JP2020127366A

JP2020127366A - ヒストンｈ３トリメチル化リシン特異的モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片

Info

Publication number: JP2020127366A
Application number: JP2017111580A
Authority: JP
Inventors: 木村　宏; Hiroshi Kimura; 宏木村; 優子佐藤; Yuko Sato; 彰人大井; Akihito Oi; 仁志胡桃坂; Hitoshi Kurumizaka; 智也鯨井; Tomoya KUJIRAI; 恭行大川; Yasuyuki Okawa
Original assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date: 2017-06-06
Filing date: 2017-06-06
Publication date: 2020-08-27
Also published as: WO2018225781A1

Abstract

【課題】クロマチンの基本単位である、ヌクレオソームを構成するヒストンの内、のＨ３の２７番目のリシンのトリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）が遺伝子発現の抑制やＸ染色体の不活性化に関与すると考えられている。Ｈ３の２７番目のリシンはＥｚｈ２と呼ぶメチル化酵素によりメチル化される。このＨ３Ｋ２７ｍｅ３のトリメチル化検出する為の、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３特異抗体で細胞内の還元状態でも機能するモノクローナル抗体の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン及び特定アミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。特定のアミノ酸配列の８１番目のアミノ酸のメチオニンが置換された重鎖可変領域ドメイン及び／又は別の特定のアミノ酸配列の２１番のアミノ酸のメチオニンが置換された軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクロナール抗体又はその抗原結合性断片。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒストンＨ３トリメチル化リシン特異的モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片に関する。本発明によれば、ヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンを細胞内で特異的に検出することができる。

クロマチンの基本単位であるヌクレオソームを構成するヒストンは、ＤＮＡ分子を折り畳んで核内に収納する。ヒストンは、アセチル化、リン酸化、メチル化などの化学修飾を受けることが知られているが、これらの化学修飾は、遺伝子発現などのクロマチン機能の制御に関わっていると考えられている。
例えば、ヒストンの１つであるＨ３の４番、９番、２７番、３６番、及び７９番のリシンはメチル化修飾されることが明らかになっている。これらのリシンメチル化のうちＨ３の２７番目のリシンのトリメチル化（以下、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３と称することがある）は、遺伝子発現の抑制やＸ染色体の不活性化に関与すると考えられている。哺乳類では性染色体として、オスがＸＹ染色体を、メスがＸＸ染色体を持っているが、メスの二本のＸ染色体のうち一本のＸ染色体が発生の段階でランダムに選択されて、高度に凝集するとともに不活性化を受ける。不活性化されたＸ染色体はその後の細胞周期を通じて凝集したままの状態を維持しており、構造的ヘテロクロマチンと非常によく似た構造を持つと考えられている。このＸ染色体の不活性化の最初の段階でヒストンＨ３の２７番目のリシンのメチル化が起きることが分かっており、Ｘ染色体の不活性化に関与すると考えられている。

また、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３は、Ｅｚｈ２と呼ばれるメチル化酵素によってメチル化されることが知られている。このＥｚｈ２は、転移性の前立腺がんにおいて過剰発現していることが報告されており（非特許文献１）、ヒストンＨ３の２７番目のリシンのメチル化と、がんの進行状態との関係も検討されている。

「ネイチャー（Nature）」（英国）２００２年、第４１９巻、ｐ６２４−６２９

前記Ｈ３の２７番目のリシンのトリメチル化を検出するためには、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３特異的モノクローナル抗体を用いることが有効である。本発明者らは、生きている細胞内でＨ３Ｋ２７ｍｅ３を、モノクローナル抗体を用いて検出することを試みたが、ほとんどの抗体がＨ３Ｋ２７ｍｅ３を検出できなかった。生きている細胞内は還元状態となっているために、モノクローナル抗体のシステイン残基のジスルフィド結合（ＳＳ結合）が乖離し、モノクローナル抗体の構造が維持できず、モノクローナル抗体として機能できないものであると本発明者らは考えた。
従って、本発明の目的は、細胞内の還元状態でも機能するモノクローナル抗体を提供することである。

本発明者は、細胞内の還元状態でも機能するモノクローナル抗体について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、特定のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び特定のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを有するモノクローナル抗体を用いることにより、細胞内の還元状態でもモノクローナル抗体が機能し、Ｈ３の２７番目のリシンのトリメチル化を検出できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列における８１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換された重鎖可変領域ドメイン、及び／又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における２１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換された軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含み、且つヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内で結合できるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、又は（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列における８１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換されたアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列における２１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換されたアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含み、且つヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内で結合できるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、
［２］前記抗原結合性断片がｓｃＦｖである、［１］に記載の抗原結合性断片、
［３］タンパク質が結合した［１］又は［２］に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性断片、
［４］前記タンパク質が、蛍光タンパク質、発光タンパク質、又はタグペプチドである［１］〜［３］のいずれかに記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性断片、
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド、
［６］［５］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
［７］［６］に記載のベクターで形質転換された宿主細胞、
［８］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
［９］［１］〜［４］のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、ヒストンＨ３と接触させる工程、及びヒストンＨ３に結合したモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を検出する工程、を含むヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析方法、及び
［１０］［１］〜［４］のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、ヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析キット、
に関する。

本発明のモノクローナル抗体は、細胞内の還元状態において、安定な構造を維持することができる。従って、細胞内でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合できるモノクローナル抗体として効果的に使用することができる。

ヒストンＨ３のアミノ末端側のテールドメインの翻訳後修飾を示した図である。本発明のｓｃＦｖとｓｆＧＦＰを連結したｐｓｃＦｖ−ＥＧＦＰベクターを示した模式図である。２Ｅ１２のｓｃＦｖが、カエルＡ３細胞（Ｂ）及びマウスＭＣ１２細胞中（Ｃ）において、２６℃及び３０℃でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合することを示した写真である。モノクローナル抗体２Ｅ１２の野生型のｓｃＦｖのアミノ酸配列、及び変異体Ｍ８６ＬのｓｃＦｖのアミノ酸配列を示した図である。変異体Ｍ８６Ｌ（Ａ）及び変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｉ（Ｂ）がマウスＭＣ１２細胞中において、３７℃でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合することを示した写真である。変異体Ｍ８６ＬのｓｃＦｖのアミノ酸配列、変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ３８ＣのｓｃＦｖのアミノ酸配列、及び変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ１０５ＮのｓｃＦｖのアミノ酸配列を示した図である。変異体Ｍ８６Ｌ（Ａ）、変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ３８Ｃ（Ｂ）、及び変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ１０５Ｎ（Ｃ）が、マウスＭＣ１２細胞中において、３７℃でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合することを示した写真である。モノクローナル抗体２Ｅ１２の重鎖可変領域ドメインのアミノ酸配列を示した図である。モノクローナル抗体２Ｅ１２の軽鎖可変領域ドメインのアミノ酸配列を示した図である。

［１］モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片
本発明のモノクローナル抗体は、ヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内で結合できるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である（以下、本明細書において「モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片」を纏めて「モノクローナル抗体」と称することがある）。具体的には、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含むか、（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列における８１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換された重鎖可変領域ドメイン、及び／又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における２１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換された軽鎖可変領域ドメインを含むか、（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含み、且つヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内で結合できるか、又は（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列における８１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換されたアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列における２１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換されたアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含み、且つヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内で結合できる、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である。

（ヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシン）
ヒストンは、ＤＮＡを折り畳んで、核内に収容する役割を有するタンパク質である。ヒストン及びＤＮＡにより、クロマチン（染色体）の基本的構成単位であるヌクレオソームが形成される。ヌクレオソームは、４種のコアヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４）から構成されるコアヒストン８量体に１４６ｂｐの２重鎖ＤＮＡが巻き付いた構造を有している。クロマチンにおいて２つのヌクレオソームは、リンカーＤＮＡにより結合しており、そしてリンカーＤＮＡにリンカーヒストン（例えば、ヒストンＨ１）が結合している。
４種のコアヒストンは、カルボキシル末端側のフォールドドメインとアミノ末端側のテールドメインを有し、テールドメインの翻訳後修飾が遺伝子発現制御に重要な働きをしていると考えられている。例えば、前記ヒストンＨ３の２７番目のリシン残基は、ヒストンメチル化酵素（ヒトのＥｚｈ２）によりメチル化される。このＨ３の２７番目のリシンは、モノメチル化、ジメチル化、及びトリメチル化されるが、特にトリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）が、発生段階におけるメスの二本のＸ染色体のうちの１本のＸ染色体の不活化を始めとした転写の抑制に強く相関していると考えられている。

（エピトープ）
本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープは、ヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンを含む周辺のアミノ酸を含む連続エピトープである。マウスの免疫に用いたペプチドのアミノ酸配列は、KQLATKAAR(トリメチルK)SAPATGGVKC（配列番号３）であり、トリメチルリシン及びその周辺の複数個のアミノ酸をエピトープとして認識している。

（可変領域ドメイン及び定常領域ドメイン）
本発明のモノクローナル抗体は、前記Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に結合する。本発明のモノクローナル抗体は、少なくとも可変領域ドメインを含む。
可変領域ドメインの重鎖はアミノ末端から、可変領域のポリペプチド（以下、重鎖可変領域ドメイン（ＶＨ）と称する）及び定常領域の３つのドメインのポリペプチド、すなわち重鎖定常領域ドメイン１（ＣＨ１）、重鎖定常領域ドメイン２（ＣＨ２）、及び重鎖定常領域ドメイン３（ＣＨ３）をその順番に有している。前記重鎖可変領域ドメインには、３つの相補性決定領域、すなわち、重鎖相補性決定領域１（以下、Ｈ−ＣＤＲ１と称することがある）、重鎖相補性決定領域２（以下、Ｈ−ＣＤＲ２と称することがある）、及び重鎖相補性決定領域３（以下、Ｈ−ＣＤＲ３と称することがある）を含み、それら３つの相補性決定領域は、重鎖可変領域フレームワークに囲まれている。重鎖可変領域フレームワークは、具体的には４つのフレームワーク領域のポリペプチド、すなわちアミノ末端から、Ｈ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、及びＨ−ＦＲ４からなっている。従って、重鎖可変領域ドメインは、Ｈ−ＦＲ１、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＦＲ３、Ｈ−ＣＤＲ３、及びＨ−ＦＲ４をその順番に含んでいる。

一方、可変領域ドメインの軽鎖はアミノ末端から、可変領域のポリペプチド（以下、軽鎖可変領域ドメイン（ＶＬ）と称する）及び定常領域のポリペプチド（以下、軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）と称する）をその順番に有している。前記軽鎖可変領域ドメインには、３つの相補性決定領域、すなわち、軽鎖相補性決定領域１（以下、Ｌ−ＣＤＲ１と称することがある）、軽鎖相補性決定領域２（以下、Ｌ−ＣＤＲ２と称することがある）、及び軽鎖相補性決定領域３（以下、Ｌ−ＣＤＲ３と称することがある）を含み、それら３つの相補性決定領域は、軽鎖可変領域フレームワークに囲まれている。軽鎖可変領域フレームワークは、具体的には４つのフレームワーク領域のポリペプチド、すなわちアミノ末端から、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３、及びＬ−ＦＲ４からなっている。従って、軽鎖可変領域ドメインは、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＦＲ３、Ｌ−ＣＤＲ３、及びＬ−ＦＲ４のそれぞれのポリペプチドをその順番に含んでいる。
なお、重鎖及び軽鎖の可変領域のポリペプチドにおける各ドメインを構成するアミノ酸配列からなるポリペプチドの割当は、Kabat（1991）、及び／又はChothia及びLesk、J.Mol.Biol. 196: 901-917（1987）；Chothiaら、Nature 342: 878-883（1989）の規定に従うものとする。

（２Ｅ１２の可変領域ドメイン）
本発明のモノクローナル抗体の１つの態様である２Ｅ１２の重鎖可変領域ドメインのアミノ酸配列を図８に示す。２Ｅ１２の重鎖可変領域ドメインは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１番〜３０番のアミノ酸からなる重鎖可変領域フレームワーク１のポリペプチド（QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGFTFT）（配列番号２０）、３１番〜３５番のアミノ酸からなる重鎖相補性決定領域１のポリペプチド（SYYMY）（配列番号２１）、３６番〜４９番のアミノ酸からなる重鎖可変領域フレームワーク２のポリペプチド（WVKQRPGQGLEWIG）（配列番号２２）、５０番〜６６番のアミノ酸からなる重鎖相補性決定領域２のポリペプチド（EINPSNGGTYFNEKFKN）（配列番号２３）、６７番〜９８番のアミノ酸からなる重鎖可変領域フレームワーク３のポリペプチド（KATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCAA）（配列番号２４）、９９番〜１０６番のアミノ酸からなる重鎖相補性決定領域３のポリペプチド（YYGNLFDY）（配列番号２５）及び１０７番〜１１７番のアミノ酸からなる重鎖可変領域フレームワーク４のポリペプチド（WGQGTTLTVSS）（配列番号２６）を含む重鎖可変領域ドメインである。
本発明のモノクローナル抗体の１つの態様である２Ｅ１２の軽鎖可変領域ドメインのアミノ酸配列を図９に示す。２Ｅ１２の軽鎖可変領域ドメインは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１番〜２３番のアミノ酸からなる軽鎖可変領域フレームワーク１のポリペプチド（DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMAC）（配列番号２７）、２４番〜４０番のアミノ酸からなる軽鎖相補性決定領域１のポリペプチド（KSSQSLLYSSNQKNYLA）（配列番号２８）、４１番〜５５番のアミノ酸からなる軽鎖可変領域フレームワーク２のポリペプチド（WYQQKPGQSPKLLIY）（配列番号２９）、５６番〜６２番のアミノ酸からなる軽鎖相補性決定領域２のポリペプチド（WASTRES）（配列番号３０）、６３番〜９４番のアミノ酸からなる軽鎖可変領域フレームワーク３のポリペプチド（GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYC）（配列番号３１）、９５番〜１０２番のアミノ酸からなる軽鎖相補性決定領域３のポリペプチド（QQYYTYPW）（配列番号３２）、及び１０３番〜１１６番のアミノ酸からなる軽鎖可変領域フレームワーク４のポリペプチド（TFGGGTKLEIKRAD）（配列番号３３）を含む軽鎖可変領域ドメインである。
本発明のモノクローナル抗体において、重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインは、モノクローナル抗体の構造を維持できる限りにおいて、それぞれの可変領域ドメインのＮ末及び／又はＣ末のアミノ酸を欠失してもよい。欠失してもよいアミノ酸の個数は、限定されるものではないが、例えば１０個以内であり、好ましくは８個以内であり、より好ましくは６個以内であり、更に好ましくは４個以内である。

（２Ｅ１２の変異体）
本発明のモノクローナル抗体の好ましい実施態様は、モノクローナル抗体２Ｅ１２の変異体である。２Ｅ１２変異体としては、配列番号１で表される２Ｅ１２の重鎖可変領域ドメインの（図８）アミノ酸配列における８１番のアミノ酸が、メチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換された重鎖可変領域ドメインを含むモノクローナル抗体を挙げることができる。また、配列番号２で表される２Ｅ１２の軽鎖可変領域ドメイン（図９）のアミノ酸配列における２１番のアミノ酸が、メチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換された軽鎖可変領域ドメインを含むモノクローナル抗体を挙げることができる。本発明のモノクローナル抗体においては、重鎖可変領域ドメインの８１番のアミノ酸の変異のみを有しているものでもよく、軽鎖可変領域ドメインの２１番目のアミノ酸の変異のみを有しているものでもよく、２つの変異を有しているものでもよい。
本発明のモノクローナル抗体は、前記重鎖可変領域ドメインの８１番のアミノ酸の変異、及び／又は軽鎖可変領域ドメインの２１番目のアミノ酸の変異を有することにより、細胞内の還元状態において、更に安定な構造を維持することができる。すなわち、重鎖可変領域ドメインの８１番のアミノ酸の変異、及び軽鎖可変領域ドメインの２１番目のアミノ酸の変異は、本発明のモノクローナル抗体の優れた効果を得るための積極的な置換である。
また、前記ロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンは、メチオニンよりも疎水性のアミノ酸であり、メチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換することにより、本発明のモノクローナル抗体の細胞内における構造を安定させることができると考えられる。

（保存的置換）
本発明のモノクローナル抗体は、前記モノクローナル抗体２Ｅ１２又はモノクローナル抗体２Ｅ１２の変異体のアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含むモノクローナル抗体でもよい。
本明細書において、「アミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸」とは、アミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味するが、これらの改変は本発明のモノクローナル抗体の優れた効果を維持した挿入、置換、欠失、又は付加（以下、保存的置換と称することがある）である。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜２個である。本発明に用いることのできる変異ペプチドの改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は数個（好ましくは、１、２、３又は４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。

本明細書において「保存的置換」とは、本発明のモノクローナル抗体の優れた効果が失われない置換を意味する。すなわち、前記挿入、置換、又は欠失、若しくは付加された場合であっても、細胞内の還元状態においてヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに結合できることを意味する。
「保存的置換」の具体的な態様としては、限定されるものではないが、１若しくは数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを挙げることができる。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。正電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
具体的には、実施例５において、変異体Ｍ８６Ｌにおいて、３８番目のチロシンをシステインに置換した変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ３８Ｃ、及び１０５番目のチロシンからアスパラギンに置換した変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ１０５Ｎを得たが、これらの変異体は、変異体Ｍ８６Ｌと同じように細胞内でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合することが可能であった。すなわち、Ｙ３８Ｃ及びＹ１０５Ｎの置換は、本発明のモノクローナル抗体の機能を阻害しない保存的置換である。

保存的置換を有する本発明のモノクローナル抗体は、ヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内（例えば、マウスＭＣ１２細胞）で結合できるモノクローナル抗体である。細胞内は還元条件下であるが、本発明のモノクローナル抗体は、還元条件下において安定な構造を維持することができ、従って、細胞内でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合することができる。

（抗原結合性断片）
本発明の抗原結合性断片は、前記ヒストンＨ３トリメチル化リシン特異的モノクローナル抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片、又は単一鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）を挙げることができる。更に、抗原結合性断片として、ディアボディー、又は前記抗体断片から形成されたマルチ特異性抗体を用いることもできる。これらの抗原結合性断片は、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することにより、得ることができるか、又は遺伝子組換えにより調製することができる。

（ｓｃＦｖ）
本発明の抗原結合性断片の１つの態様であるｓｃＦｖ（single-chain variable fragment）は、重鎖可変領域ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変領域ドメイン（ＶＬ）とをリンカーで連結することにより得られる単鎖ポリペプチド抗体である。ＶＨとＶＬとを連結する順序は、特に限定されておらず、任意の順序で配置することができる。すなわち、［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］の順序で配置されてもよく、又は［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］の順序で配置されてもよい。

リンカーは、二つの可変領域ドメインが実質的な干渉なしに架橋されるような長さのものであれば限定されない。例えば、約３〜２５残基（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８残基）を含む任意のいかなる単鎖ペプチドも、リンカーとして使用することができるが、グリシンとセリンを含むリンカーが好ましい。具体的なペプチドリンカーとしては、Ser; Gly Ser; Gly Gly Ser; Ser Gly Gly; Gly Gly Gly Ser (配列番号１０); Ser Gly Gly Gly (配列番号１１); Gly Gly Gly Gly Ser (配列番号１２); Ser Gly Gly Gly Gly (配列番号１３); Gly Gly Gly Gly Gly Ser (配列番号１４); Ser Gly Gly Gly Gly Gly (配列番号１５); Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser (配列番号１６); Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly (配列番号１７); (Gly Gly Gly Gly Ser (配列番号１８)_n［配列中、ｎは、１または複数の整数である］；および（Ser Gly Gly Gly Gly（配列番号１９）_ｎ［配列中、ｎは、１または複数の整数である］を挙げることができる。また、リンカーは、溶解性を高めるためにいくつかのGluまたはLys残基を含んでもよい。

本発明の抗原結合性断片は、前記ｓｃＦｖを２つ組み合わせたｓｃ（Ｆｖ）２を含む。ｓｃ（Ｆｖ）２とは、２つのＶＨと２つのＶＬとをリンカーにより連結して、単鎖を形成する抗原結合性断片である。具体的には２つのｓｃＦｖをリンカーにより、結合させることにより、得ることができる。リンカーとしては、ＶＨ及びＶＬを結合させるリンカーを用いることができる。

本発明のモノクローナル抗体又は抗原結合性断片は、タンパク質が結合（融合）したものでもよい。結合させるタンパク質としては、抗体の活性に著しい影響を与えるものでないかぎりにおいて、特に限定されるものではないが、蛍光タンパク質、発光タンパク質、又はタグペプチドを挙げることができる。前記タンパク質が結合していることにより、モノクローナル抗体が結合する抗原の検出を容易にすることができる。また、モノクローナル抗体の精製を容易にすることができる。

蛍光タンパク質、及び発光タンパク質としては、限定されるものではないが、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＳＢＰ２、ＥＢＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＴａｇＢＦＰ、ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＰ１、ＭｉＣｙ（ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ）、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＣＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＡＧ（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）、ｍＡＧ１、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ（Ｅｍｅｒａｌｄ）、ＥＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＧＰ２、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ＥＹＦＰ、ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ｔｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＫＯ１、ＫＯ（ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＫＯ２、Ｋｅｉｍａ５７０、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＡｐｐｌｅ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＫｅｉｍａＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ２、ＴａｇＦＰ６３５、ｍＰｌｕｍ、ｅｇＦＰ６５０、Ｎｅｐｔｕｎｅ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ｉＲＦＰ、ｅｇＦＰ６７０及びルシフェラーゼを挙げることができる。
タグペプチドとしては、ＦＬＡＧタグペプチド、ＨＡタグペプチド、ＭＹＣタグペプチド、ＧＦＰタグペプチド、ＭＢＰタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＨＩＳタグ（Ｈｉｓ６タグ）、ＨａｌｏＴａｇタグ、ＳＮＡＰタグ、ＡＣＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＴＡＰタグ、β-Galタグ又はＶ５タグを挙げることができる。

《ハイブリドーマ》
本発明のハイブリドーマは、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。

（親和定数）
本発明のモノクローナル抗体の親和定数は、特に限定されるものではないが、少なくとも１０^５〜１０^９Ｍ^−１の親和定数を有するものが好ましく、最も好ましくは１０^６以上の親和定数を有するものである。結合親和性は、例えばMunson et al., Anal. Biochem. 107: 220（1980）のスキャッチャード（Scatchard）アッセイにより測定することができる。

［２］ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
《ポリヌクレオチド》
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のモノクローナル抗体又は抗原結合性断片、若しくはそれらと前記タンパク質の結合した融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。なお、前記ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ全長であっても、翻訳領域のみからなるポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡやｃＤＮＡであってもよい。

《ベクター》
本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換できる適当なベクターに当該ポリヌクレオチドを組み込むことにより調製することができる。前記ベクターは、当該ポリヌクレオチドの発現に必要な配列、例えば、プロモーター、エンハンサーを含むことができ、更に、宿主への導入確認に必要な配列、例えば、薬剤耐性遺伝子を含むことができる。
前記ベクターとしては、宿主細胞において複製可能である限り、プラスミド、ファージ、ウイルス等のいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ−１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
例えば、前記ｓｃＦｖを発現させるベクターとしては、ｐＥＧＦＰ、又はｐＣＤＮＡ３．１を挙げることができる。

《宿主細胞》
本明細書において「宿主」とは、前記ベクターが組込まれ、モノクローナル抗体又は抗原結合性断片、若しくはそれらと前記タンパク質の結合した融合タンパク質を発現できる限りにおいて、限定されるものでなく、ファージ、細菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞を挙げることができる。例えば、ファージベクターの宿主としては、Ｍ１３ファージ、ｆｄファージ、又はＴ７ファージを挙げることができる。
また、細菌のベクターの宿主としては、大腸菌、ストレプトミセス、又は枯草菌を挙げることができる。更に、酵母ベクターの宿主としては、パン酵母、又はメタノール資化性酵母を挙げることができる。昆虫細胞ベクターの宿主としては、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９を挙げることができる。更に、動物細胞ベクターの宿主としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７、Ａ６、Ｈｅｌａ、ＭＣ１２、又はマウス胚性幹細胞を挙げることができる。

［３］ヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析方法
本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析方法は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３を特異的に分析する方法であるが、特には細胞内などの還元条件下でＨ３Ｋ２７ｍｅ３を分析できる方法である。本明細書において、「分析」とは、存在の有無を判定する「検出」、及び量を判定する「定量（測定）」の両方を意味する。
本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析方法は、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、ヒストンＨ３と接触させる工程、及びヒストンＨ３に結合したモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を検出する工程を含む。本発明の分析方法に用いるモノクローナル抗体は、前記「［１］モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片」に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である。

具体的な分析方法としては、限定されるものではないが、酵素免疫測定法、免疫組織染色法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、蛍光局在法、放射免疫測定法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、磁気ビーズ凝集法、又は磁気ビーズ酵素免疫法を挙げることができる。本発明の分析方法においては、前記モノクローナル抗体を用いることを除いては、通常の酵素免疫測定法、免疫組織染色法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、蛍光局在法、放射免疫測定法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、磁気ビーズ凝集法、又は磁気ビーズ酵素免疫法等に従って、分析することができる。

《接触工程（１）》
本発明の分析方法における接触工程（１）は、前記モノクローナル抗体と、ヒストンＨ３とを接触させる工程である。例えば、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、蛍光局在法、放射免疫測定法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、酵素免疫測定法、又は免疫組織染色法などでは、生細胞内でモノクローナル抗体とヒストンＨ３とを接触させて、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３及びモノクローナル抗体の複合体を形成させることもできる。また、生細胞内でモノクローナル抗体とヒストンＨ３とを接触させる場合、細胞にモノクローナル抗体又は抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦｖ）を導入し、細胞内でそれらを発現させることにより、モノクローナル抗体等とＨ３Ｋ２７ｍｅ３との複合体を形成させることもできる。
また、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、磁気ビーズ凝集法、又は磁気ビーズ酵素免疫法などにおいては、担体にモノクローナル抗体を結合させて、そのモノクローナル抗体にヒストンＨ３を接触させ、モノクローナル抗体等とＨ３Ｋ２７ｍｅ３との複合体を形成させることもできる。担体としては、酵素免疫測定法又は磁気ビーズ凝集法などでは、マイクロプレート又はビーズなどを用いることができる。表面プラズモン共鳴法では、金属を担体として、モノクローナル抗体を吸着させることができる。

《検出工程（２）》
本発明の分析方法における検出工程（２）は、ヒストンＨ３に結合したモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を検出する工程である。例えば、モノクローナル抗体等を直接、蛍光タンパク質又は発光タンパク質等で標識したり、又は前記のようにモノクローナル抗体等を蛍光タンパク質又は発光タンパク質との融合タンパク質として発現させた場合は、蛍光タンパク質又は発光タンパク質を検出することにより、ヒストンＨ３に結合したモノクローナル抗体等を検出することができる。また、モノクローナル抗体等を酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等）などで標識又は融合した場合は、適当な基質を用いてモノクローナル抗体等を検出することができる。
また、モノクローナル抗体等に前記タグペプチドを融合させた場合は、蛍光タンパク質、発光タンパク質、酵素などで標識された、タグペプチドに対する抗体などを用いることによって、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に結合したモノクローナル抗体を検出することができる。例えば、免疫沈降法においては、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に結合したモノクローナル抗体をタグペプチドに対する抗体で免疫沈降することによって、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３とモノクローナル抗体との複合体を検出することができる。
また、蛍光タンパク質、発光タンパク質、酵素などで標識された、本発明のモノクローナル抗体に対しる抗体を用いることによっても、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に結合したモノクローナル抗体を検出することができる。

検出されるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の量は、蛍光タンパク質の蛍光量、発光タンパク質の発光量、酵素の基質の発色量などを測定し、基準量と比較することによって、定量することが可能である

［４］ヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析キット
本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の検出キットは、前記ヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の測定方法に用いることのできるキットである。
本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の免疫学的分析用キットは、本発明のモノクローナル抗体又はその又はその抗原結合性断片を含む。
本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の免疫学的分析用キットは、更に、本発明のモノクローナル抗体又はその又はその抗原結合性断片に結合する抗体等を含んでもよい。また、本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の免疫学的分析用キットは、更に、ヒストンＨ３と反応する第２の抗体又はその抗原結合性断片を含んでもよい。

本実施形態のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析キットは、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体の抗原結合性断片を含む、ヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析方法の免疫学的分析用キットである。すなわち、本発明のキットは、本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析方法の免疫学的分析方法に用いることができる。従って、本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の免疫学的分析用キットは、酵素免疫測定法、免疫組織染色法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法：Ｂｉａｃｏｒｅ法）、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、蛍光局在法、放射免疫測定法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、磁気ビーズ凝集法、又は磁気ビーズ酵素免疫法等に用いるキットを含む。

また、前記分析方法が、標識化抗体を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法など）の場合には、抗体は、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として^３Ｈ、^１４Ｃ、又は^１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないため、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：ヒストンＨ３トリメチル化リシン特異的モノクローナル抗体の取得》
ヒストンＨ３Ｋ２７トリメチル化リシンを含む２０ｍｅｒのペプチド（ＫＱＬＡＴＫＡＡＲ(トリメチルＫ)ＳＡＰＡＴＧＧＶＫＣ）を、常法に従って、ＫＬＨとコンジュゲートさせた。０．２ｍｇ／ｍＬのペプチド溶液を、等量のフロイントアジュバントと混和し、４〜６週令のＢＡＬＢ／ｃマウスに２００μｇ皮下投与した。２週間後に２００μｇの追加免疫を行い、更に２００μｇを最終免疫として尾静脈内に投与した。

最終免疫後３日目に、このマウスより脾臓を無菌的に摘出し、ハサミ及びピンセットを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、ＧＩＴ培地で３回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３をＧＩＴ培地で３回洗浄後、該細胞と脾臓細胞を１：１０の細胞数比で混合した。２００×ｇ、５分間遠心分離後、上清を除去し、細胞隗を緩やかに混合しながら５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００（ロッシュ社）１ｍＬをゆっくりと加え、更にＧＩＴ培地９ｍＬを加えて細胞融合させた。

融合細胞は、遠心分離（２００×ｇ、５分間）によってＰＥＧを除いた後、１０％ウシ胎児血清及びヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ）を含むＧＩＴ培地に懸濁し、９６ウェル細胞培養プレートに播種した。７日間培養してハイブリドーマのみを増殖させた後、抗体を産生するクローンをＥＬＩＳＡ法により検索し、目的の反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。
スクリーニングのＥＬＩＳＡは、以下のように行った。
９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート（Ｃｏｓｔａｒ社）に、免疫に用いたペプチドとコンジュゲートしたＢＳＡ（０．５μｇ／ｍＬ）を各々５０μＬずつ分注し、４℃で一夜放置した。コントロールとして、ヒストンＨ３Ｋ２７トリメチル化リシンを含まない２０ｍｅｒのペプチド（ＫＱＬＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＣ）（配列番号４）をコンジュゲートしたＢＳＡを同様に分注した。次に、これらのプレートの各ウェルを１．６％ブロックエースを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３０分ブロッキングした。このブロッキング液を除去した後、ハイブリドーマの培養上清５０μＬをウェルに添加した。室温で６０分放置した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと称する）で３回洗浄した。続いて、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ヒツジ；ジャクソン社）１００μＬを加え、室温で１時間放置した後、再び、ＰＢＳＴで４回洗浄した。ＴＭＢ基質溶液５０μＬを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させ、反応停止液５０μＬを各ウェルに加え、各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。

得られたハイブリドーマについて、限界希釈法により単一クローンとし、抗体産生ハイブリドーマを樹立した。ヒストンＨ３Ｋ２７トリメチル化リシンを含むペプチドに反応し、ヒストンＨ３Ｋ２７トリメチル化リシンを含まないペプチドに反応しない抗体を産生するハイブリドーマを数十個得た。そのなかで、最もヒストンＨ３Ｋ２７トリメチル化リシンを含むペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを５個得た。

得られたハイブリドーマを、無血清培地（Ｓｅｒｕｍ−ＦｒｅｅＭｅｄｉｕｍ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で培養し、培地中にモノクローナル抗体を取得した。前記モノクローナル抗体は、プロテインＡセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより分離精製した。

《実施例２》
本実施例では、得られた５個のハイブリドーマからＲＮＡを調製し、ＤＮＡを作製した後に、抗体の重鎖と軽鎖をコードするｃＤＮＡの塩基配列を決定した。その配列を元にプライマーを設計し、ＰＣＲにより、重鎖と軽鎖の可変領域をクローニングした。それらをリンカー配列で連結することでｓｃＦｖを作製した。ｓｃＦｖとｓｆＧＦＰを図２に示すように連結して、ｐｓｃＦｖ−ＥＧＦＰベクターを取得し、動物細胞に発現させた。

作製したｓｃＦｖのうち、２Ｅ１２由来のｓｃＦｖ（配列番号５）は生きた細胞内において、カエルＡ３細胞及びマウスＭＣ１２細胞中において、３０℃以下でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合することを確認した（図３）。

《実施例３》
本実施例では、２Ｅ１２抗体のｓｃＦｖにランダムミューテーションを導入し、細胞内で機能する変異体の取得を試みた。ランダムミューテーションは、マンガンイオン存在下でのＰＣＲにより導入し、４８個の変異体を得た。それらの変異体をＭＣ１２細胞で発現させ、３７℃で不活性Ｘ染色体へ局在を検討した。

４８個の変異体のうち、８６番目のメチオニン（Ｍ）がロイシン（Ｌ）に置換された変異体Ｍ８６Ｌ（配列番号６）が、マウスＭＣ１２細胞内で３７℃においても機能し、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に結合した（図５Ａ）。なお、前記８６番目のメチオニン（Ｍ）は、配列番号５に記載の２Ｅ１２のｓｃＦｖのアミノ酸配列におけるアミノ酸番号である。従って、８６番目のメチオニンは、配列番号１（図８）に記載の重鎖可変領域ドメインの８１番目のメチオニンに相当する。

《実施例４》
本実施例では、更に８６番目のメチオニン立体的に近い位置にある１５８番目のメチオニンをイソロイシンに置換する変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｉ（配列番号７）を取得した。この変異は、相補的プライマーを用いたＰＣＲによる部位特異的変異の導入により行った。変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｉは、細胞質での凝集が見られず、更に安定に発現した（図５Ｂ）。なお、前記１５８番目のメチオニン（Ｍ）も、配列番号５に記載の２Ｅ１２のｓｃＦｖのアミノ酸配列におけるアミノ酸番号である。従って、１５８番目のメチオニンは、配列番号２（図９）に記載の軽鎖可変領域ドメインの２１番目のメチオニンに相当する。
また、１５８番目のメチオニンを、それぞれロイシン及びバリンに置換した変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｌ、及び変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｖを作製したところ、変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｉと同じように、細胞内で機能した。

《実施例５》
本実施例では、ＰＣＲによるランダム変異法を用いて、変異体Ｍ８６Ｌに任意の置換を導入し、変異体Ｍ８６Ｌの機能が低下しないことを確認した。
図７に示すように、変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ３８Ｃ（配列番号８）及び変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ１０５Ｎ（配列番号９）は、変異体Ｍ８６Ｌと比較して、細胞内での機能が低下せず、変異体Ｍ８６Ｌと同様にＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合することができた。すなわち、３８番目のチロシンからシステインへの置換、及び１０５番目のチロシンからアスパラギンへの置換は、変異体Ｍ８６Ｌの機能に影響を与えなかった。換言すると、３８番目のチロシンからシステインへの置換、及び１０５番目のチロシンからアスパラギンへの置換は、本発明のモノクローナル抗体の機能に影響を与えない保存的置換であると考えられる。

本発明のモノクローナル抗体等及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３の解析方法は、オスとメスの鑑別に用いることができる。また、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の量の増減を解析できることから、医薬の薬効評価、病態の解析に用いることができる。

Claims

（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列における８１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換された重鎖可変領域ドメイン、及び／又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における２１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換された軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含み、且つヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内で結合できるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、又は
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列における８１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換されたアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列における２１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、バリン、システイン、又はフェニルアラニンに置換されたアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含み、且つヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内で結合できるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
前記抗原結合性断片がｓｃＦｖである、請求項１に記載の抗原結合性断片。
タンパク質が結合した請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性断片。
前記タンパク質が、蛍光タンパク質、発光タンパク質、又はタグペプチドである請求項１〜３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性断片。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項６に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、ヒストンＨ３と接触させる工程、及びヒストンＨ３に結合したモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を検出する工程、を含むヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析方法。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、ヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析キット。