ão) propriedades biológicas melhoradas em relação à estrutura de anticorpo parental a partir da qual são geradas. Um modo conveniente para geração de tais variantes de substituição envolve maturação de afinidade usando exibição em fagos. Resumidamente, vários locais da região hipervariável (p.ex., 6-7 locais) são mutados para gerar todas as substituições de aminoácidos possíveis em cada local. As variantes assim geradas são exibidas de uma forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusões ao produto gênico III de M13 empacotado dentro de cada partícula. As variantes exibidas em fagos são depois rastreadas quanto à sua atividade biológica (p.ex., afinidade de ligação) como divulgado aqui. Para identificar locais da região hipervariável candidatos contribuindo significativamente para a ligação ao antígeno (candidatos para modificação), a mutagênese de rastreamento de alanina pode ser também realizada. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo entre o antígeno e o anticorpo/construto de anticorpo ou o domínio de ligação para identificar pontos de contato entre o domínio de ligação do anticorpo/construto de anticorpo e seu antígeno específico. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas aqui. Logo que tais variantes sejam geradas, o painel de variantes é sujeito ao rastreamento como descrito aqui e anticorpos, seus fragmentos de ligação ao antígeno, construtos de anticorpos ou domínios de ligação com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

[0075] Os anticorpos monoclonais (ou construtos de anticorpos) da presente invenção incluem especificamente versões “quiméricas” nas quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpos particular, enquanto o resto da(s) cadeia(s) é idêntico a ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos ou variantes de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente dos E.U.A. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Os anticorpos, construtos de anticorpos ou domínios de ligação quiméricos de interesse aqui incluem anticorpos “primatizados” compreendendo, p.ex., sequências de ligação ao antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (p.ex., Macaco do Velho Mundo, Símio, etc.) e sequências de região constante humana. Uma variedade de abordagens para preparação de anticorpos ou construtos de anticorpos quiméricos foi descrita. Ver, p.ex., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., Patente dos E.U.A. 4,816,567; Boss et al., Patente dos E.U.A. No. 4,816,397; Tanaguchi et al., EP 0171496; EP 0173494; e GB 2177096.

[0076] Anticorpos monoclonais, suas variantes ou fragmentos, construtos de anticorpos e domínios de ligação “humanizados” são baseados em imunoglobulinas de sequências maioritariamente humanas, que contêm (a) sequência(s) mínima(s) derivada(s) de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos, suas variantes ou fragmentos, construtos de anticorpos e domínios de ligação humanizados são baseados em imunoglobulinas humanas (anticorpos receptores) nas quais os resíduos de uma região hipervariável ou CDR são substituídos por resíduos de uma região hipervariável ou CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como um roedor (p.ex., camundongo, hamster, rato ou coelho) tendo a especificidade, afinidade, capacidade e/ou atividade biológica desejadas. Em alguns casos, os resíduos de região estrutural (FR) de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além do mais, os anticorpos, suas variantes ou fragmentos, construtos de anticorpos e domínios de ligação “humanizados” como usado aqui podem também compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente nem no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar e otimizar adicionalmente o desempenho dos anticorpos. Os anticorpos, suas variantes ou fragmentos, construtos de anticorpos e domínios de ligação humanizados podem também compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (tal como Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais ver Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

[0077] Os anticorpos, suas variantes ou fragmentos, construtos de anticorpos e domínios de ligação humanizados podem ser gerados por substituição de sequências da região variável (Fv) que não estão diretamente envolvidas na ligação ao antígeno por sequências equivalentes de regiões variáveis (Fv) humanas. Métodos exemplificativos para geração de tais moléculas são proporcionados por Morrison (1985) Science

229: 1202-1207; por Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; e por US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 5,859,205; e US 6,407,213. Estes métodos incluem isolamento, manipulação e expressão das sequências de ácidos nucleicos que codificam todas as ou parte das regiões variáveis (Fv) de imunoglobulina de pelo menos uma de uma cadeia pesada ou leve. Tais ácidos nucleicos podem ser obtidos de um hibridoma produzindo um anticorpo contra um alvo predeterminado, como descrito acima, bem como de outras fontes. O DNA recombinante codificando o anticorpo, sua variante ou fragmento, construto de anticorpo ou domínio de ligação humanizado pode ser depois clonado em um vetor de expressão apropriado.

[0078] Os anticorpos, suas variantes ou fragmentos, construtos de anticorpos e domínios de ligação humanizados podem ser também produzidos usando animais transgênicos tais como camundongos que expressam genes de cadeia pesada e leve humana, mas são incapazes de expressar os genes de cadeia pesada e leve de imunoglobulina de camundongo endógenos. Winter descreve um método de enxerto de CDR exemplificativo que pode ser usado para preparar as moléculas humanizadas descritas aqui (Patente dos E.U.A. No. 5,225,539). Todas as CDRs de uma sequência humana particular podem ser substituídas por pelo menos uma porção de uma CDR não humana, ou somente algumas das CDRs podem ser substituídas por CDRs não humanas. É somente necessário substituir o número de CDRs requerido para ligação da molécula humanizada a um antígeno predeterminado.

[0079] Um anticorpo, sua variante ou fragmento, construto de anticorpo ou domínio de ligação humanizado pode ser otimizado pela introdução de substituições conservativas,

substituições de sequência de consenso, substituições de linha germinativa e/ou retromutações. Tais moléculas de imunoglobulina alteradas podem ser preparadas por qualquer uma de várias técnicas conhecidas na técnica (p.ex., Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, e EP 239 400).

[0080] De acordo com uma modalidade, o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) é “coelho”. O termo “anticorpo de coelho”, “construto de anticorpo de coelho” e “domínio de ligação de coelho” inclui anticorpos, construtos de anticorpos e domínios de ligação, respectivamente, tendo regiões derivadas de anticorpo tais como regiões ou domínios variáveis e constantes que correspondem substancialmente a sequências de imunoglobulina de linha germinativa de coelho conhecidas na técnica. Os construtos de anticorpos ou domínios de ligação de coelho da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina de linha germinativa de coelho (p.ex., mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio- específica in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo nas CDRs e, em particular, em CDR3. Os anticorpos, construtos de anticorpos ou domínios de ligação de coelho podem ter pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou mais posições substituídas por um resíduo de aminoácido que não é codificado pela sequência de imunoglobulina de linha germinativa de coelho. A definição de anticorpos, construtos de anticorpos e domínios de ligação de coelho como usado aqui contempla também anticorpos, construtos de anticorpos e domínios de ligação totalmente de coelho que incluem somente sequências de coelho não artificialmente e/ou geneticamente alteradas de anticorpos.

[0081] Se prevê que os anticorpos monoclonais (ou construtos de anticorpos) da invenção sejam anticorpos “isolados” ou “substancialmente puros”. “Isolado” ou “substancialmente puro” quando usado para descrever os anticorpos descritos aqui significa um anticorpo que foi identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente de produção. Preferencialmente, o anticorpo está isento ou substancialmente isento de associação a todos os outros componentes de seu ambiente de produção. Os componentes contaminantes de seu ambiente de produção, tais como aqueles resultando de células transfectadas recombinantes, são materiais que poderiam interferir, p.ex., com usos de diagnóstico para o anticorpo (ou construto de anticorpo), e podem incluir enzimas, hormônios e outros compostos proteináceos ou não proteináceos. É entendido que o anticorpo (ou construto de anticorpo) isolado ou substancialmente puro pode constituir de 5% a 99,9% em peso do conteúdo total de proteína/polipeptídeo em uma dada amostra, dependendo das circunstâncias. O anticorpo (ou construto de anticorpo) desejado pode ser produzido a uma concentração significativamente mais elevada através do uso de um promotor induzível ou promotor de elevada expressão. A definição inclui a produção de um anticorpo (ou construto de anticorpo) em uma ampla variedade de organismos e/ou células hospedeiras que são conhecidas na técnica. Em certas modalidades, o anticorpo será purificado (1) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-

terminal ou interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório ou (2) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras usando coloração com azul de Coomassie ou, preferencialmente, prata. Usualmente, no entanto, um anticorpo ou construto de anticorpo isolado será preparado por pelo menos um passo de purificação.

[0082] Os anticorpos monoclonais (ou construtos de anticorpos) da presente invenção se ligam a BCMA solúvel (sBCMA). “BCMA solúvel” é um fragmento clivado de BCMA ligado à membrana. A clivagem ocorre, p.ex., através de secretases, e o BCMA eliminado (sBCMA) é liberado da superfície celular. Os níveis de BCMA solúvel estão usualmente aumentados em pacientes com MM versus indivíduos saudáveis, mas também em pacientes com outras doenças. Além do mais, o nível de sBCMA no soro do paciente pode estar correlacionado com o estado e prognóstico da doença. O nível de sBCMA pode ser também marcadamente reduzido após terapia bem-sucedida de uma doença associada à sobre-expressão de BCMA ou níveis de sBCMA aumentados. Se prevê que o sBCMA seja sBCMA humano. A sequência de aminoácidos da molécula de BCMA humana (ligada à membrana) inteira (antígeno de maturação de células B, TNFRSF17, CD269) é mostrada em SEQ ID NO: 33, e a sequência de aminoácidos do domínio extracelular de BCMA humano é mostrada em SEQ ID NO: 34. Esta sequência corresponde também ao BCMA eliminado ou solúvel. Por outras palavras se prevê que o sBCMA tenha a sequência de aminoácidos como ilustrado em SEQ ID NO: 34.

[0083] O termo “a ligação ocorre na presença de” significa, no contexto da presente invenção, que existe ligação simultânea de dois (ou mais) anticorpos (ou construtos de anticorpos) ao mesmo alvo (aqui: sBCMA). Por outras palavras, dois (ou mais) anticorpos (ou construtos de anticorpos) não competem ou não competem significativamente (entre si) pela ligação ao alvo (aqui: sBCMA). De acordo com uma modalidade, isto poderia também significar que um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) se liga a um epítopo de sBCMA que é diferente do epítopo de sBCMA de um segundo anticorpo monoclonal ou construto de anticorpo (ou adicionalmente a um terceiro anticorpo ou construto de anticorpo, ver em baixo).

[0084] De acordo com um aspecto da presente invenção, a ligação do anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) a sBCMA ocorre - adicionalmente a ocorrer na presença de um segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) se ligando a sBCMA - na presença de um terceiro anticorpo ou construto de anticorpo se ligando a sBCMA. Este terceiro anticorpo ou construto de anticorpo pode ser um anticorpo ou construto de anticorpo terapêutico se ligando ao domínio extracelular de BCMA.

[0085] Em uma modalidade da presente invenção, o terceiro anticorpo ou construção de anticorpo se liga ao agrupamento de epítopos 3 de BCMA. Mais preferencialmente se liga ao agrupamento de epítopos 3 de BCMA humano. Uma sequência de aminoácidos para o agrupamento de epítopos 3 de BCMA humano é ilustrada em SEQ ID NO: 35. Construtos de anticorpos tendo domínios que se ligam ao referido agrupamento de epítopos 3 de BCMA são descritos em detalhe em WO 2013/072406, o conteúdo da qual é deste modo incorporado por referência. Foi mostrado que estes construtos de anticorpos têm uma relação epítopo/atividade muito benéfica. Se prevê que o

“terceiro anticorpo ou construto de anticorpo” da presente invenção compreenda um domínio se ligando a BCMA e compreendendo uma região VH compreendendo uma VH-CDR1, VH- CDR2 e VH-CDR3 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1, VL -CDR2 e VL-CDR3 como reivindicado em WO 2013/072406. Se prevê além disso que compreenda um domínio se ligando a BCMA e compreendendo uma região VH e/ou uma região VL como divulgado nas reivindicações de WO 2013/072406. Se prevê também que compreenda um domínio se ligando a BCMA e um domínio se ligando a CD3 (tal como CD3 humano, preferencialmente CD3- épsilon ou CD3-épsilon humano), como divulgado e reivindicado em WO 2013/072406. Se prevê também que se ligue ao mesmo epítopo de sBCMA que os anticorpos definidos e reivindicados em WO 2013/072406 ou compitam pela ligação a sBCMA com os anticorpos definidos e reivindicados em WO 2013/072406.

[0086] Anticorpos (ou construtos de anticorpos biespecíficos) dirigidos contra CD3 (humana) ou especificamente contra épsilon CD3 são conhecidos na técnica, e suas sequências de CDRs, VH e VL podem servir como uma base para um segundo domínio de ligação do “primeiro”, “segundo” ou “terceiro” anticorpo/construto de anticorpo da invenção. Por exemplo, Kung et al. relataram em 1979 o desenvolvimento de OKT3 (Ortho Kung T3), o primeiro mAb reconhecendo CD3 (especificamente, a cadeia épsilon de CD3) em células T humanas. OKT3 (muromonab) foi o primeiro anticorpo monoclonal de origem murina a se tornar disponível para terapia em humanos. Anticorpos monoclonais anti-CD3 mais recentes incluem otelixizumab (TRX4), teplizumab (MGA031), foralumab e visilizumab, todos visando a cadeia épsilon de CD3. Construtos de anticorpos biespecíficos dirigidos contra um alvo (câncer) e CD3 estão também sendo desenvolvidos e (pré-)clinicamente testados, e seu domínio de ligação a CD3 (CDRs, VH, VL) pode servir como uma base para um segundo domínio de ligação do primeiro, segundo ou terceiro anticorpo/construto de anticorpo da invenção. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, Blinatumomab, Solitomab (MT110, AMG 110), Catumaxomab, Duvortuxizumab, Ertumaxomab, Mosunetuzumab, FBTA05 (Bi20, TPBs05), CEA-TCB (RG7802, RO6958688), AFM11 e MGD006 (S80880). Outros exemplos de domínios de ligação a CD3 são divulgados, p.ex., em US 7,994,289 B2, US 7,728,114 B2, US 7,381,803 B1, US 6,706,265 B1.

[0087] Se prevê além do mais que o terceiro construto de anticorpo da presente invenção compreenda um domínio se ligando a BCMA como descrito aqui, um domínio se ligando a CD3 como descrito aqui e um domínio que proporciona uma extensão da meia-vida do construto de anticorpo. Este último domínio pode compreender dois monômeros de polipeptídeos, compreendendo cada um uma charneira, um domínio CH2 e um domínio CH3, em que os referidos dois monômeros de polipeptídeos são fundidos entre si através de um ligante de peptídeo. Tais construtos de anticorpos e domínios HLE são descritos em detalhe em WO 2017/134134, o conteúdo do qual é incluído aqui por referência.

[0088] Em uma modalidade adicional, o “terceiro anticorpo ou construto de anticorpo” é um anticorpo/construto de anticorpo divulgado em WO 2014/089335 como tendo as seguintes sequências de aminoácidos: VH-CDRs (SEQ ID NOs: 4-6), VL- CDRs (SEQ ID NOs: 106-108), VH (SEQ ID NO: 206), VL (SEQ ID

NO: 240) de WO 2014/089335. O terceiro anticorpo ou construto de anticorpo pode consequentemente compreender uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 4, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 5 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 6 de WO 2014/089335 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 107, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 107 e uma VL- CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 108 de WO 2014/089335. Pode também compreender uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 206 de WO 2014/089335 ou uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 240 de WO 2014/089335. O terceiro anticorpo ou construto de anticorpo pode também se ligar ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo definido anteriormente ou competir pela ligação a sBCMA com o anticorpo definido anteriormente (i.e., o anticorpo tendo as sequências citadas a partir de WO 2014/089335).

[0089] Se prevê que anticorpo monoclonal/construto de anticorpo da presente invenção compreenda (a) uma região VH de coelho, (b) uma região VL de coelho ou (c) uma região VH de coelho e uma região VL de coelho. Além do mais, o anticorpo monoclonal inteiro pode ser um anticorpo de coelho. As regiões variáveis ou o próprio anticorpo/construto de anticorpo são consequentemente derivados de coelho. O termo “anticorpo de coelho”, “construto de anticorpo de coelho”, “domínio de ligação de coelho” e “região VH/VL de coelho” inclui anticorpos, construtos de anticorpos, domínios de ligação e regiões VH/VL, respectivamente, compreendendo regiões derivadas de anticorpo tais como regiões ou domínios variáveis e constantes que correspondem substancialmente a sequências de imunoglobulina de linha germinativa de coelho conhecidas na técnica. Os anticorpos, construtos de anticorpos ou domínios de ligação de coelho da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina de linha germinativa de coelho (p.ex., mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo nas CDRs e, em particular, em CDR3. A definição de anticorpos, construtos de anticorpos e domínios de ligação de coelho como usado aqui contempla também anticorpos, construtos de anticorpos, regiões VH/VL e domínios de ligação totalmente de coelho que incluem somente sequências de coelho não artificialmente e/ou geneticamente alteradas de anticorpos. Podem, p.ex., ser obtidos por campanhas de imunização com coelhos, usando técnicas padrão conhecidas na técnica. O anticorpo monoclonal da invenção pode também compreender uma região VH de coelho e/ou uma região VL de coelho e regiões constantes de anticorpo, que são, p.ex., regiões constantes de coelho (tal como a região constante de cadeia pesada de coelho exemplificativa de SEQ ID NO: 31 ou a região constante de cadeia leve de coelho exemplificativa de SEQ ID NO: 32), ou regiões constantes de outras espécies (humano, camundongo, rato, hamster, cabra, etc.), dependendo dos requisitos e da concepção do sistema de detecção de sBCMA.

[0090] De acordo com uma modalidade da presente invenção, o anticorpo monoclonal ou construto de anticorpo compreende: a) uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 1, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 2 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 3 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 4, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 5 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 6; b) uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 11, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 12 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 13 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 14, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 15 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 16; ou c) uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 21, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 22 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 23 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 24, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 25 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 26.

[0091] Se prevê além do mais que o anticorpo monoclonal da presente invenção se ligue ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de a), de b) ou de c) acima ou compita pela ligação a sBCMA com o anticorpo de a), de b ), ou de c) acima.

[0092] Se um anticorpo, construto de anticorpo ou domínio de ligação se liga ou não ao mesmo epítopo de sBCMA (ou do domínio extracelular de BCMA) que outro dado anticorpo, construto de anticorpo ou domínio de ligação pode ser medido por diferentes análises, p.ex., por mapeamento de epítopos com moléculas de BCMA quiméricas ou mutadas, como descrito, p.ex., em WO 2013/072406. Outros métodos de determinação de epítopos são descritos aqui, tais como varredura de alanina (ver, p.ex., Morrison KL & Weiss GA. Curr Opin Chem Biol. Jun 2001; 5 (3): 302-7), em que cada resíduo dentro da sequência de aminoácidos alvo a ser analisado é substituído por alanina, p.ex., através de mutagênese sítio-dirigida. A alanina é usada devido a seu grupo funcional metila quimicamente inerte, não volumoso que não obstante mimetiza as referências de estrutura secundária que muitos dos outros aminoácidos possuem. Por vezes, aminoácidos volumosos tais como valina ou leucina podem ser usados em casos onde a conservação do tamanho de resíduos mutados é desejada. Este método onde mutações sistemáticas de aminoácidos são introduzidas na sequência da proteína alvo, e a ligação de um anticorpo a cada proteína mutada é testada para identificar os aminoácidos que compreendem o epítopo, é também chamado “mutagênese sítio-dirigida”. Outros métodos disponíveis para mapear epítopos de anticorpos em antígenos alvo são mapeamento de epítopos de mutagênese shotgun de elevada produtividade, espectrometria de massa acoplada por reticulação, cocristalografia de raios-X, microscopia eletrônica criogênica e troca hidrogênio-deutério.

[0093] Se um anticorpo ou construto de anticorpo compete ou não pela ligação a um antígeno (tal como BCMA ou sBCMA) na superfície de uma célula alvo com outro dado anticorpo ou construto de anticorpo pode ser medido em um ensaio de competição tal como um ELISA competitivo. Micropartículas (esférulas) acopladas à avidina podem ser também usadas. Similar a uma placa de ELISA revestida com avidina, quando reagida com uma proteína biotinilada, cada uma destas esférulas pode ser usada como um substrato no qual um ensaio pode ser realizado. O antígeno é revestido em uma esférula e depois pré-revestido com o primeiro anticorpo. O segundo anticorpo é adicionado, e qualquer ligação adicional é determinada. A leitura ocorre através de citometria de fluxo. Um ensaio de competição baseado em células pode ser usado, usando células que expressam naturalmente BCMA ou células que foram estavelmente ou transitoriamente transformadas com BCMA. Além do mais, o Exemplo 2b) da presente invenção descreve um ensaio de competição Octet que pode ser também usado para determinar a competição entre dois anticorpos/construtos de anticorpo pela ligação a sBCMA. O termo “compete pela ligação”, no presente contexto, significa que ocorre competição entre os dois anticorpos testados de pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%, como determinado por qualquer um dos ensaios divulgados acima.

[0094] De acordo com uma modalidade da presente invenção, o anticorpo monoclonal compreende: a) uma região VH como ilustrado em qualquer uma de SEQ ID NOs: 7, 17 ou 27; b) uma região VL como ilustrado em qualquer uma de SEQ ID NOs: 8, 18 ou 28; c) uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 7 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 8; d) uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 17 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 18; e) uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 27 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 28; ou o anticorpo monoclonal da presente invenção f) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de c) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de c);

g) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de d) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de d); ou h) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de e) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de e).

[0095] Se prevê que o anticorpo monoclonal da presente invenção (ou o “primeiro anticorpo monoclonal”) e/ou o segundo anticorpo monoclonal como definido aqui se liguem(ligue) a sBCMA em uma amostra. De acordo com uma modalidade, esta amostra pode ser uma amostra biológica. De acordo com uma modalidade, a amostra é uma amostra humana, p.ex., uma amostra biológica humana. A amostra biológica pode ser uma amostra de soro, amostra de plasma, amostra de sangue, amostra de medula óssea ou amostra de tecido (humano). A amostra pode ser também sobrenadante obtido de uma cultura de células de células mononucleares da medula óssea (humanas) ou de células mononucleares do sangue periférico (humanas). A amostra pode ser obtida de um sujeito, p.ex., um sujeito humano, suspeito de ter ou tendo (sendo diagnosticado com) uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado, ou um sujeito tendo recebido tratamento para uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado.

[0096] “Sangue” é um fluido corporal em humanos e outros animais que fornece substâncias necessárias tais como nutrientes e oxigênio às células e transporta produtos residuais metabólicos para longe dessas mesmas células. Nos vertebrados, o sangue é composto por células sanguíneas suspensas no plasma sanguíneo. O plasma sanguíneo ou “plasma” é o componente líquido do sangue no qual vários tipos de células sanguíneas estão suspensos. É maioritariamente água e contém proteínas dissolvidas (tais como albuminas séricas, globulinas, fibrinogênio e outras), glucose, fatores de coagulação, eletrólitos, hormônios, dióxido de carbono e oxigênio. Soro sanguíneo ou “soro” é plasma sem fatores de coagulação. O soro inclui consequentemente todas as proteínas plasmáticas não usadas na coagulação. A “medula óssea” é um tecido semissólido que pode ser encontrado dentro das porções esponjosas ou porosas dos ossos. Um “tecido” é um nível organizacional celular entre as células e um órgão completo. Um tecido é um conjunto de células similares e sua matriz extracelular da mesma origem que em conjunto levam a cabo uma função específica. Os órgãos são depois formados pelo agrupamento funcional em conjunto de múltiplos tecidos.

[0097] Modificações covalentes do anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da invenção estão também incluídas dentro do escopo desta invenção e são geralmente, mas nem sempre, feitas pós-translacionalmente. Por exemplo, vários tipos de modificações covalentes do anticorpo são introduzidos na molécula por reação de resíduos de aminoácidos específicos do anticorpo com um agente derivatizante orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou com os resíduos de N- ou C- terminais. A derivatização com agentes bifuncionais é útil para reticular os anticorpos da presente invenção a uma matriz ou superfície insolúvel em água para uso em uma variedade de métodos, em particular, métodos de detecção. Os resíduos de glutaminila e asparaginila são frequentemente desamidados para os resíduos de glutamila e aspartila correspondentes, respectivamente. Alternativamente, estes resíduos são desamidados sob condições suavemente ácidas.

Qualquer uma das formas destes resíduos se enquadra dentro do escopo desta invenção. Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de serila ou treonila, metilação dos grupos α-amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., São Francisco, 1983, pp. 79-86), acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxila C-terminal.

[0098] De acordo com a presente invenção, o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo), o “primeiro” anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) e/ou o segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) é/são acoplado(s) a um marcador detectável. Em algumas modalidades, a modificação covalente do anticorpo monoclonal da invenção compreende a adição de um ou mais marcadores, tais como marcadores de detecção. O marcador ou grupo marcador pode ser acoplado ao anticorpo através de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir impedimento estérico potencial. Vários métodos para marcar proteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados na realização da presente invenção. O termo “marcador” ou “grupo marcador” se refere a qualquer marcador detectável. Em geral, marcadores se enquadram em uma variedade de classes, dependendo do ensaio no qual são para serem detectados – os seguintes exemplos incluem, mas não estão limitados a: a) marcadores isotópicos, que podem ser isótopos radioativos ou pesados, tais como radioisótopos ou radionuclídeos (p.ex., 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I),

b) marcadores magnéticos (p.ex., partículas magnéticas), c) frações redox ativas, d) corantes ópticos (incluindo, mas não se limitando a, cromóforos, fósforos e fluoróforos) tais como grupos fluorescentes (p.ex., FITC, rodamina, fósforos de lantanida), grupos quimioluminescentes e fluoróforos que podem ser flúoros de “pequena molécula” ou flúoros proteináceos e) grupos enzimáticos (p.ex., peroxidase de rábano- silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina) f) grupos biotinilados g) epítopos de polipeptídeos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (p.ex., sequências de pares de fecho de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metais, caudas de epítopo, etc.)

[0099] Por “marcador fluorescente” se entende qualquer molécula que pode ser detectada através de suas propriedades fluorescentes inerentes. Marcadores fluorescentes adequados incluem, mas não estão limitados a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, coumarina, metil- coumarinas, pireno, verde de Malacite, estilbeno, Amarelo de Lucifer, AzulJ Cascade, Vermelho do Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, vermelho LC 640, Cy 5, Cy 5.5, vermelho LC 705, verde do Oregon, os corantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Azul Cascade, Amarelo Cascade e R- ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC,

Rodamina, e Vermelho do Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Corantes ópticos adequados, incluindo fluoróforos, são descritos em Molecular Probes Handbook por Richard P. Haugland.

[0100] Marcadores fluorescentes proteináceos adequados incluem também, mas não estão limitados a, proteína fluorescente verde, incluindo uma espécie de Renilla, Ptilosarcus ou Aequorea de GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263: 802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Número de Acesso do Genbank® U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8º Andar, Montreal, Quebec, Canadá H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24: 462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6: 178-182), proteína fluorescente amarela intensificada (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferase (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150: 5408-5417), β-galactosidase (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2603-2607) e Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, Patentes dos E.U.A. Nos. 5,292,658; 5,418,155; 5,683,888; 5,741,668; 5,777,079; 5,804,387; 5,874,304; 5,876,995; 5,925,558).

[0101] O anticorpo/construto de anticorpo da invenção pode também compreender domínios adicionais, que são, p.ex., úteis no isolamento da molécula ou se relacionam com um perfil farmacocinético adaptado da molécula. Os domínios úteis para o isolamento de um anticorpo/construto de anticorpo podem ser selecionados de motivos de peptídeo ou partes secundariamente introduzidas, que podem ser capturadas em um método de isolamento, p.ex., uma coluna de isolamento. Modalidades não limitantes de tais domínios adicionais compreendem motivos de peptídeo conhecidos como cauda de Myc, cauda de HAT, cauda de HA, cauda de TAP, cauda de GST, domínio de ligação de quitina (cauda de CBD), proteína de ligação de maltose (cauda de MBP), cauda de Flag, cauda de Estrep e suas variantes (p.ex., cauda de EstrepII) e cauda de His. Todos os construtos de anticorpos divulgados aqui caracterizados pelas CDRs identificadas podem compreender um domínio de cauda de His, que é geralmente conhecido como uma repetição de resíduos de His consecutivos na sequência de aminoácidos de uma molécula, p.ex., de cinco resíduos de His ou de seis resíduos de His (hexa-histidina). A cauda de His pode estar localizada, p.ex., no terminal N ou C de um construto de anticorpo. Em uma modalidade, uma cauda de hexa-histidina é ligada através de ligação de peptídeo ao terminal C de um construto de anticorpo de acordo com a invenção.

[0102] A invenção proporciona adicionalmente uma molécula de polinucleotídeo/ácido nucleico codificando um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da invenção. As moléculas de ácidos nucleicos são biopolímeros compostos por nucleotídeos. Um polinucleotídeo é um biopolímero composto por 13 ou mais monômeros de nucleotídeo covalentemente ligados em uma cadeia. DNA (tal como cDNA) e RNA (tal como mRNA) são exemplos de polinucleotídeos/moléculas de ácidos nucleicos com função biológica distinta. Os nucleotídeos são moléculas orgânicas que servem como os monômeros ou subunidades de moléculas de ácido nucleico como DNA ou RNA. A molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo da presente invenção pode ser ter fita dupla ou fita única, linear e circular. Se prevê que a molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo esteja compreendido em um vetor. Se prevê além do mais que tal vetor esteja compreendido em uma célula hospedeira. A referida célula hospedeira é, p.ex., após transformação ou transfecção com o vetor ou o polinucleotídeo/molécula de ácido nucleico da invenção, capaz de expressar o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo). Para este propósito, o polinucleotídeo ou molécula de ácido nucleico está operacionalmente ligado a sequências de controle.

[0103] O código genético é o conjunto de regras pelas quais a informação codificada dentro do material genético (ácidos nucleicos) é traduzida em proteínas. A descodificação biológica em células vivas é alcançada pelo ribossomo que liga aminoácidos em uma ordem especificada por mRNA, usando moléculas de tRNA para transportar aminoácidos e para ler os três nucleotídeos de mRNA de uma vez. O código define como sequências destes tripletos de nucleotídeos, chamados códons, especificam que aminoácido será adicionado de seguida durante a síntese de proteínas. Com algumas exceções, um códon de três nucleotídeos em uma sequência de ácidos nucleicos especifica um aminoácido único. Como a vasta maioria de genes é codificada com exatamente o mesmo código, este código particular é frequentemente referido como o código genético canônico ou padrão.

[0104] A degenerescência de códons é a redundância do código genético, exibida como a multiplicidade de combinações de códons de três pares de bases que especificam um aminoácido. A degenerescência resulta porque existem mais códons do que aminoácidos codificáveis. Os códons codificando um aminoácido podem diferir em qualquer uma de suas três posições; no entanto, na maioria das vezes, esta diferença está na segunda ou terceira posição. Por exemplo, os códons GAA e GAG especificam ambos o ácido glutâmico e exibem redundância; mas nenhum especifica qualquer outro aminoácido e assim não demonstram ambiguidade. Os códigos genéticos de diferentes organismos podem ser enviesados na direção do uso de um dos vários códons que codificam o mesmo aminoácido em relação aos outros - isto é, será encontrada uma frequência maior do que um do que esperado por acaso. Por exemplo, a leucina é especificada por seis códons distintos, alguns dos quais são raramente usados. Estão disponíveis tabelas de uso de códons detalhando frequências de uso de códons genômicos para a maioria dos organismos. As tecnologias gênicas recombinantes tiram comumente vantagem deste efeito por implementação de uma técnica denominada otimização de códons, na qual esses códons são usados para conceber um polinucleotídeo que são preferenciais pela respectiva célula hospedeira (tal como uma célula de origem de hamster humano, uma célula de Escherichia coli ou uma célula de Saccharomyces cerevisiae), p.ex., de modo a aumentar a expressão da proteína. Se prevê consequentemente que os polinucleotídeos/moléculas de ácidos nucleicos da presente divulgação tenham os códons otimizados. Não obstante, o polinucleotídeo/molécula de ácido nucleico codificando um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da invenção pode ser concebido usando qualquer códon que codifica o aminoácido desejado.

[0105] De acordo com uma modalidade, o polinucleotídeo/molécula de ácido nucleico da presente invenção codificando o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da invenção está na forma de uma única molécula ou na forma de duas ou mais moléculas separadas. Se o construto de anticorpo da presente invenção for um construto de anticorpo de cadeia única, o polinucleotídeo/molécula de ácido nucleico codificando tal construto estará o mais provavelmente também na forma de uma única molécula. No entanto se prevê também que diferentes componentes do anticorpo monoclonal (tais como a cadeia pesada e a cadeia pesada) ou do construto de anticorpo estejam localizados em cadeias de polipeptídeos separadas, caso esse em que o polinucleotídeo/molécula de ácido nucleico está o mais provavelmente na forma de duas (ou mais) moléculas separadas.

[0106] O mesmo se aplica ao vetor compreendendo um polinucleotídeo/molécula de ácido nucleico da presente invenção. Se o construto de anticorpo da presente invenção for um construto de anticorpo de cadeia única, um vetor pode compreender o polinucleotídeo que codifica o construto de anticorpo em uma única localização (como uma única grelha de leitura aberta, ORF). Um vetor pode também compreender dois ou mais polinucleotídeos/moléculas de ácidos nucleicos em localizações separadas (com ORFs individuais), cada uma delas codificando um componente diferente do anticorpo monoclonal, tal como a cadeia pesada e a cadeia leve, ou do construto de anticorpo da invenção. Se prevê que o vetor compreendendo o polinucleotídeo/molécula de ácido nucleico da presente invenção esteja na forma de um único vetor ou dois ou mais vetores separados. Em uma modalidade, e para o propósito de expressar o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) em uma célula hospedeira, a célula hospedeira da invenção deve compreender o polinucleotídeo/molécula de ácido nucleico codificando o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) ou o vetor compreendendo tal polinucleotídeo/molécula de ácido nucleico em sua totalidade, significando que todos os componentes do anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) - sejam codificados como uma única molécula ou em moléculas/localizações separadas - se montarão após tradução e formarão em conjunto o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) biologicamente ativo da invenção.

[0107] A invenção proporciona também um vetor compreendendo um polinucleotídeo/molécula de ácido nucleico da invenção. Um vetor é uma molécula de ácido nucleico usada como um veículo para transferir material genético (estranho) para uma célula, usualmente para o propósito de replicação e/ou expressão. O termo “vetor” engloba – mas não está restrito a – plasmídeos, vírus, cosmídeos e cromossomos artificiais. Alguns vetores são concebidos especificamente para clonagem (vetores de clonagem), outros para expressão de proteínas (vetores de expressão). Os assim chamados vetores de transcrição são maioritariamente usados para amplificar sua inserção. A manipulação do DNA é normalmente conduzida em vetores de E. coli, que contêm elementos necessários para sua manutenção em E. coli. No entanto, os vetores podem ter também elementos que permitem que sejam mantidos em outro organismo tal como células de levedura, planta ou mamífero, e estes vetores são chamados vetores de transporte. A inserção de um vetor na célula alvo ou hospedeira é usualmente chamada transformação para células bacterianas e transfecção para células eucarióticas,

enquanto a inserção de um vetor viral é frequentemente chamada transdução.

[0108] Em geral, vetores manipulados compreendem uma origem de replicação, um local de multiclonagem e um marcador selecionável. O próprio vetor é geralmente uma sequência de nucleotídeos, comumente uma sequência de DNA, que compreende uma inserção (transgene) e uma sequência maior que serve como o “esqueleto” do vetor. Embora o código genético determine a sequência de polipeptídeos para uma dada região codificante, outras regiões genômicas podem influenciar quando e onde estes polipeptídeos são produzidos. Os vetores modernos podem portanto englobar características adicionais para além da inserção transgênica e um esqueleto: promotor, marcador genético, resistência a antibióticos, gene repórter, sequência de direcionamento, cauda de purificação de proteínas. Os vetores chamados vetores de expressão (construtos de expressão) especificamente são para a expressão do transgene na célula alvo e, geralmente, têm sequências de controle.

[0109] O termo “sequências de controle” se refere a sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência codificante operacionalmente ligada em um organismo hospedeiro particular. As sequências de controle que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um local de ligação de ribossomo. As células eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores, sinais de poliadenilação, sequência de Kozak e intensificadores.

[0110] Um ácido nucleico está “operacionalmente ligado” quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder secretor está operacionalmente ligado a DNA para um polipeptídeo se for expresso como uma pré- proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador está operacionalmente ligado a uma sequência codificante se afetar a transcrição da sequência; ou um local de ligação de ribossomo está operacionalmente ligado a uma sequência codificante se estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, “operacionalmente ligado” significa que as sequências de nucleotídeos sendo ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os intensificadores não têm de ser contíguos. A ligação é alcançada por ligação em locais de restrição convenientes. Se tais locais não existirem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeos sintéticos são usados de acordo com a prática convencional.

[0111] “Transfecção” é o processo de introdução deliberada de moléculas de ácidos nucleicos ou polinucleotídeos (incluindo vetores) em células alvo. O termo é o mais frequentemente usado para métodos não virais em células eucarióticas. A transdução é frequentemente usada para descrever transferência mediada por vírus de moléculas de ácidos nucleicos ou polinucleotídeos. A transfecção de células animais envolve tipicamente abertura de poros ou “buracos” transitórios na membrana celular, para permitir a absorção de material. A transfecção pode ser levada a cabo usando partículas biológicas (tais como transfecção viral, também chamada transdução viral), métodos baseados em químicos (tais como uso de fosfato de cálcio, lipofecção,

Fugene, polímeros catiônicos, nanopartículas) ou tratamento físico (tais como eletroporação, microinjeção, arma de genes, compressão de células, magnetofecção, pressão hidrostática, impalefecção, sonicação, transfecção óptica, choque térmico).

[0112] O termo “transformação” é usado para descrever transferência não viral de moléculas de ácidos nucleicos ou polinucleotídeos (incluindo vetores) em bactérias e, também, em células eucarióticas não animais, incluindo células vegetais. A transformação é consequentemente a alteração genética de uma célula eucariótica bacteriana ou não animal resultando da absorção direta através da(s) membrana(s) celular(es) das suas adjacências e a incorporação subsequente de material genético exógeno (moléculas de ácidos nucleicos). A transformação pode ser levada a cabo por meios artificiais. Para que a transformação aconteça, as células ou bactérias têm de estar em um estado de competência, que poderia ocorrer como uma resposta limitada no tempo a condições ambientais tais como inanição e densidade de células, e pode ser também artificialmente induzida.

[0113] Além disso, a invenção proporciona uma célula hospedeira transformada ou transfectada com o polinucleotídeo/molécula de ácido nucleico da invenção ou com o vetor da invenção. Como usado aqui, os termos “célula hospedeira” ou “célula receptora” se destinam a incluir qualquer célula individual ou cultura de células que pode ser ou foi receptora de vetores, moléculas de ácidos nucleicos exógenas e/ou polinucleotídeos codificando o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da presente invenção; e/ou receptoras do próprio anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo). A introdução do respectivo material na célula é levada a cabo por meio de transformação, transfecção e similares (vide supra). O termo “célula hospedeira” se destina também a incluir descendência ou descendência potencial de uma célula única. Como certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido a mutação natural, acidental ou deliberada ou devido a influências ambientais, tal descendência pode, de fato, não ser completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico ou total) à célula parental, mas está ainda incluída dentro do escopo do termo como usado aqui. Células hospedeiras adequadas incluem células procarióticas ou eucarióticas e incluem também - mas não estão limitadas a - bactérias (tais como E. coli), células de levedura, células fúngicas, células vegetais e células animais tais como células de inseto e células de mamífero, p.ex., células de hamster, murino, rato, macaco ou humano.

[0114] Adicionalmente aos procariotas, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou levedura são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da invenção. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de cozinheiro comum, é o mais comumente usada entre microrganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. No entanto, um número de outros gêneros, espécies e estirpes está comumente disponível e é útil aqui, tal como Schizosaccharomyces pombe, hospedeiros de Kluyveromyces tais como K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500),

K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans e K. marxianus; Yarrowia (EP 402 226); Pichia pastoris (EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tais como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos tais como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e hospedeiros de Aspergillus tais como A. nidulans e A. niger.

[0115] Células hospedeiras adequadas para a expressão de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrado incluem vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas estirpes e variantes baculovirais e células hospedeiras de inserção permissiva correspondentes de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca-da- fruta) e Bombyx mori. Uma variedade de estirpes virais para transfecção está publicamente disponível, p.ex., a variante L-1 de Autographa californica NPV e a estirpe Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser usados como o vírus aqui de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[0116] Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, Arabidopsis e tabaco podem ser também usadas como hospedeiros. Vetores de clonagem e expressão úteis na produção de proteínas em cultura de células vegetais são conhecidos dos peritos na técnica. Ver, p.ex., Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995)

The Plant J 8: 745-750 e Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

[0117] No entanto, o interesse tem sido maior em células de vertebrado, e a propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de células) se tem tornado um procedimento de rotina. Exemplos de linhas de células hospedeiras de mamífero úteis são linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (tal como COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embriogênica humana (tal como 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de hamster bebê (tais como BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (tais como CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (tais como TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (tais como CVI ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (tais como VERO-76, ATCC CRL1587); células de carcinoma cervical humano (tais como HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (tais como MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (tais como BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (tais como W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (tais como Hep G2,1413 8065); tumor mamário de camundongo (tais como MMT 060562, ATCC CCL-51); células TRI (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (tal como Hep G2).

[0118] Em uma modalidade adicional, a invenção proporciona um processo para produção de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da invenção, compreendendo o referido processo cultivo de uma célula hospedeira da invenção sob condições permitindo a expressão do anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da invenção e recuperação do anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) produzido a partir da cultura.

[0119] Como usado aqui, o termo “cultura” se refere à manutenção, diferenciação, crescimento, proliferação e/ou propagação in vitro de células sob condições adequadas em um meio. As células são cultivadas e mantidas em um meio de crescimento celular a uma temperatura e mistura de gás apropriadas. As condições de cultura variam amplamente para cada tipo de célula. As condições de crescimento típicas são uma temperatura de cerca de 37 °C, uma concentração de CO2 de cerca de 5% e uma umidade de cerca de 95%. As receitas para meios de crescimento podem variar, p.ex., no pH, concentração da fonte de carbono (tal como glucose), natureza e concentração de fatores de crescimento e a presença de outros nutrientes (tais como aminoácidos ou vitaminas). Os fatores de crescimento usados para suplementar os meios são frequentemente derivados do soro de sangue animal, tal como soro fetal bovino (FBS), soro bovino de bezerro (FCS), soro equino e soro suíno. As células podem ser cultivadas em suspensão ou como culturas aderentes. Existem também linhas de células que foram modificadas para serem capazes de sobreviver em culturas em suspensão tal que possam crescer até uma densidade mais elevada do que as condições aderentes permitiriam.

[0120] O termo “expressão” inclui qualquer passo envolvido na produção de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da invenção incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional,

tradução, modificação pós-translacional, direcionamento para localizações subcelulares ou extracelulares específicas e secreção. O termo “recuperação” se refere a uma série de processos destinados a isolar o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) a partir da cultura de células. O processo de “recuperação” ou “purificação” pode separar as partes proteicas e não proteicas da cultura de células e, finalmente, separar o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) desejado de todos os outros polipeptídeos e proteínas. Os passos de separação exploram geralmente diferenças no tamanho das proteínas, propriedades físico- químicas, afinidade de ligação e atividade biológica. As purificações preparativas visam produzir uma quantidade relativamente grande de proteínas purificadas para uso subsequente, enquanto a purificação analítica produz uma quantidade relativamente pequena de uma proteína para uma variedade de propósitos de investigação ou analíticos.

[0121] Quando se usam técnicas recombinantes, o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplásmico ou diretamente secretado no meio. Se o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) for produzido intracelularmente, como um primeiro passo, os detritos particulados, células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. O anticorpo (ou construto de anticorpo) da invenção pode, p.ex., ser produzido em bactérias tais como E. coli. Após expressão, o construto é isolado a partir da pasta de células bacterianas em uma fração solúvel e pode ser purificado, p.ex., através de cromatografia por afinidade e/ou exclusão de tamanhos. A purificação final pode ser levada a cabo de uma maneira similar ao processo de purificação de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) expresso em células de mamífero e secretada no meio. Carter et al. (Biotechnology (NY) fev 1992; 10 (2): 163-7) descrevem um procedimento para isolamento de anticorpos que são secretados no espaço periplásmico de E. coli.

[0122] Onde o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) é secretado no meio, sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente em primeiro lugar concentrados usando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração.

[0123] O anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da invenção preparado a partir das células hospedeiras pode ser recuperado ou purificado usando, por exemplo, cromatografia por hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia por afinidade. Outras técnicas para purificação de proteínas tais como fracionamento em uma coluna de permuta iônica, permuta iônica de modo misto, HIC, precipitação de etanol, cromatografia por exclusão de tamanhos, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina sepharose, cromatografia em uma resina de permuta aniônica ou catiônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), imunoafinidade (tal como Proteína A/G/L), cromato-focagem, SDS-PAGE, ultrafiltração e precipitação de sulfato de amônio estão também disponíveis dependendo do anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) a ser recuperado. Um inibidor de protease pode ser incluído em qualquer um dos passos anteriores para inibir a proteólise, e antibióticos podem ser incluídos para evitar o crescimento de contaminantes.

[0124] Além disso, a invenção proporciona uma composição ou formulação compreendendo o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da invenção ou compreendendo o anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) produzido de acordo com o processo da invenção. A composição é preferencialmente uma composição de diagnóstico. Como usado aqui, o termo “composição de diagnóstico” se relaciona com uma composição que é adequada para uso em um estojo de diagnóstico ou em um sistema de detecção. Uma possível composição de diagnóstico desta invenção compreende um ou uma pluralidade dos anticorpos monoclonais (ou construtos de anticorpos) da invenção, preferencialmente em uma quantidade que é útil para a detecção de sBCMA em uma amostra. A composição de diagnóstico pode compreender adicionalmente formulações adequadas de um ou mais transportadores, estabilizantes, excipientes, diluentes, solubilizantes, tensoativos, emulsificantes, conservantes e/ou adjuvantes. As composições de diagnóstico da invenção incluem, mas não estão limitadas a, composições líquidas, congeladas e liofilizadas.

[0125] As composições podem compreender um transportador tal como um transportador diagnosticamente aceitável. Em geral, como usado aqui, “transportador diagnosticamente aceitável” significa quaisquer e todas soluções aquosas e não aquosas, soluções estéreis, solventes, tampões, p.ex., soluções salinas tamponadas com fosfato (PBS), água, suspensões, emulsões, tais como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes molhantes, lipossomos, meios de dispersão e revestimentos, que são compatíveis com uso de diagnóstico. O uso de tais meios e agentes em composições de diagnóstico é bem conhecido na técnica, e as composições compreendendo tais transportadores podem ser formuladas por métodos convencionais bem conhecidos.

[0126] Certas modalidades proporcionam composições de diagnóstico compreendendo o construto de anticorpo da invenção e adicionalmente um ou mais excipientes tais como aqueles ilustrativamente descritos em esta seção e em outro lugar aqui. Os excipientes podem ser usados na invenção para uma ampla variedade de propósitos, tais como ajuste de propriedades físicas, químicas, ou biológicas das formulações, tais como ajuste de viscosidade, e em processos da invenção para melhorar a eficácia e/ou para estabilizar tais formulações e processos contra a degradação e deterioração, p.ex., devida a estresses que ocorrem durante a fabricação, transporte, armazenamento, preparação pré-uso, administração e daí em diante. Os excipientes devem em geral ser usados em suas concentrações eficazes mais baixas.

[0127] Em certas modalidades, a composição de diagnóstico pode conter materiais de formulação para o propósito de modificação, manutenção ou preservação de certas características da composição tais como o pH, osmolaridade, viscosidade, claridade, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração (ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Edição, 1990, Mack Publishing Company). Em tais modalidades, os materiais de formulação adequados podem incluir, mas não estão limitados a: • aminoácidos

• antimicrobianos, tais como agentes antibacterianos e antifúngicos • antioxidantes • tampões, sistemas de tampão e agentes tamponantes que são usados para manter a composição a pH fisiológico ou a um pH ligeiramente mais baixo, tipicamente dentro de uma gama de pH de cerca de 5 a cerca de 8 ou 9. • solventes não aquosos, óleos vegetais e ésteres orgânicos injetáveis • transportadores aquosos incluindo água, soluções alcoólicas/aquosas, suspensões ou emulsões, incluindo solução salina e meios tamponados • polímeros biodegradáveis tais como poliésteres • agentes de volume • agentes quelantes • agentes isotônicos e retardadores da absorção • agentes complexantes • enchimentos • carboidratos • proteínas (baixo peso molecular), polipeptídeos ou transportadores proteináceos, preferencialmente de origem humana • agentes corantes e aromatizantes • agentes redutores contendo enxofre • agentes diluentes • agentes emulsificantes • polímeros hidrofílicos • contraíons formadores de sais • conservantes • complexos de metal

• solventes e cossolventes • açúcares e álcoois de açúcar • agentes de suspensão • tensoativos ou agentes molhantes • agentes intensificadores da estabilidade • agentes intensificadores da tonicidade • veículos de entrega parenteral • veículos de entrega intravenosa

[0128] É conhecimento comum que os diferentes constituintes da composição de diagnóstico podem ter diferentes efeitos, por exemplo, e o aminoácido pode atuar como um tampão, um estabilizante e/ou um antioxidante; o manitol pode atuar como um agente de volume e/ou um agente intensificador da tonicidade; o cloreto de sódio pode atuar como veículo de entrega e/ou agente intensificador da tonicidade; etc.

[0129] De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um sistema de detecção compreendendo: a) um primeiro anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) que se liga a sBCMA e b) um segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) que se liga a sBCMA, em que a ligação do primeiro anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) a sBCMA ocorre na presença do segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) se ligando a sBCMA.

[0130] A presente invenção proporciona também um sistema de detecção compreendendo: a) um primeiro anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) que se liga a sBCMA e b) um segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) que se liga a sBCMA, em que a ligação do segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) a sBCMA ocorre na presença do primeiro anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) se ligando a sBCMA.

[0131] A presente invenção proporciona também um sistema de detecção compreendendo: a) um primeiro anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) que se liga a sBCMA e b) um segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) que se liga a sBCMA, em que a ligação do primeiro anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) a sBCMA ocorre na presença do segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) se ligando a sBCMA, e em que a ligação do segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) a sBCMA ocorre na presença do primeiro anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) se ligando a sBCMA.

[0132] Um “sistema de detecção” é um estojo ou ferramenta (ou um estojo/ferramenta de diagnóstico) compreendendo reagentes para levar a cabo um ensaio analítico. No contexto da presente invenção, o ensaio detecta e/ou quantifica a presença de sBCMA em uma amostra, usualmente uma amostra líquida. O sistema de detecção compreende um par de anticorpos (primeiro e segundo anticorpos monoclonais) que se ligam a sBCMA. Usualmente, o sistema de detecção envolve o uso de um suporte sólido (tal como uma placa de microtitulação ou uma membrana) que serve como uma superfície para imobilizar o antígeno a ser detectado (p.ex., no caso de um “ELISA direto”) ou o anticorpo (monoclonal) se ligando a sBCMA (o “anticorpo de captura”) ou um “anticorpo secundário” (p.ex., um anticorpo anti-Fc) que se liga ao anticorpo se ligando a sBCMA (o anticorpo de captura). Em geral, a imobilização ocorre não especificamente (através de adsorção à superfície) ou especificamente (através de captura por um anticorpo, p.ex., um anticorpo secundário). Um sistema de detecção pode compreender além do mais um anticorpo de detecção (monoclonal) se ligando a sBCMA (opcionalmente acoplado com uma enzima, um marcador detectável ou um grupo repórter) e, opcionalmente, um anticorpo secundário (p.ex., um anticorpo anti-Fc) que se liga ao anticorpo de detecção e que é acoplado com uma enzima, um marcador detectável ou um grupo repórter. No presente caso, o anticorpo de captura pode ser o “primeiro anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) que se liga a sBCMA” e o anticorpo de detecção pode ser o “segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) que se liga a sBCMA” ou vice-versa. Por outras palavras, o primeiro ou o segundo anticorpo monoclonal ou construto de anticorpo da invenção pode ser acoplado com uma enzima, um marcador detectável ou um grupo repórter.

[0133] Um sistema de detecção muito bem conhecido é o ensaio ELISA, que pode ser usado para os propósitos da presente invenção. Um ELISA em “sanduíche” é usado para detectar o antígeno da amostra (aqui: sBCMA) ou para quantificar uma quantidade desconhecida do antígeno. Os passos podem incluir: Uma superfície é proporcionada à qual uma quantidade conhecida do assim chamado “anticorpo de captura” é ligado. Esta ligação pode ocorrer diretamente através de adsorção do anticorpo de captura à superfície ou através de um anticorpo secundário (p.ex., um anticorpo anti- Fc) que é adsorvido à superfície e que se liga ao anticorpo de captura.

Quaisquer locais de ligação não específica na superfície são bloqueados.

A amostra contendo o antígeno é aplicada à superfície, e o antígeno é capturado (ligado) pelo anticorpo.

A placa é lavada para remover o antígeno não ligado.

Um “anticorpo de detecção” é adicionado e se liga ao antígeno.

Este anticorpo de detecção pode ser acoplado (p.ex., covalentemente ligado) com uma enzima, um marcador detectável ou um grupo repórter.

Se este não for o caso é aplicado um anticorpo secundário que é acoplado com uma enzima, um marcador detectável ou um grupo repórter e que se liga ao anticorpo de detecção, p.ex., à sua região Fc.

A placa é lavada para remover quaisquer anticorpos não ligados.

É adicionado um substrato químico que é convertido (p.ex., pela enzima) em uma forma detectável, tal como um sinal óptico (p.ex., cor ou fluorescente) ou um sinal eletroquímico.

A absorvância ou fluorescência ou sinal eletroquímico (p.ex., corrente) dos poços ou superfície da placa é medido para determinar a presença e/ou quantidade do antígeno.

Os marcadores enzimáticos comumente usados incluem: - OPD (di-hidrocloreto de o-fenilenodiamina) fica âmbar para detectar peroxidase de rábano-silvestre (HRP) que é frequentemente usada como proteína conjugada - TMB (3,3´, 5,5´-tetrametilbenzidina) fica azul quando detecta HRP e fica amarelo ácido sulfúrico ou fosfórico - ABTS (Sal de 2,2´-azinobis[ácido 3-etilbenzotiazolina- 6-sulfônico]-diamônio) fica verde quando detecta HRP

- PNPP (Fosfato de p-Nitrofenila, Sal Dissódico) fica amarelo quando detecta fosfatase alcalina

[0134] O ELISA tradicional envolve tipicamente repórteres e substratos cromogênicos que produzem mudança de cor observável para indicar a presença de antígeno. As técnicas tipo ELISA mais recentes usam repórteres de PCR fluorogênicos, eletroquimioluminescentes e quantitativos para criar sinais quantificáveis. Estes novos repórteres podem ter várias vantagens, incluindo sensibilidades e multiplexação mais elevadas. Em termos técnicos, estes ensaios não são estritamente “ELISAs”, pois não são “ligados a enzimas”, mas são ao invés ligados a algum repórter não enzimático. No entanto, dado que os princípios gerais em estes ensaios são largamente similares, são frequentemente agrupados na mesma categoria que os ELISAs.

[0135] O sistema de detecção pode ser usado em um formato qualitativo ou quantitativo. Os resultados qualitativos proporcionam um resultado positivo ou negativo simples (sim ou não) para uma amostra. O corte entre positivo e negativo pode ser estatístico. Duas ou três vezes o desvio padrão (erro inerente a um teste) é frequentemente usado para distinguir amostras positivas de negativas. Em um formato quantitativo, a densidade óptica (DO) da amostra ou o sinal eletroquímico é comparado com uma curva padrão, que é tipicamente uma diluição em série de uma solução de concentração conhecida da molécula alvo (sBCMA).

[0136] As definições e especificações do anticorpo monoclonal de acordo com a invenção e o segundo anticorpo monoclonal, como proporcionado anteriormente, se aplicam similarmente para o primeiro anticorpo monoclonal e o segundo anticorpo monoclonal que estão compreendidos no sistema de detecção da invenção.

Por exemplo se prevê que o sBCMA tenha a sequência de aminoácidos como ilustrado em SEQ ID NO: 34. Se prevê também que a ligação do primeiro anticorpo monoclonal a sBCMA e a ligação do segundo anticorpo monoclonal a sBCMA ocorram na presença de um terceiro anticorpo ou construto de anticorpo se ligando a sBCMA.

Este terceiro anticorpo ou construto de anticorpo pode ser um anticorpo ou construto de anticorpo anti-BCMA terapêutico, tal como um conjugado de anticorpo e fármaco (ADC) ou um anticorpo biespecífico CD3xBCMA.

O terceiro anticorpo ou construto de anticorpo pode estar presente na amostra (p.ex., amostra biológica) a ser analisada usando o sistema de detecção.

Ver anteriormente para mais detalhes sobre o terceiro anticorpo/construto de anticorpo se ligando a sBCMA.

Além do mais se prevê que o primeiro anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) do sistema de detecção compreenda (a) uma região VH de coelho, (b) uma região VL de coelho ou (c) uma região VH de coelho e uma região VL de coelho.

Do mesmo modo, o segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) do sistema de detecção pode compreender (a) uma região VH de coelho, (b) uma região VL de coelho ou (c) uma região VH de coelho e uma região VL de coelho.

Além do mais, o primeiro anticorpo monoclonal inteiro e/ou o segundo anticorpo monoclonal inteiro do sistema de detecção podem ser um anticorpo de coelho.

Se prevê também que o primeiro anticorpo monoclonal e/ou o segundo anticorpo monoclonal do sistema de detecção tenha/tenham uma afinidade (KD) por sBCMA de cerca de ≤10-7 M, ≤10-8 M, ≤10-9 M ou ≤10-10 M.

Se prevê também que o primeiro anticorpo monoclonal do sistema de detecção e/ou o segundo anticorpo monoclonal do sistema de detecção seja/sejam um anticorpo IgG, IgD, IgE, IgM ou IgA. De acordo com uma modalidade, o primeiro e/ou segundo anticorpo monoclonal são um anticorpo IgG, tal como um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. O isótipo e a subclasse do anticorpo podem ser de coelho (p.ex., IgG de coelho, IgG1 de coelho, etc.).

[0137] A presente invenção proporciona também que o primeiro anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) do sistema de detecção: a) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 1, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 2 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 3 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 4, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 5 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 6; b) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 11, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 12 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 13 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 14, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 15 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 16; c) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de a) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de a); ou d) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de b) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de b);

e/ou que o segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) do sistema de detecção: e) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 21, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 22 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 23 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 24, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 25 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 26; ou f) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de e) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de e).

[0138] A presente invenção proporciona também que o primeiro anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) do sistema de detecção: a) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 7 ou 17; b) compreende uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 8 ou 18; c) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 7 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 8; d) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 17 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 18; e) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de c) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de c); ou f) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de d) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de d); e/ou que o segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) do sistema de detecção:

g) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 27; h) compreende uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 28; i) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 27 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 28; ou j) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de i) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de i).

[0139] Se prevê para o sistema de detecção que a) ou o primeiro anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) é usado como anticorpo de captura, e o segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) é usado como anticorpo de detecção, ou b) o primeiro anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) é usado como anticorpo de detecção, e o segundo anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) é usado como anticorpo de captura.

[0140] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona também o uso de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da presente invenção ou o uso do sistema de detecção da presente invenção para: - detecção de sBCMA em uma amostra; - quantificação de sBCMA em uma amostra; - diagnóstico de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado; - estratificação de pacientes diagnosticados com uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado; - monitorização da progressão de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado; ou

- monitorização da resposta ao tratamento de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado.

[0141] Em uma modalidade, a amostra é uma amostra biológica, tal como uma amostra biológica humana. Uma amostra (amostra biológica/amostra biológica humana) pode ser uma amostra de soro, amostra de plasma, amostra de sangue, amostra de medula óssea ou amostra de tecido. A amostra pode ser também sobrenadante obtido de uma cultura de células de células mononucleares da medula óssea ou de células mononucleares do sangue periférico. A amostra pode ser obtida de um sujeito, p.ex., um sujeito humano, suspeito de ter ou tendo (sendo diagnosticado com) uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado, ou um sujeito tendo recebido tratamento para uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado.

[0142] Uma doença é uma condição anormal particular que afeta negativamente a estrutura ou função de parte de ou todo um organismo, tal como um humano, e que não é devida a nenhuma lesão externa. As doenças são frequentemente consideradas como “condições médicas” ou “disfunções” que estão associadas a sinais e sintomas específicos. A doença de acordo com a presente invenção está associada a sBCMA ou sBCMA aumentado. Este sBCMA pode, p.ex., ser detectado e/ou quantificado na medula óssea, sangue, soro ou plasma, p.ex., de um sujeito humano, ou no sobrenadante obtido de uma cultura de células de células mononucleares da medula óssea ou de células mononucleares do sangue periférico, p.ex., de um sujeito humano. O termo “aumentado” é usado comparação em com um sujeito saudável, i.e., um sujeito que não tem tal doença. De acordo com uma modalidade, a doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado é um “neoplasma positivo quanto a BCMA”.

[0143] Um “neoplasma” é um crescimento anormal de tecido, usualmente mas nem sempre formando uma massa. Quando também forma uma massa é comumente referido como um “tumor”. Em tumores cerebrais, a divisão descontrolada de células significa que a massa de um neoplasma aumenta em tamanho e, em um espaço confinado tal como a cavidade intracraniana, isto rapidamente se torna problemático porque a massa invade o espaço do cérebro o empurrando para o lado, levando à compressão do tecido cerebral e pressão intracraniana aumentada e destruição do parênquima. De acordo com a invenção, o “neoplasma” ou “tumor” se refere também a uma condição que beneficiaria do tratamento com uma terapia dirigida a BCMA, em particular, BCMA expresso na superfície celular (tal como anticorpos específicos de BCMA - incluindo anticorpos nus, conjugados anticorpo-fármaco (ADCs), anticorpos biespecíficos tais como aqueles dirigidos contra BCMA e CD3 - bem como terapias celulares tais como células T receptoras de antígeno quimérico (CAR-T), tais terapias incluindo mas não se limitando a AMG 420, AMG 701, GSK 916, JNJ-64007957 (JNJ-7957), PF-06863135 (PF-3135), CC-93269, REGN5458, HPN217, TNB-383B, P-BCMA-101, JNJ-68284528, JCARH125 e bb2121. Esta condição inclui disfunções ou doenças crônicas e agudas incluindo aquelas condições patológicas que predispõem um mamífero à condição (neoplasma ou tumor) em questão.

[0144] Os neoplasmas ou tumores podem ser benignos, potencialmente malignos (pré-cancerosos) ou malignos (cancerosos). Os neoplasmas/tumores malignos são comumente chamados câncer. Eles invadem e destroem usualmente o tecido circundante e podem formar metástases, i.e., se disseminam para outras partes, tecidos ou órgãos do corpo. Um “tumor primário” é um tumor crescendo no local anatômico onde a progressão tumoral começou e procedeu para originar uma massa cancerosa. Por exemplo, um tumor cerebral ocorre quando células anormais se formam dentro do cérebro. A maioria dos cânceres se desenvolve em seu local primário mas depois forma metástases ou se dissemina para outras partes (p.ex., tecidos e órgãos) do corpo. Estes tumores adicionais são tumores secundários. A maioria dos cânceres continua a ser chamada após seu local primário, mesmo após se terem disseminado para outras partes do corpo.

[0145] Os linfomas e leucemias são neoplasmas hematopoiéticos ou linfoides. Para os propósitos da presente invenção, linfomas e leucemias são também englobados pelos termos “tumor”, “câncer” ou “neoplasma”. O linfoma é um grupo de cânceres do sangue que se desenvolvem a partir de linfócitos (um tipo de glóbulo branco). A leucemia é um grupo de cânceres que começa usualmente na medula óssea e resulta em elevados números de glóbulos brancos anormais. Estes glóbulos brancos não estão totalmente desenvolvidas e são chamados blastos ou células de leucemia. Os linfomas e as leucemias são uma parte do grupo mais amplo de tumores dos tecidos hematopoiéticos e linfoides.

[0146] Para os propósitos da presente invenção, os termos “neoplasma”, “tumor” e “câncer” podem ser usados indistintamente e compreendem tanto tumores/cânceres primários como tumores/cânceres secundários (ou “metástases”), bem como neoplasmas formadores de massas

(tumores) e neoplasmas linfoides (tais como linfomas e leucemias) e, também, MRD.

[0147] O termo “doença residual mínima” (MRD) se refere à evidência quanto à presença de pequenos números de células cancerosas residuais que permanecem no paciente após tratamento do câncer, p.ex., quando o paciente está em remissão (o paciente não tem sintomas ou sinais de doença). Um número muito pequeno de células cancerosas restantes não pode ser geralmente detectado por meios de rotina porque os testes padrão usados para avaliar ou detectar o câncer não são sensíveis o suficiente para detectar MRD. Hoje em dia estão disponíveis testes de biologia molecular muito sensíveis para MRD, tais como citometria de fluxo, PCR e sequenciamento de última geração. Estes testes podem medir os níveis mínimos de células cancerosas em amostras de tecido, por vezes tão baixos quanto uma célula cancerosa em um milhão de células normais. No contexto da presente invenção se prevê que os termos “prevenção”, “tratamento” ou “melhoria” de um neoplasma englobem também “prevenção, tratamento ou melhoria de MRD”, independentemente de a MRD ter sido detectada ou não.

[0148] Se prevê que o neoplasma positivo quanto a BCMA é um neoplasma de células B ou um neoplasma de células plasmáticas. As células B, também conhecidas como linfócitos B, são um tipo de glóbulo branco do subtipo linfócito. Funcionam no componente da imunidade humoral do sistema imunitário adaptativo por secreção de anticorpos. Adicionalmente, as células B apresentam antígenos (são também classificadas como células apresentadoras de antígenos profissionais) e secretam citocinas. Nos mamíferos, as células B amadurecem na medula óssea, que fica no centro da maioria dos ossos. As células B, ao contrário das outras duas classes de linfócitos - células T e células matadoras naturais (NK) - expressam receptores de células B (BCRs) em sua membrana celular. Os BCRs permitem que a célula B se ligue a um antígeno específico, contra o qual iniciará uma resposta de anticorpos. As células plasmáticas, também chamadas células plasmáticas B, plasmócitos ou células B efetoras, são glóbulos brancos que secretam grandes volumes de anticorpos. São usualmente transportados pelo plasma sanguíneo e pelo sistema linfático. As células plasmáticas têm origem na medula óssea. As células B se diferenciam em células plasmáticas que produzem moléculas de anticorpo intimamente modeladas pelos receptores da célula B precursora. Uma vez liberadas no sangue e linfa, estas moléculas de anticorpo se ligam ao antígeno alvo e iniciam sua neutralização ou destruição.

[0149] A “doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado”, o “neoplasma positivo quanto a BCMA” ou o “neoplasma de células B (positivo quanto a BCMA) ou neoplasma de células plasmáticas” pode ser selecionado do grupo incluindo, mas não se limitando a, mieloma múltiplo, mieloma múltiplo recidivado e/ou refratário, mieloma múltiplo de cadeia pesada, mieloma múltiplo de cadeia leve, mieloma extramedular (plasmocitoma extramedular, mieloma múltiplo extramedular), plasmocitoma, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia de Waldenström (linfoma linfoplasmático), mieloma latente (mieloma múltiplo latente), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma primário do CNS (PCNSL) e linfoma não-Hodgkin de células B

(B-NHL). O Mieloma Múltiplo pode ser selecionado do grupo consistindo em ou compreendendo mieloma múltiplo recidivado e/ou refratário, mieloma múltiplo de cadeia pesada, mieloma múltiplo de cadeia leve, mieloma múltiplo extramedular e mieloma múltiplo latente.

[0150] “Diagnóstico” ou “diagnóstico médico” é o processo de determinação que disfunção ou condição explica os sintomas e sinais de um sujeito. Usualmente, um ou mais procedimentos de diagnóstico, tais como exames de diagnóstico ou médicos, são feitos durante o processo. Em medicina, o termo “monitorização” se refere à observação de uma doença, condição ou um ou vários parâmetros médicos ao longo do tempo. Pode ser realizada por medição contínua de certos parâmetros por uso de um monitor médico e/ou por realização repetida de testes médicos. Um teste de diagnóstico ou médico é um procedimento médico realizado para detectar, diagnosticar ou monitorizar doenças, processos de doenças, suscetibilidade e/ou determinar um curso de tratamento. Está relacionado com química clínica e diagnóstico molecular, e os procedimentos são tipicamente realizados em um laboratório médico.

[0151] As terapias ou tratamentos médicos são esforços para curar ou melhorar uma doença. Na área médica, os tratamentos comuns incluem medicações. Uma medicação (também referida como medicamento, fármaco farmacêutico ou fármaco) é usado para diagnosticar, curar, tratar ou prevenir uma doença. O termo “tratamento” se refere consequentemente tanto ao tratamento terapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas. No contexto da presente invenção, o tratamento inclui a aplicação ou administração de um anticorpo ou construto de anticorpo anti-BCMA ao corpo, a um tecido isolado ou a uma célula de um paciente ou um sujeito com necessidade que tem uma doença como descrito aqui, um sintoma de tal doença ou uma predisposição na direção de tal doença, com o propósito de curar, sarar, aliviar, atenuar, alterar, remediar, melhorar, aprimorar ou afetar a doença, o sintoma da doença ou a predisposição na direção da doença.

[0152] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona também um método para detecção e/ou quantificação de sBCMA em uma amostra, compreendendo os passos de: (a) uso de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da presente invenção, ou uso de um sistema de detecção da presente invenção, para determinação do conteúdo de sBCMA em uma amostra; e (b) comparação do conteúdo de sBCMA determinado no passo (a) com (i) um valor predefinido para o conteúdo de sBCMA, (ii) o conteúdo de sBCMA determinado em uma amostra de controle ou (iii) o conteúdo de sBCMA determinado em uma amostra obtida da mesma fonte ou sujeito em um ponto temporal prévio.

[0153] Para os propósitos da presente invenção, o termo “conteúdo” (de sBCMA) pode ser usado indistintamente com os termos “nível”, “quantidade” ou “concentração” (de sBCMA). O “valor predefinido para o conteúdo de sBCMA” pode ser um “valor de corte” que foi predeterminado. Este valor pode, p.ex., indicar que um certo conteúdo de sBCMA em uma amostra é indicativo de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentada ou um neoplasma positivo quanto a BCMA. Por exemplo, se o conteúdo de sBCMA em uma amostra for determinado como sendo três desvios padrão acima do valor de corte predeterminado, o sujeito do qual a amostra foi obtida é considerado positivo para mieloma múltiplo (ou outras doenças como descrito aqui). A “amostra de controle” é usualmente obtida de uma fonte da mesma natureza que a amostra a ser analisada (tal como uma amostra de soro). A amostra de controle pode ser uma amostra (“amostra de controle negativo”) representando um conteúdo de sBCMA “normal” (p.ex., representando um sujeito saudável) ou pode ser uma amostra (“amostra de controle positivo”) representando um conteúdo de sBCMA “anormalmente aumentado” (p.ex., representando um sujeito tendo uma doença como definido aqui).

[0154] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um método para diagnóstico de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado, compreendendo os passos de: (a) uso de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da presente invenção, ou uso de um sistema de detecção da presente invenção, para determinação do conteúdo de sBCMA em uma amostra; e (b) comparação do conteúdo de sBCMA determinado no passo (a) com (i) um valor de corte predefinido para o conteúdo de sBCMA, indicando ausência de tal doença, ou (ii) o conteúdo de sBCMA determinado em uma amostra de controle representando ausência de tal doença,

em que um conteúdo de sBCMA mais elevado determinado no passo (a) em comparação com o valor de corte predefinido de (i) ou o conteúdo de sBCMA determinado na amostra de controle de (ii) indica a presença de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado.

[0155] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona também um método para monitorização da progressão de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado ou para monitorização da resposta ao tratamento de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado, compreendendo os passos de: (a) uso de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da presente invenção, ou uso de um sistema de detecção da presente invenção, para determinação do conteúdo de sBCMA em um primeiro ponto temporal em uma amostra biológica obtida de um sujeito diagnosticado com tal doença; (b) uso de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) da presente invenção, ou uso de um sistema de detecção da presente invenção, para determinação do conteúdo de sBCMA em um segundo ponto temporal (posterior) ou após tratamento em uma amostra biológica obtida do sujeito; e (c) comparação do conteúdo de sBCMA determinado no passo (a) com o conteúdo de sBCMA determinado no passo (b); em que um conteúdo mais elevado de sBCMA determinado no passo (a) em comparação com o conteúdo de sBCMA determinado no passo (b) indica que a doença está progredindo, e/ou em que um conteúdo mais baixo de sBCMA determinado no passo (a) em comparação com o conteúdo de sBCMA determinado no passo (b) indica que a referida doença está entrando em remissão ou que a referida doença está respondendo ao tratamento.

[0156] Se prevê para os métodos acima que a “amostra” seja uma amostra biológica, tal como uma amostra biológica humana. A amostra pode ser uma amostra de soro (humano), amostra de plasma, amostra de sangue, amostra de medula óssea, amostra de tecido ou sobrenadante obtido de uma cultura de células de células mononucleares da medula óssea (humanas) ou células mononucleares do sangue periférico (humanas). A “amostra” pode ser também obtida de um sujeito humano, preferencialmente um sujeito humano suspeito de ter ou tendo (sendo diagnosticado com) uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado, ou um sujeito tendo recebido tratamento para uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado, como definido anteriormente.

[0157] Se prevê para os métodos acima que a “doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado” possa ser um neoplasma positivo quanto a BCMA. A doença ou o neoplasma positivo quanto a BCMA pode ser selecionado do grupo consistindo em mieloma múltiplo, mieloma múltiplo recidivado e/ou refratário, mieloma múltiplo de cadeia pesada, mieloma múltiplo de cadeia leve, mieloma extramedular (plasmocitoma extramedular, mieloma múltiplo extramedular), plasmocitoma, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia de Waldenström (linfoma linfoplasmático), mieloma latente (mieloma múltiplo latente), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma primário do CNS (PCNSL) e linfoma não-Hodgkin de células B (B-NHL).

[0158] A presente invenção se refere aos seguintes itens:

Item 1. Um anticorpo monoclonal que se liga a BCMA solúvel (sBCMA), em que a ligação do anticorpo a sBCMA ocorre na presença de um segundo anticorpo monoclonal se ligando a sBCMA.

Item 2. O anticorpo monoclonal de acordo com o item 1, em que sBCMA tem a sequência de aminoácidos como ilustrado em SEQ ID NO: 34. Item 3. O anticorpo monoclonal de acordo com o item 1 ou 2, em que a ligação do anticorpo monoclonal a sBCMA ocorre na presença de um terceiro anticorpo ou construto de anticorpo se ligando a sBCMA.

Item 4. O anticorpo monoclonal de acordo com o item 3, em que o terceiro anticorpo monoclonal ou construto de anticorpo se liga ao agrupamento de epítopos 3 de BCMA, preferencialmente ao agrupamento de epítopos 3 de BCMA humano, preferencialmente tendo uma sequência de aminoácidos como ilustrado em SEQ ID NO: 35. Item 5. O anticorpo monoclonal de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que o anticorpo monoclonal compreende uma região VH de coelho e/ou uma região VL de coelho.

Item 6. O anticorpo monoclonal de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que o anticorpo monoclonal tem uma afinidade (KD) por sBCMA de cerca de ≤10-7 M, ≤10-8 M, ≤10-9 M ou ≤10-10 M.

Item 7. O anticorpo monoclonal de acordo com o item 6, em que a afinidade é determinada em um ensaio Biacore.

Item 8. O anticorpo monoclonal de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que o anticorpo monoclonal:

a) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 1, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 2 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 3 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 4, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 5 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 6; b) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 11, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 12 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 13 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 14, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 15 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 16; c) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 21, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 22 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 23 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 24, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 25 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 26; d) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de a) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de a); e) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de b) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de b); ou f) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de c) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de c). Item 9. O anticorpo monoclonal de acordo com o item 8, compreendendo:

a) uma região VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, 65% ou 70%, preferencialmente pelo menos 75% ou 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e, o mais preferencialmente, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homóloga a SEQ ID NO: 7; e uma região VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, 65% ou 70%, preferencialmente pelo menos 75% ou 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e, o mais preferencialmente, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homóloga a SEQ ID NO: 8; e opcionalmente compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 1, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 2 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 3 e, opcionalmente, compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 4, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 5 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 6; b) uma região VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, 65% ou 70%, preferencialmente pelo menos 75% ou 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e, o mais preferencialmente, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homóloga a SEQ ID NO: 17; e uma região VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, 65% ou 70%, preferencialmente pelo menos 75% ou 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e, o mais preferencialmente, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homóloga a SEQ ID NO: 18; e opcionalmente compreendendo uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 11, uma VH-

CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 12 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 13 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 14, uma VL- CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 15 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 16; ou c) uma região VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, 65% ou 70%, preferencialmente pelo menos 75% ou 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e, o mais preferencialmente, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homóloga a SEQ ID NO: 27; e uma região VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, 65% ou 70%, preferencialmente pelo menos 75% ou 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e, o mais preferencialmente, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homóloga a SEQ ID NO: 28; e opcionalmente compreendendo uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 21, uma VH- CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 22 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 23 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 24, uma VL- CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 25 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 26; Item 10. O anticorpo monoclonal de acordo com o item 8, em que o anticorpo monoclonal: a) compreende uma região VH como ilustrado em qualquer uma de SEQ ID NOs: 7, 17 ou 27; b) compreende uma região VL como ilustrado em qualquer uma de SEQ ID NOs: 8, 18 ou 28;

c) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 7 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 8; d) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 17 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 18; e) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 27 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 28; f) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de c) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de c); g) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de d) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de d); ou h) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de e) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de e). Item 11. O anticorpo monoclonal de acordo com qualquer um dos itens 7 a 10, em que a ligação ao epítopo de sBCMA é determinada através de mapeamento de epítopos com moléculas de BCMA quiméricas ou mutadas, mutagênese sítio-dirigida (p.ex., varredura de alanina), mapeamento de epítopos de mutagênese shotgun de elevada produtividade, espectrometria de massa acoplada a reticulação, cocristalografia de raios- X, microscopia eletrônica criogênica e troca hidrogênio- deutério.

Item 12. O anticorpo monoclonal de acordo com qualquer um dos itens 7 a 10, em que a competição pela ligação a sBCMA é determinada em um ensaio ELISA competitivo, em um ensaio de competição Octet (como descrito no Exemplo 2 aqui) ou em um ensaio de competição usando micropartículas acopladas à avidina.

Item 13. O anticorpo monoclonal de acordo com qualquer um dos itens 7 a 10 ou 12, em que a competição pela ligação a sBCMA é definida como uma competição ocorrendo entre os dois anticorpos testados de pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%. Item 14. O anticorpo monoclonal de acordo com qualquer um dos itens precedentes, que é um anticorpo IgG, IgD, IgE, IgM ou IgA, preferencialmente um anticorpo IgG, tal como um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Item 15. O anticorpo monoclonal de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que o anticorpo monoclonal e/ou o segundo anticorpo monoclonal se ligam(liga) a sBCMA em uma amostra biológica, preferencialmente uma amostra biológica humana, tal como uma amostra de soro (humano), um amostra de plasma (humano), uma amostra de sangue (humano), uma amostra de medula óssea (humana), uma amostra de tecido (humano) ou sobrenadante obtido de uma cultura de células de células mononucleares da medula óssea (humanas) ou células mononucleares do sangue periférico (humanas). Item 16. Um polinucleotídeo codificando um anticorpo monoclonal como definido em qualquer um dos itens precedentes.

Item 17. Um vetor compreendendo o polinucleotídeo como definido no item 16. Item 18. Uma célula hospedeira transformada ou transfectada com o polinucleotídeo como definido no item 16 ou com o vetor como definido no item 17. Item 19. Um processo para produção de um anticorpo monoclonal como definido em qualquer um dos itens 1 a 15, compreendendo o referido processo cultivo de uma célula hospedeira como definida no item 18 sob condições permitindo a expressão do referido anticorpo monoclonal e recuperação do anticorpo monoclonal produzido a partir da cultura.

Item 20. Uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal como definido em qualquer um dos itens 1 a 15 ou produzido de acordo com o processo do item 19. Item 21. Um sistema de detecção compreendendo: a) um primeiro anticorpo monoclonal que se liga a sBCMA e b) um segundo anticorpo monoclonal um primeiro monoclonal a sBCMA, em que a ligação do primeiro anticorpo monoclonal a sBCMA ocorre na presença do segundo anticorpo monoclonal se ligando a sBCMA e/ou em que a ligação do segundo anticorpo monoclonal a sBCMA ocorre na presença do primeiro anticorpo monoclonal se ligando a sBCMA.

Item 22. O sistema de detecção de acordo com o item 21, em que sBCMA tem a sequência de aminoácidos como ilustrado em SEQ ID NO: 34. Item 23. O sistema de detecção de acordo com o item 21 ou 22, em que a ligação do primeiro anticorpo monoclonal a sBCMA e a ligação do segundo anticorpo monoclonal a sBCMA ocorrem na presença de um terceiro anticorpo ou construto de anticorpo se ligando a sBCMA.

Item 24. O sistema de detecção de acordo com o item 23, em que o terceiro anticorpo ou construto de anticorpo se liga ao agrupamento de epítopos 3 de BCMA, preferencialmente ao agrupamento de epítopos 3 de BCMA humano, preferencialmente tendo uma sequência de aminoácidos como ilustrado em SEQ ID NO: 35. Item 25. O sistema de detecção de acordo com qualquer um dos itens 21 a 24, em que o primeiro anticorpo monoclonal e/ou o segundo anticorpo monoclonal compreendem(compreende) uma região VH de coelho e/ou uma região VL de coelho.

Item 26. O sistema de detecção de acordo com qualquer um dos itens 21 a 25, em que o primeiro anticorpo monoclonal e/ou o segundo anticorpo monoclonal têm uma afinidade (KD) por sBCMA de cerca de ≤10-7 M, ≤10-8 M, ≤10-9 M ou ≤10-10 M.

Item 27. O sistema de detecção de acordo com qualquer um dos itens 21 a 26, em que o primeiro anticorpo monoclonal: a) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 1, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 2 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 3 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 4, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 5 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 6; b) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 11, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 12 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 13 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 14, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 15 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 16; ou c) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de a) ou b) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de a) ou b); e/ou em que o segundo anticorpo monoclonal: d) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 21, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 22 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 23 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 24, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 25 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 26; ou e) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de d) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de d). Item 28. O sistema de detecção de acordo com o item 27, em que o primeiro anticorpo monoclonal: a) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 7 ou 17; b) compreende uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 8 ou 18; c) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 7 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 8; d) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 17 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 18; ou e) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de c) ou d) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de c) ou d); e/ou em que o segundo anticorpo monoclonal: f) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 27; g) compreende uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 28; h) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 27 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 28; ou i) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de h) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de h). Item 29. O sistema de detecção de acordo com qualquer um dos itens 21 a 28, em que o primeiro anticorpo monoclonal e/ou o segundo anticorpo monoclonal é/são um anticorpo IgG,

IgD, IgE, IgM ou IgA, preferencialmente um anticorpo IgG, tal como um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Item 30. O sistema de detecção de acordo com qualquer um dos itens 21 a 29, em que o primeiro anticorpo monoclonal é usado como anticorpo de captura, e o segundo anticorpo monoclonal é usado como anticorpo de detecção, ou em que o primeiro anticorpo monoclonal é usado como anticorpo de detecção, e o segundo anticorpo monoclonal é usado como anticorpo de captura.

Item 31. Uso de um anticorpo monoclonal de qualquer um dos itens 1 a 15 ou do sistema de detecção de qualquer um dos itens 21 a 30 para: - detecção de sBCMA em uma amostra; - quantificação de sBCMA em uma amostra; - diagnóstico de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado; - estratificação de pacientes diagnosticados com uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado; - monitorização da progressão de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado; ou - monitorização da resposta ao tratamento de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado.

Item 32. Um método para detecção e/ou quantificação de sBCMA em uma amostra, compreendendo os passos de: (a) uso de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) de qualquer um dos itens 1 a 15, ou uso de um sistema de detecção de qualquer um dos itens 21 a 30, para determinação do conteúdo de sBCMA em uma amostra; e

(b) comparação do conteúdo de sBCMA determinado no passo (a) com (i) um valor predefinido para o conteúdo de sBCMA, (ii) o conteúdo de sBCMA determinado em uma amostra de controle ou (iii) o conteúdo de sBCMA determinado em uma amostra obtida da mesma fonte ou sujeito em um ponto temporal prévio.

Item 33. Um método para diagnóstico de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado, compreendendo os passos de: (a) uso de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) de qualquer um dos itens 1 a 15, ou uso de um sistema de detecção de qualquer um dos itens 21 a 30, para determinação do conteúdo de sBCMA em uma amostra; e (b) comparação do conteúdo de sBCMA determinado no passo (a) com (i) um valor de corte predefinido para o conteúdo de sBCMA, indicando ausência de tal doença, ou (ii) o conteúdo de sBCMA determinado em uma amostra de controle representando ausência de tal doença, em que um conteúdo de sBCMA mais elevado determinado no passo (a) em comparação com o valor de corte predefinido de (i) ou o conteúdo de sBCMA determinado na amostra de controle de (ii) indica a presença de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado.

Item 34. Um método para monitorização da progressão de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado ou para monitorização da resposta ao tratamento de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado, compreendendo os passos de: (a) uso de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) de qualquer um dos itens 1 a 15, ou uso de um sistema de detecção de qualquer um dos itens 21 a 30, para determinação do conteúdo de sBCMA em um primeiro ponto temporal em uma amostra biológica obtida de um sujeito diagnosticado com tal doença; (b) uso de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo) de qualquer um dos itens 1 a 15, ou uso de um sistema de detecção de qualquer um dos itens 21 a 30, para determinação do conteúdo de sBCMA em um segundo ponto temporal ou após tratamento em uma amostra biológica obtida do sujeito; e (c) comparação do conteúdo de sBCMA determinado no passo (a) com o conteúdo de sBCMA determinado no passo (b); em que um conteúdo mais elevado de sBCMA determinado no passo (a) em comparação com o conteúdo de sBCMA determinado no passo (b) indica que a doença está progredindo, e/ou em que um conteúdo mais baixo de sBCMA determinado no passo (a) em comparação com o conteúdo de sBCMA determinado no passo (b) indica que a referida doença está entrando em remissão ou que a referida doença está respondendo ao tratamento.

Item 35. O uso do item 31 ou o método de qualquer um dos itens 32 a 34, em que a amostra é uma amostra biológica, preferencialmente uma amostra biológica humana, tal como uma amostra de soro, uma amostra de plasma, uma amostra de sangue, uma amostra de medula óssea, uma amostra de tecido ou sobrenadante obtido de uma cultura de células de células mononucleares da medula óssea ou células mononucleares do sangue periférico. Item 36. O uso do item 31 ou 35 ou o método de qualquer um dos itens 32 a 35, em que a amostra é obtida de um sujeito humano, preferencialmente um sujeito humano suspeito de ter ou tendo uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado, ou um sujeito tendo recebido tratamento para uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado. Item 37. O uso de qualquer um dos itens 31, 35 ou 36 ou o método de qualquer um dos itens 32 a 36, em que a doença é selecionada do grupo consistindo em mieloma múltiplo, mieloma múltiplo recidivado e/ou refratário, mieloma múltiplo de cadeia pesada, mieloma múltiplo de cadeia leve, mieloma extramedular (plasmocitoma extramedular, mieloma múltiplo extramedular), plasmocitoma, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia de Waldenström (linfoma linfoplasmático), mieloma latente (mieloma múltiplo latente), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma primário do CNS (PCNSL) e linfoma não-Hodgkin de células B (B-NHL).

[0159] Como usado aqui, as formas singulares “um", “uma” e “o/a” incluem formas referências plurais a não ser que o contexto indique claramente de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a “um reagente” inclui um ou mais de tais reagentes diferentes e a referência ao “método” inclui referência a passos e métodos equivalentes conhecidos dos peritos na técnica que poderiam ser modificados ou substituídos pelos métodos descritos aqui.

[0160] A não ser que de outro modo indicado, o termo “pelo menos” precedendo uma série de elementos é para ser entendido como se referindo a cada elemento na série. Os peritos na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita aqui. Tais equivalentes se destinam a serem englobados pela presente invenção.

[0161] O termo “e/ou” sempre que usados aqui inclui o significado de "e", “ou” e “toda ou qualquer outra combinação dos elementos conectados ao referido termo”.

[0162] O termo “cerca de” ou “aproximadamente” como usado aqui significa dentro de ±20%, preferencialmente dentro de ±15%, mais preferencialmente dentro de ±10% e, o mais preferencialmente, dentro de ±5% de um dado valor ou gama. Inclui também o valor concreto, p.ex., “cerca de 50” inclui o valor "50”.

[0163] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações, a não ser que o contexto requeira de outro modo, a palavra “compreendem”, e variações tais como “compreende” e “compreendendo”, será entendida como implicando a inclusão de um número inteiro ou passos ou grupo de números inteiros ou passos apresentado, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou passo ou grupo de números inteiros ou passos. Quando usado aqui, o termo “compreendendo” pode ser substituído pelo termo “contendo” ou “incluindo” ou por vezes quando usado aqui pelo termo “tendo”.

[0164] Quando usado aqui, “consistindo em” exclui qualquer elemento, passo ou ingrediente não especificado no elemento da reivindicação. Quando usado aqui, “consistindo essencialmente em” não exclui materiais ou passos que não afetam materialmente as características novas e básicas da reivindicação.

[0165] Em cada caso aqui, qualquer um dos termos “compreendendo”, “consistindo essencialmente em” e “consistindo em” pode ser substituído por qualquer um dos outros dois termos.

[0166] Deve ser entendido que a descrição acima e os exemplos em baixo proporcionam arranjos exemplificativos, mas a presente invenção não está limitada às metodologias, técnicas, protocolos, materiais, reagentes, substâncias, etc. particulares, descritos aqui e pois tais podem variar. A terminologia usada aqui é para o propósito de descrever modalidades particulares somente e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é definido meramente pelas reivindicações. Aspectos da invenção são proporcionados nas reivindicações independentes. Algumas características opcionais da invenção são proporcionadas nas reivindicações dependentes.

[0167] Todas as publicações e patentes citadas ao longo do texto deste relatório descritivo (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções, etc.), estejam supra ou infra, são deste modo incorporadas por referência em sua totalidade. Nada aqui é para ser interpretado como uma admissão de que a invenção não está intitulada a antecipar tal divulgação em virtude da invenção prévia. Na medida em que o material incorporado por referência contradiga ou seja inconsistente com este relatório descritivo, o relatório descritivo substituirá qualquer tal material.

[0168] Um melhor entendimento da presente invenção e das suas vantagens será obtido a partir dos seguintes exemplos, oferecidos para propósitos ilustrativos somente.

Os exemplos não se destinam a limitar e não devem ser interpretados como limitando o escopo da presente invenção de modo algum.

EXEMPLOS Exemplo 1: Geração de mAbs em sanduíche anti-sBCMA monoclonais de coelho

[0169] O objetivo dos presentes esforços foi gerar um par de anticorpos não interferentes (“par em sanduíche”) para detectar sBCMA, mesmo na presença de um anticorpo ou construto de anticorpo anti-BCMA terapêutico, tal como “Ther-Ab1” ou “Ther-Ab2” ou outros anticorpos/construtos de anticorpos, tais como aqueles tendo as mesmas CDRs ou CDRs similares e/ou se ligando ao mesmo epítopo dentro de sBCMA. Ther-Ab2 é um construto de anticorpo biespecífico de meia- vida prolongada CD3xBCMA que foi previamente mostrado que se liga ao agrupamento de epítopos 3 (SEQ ID NO: 35) do domínio extracelular de BCMA, ver WO 2013/072406. Ther-Ab1 tem um formato de IgG1 e foi presentemente mostrado que interfere com a detecção/quantificação de BCMA usando um estojo de ELISA comercial (R&D systems goat polyclonal antibody BCMA capture and detect), ver Fig. 1A). Ther-Ab1 é divulgado em WO 2014/089335 como tendo as seguintes sequências de aminoácidos: VH-CDRs (SEQ ID NOs: 4-6), VL-CDRs (SEQ ID NOs: 106-108), VH (SEQ ID NO: 206), VL (SEQ ID NO: 240) de WO 2014/089335.

[0170] Em um próximo passo, cerca de 400 hibridomas XenoMouse® foram gerados contra BCMA e testaram positivo em um ensaio ELISA para ligação a BCMA. No entanto, o rastreamento destes hibridomas XenoMouse® não identificou nenhum anticorpo em sanduíche com Ther-Ab1, mesmo quando se usaram diferentes formatos de Octet (ver Fig. 1B).

[0171] Em um passo subsequente, campanhas de imunização de coelhos foram levadas a cabo com uma proteína quimérica compreendendo BCMA como imunógeno. Os soros de coelho foram rastreados quanto ao ensanduichamento com Ther-Ab1. Os seguintes materiais foram usados: • Biossensores de estreptavidina (Pall ForteBio 18-5021) • BCMA biotinilado • Ther-Ab1 • Sangramentos terminais de coelho • IgG irrelevante de coelho (Abcam 172730) • Microplaca de polipropileno preto de fundo plano de 384 poços (Greiner BioOne 781209) • Microplaca de polipropileno preto de fundo plano de 96 poços (Greiner BioOne 655209) • ForteBio Octet HTX • Tampão de ensaio Octet (Tris a 10 mM, Triton a 0,1%, NaCl a 150 mM, CaCl2 a 1 mM, BSA a 0,1 mg/mL, pH 7,4)

[0172] Todas as amostras foram preparadas em tampão de ensaio Octet. Ther-Ab1 e IgG irrelevante de coelho foram preparados a 10 µg/mL e Biotina-BCMA a 0,15 µg/mL. As amostras foram adicionadas a uma placa de 384 poços a 80 µL/poço. Os biossensores foram pré-incubados em 200 µL de tampão Octet usando as placas de 96 poços.

[0173] O ensaio foi configurado no ForteBio HTX para operar como se segue (ver também Fig. 1C)):

1. Linha de base (tampão octet, 60 segundos)

2. Carga (Biotina-BCMA, 300 segundos)

3. Associação (Ther-Ab1, 900 segundos)

4. Linha de base (tampão octet, 60 segundos)

5. Anticorpo em sanduíche (soros de coelho ou anticorpo IgG irrelevante, 300 segundos)

[0174] A função de análise de ponto repórter no Octet foi usada para determinar o sinal de ligação no passo de sanduíche de anticorpo. O passo de sanduíche de anticorpo foi em primeiro lugar alinhada até zero tal que o sinal calculado fosse o valor absoluto. Os anticorpos em sanduíche com Ther-Ab1 foram confirmados em soros de coelho por Octet.

[0175] Após enriquecimento adicional de células derivadas de coelho que se ligam a BCMA, outro ensaio de sanduíche Octet BCMA foi levado a cabo com Ther-Ab2, confirmando a existência de anticorpos em sanduíche com Ther- Ab2.

[0176] Finalmente, três novos anticorpos anti-sBCMA de coelho foram identificados (sBCMA-mAb1, sBCMA-mAb2 e sBCMA- mAb3), e suas regiões variáveis de cadeia pesada e leve foram sequenciadas. Nos seguintes ensaios, estes anticorpos foram caracterizados em mais detalhe. Exemplo 2: Caracterização de mAbs em sanduíche anti-sBCMA monoclonais de coelho em ensaios Octet

[0177] a) Os anticorpos recombinantes purificados sBCMA-mAb1 e sBCMA-mAb2 foram selecionados para ensanduichamento com Ther-Ab2. Os seguintes materiais foram usados: • Biossensores anti-huFc (cinéticos) (Pall ForteBio 18- 5064) • BCMA • Ther-Ab2 • Construto de anticorpo biespecífico (CD3 x alvo-X) irrelevante (diferindo de Ther-Ab2 somente no domínio de ligação ao alvo) • sBCMA-mAb2 não purificado mas sobrenadante quantificado

• sBCMA-mAb1 • IgG irrelevante de coelho (Abcam 172730) • Microplaca de polipropileno preto de fundo inclinado de 384 poços (ForteBio 18-5080) • Microplaca de polipropileno preto de fundo plano de 96 poços (GreinerBioOne 655209) • ForteBio Octet HTX • Tampão de ensaio Octet (Tris a 10 mM, Triton a 0,1%, NaCl a 150 mM, CaCl2 a 1 mM, BSA a 0,1 mg/mL, pH 7,4)

[0178] Todas as amostras foram preparadas em tampão de ensaio Octet. Anticorpos de teste, IgG irrelevante de coelho e construto de anticorpo biespecífico irrelevante foram preparados a 5 µg/mL. BCMA foi preparado a 2 µg/mL. As amostras foram adicionadas à placa de 384 poços a 60 µL/poço. Os biossensores foram pré-incubados em 200 µL de tampão Octet usando as placas de 96 poços.

[0179] O ensaio foi configurado no ForteBio HTX para operar como se segue:

1. Linha de base (tampão Octet, 60 segundos)

2. Carga do primeiro anticorpo (Ther-Ab2 ou construto de anticorpo biespecífico irrelevante, 120 segundos)

3. Ativação (BCMA, 120 segundos)

4. Linha de base (tampão Octet, 60 segundos)

5. Segundo anticorpo (sBCMA-mAb2, sBCMA-mAb1 ou anticorpo de Coelho irrelevante, 120 segundos)

[0180] A função de análise de ponto repórter no Octet foi usada para determinar o sinal de ligação no passo de segundo anticorpo. O passo de segundo anticorpo foi em primeiro lugar alinhada até zero tal que o sinal calculado fosse o valor absoluto. Os resultados são mostrados na Fig. 2. Foi mostrado que os anticorpos anti-sBCMA de coelho sBCMA-mAb1 e sBCMA- mAb2 ensanduícham com Ther-Ab2.

[0181] b) Em linha com o ensaio descrito no Exemplo 2a), ensaios Octet adicionais foram levados a cabo. A seguinte configuração demonstrou que os anticorpos sBCMA- mAb1 e sBCMA-mAb2 partilham um epítopo de sBCMA similar (ensaio de competição):

1. Linha de base (tampão Octet)

2. Carga de primeiro anticorpo (Ther-Ab2)

3. Ativação (BCMA)

4. Linha de base (tampão Octet)

5. Anticorpo de coelho 1 (sBCMA-mAb1, sBCMA-mAb2 ou anticorpo IgG de coelho irrelevante, ver em baixo tabela 2)

6. Anticorpo de coelho 2 (sBCMA-mAb2, sBCMA-mAb1 ou anticorpo IgG de coelho irrelevante, ver em baixo tabela 2) Tabela 2: Combinações de anticorpos de coelho 1 e 2 em diferentes abordagens experimentais (1-9) Anticorpo Anticorpo Ensaio Rb 1 Rb 2 1 sBCMA-mAb1 sBCMA-mAb1 2 sBCMA-mAb1 sBCMA-mAb2 sBCMA-mAb1 IgG de Rb 3 irr 4 sBCMA-mAb2 sBCMA-mAb1 5 sBCMA-mAb2 sBCMA-mAb2 sBCMA-mAb2 IgG de Rb 6 irr 7 Rb-IgG irr sBCMA-mAb1

8 Rb-IgG irr sBCMA-mAb2 IgG de Rb 9 Rb-IgG irr irr

[0182] c) Notavelmente, somente um dos 226 anticorpos de coelho contra sBCMA foi capaz de ensanduichar com Ther- Ab2 e sBCMA-mAb1, nomeadamente, sBCMA-mAb3. Isto foi demonstrado em um ensaio de sanduíche Octet compreendendo os seguintes passos:

1. Capturar Fc anticoelho de cabra B no sensor Octet SA

2. Ligar sBCMA-mAb1

3. Bloquear o sensor com IgG irrelevante

4. Ligar Ther-Ab2 ou construto de anticorpo biespecífico irrelevante +/- BCMA

5. Ligar sBCMA-mAb3

[0183] Os resultados são mostrados na Fig. 3. Eles foram confirmados em um ensaio adicional usando sBCMA-mAb1 e sBCMA- mAb3 como anticorpos recombinantes purificados e compreendendo os seguintes passos de sanduíche Octet:

1. Capturar Fc anticoelho de cabra B no sensor Octet SA

2. Ligar sBCMA-mAb1

3. Bloquear o sensor com IgG irrelevante

4. Ligar +/- BCMA

5. Ligar Ther-Ab2

6. Ligar sBCMA-mAb3

[0184] Os resultados são mostrados na Fig. 4. A substituição de sBCMA-mAb1 por um IgG irrelevante no passo 2 não levou a qualquer sinal no ensaio após adição adicional de BCMA, Ther-Ab2 e sBCMA-mAb3 (controle negativo).

[0185] d) A seguinte configuração demonstrou que a sanduíche sBCMA/Ther-Ab2 ótima - em termos de interferência mínima com Ther-Ab2 - é capturar com sBCMA-mAb1 e detectar com sBCMA-mAb3:

1. Capturar Fc anticoelho de cabra B no sensor Octet SA

2. Ligar sBCMA-mAb1 (configuração 1) ou ligar sBCMA-mAb3 (configuração 2)

3. Bloquear o sensor com IgG irrelevante

4. Ligar +/- BCMA

5. Ligar Ther-Ab2

6. Ligar sBCMA-mAb3 (configuração 1) ou ligar sBCMA-mAb1 (configuração 2)

[0186] A diferença de sinal entre uma configuração com e sem BCMA foi mais pronunciada quando se usou sBCMA-mAb1 como anticorpo de captura em comparação com o uso de sBCMA-mAb3 como anticorpo de captura. Exemplo 3: Determinação da afinidade de mAbs em sanduíche anti-sBCMA monoclonais de coelho

[0187] Os perfis de afinidade de ligação foram medidos para os seguintes mAbs em sanduíche anti-sBCMA monoclonais de coelho: - sBCMA-mAb1 (concentração de estoque 1,43 mg/mL) - sBCMA-mAb2 (concentração de estoque 2,251 mg/mL) - sBCMA-mAb3 (concentração de estoque 0,78 mg/mL)

[0188] As experiências foram realizadas usando um Biacore 3000 (GE Healthcare) a 25 °C. O tampão de operação foi HBS- P (HEPES a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, Tensoativo P-20 a 0,05%) + BSA a 0,1%, e a cinética foi realizada a um caudal elevado (100 µL/min). Glicina a 10 mM, pH 1,7 foi usada para regeneração.

[0189] Preparação da superfície: Um IgG Fc anticoelho de cabra (Prod. # 111-005-046 da Jackson Research) foi diluído

1/20 em NaAcetato, pH 5 e covalentemente acoplado à amostra e Fc de referência (Fc 1) de um chip sensor CM5 usando acoplamento de amina. Os mAbs individuais foram diluídos em HBS-P + BSA a 0,1% e capturados em Fc 2, 3 ou 4 a 0,3 µg/mL para análise cinética da ligação a sBCMA.

[0190] Parâmetros de Interação: sBCMA (estoque de 1,19 mg/mL) foi injetado como analito a 600 nM, 300 nM, 150 nM, 75 nM, 37,5 nM, 18,8 nM e 9,4 nM com o concentrado a 75 mM operado duas vezes para medir a reprodutibilidade. A taxa de associação foi monitorizada durante 2,5 minutos. O tempo de dissociação foi 20 minutos para determinar cinética mais precisa para aqueles mAbs com taxas de dissociação mais lentas. Os dados tinham referência de fundo dupla na medida em que tanto um Fc de referência como uma concentração de analito de 0 nM foram subtraídos dos dados. Um modelo de ligação de Langmuir 1:1 com transferência de massa foi usado a partir do software de avaliação Biacore.

[0191] Os resultados são mostrados na Fig. 5 e na seguinte Tabela 3: Tabela 3: Determinação da afinidade de mAbs em sanduíche anti-sBCMA monoclonais de coelho mAb KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) sBCMA-mAb1 1,03 x 10-10 6,3 x 105 6,47 x 10-5 sBCMA-mAb2 3,77 x 10-7 4,92 x 104 0,0185 sBCMA-mAb3 4,5 x 10-9 9,01 x 105 4,05 x 10-3 Tabela 4: Tabela de sequências SEQ Format Sequência de aminoácidos Design ID o/font ação NO e sBCMA- VH- SGYYIC 1 mAb1 CDR1 VH- CIYTGSSGSTDYASWAKG 2 CDR2 VH- DYGHSYWNL 3 CDR3 VL- QASEDISSRLA 4 CDR1 VL- AASTLAS 5 CDR2 VL- LGDYYVSSYGNA 6 CDR3

VH QSLEESGGDLVKPGAFLTLTCTASGFSFSSGYYICW

VRQAPGKGLEWIACIYTGSSGSTDYASWAKGRFTIS 7

KTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARDYGHSYWNLW GPGTLVTVSS VL DIVMTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASEDISSRLAWY

QQKPGQPPKLLIGAASTLASGVSSRFKGSRSGTEYT 8

LTISDLECADAATYYCLGDYYVSSYGNAFGGGTEVV VK H QSLEESGGDLVKPGAFLTLTCTASGFSFSSGYYICW VRQAPGKGLEWIACIYTGSSGSTDYASWAKGRFTIS KTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARDYGHSYWNLW GPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLG

CLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGL 9

YSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPS TCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQ QFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPA PIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLT CMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDG SYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQ KSISRSPGK L DIVMTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASEDISSRLAWY QQKPGQPPKLLIGAASTLASGVSSRFKGSRSGTEYT

LTISDLECADAATYYCLGDYYVSSYGNAFGGGTEVV 10

VKGDPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFP DVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSST

LTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC sBCMA- VH- SSYWIC 11 mAb2 CDR1 VH- CIYAGSGDFTYYASWAKG 12 CDR2 VH- DAATSYYSHYFTL 13 CDR3 VL- QASQSIYSGLA 14 CDR1 VL- DASDLAS 15 CDR2 VL- QVTHYESGVP 16 CDR3

VH QSLEESGGDLVKPGASLTLTCTASGFSFSSSYWICW

VRQAPGKGLEWIACIYAGSGDFTYYASWAKGRFTVS 17

KTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARDAATSYYSHY FTLWGPGTLVTVSS

VL DVVMTQTPASVSEPVGGTVTIKCQASQSIYSGLAWY 18 QQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGYGTEFT

LTISGVQCEDAATYYCQVTHYESGVPLGGGTEVVVE

H QSLEESGGDLVKPGASLTLTCTASGFSFSSSYWICW 19

VRQAPGKGLEWIACIYAGSGDFTYYASWAKGRFTVS KTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARDAATSYYSHY FTLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSST VTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQ SSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKT VAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPP LREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNK ALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRS VSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVL DSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHN HYTQKSISRSPGK L DVVMTQTPASVSEPVGGTVTIKCQASQSIYSGLAWY QQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGYGTEFT

LTISGVQCEDAATYYCQVTHYESGVPLGGGTEVVVE 20

GDPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDV TVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLT

LTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC sBCMA- VH- SYYYMC 21 mAb3 CDR1 VH- CIFSDSGGHTAYASWAEG 22 CDR2 VH- DRRDVVYIRDL 23 CDR3 VL- QSSESVYNNNALA 24 CDR1 VL- GASSLAS 25 CDR2 VL- AGYKRYNNDGHA 26 CDR3

VH QEQLEESGGGLVKPGGTLTLTCKASGMDFSSYYYMC

WVRQAPGKGLEWIACIFSDSGGHTAYASWAEGRFTI 27

SKTSSTTVTLQMTSLTVADTATYFCARDRRDVVYIR DLWGPGTLVTVSS VL ALVMTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSESVYNNNALA

WYQQKPGQPPKLLIYGASSLASGVPSRFKGSGSGTQ 28

FTLTISDLECDDAATYYCAGYKRYNNDGHAFGGGTE VVVK H QEQLEESGGGLVKPGGTLTLTCKASGMDFSSYYYMC WVRQAPGKGLEWIACIFSDSGGHTAYASWAEGRFTI SKTSSTTVTLQMTSLTVADTATYFCARDRRDVVYIR DLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTV TLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQS

SGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTV 29 APSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISR

TPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPL REQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKA LPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSV SLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLD SDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNH YTQKSISRSPGK L ALVMTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSESVYNNNALA WYQQKPGQPPKLLIYGASSLASGVPSRFKGSGSGTQ

FTLTISDLECDDAATYYCAGYKRYNNDGHAFGGGTE 30

VVVKGDPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKY FPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLS

STLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC Região GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEP 31 consta coelho VTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVT nte de SSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPP cadeia ELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQ pesada DDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVS exempl TLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKAR ificat GQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSD iva ISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSV

PTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK Região GDPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDV consta TVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLT nte de LTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC cadeia 32 coelho leve exempl ificat iva

MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLT CQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFV

LMFLLRKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSR 33 BCMA humano

TGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCF PLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKS

ISAR ECD de

BCMA MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLT 34 humano (sBCMA CQRYCNASVTNSVKGTNA ) Agrupa mento 35 de humano CQLRCSSNTPPLTCQRYC epítop os de

ECD de BCMA 3

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal que se liga a BCMA solúvel (sBCMA) caracterizado pelo fato de que a ligação do anticorpo a sBCMA ocorre na presença de um segundo anticorpo monoclonal se ligando a sBCMA.

2. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que sBCMA tem a sequência de aminoácidos como ilustrado em SEQ ID NO: 34.

3. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a ligação do anticorpo monoclonal a sBCMA ocorre na presença de um terceiro anticorpo ou construto de anticorpo se ligando a sBCMA.

4. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreende uma região VH de coelho e/ou uma região VL de coelho.

5. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal tem uma afinidade (KD) por sBCMA de cerca de ≤10-7 M, ≤10-8 M, ≤10-9 M ou ≤10-10 M.

6. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a afinidade é determinada em um ensaio Biacore.

7. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal: a) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 1, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 2 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID

NO: 3 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 4, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 5 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 6; b) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 11, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 12 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 13 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 14, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 15 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 16; c) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 21, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 22 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 23 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 24, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 25 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 26; d) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de a) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de a); e) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de b) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de b); ou f) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de c) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de c).

8. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal: a) compreende uma região VH como ilustrado em qualquer uma de SEQ ID NOs: 7, 17 ou 27;

b) compreende uma região VL como ilustrado em qualquer uma de SEQ ID NOs: 8, 18 ou 28; c) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 7 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 8; d) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 17 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 18; e) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 27 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 28; f) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de c) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de c); g) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de d) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de d); ou h) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de e) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de e).

9. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo IgG, IgD, IgE, IgM ou IgA, preferencialmente um anticorpo IgG, tal como um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

10. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal e/ou o segundo anticorpo monoclonal se ligam(liga) a sBCMA em uma amostra de soro humano, plasma humano ou sangue humano.

11. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que codifica um anticorpo monoclonal, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

12. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 11.

13. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que é transformada ou transfectada com o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 11, ou com o vetor, conforme definido na reivindicação 12.

14. Processo para produção de um anticorpo monoclonal, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que compreende cultivo de uma célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 13, sob condições permitindo a expressão do referido anticorpo monoclonal e recuperação do anticorpo monoclonal produzido a partir da cultura.

15. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo monoclonal, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou produzido de acordo com o processo, conforme definido na reivindicação 14.

16. Sistema de detecção caracterizado pelo fato de que compreende: a) um primeiro anticorpo monoclonal que se liga a sBCMA e b) um segundo anticorpo monoclonal um primeiro monoclonal a sBCMA, em que a ligação do primeiro anticorpo monoclonal a sBCMA ocorre na presença do segundo anticorpo monoclonal se ligando a sBCMA e/ou em que a ligação do segundo anticorpo monoclonal a sBCMA ocorre na presença do primeiro anticorpo monoclonal se ligando a sBCMA.

17. Sistema de detecção, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que sBCMA tem a sequência de aminoácidos como ilustrado em SEQ ID NO: 34.

18. Sistema de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que a ligação do primeiro anticorpo monoclonal a sBCMA e a ligação do segundo anticorpo monoclonal a sBCMA ocorrem na presença de um terceiro anticorpo ou construto de anticorpo se ligando a sBCMA.

19. Sistema de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo monoclonal e/ou o segundo anticorpo monoclonal compreendem(compreende) uma região VH de coelho e/ou uma região VL de coelho.

20. Sistema de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16, 17, 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo monoclonal e/ou o segundo anticorpo monoclonal têm uma afinidade (KD) por sBCMA de cerca de ≤10-7 M, ≤10-8 M, ≤10-9 M ou ≤10-10 M.

21. Sistema de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16, 17, 18, 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo monoclonal: a) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 1, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 2 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 3 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 4, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 5 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 6;

b) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 11, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 12 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 13 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 14, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 15 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 16; ou c) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de a) ou b) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de a) ou b); e/ou em que o segundo anticorpo monoclonal: d) compreende uma região VH compreendendo uma VH-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 21, uma VH-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 22 e uma VH-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 23 e uma região VL compreendendo uma VL-CDR1 como ilustrado em SEQ ID NO: 24, uma VL-CDR2 como ilustrado em SEQ ID NO: 25 e uma VL-CDR3 como ilustrado em SEQ ID NO: 26; ou e) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de d) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de d).

22. Sistema de detecção, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo monoclonal: a) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 7 ou 17; b) compreende uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 8 ou 18; c) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 7 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 8;

d) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 17 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 18; ou e) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de c) ou d) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de c) ou d); e/ou em que o segundo anticorpo monoclonal: f) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 27; g) compreende uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 28; h) compreende uma região VH como ilustrado em SEQ ID NO: 27 e uma região VL como ilustrado em SEQ ID NO: 28; ou i) se liga ao mesmo epítopo de sBCMA que o anticorpo de h) ou compete pela ligação a sBCMA com o anticorpo de h).

23. Sistema de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo monoclonal e/ou o segundo anticorpo monoclonal é/são um anticorpo IgG, IgD, IgE, IgM ou IgA, preferencialmente um anticorpo IgG, tal como um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

24. Sistema de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo monoclonal é usado como anticorpo de captura, e o segundo anticorpo monoclonal é usado como anticorpo de detecção, ou em que o primeiro anticorpo monoclonal é usado como anticorpo de detecção, e o segundo anticorpo monoclonal é usado como anticorpo de captura.

25. Uso de um anticorpo monoclonal, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou do sistema de detecção, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que é para: - detecção de sBCMA em uma amostra; - quantificação de sBCMA em uma amostra; - diagnóstico de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado; - estratificação de pacientes diagnosticados com uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado; - monitorização da progressão de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado; ou - monitorização da resposta ao tratamento de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado.

26. Método para detecção e/ou quantificação de sBCMA em uma amostra caracterizado pelo fato de que compreende os passos de: (a) uso de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo), conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou uso de um sistema de detecção, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, para determinação do conteúdo de sBCMA em uma amostra; e (b) comparação do conteúdo de sBCMA determinado no passo (a) com (i) um valor predefinido para o conteúdo de sBCMA, (ii) o conteúdo de sBCMA determinado em uma amostra de controle ou

(iii) o conteúdo de sBCMA determinado em uma amostra obtida da mesma fonte ou sujeito em um ponto temporal prévio.

27. Método para diagnóstico de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado caracterizado pelo fato de que compreende os passos de: (a) uso de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo), conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou uso de um sistema de detecção, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, para determinação do conteúdo de sBCMA em uma amostra; e (b) comparação do conteúdo de sBCMA determinado no passo (a) com (i) um valor de corte predefinido para o conteúdo de sBCMA, indicando ausência de tal doença, ou (ii) o conteúdo de sBCMA determinado em uma amostra de controle representando ausência de tal doença, em que um conteúdo de sBCMA mais elevado determinado no passo (a) em comparação com o valor de corte predefinido de (i) ou o conteúdo de sBCMA determinado na amostra de controle de (ii) indica a presença de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado.

28. Método para monitorização da progressão de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado ou para monitorização da resposta ao tratamento de uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado, caracterizado pelo fato de que compreende os passos de:

(a) uso de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo), conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou uso de um sistema de detecção, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, para determinação do conteúdo de sBCMA em um primeiro ponto temporal em uma amostra biológica obtida de um sujeito diagnosticado com tal doença; (b) uso de um anticorpo monoclonal (ou construto de anticorpo), conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou uso de um sistema de detecção, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, para determinação do conteúdo de sBCMA em um segundo ponto temporal ou após tratamento em uma amostra biológica obtida do sujeito; e (c) comparação do conteúdo de sBCMA determinado no passo (a) com o conteúdo de sBCMA determinado no passo (b); em que um conteúdo mais elevado de sBCMA determinado no passo (a) em comparação com o conteúdo de sBCMA determinado no passo (b) indica que a doença está progredindo, e/ou em que um conteúdo mais baixo de sBCMA determinado no passo (a) em comparação com o conteúdo de sBCMA determinado no passo (b) indica que a referida doença está entrando em remissão ou que a referida doença está respondendo ao tratamento.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 25, ou o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26, 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra biológica, preferencialmente uma amostra biológica humana, tal como uma amostra de soro, uma amostra de plasma, uma amostra de sangue, uma amostra de medula óssea, uma amostra de tecido ou sobrenadante obtido de uma cultura de células de células mononucleares da medula óssea ou células mononucleares do sangue periférico.

30. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 29, ou o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26, 27, 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que a amostra é obtida de um sujeito humano, preferencialmente um sujeito humano suspeito de ter ou tendo uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado, ou um sujeito tendo recebido tratamento para uma doença associada a sBCMA ou sBCMA aumentado.

31. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25, 29 ou 30, ou o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26, 27, 28, 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada do grupo consistindo em mieloma múltiplo, mieloma múltiplo recidivado e/ou refratário, mieloma múltiplo de cadeia pesada, mieloma múltiplo de cadeia leve, mieloma extramedular (plasmocitoma extramedular, mieloma múltiplo extramedular), plasmocitoma, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia de Waldenström (linfoma linfoplasmático), mieloma latente (mieloma múltiplo latente), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma primário do CNS (PCNSL) e linfoma não-Hodgkin de células B (B-NHL).