JP2021525779A - 機能性および製造可能性を改善するための普遍的なまたは正規化された抗体フレームワーク - Google Patents

Abstract

本発明は、診断上の適用のためのウサギモノクローナル抗体についての普遍的なまたは正規化された配列テンプレートを設計および製造する方法を提供する。本発明はさらに、熱安定性、長期安定性、発現、脱アミノ／酸化、および／または凝集のような望ましい抗体特性を最適化する方法を提供する。本発明はさらに、普遍的なまたは正規化されたウサギモノクローナル抗体テンプレートまたはフレームワークおよびそれらから得られる抗体を提供する。【選択図】図６Ａ

Description

関連出願の相互参照
本明細書により、２０１８年６月８日出願の米国仮特許出願第６２／６８２，７９５号の優先権を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ＡＳＣＩＩ対応テキストファイル（．ＴＸＴ）として提出された配列表の参照
２０１９年４月２６日に作成された２２１０４バイトの大きさ）のＡＳＣＩＩ準拠のテキストファイルの形式の配列表（「Ｐ３４８１４ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ＳＴ２５」という表題）は、本出願と同時に提出されており、配列表の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、可変領域を改変することにより、診断上の適用のためのウサギモノクローナル抗体を製造するための普遍的なまたは正規化された配列テンプレートを設計する方法を提供する。本発明はさらに、熱安定性、長期安定性、発現のような望ましい抗体特性、診断アッセイに悪影響を及ぼす可能性のある脱アミノ／酸化および／または凝集を、標的への結合特異性に悪影響を与えることなく最適化する方法を提供する。本発明はさらに、普遍的なまたは正規化された抗体テンプレートまたはフレームワーク、およびそれらから得らえるウサギモノクローナル抗体を提供する。

再現性のある結合比を改善する方法、ならびに免疫組織化学のような診断アッセイで使用するための安定性および開発可能性のために抗体フレームワーク領域を標準化するための方法を開発する必要がある。

原則として、抗体工学法を使用して、フレームワークおよび定常領域のような抗体テンプレートを標準化することができると同時に、抗体の特異性および親和性も維持することができる。

抗体の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）は、標的抗原に対する抗体の特異性および親和性の主な決定因子であるので、通常は改変されない。しかしながら、いくつかの場合において、ＣＤＲ配列自体が抗体の不安定性の原因となることがある。

実際には、蓄積された抗体工学の知識のほとんどは、ヒトおよびマウスの抗体に関する。しかしながら、ウサギモノクローナル抗体は、一次抗原検出試薬としても、二次シグナルの生成または増幅の試薬としても、いくつかの診断上の適用において使用されている。

一次抗体は、絶妙な特異性を持つ特定の腫瘍マーカーを選択するために使用され、二次抗体は、検出シグナルを生成するために使用される。各抗体は、特異性、親和性、産生レベル、安定性、および結合への適合性に関して独特である。この独自性は、アミノ酸配列に由来し、診断アッセイの開発および製造の標準化に課題をもたらしている。本発明者らは、この問題を解決するためにタンパク質工学を利用し、特に安定性のための抗体フレームワーク領域を標準化すること、より一般的には抗体の開発可能性について労力を注いだ。

ウサギモノクローナル抗体を使用することには数多くの利点がある。ウサギモノクローナル抗体を使用することにより、ある特定のタンパク質がヒトおよびマウスにおいて自己抗原として認識されるという問題が回避される。さらに、ウサギモノクローナル抗体は、小さなエピトープに対する改善された免疫応答を有し、より多様な範囲のエピトープを認識し、マウス抗原に対してより良好な応答を有する。したがって、ウサギモノクローナル抗体は、マウスのような他の宿主由来のモノクローナル抗体よりも抗原に対してより良好な反応を与える。

その上、ウサギモノクローナル抗体を使用すると、より正確な免疫組織化学の結果が得られ、このことは、ウサギの独特な免疫系による可能性がある。ウサギは、マウスよりも広範囲の高親和性抗体を生成することができる。それゆえ、同じように適切なマウス抗体を見つけるよりも、ある範囲の適用において機能することができるウサギ抗体を見つける方が見込みがある。加えて、マウスで貧弱な応答を誘発するより小さな多数のペプチドは、ウサギにおいて好ましい応答を生じる。これらの理由から、ウサギモノクローナル抗体は、研究上のおよび臨床上の適用においてより好ましくなってきている。

参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００４／００８６９７９は、ウサギ抗体を現すための方法を開示しており、該方法は、（ａ）親ウサギ抗体の該フレームワーク領域のアミノ酸配列を非ウサギ抗体の該フレームワーク領域のアミノ酸配列と比較することにより、該非ウサギ抗体の対応する位置のアミノ酸とは異なる該親ウサギ抗体のフレームワーク領域の表面に露出したアミノ酸を同定することと、（ｂ）該同定されたアミノ酸を、非ウサギ抗体の該対応する位置のアミノ酸で置換して、該ウサギ抗体を現すこととを含む。

参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００５／０３０３３１は、ウサギモノクローナル抗体をヒト化する方法を開示しており、該方法は、（ａ）親ウサギ抗体の重および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、類似のヒト抗体の重および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と比較することと、（ｂ）該ウサギ抗体の該重および軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域内のアミノ酸を変化させることにより、該変化したフレームワーク領域が、該類似のヒト抗体の等価のフレームワーク領域に対して配列がより類似するようになることとを含み、該変化したアミノ酸は、相補性決定領域（ＣＤＲ）接触、鎖間接触に関与していないか、または実質的に異なる側鎖を有する埋もれた残基である。

参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４６２，６９７号は、ａ）のウサギ抗体のアミノ酸配列を、親ウサギ抗体と同じウサギから得られた複数の関連抗体のアミノ酸配列と比較することによって、該親ウサギ抗体における変異の寛容性のある位置を同定し、この中で、該親抗体および該関連抗体は、ｉ）同じ抗原に結合し、ｉｉ）各々が、互いに対して少なくとも９０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含み、ｉｉｉ．各々が、互いに対して少なくとも９０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み、ｉｖ．互いに対して０、１、または２のアミノ酸置換を除いて、長さが同一でありかつ配列が同一であるＨ３ ＣＤＲを有し、ｖ．互いに対して０、１、または２のアミノ酸置換を除いて、長さが同一でありかつ配列が同一であるＬ３ ＣＤＲを有することと、ｂ）該親ウサギ抗体のアミノ酸配列をヒト抗体のアミノ酸配列と整列させ、この中で、該ヒト抗体が、該親ウサギ抗体と最も均質である１０のヒト抗体のうちの１つであることと、ｃ）該変異の寛容性のある位置に存在するアミノ酸を、該ヒト抗体の対応するアミノ酸で置換して、ヒト化抗体を生成することと、を含む、ウサギ抗体をヒト化するための方法を開示している。

したがって、熱安定性のような望ましい抗体特徴を最適化する、標準化された、普遍的な、または正規化された（相互交換可能に使用）ウサギモノクローナル抗体フレームワークまたはテンプレートを提供する必要がある。熱安定性の向上と凝集の低下は、診断アッセイの標準化にとって重要な保存期間の延長につながる。

本発明は、野生型ウサギ抗体を選択することと、望ましい特性を最適化するために正規化したウサギ抗体を得るために該野生型ウサギ抗体を突然変異させることとを含む、正規化されたウサギ抗体を設計および製造する方法を提供する。

本開示の一態様において、野生型ウサギ抗体を選択することと、野生型抗体配列を熱安定性であるおよび／または少なくとも１２か月間の長期安定性を有することが公知のウサギ抗体における同じ位置で最も頻繁に生じる接合領域におけるアミノ酸残基のセットを可変フレームワークおよび／または接合領域において含む正規化された抗体と比較し、正規化された配列とは異なる野生型抗体における１以上のアミノ酸残基を同定することと、ステップ（ｂ）において同定された野生型抗体の該１以上のアミノ酸残基を、正規化された配列の対応するアミノ酸残基へ突然変異させて、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体を得ることとを含み、抗体の標的に対する抗体の結合親和性は、改変されていない野生型抗体の結合親和性と比較したとき、許容範囲内にとどまる。いくつかの実施形態において、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体は、ＶＨ鎖において配列番号１、４、５、６、７、８、９、または１０によるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体は、Ｖｋ鎖において配列番号２、１２、１３、１４、１５、１６、または１７によるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体は、配列番号１、４、５、６、７、８、９、または１０によるアミノ酸配列と、配列番号２、１２、１３，１４，１５，１６，または１７によるアミノ酸配列とを含む。いくつかの実施形態において、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体は、野生型ウサギ抗体と比較して改善された熱安定性を呈する。いくつかの実施形態において、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体は、野生型ウサギ抗体と比較して、改善された長期安定性を呈する。いくつかの実施形態において、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体は、野生型ウサギ抗体と比較して、改善された脱アミノを呈する。いくつかの実施形態において、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体は、野生型ウサギ抗体と比較して改善された発現を呈する。いくつかの実施形態において、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体は、一次ウサギ抗体である。いくつかの実施形態において、突然変異はカッパ鎖のＪ１領域にある。いくつかの実施形態では、突然変異はカッパ鎖のＦＲ４領域にある。いくつかの実施形態において、突然変異は、重鎖のＪ２、Ｊ４、および／またはＪ６領域にある。いくつかの実施形態において、抗体のその標的への結合親和性は、改変されていない野生型抗体の結合親和性と比較したとき、許容範囲内にとどまる。いくつかの実施形態では、突然変異は、相補性決定領域にある。

一態様において、本発明は、本開示の方法によって得られる普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体を特色とする。

本開示の一態様において、ＶＨ領域内の配列番号１、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体である。

本開示の一態様において、Ｖｋ領域内の配列番号２、１２、１３、１４、１５、１６、および１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体である。

本開示の一態様において、配列番号１、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群から選択されるＶＨ領域内のアミノ酸配列と配列番号２、１２、１３、１４、１５、１６、および１７からなる群から選択されるＶｋ領域内のアミノ酸配列とを含む、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体である。

開示された方法のいくつかの実施形態において、突然変異した普遍的なまたは正規化された抗体は、診断上の使用のために改善された特性を有する。いくつかの実施形態において、改善された特性は、熱安定性、長期安定性、凝集の低下および酸化／脱アミドの低下からなる群から選択される。開示された方法のいくつかの実施形態において、突然変異は、相補性決定領域にない。

本開示の一態様において、診断上の使用のための抗体における１以上の特性を改善する方法であり、組換え発現、熱安定性、長期安定性、凝集、および酸化／脱アミドからなる群から選択される１以上の特徴が不足している野生型ウサギ抗体を選択すること、野生型抗体配列を、可変フレームワークおよび／または許容され得る範囲内の特徴を有することが公知のウサギ抗体のセットにおける同じ位置で最も頻繁に発生する接合領域内のアミノ酸残基のセットを含む正規化された抗体配列と比較すること、ならびに正規化された配列とは異なる野生型抗体中の１以上のアミノ酸残基を同定すること、ならびに野生型抗体の該同定された１以上のアミノ酸残基を、正規化された配列の対応するアミノ酸残基へ突然変異させることを含み、該１以上の特徴は、改変されていない野生型抗体と比較して改善される。本開示の一態様において、野生型ウサギ抗体を選択すること、野生型抗体配列を、可変フレームワーク／熱安定性、長期安定性、凝集の低下および酸化／脱アミドの低下からなる群から選択される許容され得る範囲内の特徴を有することが公知のウサギ抗体のセットにおける同じ位置で最も頻繁に生じる接合領域内のアミノ酸残基のセットを含む正規化された抗体配列と比較し、該同定された残基の１以上において野生型配列への変化を含有する相補性決定領域をコードする標準的な発現ベクターを調製し、適切な宿主細胞内で該ベクターを発現させ、該抗体をステップから精製することを含む、組換えウサギモノクローナル抗体を製造する方法である。いくつかの実施形態において、正規化された配列のアミノ酸残基の該セットは、関連する特徴を有する少なくとも５０のウサギ抗体の同じ位置で最も頻繁に生じる。いくつかの実施形態において、正規化された配列のアミノ酸残基の該セットは、関連する特徴を有する少なくとも１００のウサギ抗体の同じ位置で最も頻繁に生じる。いくつかの実施形態において、正規化された配列のアミノ酸残基の該セットは、関連する特徴を有する少なくとも１５０のウサギ抗体の同じ位置で最も頻繁に生じる。いくつかの実施形態において、正規化された配列のアミノ酸残基の該セットは、関連する特徴を有する少なくとも２００のウサギ抗体の同じ位置で最も頻繁に生じる。いくつかの実施形態において、正規化された配列のアミノ酸残基の該セットは、関連する特徴を有する少なくとも２５０のウサギ抗体の同じ位置で最も頻繁に生じる。いくつかの実施形態において、正規化された配列のアミノ酸残基の該セットは、関連する特徴を有する少なくとも３００のウサギ抗体の同じ位置で最も頻繁に生じる。

本発明者らは、驚くべきことに、本発明によって得られた抗体が、標的に対する結合親和性および特異性に実質的に影響を与えることなく、優れた特性を呈することを見出した。

本開示はさらに、野生型ウサギ抗体を選択すること、および該野生型ウサギ抗体を突然変異させることによって得られる正規化されたモノクローナルウサギ抗体を提供する。

本発明のさらなる目的、特色、および利点は、後続の発明を実施するための形態から明らかとなることになる。

本特許または出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開のコピーは、申請に応じて、必要な手数料を支払うことにより、米国特許庁から提供されることになる。

図１は、（Ａ）本発明により採用されるタンパク質工学戦略の概観、および（Ｂ）スクリプトプログラムを使用して普遍的なテンプレートに基づいて変異体を生成する方法の概略図を示す。軽鎖（桃色）と重鎖（紫色）についてのこれらの変異体を遺伝子合成した後、ｐＴＴ５ベクターまたはｐＤＶ３ａベクターのいずれかへとクローン化した後、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを行った。培養物を振盪フラスコ内で６日間成長させ、抗体上清を収集し、必要に応じて精製した。抗体上清を段階希釈して抗体濃度を決定し、結合親和性を決定するために使用した。抗体上清の熱安定性をＥＬＩＳＡによって検査した。精製された抗体は、融点および凝集温度の測定に使用した。免疫組織化学的過程は対照組織で行った。 図１は、（Ａ）本発明により採用されるタンパク質工学戦略の概観、および（Ｂ）スクリプトプログラムを使用して普遍的なテンプレートに基づいて変異体を生成する方法の概略図を示す。軽鎖（桃色）と重鎖（紫色）についてのこれらの変異体を遺伝子合成した後、ｐＴＴ５ベクターまたはｐＤＶ３ａベクターのいずれかへとクローン化した後、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを行った。培養物を振盪フラスコ内で６日間成長させ、抗体上清を収集し、必要に応じて精製した。抗体上清を段階希釈して抗体濃度を決定し、結合親和性を決定するために使用した。抗体上清の熱安定性をＥＬＩＳＡによって検査した。精製された抗体は、融点および凝集温度の測定に使用した。免疫組織化学的過程は対照組織で行った。

図２は、（Ａ）ウサギ（黄色）およびマウス（緑色）の抗体のＶＨドメイン、ならびに（Ｂ）ＶＨドメインのＴｙｒコーナーの拡大図を示している。 図２は、（Ａ）ウサギ（黄色）およびマウス（緑色）の抗体のＶＨドメイン、ならびに（Ｂ）ＶＨドメインのＴｙｒコーナーの拡大図を示している。

図３は、ウサギ抗体配列におけるアミノ酸の分布を示している。 図３は、ウサギ抗体配列におけるアミノ酸の分布を示している。 図３は、ウサギ抗体配列におけるアミノ酸の分布を示している。 図３は、ウサギ抗体配列におけるアミノ酸の分布を示している。 図３は、ウサギ抗体配列におけるアミノ酸の分布を示している。 図３は、ウサギ抗体配列におけるアミノ酸の分布を示している。 図３は、ウサギ抗体配列におけるアミノ酸の分布を示している。 図３は、ウサギ抗体配列におけるアミノ酸の分布を示している。 図３は、ウサギ抗体配列におけるアミノ酸の分布を示している。 図３は、ウサギ抗体配列におけるアミノ酸の分布を示している。

図４は、本発明の普遍的なまたは正規化された抗体テンプレートを示している。行：（ＮＯ）番号付けシステム（主にＩＭＧＴ）およびＦＲとＣＤＲのおおよその位置、（ＩＫ）重要なＶｋの位置、（ＴＫ）普遍的なまたは正規化されたＶｋテンプレート、（ＩＨ）重要なＶＨ鎖の位置、（ＴＨ）普遍的なまたは正規化されたＶＨテンプレート。ＩＫ行およびＩＨ行：（ｃ）推定されるＣＤＲ接触、（ｄ）埋もれておりかつ推定されるＣＤＲ接触、（２）埋もれた極性領域２、（ｂ）埋もれたもの、（０）アミノ酸残基なし。（−）優先性なし、（ｉ）推定される鎖間接触、（ｔ）埋もれたチロシンコーナー、（ｖ）ターン、（ｘ）親和性を変えるリスクが非常に低い状態で変化させることができる表面残基、（ｕ／ｃ／ｂ）漠然と定義されたＣＤＲであって、これらの残基は、親和性を変えるリスクが高いとはいえ、保存的に変化させることができる、（ｓ）シグナルペプチド後の最初の位置（推定されるＣＤＲ接触）またはＤ−Ｅループ内の残基ＶＨ８４であって、一部のウサギＶＨ鎖には存在しない。

図５は、（Ａ）ＶＨ系列およびＶｋ系列の突然変異体ならびに（Ｂ）野生型Ｖｋと対形成したＶＨ変異体、および（Ｃ）野生型ＶＨと対形成したＶｋ変異体、および（Ｄ）合成致死性の決定因子についての結合曲線を示す。 図５は、（Ａ）ＶＨ系列およびＶｋ系列の突然変異体ならびに（Ｂ）野生型Ｖｋと対形成したＶＨ変異体、および（Ｃ）野生型ＶＨと対形成したＶｋ変異体、および（Ｄ）合成致死性の決定因子についての結合曲線を示す。 図５は、（Ａ）ＶＨ系列およびＶｋ系列の突然変異体ならびに（Ｂ）野生型Ｖｋと対形成したＶＨ変異体、および（Ｃ）野生型ＶＨと対形成したＶｋ変異体、および（Ｄ）合成致死性の決定因子についての結合曲線を示す。 図５は、（Ａ）ＶＨ系列およびＶｋ系列の突然変異体ならびに（Ｂ）野生型Ｖｋと対形成したＶＨ変異体、および（Ｃ）野生型ＶＨと対形成したＶｋ変異体、および（Ｄ）合成致死性の決定因子についての結合曲線を示す。

図６は、（Ａ）ＶＨ突然変異体を有する野生型（「ＷＴ」）Ｖｋについての熱安定性曲線、（Ｂ）ＷＴ ＶＨおよびＶｋ突然変異体についての熱安定性曲線、ならびに（Ｃ）ｘＣＤ２ ＷＴ対最も突然変異したＶＨおよびＶｋについての熱安定性曲線を示す。 図６は、（Ａ）ＶＨ突然変異体を有する野生型（「ＷＴ」）Ｖｋについての熱安定性曲線、（Ｂ）ＷＴ ＶＨおよびＶｋ突然変異体についての熱安定性曲線、ならびに（Ｃ）ｘＣＤ２ ＷＴ対最も突然変異したＶＨおよびＶｋについての熱安定性曲線を示す。 図６は、（Ａ）ＶＨ突然変異体を有する野生型（「ＷＴ」）Ｖｋについての熱安定性曲線、（Ｂ）ＷＴ ＶＨおよびＶｋ突然変異体についての熱安定性曲線、ならびに（Ｃ）ｘＣＤ２ ＷＴ対最も突然変異したＶＨおよびＶｋについての熱安定性曲線を示す。

図７は、（Ａ）発現レベル、融点、および凝集点（「Ｔ_ａｇｇ２６６」および「Ｔ_ａｇｇ４７３」）普遍的なまたは正規化されたテンプレートへの変換の効果、ならびに本発明の普遍的なまたは正規化されたテンプレートに変換されたＷＴ ｘＣＤ２抗体およびｘＣＤ２抗体の類似の染色パターンを示す。 図７は、（Ａ）発現レベル、融点、および凝集点（「Ｔ_ａｇｇ２６６」および「Ｔ_ａｇｇ４７３」）普遍的なまたは正規化されたテンプレートへの変換の効果、ならびに本発明の普遍的なまたは正規化されたテンプレートに変換されたＷＴ ｘＣＤ２抗体およびｘＣＤ２抗体の類似の染色パターンを示す。

略称
「ＦＲ」は「フレームワーク領域」を指す。

「ＣＤＲ」は「相補性決定領域」を指す。

「Ｖ」は可変領域を指す。

「Ｖｋ」は可変カッパ鎖（軽鎖）を指す。

「Ｖλ」は可変ラムダ鎖（軽鎖）を指す。

「ＶＨ」は可変重鎖を指す。

「Ｊ」は「結合領域」を指す。

本開示の種々の実施形態の概観を容易にするために、具体的な用語の以下の説明を提供する。

抗体：少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含み、抗原のエピトープを特異的に結合するポリペプチド。抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または抗体のフラグメント、および当技術分野で公知の他のものが含まれる。いくつかの例において、抗体は、ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）のような別の分子に連結または結合している。

抗体は、重および軽鎖で構成されており、それらの各々には可変重（ＶＨ）領域および可変軽（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域がある。まとまって、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原を結合することの原因となる。これには、インタクトな免疫グロブリン、ならびに、それらのＦａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）のような、当技術分野で周知の変異体および部分が含まれる。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合している融合タンパク質であるが、ｄｓＦｖにおいて、鎖が変異してジスルフィド結合が導入され、鎖の会合を安定にする。該用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）および（二重特異性抗体のような）ヘテロコンジュゲート抗体のような組換え形態を含む。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。

「モノクローナル抗体」は、マウスもしくはウサギ由来の、または単一抗体の軽および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞由来のＢリンパ球の単一クローンによって産生された抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に知られている方法によって、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞との融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって産生される。これらの融合細胞およびその継代は「ハイブリドーマ」と呼ばれる。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。

一次（１°）抗体は、生物試料の１以上の構成要素に免疫特異的な抗体である。１次抗体は、試料中のバイオマーカーの検出および分析、例えば、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、およびこれらに類するものを必要とする診断上の適用において頻繁に使用される。二次（２°）抗体は、別の抗体（またはその他の抗体の構成要素）に免疫特異的な抗体であり、関心対象のバイオマーカーの間接的な検出に依存する診断上の適用において頻繁に使用される。例えば、免疫組織化学的および免疫細胞化学的用途では、一次抗体を使用して、一次抗体が結合しているバイオマーカーに近接した組織学的または細胞学的試料上の検出可能な部分の沈着を媒介する。いくつかの場合において、検出可能な部分が一次抗体に直接結合しており、したがって、バイオマーカー特異的試薬がその標的に結合すると、試料上に沈着する（概して、直接標識法と称される）。他の実施形態において、検出可能な部分の沈着は、試料に結合した一次抗体に二次抗体を結合させることによってもたらされ、続いて、二次抗体に結合するか、そうでなければ、検出可能な部分の沈着をもたらす様式で二次抗体と反応する検出試薬のセットが使用される（概して、間接標識法と称される）。間接的な組織化学的または細胞化学的検出方法で使用するための市販の試薬またはキットの非限定的な例としては、ＶＥＮＴ ＡＮＡ ｕｌｔｒａＶｉｅｗ検出システム（ＨＲＰおよびＡＰを含む、酵素に結合した二次抗体）、ＶＥＮＴ ＡＮＡ ｉＶＩＥＷ検出システム（ビオチン化抗種二次抗体およびストレプトアビジン結合酵素）、ＶＥＮＴＡＮＡ ＯｐｔｉＶｉｅｗ検出システム（ＯｐｔｉＶｉｅｗ）（ハプテンに結合した抗種二次抗体および酵素多量体に結合した抗ハプテン三次抗体）、ＶＥＮＴＡＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（一次抗体結合の部位にある酵素の数を増幅させるために、先のＶＥＮＴＡＮＡ検出システムのうちのいずれかと共に使用することができる非結合二次抗体）、ＶＥＮＴＡＮＡ ＯｐｔｉＶｉｅｗ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム（ハプテンに結合した抗種二次抗体、酵素多量体に結合した抗ハプテン三次抗体、および同じハプテンに結合したチラミドが挙げられる。使用の際、二次抗体は試料と接触して一次抗体への結合をもたらす。次に、試料を抗ハプテン抗体とともにインキュベートして、酵素を二次抗体に会合させる。次に、試料をチラミドとともにインキュベートして、追加のハプテン分子の堆積をもたらす。次に、試料を抗ハプテン抗体とともに再度インキュベートして、追加の酵素分子の沈着をもたらす。次に、試料を検出可能な部分とともにインキュベートして、色素沈着をもたらし）、ＶＥＮＴ ＡＮＡ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＯｍｎｉＭａｐ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＵｌｔｒａＭａｐ抗ハプテン抗体、二次抗体、色原体、蛍光体、および色素キットであって、それらの各々は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ）、ＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎおよびＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ＋ＩＨＣ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＨＲＰまたはＡＰと直接、酵素対抗体の比率の高いコンパクトなポリマーへと重合する二次抗体）、ならびにＤＡＫＯ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）＋Ｓｙｓｔｅｍ（二次抗体へ結合する酵素標識ポリマー）から入手可能である。

使用する抗体または検出システムの種類に関係なく、各抗体は、特異性、親和性、産生レベル、安定性、および結合への適合性に関して独特であり、アッセイの開発および製造の標準化に課題がある。本発明者らは、タンパク質工学を使用してこの問題を解決し、ａ）組換え抗体に変換するためのハイブリドーマのクローン化、ｂ）より高くより再現性のある結合比を得るための抗体配列の改変、ならびにｃ）安定性のための抗体フレームワーク領域の標準化、およびより一般的には、抗体の開発可能性に焦点を絞ってきた。

本発明者らは、驚くべきことに、本発明の方法を使用して、再現性および開発を改善するための正規化された抗体を製造することができることを発見した。

図１Ａは、例示的なタンパク質工学戦略の概観を示している。ハイブリドーマは、経時的に抗体産生を喪失する可能性があり、それゆえ、抗体の組換え版への変換は、ある特定のクローンにとって必要であることがある。また、組換え抗体によって、タンパク質工学は、信頼できる標識のために部位特異的結合を導入することもでき、開発可能性、安定性、および下流の適用に必要とされる他の所望の特性のために抗体組成を最適化することもできる。結合についての現法では、抗体において利用可能な自然の特性に依存しており、したがってバイオコンジュゲートの無作為な分布を生じる。部位特異的結合部位を導入すると、製造可能性と製品組成を大幅に改善することができる。操作された組換え抗体が制御下にあれば、抗体クローンは最終的にＣＨＯ細胞に基づいてターゲットとされる統合システムへと導入することができる。これにより、ハイブリドーマによって産生される抗体の量と互角の大規模な発現、産生、および製造を可能にすることができる。

図１Ｂは、既存の抗体ベクターまたはハイブリドーマクローン由来のｃＤＮＡが、特異的に設計されたプライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応を使用して軽鎖（桃色）および重鎖（紫色）が増幅する出発テンプレートとして使用することができる。抗体鎖をｐＴＴ５ベクターまたはｐＤＶ３ａベクターのいずれかへとクローン化した後、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを行い、培養物を振盪フラスコ内で６日間成長させた。抗体上清を回収および精製し、精製した抗体をＥＬＩＳＡアッセイで特徴づけて抗原結合を決定し、免疫組織化学で機能を確認する。

本発明者らは、「普遍的または正規化された安定した足場テンプレート」を生成し、ウサギモノクローナル抗体の安定化に向けたその応用を提示した。具体的には、本発明者らは、ａ）ハイブリドーマの使用を延長する必要がなく、ハイブリドーマの不安定性による特定の抗体発現の喪失のリスクがなく、ｂ）抗体の可変領域を再設計して、特異性および親和性を失うことなく、安定性のような望ましい製剤特性を導入することができることを発見した。

原則として、抗体の特異性および親和性を維持しながら抗体の足場を標準化するために工学を使用することができるが、実際には、蓄積された抗体工学の知識のほとんどは、ヒトおよびマウスの抗体に関する。本発明者らは、ウサギ抗体の構造および配列を検討し、ヒトおよびマウス抗体との多くの類似性を発見し、構造のアラインメントを生成するためにウサギ可変重（ＶＨ）鎖および可変カッパ軽（Ｖｋ）鎖に対してわずかに改変されたＩＭＧＴ番号付けシステムを創出した。フレームワーク（ＦＲ）配列内で最も頻繁に発生するアミノ酸（Ａａ）は、より高い安定性につながることができる。それゆえ、結合に重要ではない位置については、頻繁に発生するＡａまたは公知の安定性の問題のないウサギ抗体に存在するＡａを使用して、不安定な抗体を変換するためのテンプレートとして作用することができる普遍的なまたは正規化された抗体足場を構築することができる。

本発明者らは、これらの配列がより高い安定性および他の望ましい特性をもたらすであろうという観点から、ウサギ抗体において生殖系列由来で頻繁に発生するアミノ酸配列を調査した。強いバイアスがない配列位置について、本発明者らは、頻繁に存在するアミノ酸を使用した。加えて、本発明者らは、公知の安定性の問題のない抗体に存在するアミノ酸を使用した。緩く規定されたＣＤＲは、概して、そのままにしておくことができる。

本発明者らは、最初に、ウサギＶｋおよびＶＨ領域の配列および構造をそれらのヒトおよびマウスの対応物と比較し、個々のウサギ抗体のアミノ酸残基がそれらの対応するヒトおよびマウスの対応物と類似の構造的役割を有することを確認した。

本発明者らは、最初に、ウサギのＶｋおよびＶＨ領域の配列および構造を、それらのヒトおよびマウスの対応物と比較した。

本発明による抗体は、カッパおよび重可変領域（それぞれ、Ｖｋ、Ｖλ、およびＶＨ）のフレームワークを網羅する１以上の普遍的なまたは正規化された抗体テンプレートから製造される。フレームワーク領域は、抗体の可変鎖の超可変領域間において認められる。フレームワーク領域は、抗原または標的と接触する位置に超可変領域を保持するための足場として機能するベータシート（ベータバレル）構造を形成する。

本発明のこれらの普遍的なまたは正規化された抗体テンプレートは、既存のウサギモノクローナル抗体の可変領域の構造および配列の分析に基づいて生成された。

一実施形態において、本開示は、当業者が、結合親和性をかなり失うことなく、所望の特性を改善するために、候補抗体から、普遍的なまたは正規化されたテンプレート内の対応する残基まで、可能な限り多くの残基を変化させることができる方法を提供する。別の実施形態において、本発明による方法は、親和性を失うことなく安定性が増大するＣＤＲ配列に適用可能である。

一実施形態において、結合親和性は、標的への抗体の結合の解離定数（Ｋ_Ｄ）を評価することによって決定される。結合対のＫ_Ｄは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、生体層干渉法（ＢＬＩ）、および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を含む、表面に基づく（不均一な）方法を使用して評価することができる。Ｓｃｈｕｃｋ １９９７、Ｇａｕｇｌｉｔｚ ２００８、Ｆｒｉｇｕｅｔら．１９８５。

概して、普遍的なまたは正規化された抗体のＫ_Ｄは、１０^−６〜１０^−１２（Ｍ）の範囲にあることになるが、いずれの場合においても、野生型抗体と比較して改善することができる。

本発明者らは、Ｓｐｒｉｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって独立して単離された抗体由来の種々の抗原およびペプチドに対する抗体からおよそ３００のアミノ酸配列を収集した。本発明者らはさらに、公開されたウサギ抗体構造の９つのＶＨ／Ｖｋ配列４ＨＢＣ、４ＨＴ１、４Ｊ０１、４Ｊ０４、４ＭＡ３、４０４Ｙ、４ＺＴＰ、５Ｃ０Ｎ、５ＤＲＮを収集し、これらは、ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋからダウンロードした。これらの配列におけるアミノ酸の分布を図３に示しており、この中で、緑色の着色の強度は、示された位置でのアミノ酸の発生率に比例する。

本発明者らはさらに、３９のＶＨおよび６５のＶｋ１の機能的生殖系列配列を収集した（図３では分析されていない）。

次に、ＶＨ配列およびＶｋ配列を、主にＩＭＧＴ番号付けシステム（Ｌｅｆｒａｎｃら，２００３，「ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ」を参照されたい）ならびにマウスおよびヒト抗体について公開された構造アラインメント（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００１，「Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ」を参照されたい）を用いて整列させた。

すべてのヒト、マウス、およびウサギの抗体に概して適用可能なすべてのフレームワークアミノ酸位置および位置依存構造特性を、すでに説明されているように（Ｃｈｏｔｈｉａら．１９９８、Ｎａｒｃｉｓｏら．２０１１）注釈付けおよび確認したが、ａ）ＶＨ ＦＲ２ Ｃ４０とＣ５５との間に形成される追加のジスルフィド結合の頻繁な存在、ｂ）数個のＶｋ１配列における内部ＣＤＲ３ジスルフィド結合、ｃ）Ｖｋ ＦＲ３（ｋａｂｂａｔ Ｃ８０）における、またはＦＲ４（最後の位置）におけるＣｙｓ残基と、ＣＫにおけるＣｙｓ残基との間のドメイン間ジスルフィド結合、ならびにｄ）残基ＶＨ８５または残基ＶＨ８４およびＶＨ８５の両方がないままにできる、多くのウサギＶＨ ＦＲ３領域における短縮型ＤＥループは除いた。

次に、これらの番号付けシステムをまとめて使用して、本発明者らは、ＶＨおよびＶｋ構造整列位置の各々における２０の標準的なアミノ酸残基の各々についての発生頻度を計算した。提案された普遍的なまたは正規化されたＶｋおよびＶＨテンプレートを図４に示す。

カッパ鎖フレームワーク４（「ＦＲ４」）については、Ｊ１接合領域に由来するＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号１８）の例示的な配列を選択した。

重鎖については、接合領域Ｊ２、Ｊ４、およびＪ６に由来するＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１９）の例示的な配列を選択した。

これらのＶｋ配列およびＶＨ ＦＲ４配列は、ほとんどのクローン化抗体において認められ、公知の安定性の問題はない。

採用された番号付けシステムはまた、図４に示されており、これは、ＶＨ鎖およびＶｋ鎖の両方に適用される。濃青色の着色は、生殖細胞系列における１００％の保存を示す。ＦＲ４については、該配列はそれぞれ、ウサギの生殖細胞系列ＫＪ１およびＨＪ２／４／６に対応する。濃緑色の着色は、Ｓｐｒｉｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅが提供する抗体の８９％の発生を示す。薄緑色は、公知の安定性の問題がない抗体に一般的に見られる残基を示す。最後に、「−」は、元の野生型配列と同様に保存すべきアミノ酸位置を示す。

一実施形態において、本発明の組換えた普遍的なまたは正規化された抗体は、診断用抗体の産生に適した何らかの宿主種によって産生される。一実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。具体的な実施形態において、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞である。別の具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。さらなる実施形態において、宿主細胞は、酵母、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または糸状真菌細胞である。さらなる実施形態において、宿主細胞は、昆虫細胞である。組換えた普遍的なまたは正規化された抗体の精製は、クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを含む何らかの公知の方法を使用して達成することができる。

別の実施形態において、本発明の抗体は、ウサギ、マウス、またはヒトの抗体である。

別の実施形態において、本発明の抗体は、ウサギ抗体である。

実施形態において、本発明の抗体は、一次ウサギ抗体である。

実施形態において、本発明の抗体は、二次ウサギ抗体である。

実施形態において、本発明の抗体は、ヒト化可能である。

別の実施形態において、抗体は、抗体フラグメント、またはＦａｂおよび一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む一本鎖抗体である。

別の実施形態では、抗体は、異なる抗体および／または種に由来の定常領域を有するキメラ抗体である。

実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ（すべてのサブタイプ）、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む何らかのアイソタイプのものである。

実施形態において、本発明の抗体は、野生型の非修飾抗体と比較して、改善された熱安定性、長期安定性、組換え発現／力価、脱アミノ／酸化、および／または凝集を呈する。

当技術分野で公知の安定性アッセイを使用して、熱安定性／変性を測定することができる。一実施形態において、免疫組織化学を使用することができる。別の実施形態において、ＥＬＩＳＡを使用することができる。別の実施形態において、２次元電気泳動法が使用される。別の実施形態において、示差走査熱量測定法および／または円二色性分光法を使用することができる。さらなる実施形態において、ナノ示差走査蛍光分析法を使用することができる。例えば、Ｖｅｒｍｅｅｒ ａｎｄ Ｎｏｒｄｅ，２０００、Ｓｖｉｌｅｎｏｖら．２０１８、Ｓｔｒｕｔｚ ２０１６，Ａｍｉｎら．２０１４を参照されたい。一実施形態において、融点の上昇は、熱安定性の改善と相関している。

タンパク質凝集は、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、光不明瞭化（ＬＯ）、マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）のような動的イメージング粒子分析（ＤＩＰＡ）技術（ＭＦＩ）、およびＣｏｕｌｔｅｒ計数装置（ＣＣ）を含む、種々の公知の技術を用いて測定することができる。Ｅｎｇｅｌｓｍａｎら，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０１１；２８（４）：９２０−３３。

実施形態において、本発明の抗体は、改善された熱安定性を呈する。

別の実施形態において、本発明の抗体は、改善された長期安定性を呈する。長期安定性には、−２０〜−７０℃の温度で少なくとも６か月、好ましくは少なくとも１年、より好ましくは少なくとも２年、最も好ましくは少なくとも３年が含まれる。一実施形態において、抗体は凍結乾燥される。

別の実施形態において、本発明の抗体は、例えば、対応する非修飾の野生型抗体と比較して、組換え発現からの力価上昇によって決定されるように、改善された発現を呈する。一実施形態において、力価は、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも０．７５ｇ／Ｌである。別の実施形態において、発現の上昇は、ＯＤ２８０の読み取りを行うことによって測定され得る。さらに他の実施形態において、また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して濃度を測定することもでき、また、標準物質を用いたタンパク質ゲル電気泳動法を使用して抗体濃度を決定し得る。

別の実施形態において、本発明の抗体は、改善された脱アミノ／酸化（すなわち、脱アミド／酸化の低下）を呈する。脱アミドは、アスパラギンおよびグルタミンの側鎖が修飾されたときに発生する自発的な反応であり、環状中間化合物をもたらすことができる。酸化は、主にシステインおよびメチオニンで起こり、これらの含硫残基は、鎖内または鎖間ジスルフィド結合の形成をもたらす。酸化を評価する方法は、Ｙａｎ．２００９において詳細に説明されている。トリプトファンもまた容易に酸化される。トリプトファンの喪失は、オキシインドリルアラニン（Ｏｉａ）、３ａ−ヒドロキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール−２−カルボン酸（ＰＩＣ）、Ｎ−ホルミルキヌレニン（ＮＦＫ）、ジオキシインドリルアラニン（ＤｉＯｉａ）、キヌレニン（Ｋｙｎ）、および５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＯＨ−Ｔｒｐ）を含むＴｒｐ分解化合物の同定によって解明され得る。

別の実施形態において、本発明の抗体は、改善された凝集（すなわち、凝集低下）を呈する。

実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１、４、５、６、７、８、９、または１０によるアミノ酸配列を含み、該配列は、普遍的なまたは正規化されたまたは正規化されたＶｋテンプレート（配列番号１）およびその突然変異体を含む。

実施形態において、本発明の抗体は、普遍的なまたは正規化されたＶＨテンプレート（配列番号２）およびその突然変異体を説明する配列番号２、１２、１３、１４、１５、１６、または１７によるアミノ酸配列を含む。

実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１、４、５、６、７、８、９、または１０によるアミノ酸配列と、配列番号２、１２、１３、１４、１５、１６、または１７によるアミノ酸配列とを含む。

実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１によるアミノ酸配列を含む。

実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２によるアミノ酸配列を含む。

実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１および配列番号２によるアミノ酸配列を含む。

本明細書に開示する上述のアミノ酸配列は、１つ以上の残基の置換によってさらに修飾することができる。このような置換は、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸によって置き換えられる場合のような、あるアミノ酸が類似の構造および特徴のアミノ酸によって置き換えられる場合、保存的な性質のものであることができる。

さらに保存的であるのは、ロイシンがイソロイシンによって置き換えられる場合のような、同じまたは類似の大きさおよび化学的性質のアミノ酸の置き換えであろう。天然の相同タンパク質のファミリーにおける配列変異の研究では、ある特定のアミノ酸置換は、他のものよりも寛容性があることが多く、これらはしばしば、元のアミノ酸とその置き換え物との間の大きさ、帯電性、極性、および疎水性における類似性との相関を示し、このようなことは、「保存的置換」を規定するための基礎である。

保存的置換は、次の５つの群すなわち、第１の群−小さな脂肪族の、非極性、またはわずかに極性がある残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、第２の群−極性がある、負に帯電した残基およびこれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）、第３の群−極性がある、正に帯電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、第４の群−大きな、脂肪族の、非極性の残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）、および第５の群−大きな、芳香族の残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）、のうちの１つの中での交換であることができる。

あまり保存的でない置換には、アラニンのイソロイシン残基による置き換えのような、あるアミノ酸を類似の特徴を有するが、大きさが多少異なる別のアミノ酸による置き換えが含まれる。

非常に非保存的な置換には、酸性アミノ酸を、性質上極性のあるアミノ酸、または塩基性のアミノ酸でさえ、置換することが包含され得る。しかしながら、このような「非常に重要な」置換は、化学的効果が完全に予測可能ではなく、非常に重要な置換が単純な化学的原理からは予測できない偶発的な効果を十分に生じ得るので、潜在的に効果がないとして却下することはできない。

一実施形態において、本発明は、配列番号１、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、または配列番号２、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８もしくは１９のいずれかに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む。パーセント同一性は、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．１９８４によって説明され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラム、第６．０版を使用して配列情報を比較することによって決定することができる。ＧＡＰプログラムは、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ １９７０の整列方法をＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ １９８１が改変したものを利用している。別の実施形態において、本発明は、配列番号１、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、または配列２、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８もしくは１９のいずれかに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有するアミノ酸配列を含み、熱安定性、長期安定性、および発現のような改善された特性を呈する。

具体的な実施形態において、普遍的なまたは正規化されたまたは正規化された抗体は、野生型Ｖｋ鎖と少なくとも１つの突然変異を有するＶＨ鎖とを含む。

具体的な実施形態において、普遍的なまたは正規化されたまたは正規化された抗体は、野生型Ｖｋ鎖とＹ５２Ｗ突然変異を有するＶＨ鎖とを含む。

別の具体的な実施形態において、普遍的または正規化されたまたは正規化された抗体は、野生型Ｖｋ鎖と以下のすべての突然変異、すなわちＶ４Ｌ、＿８３Ｓ、Ｓ９６Ｔ、Ａ５４Ｇ、Ｎ１０１Ｔ、およびＹ５２Ｗを有するＶＨ鎖とを含み、この中で、＿は、元の野生型配列のように保存されるべきであるアミノ酸位置を示す。さらに別の具体的な実施形態において、普遍的なまたは正規化されたまたは正規化されたｌ抗体は、野生型Ｖｋ鎖と以下のすべての突然変異、すなわちＶ４Ｌ、Ｒ４８Ｋ、＿８３Ｓ、Ｓ９６Ｔ、Ａ５４Ｇ、およびＮ１０１Ｔを有するＶＨ鎖とを含む。

具体的な実施形態において、普遍的なまたは正規化された抗体は、１つの突然変異のみを有するＶｋ鎖と、野生型ＶＨ鎖とを含む。別の実施形態において、普遍的なまたは正規化または正規化された抗体は、野生型のＶｋ鎖またはＶλ鎖と突然変異したＶＨ鎖とを含む。別の具体的な実施形態において、普遍的なまたは正規化された抗体は、野生型のＶｋ鎖またはＶλ鎖と、以下の突然変異、すなわちＶ４Ｌ、Ｒ４８Ｋ、＿８３Ｓ、Ｓ９６Ｔ、Ａ５４Ｇ、Ｎ１０１Ｔ、またはＹ５２Ｗのうちの１つ以上を有するＶＨ鎖とを含む。

別の実施形態において、普遍的なまたは正規化された抗体は、少なくとも１つの突然変異を有するＶｋ鎖またはＶλ鎖と、少なくとも１つの突然変異を有するＶＨ鎖とを含む。具体的な実施形態において、Ｖｋ鎖突然変異は、Ａ２Ｑ、Ｓ２０Ｔ、Ｓ４６Ｐ、Ａ４０Ｓ、Ｑ５２Ｌ、またはＰ６９Ｓである。別の具体的な実施形態において、Ｖｋ鎖は、上述の突然変異の少なくとも２つを含むが、ただし、突然変異がＳ２０ＴおよびＱ５２Ｌのいずれでもないということを条件とする。別の具体的な実施形態において、Ｖｋ鎖は、以下の突然変異、すなわちＡ２Ｑ、Ｓ２０Ｔ、Ｓ４６Ｐ、Ａ４０Ｓ、およびＰ６９Ｓのすべてを含む。別の具体的な実施形態において、Ｖｋ鎖は、以下の突然変異、すなわちＡ２Ｑ、Ｓ４６Ｐ、Ａ４０Ｓ、Ｑ５２Ｌ、およびＰ６９Ｓのすべてを含む。

別の実施形態において、普遍的なまたは正規化された抗体は、以下の突然変異、すなわち、Ａ２Ｑ、Ｓ２０Ｔ、Ａ４０Ｓ、Ｓ４６Ｐ、Ｑ５２ＬまたはＰ６９Ｓの１つ以上を有するＶｋ鎖を含み、ただし、突然変異は、Ｓ２０ＴおよびＱ５２Ｌのいずれでもなく、かつＶＨ鎖は、以下の突然変異、すなわちＶ４Ｌ、Ｒ４８Ｋ、＿８３Ｓ、Ｓ９６Ｔ、Ａ５４Ｇ、Ｎ１０１Ｔ、およびＹ５２Ｗの１つ以上を有する。

別の実施形態において、普遍的なまたは正規化された抗体は、少なくとも１つの突然変異を有するＶｋ鎖またはＶλ鎖と、以下の突然変異、すなわちＶ４Ｌ、Ｒ４８Ｋ、＿８３Ｓ、Ｓ９６Ｔ、Ａ５４Ｇ、Ｎ１０１Ｔ、およびＹ５２Ｗの１つ以上を有する。

別の実施形態において、普遍的なまたは正規化された抗体は、診断アッセイにおいて使用される。一実施形態において、該アッセイは免疫組織化学（ＩＨＣ）である。別の実施形態において、該アッセイは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。別の実施形態において、該診断アッセイは免疫細胞化学（ＩＣＣ）である。さらなる実施形態において、該診断アッセイは、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳである。なおもさらなる実施形態では、該診断アッセイは、放射性免疫検定（ＲＩＡ）である。

本発明の方法は、安定性もしくは凝集または先に扱ったその他の特性を用いると問題があることが公知のまたは問題があることが発見された抗体に関する使用に制限されない。別の実施形態において、本発明の方法を使用して、免疫検定用の抗体のパネルを標準化することができる。
以下の実施例は、本開示のある特定の実施形態を説明するために作用するのであって、本開示を制限することを意図するものではない。実際、同じ方法を使用して他のウサギ抗体を改変することができる。

実施例１−普遍的なまたは正規化されたテンプレートへの変換のための突然変異誘発

Ｓｐｒｉｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより作製されたウサギモノクローナル抗体を９マーのペプチドに対して選択した。７３．１ＣのＴ_Ｍ、７３．４ＣのＴ_ａｇｇ２６６ ７３．８ＣのＴ_ａｇｇ４７３および０．５１ｍｇ／ｍｌの発現収量。

選択したウサギモノクローナル抗体のＶｋおよびＶＨをコードするＤＮＡ配列は、Ｓｐｒｉｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手し、発現ベクターを構築した。

発現ベクターは、元のヒト配列の代わりにウサギＩｇＧ定常領域を発現するように改変されたｐＤＶ２／ｐＲＫ−Ｆｃシステム（（Ｓｈａｎｇら．２０１５、Ｔｅｓａｒ ａｎｄ Ｈｏｔｚｅｌ ２０１３）に基づいた。

濃度は、いくつかの希釈で測定した試料抗体の吸光度の値を標準曲線の吸光度の値と比較することにより決定した。

一連のＶＨ鎖およびＶｋ鎖は、元の野生型抗体から普遍的なまたは正規化されたテンプレートへの個別のおよび複数の配列変更をいずれも行って合成した（ＶＨ系列およびＶｋ系列を示す図５Ａを参照されたい）。

ＣＤＲ３およびＦＲ４の領域では、元のＩＭＧＴ残基Ｃ１０４は、野生型抗体と同様に維持した。野生型ＦＲ４配列は、普遍的なまたは正規化されたテンプレートのものと完全に一致した。ＦＲ４は、普遍的なまたは正規化されたテンプレートと同一である。（Ｎ０、ＩＭ、ＴＨ）図５と同じ。ＶＨ変異体：（ｈｗｔ）ＷＴ ＨＣ。Ｖｋ変異体：（ｋｗｔ）野生型軽鎖。

ＶＨ系列およびＶｋ系列は、ＨＥＫ２９３細胞内で発現させ、それにより各突然変異した重鎖が、野生型のカッパ鎖と組み合わされるようにし、その逆もあるようにした。

ＥＬＩＳＡを使用して、ウサギの抗体濃度を測定し、以下に説明するようなすべての変異体の間で抗体結合を比較した。

実施例２−ＥＬＩＳＡアッセイ

抗体濃度およびＥＣ５０は、ＥＬＩＳＡを介して測定した。

濃度は、いくつかの希釈で測定した試料抗体の吸光度の値を標準曲線の吸光度の値と比較することにより決定した。

遺伝子合成を使用して、異なるＶＨおよびＶｋの単一のおよび組み合わせ突然変異体を生成した後、ｐＴＴ５ベクターまたはｐＤＶ３ａベクター内へとクローン化した。ＣＤＲ３およびＦＲ４は変化させず、ＦＲ４は、普遍的なまたは正規化されたテンプレートと同一であった。

表１は、アッセイされた野生型および突然変異体の配列を説明している。

特に、すべての普遍的なまたは正規化されたＶＨテンプレートが変化したクローン（図６、「ｈ．全部」）は、野生型抗体と同じ親和性を有している。

対照的に、図６Ｃに示すように、Ｖｋ単一突然変異は結合に影響を及ぼさなかったが、すべてのＶｋ突然変異の組み合わせ（「ｋ．全部」）は結合を終止させた。Ｖｋ突然変異の少なくとも２つは合成致死性であり、検査を経てＡ４０ＳおよびＱ５２Ｌとして同定されたと仮定されている。図６Ｄに示すように、Ｑ５２Ｌを有さないｋ．全部（−Ｑ５２Ｌ）およびＡ４０Ｓを有さないｋ．全部（−Ａ４０Ｓ）は、すべての突然変異（ｋ．全部）を有するＶｋの結合を回復させなかったのに対し、Ａ４０ＳおよびＱ５２Ｌの両方を有さないｋ．全部（−Ａ４０Ｓ−Ｑ５２Ｌ）は、野生型Ｖｋ（ｋｗｔ）のレベルと同様のレベルまで結合を回復させた。

リン酸緩衝塩類溶液（「ＰＢＳ」）中のヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．ｏｆ Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（「Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍ」）から入手；４１１−００５−００３）の３μｇ／ｍＬ溶液を、丸底マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ６５００６１）のウェルに１００μｌ／ウェルの量で添加した。次に、プレートを密封し、４℃で一晩保存した。

ウェルを空にし、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）１５０μｌで再充填し、室温で１時間、振盪しながらインキュベートした。次に、ウェルを空にし、標準的なＣｈｒｏｍｏｐｕｒｅ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ全分子（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍ；０１１．０００．００３）の１００μｌ／ウェルの段階希釈物および試料培養上清を添加した。

標準物質と未知のものとを、室温で２時間、振盪しながら結合させておいた。次に、ウェルを空にし、ＰＢＳ＋０．５％トゥイーン２０（「ＰＢＳＴ」）で少なくとも４回洗浄した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（「ＨＲＰ」）結合ヤギ抗ウサギＩＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍ １１１−０３５−０４６）をＰＢＳ中で１／２０００希釈し、１００μｌ／ウェルの量で添加した。

ＨＲＰ結合体を室温で４５分間、振盪しながらインキュベートした。次に、ウェルを空にし、ＰＢＳＴで少なくとも４回洗浄した。

ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号００２０２３））を１００μｌ／ウェルの量で添加し、このプレートを室温で振盪することなく、青色の発色が安定するまで（およそ３０分後）インキュベートした。

マイクロタイタープレートリーダーセットを使用して、シグナルを６５０ｎｍで読み取り、プレートを３〜５秒間振盪した後、読み取った。

抗体結合曲線は、先に説明したＥＬＩＳＡプロトコルに従って作成したが、マイクロタイタープレートを最初に、ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌの特定の抗原の溶液１００μｌ／ウェルを播種することによって調製したことを除く。

実施例３−熱安定性分析

上述の突然変異体および野生型の配列の安定性を検査するために、熱安定性を最適化のための望ましい特性として選択した。

熱安定性は、迅速かつ正確に測定することができる。熱安定性がないとは、凝集または分解のような、抗体と関係する追加の問題につながる可能性がある。

細胞培養上清を１０ｎｇ／ｍｌに希釈し、２０μの一定分量を８チューブＰＣＲストリップに分注した。各ストリップには、最多８つの異なる細胞培養上清が含まれていた。いくつかのストリップを等しく調製し、ＰＣＲストリップ遠心分離機で回転させ、氷中に入れた。

サーモサイクラーは、数回の連続した１０分間の温度保持でプログラムした。ストリップをサーモサイクラー内に連続して入れ、毎回、前のストリップを取り出して新たなストリップと置き換え、インキュベーション後、遠心分離して氷中に戻した。

対照ストリップを氷中に残し、処理したストリップを４℃で一晩保存した。

翌日、特定の抗原でコーティングされたマイクロタイタープレートを使用してＥＬＩＳＡを行った。

ＶＨにおけるいくつかの単一突然変異が熱安定性を改善することが観察された。特に、図６Ａに示すように、点突然変異Ｙ５２Ｗは、特に、改善された熱安定性をもたらした。しかしながら、安定性の利点は相加的であり、Ｙ５２Ｗの非存在下でさえ、最大安定性を達成したが、ただし、他のすべての突然変異が同時に含まれていることを条件とした。

図６Ｂは、ＷＴ ＶＨおよびＶｋ突然変異体の熱安定性曲線を示している。本結果は、Ｖｋ変異体がほとんどまたはまったく改善をもたらさなかったことを示している。図６Ｃは、ｘＣＤ２ ＷＴ対最も突然変異したＶＨ配列およびＶｋ配列を示している。結果は、完全に突然変異したＶＨおよびＶｋを最も許容される突然変異と組み合わせることにより、最大の安定性が達成されたことを示している。

結合部位から遠隔の残基の修飾が結合親和性に有意な影響を有する可能性があるので、安定性の改善は予想外であった。

普遍的なまたは正規化されたテンプレートへの変換はまた、発現レベルおよびＴ_ｍの上昇ももたらす。図７Ａは、抗体を調製すると、野生型抗体（４．５ｍｇ）よりも、普遍的なまたは正規化されたテンプレート抗体（１７．３ｍｇ）の収量が多くなること、すなわち、普遍的なまたは正規化されたテンプレートクローンで３倍高い収量が得られたこと、野生型抗体（７３．１℃）よりも普遍的なまたは正規化されたテンプレート抗体（７５．５℃）のＴ_ｍが高く、野生型抗体（７３．４℃）よりも普遍的なまたは正規化されたテンプレート抗体（７７．８℃）のＴ_ａｇｇ２６６が高く、野生型抗体（７３．８℃）よりも普遍的なまたは正規化されたテンプレート抗体（７８．４℃）のＴ_ａｇｇ４７３が高いことを示している。図７Ｂは、普遍的なまたは正規化されたテンプレート抗体の染色強度が野生型抗体の染色強度に匹敵することを示している。

本発明の利点には、組換え抗体が、信頼できる産物源ならびにバイオコンジュゲーション、安定性、および製造可能性を改善するためのタンパク質工学における尽力のための出発点を提供することを含めることができる。
参考文献
以下の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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Claims (29)

1. 普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体を作製する方法であって、
   （ａ） 野生型ウサギ抗体を選択することと、
   （ｂ） 前記野生型抗体配列を、熱安定性であることが公知のおよび／または少なくとも１２か月間の長期安定性を有することが公知のウサギ抗体における同じ位置で最も頻繁に生じるアミノ酸残基のセットを可変フレームワークおよび／または接合領域において含む正規化された抗体配列と比較し、前記正規化された配列とは異なる前記野生型抗体における１以上のアミノ酸残基を同定することと、
   （ｃ）ステップ（ｂ）で同定された前記野生型抗体の前記１以上のアミノ酸残基を、前記正規化された配列の対応するアミノ酸残基へ突然変異させて、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体を得ることと、を含み、
   前記抗体のその標的への結合親和性が、前記改変されていない野生型抗体の結合親和性と比較したとき、許容範囲内にとどまる、方法。
2. 前記普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体が、ＶＨ鎖において配列番号１、４、５、６、７、８、９、または１０によるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体が、Ｖｋ鎖において配列番号２、１２、１３、１４、１５、１６、または１７によるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
4. 請求項１に記載の方法であって、前記普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体が、
   （ａ） 配列番号１、４、５、６、７、８、９、または１０によるアミノ酸配列、および
   （ｂ） 配列番号２、１２、１３、１４、１５、１６、または１７によるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体が、前記野生型ウサギ抗体と比較して改善された熱安定性を呈する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体が、前記野生型ウサギ抗体と比較して改善された長期安定性を呈する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体が、前記野生型ウサギ抗体と比較して改善された脱アミノを呈する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体が、前記野生型ウサギ抗体と比較して改善された発現を呈する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体が、一次ウサギ抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記突然変異が、カッパ鎖のＪ１領域にある、請求項１に記載の方法。
11. 前記突然変異が、カッパ鎖のＦＲ４領域にある、請求項１に記載の方法。
12. 前記突然変異が、重鎖のＪ２、Ｊ４、および／またはＪ６領域にある、請求項１に記載の方法。
13. 前記抗体のその標的への結合親和性が、前記改変されていない野生型抗体の結合親和性と比較したとき、許容範囲内にとどまる、請求項１に記載の方法。
14. 前記突然変異が、相補性決定領域にある、請求項１に記載の方法。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により得られる、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体。
16. 前記ＶＨ領域の配列番号１、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体。
17. 前記Ｖｋ領域の配列番号２、１２、１３、１４、１５、１６，および１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体。
18. 配列番号１、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群から選択される前記ＶＨ領域のアミノ酸配列と、配列番号２、１２、１３、１４、１５、１６、および１７からなる群から選択される前記Ｖｋ領域のアミノ酸配列とを含む、普遍的なまたは正規化されたウサギ抗体。
19. 前記突然変異した普遍的なまたは正規化された抗体が、診断上の使用のために改善された特性を有する、請求項１に記載の方法。
20. 前記改善された特性が、熱安定性、長期安定性、凝集の低下および酸化／脱アミドの低下からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記突然変異が、前記相補性決定領域にない、請求項１に記載の方法。
22. 診断上の使用のための抗体において１以上の特性を改善する方法であって、
    （ａ） 組換え発現、熱安定性、長期安定性、凝集、および酸化／脱アミドからなる群から選択される１以上の特性が欠損している野生型ウサギ抗体を選択することと、
    （ｂ） 前記野生型抗体配列を、熱安定性であることが公知のおよび／または（ａ）の特徴を許容範囲内で有することが公知のウサギ抗体のセットにおける同じ位置で最も頻繁に生じるアミノ酸残基のセットを可変フレームワークおよび／または接合領域において含む正規化された抗体配列と比較し、前記正規化された配列とは異なる前記野生型抗体における１以上のアミノ酸残基を同定することと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）で同定された前記野生型抗体の前記１以上のアミノ酸残基を、前記正規化された配列の対応するアミノ酸残基へ突然変異させることであって、ステップ（ａ）における前記１以上の特徴が、前記改変されていない野生型抗体と比較して改善される、突然変異させることと、を含む、方法。
23. 組換えウサギモノクローナル抗体を製造する方法であって、
    （ａ） 野生型ウサギ抗体を選択することと、
    （ｂ） 前記野生型抗体配列を、熱安定性、長期安定性、凝集の低下、および酸化／脱アミドの低下からなる群から選択される許容範囲内での特徴を有することが公知のウサギ抗体のセットにおける同じ位置で最も頻繁に生じるアミノ酸残基のセットを可変フレームワークおよび／または接合領域において含む正規化された抗体配列と比較し、前記正規化された配列とは異なる前記野生型抗体における１以上のアミノ酸残基を同定することと、
    （ｃ） ステップ（ｂ）で同定された１以上の残基の野生型配列への変化を含む相補性決定領域をコードする標準的な発現ベクターを調製することと、
    （ｄ）適切な宿主細胞において前記ベクターを発現させることと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）から前記抗体を精製することと、を含む、方法。
24. 前記正規化された配列の前記アミノ酸残基の前記セットが、前記関連する特徴を有する少なくとも５０のウサギ抗体の同じ位置で最も頻繁に生じる、請求項１〜１４または１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記正規化された配列の前記アミノ酸残基の前記セットが、前記関連する特徴を有する少なくとも１００のウサギ抗体の同じ位置で最も頻繁に生じる、請求項１〜１４または１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記正規化された配列の前記アミノ酸残基の前記セットが、前記関連する特徴を有する少なくとも１５０のウサギ抗体の同じ位置で最も頻繁に生じる、請求項１〜１４または１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記正規化された配列の前記アミノ酸残基の前記セットが、前記関連する特徴を有する少なくとも２００のウサギ抗体の同じ位置で最も頻繁に生じる、請求項１〜１４または１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記正規化された配列の前記アミノ酸残基の前記セットが、前記関連する特徴を有する少なくとも２５０のウサギ抗体の同じ位置で最も頻繁に生じる、請求項１〜１４または１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記正規化された配列の前記アミノ酸残基の前記セットが、前記関連する特徴を有する少なくとも３００のウサギ抗体の同じ位置で最も頻繁に生じる、請求項１〜１４または１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
    

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