CN115850458A - 一种抗冠状病毒rbd蛋白的抗体、制备方法和应用 - Google Patents

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CN115850458A CN202211307925.1A CN202211307925A CN115850458A CN 115850458 A CN115850458 A CN 115850458A CN 202211307925 A CN202211307925 A CN 202211307925A CN 115850458 A CN115850458 A CN 115850458A
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刘霄卉
魏化伟
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Abstract

本发明公开了一种抗冠状病毒RBD蛋白的抗体、制备方法和应用,所述抗体的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示,轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示,所述抗体能够特异性结合冠状病毒Spike RBD蛋白,与Spike RBD蛋白具有较好的结合活性,临床应用前景广阔。

Description

一种抗冠状病毒RBD蛋白的抗体、制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体地,涉及一种抗冠状病毒RBD蛋白的抗体、制备方法和应用。
背景技术
冠状病毒(Coronavirus)是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒,冠状病毒仅感染脊椎动物,与人和动物的多种疾病相关,可引起多种急慢性呼吸道、消化道和神经系统疾病。到目前为止,能够使人类致病的冠状病毒共有7种,包括SARS冠状病毒和MERS冠状病毒等。新型冠状病毒又称为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)。SARS-CoV-2与非典型性肺炎病毒(SARS-CoV)在病毒复制和侵染宿主细胞特性方面有很多相似性,两种病毒表面的刺突(Spike,S)蛋白同源性高达76%,均与血管紧张素转换酶2(ACE2)受体结合,是病毒感染宿主细胞的重要环节。
SARS-CoV-2有四种主要的结构蛋白:刺突蛋白(Spike protein,S蛋白)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N蛋白)、膜蛋白(Membrane protein,M蛋白)、包膜蛋白(Envelopeprotein,E蛋白),其中,S蛋白有两个亚基:S1亚基和S2亚基,受体结合域(RBD)位于S1亚基上,它以三聚体的形式组成病毒粒子外膜表面的刺突,其主要功能是识别宿主细胞表面受体,介导与宿主细胞的融合,S2亚基可以充当I类病毒的融合蛋白来介导病毒体和细胞膜的融合,绝大部分冠状病毒的抗体都是靶向S1亚基或S1亚基上的受体结合域(RBD)。已有研究报道揭示与SARS-CoV相比,SARS-CoV-2 RBD某些关键的抗原表位已经发生改变,意味着基于SARS-CoV开发的抗体或者疫苗极有可能不具有对SARS-CoV-2相关的活性。
因此,寻找靶向SARS-CoV-2 Spike RBD蛋白的有效抗体对早期检测SARS-CoV-2、预防和/或治疗SARS-CoV-2具有重要意义。
发明内容
鉴于此,本发明的目的在于提供一种抗冠状病毒RBD蛋白的抗体、制备方法和应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现:
本发明的第一方面提供了一种抗冠状病毒RBD蛋白的抗体。
进一步,所述抗体包含重链可变区和轻链可变区;
所述重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示;
所述轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示。
进一步,所述重链可变区还包括重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4,所述轻链可变区还包括轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4;
所述重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示;
所述轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
进一步,所述抗体包含:
(1) 与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少90%同源性的重链可变区序列;
(2) 与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少90%同源性的轻链可变区序列;或
(3) 如(1)中所述的重链可变区序列和如(2)中所述的轻链可变区序列。
在本发明的具体实施方案中,所述抗体优选为重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示的抗体。
包括所述优选抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体也包括在本发明的范围之内。保守氨基酸序列变体包括不显著改变本发明优选抗体的结合性质和中和性质的氨基酸序列的修饰,如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体,氨基酸的缺失、增加导致的变体。
本发明所述的抗体还包括人源与非人源抗体,以及具有与本发明所述的抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。
本发明的第二方面提供了一种分离的核酸分子。
进一步,所述核酸分子编码本发明第一方面所述的抗体。
本发明的编码所述抗体的核酸分子包括具有上述核苷酸序列的保守核苷酸序列变体的核酸分子。所谓的保守核苷酸序列变体源于遗传密码简并和沉默的变体,核苷酸的替代、缺失和增加也包含在内。
本发明还提供了一种所述核酸分子的DNA片段。所述DNA片段可以编码抗体重链或轻链可变区的任何区域,包括重链可变区CDR1、CDR2、或CDR3,或轻链可变区CDR1、CDR2、或CDR3。
本发明的第三方面提供了一种载体。
进一步,所述载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。
在本发明的具体实施方案中,所述载体优选为表达载体,除了前面所述的核酸分子之外,表达载体还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。
表达载体是指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。载体的种类包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之,只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。在表达载体中,除了含有复制起点外,还可含有标记基因和其他翻译控制元件。
本发明的第四方面提供了一种经工程改造的宿主细胞。
进一步,所述经工程改造的宿主细胞包含本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体;
优选地,所述宿主细胞包括真核细胞、原核细胞;
更优选地,所述宿主细胞为真核细胞;
最优选地,所述真核细胞为哺乳动物细胞。
所述真核细胞和原核细胞能够用作用于表达本发明第一方面所述抗体的宿主细胞,此类宿主细胞是此类宿主细胞是本领域中众所周知的,并且许多可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)获得。这些宿主细胞尤其包含中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2细胞、海拉细胞(HeLa cell)、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如,Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包含人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系(例如,草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉纹夜蛾(Trichoplusiani))、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包含酵母和丝状真菌细胞。
在本发明的具体实施方案中,所述宿主细胞优选为HEK293细胞。
本发明的第五方面提供了一种用于检测样本中冠状病毒的产品。
进一步,所述产品包含本发明第一方面所述的抗体。
在本发明的具体实施方案中,所述产品包括(但不限于)检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括如前第一方面所述的抗体或其抗原结合片段能够检测出冠状病毒RBD蛋白的检测产品均包括在本发明的保护范围之内。
本发明的第六方面提供了一种药物组合物。
进一步,所述药物组合物包含治疗有效量的本发明第一方面所述的抗体。
在本发明的具体实施方案中,所述药物组合物还包括药学上可接受的载体,所述载体包括(但不限于)已经被美国食品与药品管理局认可的、可用于人类或动物的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、稀释剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗压剂、溶剂或乳化剂等对组成药物组合物无副作用的各种形式的载体。
本发明的第七方面提供了如下任一种方法:
(1) 一种用于制备本发明第一方面所述抗体的方法,所述方法包括如下步骤:培养本发明第四方面所述的经工程改造的宿主细胞,回收得到本发明第一方面所述的抗体;
(2) 一种非诊断目的的检测冠状病毒RBD蛋白的方法,所述方法包括如下步骤:提取含有冠状病毒RBD蛋白的样品,将获取的样品与本发明第一方面所述的抗体接触,检测样品与抗体的免疫反应,确定样品中RBD蛋白的表达水平。
本发明的第八方面提供了如下任一方面应用:
(1) 本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第五方面所述的产品在检测冠状病毒RBD蛋白或冠状病毒感染中的应用;
(2) 本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第五方面所述的产品在制备诊断冠状病毒感染相关疾病的产品中的应用;
(3) 本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第六方面所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗与冠状病毒感染相关疾病的药物中的应用。
相对于现有技术,本发明具有的优点和有益效果:
本发明提供了一种新型的靶向SARS-CoV-2 Spike RBD蛋白的抗体,所述抗体具有高纯度、高表达量的特点,能够特异性结合冠状病毒Spike RBD蛋白,与Spike RBD蛋白具有较好的结合活性,本发明为早期筛查冠状病毒提供了一种有效检测方法,同时为冠状病毒感染的防治提供了基础,具有重要的生物学和医学意义。
附图说明
图1为检测单克隆抗体2E9的电泳结果图;
图2为检测单克隆抗体2E9的HPLC结果图;
图3为ELISA检测单克隆抗体2E9的结合活性结果图。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,首次意外地研发出了一种针对冠状病毒(SARS-CoV-2)Spike RBD蛋白的单克隆抗体2E9,所述单克隆抗体的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示,轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示。经实验验证发现,所述单克隆抗体能够特异性结合冠状病毒Spike RBD蛋白,与Spike RBD蛋白具有较好的结合活性。在此基础上,完成了本发明。
如本文中使用,术语“RBD”是指冠状病毒S蛋白结构域的细胞受体结合区(Receptor binding domain,RBD),同“Spike RBD蛋白”或“RBD蛋白”,在本文中可互换使用,冠状病毒一般包括刺突蛋白(Spike protein,S蛋白)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N蛋白)、膜蛋白(Membrane protein,M蛋白)、包膜蛋白(Envelope protein,E蛋白),刺突蛋白(S蛋白)与宿主细胞受体结合介导病毒的入侵并决定病毒组织或宿主嗜性。S蛋白可识别宿主细胞受体并介导膜融合,对于病毒颗粒进入细胞至关重要,是病毒感染宿主细胞的关键因子。S蛋白结构域的RBD直接参与了宿主受体的识别,该区域的氨基酸变异会导致病毒的种属嗜性和感染特性的变化。
如本文中使用,术语“单克隆抗体”是指免疫球蛋白分子,同“抗体”或“单抗”,其包括四个多肽链、通过二硫键(即,全抗体分子)互连的两个重链(HC)和两个轻链(LC)及其多聚体(例如,IgM)。示例性抗体包含例如表1中所列的单克隆抗体2E9。每个重链包括重链可变区(“VH”或“HCVR”)和重链恒定区(包含结构域CH1、CH2和CH3)。每个轻链包含轻链可变区(“VL”或“LCVR”)和轻链恒定区(CL)。VH区和VL区可以被进一步细分成被称作互补决定区(CDR)的高变区,其间散布着更保守的被称作构架区/框架区(FR)的区。每个VH和VL包括从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链CDR也可以被称作HCDR或CDR-H,并且如上文所描述的进行编号(例如,HCDR1、HCDR2和HCDR3或CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)。同样,轻链CDR可以被称作LCDR或CDR-L,并编号LCDR1、LCDR2和LCDR3或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
通常,抗体重链和轻链两者的可变结构域包括三个高变区(也称为互补决定区(CDR)),其位于相对保守的构架区/框架区(FR)内。通常,从N端到C端,轻链可变结构域和重链可变结构域两者包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本发明的实施例中,将氨基酸分配给每个结构域是根据以下文献中的定义进行的:《免疫学目的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》, Kabat等人;Kabat(1978)《先进蛋白质化学(Adv.Prot.Chem.)》, 32:1-75;Kabat等人, (1977), 《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》, 252:6609-6616;Chothia等人, 《分子生物学杂志(JMol.Biol.)》(1987), 196:901-917或Chothia等人, (1989), 《自然》, 342:878-883。
在本发明中,单克隆抗体涵盖与所述抗体的氨基酸序列或者编码该抗体的任何核苷酸序列具有一定程度的序列一致性或序列同源性的序列,本发明中,“同源性”可等同于“一致性”,所述抗体可以进行各种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度常常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。这样的修饰可以包括在糖基化、甲硫氨酸氧化、哌嗪二酮形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺化中的变化。常见修饰是由于羧肽酶的作用导致的羧基末端碱性残基(诸如赖氨酸或精氨酸)的缺失。
如本文中使用,术语“同一性”指示在比对的序列的任何特定位置上,序列之间的氨基酸残基是相同的。如本文所用,“相似性”指示在比对的序列的任何特定位置上,序列之间的氨基酸残基为相似类型。例如,亮氨酸可被置换成异亮氨酸或缬氨酸。可通常彼此置换的其它氨基酸包括(但不限于):苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸),赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸),天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸),天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸),以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。通常,一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰,其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
可利用取代、缺失、插入或其任意组合来实现最终的衍生物或变体。通常,这些变化在几个氨基酸上进行以使分子的改变最小化,特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。然而,在某些情况下可以容忍更大的变化。氨基酸取代通常是单个碱基的;插入通常将为大约一个至大约二十个氨基酸残基的数量级,虽然可能容忍显著更大的插入。缺失的范围为大约一个至大约二十个氨基酸残基,虽然在一些情况下,缺失可以大得多。在本发明的具体实施方案中,所述衍生物或变体是指与本发明所述的单克隆抗体的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3和轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列具有至少约70%、72%、74%、75%、76%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%同源性的衍生物或变体,上述基于本发明所述的抗体得到的衍生物或变体同样包含在本发明的保护范围内。
本发明提供的抗体也可缀合至治疗剂以形成免疫缀合物,例如抗体-药物缀合物(ADC)。适宜治疗剂包括抗代谢物、烷基化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰酶抑制剂、出核抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在ADC中,抗体和治疗剂优选是经由可切割接头(例如肽基、二硫化物或腙接头)缀合。
本发明还提供了其他多肽,如包含单克隆抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外,本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常,该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸,较佳地至少约50个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。
如本文中使用,术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的,在本发明的具体实施方案中优选为双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时,核酸是“有效连接的”。例如,如果启动子或增强子影响编码序列的转录,那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
本发明对载体没有特别的限制,其选择取决于所期望的功能。载体的非限制性实例包括质粒、黏粒、病毒、噬菌体和其他常规用于例如遗传工程的载体。本领域技术人员众所周知的方法可以用于构建各种质粒和载体。
在一个实施方案中,载体是表达载体。根据本发明的表达载体能够指导本发明的核酸分子在宿主中的复制和表达,并因此保证由此编码的本发明的抗体的可变链结构域在选择的宿主中的表达。在进一步的实施方案中,一种或多种载体包含进一步的序列以确保不仅表达本发明的所述可变链结构域,而且也表达包含本发明的所述可变链结构域的全长抗体。
表达载体可以例如是克隆载体、双元载体或整合型载体。表达包括核酸分子的转录,例如转录成可翻译的mRNA。载体的非限制性实例包括(但不限于):E-027 pCAG Kosak-Cherry (L45a)载体系统、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pREP (Invitrogen)、pCEP4 (Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1 (Stratagene)、pSG5 (Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pcDNA3.1、pSPORT1 (GIBCO BRL)、pGEMHE (Promega)、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP (Clontech)、pQE-12、pUC-系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pBluescript (Stratagene)、pET-系列表达载体(Novagen)或pCRTOPO (Invitrogen)、λgt11、pJOE、pBBR1-MCS系列。
通常,载体可含有一种或多种用于克隆或表达的复制起点(ori)和遗传系统、一种或多种用于在宿主中选择的标记(例如,抗生素抗性)和一种或多种表达盒。另外,可以使用已确立的方法将载体中包含的编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列连接。这种调控序列是本领域技术人员众所周知的,并且包括但不限于确保转录起始的调控序列、内部核糖体进入位点(IRES)和任选的确保转录终止和转录物稳定的调控元件。确保转录起始的这种调控元件的非限制性实例包括启动子、翻译起始密码子、增强子、绝缘子和/或确保转录终止的调控元件,其包括在本发明的核酸分子的下游。
合适的启动子的例子包括(但不限于):巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40-启动子、RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒)、lacZ启动子、四环素启动子/操纵基因(tetp/o)、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG-启动子(鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒立即早期增强子的组合)、gai10启动子、人延伸因子1α-启动子、AOX1启动子、GAL1启动子CaM-激酶启动子,lac,trp或tac启动子,T7或T5启动子,lacUV5启动子。合适的增强子的一个例子是SV40-增强子。确保转录终止的调控元件的非限制性的例子包括(但不限于):SV40-聚腺苷酸化位点、tk-聚腺苷酸化位点、不依赖ρ因子的lpp终止子或AcMNPV多角体聚腺苷酸化信号。
在本发明中,任何适当的宿主细胞/载体系统可用于编码本发明的抗体分子的DNA序列或所述的核酸分子的表达。可使用细菌(例如大肠杆菌)及其它微生物系统,或还可使用真核生物(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。上述细胞包含(但并不限于)哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌来源的细胞。作为哺乳动物细胞,可优选使用选自(但并不限于)由CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞和HEK293T细胞组成的组中的一种作为宿主细胞。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。
在本发明的具体实施方案中,所述宿主细胞为HEK293细胞。
如本文中使用,术语“冠状病毒感染相关疾病”是指由冠状病毒引起或导致的疾病或病症。适合于使用本发明所述的抗体或药物组合物进行预防和/或治疗的疾病是冠状病毒感染引起的相关疾病,包括:高烧、干咳、呼吸短促、肺炎、胃肠道症状(如腹泻)、器官衰竭(肾衰竭和肾功能障碍)、脓毒性休克和严重病例的死亡。
在本发明中,用于检测或测定目标抗原(例如RBD蛋白)的量的方法可以是任何已知方法。例如,它包括免疫检测或测定方法。
免疫检测或测定方法是使标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、流式细胞技术、物理化学方法等。
冠状病毒感染相关疾病的诊断可以通过采用本发明的抗体或抗体片段检测或测定RBD蛋白来诊断。
在本发明中,对用于检测或测定目标抗原(例如RBD蛋白)的样品没有特别限制,只要它具有包含表达目标抗原(例如RBD蛋白)的可能性即可,例如:组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法;下述实施例中所用的试剂、生物材料等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1 单克隆抗体的筛选
1、重组新冠Spike RBD蛋白的合成
合成SARS-CoV-2病毒的RBD蛋白序列,构建至pEM5.1载体;抽提转染用质粒;转染至HEK293细胞,培养细胞7天;收获上清,Ni柱纯化,经过浓缩置换缓冲液,得到重组新冠RBD蛋白,重组新冠Spike RBD蛋白序列来源Uniprot P0DTC2。序列如SEQ ID NO:1所示,见下表1。
Figure SMS_1
2、免疫
第一次用福氏完全佐剂,每只100 μg,腹腔注射,总剂量0.5 mL/只,间隔3周进行第二次免疫;第二次起用福氏不完全佐剂,剂量为50 μg/0.5 mL/只,间隔2周进行第三次免疫;第三次注射后10天准备细胞融合;
取饲养细胞,可按105个/孔使用,于融合前一天铺板105个/100 μL/孔;取小鼠免疫脾细胞与准备好的骨髓瘤细胞用融合剂PEG进行融合,铺入已经加入饲养细胞的96细胞培养板,100 μL/孔。
3、杂交瘤细胞的筛选和克隆
通过ELISA检测方法进行阳性孔筛选,铺重组表达RBD蛋白过夜;洗板,加脱脂奶粉封闭,37℃,1 h;洗板,加入100 μL 96孔培养液上清,37℃,孵育1 h;洗板,加入HRP标记羊抗鼠二抗,37℃,孵育30 min;洗板,加入显色液,显色10 min,加入终止液,读取OD 450的数值;筛选高表达量细胞株进行亚克隆培养。
4、测序
收集细胞,采用Trizol抽提总RNA,用oligo(dT)20为引物,逆转录生成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后,通过TA克隆插入载体,进行转化,挑选阳性克隆送测序。
5、实验结果
筛选出靶向Spike RBD蛋白的抗SARS-CoV-2的单克隆抗体2E9,序列如表2所示。
Figure SMS_2
实施例2 单克隆抗体2E9的功能性研究
1、单克隆抗体的表达和纯化
1)对筛选出的序列进行化学合成,并克隆至真核表达载体中。
2)对质粒扩增提取。
3)将编码抗体的质粒瞬时转染入哺乳动物细胞HEK293。
4)收集上清,利用亲和层析方法,纯化获得单克隆抗体。
5)结果显示,纯化后的抗体表达量是134 mg/L。
2、单克隆抗体的理化性质检测
2.1凝胶电泳检测单克隆抗体的纯度
1)仪器设备
实验所使用到的仪器设备如表3所示。
Figure SMS_3
2)主要试剂
实验所使用到的主要试剂如表4所示。
Figure SMS_4
3)样品制备
取20 μL的样品与5 μL的5×还原buffer混合均匀,在95℃中加热5 min,冷却;
取20 μL的样品与5 μL的5×非还原buffer混合均匀。
4)电泳
配置胶,加适量的电泳缓冲液,加样,进行电泳。
5)染色与脱色
电泳结束后,取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中,室温染色1 h或更长时间;倒出染色液,加入适量考马斯亮蓝染色脱色液,室温脱色4-24 h。完成脱色后,用ddH2O浸泡,参照Marker蛋白,与未染色凝胶对比,切下所需蛋白成分的凝胶,收集起来。然后把所要提纯的蛋白从凝胶中分离出来。
6)实验结果
结果如图1所示,从左至右条带分别是marker、还原条带;电泳结果图显示单克隆抗体的检测纯度均大于95%。
2.2 HPLC检测单克隆抗体的纯度
1)仪器设备
实验所使用到的仪器设备如表5所示。
Figure SMS_5
2)主要试剂
实验所使用到的主要试剂如表6所示。
Figure SMS_6
3)流动相配制
将磷酸氢二钾三水、磷酸二氢钾和氯化钾加入到约900 mL纯化水中,搅拌溶解,定容至1 L,用pH计测量,确定其pH在6.2±0.1之间。0.22 μm滤膜过滤,室温保存。
4)样品制备
系统适用性样品:MIL62标准品用流动相稀释至2 mg/mL;
供试品:待测样品用流动相稀释至2 mg/mL。
5)色谱条件
具体色谱条件如表7所示。
Figure SMS_7
6)实验结果
结果如图2所示,液相检测结果显示单克隆抗体的检测纯度均大于95%。
3、单克隆抗体的结合活性检测
1)包被:用包被液将抗原RBD蛋白稀释成2 μg/mL,混匀,加入96孔包被板,100 μL/孔,封膜封闭,4℃过夜。
2)洗板机洗涤3次,最后一次不能有液体残留在板子上,用吸水纸拍干板子表面的液体。
3)封闭:加入5%奶粉(0.5 g奶粉溶于10 mL DPBS),300 μL/孔,37℃孵育1 h,按照步骤2)洗板3次。
4)将抗体进行梯度稀释,100 μL/孔,37℃反应1 h,按照步骤2)洗板3次。
5)加二抗:用DPBS按照1:2000稀释,加入96孔板,100 μL/孔,37℃反应1 h,按照步骤2)洗板3次。
6)显色:加入TMB,100 μL/孔,室温避光显色10 min。
7)终止:加入2N H2SO4,100 μL/孔。
8)酶标仪测OD450,10 min内检测。
9)实验结果
结果如图3所示,结果显示,单克隆抗体2E9能够与抗原RBD蛋白特异性结合,并且呈现浓度依赖性,EC50为0.03731 μg/mL。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种抗冠状病毒RBD蛋白的抗体,其特征在于,所述抗体包含重链可变区和轻链可变区;
所述重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4所示;
所述轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示。
2.根据权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述重链可变区还包括重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4,所述轻链可变区还包括轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4;
所述重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示;
所述轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
3.根据权利要求2所述的抗体,其特征在于,所述抗体包含:
(1)与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少90%同源性的重链可变区序列;
(2)与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少90%同源性的轻链可变区序列;或
(3)如(1)中所述的重链可变区序列和如(2)中所述的轻链可变区序列。
4.一种分离的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码权利要求1-3中任一项所述的抗体。
5.一种载体,其特征在于,所述载体包含权利要求4所述的核酸分子。
6.一种经工程改造的宿主细胞,其特征在于,所述经工程改造的宿主细胞包含权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的载体;
优选地,所述宿主细胞包括真核细胞、原核细胞;
更优选地,所述宿主细胞为真核细胞;
最优选地,所述真核细胞为哺乳动物细胞。
7.一种用于检测样本中冠状病毒的产品,其特征在于,所述产品包含权利要求1-3中任一项所述的抗体。
8.一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求1-3中任一项所述的抗体。
9.如下任一种方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)一种用于制备权利要求1-3中任一项所述抗体的方法,所述方法包括如下步骤:培养权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞,回收得到权利要求1-3中任一项所述的抗体;
(2)一种非诊断目的的检测冠状病毒RBD蛋白的方法,所述方法包括如下步骤:提取含有冠状病毒RBD蛋白的样品,将获取的样品与权利要求1-3中任一项所述的抗体接触,检测样品与抗体的免疫反应,确定样品中RBD蛋白的表达水平。
10.如下任一方面应用,其特征在于,所述应用包括:
(1)权利要求1-3中任一项所述的抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞、权利要求7所述的产品在检测冠状病毒RBD蛋白或冠状病毒感染中的应用;
(2)权利要求1-3中任一项所述的抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞、权利要求7所述的产品在制备诊断冠状病毒感染相关疾病的产品中的应用;
(3)权利要求1-3中任一项所述的抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞、权利要求8所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染相关疾病的药物中的应用。
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