WO2018225781A1 - ヒストンｈ３トリメチル化リシン特異的モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片 - Google Patents

ヒストンｈ３トリメチル化リシン特異的モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片 Download PDF

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木村　宏
優子 佐藤
彰人 大井
仁志 胡桃坂
智也 鯨井
恭行 大川
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国立大学法人東京工業大学
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a histone H3 trimethylated lysine specific monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof. According to the present invention, the 27th trimethylated lysine of histone H3 can be specifically detected in the cell.
  • Histones constituting nucleosomes which are the basic units of chromatin, fold DNA molecules and store them in the nucleus. Histones are known to undergo chemical modifications such as acetylation, phosphorylation, and methylation, and these chemical modifications are thought to be involved in the regulation of chromatin functions such as gene expression. For example, one of histones, H3, No. 4, No. 9, No. 27, No. 36, and No. 79 lysine has been shown to be methylated. Of these lysine methylations, trimethylation of the 27th lysine of H3 (hereinafter sometimes referred to as H3K27me3) is considered to be involved in suppression of gene expression and inactivation of the X chromosome.
  • H3K27me3 trimethylation of the 27th lysine of H3
  • XY chromosomes In mammals, males have XY chromosomes and females have XX chromosomes as sex chromosomes, but one X chromosome of two female X chromosomes is randomly selected at the stage of development and highly aggregated. And undergo inactivation. Inactivated X chromosomes remain aggregated throughout the subsequent cell cycle and are thought to have a structure very similar to structural heterochromatin. It is known that methylation of the 27th lysine of histone H3 occurs at the initial stage of inactivation of the X chromosome, and it is considered to be involved in inactivation of the X chromosome.
  • H3K27me3 is methylated by a methylating enzyme called Ezh2.
  • This Ezh2 has been reported to be overexpressed in metastatic prostate cancer (Non-patent Document 1), and the relationship between the 27th lysine methylation of histone H3 and the progression of cancer is also present. It is being considered.
  • an object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that functions even in a reduced state in a cell.
  • the present inventors have surprisingly found that a heavy chain variable region domain consisting of a specific amino acid sequence and a light chain variable region consisting of a specific amino acid sequence It was found that by using a monoclonal antibody having a domain, the monoclonal antibody functions even in a reduced state in the cell, and trimethylation of the 27th lysine of H3 can be detected.
  • the present invention is based on these findings.
  • the present invention [1] (1) A monoclonal antibody comprising the heavy chain variable region domain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the light chain variable region domain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or antigen binding thereof Fragment, (2) the heavy chain variable region domain in which amino acid 81 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced by methionine to leucine, and / or amino acid 21 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • a light chain comprising a chain variable region domain and an amino acid sequence in which one or more amino acids are inserted, substituted, or
  • the monoclonal antibody of the present invention can maintain a stable structure in the reduced state in the cell. Therefore, it can be effectively used as a monoclonal antibody capable of binding to H3K27me3 in cells.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a pscFv-EGFP vector in which scFv and sfGFP of the present invention are linked.
  • FIG. 2E12 is a photograph showing that scFv of 2E12 binds to H3K27me3 at 26 ° C. and 30 ° C. in frog A6 cells (B) and mouse MC12 cells (C). It is the figure which showed the amino acid sequence of the wild type scFv of monoclonal antibody 2E12, and the amino acid sequence of scFv of variant M86L.
  • variant M86L (A) and variant M86L / M158I (B) couple
  • the monoclonal antibody of the present invention is a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that can bind intracellularly to the 27th trimethylated lysine of histone H3 (hereinafter referred to as the present specification).
  • “monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof” may be collectively referred to as “monoclonal antibody”).
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention consists of (1) a heavy chain variable region domain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid number 81 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced by leucine to methionine
  • the heavy chain variable region domain consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are inserted, substituted, or deleted, or added to one or both ends thereof, and the 21st in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • the amino acid sequence in which one amino acid is replaced by leucine, isoleucine, or valine from methionine isoleucine, or valine from methionine.
  • Histone is a protein that has a role of folding DNA and accommodating it in the nucleus. Histone and DNA form nucleosomes, which are the basic building blocks of chromatin (chromosomes). The nucleosome has a structure in which a 146 bp double-stranded DNA is wrapped around a core histone octamer composed of four types of core histones (H2A, H2B, H3, and H4). In chromatin, two nucleosomes are linked by linker DNA, and linker histone (eg, histone H1) is bound to linker DNA.
  • linker histone eg, histone H1
  • the four core histones have a fold domain on the carboxyl terminal side and a tail domain on the amino terminal side, and post-translational modification of the tail domain is considered to play an important role in controlling gene expression.
  • the 27th lysine residue of histone H3 is methylated by histone methylase (human Ezh2).
  • This 27th lysine of H3 is monomethylated, dimethylated, and trimethylated, and in particular, trimethylation (H3K27me3) is a failure of one X chromosome of two female X chromosomes during development. It is thought to be strongly correlated with suppression of transcription including activation.
  • the epitope to which the monoclonal antibody of the present invention binds is a continuous epitope including peripheral amino acids including the 27th trimethylated lysine of histone H3.
  • the amino acid sequence of the peptide used for immunization of the mouse is KQLATKAAR (trimethyl K) SAPATGGVKC (SEQ ID NO: 3), and recognizes trimethyl lysine and a plurality of amino acids around it as epitopes.
  • the monoclonal antibody of the present invention binds to the H3K27me3.
  • the monoclonal antibody of the present invention includes at least a variable region domain.
  • the heavy chain of the variable region domain is from the amino terminus, the polypeptide of the variable region (hereinafter referred to as heavy chain variable region domain (VH)) and the polypeptide of the three domains of the constant region, namely heavy chain constant region domain 1 (CH1 ), Heavy chain constant region domain 2 (CH2), and heavy chain constant region domain 3 (CH3) in that order.
  • the heavy chain variable region domain has three complementarity determining regions, namely a heavy chain complementarity determining region 1 (hereinafter sometimes referred to as H-CDR1) and a heavy chain complementarity determining region 2 (hereinafter referred to as H- And a heavy chain complementarity determining region 3 (hereinafter also referred to as H-CDR3), and these three complementarity determining regions are surrounded by a heavy chain variable region framework.
  • the heavy chain variable region framework is specifically composed of four framework region polypeptides, namely H-FR1, H-FR2, H-FR3, and H-FR4, from the amino terminus.
  • the heavy chain variable region domain includes H-FR1, H-CDR1, H-FR2, H-CDR2, H-FR3, H-CDR3, and H-FR4 in that order.
  • the light chain of the variable region domain has, from the amino terminus, a variable region polypeptide (hereinafter referred to as light chain variable region domain (VL)) and a constant region polypeptide (hereinafter referred to as light chain constant region domain (CL)).
  • VL variable region polypeptide
  • CL constant region polypeptide
  • the light chain variable region domain includes three complementarity determining regions, namely, a light chain complementarity determining region 1 (hereinafter sometimes referred to as L-CDR1) and a light chain complementarity determining region 2 (hereinafter referred to as L- And light chain complementarity determining region 3 (hereinafter also referred to as L-CDR3), which are surrounded by a light chain variable region framework.
  • L-CDR1 light chain complementarity determining region 1
  • L-CDR3 light chain complementarity determining region 3
  • the light chain variable region framework consists of four framework region polypeptides, namely L-FR1, L-FR2, L-FR3, and L-FR4 from the amino terminus.
  • the light chain variable region domain contains the respective polypeptides of L-FR1, L-CDR1, L-FR2, L-CDR2, L-FR3, L-CDR3, and L-FR4 in that order.
  • Polypeptides consisting of amino acid sequences constituting each domain in the heavy chain and light chain variable region polypeptides are assigned by Kabat (1991), and / or Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901. -917 (1987); Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989).
  • FIG. 8 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable region domain of 2E12, which is one embodiment of the monoclonal antibody of the present invention.
  • the heavy chain variable region domain of 2E12 is a heavy chain variable region framework 1 polypeptide (QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGFTFT) consisting of amino acids 1 to 30 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 20), 31 to Polypeptide of heavy chain complementarity determining region 1 consisting of amino acid No. 35 (SYYMY) (SEQ ID NO: 21), heavy chain variable region framework 2 polypeptide consisting of amino acids No. 36 to 49 (WVKQRPGQGLEWIG) (SEQ ID NO.
  • QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGFTFT heavy chain variable region framework 1 polypeptide
  • the light chain variable region domain of 2E12 is a polypeptide of the light chain variable region framework 1 consisting of amino acids 1 to 23 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMAC) (SEQ ID NO: 27), 24 to Polypeptide of light chain complementarity determining region 1 consisting of amino acid 40 (KSSQSLLYSSNQKNYLA) (SEQ ID NO: 28), light chain variable region framework 2 polypeptide consisting of amino acids 41 to 55 (WYQQKPGQSPKLLIY) (SEQ ID NO: 29), light chain complementarity determining region 2 polypeptide consisting of amino acids 56 to 62 (WASTRES) (SEQ ID NO: 30), light chain variable region framework 3 polypeptide consisting of amino acids 63 to 94 (GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYC
  • the heavy chain variable region domain and the light chain variable region domain are deleted from the N-terminal and / or C-terminal amino acids of each variable region domain as long as the structure of the monoclonal antibody can be maintained. Also good.
  • the number of amino acids that may be deleted is not limited, but is, for example, 10 or less, preferably 8 or less, more preferably 6 or less, and still more preferably 4 or less. is there.
  • a preferred embodiment of the monoclonal antibody of the present invention is a variant of monoclonal antibody 2E12.
  • a monoclonal antibody containing a heavy chain variable region domain in which the amino acid number 81 in the amino acid sequence of the heavy chain variable region domain of 2E12 represented by SEQ ID NO: 1 is substituted from methionine to leucine (FIG. 8). Mention may be made of antibodies.
  • a monoclonal antibody comprising a light chain variable region domain in which the 21st amino acid in the amino acid sequence of the light chain variable region domain of 2E12 represented by SEQ ID NO: 2 (FIG.
  • the monoclonal antibody of the present invention may have only the 81st amino acid mutation of the heavy chain variable region domain, or may have only the 21st amino acid mutation of the light chain variable region domain. Well, it may have two mutations.
  • the monoclonal antibody of the present invention has a mutation at the 81st amino acid in the heavy chain variable region domain and / or a mutation at the 21st amino acid in the light chain variable region domain, so that it is more stable in the reduced state in the cell.
  • a simple structure can be maintained. That is, the 81st amino acid mutation of the heavy chain variable region domain and the 21st amino acid mutation of the light chain variable region domain are aggressive substitutions for obtaining the excellent effects of the monoclonal antibody of the present invention.
  • the leucine is an amino acid that is more hydrophobic than methionine, and it is considered that the intracellular structure of the monoclonal antibody of the present invention can be stabilized by replacing methionine with leucine.
  • a heavy chain variable region domain consisting of an amino acid sequence and an amino acid in which one or a plurality of amino acids are inserted, substituted, or deleted at one or both ends in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 It may be a monoclonal antibody comprising a light chain variable region domain consisting of a sequence.
  • an amino acid sequence in which one or more amino acids are inserted, substituted, or deleted, or added to one or both ends thereof has been altered by amino acid substitution or the like.
  • these modifications are insertions, substitutions, deletions or additions (hereinafter sometimes referred to as conservative substitutions) that maintain the excellent effects of the monoclonal antibody of the present invention.
  • the number of amino acid modifications is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, and most preferably 1 to 2.
  • modified amino acid sequences of mutant peptides that can be used in the present invention are preferably amino acid sequences having one or several (preferably 1, 2, 3, or 4) conservative substitutions of the amino acids. Can be.
  • the “conservative substitution” means a substitution that does not lose the excellent effect of the monoclonal antibody of the present invention. That is, even when the insertion, substitution, deletion or addition is performed, it means that it can bind to the 27th trimethylated lysine of histone H3 in the reduced state in the cell.
  • Specific embodiments of “conservative substitution” include, but are not limited to, replacing one or several amino acid residues with another chemically similar amino acid residue. For example, when a certain hydrophobic residue is substituted by another hydrophobic residue, a certain polar residue is substituted by another polar residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids that can be made by such substitutions are known in the art for each amino acid.
  • nonpolar (hydrophobic) amino acids examples include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine, and the like.
  • polar (neutral) amino acids examples include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, cysteine, and the like.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • negatively charged (acidic) amino acids examples include aspartic acid and glutamic acid.
  • mutant M86L / Y38C in which the 38th tyrosine was replaced with cysteine and mutant M86L / Y105N in which 105th tyrosine was replaced with asparagine were obtained.
  • These mutants were able to bind to H3K27me3 in the cells in the same manner as mutant M86L. That is, the substitution of Y38C and Y105N is a conservative substitution that does not inhibit the function of the monoclonal antibody of the present invention.
  • the monoclonal antibody of the present invention having a conservative substitution is a monoclonal antibody capable of binding to the 27th trimethylated lysine of histone H3 intracellularly (for example, mouse MC12 cells). Although intracellularly under reducing conditions, the monoclonal antibody of the present invention can maintain a stable structure under reducing conditions, and therefore can bind to H3K27me3 in cells.
  • Antigen-binding fragment examples of the antigen-binding fragment of the present invention include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , and Fv fragment of the histone H3 trimethylated lysine specific monoclonal antibody, or a single chain antibody molecule (scFv). . Furthermore, diabodies or multispecific antibodies formed from the antibody fragments can also be used as the antigen-binding fragment.
  • These antigen-binding fragments can be obtained, for example, by digesting an antibody with a proteolytic enzyme (for example, pepsin or papain) by a conventional method, and subsequently purifying the protein by a conventional method for protein separation and purification. Or can be prepared by genetic recombination.
  • a proteolytic enzyme for example, pepsin or papain
  • ScFv single-chain variable fragment
  • VH heavy chain variable region domain
  • VL light chain variable region domain
  • Single chain polypeptide antibody Single chain polypeptide antibody.
  • the order in which VH and VL are connected is not particularly limited, and can be arranged in any order. That is, they may be arranged in the order of [VH] linker [VL], or may be arranged in the order of [VH] linker [VL].
  • the linker is not limited as long as it has such a length that the two variable region domains can be cross-linked without substantial interference.
  • any single chain peptide containing about 3-25 residues eg, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 residues
  • a linker containing glycine and serine is preferred.
  • linkers include Ser; Gly Ser; Gly Gly Ser; Ser Gly Gly; Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 10); Ser Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 11); Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 12) Ser Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 13); Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 14); Ser Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 15); Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 16); Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 17); (Gly Gly Gly Ser ( SEQ ID NO: 18) n [in the sequence, n is 1 or more integer; and (Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ No. 19) n [wherein n is an integer of one or more]
  • the linker may also contain several Glu or Lys residues to increase solubility
  • the antigen-binding fragment of the present invention contains sc (Fv) 2 obtained by combining two scFvs.
  • sc (Fv) 2 is an antigen-binding fragment in which two VHs and two VLs are linked by a linker to form a single chain. Specifically, it can be obtained by joining two scFvs with a linker.
  • the linker a linker that binds VH and VL can be used.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment of the present invention may be a protein bound (fused).
  • the protein to be bound is not particularly limited as long as it does not significantly affect the activity of the antibody, and examples thereof include a fluorescent protein, a luminescent protein, and a tag peptide. By binding the protein, it is possible to easily detect the antigen to which the monoclonal antibody binds. In addition, the purification of the monoclonal antibody can be facilitated.
  • fluorescent proteins and photoproteins include, but are not limited to, Sirius, EBFP, SBP2, EBP2, Azure, mKalama1, TagBFP, mBlueberry, mTurquoise, ECFP, Cerulean, mCuleMim, TPCM Cyan), TurboGFP, CFP, AcGFP, TagGFP, AG (Azami-Green), mAG1, ZsGreen, EmGFP (Emerald), EGFP, sfGFP, GP2, T-Sapphire, HyPer, TagYFP, mAYR, MeYP , PhiYFP, PhiYFP-m, turboYFP , ZsYellow, mBanana, mKO1, KO (Kusisten Orange), mOrange, mOrgage2, mKO1, Keima570, TurboRFP, DsRed-Express, DsRed, DsRed2, DsRed2, TagRFP, DsRed-M ,
  • FLAG tag peptide FLAG tag peptide, HA tag peptide, MYC tag peptide, GFP tag peptide, MBP tag peptide, GST tag peptide, HIS tag (His6 tag), HaloTag tag, SNAP tag, ACP tag, CLIP tag, TAP tag , ⁇ -Gal tag or V5 tag.
  • the hybridoma of the present invention is a hybridoma that produces a monoclonal antibody comprising the heavy chain variable region domain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the light chain variable region domain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It is.
  • the affinity constant of the monoclonal antibody of the present invention is not particularly limited, but preferably has an affinity constant of at least 10 5 to 10 9 M ⁇ 1 , and most preferably has an affinity constant of 10 6 or more. is there. Binding affinity can be measured, for example, by the Scatchard assay of Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220 (1980).
  • Polynucleotide, vector, and host cell ⁇ Polynucleotide
  • the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide encoding the monoclonal antibody or antigen-binding fragment of the present invention, or a fusion protein in which they are bound to the protein.
  • the polynucleotide may be a full-length genomic DNA or a polynucleotide consisting only of a translation region, for example, mRNA or cDNA.
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains the polynucleotide of the present invention, and is prepared by incorporating the polynucleotide into an appropriate vector capable of transforming a eukaryotic or prokaryotic host cell. Can do.
  • the vector can contain a sequence necessary for expression of the polynucleotide, such as a promoter and an enhancer, and can further contain a sequence necessary for confirmation of introduction into a host cell, such as a drug resistance gene.
  • any vector such as a plasmid, a phage, or a virus can be used as long as it can replicate in a host cell.
  • Escherichia coli plasmids such as pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pKC30, and pCFM536, Bacillus subtilis plasmids such as pUB110, yeast plasmids such as pG-1, YEp13, and YCp50, and phage DNAs such as ⁇ gt110 and ⁇ ZAPII.
  • vectors for mammalian cells include viral DNA such as baculovirus, vaccinia virus, adenovirus, SV40 and its derivatives.
  • the vector contains a replication origin, a selectable marker, and a promoter, and may contain an enhancer, a transcription termination sequence (terminator), a ribosome binding site, a polyadenylation signal, and the like as necessary.
  • examples of the vector for expressing the scFv include pEGFP and pCDNA3.1.
  • the term “host cell” is not limited as long as the vector is incorporated and a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment, or a fusion protein in which the protein is bound to the same can be expressed. Mention may be made of bacteria, yeast, insect cells or animal cells.
  • the host cell of the phage vector can include M13 phage, fd phage, or T7 phage. Examples of bacterial vector host cells include Escherichia coli, Streptomyces, and Bacillus subtilis.
  • examples of host cells for yeast vectors include baker's yeast and methanol-assimilating yeast. Examples of insect cell vector host cells include Drosophila S2 and Spodoptera Sf9.
  • host cells of animal cell vectors can include CHO, COS, BHK, 3T3, C127, A6, Hela, MC12, or mouse embryonic stem cells.
  • the method for analyzing the trimethylation of 27th lysine of histone H3 of the present invention is a method for specifically analyzing H3K27me3.
  • H3K27me3 can be analyzed under reducing conditions such as In this specification, “analysis” means both “detection” for determining the presence or absence and “quantification (measurement)” for determining the amount.
  • the method for analyzing the trimethylation of the 27th lysine of histone H3 of the present invention comprises the step of contacting the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof with histone H3, and the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof bound to histone H3. Detecting.
  • the monoclonal antibody used in the analysis method of the present invention is the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof described in “[1] Monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof”.
  • Specific analysis methods include, but are not limited to, enzyme immunoassay, immunohistochemical staining, surface plasmon resonance, latex agglutination immunoassay, chemiluminescence immunoassay, fluorescent antibody method, fluorescent localization Examples include a method, radioimmunoassay method, immunoprecipitation method, chromatin immunoprecipitation method, Western blot method, immunochromatography method, magnetic bead agglutination method, or magnetic bead enzyme immunization method.
  • the usual enzyme immunoassay method, immunohistochemical staining method, surface plasmon resonance method, latex agglutination immunoassay method, chemiluminescence immunoassay method, fluorescent antibody Analysis can be performed according to a method, a fluorescence localization method, a radioimmunoassay method, an immunoprecipitation method, a chromatin immunoprecipitation method, a Western blot method, an immunochromatography method, a magnetic bead agglutination method, a magnetic bead enzyme immunoassay, or the like.
  • the contact step (1) in the analysis method of the present invention is a step of bringing the monoclonal antibody into contact with histone H3.
  • histone H3 can be contacted to form a complex of H3K27me3 and a monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody and histone H3 are brought into contact with each other in a living cell
  • a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment for example, scFv
  • scFv an antigen-binding fragment
  • a monoclonal antibody is bound to a carrier and Histone H3 can be brought into contact with the antibody to form a complex of monoclonal antibody or the like and H3K27me3.
  • the carrier microplates or beads can be used for enzyme immunoassay or magnetic bead aggregation.
  • a monoclonal antibody can be adsorbed using a metal as a carrier.
  • the detection step (2) in the analysis method of the present invention is a step of detecting a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof bound to histone H3.
  • a monoclonal antibody or the like is directly labeled with a fluorescent protein or a photoprotein, or when the monoclonal antibody or the like is expressed as a fusion protein with a fluorescent protein or a photoprotein as described above, the fluorescent protein or photoprotein is By detection, a monoclonal antibody or the like bound to histone H3 can be detected.
  • the monoclonal antibody or the like when a monoclonal antibody or the like is labeled or fused with an enzyme (for example, alkaline phosphatase, peroxidase, ⁇ -D-galactosidase, etc.), the monoclonal antibody or the like can be detected using an appropriate substrate.
  • the tag peptide when the tag peptide is fused to a monoclonal antibody or the like, the monoclonal antibody bound to H3K27me3 can be detected by using an antibody against the tag peptide labeled with a fluorescent protein, a luminescent protein, an enzyme, or the like. it can.
  • a complex of H3K27me3 and a monoclonal antibody can be detected by immunoprecipitation of a monoclonal antibody bound to H3K27me3 with an antibody against the tag peptide.
  • a monoclonal antibody bound to H3K27me3 can also be detected by using an antibody against the monoclonal antibody of the present invention labeled with a fluorescent protein, a luminescent protein, an enzyme or the like.
  • the amount of H3K27me3 detected can be quantified by measuring the fluorescence amount of the fluorescent protein, the luminescence amount of the photoprotein, the color development amount of the enzyme substrate, etc., and comparing with the reference amount.
  • the kit for detecting trimethylation of 27th lysine of histone H3 of the present invention is used in the method for measuring trimethylation of 27th lysine of histone H3. It is a kit that can.
  • the kit for immunological analysis of trimethylation of the 27th lysine of histone H3 of the present invention comprises the monoclonal antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof.
  • the kit for immunological analysis of trimethylation of the 27th lysine of histone H3 of the present invention may further contain an antibody that binds to the monoclonal antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof.
  • the kit for immunological analysis of trimethylation of the 27th lysine of histone H3 of the present invention may further comprise a second antibody that reacts with histone H3 or an antigen-binding fragment thereof.
  • the kit for analyzing the trimethylation of the 27th lysine of histone H3 is an immunization method for the analysis of the trimethylation of the 27th lysine of histone H3, which contains the monoclonal antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof. It is a kit for biological analysis. That is, the kit of the present invention can be used in an immunological analysis method for analyzing the trimethylation of the 27th lysine of histone H3 of the present invention.
  • the kit for immunological analysis of the trimethylation of the 27th lysine of histone H3 of the present invention is an enzyme immunoassay method, an immunohistochemical staining method, a surface plasmon resonance method (SPR method: Biacore method), and a latex agglutination immunoassay.
  • Method chemiluminescence immunoassay, fluorescent antibody method, fluorescence localization method, radioimmunoassay method, immunoprecipitation method, chromatin immunoprecipitation method, Western blot method, immunochromatography method, magnetic bead agglutination method, or magnetic bead enzyme immunoassay method Including kits used for etc.
  • the analysis method is an immunological method using a labeled antibody (for example, enzyme immunoassay, chemiluminescence immunoassay, fluorescent antibody method, radioimmunoassay, etc.), the antibody is labeled. It can be included in the form of a labeled antibody or labeled antibody fragment labeled with a substance.
  • a labeled antibody for example, enzyme immunoassay, chemiluminescence immunoassay, fluorescent antibody method, radioimmunoassay, etc.
  • the antibody is labeled. It can be included in the form of a labeled antibody or labeled antibody fragment labeled with a substance.
  • the labeling substance peroxidase as an enzyme, alkaline phosphatase, 3 beta-D-galactosidase, or glucose oxidase, fluorescein isothiocyanate or a rare earth metal chelates as fluorescent substance, a radioactive isotope H, 14 C Or 125 I and the like, and biotin, avidin, chemiluminescent substance, and the like.
  • peroxidase as an enzyme, alkaline phosphatase, 3 beta-D-galactosidase, or glucose oxidase
  • fluorescein isothiocyanate or a rare earth metal chelates as fluorescent substance
  • a radioactive isotope H, 14 C Or 125 I and the like and biotin, avidin, chemiluminescent substance, and the like.
  • an enzyme, a chemiluminescent substance, or the like it is not possible to provide a measurable signal by itself, and therefore it is preferable to select and include
  • Example 1 Acquisition of histone H3 trimethylated lysine specific monoclonal antibody A 20-mer peptide containing histone H3K27 trimethylated lysine (KQLATKAAR (trimethyl K) SAPATGGVKC) was conjugated with KLH according to conventional methods. A 0.2 mg / mL peptide solution was mixed with an equal volume of Freund's adjuvant and 200 ⁇ g was subcutaneously administered to 4-6 week old BALB / c mice. Two weeks later, 200 ⁇ g of booster immunization was performed, and 200 ⁇ g was administered into the tail vein as the final immunization.
  • KQLATKAAR trimethyl K
  • SAPATGGVKC 20-mer peptide containing histone H3K27 trimethylated lysine
  • the spleen was aseptically removed from this mouse, the spleen was loosened into individual cells using scissors and tweezers, and washed three times with GIT medium.
  • the mouse myeloma cell line P3X63Ag8.653 in the logarithmic growth phase was washed 3 times with GIT medium, and the cells and spleen cells were mixed at a cell number ratio of 1:10. After centrifugation at 200 ⁇ g for 5 minutes, remove the supernatant, slowly add 1 mL of 50% polyethylene glycol (PEG) 1500 (Roche) while gently mixing the cell sputum, and then add 9 mL of GIT medium and add cells. Fused.
  • PEG polyethylene glycol
  • the fused cells were removed from the PEG by centrifugation (200 ⁇ g, 5 minutes), suspended in GIT medium containing 10% fetal bovine serum and hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT), and a 96-well cell culture plate. Sowing. After culturing for 7 days and growing only the hybridoma, clones producing the antibody were searched by ELISA to obtain a hybridoma producing a monoclonal antibody having the desired reaction specificity.
  • the screening ELISA was performed as follows.
  • each of BSA (0.5 ⁇ g / mL) conjugated with the peptide used for immunization was dispensed into a 96-well ELISA plate (Costar) and left overnight at 4 ° C.
  • BSA conjugated with 20mer peptide (KQLATKAARKSAPATGGVKC) (SEQ ID NO: 4) not containing histone H3K27 trimethylated lysine was similarly dispensed.
  • PBS phosphate buffered saline
  • PBST 0.05% Tween 20 / PBS
  • HRP horseradish peroxidase
  • Sheep horseradish peroxidase
  • 50 ⁇ L of TMB substrate solution was added to each well and reacted at 25 ° C. for 30 minutes.
  • 50 ⁇ L of a reaction stop solution was added to each well, and the absorbance at 405 nm of each well was measured.
  • the obtained hybridoma was made into a single clone by a limiting dilution method, and an antibody-producing hybridoma was established. Dozens of hybridomas were produced that reacted with peptides containing histone H3K27 trimethylated lysine and produced antibodies that did not react with peptides without histone H3K27 trimethylated lysine. Among them, 5 hybridomas specifically reacting with a peptide containing the most histone H3K27 trimethylated lysine were obtained.
  • the obtained hybridoma was cultured in a serum-free medium (Serum-Free Medium; Thermo Fisher Scientific), and a monoclonal antibody was obtained in the medium.
  • the monoclonal antibody was separated and purified by affinity chromatography using a protein A sepharose column.
  • RNA was prepared from the obtained 5 hybridomas, DNA was prepared, and then the base sequence of cDNA encoding the heavy chain and light chain of the antibody was determined. Primers were designed based on the sequence, and the heavy and light chain variable regions were cloned by PCR. ScFvs were prepared by linking them with a linker sequence. scFv and sfGFP were ligated as shown in FIG. 2 to obtain a pscFv-EGFP vector and expressed in animal cells.
  • 2E12-derived scFv (SEQ ID NO: 5) binds to H3K27me3 in frog A6 cells and mouse MC12 cells in living cells at 30 ° C. or lower (FIG. 3).
  • Example 3 random mutation was introduced into scFv of 2E12 antibody to try to obtain mutants that function in cells. Random mutation was introduced by PCR in the presence of manganese ions to obtain 48 mutants. These mutants were expressed in MC12 cells and examined for localization to an inactive X chromosome at 37 ° C.
  • mutant M86L (SEQ ID NO: 6) in which 86th methionine (M) was replaced by leucine (L) also functioned at 37 ° C. in mouse MC12 cells and bound to H3K27me3.
  • the 86th methionine (M) is the amino acid number in the amino acid sequence of 2E12 scFv described in SEQ ID NO: 5. Therefore, the 86th methionine corresponds to the 81st methionine of the heavy chain variable region domain described in SEQ ID NO: 1 (FIG. 8).
  • Example 4 In this example, a mutant M86L / M158I (SEQ ID NO: 7) was obtained in which the 158th methionine located at a sterically close position of the 86th methionine was replaced with isoleucine. This mutation was performed by introducing a site-specific mutation by PCR using a complementary primer. Mutant M86L / M158I was expressed more stably without aggregation in the cytoplasm (FIG. 5B). The 158th methionine (M) is also the amino acid number in the amino acid sequence of 2E12 scFv described in SEQ ID NO: 5.
  • the 158th methionine corresponds to the 21st methionine of the light chain variable region domain described in SEQ ID NO: 2 (FIG. 9).
  • mutant M86L / M158L and mutant M86L / M158V in which the 158th methionine was replaced with leucine and valine, respectively, were prepared.
  • Mutant M86L / M158I and mutant M86L / M158V were also confirmed to function stably in the cells, but the effect was higher in the order of mutant M86L / M158I> mutant M86L / M158L> mutant M86L / M158V.
  • Example 5 random substitution by PCR was used to introduce an arbitrary substitution into mutant M86L, and it was confirmed that the function of mutant M86L did not decrease.
  • the mutant M86L / Y38C (SEQ ID NO: 8) and the mutant M86L / Y105N (SEQ ID NO: 9) are not reduced in intracellular function as compared to the mutant M86L.
  • the substitution of the 38th tyrosine to cysteine and the substitution of the 105th tyrosine to asparagine did not affect the function of the mutant M86L.
  • the substitution from the 38th tyrosine to cysteine and the substitution from the 105th tyrosine to asparagine are considered to be conservative substitutions that do not affect the function of the monoclonal antibody of the present invention.
  • Example 6 In this example, a mutant M158I (SEQ ID NO: 34) in which the 158th methionine was replaced with isoleucine and a mutant M158L (SEQ ID NO: 35) in which the 158th methionine was replaced with leucine were obtained. These mutations were performed by introducing site-specific mutations by PCR using complementary primers. Mutant M158I and mutant M158L showed no cytoplasmic aggregation and were expressed as stably as mutant M86L.
  • Example 7 the scFv of mutant M86L / M158I was linked to iRFP or mCherry and confirmed to function in cells.
  • scFv and iRFP or mCherry were ligated to obtain an expression vector, which was expressed in mouse MC12 cells.
  • FIG. 11 it was confirmed that even when linked to iRFP or mCherry other than sfGFP, it functions in cells.
  • Example 8 it was confirmed that the intracellular function was improved when a nuclear translocation signal was added to the scFv of the mutant M86L / M158I.
  • a nuclear translocation signal NLS
  • scFv nuclear translocation signal
  • Example 9 when the H3K27 trimethylation level was reduced using an inhibitor of methylase, it was confirmed that the reduction in methylation level could be detected by the scFv of mutant M86L / M158I expressed in the cells.
  • GSK126 was added at a final concentration of 2 ⁇ M to HeLa cells constitutively expressing scFv of mutant M86L / M158I linked with sfGFP, and then observed under a fluorescence microscope for 48 hours while culturing. As shown in FIG. 14, it was confirmed that scFv moved from the nucleus to the cytoplasm as the H3K27 trimethylation level decreased.
  • the analysis method of the monoclonal antibody and the like of the present invention and H3K27me3 can be used for discrimination between male and female. Moreover, since the increase / decrease in the amount of H3K27me3 can be analyzed, it can be used for the evaluation of drug efficacy and the analysis of disease states.

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Abstract

本発明の目的は、細胞内の還元状態でも機能するモノクローナル抗体を提供することである。　前記課題は、本発明の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片によって解決することができる。

Description

ヒストンＨ３トリメチル化リシン特異的モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片
　本発明は、ヒストンＨ３トリメチル化リシン特異的モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片に関する。本発明によれば、ヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンを細胞内で特異的に検出することができる。
　クロマチンの基本単位であるヌクレオソームを構成するヒストンは、ＤＮＡ分子を折り畳んで核内に収納する。ヒストンは、アセチル化、リン酸化、メチル化などの化学修飾を受けることが知られているが、これらの化学修飾は、遺伝子発現などのクロマチン機能の制御に関わっていると考えられている。
　例えば、ヒストンの１つであるＨ３の４番、９番、２７番、３６番、及び７９番のリシンはメチル化修飾されることが明らかになっている。これらのリシンメチル化のうちＨ３の２７番目のリシンのトリメチル化（以下、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３と称することがある）は、遺伝子発現の抑制やＸ染色体の不活性化に関与すると考えられている。哺乳類では性染色体として、オスがＸＹ染色体を、メスがＸＸ染色体を持っているが、メスの二本のＸ染色体のうち一本のＸ染色体が発生の段階でランダムに選択されて、高度に凝集するとともに不活性化を受ける。不活性化されたＸ染色体はその後の細胞周期を通じて凝集したままの状態を維持しており、構造的ヘテロクロマチンと非常によく似た構造を持つと考えられている。このＸ染色体の不活性化の最初の段階でヒストンＨ３の２７番目のリシンのメチル化が起きることが分かっており、Ｘ染色体の不活性化に関与すると考えられている。
　また、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３は、Ｅｚｈ２と呼ばれるメチル化酵素によってメチル化されることが知られている。このＥｚｈ２は、転移性の前立腺がんにおいて過剰発現していることが報告されており（非特許文献１）、ヒストンＨ３の２７番目のリシンのメチル化と、がんの進行状態との関係も検討されている。
「ネイチャー（Nature）」（英国）２００２年、第４１９巻、ｐ６２４－６２９
　前記Ｈ３の２７番目のリシンのトリメチル化を検出するためには、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３特異的モノクローナル抗体を用いることが有効である。本発明者らは、生きている細胞内でＨ３Ｋ２７ｍｅ３を、モノクローナル抗体を用いて検出することを試みたが、ほとんどの抗体がＨ３Ｋ２７ｍｅ３を検出できなかった。生きている細胞内は還元状態となっているために、モノクローナル抗体のシステイン残基のジスルフィド結合（ＳＳ結合）が乖離し、モノクローナル抗体の構造が維持できず、モノクローナル抗体として機能できないものであると本発明者らは考えた。
　従って、本発明の目的は、細胞内の還元状態でも機能するモノクローナル抗体を提供することである。
　本発明者は、細胞内の還元状態でも機能するモノクローナル抗体について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、特定のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び特定のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを有するモノクローナル抗体を用いることにより、細胞内の還元状態でもモノクローナル抗体が機能し、Ｈ３の２７番目のリシンのトリメチル化を検出できることを見出した。
　本発明は、こうした知見に基づくものである。
　従って、本発明は、
［１］（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列における８１番のアミノ酸がメチオニンからロイシンに置換された重鎖可変領域ドメイン、及び／又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における２１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、又はバリンに置換された軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含み、且つヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内で結合できるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、又は（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列における８１番のアミノ酸がメチオニンからロイシンに置換されたアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列における２１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、又はバリンに置換されたアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含み、且つヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内で結合できるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、
［２］前記抗原結合性断片がｓｃＦｖである、［１］に記載の抗原結合性断片、
［３］タンパク質が結合した［１］又は［２］に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性断片、
［４］前記タンパク質が、蛍光タンパク質、発光タンパク質、又はタグペプチドである［１］～［３］のいずれかに記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性断片、
［５］［１］～［４］のいずれかに記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド、
［６］［５］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
［７］［６］に記載のベクターで形質転換された宿主細胞、
［８］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
［９］［１］～［４］のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、ヒストンＨ３と接触させる工程、及びヒストンＨ３に結合したモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を検出する工程、を含むヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析方法、及び
［１０］［１］～［４］のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、ヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析キット、
に関する。
　本発明のモノクローナル抗体は、細胞内の還元状態において、安定な構造を維持することができる。従って、細胞内でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合できるモノクローナル抗体として効果的に使用することができる。
ヒストンＨ３のアミノ末端側のテールドメインの翻訳後修飾を示した図である。 本発明のｓｃＦｖとｓｆＧＦＰを連結したｐｓｃＦｖ－ＥＧＦＰベクターを示した模式図である。 ２Ｅ１２のｓｃＦｖが、カエルＡ６細胞（Ｂ）及びマウスＭＣ１２細胞中（Ｃ）において、２６℃及び３０℃でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合することを示した写真である。 モノクローナル抗体２Ｅ１２の野生型のｓｃＦｖのアミノ酸配列、及び変異体Ｍ８６ＬのｓｃＦｖのアミノ酸配列を示した図である。 変異体Ｍ８６Ｌ（Ａ）及び変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｉ（Ｂ）がマウスＭＣ１２細胞中において、３７℃でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合することを示した写真である。 変異体Ｍ８６ＬのｓｃＦｖのアミノ酸配列、変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ３８ＣのｓｃＦｖのアミノ酸配列、及び変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ１０５ＮのｓｃＦｖのアミノ酸配列を示した図である。 変異体Ｍ８６Ｌ（Ａ）、変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ３８Ｃ（Ｂ）、及び変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ１０５Ｎ（Ｃ）が、マウスＭＣ１２細胞中において、３７℃でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合することを示した写真である。 モノクローナル抗体２Ｅ１２の重鎖可変領域ドメインのアミノ酸配列を示した図である。 モノクローナル抗体２Ｅ１２の軽鎖可変領域ドメインのアミノ酸配列を示した図である。 ｉＲＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙと結合した変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｉのベクターの構成を示した図である。 ｉＲＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙと結合した変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８ＩをマウスＭＣ１２細胞に発現させて、細胞内でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合に結合することを確認した写真である。 核移行シグナルを有する変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｉのベクターの構成を示した図である。 核移行シグナルを有する変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｉが核内に集積していることを示す写真である。 Ｈ３Ｋ２７トリメチル化を低下させるＧＳＫ１２６を作用させた細胞において、変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｉを用いて、Ｈ３Ｋ２７トリメチルを検出した写真である。
［１］モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片
　本発明のモノクローナル抗体は、ヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内で結合できるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である（以下、本明細書において「モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片」を纏めて「モノクローナル抗体」と称することがある）。具体的には、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含むか、（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列における８１番のアミノ酸がメチオニンからロイシンに置換された重鎖可変領域ドメイン、及び／又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における２１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、又はバリンに置換された軽鎖可変領域ドメインを含むか、（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含み、且つヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内で結合できるか、又は（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列における８１番のアミノ酸がメチオニンからロイシンに置換されたアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列における２１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、又はバリンに置換されたアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含み、且つヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内で結合できる、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である。
（ヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシン）
　ヒストンは、ＤＮＡを折り畳んで、核内に収容する役割を有するタンパク質である。ヒストン及びＤＮＡにより、クロマチン（染色体）の基本的構成単位であるヌクレオソームが形成される。ヌクレオソームは、４種のコアヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４）から構成されるコアヒストン８量体に１４６ｂｐの２重鎖ＤＮＡが巻き付いた構造を有している。クロマチンにおいて２つのヌクレオソームは、リンカーＤＮＡにより結合しており、そしてリンカーＤＮＡにリンカーヒストン（例えば、ヒストンＨ１）が結合している。
　４種のコアヒストンは、カルボキシル末端側のフォールドドメインとアミノ末端側のテールドメインを有し、テールドメインの翻訳後修飾が遺伝子発現制御に重要な働きをしていると考えられている。例えば、前記ヒストンＨ３の２７番目のリシン残基は、ヒストンメチル化酵素（ヒトのＥｚｈ２）によりメチル化される。このＨ３の２７番目のリシンは、モノメチル化、ジメチル化、及びトリメチル化されるが、特にトリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）が、発生段階におけるメスの二本のＸ染色体のうちの１本のＸ染色体の不活化を始めとした転写の抑制に強く相関していると考えられている。
（エピトープ）
　本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープは、ヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンを含む周辺のアミノ酸を含む連続エピトープである。マウスの免疫に用いたペプチドのアミノ酸配列は、KQLATKAAR(トリメチルK)SAPATGGVKC（配列番号３）であり、トリメチルリシン及びその周辺の複数個のアミノ酸をエピトープとして認識している。
（可変領域ドメイン及び定常領域ドメイン）
　本発明のモノクローナル抗体は、前記Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に結合する。本発明のモノクローナル抗体は、少なくとも可変領域ドメインを含む。
　可変領域ドメインの重鎖はアミノ末端から、可変領域のポリペプチド（以下、重鎖可変領域ドメイン（ＶＨ）と称する）及び定常領域の３つのドメインのポリペプチド、すなわち重鎖定常領域ドメイン１（ＣＨ１）、重鎖定常領域ドメイン２（ＣＨ２）、及び重鎖定常領域ドメイン３（ＣＨ３）をその順番に有している。前記重鎖可変領域ドメインには、３つの相補性決定領域、すなわち、重鎖相補性決定領域１（以下、Ｈ－ＣＤＲ１と称することがある）、重鎖相補性決定領域２（以下、Ｈ－ＣＤＲ２と称することがある）、及び重鎖相補性決定領域３（以下、Ｈ－ＣＤＲ３と称することがある）を含み、それら３つの相補性決定領域は、重鎖可変領域フレームワークに囲まれている。重鎖可変領域フレームワークは、具体的には４つのフレームワーク領域のポリペプチド、すなわちアミノ末端から、Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３、及びＨ－ＦＲ４からなっている。従って、重鎖可変領域ドメインは、Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＦＲ３、Ｈ－ＣＤＲ３、及びＨ－ＦＲ４をその順番に含んでいる。
　一方、可変領域ドメインの軽鎖はアミノ末端から、可変領域のポリペプチド（以下、軽鎖可変領域ドメイン（ＶＬ）と称する）及び定常領域のポリペプチド（以下、軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）と称する）をその順番に有している。前記軽鎖可変領域ドメインには、３つの相補性決定領域、すなわち、軽鎖相補性決定領域１（以下、Ｌ－ＣＤＲ１と称することがある）、軽鎖相補性決定領域２（以下、Ｌ－ＣＤＲ２と称することがある）、及び軽鎖相補性決定領域３（以下、Ｌ－ＣＤＲ３と称することがある）を含み、それら３つの相補性決定領域は、軽鎖可変領域フレームワークに囲まれている。軽鎖可変領域フレームワークは、具体的には４つのフレームワーク領域のポリペプチド、すなわちアミノ末端から、Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３、及びＬ－ＦＲ４からなっている。従って、軽鎖可変領域ドメインは、Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＦＲ３、Ｌ－ＣＤＲ３、及びＬ－ＦＲ４のそれぞれのポリペプチドをその順番に含んでいる。
　なお、重鎖及び軽鎖の可変領域のポリペプチドにおける各ドメインを構成するアミノ酸配列からなるポリペプチドの割当は、Kabat（1991）、及び／又はChothia及びLesk、J.Mol.Biol. 196: 901-917（1987）；Chothiaら、Nature 342: 878-883（1989）の規定に従うものとする。
（２Ｅ１２の可変領域ドメイン）
　本発明のモノクローナル抗体の１つの態様である２Ｅ１２の重鎖可変領域ドメインのアミノ酸配列を図８に示す。２Ｅ１２の重鎖可変領域ドメインは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１番～３０番のアミノ酸からなる重鎖可変領域フレームワーク１のポリペプチド（QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGFTFT）（配列番号２０）、３１番～３５番のアミノ酸からなる重鎖相補性決定領域１のポリペプチド（SYYMY）（配列番号２１）、３６番～４９番のアミノ酸からなる重鎖可変領域フレームワーク２のポリペプチド（WVKQRPGQGLEWIG）（配列番号２２）、５０番～６６番のアミノ酸からなる重鎖相補性決定領域２のポリペプチド（EINPSNGGTYFNEKFKN）（配列番号２３）、６７番～９８番のアミノ酸からなる重鎖可変領域フレームワーク３のポリペプチド（KATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCAA）（配列番号２４）、９９番～１０６番のアミノ酸からなる重鎖相補性決定領域３のポリペプチド（YYGNLFDY）（配列番号２５）及び１０７番～１１７番のアミノ酸からなる重鎖可変領域フレームワーク４のポリペプチド（WGQGTTLTVSS）（配列番号２６）を含む重鎖可変領域ドメインである。
　本発明のモノクローナル抗体の１つの態様である２Ｅ１２の軽鎖可変領域ドメインのアミノ酸配列を図９に示す。２Ｅ１２の軽鎖可変領域ドメインは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１番～２３番のアミノ酸からなる軽鎖可変領域フレームワーク１のポリペプチド（DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMAC）（配列番号２７）、２４番～４０番のアミノ酸からなる軽鎖相補性決定領域１のポリペプチド（KSSQSLLYSSNQKNYLA）（配列番号２８）、４１番～５５番のアミノ酸からなる軽鎖可変領域フレームワーク２のポリペプチド（WYQQKPGQSPKLLIY）（配列番号２９）、５６番～６２番のアミノ酸からなる軽鎖相補性決定領域２のポリペプチド（WASTRES）（配列番号３０）、６３番～９４番のアミノ酸からなる軽鎖可変領域フレームワーク３のポリペプチド（GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYC）（配列番号３１）、９５番～１０２番のアミノ酸からなる軽鎖相補性決定領域３のポリペプチド（QQYYTYPW）（配列番号３２）、及び１０３番～１１６番のアミノ酸からなる軽鎖可変領域フレームワーク４のポリペプチド（TFGGGTKLEIKRAD）（配列番号３３）を含む軽鎖可変領域ドメインである。
　本発明のモノクローナル抗体において、重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインは、モノクローナル抗体の構造を維持できる限りにおいて、それぞれの可変領域ドメインのＮ末及び／又はＣ末のアミノ酸を欠失してもよい。欠失してもよいアミノ酸の個数は、限定されるものではないが、例えば１０個以内であり、好ましくは８個以内であり、より好ましくは６個以内であり、更に好ましくは４個以内である。
（２Ｅ１２の変異体）
　本発明のモノクローナル抗体の好ましい実施態様は、モノクローナル抗体２Ｅ１２の変異体である。２Ｅ１２変異体としては、配列番号１で表される２Ｅ１２の重鎖可変領域ドメインの（図８）アミノ酸配列における８１番のアミノ酸が、メチオニンからロイシン、に置換された重鎖可変領域ドメインを含むモノクローナル抗体を挙げることができる。また、配列番号２で表される２Ｅ１２の軽鎖可変領域ドメイン（図９）のアミノ酸配列における２１番のアミノ酸が、メチオニンからロイシン、イソロイシン、又はバリンに置換された軽鎖可変領域ドメインを含むモノクローナル抗体を挙げることができ、好ましくはメチオニンからロイシン、又はイソロイシンに置換された軽鎖可変領域ドメインを含むモノクローナル抗体である。本発明のモノクローナル抗体においては、重鎖可変領域ドメインの８１番のアミノ酸の変異のみを有しているものでもよく、軽鎖可変領域ドメインの２１番目のアミノ酸の変異のみを有しているものでもよく、２つの変異を有しているものでもよい。
　本発明のモノクローナル抗体は、前記重鎖可変領域ドメインの８１番のアミノ酸の変異、及び／又は軽鎖可変領域ドメインの２１番目のアミノ酸の変異を有することにより、細胞内の還元状態において、更に安定な構造を維持することができる。すなわち、重鎖可変領域ドメインの８１番のアミノ酸の変異、及び軽鎖可変領域ドメインの２１番目のアミノ酸の変異は、本発明のモノクローナル抗体の優れた効果を得るための積極的な置換である。
　また、前記ロイシンは、メチオニンよりも疎水性のアミノ酸であり、メチオニンからロイシンに置換することにより、本発明のモノクローナル抗体の細胞内における構造を安定させることができると考えられる。
（保存的置換）
　本発明のモノクローナル抗体は、前記モノクローナル抗体２Ｅ１２又はモノクローナル抗体２Ｅ１２の変異体のアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含むモノクローナル抗体でもよい。
　本明細書において、「アミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸」とは、アミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味するが、これらの改変は本発明のモノクローナル抗体の優れた効果を維持した挿入、置換、欠失、又は付加（以下、保存的置換と称することがある）である。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～５個、最も好ましくは１～２個である。本発明に用いることのできる変異ペプチドの改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は数個（好ましくは、１、２、３又は４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
　本明細書において「保存的置換」とは、本発明のモノクローナル抗体の優れた効果が失われない置換を意味する。すなわち、前記挿入、置換、又は欠失、若しくは付加された場合であっても、細胞内の還元状態においてヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに結合できることを意味する。
　「保存的置換」の具体的な態様としては、限定されるものではないが、１若しくは数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを挙げることができる。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。正電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　具体的には、実施例５において、変異体Ｍ８６Ｌにおいて、３８番目のチロシンをシステインに置換した変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ３８Ｃ、及び１０５番目のチロシンからアスパラギンに置換した変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ１０５Ｎを得たが、これらの変異体は、変異体Ｍ８６Ｌと同じように細胞内でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合することが可能であった。すなわち、Ｙ３８Ｃ及びＹ１０５Ｎの置換は、本発明のモノクローナル抗体の機能を阻害しない保存的置換である。
　保存的置換を有する本発明のモノクローナル抗体は、ヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内（例えば、マウスＭＣ１２細胞）で結合できるモノクローナル抗体である。細胞内は還元条件下であるが、本発明のモノクローナル抗体は、還元条件下において安定な構造を維持することができ、従って、細胞内でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合することができる。
（抗原結合性断片）
　本発明の抗原結合性断片は、前記ヒストンＨ３トリメチル化リシン特異的モノクローナル抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、又は単一鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）を挙げることができる。更に、抗原結合性断片として、ディアボディー、又は前記抗体断片から形成されたマルチ特異性抗体を用いることもできる。これらの抗原結合性断片は、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することにより、得ることができるか、又は遺伝子組換えにより調製することができる。
（ｓｃＦｖ）
　本発明の抗原結合性断片の１つの態様であるｓｃＦｖ（single-chain variable fragment）は、重鎖可変領域ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変領域ドメイン（ＶＬ）とをリンカーで連結することにより得られる単鎖ポリペプチド抗体である。ＶＨとＶＬとを連結する順序は、特に限定されておらず、任意の順序で配置することができる。すなわち、［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］の順序で配置されてもよく、又は［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］の順序で配置されてもよい。
　リンカーは、二つの可変領域ドメインが実質的な干渉なしに架橋されるような長さのものであれば限定されない。例えば、約３～２５残基（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８残基）を含む任意のいかなる単鎖ペプチドも、リンカーとして使用することができるが、グリシンとセリンを含むリンカーが好ましい。具体的なペプチドリンカーとしては、Ser; Gly Ser; Gly Gly Ser; Ser Gly Gly; Gly Gly Gly Ser (配列番号１０); Ser Gly Gly Gly (配列番号１１); Gly Gly Gly Gly Ser (配列番号１２); Ser Gly Gly Gly Gly (配列番号１３); Gly Gly Gly Gly Gly Ser (配列番号１４); Ser Gly Gly Gly Gly Gly (配列番号１５); Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser (配列番号１６); Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly (配列番号１７); (Gly Gly Gly Gly Ser (配列番号１８)n［配列中、ｎは、１または複数の整数である］；および（Ser Gly Gly Gly Gly（配列番号１９）ｎ［配列中、ｎは、１または複数の整数である］を挙げることができる。また、リンカーは、溶解性を高めるためにいくつかのGluまたはLys残基を含んでもよい。
　本発明の抗原結合性断片は、前記ｓｃＦｖを２つ組み合わせたｓｃ（Ｆｖ）２を含む。ｓｃ（Ｆｖ）２とは、２つのＶＨと２つのＶＬとをリンカーにより連結して、単鎖を形成する抗原結合性断片である。具体的には２つのｓｃＦｖをリンカーにより、結合させることにより、得ることができる。リンカーとしては、ＶＨ及びＶＬを結合させるリンカーを用いることができる。
　本発明のモノクローナル抗体又は抗原結合性断片は、タンパク質が結合（融合）したものでもよい。結合させるタンパク質としては、抗体の活性に著しい影響を与えるものでないかぎりにおいて、特に限定されるものではないが、蛍光タンパク質、発光タンパク質、又はタグペプチドを挙げることができる。前記タンパク質が結合していることにより、モノクローナル抗体が結合する抗原の検出を容易にすることができる。また、モノクローナル抗体の精製を容易にすることができる。
　蛍光タンパク質、及び発光タンパク質としては、限定されるものではないが、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＳＢＰ２、ＥＢＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＴａｇＢＦＰ、ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＰ１、ＭｉＣｙ（Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ　Ｃｙａｎ）、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＣＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＡＧ（Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ）、ｍＡＧ１、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ（Ｅｍｅｒａｌｄ）、ＥＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＧＰ２、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ＥＹＦＰ、ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ－ｍ、ｔｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＫＯ１、ＫＯ（Ｋｕｓａｂｉｒａ　Ｏｒａｎｇｅ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＫＯ２、Ｋｅｉｍａ５７０、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＡｐｐｌｅ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＫｅｉｍａＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ２、ＴａｇＦＰ６３５、ｍＰｌｕｍ、ｅｇＦＰ６５０、Ｎｅｐｔｕｎｅ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ｉＲＦＰ、ｅｇＦＰ６７０及びルシフェラーゼを挙げることができる。
　タグペプチドとしては、ＦＬＡＧタグペプチド、ＨＡタグペプチド、ＭＹＣタグペプチド、ＧＦＰタグペプチド、ＭＢＰタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＨＩＳタグ（Ｈｉｓ６タグ）、ＨａｌｏＴａｇタグ、ＳＮＡＰタグ、ＡＣＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＴＡＰタグ、β-Galタグ又はＶ５タグを挙げることができる。
《ハイブリドーマ》
　本発明のハイブリドーマは、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。
（親和定数）
　本発明のモノクローナル抗体の親和定数は、特に限定されるものではないが、少なくとも１０５～１０９Ｍ－１の親和定数を有するものが好ましく、最も好ましくは１０６以上の親和定数を有するものである。結合親和性は、例えばMunson et al., Anal. Biochem. 107: 220（1980）のスキャッチャード（Scatchard）アッセイにより測定することができる。
［２］ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
《ポリヌクレオチド》
　本発明のポリヌクレオチドは、本発明のモノクローナル抗体又は抗原結合性断片、若しくはそれらと前記タンパク質の結合した融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。なお、前記ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ全長であっても、翻訳領域のみからなるポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡやｃＤＮＡであってもよい。
《ベクター》
　本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換できる適当なベクターに当該ポリヌクレオチドを組み込むことにより調製することができる。前記ベクターは、当該ポリヌクレオチドの発現に必要な配列、例えば、プロモーター、エンハンサーを含むことができ、更に、宿主細胞への導入確認に必要な配列、例えば、薬剤耐性遺伝子を含むことができる。
　前記ベクターとしては、宿主細胞において複製可能である限り、プラスミド、ファージ、ウイルス等のいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ－１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
　例えば、前記ｓｃＦｖを発現させるベクターとしては、ｐＥＧＦＰ、又はｐＣＤＮＡ３．１を挙げることができる。
《宿主細胞》
　本明細書において「宿主細胞」とは、前記ベクターが組込まれ、モノクローナル抗体又は抗原結合性断片、若しくはそれらと前記タンパク質の結合した融合タンパク質を発現できる限りにおいて、限定されるものでなく、ファージ、細菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞を挙げることができる。例えば、ファージベクターの宿主細胞としては、Ｍ１３ファージ、ｆｄファージ、又はＴ７ファージを挙げることができる。
　また、細菌のベクターの宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、又は枯草菌を挙げることができる。更に、酵母ベクターの宿主細胞としては、パン酵母、又はメタノール資化性酵母を挙げることができる。昆虫細胞ベクターの宿主細胞としては、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９を挙げることができる。更に、動物細胞ベクターの宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７、Ａ６、Ｈｅｌａ、ＭＣ１２、又はマウス胚性幹細胞を挙げることができる。
［３］ヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析方法
　本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析方法は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３を特異的に分析する方法であるが、特には細胞内などの還元条件下でＨ３Ｋ２７ｍｅ３を分析できる方法である。本明細書において、「分析」とは、存在の有無を判定する「検出」、及び量を判定する「定量（測定）」の両方を意味する。
　本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析方法は、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、ヒストンＨ３と接触させる工程、及びヒストンＨ３に結合したモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を検出する工程を含む。本発明の分析方法に用いるモノクローナル抗体は、前記「［１］モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片」に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である。
　具体的な分析方法としては、限定されるものではないが、酵素免疫測定法、免疫組織染色法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、蛍光局在法、放射免疫測定法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、磁気ビーズ凝集法、又は磁気ビーズ酵素免疫法を挙げることができる。本発明の分析方法においては、前記モノクローナル抗体を用いることを除いては、通常の酵素免疫測定法、免疫組織染色法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、蛍光局在法、放射免疫測定法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、磁気ビーズ凝集法、又は磁気ビーズ酵素免疫法等に従って、分析することができる。
《接触工程（１）》
　本発明の分析方法における接触工程（１）は、前記モノクローナル抗体と、ヒストンＨ３とを接触させる工程である。例えば、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、蛍光局在法、放射免疫測定法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、酵素免疫測定法、又は免疫組織染色法などでは、生細胞内でモノクローナル抗体とヒストンＨ３とを接触させて、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３及びモノクローナル抗体の複合体を形成させることもできる。また、生細胞内でモノクローナル抗体とヒストンＨ３とを接触させる場合、細胞にモノクローナル抗体又は抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦｖ）を導入し、細胞内でそれらを発現させることにより、モノクローナル抗体等とＨ３Ｋ２７ｍｅ３との複合体を形成させることもできる。
　また、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、磁気ビーズ凝集法、又は磁気ビーズ酵素免疫法などにおいては、担体にモノクローナル抗体を結合させて、そのモノクローナル抗体にヒストンＨ３を接触させ、モノクローナル抗体等とＨ３Ｋ２７ｍｅ３との複合体を形成させることもできる。担体としては、酵素免疫測定法又は磁気ビーズ凝集法などでは、マイクロプレート又はビーズなどを用いることができる。表面プラズモン共鳴法では、金属を担体として、モノクローナル抗体を吸着させることができる。
《検出工程（２）》
　本発明の分析方法における検出工程（２）は、ヒストンＨ３に結合したモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を検出する工程である。例えば、モノクローナル抗体等を直接、蛍光タンパク質又は発光タンパク質等で標識したり、又は前記のようにモノクローナル抗体等を蛍光タンパク質又は発光タンパク質との融合タンパク質として発現させた場合は、蛍光タンパク質又は発光タンパク質を検出することにより、ヒストンＨ３に結合したモノクローナル抗体等を検出することができる。また、モノクローナル抗体等を酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ等）などで標識又は融合した場合は、適当な基質を用いてモノクローナル抗体等を検出することができる。
　また、モノクローナル抗体等に前記タグペプチドを融合させた場合は、蛍光タンパク質、発光タンパク質、酵素などで標識された、タグペプチドに対する抗体などを用いることによって、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に結合したモノクローナル抗体を検出することができる。例えば、免疫沈降法においては、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に結合したモノクローナル抗体をタグペプチドに対する抗体で免疫沈降することによって、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３とモノクローナル抗体との複合体を検出することができる。
　また、蛍光タンパク質、発光タンパク質、酵素などで標識された、本発明のモノクローナル抗体に対しる抗体を用いることによっても、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に結合したモノクローナル抗体を検出することができる。
　検出されるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の量は、蛍光タンパク質の蛍光量、発光タンパク質の発光量、酵素の基質の発色量などを測定し、基準量と比較することによって、定量することが可能である
［４］ヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析キット
　本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の検出キットは、前記ヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の測定方法に用いることのできるキットである。
　本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の免疫学的分析用キットは、本発明のモノクローナル抗体又はその又はその抗原結合性断片を含む。
　本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の免疫学的分析用キットは、更に、本発明のモノクローナル抗体又はその又はその抗原結合性断片に結合する抗体等を含んでもよい。また、本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の免疫学的分析用キットは、更に、ヒストンＨ３と反応する第２の抗体又はその抗原結合性断片を含んでもよい。
　本実施形態のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析キットは、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体の抗原結合性断片を含む、ヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析方法の免疫学的分析用キットである。すなわち、本発明のキットは、本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析方法の免疫学的分析方法に用いることができる。従って、本発明のヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の免疫学的分析用キットは、酵素免疫測定法、免疫組織染色法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法：Ｂｉａｃｏｒｅ法）、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、蛍光局在法、放射免疫測定法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、磁気ビーズ凝集法、又は磁気ビーズ酵素免疫法等に用いるキットを含む。
　また、前記分析方法が、標識化抗体を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法など）の場合には、抗体は、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないため、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：ヒストンＨ３トリメチル化リシン特異的モノクローナル抗体の取得》
　ヒストンＨ３Ｋ２７トリメチル化リシンを含む２０ｍｅｒのペプチド（ＫＱＬＡＴＫＡＡＲ(トリメチルＫ)ＳＡＰＡＴＧＧＶＫＣ）を、常法に従って、ＫＬＨとコンジュゲートさせた。０．２ｍｇ／ｍＬのペプチド溶液を、等量のフロイントアジュバントと混和し、４～６週令のＢＡＬＢ／ｃマウスに２００μｇ皮下投与した。２週間後に２００μｇの追加免疫を行い、更に２００μｇを最終免疫として尾静脈内に投与した。
　最終免疫後３日目に、このマウスより脾臓を無菌的に摘出し、ハサミ及びピンセットを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、ＧＩＴ培地で３回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３をＧＩＴ培地で３回洗浄後、該細胞と脾臓細胞を１：１０の細胞数比で混合した。２００×ｇ、５分間遠心分離後、上清を除去し、細胞隗を緩やかに混合しながら５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００（ロッシュ社）１ｍＬをゆっくりと加え、更にＧＩＴ培地９ｍＬを加えて細胞融合させた。
　融合細胞は、遠心分離（２００×ｇ、５分間）によってＰＥＧを除いた後、１０％ウシ胎児血清及びヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ）を含むＧＩＴ培地に懸濁し、９６ウェル細胞培養プレートに播種した。７日間培養してハイブリドーマのみを増殖させた後、抗体を産生するクローンをＥＬＩＳＡ法により検索し、目的の反応特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。
　スクリーニングのＥＬＩＳＡは、以下のように行った。
　９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート（Ｃｏｓｔａｒ社）に、免疫に用いたペプチドとコンジュゲートしたＢＳＡ（０．５μｇ／ｍＬ）を各々５０μＬずつ分注し、４℃で一夜放置した。コントロールとして、ヒストンＨ３Ｋ２７トリメチル化リシンを含まない２０ｍｅｒのペプチド（ＫＱＬＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＣ）（配列番号４）をコンジュゲートしたＢＳＡを同様に分注した。次に、これらのプレートの各ウェルを１．６％ブロックエースを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３０分ブロッキングした。このブロッキング液を除去した後、ハイブリドーマの培養上清５０μＬをウェルに添加した。室温で６０分放置した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと称する）で３回洗浄した。続いて、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ヒツジ；ジャクソン社）１００μＬを加え、室温で１時間放置した後、再び、ＰＢＳＴで４回洗浄した。ＴＭＢ基質溶液５０μＬを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させ、反応停止液５０μＬを各ウェルに加え、各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
　得られたハイブリドーマについて、限界希釈法により単一クローンとし、抗体産生ハイブリドーマを樹立した。ヒストンＨ３Ｋ２７トリメチル化リシンを含むペプチドに反応し、ヒストンＨ３Ｋ２７トリメチル化リシンを含まないペプチドに反応しない抗体を産生するハイブリドーマを数十個得た。そのなかで、最もヒストンＨ３Ｋ２７トリメチル化リシンを含むペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを５個得た。
　得られたハイブリドーマを、無血清培地（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で培養し、培地中にモノクローナル抗体を取得した。前記モノクローナル抗体は、プロテインＡセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより分離精製した。
《実施例２》
　本実施例では、得られた５個のハイブリドーマからＲＮＡを調製し、ＤＮＡを作製した後に、抗体の重鎖と軽鎖をコードするｃＤＮＡの塩基配列を決定した。その配列を元にプライマーを設計し、ＰＣＲにより、重鎖と軽鎖の可変領域をクローニングした。それらをリンカー配列で連結することでｓｃＦｖを作製した。ｓｃＦｖとｓｆＧＦＰを図２に示すように連結して、ｐｓｃＦｖ－ＥＧＦＰベクターを取得し、動物細胞に発現させた。
　作製したｓｃＦｖのうち、２Ｅ１２由来のｓｃＦｖ（配列番号５）は生きた細胞内において、カエルＡ６細胞及びマウスＭＣ１２細胞中において、３０℃以下でＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合することを確認した（図３）。
《実施例３》
　本実施例では、２Ｅ１２抗体のｓｃＦｖにランダムミューテーションを導入し、細胞内で機能する変異体の取得を試みた。ランダムミューテーションは、マンガンイオン存在下でのＰＣＲにより導入し、４８個の変異体を得た。それらの変異体をＭＣ１２細胞で発現させ、３７℃で不活性Ｘ染色体へ局在を検討した。
　４８個の変異体のうち、８６番目のメチオニン（Ｍ）がロイシン（Ｌ）に置換された変異体Ｍ８６Ｌ（配列番号６）が、マウスＭＣ１２細胞内で３７℃においても機能し、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に結合した（図５Ａ）。なお、前記８６番目のメチオニン（Ｍ）は、配列番号５に記載の２Ｅ１２のｓｃＦｖのアミノ酸配列におけるアミノ酸番号である。従って、８６番目のメチオニンは、配列番号１（図８）に記載の重鎖可変領域ドメインの８１番目のメチオニンに相当する。
《実施例４》
　本実施例では、更に８６番目のメチオニン立体的に近い位置にある１５８番目のメチオニンをイソロイシンに置換する変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｉ（配列番号７）を取得した。この変異は、相補的プライマーを用いたＰＣＲによる部位特異的変異の導入により行った。変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｉは、細胞質での凝集が見られず、更に安定に発現した（図５Ｂ）。なお、前記１５８番目のメチオニン（Ｍ）も、配列番号５に記載の２Ｅ１２のｓｃＦｖのアミノ酸配列におけるアミノ酸番号である。従って、１５８番目のメチオニンは、配列番号２（図９）に記載の軽鎖可変領域ドメインの２１番目のメチオニンに相当する。
　また、１５８番目のメチオニンを、それぞれロイシン及びバリンに置換した変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｌ、及び変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｖを作製した。変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｉ及び変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｖも細胞内で安定に機能することを確認したが、変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｉ＞変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｌ＞変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８Ｖの順番で効果が高かった。
《実施例５》
　本実施例では、ＰＣＲによるランダム変異法を用いて、変異体Ｍ８６Ｌに任意の置換を導入し、変異体Ｍ８６Ｌの機能が低下しないことを確認した。
　図７に示すように、変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ３８Ｃ（配列番号８）及び変異体Ｍ８６Ｌ／Ｙ１０５Ｎ（配列番号９）は、変異体Ｍ８６Ｌと比較して、細胞内での機能が低下せず、変異体Ｍ８６Ｌと同様にＨ３Ｋ２７ｍｅ３に結合することができた。すなわち、３８番目のチロシンからシステインへの置換、及び１０５番目のチロシンからアスパラギンへの置換は、変異体Ｍ８６Ｌの機能に影響を与えなかった。換言すると、３８番目のチロシンからシステインへの置換、及び１０５番目のチロシンからアスパラギンへの置換は、本発明のモノクローナル抗体の機能に影響を与えない保存的置換であると考えられる。
《実施例６》
　本実施例では、１５８番目のメチオニンをイソロイシンに置換する変異体Ｍ１５８Ｉ（配列番号３４）及び１５８番目のメチオニンをロイシンに置換する変異体Ｍ１５８Ｌ（配列番号３５）を取得した。これらの変異は、相補的プライマーを用いたＰＣＲによる部位特異的変異の導入により行った。変異体Ｍ１５８Ｉ及び変異体Ｍ１５８Ｌは、細胞質での凝集が見られず、変異体Ｍ８６Ｌと同程度に安定に発現した。
《実施例７》
　本実施例では、変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８ＩのｓｃＦｖをｉＲＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙと連結し、細胞内で機能することを確認した。図１０に示すように、ｓｃＦｖとｉＲＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙを連結して発現ベクターを取得し、マウスＭＣ１２細胞に発現させた。図１１に示すように、ｓｆＧＦＰ以外のｉＲＦＰやｍＣｈｅｒｒｙと連結した場合も、細胞内で機能することを確認した。
《実施例８》
　本実施例では、変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８ＩのｓｃＦｖに核移行シグナルを付加した場合に細胞内機能が向上することを確認した。図１２に示すように、バクテリオファージＳＶ４０由来の核移行シグナル（ＮＬＳ）を、ｓｃＦｖとｓｆＧＦＰの間に挿入した発現ベクターを取得し、動物細胞に発現させた。図１３に示すように、核移行シグナルを付加した場合、変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８ＩのｓｃＦｖはより核に集積し、細胞内での機能が向上することを確認した。
《実施例９》
　本実施例では、メチル化酵素の阻害剤を用いてＨ３Ｋ２７トリメチル化レベルを低下させた場合、細胞内で発現させた変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８ＩのｓｃＦｖによりメチル化レベルの低下を検出できることを確認した。ｓｆＧＦＰを連結した変異体Ｍ８６Ｌ／Ｍ１５８ＩのｓｃＦｖを恒常的に発現するＨｅＬａ細胞に、ＧＳＫ１２６を終濃度２μＭとなるように添加した後、蛍光顕微鏡下で４８時間培養しながら観察した。図１４に示すように、Ｈ３Ｋ２７トリメチル化レベルの低下にともない、ｓｃＦｖが核から細胞質へ局在を移行することを確認した。
　本発明のモノクローナル抗体等及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３の解析方法は、オスとメスの鑑別に用いることができる。また、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の量の増減を解析できることから、医薬の薬効評価、病態の解析に用いることができる。

Claims (10)

  1. 　（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、
    （２）配列番号１で表されるアミノ酸配列における８１番のアミノ酸がメチオニンからロイシンに置換された重鎖可変領域ドメイン、及び／又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における２１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、又はバリンに置換された軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、
    （３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含み、且つヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内で結合できるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、又は
    （４）配列番号１で表されるアミノ酸配列における８１番のアミノ酸がメチオニンからロイシンに置換されたアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び／又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における２１番のアミノ酸がメチオニンからロイシン、イソロイシン、又はバリンに置換されたアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメインを含み、且つヒストンＨ３の２７番目のトリメチル化リシンに、細胞内で結合できるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
  2. 　前記抗原結合性断片がｓｃＦｖである、請求項１に記載の抗原結合性断片。
  3. 　タンパク質が結合した請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性断片。
  4. 　前記タンパク質が、蛍光タンパク質、発光タンパク質、又はタグペプチドである請求項１～３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性断片。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
  6. 　請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  7. 　請求項６に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
  8. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ドメイン、を含むモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
  9. 　請求項１～４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を、ヒストンＨ３と接触させる工程、及びヒストンＨ３に結合したモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を検出する工程、を含むヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析方法。
  10. 　請求項１～４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、ヒストンＨ３の第２７番目リシンのトリメチル化の分析キット。
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Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CONBIO2017, 6 December 2017 (2017-12-06) *
HAYASHI-TAKANAKA, YOKO ET AL.: "Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 39, no. 15, 2011, pages 6475 - 6488, XP055041142, ISSN: 0305-1048, DOI: doi:10.1093/nar/gkr343 *
pages 118 - 119, ISSN: 0288-5514 *
SATO, YUKO ET AL., SEMI-QUANTITATIVE ANALYSIS OF H4K20MEL LEVELS IN LIVING CELLS USING MINTBODY, BIO-PROTOCOL, vol. 7, 20 May 2017 (2017-05-20), pages e2276/1 - 9, ISSN: 2331-8325 *
vol. 52, no. 5, 2012, pages 234 - 235, ISSN: 0582-4052 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020175502A1 (ja) * 2019-02-27 2020-09-03 国立大学法人東京医科歯科大学 抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグタンパク質との融合タンパク質
JP7562148B2 (ja) 2019-02-27 2024-10-07 国立大学法人 東京医科歯科大学 抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグタンパク質との融合タンパク質

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