WO2020175502A1 - 抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグタンパク質との融合タンパク質 - Google Patents

抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグタンパク質との融合タンパク質 Download PDF

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protein
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acid sequence
antigen
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純雄 寺田
佐藤　啓介
紀 中井
健太 齊藤
将彦 川岸
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国立大学法人東京医科歯科大学
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Definitions

  • the present invention relates to a fusion protein of an antigen-binding protein and a fluorescent protein or a fluorescently labeled tag protein.
  • Non-Patent Document 1 Fluorescence is known to have polarized light.
  • ⁇ which is a green fluorescent protein
  • Non-Patent Document 2 Fluorescence is known to have polarized light.
  • Non-Patent Document 2 an example of observing polarized light of septin by linking ⁇ with a protein called septin.
  • Non-patent Document 2 it was revealed for the first time that the orientation of septin fibers on the cell division plane of Saccharomyces cerevisiae changed with time by observing the polarized light.
  • the present invention provides a fusion protein of an antigen-binding protein and a fluorescent protein or a fluorescently labeled tag protein.
  • the present inventors have established that an antigen-binding protein and a fluorescent protein or ⁇ 0 2020/175502 2 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • the fusion protein with the tag protein As for the fusion protein with the tag protein, a large number of fusion proteins in which the helices of two proteins were linked and /3 sheets were linked. The present inventors have found that the obtained fusion protein retains the binding property to the antigen and is suitable for the observation of fluorescence. The present inventors have also found that the obtained fusion protein is suitable for observation of fluorescence polarization.
  • a fusion protein of an antigen-binding protein and a fluorescent protein or a tag to be fluorescently labeled
  • the antigen-binding protein is an antigen-binding protein having a helix structure or a /3 sheet structure at the end,
  • the fluorescent protein or the tag to be fluorescently labeled is a fluorescent protein having a helix structure or a /3 sheet structure at the end or a tag to be fluorescently labeled, and the helix at the end is linked to the helix at the end, or A fusion protein in which the terminal /3 sheet structure and the terminal /3 sheet structure are linked.
  • the antigen-binding protein has a helix structure at the 1 ⁇ 1 end
  • the fluorescent protein or the tag to be fluorescently labeled has a helix structure at the ⁇ terminal
  • the fusion protein according to (1) above wherein the helix at the end of the antigen-binding protein and the helix at the end of the fluorescent protein or the tag to be fluorescently labeled are linked.
  • the fluorescent protein is a fluorescent protein having a helix structure at the 3 ⁇ end, which is selected from a fluorescent protein having a ⁇ and ⁇ -like/3 barrel structure and a circular permutation mutant of a point mutant. ) Or the fusion protein described in (3). ⁇ 0 2020/175502 3 (:171? 2020/007568
  • the antigen-binding protein has a /3 sheet structure at the 0 terminus
  • Fluorescent protein has a /3 sheet structure at the 1 ⁇ 1 end
  • the fluorescent protein is selected from the group consisting of fluorescent proteins and point mutants having ⁇ and ⁇ -like / 3 barrel structures, and circular permutation mutants and deletion mutants thereof at the 1 ⁇ 1 end. / 3
  • the tag to be fluorescently labeled is a dehalogenation domain of a haloalkane dehalogenase having an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or 29 having a helix structure at the 0-terminal, (2) or
  • the fusion protein according to any one of (3).
  • composition comprising the fusion protein according to any one of (1) to (9) above.
  • nucleic acid according to (11) above is included, wherein the nucleic acid is operably linked to a regulatory sequence, and is used for expressing a fusion protein in a cell.
  • a method comprising observing an antigen bound to the fusion protein according to any one of (1) to (9) above. ⁇ 0 2020/175 502 4 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • a first antigen bound to the first fusion protein which is the fusion protein according to any one of (1) to (9) above,
  • the second fusion protein which is the fusion protein according to any one of (1) to (9) above (however, the fluorescence wavelengths of the first fusion protein and the second fusion protein are different) With antigen
  • a method of designing an amino acid sequence of a fusion protein comprising preparing a first amino acid sequence which is an amino acid sequence of an antigen-binding protein and a second amino acid sequence which is an amino acid sequence of a fluorescent protein. , Where the 1 ⁇ 1 end of the first amino acid sequence and the 0 end of the second amino acid sequence, or the 0 end of the first amino acid sequence and the 1 ⁇ 1 end of the second amino acid sequence are both in a helix structure. Or both / 3 seat structure,
  • Both of them are helix structures by excising a part of them, or both are a /3 sheet structure by excising a part of 1 ⁇ 1 end or ⁇ end.
  • the 1 ⁇ ! end of the sequence and the 0 end of the second amino acid sequence, or the 0 end of the first amino acid sequence and the 1 ⁇ 1 end of the second amino acid sequence are linked so that the connecting point is a helix structure or / 3 Obtaining an amino acid sequence that is part of a 3 sheet structure.
  • a method for producing a gene expression vector for expressing the nucleic acid which comprises operably linking the nucleic acid obtained in (18) above to a promoter.
  • Fig. 18 illustrates a method of ligating two proteins in the fusion protein of the present invention (method of ligating helices).
  • Fig. 1 Minami was obtained by estimating the crystal structure of each protein.
  • FIG. 3 shows a three-dimensional structural model of a fusion protein of dried squid and afimer.
  • FIG. 1 (:) Fig. 10 shows the results of crystal structure analysis of a fusion protein of 0 13 0 and afimer.
  • FIG. 2 shows the results of observation under a fluorescence polarization microscope of cells expressing the fusion protein of the present invention in which the fluorescent protein is _ 3 and the aphimer binds to actin.
  • Fig. 3 shows that The result of having observed the cell which expressed the fusion protein of this invention which is an afimer which an afimer binds to actin under a fluorescence polarization microscope is shown.
  • Fig. 4 shows fluorescence fluorescence microscopy of cells expressing the fusion protein of the present invention, in which the fluorescent protein is 0,1, and the affimer binds to actin. The results observed below are shown.
  • FIG. 5 illustrates a method for ligating the fusion protein of the present invention in which the tag to be fluorescently labeled is a halo tag and the afimer is an afimer that binds to actin.
  • Fig. 68 shows a three-dimensional structural model of a fusion protein of halotag and an actimer for actin, and fluorescence polarization microscopy of cells expressing this fusion protein. ⁇ 0 2020/175 502 6 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • FIG. 6 shows a three-dimensional structural model of a fusion protein of halotag and an affimer for actin, and the result of observing cells expressing this fusion protein under fluorescence polarization microscopy.
  • the number of turns of the helix at the connecting point is different from that in Fig. 68.
  • Fig. 6(:) Fig. 60 shows a three-dimensional structural model of a fusion protein of halotag and an affimer for actin and the result of observing cells expressing this fusion protein under fluorescence polarization microscopy.
  • the number of turns of the helix at the connecting point is different from that of Fig. 6.
  • Fig. 78 illustrates the method for ligating the fusion protein of 13 13°C and Nanobody.
  • FIG. 7 shows the results of observation under fluorescence polarization microscopy of cells expressing the fusion protein of ⁇ 13 dried and the nanobody that binds to vimentin, which were linked by the linking method of Fig. 78. ..
  • Fig. 7 (:) Fig. 7 (3 shows a fusion protein of nanobody that binds to vimentin and ⁇ 1 7 6 — 1 7 2 ⁇ 1 ⁇ / 6 11 Li 3 linked by the same linking method as in Fig. 7] The result of having observed the cell which expresses under a fluorescence polarization microscope is shown.
  • Fig. 88 illustrates the method for ligating the fusion protein between Hachijo 6 and Nanobody.
  • FIG. 8 shows the results of observation under a fluorescence polarization microscope of cells expressing the fusion protein of 8 6 and the nanobody that binds to vimentin, which were linked by the linking method of FIG.
  • Fig. 98 illustrates a method of ligating fusion proteins of 1313 and 30.
  • Fig. 9 2 shows the results of observing cells expressing a fusion protein of 30 V binding to non-muscle myosin II under a fluorescence polarization microscope.
  • Fig. 90 shows that it is bound to myosin by the same method as in Fig. 70. 3 ⁇ 0 2020/175 502 7 ⁇ (: 171-1? 2020 /007568
  • Fig. 10 shows a three-dimensional structural model of a fusion protein (SEQ ID NO: 35) of the actin-binding site of utrophin and 01_M in Table 1 and fluorescence of cells expressing the fusion protein. The result observed under the polarization microscope is shown.
  • Fig. 11 shows a three-dimensional structural model of a fusion protein of an actin-binding affimer and 01 3 0 8 ⁇ , and cells were observed under a fluorescence polarization microscope using the fusion protein. The result is shown.
  • Fig. 12 shows a three-dimensional structural model of a fusion protein of an actin-binding affimer and ⁇ 161 ⁇ 1 ⁇ ⁇ “ ⁇ ⁇ ⁇ .” Using the fusion protein, cells were observed under a fluorescence polarization microscope. The result is shown.
  • Fig. 13 shows a three-dimensional structural model of a fusion protein of a nanobody that binds to the 8!_8 tag and ⁇ 1762-172 mV enu 3, the fusion protein, and an affimer.
  • a fusion protein with an eight !_ eight tag that is, a fusion protein in which the alpha helix at the 1 ⁇ ! end of the affimer that binds to actin is deleted and the eight !_ eight tag sequences are linked in a continuous alpha helix
  • the result of having observed the expressed cell under the fluorescence polarization microscope is shown.
  • Fig. 14 shows a three-dimensional structural model of an actin that binds to an actin with linked 8!_8 tags.
  • the eight!_eight tags are shown in dark grey, and the affimers are shown in light grey.
  • antigen-binding protein means a protein that binds to a specific substance.
  • the antigen binding protein can be a modified or unnatural protein or antigen binding fragment thereof.
  • the antigen-binding protein may be a protein that has a binding affinity for an antigen by modifying the amino acid sequence, and has a 1 ⁇ 1 terminal or (3 terminal/3 sheet structure or helix structure (for example, a scan protein).
  • a fold protein for example, an antibody, an antigen-binding fragment of an antibody (eg, 3 c F v), single-chain variable domain (V HH domain) of camel and llama heavy chain antibodies (eg, NanobodyTM), and skyafold protein based on bacterial albumin-binding domain (eg, ABDTM) )), a skiafold protein having a human skeleton domain of the 10th domain as a basic skeleton (for example, Adnectin (trademark), FingR (trademark) or Monobody (trademark) )), staphylococcal protein A Skiafold protein having Z domain as a basic skeleton (for example, Affibody (trademark) ), and Schiyafold protein having human Ar B-crystallin as a basic skeleton (for example, Affirin (Affi ⁇ in (trademark)) )
  • an archaeal DNA-binding protein S ac 7 d is a skeleton protein having a basic skeleton (for example, Affitin (trademark) ), and a triple antiparallel helix is a skiafold protein having a basic skeleton (for example, Rufabody (AI phabody (trademark))), skiyafold protein having human or insect lipocalin as a basic skeleton (for example, anticalin (Antica ⁇ in (trademark))), armadillo protein having a basic skeleton Proteins (eg armadillo repeat proteins), Schiyafold proteins with the C-type lectin domain CT LD 3 as the basic skeleton (eg A trimer (trademark)), Polymerized LDLR-A modules as the basic skeleton Sukiyafold protein (eg, Avima-(AV imer (trademark))), Skiyafold protein (eg, Centityrin (trademark)) having the Fn3 domain of human
  • the N-terminal or C-terminal /S sheet structure or helix structure of these proteins is used for ligation in the fusion protein of the present invention.
  • the site of the amino acid involved in the binding affinity to the antigen in the above-described skiafold protein is well known, and the amino acid at the site is suitable for binding to the antigen by ribosome display or phage display.
  • skiafold protein having a desired antigen-binding property can be obtained.
  • an antigen-binding protein an antigen-binding protein having a helix or /S sheet at the N-terminal or C-terminal is In the present invention, it can be used as a fusion protein with a fluorescent protein.
  • Skiafold protein refers to a parent protein (protein before modification) and a tertiary protein having a function of retaining a paratope (in particular, retaining its three-dimensional shape).
  • a basic skeleton means a portion other than the intended modification site (eg, paratope) in the skiffold protein.
  • a paratope refers to an antigen-binding protein in an antigen-binding protein. It means the part that is combined with.
  • fluorescent protein means that by irradiating an electromagnetic wave of a short wavelength, its energy is absorbed and an electron is excited, and when this returns to a ground state, an electromagnetic wave of a longer wavelength is emitted. The protein released.
  • fluorescent proteins ⁇ 0 2020/175 502 10 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • a fluorescent protein suitable for fluorescence polarization observation can be preferably used for fluorescence polarization observation. Fluorescent proteins suitable for fluorescence polarization observation and fluorescent proteins not suitable for fluorescence polarization observation can be used for simple fluorescence observation.
  • affimer refers to a biologically inactive and physically stable variant of Stefin-8 or cystatin as a basic skeleton. It is a protein that has an antigen-binding site in two loops that are presented on the same side from the 4/3 sheet structure of the basic skeleton. By making the amino acid sequences of the loop portion diverse, it is possible to obtain affima having binding properties to various antigens by phage display.
  • a variant of Stefin 8 having the amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 disclosed in 0 2 0 9/1 3 6 1 8 2 can be used, and
  • a variant of Stefin 8 in which glycine may be replaced with arginine is a two loops presented on the same side from the 4/3 sheet structure of the basic skeleton.
  • Affimer has a ⁇ helix structure at the 1 ⁇ 1 end.
  • It may be a protein having a basic skeleton, and may be a protein having an antigen-binding site in two loops presented on the same side from the four/3 sheet structures of the basic skeleton.
  • Examples of the affimers that do include, for example, any one of the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 disclosed in ⁇ / ⁇ 2 0 1 4 /1 2 5 2 9 0.
  • the molecular child of Affima _ is Can be
  • “Nanobody” means a variable region domain of an antibody consisting only of heavy chains found in certain animals, whereas an antibody consists of a heavy chain and a light chain. ⁇ 0 2020/175 502 1 1 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • Nanobody is And bind to the antigen at these three 0s. Nanobodies immunize animals that produce antibodies consisting of the above heavy chains only with antigens, isolate the mitochondria from the immunized animals, and include the variable region. Eight libraries can be obtained by incorporating them into a phage display library using 1 ⁇ /113 phages and screening with an antigen.
  • the Nanobody has a 3 sheet structure that can connect a fluorescent substance to the 1 ⁇ 1 terminal and (3 terminal at the present invention.
  • a 0 sheet structure at the terminal and/or the 0 terminal for example, the 0 terminal
  • the 0 sheet structure can be linked to the /3 sheet structure of fluorescent proteins or tags that are fluorescently labeled.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are A flexible linker that connects the heavy-chain variable region and the light-chain variable region to facilitate association between the heavy-chain variable region and the light-chain variable region while retaining the antigen specificity of the original antibody through antigen recognition.
  • the flexible linker a flexible linker whose structure can be freely changed depending on the association state of 30 V with an antigen is used, and for example, a glycine-rich sequence of about 15 amino acids (for example, hydrophilic linker) is used.
  • Serine may be added in order to secure the property
  • Phosphorus having a 3- amino acid sequence can be used.
  • the 30V is a marker that has the desired antigen-binding property from a phage library in which the antigen-binding site of the 30V (eg, a framework sequence of a mammal such as human) having a framework sequence is randomized. You can choose and get. 30 is! ⁇ ! and (3 ends It has bright /s sheet structure that can connect fluorescent material.
  • the N-terminal and/or C-terminal 0 sheet structure of sc F v for example, the C-terminal /S sheet structure can be linked to the fluorescent protein or the /S sheet structure of a fluorescently labeled tag. ..
  • DAR Pin is an antigen-binding protein developed by Molecuruparprt Ers AG.
  • DAR Pin is a human protein that has ankyrin repeat units (usually about 2 to 30), and each repeat unit contains a backbone residue and a target interaction residue (see, for example, W02 002/020565). ).
  • Ankyrin repeat units have a common fold consisting of two antiparallel a helices followed by a /S hairpin ⁇ where /S pairpin has a loop that connects to the next repeat unit ⁇ .
  • DAR P i n forms a curved structure.
  • the target interacting residue may be present on the /S hairpin of the ankyrin repeat unit and on the exposed portion of the first a-helix.
  • DAR Pin can be obtained by selecting based on the binding property to the antigen.
  • DAR Pin can be obtained using, for example, methods such as phage display, liposome display, and plasmid display.
  • the DAR Pin has an a-helix at the end and a /S sheet at the other end, and in the present invention, it provides a site for connecting a fluorescent substance.
  • the "monobody” is also called FingR or Adnectin, and is a scaffold having a basic skeleton of the 10th domain of human fibronectin (fibronectin ⁇ type domain). It has a fold-out texture. This domain has a structure similar to that of the antibody variable domain, ie it has seven /S sheet structures forming an /S sandwich and three loops on either side corresponding to the three complementarity determining regions.
  • the binding specificity for the antigen is
  • Amino acid sequence of loop BC between 2nd and 3rd / S sheets, loop DE between 4th and 5th / S sheets, and loop FG between 6th and 7th / S sheets Can be modified by Or between the 3rd and 4th / S seats ⁇ 0 2020/175 502 13 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • Monobodies may have a 1 ⁇ 1 end and a /3 sheet at the (3 end) to provide sites for connecting the fluorophore.
  • having an amino acid sequence corresponding to a certain amino acid sequence includes, in addition to the amino acid sequence, one having an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence and having the same function. Used in meaning. For example, when the sequences differ between species, not only the amino acid sequence of a particular species but also an amino acid sequence that retains the same function in a closely related species may be an amino acid sequence having a high similarity to the amino acid sequence of the particular species. Has an array. “Having an amino acid sequence corresponding to a certain amino acid sequence” can mean having an amino acid sequence having the same function corresponding to such an amino acid sequence.
  • the term "protein” may mean a protein having another amino acid sequence and a protein having another amino acid sequence.
  • the fluorescent protein has a ⁇ 3 terminal helix structure (for example,
  • the helix linker is not particularly limited and may have, for example, the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 14, and 23.
  • the N-terminal /S sheet structure of a fluorescent protein and the /S sheet structure of a nanobody or sc FV at the C-terminal can be linked.
  • Two linked / S sheets can form one large / S sheet structure, but the fusion protein of the present invention is a fusion protein of a fluorescent protein and a nanobody or sc FV linked in this way. I will provide a.
  • the ligation may be performed by directly connecting the /3-sheets to each other, or may be performed via a linker.
  • the linker for example, phosphorus having a /S sheet structure can be used, or one or two to several valine (V) or other structurally inflexible amino acids can be used as the linker.
  • a circular permutation mutant of GFP (CP GFP) can be used as a fluorescent protein having a C-terminal helical structure.
  • CP GFP modified fluorescent proteins of GFP
  • the circularly permuted fluorescent protein is linked to the N-terminal and C-terminal of the protein with or without a linker, and is bisected with another appropriate portion to determine the positions of the N-terminal and C-terminal sequences. It is a modified mutant.
  • Circularly permuted mutants may have an important condition that the N- and C-termini are located close to each other in the three-dimensional structure, but many fluorescent proteins satisfy this condition, and the circularly permuted mutants modify the fluorescent protein. Has become a standard technique for modifying fluorescent proteins.
  • a circular permutation mutant allows a fluorescent protein having a C-terminal helical structure to be used for the production of a fusion protein with an affimer.
  • a circular permutation mutant can also be used to prepare a fluorescent protein having an N-terminal /S sheet structure for producing a fusion protein with Nanobody or sc FV.
  • G F P variant fluorescent protein ⁇ more specifically, for example, G F P G
  • Examples of the fluorescent protein having an FP-like / S barrel structure that is, a GFP-like protein
  • its point mutant, or circular permutation thereof ⁇ include, for example, superfolder GFP (sf GFP), EG FP, C itrine, Ve nus, mVe nus, YFP, mA pple, m ⁇ range, mC herry, BFP, T ag BFP, mT urquoi ⁇ 02020/175502 15 ⁇ (:171? 2020/007568
  • a circular permutation mutant of a protein for example, a fluorescent protein that is a circular permutation mutant having a helix structure at the 0-terminal; written as a prefix of the protein name “ ) Is added, it is clearly indicated that the protein is a circular permutation mutant.
  • the modified fluorescent protein of ⁇ the order of the /3 sheet forming the /3 barrel is set.
  • And 01 036-1 463, and their modified fluorescent proteins, and one or more selected from the group consisting of these can be used by converting them into a circular permutation mutant having a helix structure at the ⁇ 3 end. it can.
  • the crystal structure of these proteins has been published in, for example, Protein 0 ata Bank (906), and it exists at the 1 ⁇ 1 or 0 terminal of these proteins / 3 sheet structure or helix.
  • the structure can be used for ligation of the fusion proteins of the invention.
  • Used in the present invention has a helix structure at the end Is not particularly limited as long as it has a helix structure at the terminal, but for example, it has an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO:1. Can be used.
  • Examples of the fluorescent protein having a C-terminal helix structure include phytochrome-based near-infrared fluorescent proteins.
  • Phytochrome-based near-infrared fluorescent proteins include i R F P and m i R F P.
  • i RFP contains the PAS domain and GAF domain (PAS-GAF) of hodopseud omo naspalustris / of the cteriophytochrome R p B ph P 2 and incorporates pyribelzin ⁇ X a to generate near infrared fluorescence.
  • PAS-GAF PAS domain and GAF domain
  • RFP contains the PAS domain and GAF domain (P AS-GA F) of Rhodopseud omo naspalustris Bacteriophytochrome R p B ph PI, and emits near-infrared fluorescence by incorporating pyribelzin ⁇ X a. , Lacks the C-terminal a-helix required for dimerization and has various mutations (see Shcherbakova DM eta I., Nature Communication, 7, A rticle number: 1 2405, 2016).
  • mi RFP examples include, but are not limited to, mi RFP 670 (excitation/emissionat 642/670 nm), mi RFP 709 (excitation/emissionat 683/709 nm), and mi RFP 703 (excitation/emissionat 673/703 nm). nm), as well as mi RFPs derived from these mi RFPs.
  • mi RFP 670 can have an amino acid sequence corresponding to, for example, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:22.
  • These phytochrome-based near-infrared fluorescent proteins have a helix structure at the C-terminus of the GAF domain and can be used to make fusion proteins with affima.
  • RFP 670 nano can also be used to make the fusion proteins of the invention.
  • RFP 670 nano has 3784 ⁇ 8 domains with 71 ⁇ /1, 25 ⁇ , 1 ⁇ /126
  • mi RFP 670 nano has a helix structure at the 1 ⁇ 1 end and can be used for ligation with a fluorescent protein in the present invention.
  • the dehalogenation domain of the haloalkane dehalogenase has a pocket for ligand insertion near 831 06 in the active center.
  • a fluorescent substance can be bound to the above-mentioned tagged protein.
  • the haloalkane dehalogenase de/ ⁇ logenating domain that can be used for such purposes include the haloalkane dehalogenase de/logenating domain that has lost the dehalogenase activity.
  • Active mutants (1 to 1272) converted to enylalanine can be used, and examples thereof include a de-/genogenization domain having an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or 29.
  • the dehalogenation domain of this haloalkane dehalogenase has a ⁇ helix at the O-terminal.
  • the binding between the ligand and the dehalogenation domain is suitable for polarized light observation.
  • the use of the dehalogenation domain of haloalkane dehalogenase and its active mutants in fluorescence polarization observation. Can be provided.
  • Fluorescent substances that can be used as the ligand include coumarin, oregon green, diAc FAM, tetramethylrhodamine (TMR), STEL LA Fluor 650, ST EL LA Fluor 700, ST ELLAF luor 720, indocyanine. Green, Alexa FI uor 488, and AI exa Fluor 660 are commercially available as H a ⁇ otag ligands.
  • the length of the helix structure is not particularly limited as long as the helix structure is formed.
  • it is possible to change the bond angle with the affimer by changing the length of the amino acid of the helix at the connection site, which changes the polarization plane of the fluorescent protein relative to the affimer. It is possible to do so.
  • a-helix it makes one cycle with about 3.5 amino acids, so by increasing the length of a-helix by 1 amino acid, the bond angle is changed by about 100 degrees.
  • the bond angle is changed by about 120 degrees.
  • the length of the helix can be regulated by one or more selected from amino acid additions, deletions and insertions. Further, the length of the helix can be adjusted appropriately according to its purpose.
  • the method of regulation is not particularly limited, but may be carried out, for example, by changing the length of one of the helices of the fusion protein, or by inserting a peptide having a helix structure at the ligation site of the fusion protein. You may go by In each case, a new helix structure including the regions before and after the ligation site is newly formed, so that the fusion protein is more rigidly ligated.
  • the length of the /S sheet structure is not particularly limited as long as the /S sheet structure is formed.
  • a structurally inflexible structure including the /S sheet structure before and after the connecting portion is newly formed after the connection, whereby the fusion protein is more firmly connected.
  • the fusion protein of the present invention may be, for example:
  • a nucleic acid encoding the fusion protein of the present invention for example, a nucleic acid.
  • a nucleic acid encoding a fusion protein of the invention can be operably linked to at least one regulatory sequence (eg, promoter).
  • an expression vector comprising a nucleic acid encoding a fusion protein of the invention operably linked to at least one regulatory sequence (eg, a promoter) (eg, mammalian cells containing the fusion protein).
  • a vector to be expressed is provided.
  • the control sequence is not particularly limited, and includes, for example, a promoter of 3 ⁇ 4 polymerase polymerase, such as ⁇ 1 ⁇ /1 immediate early, 1 to 13 thymidine kinase, early and late 340, retro. Of virus! -Promoters such as Ding [3 ⁇ 4 and metallothionein ⁇ .
  • a promoter for expressing in E. coli for example, I30, I
  • 3-phosphoglycerate kinase and the like.
  • a promoter for expression in plants for example, the cauliflower mosaic virus ( ⁇ 3 1 ⁇ / 1) 3 5 3 transcriptional initiation region, Agrobacterium Tsumefu Ashiensu Ding one hundred and eight from the 1 'or 2' promoter , And a promoter such as dexamethasine. Promo for expression in Saccharomyces cerevisiae ⁇ 0 2020/175 502 20 (:171? 2020/007568
  • -Yuichi includes, for example, 8 0 1 to 1 1, Ding 0 1 to 1 3, 0 [ ⁇ 1, 0 8 1_1.
  • Examples of promoters for expression in fission yeast include promoters such as 3, 10 ⁇ , nmt 1, and ⁇ 1 ⁇ /1.
  • Expression vectors include plasmids, phages, phagemids, cosmids, phosmids, artificial chromosomes, retroviruses, lentiviruses, measles virus, vaccinia virus, adenovirus, adeno-associated virus, and Sendai virus.
  • cells for example, animal cells, plant cells, bacteria, archaea, and fungal cells
  • a method of introducing a linear or circular port encoding a fusion protein of the present invention operably linked to a control sequence into cells a stable expression strain may be obtained after the introduction
  • a genome editing technique for example, Dinghachi!_Mi 1 ⁇ 1, 1 ⁇ 1, or ⁇ System or the like
  • a method for introducing a linear or cyclic liposome encoding the fusion protein of the present invention operably linked to a control sequence into the cell genome for example, animal cells, plant cells, bacteria, archaea, and fungal cells
  • a method of introducing a nucleic acid into a cell without using a gene expression vector and a method of expressing a protein encoded by the nucleic acid are also known.
  • a fusion protein of the present invention is prepared by introducing into a cell a nucleic acid (eg, a linear nucleic acid, eg, a linear nucleic acid) that encodes the fusion protein of the present invention in which a regulatory sequence (eg, a promoter) is operably linked.
  • a regulatory sequence eg, a promoter
  • Escherichia coli can be introduced into cells to express the fusion protein of the present invention intracellularly.
  • the nucleic acid encoding the fusion protein of the present invention is a nucleic acid encoding a fusion protein or a messenger.
  • compositions comprising a nucleic acid encoding the fusion protein of the present invention.
  • compositions comprising a gene expression vector containing a nucleic acid encoding the fusion protein of the present invention.
  • compositions may include nucleic acid and/or gene expression vectors and excipients. Excipients include excipients for stabilizing nucleic acid and/or gene expression vectors. ⁇ 0 2020/175502 21 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • Excipients include salts, chelating agents, and 1 to 1 adjusting agents.
  • the fusion protein of the present invention is a protein, it can be introduced into cells, or a nucleic acid encoding the fusion protein can be introduced into cells for forced expression. Therefore, the fusion protein of the present invention can be used for observing an antigen in cells.
  • a composition for example, a composition for introducing the fusion protein of the present invention into cells
  • a composition for example, a composition for intracellular expression of the fusion protein of the present invention
  • a nucleic acid encoding the fusion protein of the present invention can be provided.
  • a method for observing an antigen (hereinafter, also referred to as “a method for observing a fusion protein of the present invention”).
  • the method of observing the antigen can include observing the antigen bound to the fusion protein of the invention.
  • the term “antigen” means, but is not limited to, a substance that can be an immunogen of an antibody, a substance that can be an immunogen of an affimer, a substance that can be an immunogen of Nanobodies, or a substance that can be an immunogen of 30 V.
  • Such an antigen can form a bond with the fusion protein of the present invention, for example, in a solution or in a cell, or on the cell surface.
  • the antigen may be complexed with another protein, or may not be complexed with another protein. Observations can usually be made in solution or in cells, or against the antigen bound to the fusion protein of the invention on the cell surface. The observation can be performed under a microscope (for example, a fluorescence microscope and a fluorescence polarization microscope).
  • a microscope for example, a fluorescence microscope and a fluorescence polarization microscope.
  • the fluorescent protein and the antigen-binding protein are bound at a constant rotation angle, and the polarized light of fluorescence is constant with respect to the antigen-binding protein. Therefore, the fusion protein of the present invention can preferably be observed under a fluorescence polarization microscope.
  • the antigen includes animal, plant, bacterial, fungal, and archaeal antigens.
  • Antigens include intracellular antigens, extracellular antigens, and antigens on cell membranes.
  • the antigen may be in free form or some other form. ⁇ 02020/175502 22 ⁇ (:171? 2020/007568
  • the antigen may be a monomer form antigen or a polymer form antigen.
  • the cells may be any of fertilized eggs, pluripotent stem cells, stem cells, progenitor cells, somatic cells, and germ cells (eg, egg cells).
  • the antigen may be a constituent of a component other than cells in an organism, for example, a component of flagella (eg, sperm or microbial flagella).
  • the antigen may be an intracellular skeleton such as actin, microtubule, septin, and intermediate filament.
  • the antigen is an intracellular actin (eg, ⁇ -actin, /3-actin, and ... ⁇ -actin).
  • Microtubule tubulin eg, Tubulin, Tubulin and tubulin
  • septin e.g., septin, and intermediate filaments (eg, keratin, 808 (glial fibrillary acidic protein), vimentin, neurofilament IV!, neurofilament!-, neurofilament 1 ⁇ 1, internexins, lamins 1, lamins 2, lamins 8) and the like.
  • intermediate filaments eg, keratin, 808 (glial fibrillary acidic protein), vimentin, neurofilament IV!, neurofilament!-, neurofilament 1 ⁇ 1, internexins, lamins 1, lamins 2, lamins 8) and the like.
  • antigens include, but are not limited to, myosin (for example, myosin ⁇ , myosin ⁇ , myosin ⁇ , myosin ⁇ V, myosin V, myosin VI ⁇ , and Myosin, such as X, and their heavy chains or light chains), dynein (eg, axonemal dynein and cytoplasmic dynein), kinesin (for example, but not limited to, [ ⁇ 1 18, K ⁇ F] Ba s [ ⁇ 1 1/3 / ⁇ 1 1 0, ⁇ 1 2 8], [ ⁇ ⁇ 3, [ ⁇ ⁇ 4, [ ⁇ ⁇ 5, [ ⁇ ⁇ 13 ⁇ , [ ⁇ ⁇ 1 7, [ ⁇ ⁇ 26 eight, 2 and ⁇ 3, and other kinesins belonging to the kinesin superfamily).
  • myosin for example, myosin ⁇ , myosin ⁇ , myosin ⁇ , myosin ⁇ V, myosin V,
  • the antigens include, but are not limited to, membrane proteins (for example, receptor proteins, ⁇ proteins, ion transporters (ion channels, ion pumps), and transporter proteins).
  • the antigen is not particularly limited, but for example, the Mihoha [3 ⁇ 4 domain protein (8 1 ⁇ 0 2020/175 502 23 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • the antigen is not limited to the above, and may be various biomolecules (eg, proteins, lipids, nucleic acids, hormones, sugars, etc.).
  • the antigen may be, for example, but not limited to, a lipid membrane or a lipid membrane domain ⁇ for example, a lipophilic fluorescent dye or a lipid binding motif may be used ⁇ .
  • components of cells other than the intracellular skeleton may also be observed. For example, in the case of carrying out polarized fluorescence correlation spectroscopy or polarized fluorescence cross-correlation spectroscopy in the present invention, it is possible to evaluate rotational diffusion of components of cells other than the intracellular skeleton.
  • the method for observing an antigen may include fluorescence correlation spectroscopy (03).
  • Fluorescence correlation spectroscopy can include observing the molecular motion of a fluorophore under a microscope (such as a confocal microscope or a two-photon microscope).
  • Fluorescence correlation spectroscopy can include irradiating the fusion protein of the invention with light (eg, laser light) and measuring the fluctuations in fluorescence intensity.
  • Fluorescence correlation spectroscopy may include inverse Fourier transforming the intensity spectrum (temporal spectrum) to obtain temporal autocorrelation.
  • the fluorescence correlation spectroscopy can evaluate the diffusion motion (translational diffusion motion) of the fusion protein of the present invention and the number of molecules in the measurement region.
  • the method of the invention may include determining the diffusion coefficient of the fusion protein of the invention.
  • simultaneous measurement of changes in fluorescence intensity from multiple fluorescent molecules can be used to detect binding between multiple fusion proteins of the present invention.
  • the method for observing an antigen can include, in one aspect, observing fluorescence polarization. Light polarization can be observed under a light polarization microscope. The polarized light can evaluate the rotational diffusion motion of the fusion protein by analyzing its intensity through a polarizing plate.
  • the method of the invention may include determining the radius of gyration of the fusion protein of the invention.
  • the radius of gyration of fluid is the structural fluctuation of the fusion protein of the present invention. Evaluation of the fluctuation of the surrounding microscopic environment, the evaluation of the binding between the fusion protein of the present invention and other proteins, or the plurality of the present invention. It can be used to assess binding between fusion proteins of species.
  • a method for observing an antigen is ⁇ 0 2020/175 502 24 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • the method for observing an antigen comprises: the antigen bound to the first fusion protein which is the fusion protein of the present invention; and the second fusion protein which is the fusion protein of the present invention ⁇ however, Fluorescence wavelengths of the first fusion protein and the second fusion protein are different ⁇ and the second correlation with the second antigen and fluorescence correlation spectroscopy (03) may be included.
  • the method for observing an antigen may include analyzing the simultaneity of fluctuations in fluorescence intensity of two or more antigens (fluorescence cross-correlation spectroscopy (0.33)).
  • fluorescence cross-correlation spectroscopy 0.33
  • two or more fusion proteins of the present invention ie, the first fusion protein, the second fusion protein can be used; Fusion protein may be used, a fourth fusion protein may be further used, and further more fusion proteins of the present invention may be used (provided that the respective fluorescence wavelengths are different.
  • the method for observing an antigen may, in certain embodiments, include observing fluorescence polarization.
  • the fluorescence polarization may be observed under fluorescence polarization microscopy.
  • the advantage of performing fluorescence correlation spectroscopy (03) and fluorescence cross-correlation spectroscopy ((033) under a polarization fluorescence microscope is that it is possible to detect rotational diffusion motion of fluorescence.
  • the method for observing an antigen may further include, in one embodiment, observing fluorescence polarization to detect rotational diffusive movements of the molecule, which is sensitive to changes in particle size.
  • the method for observing an antigen is: It can include assessing the binding status of one or more antigens, and also assessing the binding status of two or more antigens in solution.
  • Polarization observation of fluorescence can be appropriately performed by those skilled in the art using a fluorescence polarization microscope. Polarization can be observed with respect to two or more planes of polarization, including, for example, a first plane of polarization and a second plane of polarization. Polarization is the first plane of polarization and the second ⁇ 02020/175502 25 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • the observation of the fusion protein of the present invention can be performed by super-resolution microscopy.
  • super-resolution microscopy include stimulated emission suppression microscopy.
  • With super-resolution microscopy it is possible to observe an observation object with a resolution below the diffraction limit of light (for example, below 200).
  • fluorescent molecules can be detected as bright spots at the single-molecule level.
  • a vector for intracellular expression which comprises the above nucleic acid.
  • a method for designing an amino acid sequence of a fusion protein which comprises a first amino acid sequence which is an amino acid sequence of an antigen-binding protein and a fluorescent protein.
  • the second amino acid sequence that is the amino acid sequence of the protein, and here, the 1 ⁇ 1 end of the first amino acid sequence and the 0 end of the second amino acid sequence, or the 0 of the first amino acid sequence.
  • Either the terminal or the 1 ⁇ 1 terminal of the second amino acid sequence has a helix structure, or the 1 ⁇ 1 terminal or ((3 terminal ends are partially excised to form a helix structure,
  • the 1 ⁇ 1 end of the first amino acid sequence and the O end of the second amino acid sequence, or the O end of the first amino acid sequence and the 1 ⁇ 1 end of the second amino acid sequence are linked, whereby the connecting point To obtain an amino acid sequence which is part of a helix structure.
  • the fusion protein having the designed amino acid sequence may be suitable for fluorescence polarization observation.
  • truncation of the 1 ⁇ 1 or ⁇ 3 ends does not abolish the binding properties of the antigen binding protein and the fluorescent properties of the fluorescent protein.
  • a method for designing an amino acid sequence of a fusion protein which comprises a first amino acid sequence which is an amino acid sequence of an antigen-binding protein and a second amino acid sequence which is an amino acid sequence of a fluorescent protein.
  • a first amino acid sequence which is an amino acid sequence of an antigen-binding protein
  • a second amino acid sequence which is an amino acid sequence of a fluorescent protein.
  • the 1 ⁇ 1 end of the first amino acid sequence and the O end of the second amino acid sequence, or the O end of the first amino acid sequence and the 1 ⁇ 1 end of the second amino acid sequence are linked, whereby the connecting point And obtaining an amino acid sequence that is part of a /3 sheet structure.
  • the fusion protein having the designed amino acid sequence may be suitable for fluorescence polarization observation.
  • truncation of the 1 ⁇ 1 or ⁇ 3 ends does not abolish the binding properties of the antigen binding protein and the fluorescent properties of the fluorescent protein.
  • a method for designing a fusion protein comprising: ⁇ 0 2020/175 502 27 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • the helix is linked to the 8 1_ 8 tag (8 1_ 8 tag may have, for example, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40 or the amino acid sequence of the corresponding tag). , Thereby obtaining an amino acid sequence in which the ligation site is part of the helix structure.
  • the fusion protein having the designed amino acid sequence can be detected by a fluorescent protein tightly linked to an antigen-binding protein that binds to the 81_8 tag, and can be used for fluorescence polarization observation. Preferably, excising a part of the 1 ⁇ 1 end or (3 terminus does not delete the functional region of the protein.
  • the protein may be an antigen binding protein.
  • the protein may be the protein to be observed.
  • Antigen-binding proteins that bind to the 1_8_8 tag include Nanobodies that bind to the 1_8_8 tag, 30, affimers, and the antigen-binding proteins exemplified above.
  • Examples of the fluorescent protein also include the fluorescent proteins exemplified above, and fusion proteins in which these are linked to each other by a helix structure or /3 sheets (for example, any of the above (he) to (mouth)) Fusion protein which binds to the 8 1_ 8 tag) can be used to detect the 8 1_ 8 tag. It is preferable to have a structure, and it can be a fusion protein in which the helix structure of the 8 1 _ 8 tag is ligated so that the ligation part becomes part of the helix structure.
  • a method comprising obtaining a nucleic acid sequence encoding the fusion protein based on the designed amino acid sequence.
  • a method for producing a nucleic acid having a nucleic acid sequence encoding the designed amino acid sequence can be provided.
  • a nucleic acid having a nucleic acid sequence encoding the designed amino acid sequence (for example, Eight) can be provided.
  • a gene gene containing a nucleic acid having the obtained nucleic acid sequence is also included. ⁇ 0 2020/175 502 28 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • the nucleic acid can be operably linked to a promoter.
  • the resulting gene expression vector can be used for synthesizing a fusion protein having an amino acid sequence designed in a cell by being expressibly introduced into a cell.
  • the fusion protein and the nucleic acid encoding the fusion protein may be useful for fluorescence polarization observation.
  • Example 1 Design and observation of a fusion protein of a circular permutation mutant ⁇ _ _ 5 and an affimer
  • Affimer is a protein derived from stefin or cystatin, and is a protein composed of ⁇ helix and four folded sheet structures in contact with it.
  • the four folded/3 sheets are stabilized by a helix and have a solid tertiary structure. It is known that four /3 sheets form three loops, and amino acids can be introduced into two loops on the same side. It is also known that the introduced amino acid allows the affimer to acquire a selective binding affinity for an antigen such as an antibody. It has also been revealed that techniques such as phage display can be used to design an affimer that exhibits binding affinity for a desired antigen.
  • a 013 helix having a helix (which is considered to be a 3/10 helix) at the 0 end and an affimer having a helix at the end of 1 ⁇ 1 And the 1 ⁇ !-terminal helix were ligated via a helix linker to obtain a fusion protein (see Figure 18).
  • amino acid sequence having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was used as the amino acid sequence having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • an afimer having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 was used as the afimer. This afimer can selectively bind to actin fibers (_actin).
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are linked in-frame via the helix linker having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3,
  • a fusion protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 was designed by.
  • SEQ ID NO: 4 contains an amino acid sequence of ! ⁇ 1 8 tags at the 0 terminus.
  • the designed fusion protein was produced in E. coli and purified, and the obtained fusion protein was crystallized and subjected to X-ray crystal structure analysis. From the obtained X-ray diffraction image, it was revealed that the fusion protein had the crystal structure shown in Fig. 1 ⁇ 3. As shown in Fig. 10, it is clear that the helix at the 0 end and the helix at the 1 ⁇ ! end are linked to form a new helix between 0 13 and the Afimer. Became.
  • the expression vector in which the designed fusion protein-encoding plasmid was placed under an appropriate promoter was introduced by the lipofexcion method (lipofectamine 300 000 reagent) into 1 to 16 !_ 3 cells.
  • the fusion protein was expressed.
  • the cells expressing the fusion protein were observed under a fluorescence polarization microscope.
  • fluorescence polarization anisotropic
  • Affimers are thought to bind to actin filaments in a uniform orientation. This is because actin filaments are polymers composed of repeating actin monomers. The fact that the polarization planes of the fusion protein are aligned means that in the fusion protein
  • Example 2 Circular permutation mutant 11 Design and observation of the insect-protein combination between Li5 and Affimer
  • Example 1 The strategy disclosed in Example 1 was used to couple O P m V 6 nu 3 with Affimer.
  • Affimer The strategy disclosed in Example 1 was used to couple O P m V 6 nu 3 with Affimer.
  • a helix present at the 1 ⁇ 1 end of the affimer were linked in-frame to design a fusion protein.
  • the fluorescent protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 was used.
  • the affimer the same amino acid sequence as in Example 1 was used. ⁇ 0 2020/175 502 31 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 were linked in-frame via alanine (), whereby the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 was linked.
  • a fusion protein of ⁇ 01 6 11 Li 3 and Afimer was designed.
  • SEQ ID NO: 6 contains a 1 to 18 tag amino acid sequence at the 0 terminus.
  • Example 1 The strategy disclosed in Example 1 was used to link ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ i 362 with Afimer.
  • a fusion protein was designed by linking the 3/10 helix at the end and the ⁇ helix> at the 1 ⁇ ] end of the Afimer in frame.
  • a fluorescent protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 was used as the ⁇ I 3 62.
  • the affimer was an affimer having the same amino acid sequence as in Example 1.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 were linked in-frame via alanine (8) by a genetic engineering method, whereby the sequence set forth in SEQ ID NO: 8 was obtained.
  • Example 4 Design and view of fusion protein of fluorescently labeled tag and afimer
  • halo tag is a protein labeling technology that can bind to various fluorescent ligands that are permeable to cell membranes.
  • a halo tag can be introduced into a desired antigen by linking the halo tag and an afimer, but the application to fluorescent polarization observation was attempted by using the strategy disclosed in the above example.
  • Fusion protein (first) ⁇ 0 2020/175 502 33 ⁇ (: 171? 2020/007568
  • halo tag a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 was used.
  • affimer an affimer having the same amino acid sequence as in Example 1 was used.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 were linked in-frame via a helix linker having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, and A fusion protein of halotag and affimer having the amino acid sequence of No. 11 was designed.
  • Halotag has a ⁇ helix structure at the 0 terminus as shown in FIG. In this example, the «end helix and the 1 ⁇ 1 end «helix of the affimer were linked via the above-mentioned helix linker (see Fig. 5).
  • the actin filament bundle whose fluorescence intensity is weakly observed when the plane of observation polarization is horizontal, shows that the fluorescence intensity is strongly observed when the plane of observation polarization is vertical, while It was observed that the actin filament bundle, whose fluorescence intensity was strongly observed when the polarization plane was horizontal, was weakly observed when the observation polarization plane was vertical.
  • the fusion protein obtained by directly linking the «helix existing at the 0-terminal of the halo tag and the «helix existing at the 1 ⁇ !-terminal of the affimer in frame also shows polarization. It was Since it exhibits polarized light, the mutual binding between the fluorescent dye, halo tag, and affimer is fixed in the titer, and it is considered that the binding has little flexibility.
  • a helix is a secondary structure of a protein that winds once with 3.5 amino acids. ⁇ It was confirmed whether the polarization plane rotates by shifting the amino acids between the helices and connecting them (changing the number of turns).
  • a fluorescent protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 was used as the halo tag.
  • An affimer having the same amino acid sequence as in Example 1 was used as the affimer.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 were linked in-frame via the helix linker having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, whereby the SEQ ID NO: A fusion protein of a halo tag having the amino acid sequence described in 13 and an affimer was designed.
  • the length of the helical linker differs from that of the fusion protein shown in Fig. 68 by 1 amino acid (that is, the rotation angle differs by about 100 degrees).
  • the actin filament bundle whose fluorescence intensity is weakly observed when the observation polarization plane is horizontal, shows that the fluorescence intensity is strongly observed when the observation polarization plane is vertical, while It was observed that the actin filament bundle, whose fluorescence intensity was strongly observed when the polarization plane was horizontal, was weakly observed when the observation polarization plane was vertical. From this fact, the fusion protein obtained by directly linking the «helix existing at the 0-terminal of the halo tag and the «helix existing at the 1 ⁇ !-terminal of the affimer in frame also shows polarization. It was ⁇ 0 2020/175 502 35 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • the ⁇ helix existing at the 0-terminal of the halo tag and the ⁇ helix existing at the 1 ⁇ 1 terminal of the affimer can be established as a fluorescence polarization labeling strategy even if the number of turns is changed and linked. Became clear. According to the models disclosed in Fig. 68 and Fig. 6, it is clear that it is possible in principle to freely change the rotation angle of polarized light by changing the number of turns.
  • a fluorescent protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 was used as the halo tag.
  • An affimer having the same amino acid sequence as in Example 1 was used as the affimer.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 were linked in-frame via a helix linker having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, whereby the sequence shown in SEQ ID NO: A fusion protein of a halo tag having the amino acid sequence described in 15 and an affimer was designed.
  • the length of the helical linker differs from that of the fusion protein shown in Fig. 68 by 2 amino acids (that is, the rotation angle differs by about 200 degrees).
  • the binding angle of the affimer with respect to the halo tag is different in the fusion proteins of FIG. 68, FIG.
  • Example 5 Design and observation of fusion protein of circular permutation c p- s f G F P and Nanobody
  • Nanobodies are antibodies that consist only of heavy chains (for example, cartilage of sharks and sharks). Antibodies such as fish, camels, dromedaries, llamas, and alpaca) can bind to the antigen only in the heavy chain variable region, and some are derived from the heavy chain variable region and the light chain variable region.
  • the peptides containing these variable regions have a molecular weight about 10-fold lower than that of ordinary GG antibody (approximately 12 to 15 kDa), and are called Nanobodies. It has also been shown that techniques such as phage display can be used to design Nanobodies that exhibit binding affinity for the desired antigen.
  • sf GFP (superfolder GFP) is a modified form of GFP obtained from Owan jellyfish. It is characterized by rapid structure folding in cells. In this example, it was tried to connect the sf GFP and the Nanobody with 13 sheets. Since Nanobodies have a /S sheet at the C-terminus, a circular permutation mutant with an /S sheet at the N-terminus c p_ sf GFP (details) ⁇ 0 2020/175 502 37 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • a fluorescent protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 was used.
  • As the Nanobody a Nanobody binding to vimentin having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 was used.
  • a fusion protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 was designed by linking it with the 1 ⁇ 3 end of the nanobody that binds to vimentin and having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 ..
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 has 1 to 1 3 tags and D 7 tags at the 1 ⁇ 1 end.
  • Figure 78 shows the predicted fusion protein structural model. In this model, the site where the Nanobody binds to the antigen is in the opposite direction to the fluorescent protein, ensuring accessibility to the antigen.
  • a fluorescence polarization microscope By introducing an expression vector in which the designed fusion protein-encoding lip is placed under an appropriate promoter by the lipofussion method (avalanche-everyday-transfection reagent), The fusion protein was expressed in cells. The cells expressing the fusion protein were observed under a fluorescence polarization microscope. The result was as shown in Fig. 7. As shown in Fig. 7, the vimentin fiber, whose fluorescence intensity is weak when the plane of observation polarization is horizontal, shows strong fluorescence intensity when the plane of observation polarization is strong, while It was observed that vimentin fibers, whose fluorescence intensity was strongly observed when the plane of polarization was horizontal, were weakly observed when the plane of polarization of observation was vertically. Thus, the produced fusion protein was able to stain vimentin fibers, and the fluorescence thereof showed polarization.
  • Example 6 Design and observation of a worm protein with nanobodies and 7 6 — 1 7 2 ⁇ 1 ⁇ / 6 11 5 ⁇ 0 2020/175 502 38 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • a fusion protein (SEQ ID NO: 31; sequence: SEQ ID NO: 16) linked to a vimentin-binding nanobody (SEQ ID NO: 16) and ⁇ 176—172 mV enus (SEQ ID NO: 30) were linked via VV.
  • the amino acid sequence shown in No. 31 has a 1 to 1 I 3 tag and a Ding 7 tag at the 1 ⁇ ! end () (see the upper panel of Fig. 70), and It was expressed in ⁇ 16 !_3 cells.
  • intracellular vimentin could be observed as shown in Fig. 7(3), and the fluorescence thereof showed polarization.
  • the direction of polarization was different from the case of 0 13° above.
  • 0 3 3° of Example 5 and 0 1 7 6-1 7 2 mV enus used in this example are basically However, in this example, it is possible to change the angle of polarization by creating circularly permuted mutants of the fluorescent protein at various positions. It has been shown.
  • Example 7 Design and observation of fusion protein of 800 I 6 and Nanobody
  • the fluorescent protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 was used.
  • a Nanobody binding to vimentin having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 was used.
  • a fusion protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 was designed by linking the ⁇ -terminal / 3 sheet of ⁇ -terminal via a non-flexible linker (“stiff linker”).
  • FIG. 88 shows the expected structural model of the fusion protein. In this model, the site where the Nanobody binds to the antigen is in the opposite direction to the fluorescent protein, ensuring accessibility to the antigen.
  • the fusion protein was expressed in cells.
  • the cells expressing the fusion protein were observed under a fluorescence polarization microscope.
  • the result was as shown in Fig. 8.
  • the vimentin fiber whose fluorescence intensity is weak when the plane of observation polarization is horizontal, shows strong fluorescence intensity when the plane of observation polarization is strong, while It was observed that vimentin fibers, whose fluorescence intensity was strongly observed when the plane of polarization was horizontal, were weakly observed when the plane of polarization of observation was vertically.
  • the produced fusion protein was able to stain vimentin fibers, and the fluorescence thereof showed polarization.
  • Nanobody can be obtained without loss of polarization. It is clear that the fluorescent protein labeling of is possible.
  • Example 8 Design and observation of a fusion protein of ⁇ 13-3 and ⁇ V
  • a fusion protein was obtained by designing a 3/3 sheet structure at the 1 ⁇ 1 end and ligating it with the /3 sheet structure present at the 0 end of 30.
  • 30V is a protein having a structure in which the variable region of the heavy chain and the variable region of the light chain of the antibody are linked by a flexible link.
  • the antibody is produced by a genetic engineering technique, the binding property of the antibody can be maintained.
  • a technique for producing 30 V by phage display is well known, which makes it possible to obtain 30 V having a desired binding property for a desired antigen.
  • the /3 sheet structure at the 1 ⁇ 1 end of the dried spores is directly linked to the (3)/3 sheet structure at the 30 V having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 to form SEQ ID NO: 21
  • a fusion protein having the amino acid sequence described in 1. was designed.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 has 1 to 1 3 tags and D 7 tags at the 1 ⁇ 1 end.
  • the structure is shown in Fig. 9.
  • the antigen recognition site of the fusion protein of 30 V is exposed on the side opposite to the fused _ _ 3 chi, and the accessibility of the antigen to the antigen recognition site is Secured.
  • a fusion protein (SEQ ID NO: 3 2) in which 30 V (SEQ ID NO: 20) and 0 1 7 6-1 7 2 0 16 L3 (SEQ ID NO: 30) were linked via ⁇ ) (See Figure 9 (panel above 3)) and
  • Example 9 Design and observation of fusion protein of Afimer and 303 "I ⁇ 1:
  • the obtained fusion protein is shown by the three-dimensional structural model shown in Fig. 11.
  • the expression vector in which the designed coding site of the fusion protein is located under the appropriate promoter—by the lipofexcion method (lipofectamine 300 000 reagent) the above fusion protein was introduced into 1 to 1 ⁇ !_ 3 cells.
  • Cells expressing the fusion protein were observed under a fluorescence polarization microscope.
  • Example 10 Design and Observation of Fusion Protein of Afimer and 01 6 0 11 ⁇ "6 11 1
  • 01 6 ⁇ 11 ⁇ “Expose the 1/3 sheet at the 1 ⁇ 1 end of 6 6 and connect it to the 3rd sheet at the 0 end of the Afimer to connect it to the Afimer. I got a good fusion quality with. 01 6 ⁇ 11 ⁇ “6 6
  • the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38 which was prepared by incorporating the protein, was used.
  • As the affimer an affimer that binds to actin having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 was used. These were linked by a genetic engineering technique to design a fusion protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 39.
  • the obtained fusion protein is shown by the three-dimensional structural model shown in FIG. In Fig. 12, it can be seen that the 0/3 end sheet of the Afimer and the 1/3 sheet at the end of the 0 16 10 1 ⁇ " ⁇ form a series of 3 sheets.
  • the ribofection method lipofectamine 300 reagent
  • Example 11 1 A method for introducing polarized fluorescence into a protein by introducing an 8!_8 tag into the protein
  • the protein to be observed is labeled with an 8!_8 tag (alpha tag) and is detected with a Nanobody that binds to the 8!_8 tag.
  • an 8!_8 tag (SEQ ID NO: 40) was introduced into an actin-binding affimer (SEQ ID NO: 2), and SEQ ID NO: 4 was introduced.
  • a fusion protein having the amino acid sequence described in 1 was obtained.
  • the three-dimensional structural model of this fusion protein was as shown in Figure 13.
  • This fusion protein was expressed in 1 to 16 !_ 3 IV! cells.
  • anti-8!-8 tag nanobodies (SEQ ID NO: 42) and ⁇ 17 6-1 7 2 ⁇ 16 ⁇ 0 2020/175 502 43 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • the fusion protein (SEQ ID NO: 43) was contacted and fluorescence polarization observation was performed.
  • Example 12 Other Examples
  • fusion proteins shown in Table 1 below were designed and it was confirmed whether fluorescence polarization labeling was possible in the same manner. In each of the following cases, it was confirmed that the antigen could be fluorescently labeled, and the fluorescence clearly showed polarization, so that it could be used as a fluorescent polarization label. Affimer, nanobody, and 30 V could be used as antigen-binding proteins.
  • utrophin is a protein known as a protein that binds to actin.
  • the terminal helix structure of the fluorescent protein or the tag protein to be fluorescently labeled and the terminal helix structure of the antigen-binding protein were It may be effective to ligate and the terminal /3 sheet structure of the fluorescent protein and the terminal /3 sheet structure of the antigen-binding protein.
  • a fluorescent protein having no helix or /3 sheet structure at the end for example, it is a useful protein modification technique to prepare a circularly permuted mutant of a fluorescent protein so as to have a helix or /3 sheet structure at the end.
  • helices may be directly linked to each other or may be linked via a linker having a helix structure.
  • the bond angle between the two protein moieties in the fusion protein can be rotated by about 100 degrees by changing its length by 1 amino acid, It can broaden the strategy of fusion protein production technology.
  • the sheet structures When the sheet structures are linked together, they may be linked directly, may be linked by deleting the ends, or may be linked via a hard amino acid residue such as valine (V). It became clear .
  • V valine
  • SEQ ID NO: 2 an example of an amino acid sequence of an actimer that binds to actin
  • SEQ ID NO: 3 an example of an amino acid sequence of a helix linker
  • SEQ ID NO: 6 ⁇ 01 6 11 An example of the amino acid sequence of the fusion protein of Li3 and afimer ⁇ 0 2020/175 502 46 ⁇ (: 171? 2020 /007568
  • SEQ ID NO: 9 Example of amino acid sequence of halo tag
  • SEQ ID NO: 10 Example of amino acid sequence of helix linker 2
  • SEQ ID NO: 11 of the amino acid sequence of the fusion protein of halo tag and affimer
  • SEQ ID NO: 12 Example of amino acid sequence of helix linker 3
  • SEQ ID NO: 13 of the amino acid sequence of the fusion protein of halo tag and affimer
  • SEQ ID NO: 14 Example of amino acid sequence of helix linker 4
  • SEQ ID NO: 15 of the amino acid sequence of the fusion protein of halotag and affimer
  • SEQ ID NO: 16 Example of amino acid sequence of Nanobody that binds to vimentin
  • SEQ ID NO: 17 Example of amino acid sequence of fusion protein of Nanobody and _ _ 3 _
  • SEQ ID NO: 19 Example of amino acid sequence of fusion protein of Nanobody and Hachijo 6
  • SEQ ID NO: 20 An example of a 30 V amino acid sequence that binds to non-muscle myosin ⁇
  • SEQ ID NO: 21 An example of the amino acid sequence of the fusion protein of ⁇ and ⁇ 13
  • SEQ ID NO: 23 Example of amino acid sequence of helix linker 5
  • SEQ ID NO: 24: 6 Examples of amino acid sequence of the fusion protein of 7_Rei and Afima
  • SEQ ID NO: 25 Fusion protein of Nanobody and XII Quality amino acid sequence example
  • SEQ ID NO: 26 Examples of amino acid sequence of the fusion protein of Nanobody and c PMVE nus
  • SEQ ID NO: 27 Example of amino acid sequence of fusion protein of s c F v and c pmT u r q u o i s e 2
  • SEQ ID NO: 28 H a l ⁇ a I k a n e d e h a I o g e n a se Amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 29 Amino acid sequence of H 27 2 F variant of H a l o a l k a n e d e h a l o g e n a se
  • SEQ ID NO: 30 Example of amino acid sequence of c p 176 — 1 72 mVe n u s
  • SEQ ID NO: 31 Example of fusion protein of Nanobody and c p 1 76-1 72 mV e n u s
  • SEQ ID NO: 32 An example of the amino acid sequence of the fusion protein of s c FV and cp 1 76-1 72mV e n u s
  • SEQ ID NO: 33 Example of amino acid sequence of actin-binding site of utrophin
  • SEQ ID NO: 34 Example of amino acid sequence of mEG F P
  • SEQ ID NO: 35 Example of amino acid sequence of fusion protein of actin-binding site of utrophin and m EG F P
  • SEQ ID NO: 36 Example of amino acid sequence of mS c a r ET fragment with N-terminal truncated
  • SEQ ID NO: 37 Example of amino acid sequence of fusion protein of actin-binding affimer and m S ca r l et
  • SEQ ID NO: 38 Example of amino acid sequence of mN e ⁇ n G r e e n fragment with N-terminal truncated
  • SEQ ID NO: 39 Example of amino acid sequence of fusion protein of actin-binding affimer and mN e on G r e e n
  • SEQ ID NO: 40 Example of amino acid sequence of ALF A tag
  • SEQ ID NO: 41 Example of amino acid sequence of affima into which AL FA tag is introduced ⁇ 02020/175502 48 ⁇ (: 17 2020 /007568
  • SEQ ID NO: 42 An example of amino acid sequence of anti-1_tag nanobody
  • SEQ ID NO: 43 Anti-8 1_8 tag nanobody and ⁇ 1 76-1 72 111

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Abstract

本発明は、抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグタンパク質との融合タンパク質を提供する。　本発明によれば、抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグとの融合タンパク質であって、抗原結合タンパク質は、末端にヘリックス構造またはβシート構造を有する抗原結合タンパク質であり、蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグは、末端にヘリックス構造またはβシート構造を有する蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグであり、当該末端のヘリックスと末端のヘリックスとが連結されている、または当該末端のβシート構造と末端のβシート構造とが連結されている、融合タンパク質などが提供される。

Description

\¥02020/175502 1 ?＜：17 2020 /007568 明 細 書
発明の名称 ：
抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグタンパク 質との融合タンパク質
技術分野
[0001] 本発明は、 抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識される夕 グタンパク質との融合タンパク質に関する。
背景技術
[0002] タンパク質の可視化のために蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグタ ンパク質を標的タンパク質に連結させる技術が開発されている。 これらの技 術は、 標的タンパク質の局在を蛍光顕微鏡下で観察することに用いられる。
[0003] 蛍光は、 偏光を有することが知られている。 例えば、 緑色蛍光タンパク質 である◦ が偏光を有することが開示されている （非特許文献 1） 。 また 、 ◦ をセプチンというタンパク質に連結させてセプチンの偏光を観察し た事例が開示されている （非特許文献 2） 。 非特許文献 2では、 出芽酵母の 細胞分裂面におけるセプチン繊維の配向が時間と共に変化することが、 その 偏光を観察することで初めて明らかになった。
先行技術文献
非特許文献
[0004] 非特許文献 1 : 1 门〇リ 6 6 I 3 I . , 八3, 99 : 4272
-4277, 2002
非特許文献
Figure imgf000003_0001
，
「 6， 28， 466-469, 2006
発明の概要
[0005] 本発明は、 抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識される夕 グタンパク質との融合タンパク質を提供する。
[0006] 本発明者らは、 抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識され \¥0 2020/175502 2 卩（：171? 2020 /007568
るタグタンパク質との融合タンパク質において、 2つのタンパク質のへリッ クス同士を連結させた融合タンパク質、 および/ 3シート同士を連結させた融 合タンパク質を多数得た。 本発明者らは、 得られた融合タンパク質が抗原へ の結合性を保持し、 かつ蛍光の観察に適していることを見出した。 本発明者 らはまた、 得られた融合タンパク質は、 蛍光偏光の観察に適していることを 見出した。
[0007] すなわち、 本発明によれば、 以下の産業上利用可能な発明が提供される。
( 1 ) 抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグとの 融合タンパク質であって、
抗原結合タンパク質は、 末端にヘリックス構造または/ 3シート構造を有す る抗原結合タンパク質であり、
蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグは、 末端にヘリックス構造また は/ 3シート構造を有する蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグであり、 当該末端のヘリックスと末端のヘリックスとが連結されている、 または 当該末端の /3シート構造と末端の /3シート構造とが連結されている、 融合タンパク質。
( 2 ) 抗原結合タンパク質が、 1\1末端にヘリックス構造を有し、
蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグが、 〇末端にヘリックス構造を 有し、
抗原結合タンパク質の末端のヘリックスと蛍光タンパク質または蛍光標識 されるタグの末端のへリックスとが連結されている、 上記 ( 1 ) に記載の融 合タンパク質。
( 3 ) 抗原結合タンパク質が、 アフィマーである、 上記 ( 2 ) に記載の融合 タンパク質。
( 4 ) 蛍光タンパク質が、 ◦ 及び◦ 様の/ 3バレル構造を有する蛍光 タンパク質と点変異体の円順列変異体から選択される <3末端にヘリックス構 造を有する蛍光タンパク質である、 上記 ( 2 ) または ( 3 ) に記載の融合夕 ンパク質。 \¥0 2020/175502 3 卩（：171? 2020 /007568
（5） 抗原結合タンパク質が、 0末端に/ 3シート構造を有し、
蛍光タンパク質が、 1\1末端に/ 3シート構造を有し、
当該＜3末端の/ 3シート構造と 1\1末端の/ 3シート構造とが連結されている、 上記 （1） に記載の融合タンパク質。
（6） 抗原結合タンパク質が、 ナノボディまたは 3〇 Vである、 上記 （5 ） に記載の融合タンパク質。
（7） 蛍光タンパク質が、 ◦ 及び◦ 様の/ 3バレル構造を有する蛍光 タンパク質および点変異体、 並びにこれらの円順列変異体および欠失変異体 からなる群から選択される、 1\1末端に/ 3シート構造を有する蛍光タンパク質 である、 上記 （5） または （6） に記載の融合タンパク質。
（8） 蛍光標識されるタグが、 0末端にヘリックス構造を有する配列番号 9 または 2 9に記載されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するハロ アルカンデハロゲナーゼの脱ハロゲン化ドメインである、 上記 （2） または
（3） のいずれかに記載の融合タンパク質。
（9） 蛍光タンパク質が、 〇末端にヘリックス構造を有するフィ トクロム系 もしくはシアノバクテリオクロム系の近赤外蛍光タンパク質である、 上記 （ 2） または （3） に記載の融合タンパク質。
（1 0） 上記 （1） 〜 （9） のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、 組 成物。
（1 1） 上記 （1） 〜 （9） のいずれかに記載の融合タンパク質をコードす る核酸。
（1 2） 上記 （1 1） に記載の核酸を含み、 前記核酸は、 制御配列に作動可 能に連結したものである、 細胞内で融合タンパク質を発現させることに用い るための遺伝子発現べクター、 または当該べクターで形質転換された細胞、 もしくは
Figure imgf000005_0001
八を導入された細胞。
（1 3） 抗原の観察方法であって、
上記 （1） 〜 （9） のいずれかに記載の融合タンパク質と結合した抗原を 観察することを含む、 方法。 \¥0 2020/175502 4 卩（：171? 2020 /007568
（1 4） 抗原が、 水溶液内または細胞内、 もしくは細胞表面の抗原である、 上記 （1 3） に記載の方法。
（1 5） 上記 （1 3） または （1 4） に記載の方法であって、
上記 （1） 〜 （9） のいずれかに記載の融合タンパク質である第一の融合 タンパク質と結合した第一の抗原と、
上記 （1） 〜 （9） のいずれかに記載の融合タンパク質である第二の融合 タンパク質 ｛但し、 第一の融合タンパク質と第二の融合タンパク質の蛍光波 長は異なる｝ と結合した第二の抗原と
のそれぞれを観察することを含む、 方法。
（1 6） 上記 （1 5） に記載の方法であって、
第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質の蛍光相関分光、 及び 虽光相互相関分光を実施することを含む、 方法。
（1 7） 蛍光相関分光、 及び蛍光相互相関分光が、 偏光蛍光相関分光である 、 上記 （1 6） に記載の方法。
（1 8） 融合タンパク質のアミノ酸配列を設計する方法であって、 抗原結合タンパク質のアミノ酸配列である第一のアミノ酸配列と蛍光タン パク質のアミノ酸配列である第二のアミノ酸配列を用意することと、 ここで 、 第一のアミノ酸配列の 1\1末端および第二のアミノ酸配列の〇末端、 または 、 第一のアミノ酸配列の〇末端および第二のアミノ酸配列の 1\1末端が、 共に ヘリックス構造であるか、 共に/ 3シート構造であるか、
Figure imgf000006_0001
の一部を切除することで共にヘリックス構造となるものであるか、 1\1末端ま たは〇末端の一部を切除することで共に/ 3シート構造となるものであり、 第一のアミノ酸配列の 1\!末端および第二のアミノ酸配列の〇末端、 または 、 第一のアミノ酸配列の〇末端および第二のアミノ酸配列の 1\1末端を連結し 、 これによって、 連結箇所がヘリックス構造または/ 3シート構造の一部とな るアミノ酸配列を得ることとを含む、 方法。
（1 8八） 得られたアミノ酸配列をコードする核酸を得ることを含む、 上記
（1 8） に記載の方法。 \¥0 2020/175502 5 卩（：171? 2020 /007568
（1 8巳） プロモーターに作動可能に上記 （1 8 ） において得られた核酸 を連結することを含む、 当該核酸を発現させるための遺伝子発現べクターを 製造する方法。
（1 8〇 上記 （1 8） に記載の方法によって得られるアミノ酸配列。
（1 8 0） 上記 （1 8 ） に記載の方法によって得られる核酸。
（1 8巳） 上記 （1 8巳） に記載の方法によって得られる遺伝子発現べクタ 図面の簡単な説明
［0008］ ［図 1八］図 1 八は、 本発明の融合タンパク質における 2つのタンパク質の連結 方法 （ヘリックス同士の連結方法） を図解するものである。
［図 ］図 1 巳は、 それぞれのタンパク質の結晶構造から推定して得た〇 _
3 干〇 とアフイマーとの融合タンパク質の立体構造モデルを示す。
［図 1（：］図 1 〇は、 〇 一 3 干 0 ？とアフイマーとの融合タンパク質の結晶 構造解析結果を示す。
［図 2］図 2は、 蛍光タンパク質が〇 _ 3 干◦ であり、 アフイマーがアク チンに結合するアフイマーである本発明の融合タンパク質を発現した細胞を 蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
［図 3］図 3は、 蛍光タンパク質が〇
Figure imgf000007_0001
アフイマーがアク チンに結合するアフイマーである本発明の融合タンパク質を発現した細胞を 蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
［図 4］図 4は、 虽光タンパク質が〇 〇1丁リ 「 リ 〇 丨 3 6 2であり、 アフイ マーがアクチンに結合するアフイマーである本発明の融合タンパク質を発現 した細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
［図 5］図 5は、 蛍光標識されるタグがハロタグであり、 アフイマーがアクチン に結合するアフイマーである本発明の融合タンパク質の連結方法を図解する ものである。
［図 6八］図 6八は、 ハロタグとアクチンに対するアフイマーとの融合タンパク 質の立体構造モデルと、 この融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微 \¥0 2020/175502 6 卩（：171? 2020 /007568
鏡下で観察した結果を示す。
［図 68］図 6巳は、 ハロタグとアクチンに対するアフィマーとの融合タンパク 質の立体構造モデルと、 この融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微 鏡下で観察した結果を示す。 図 6八とは、 連結箇所のへリックスの巻き数が 異なる。
［図 6（：］図 6〇は、 ハロタグとアクチンに対するアフィマーとの融合タンパク 質の立体構造モデルと、 この融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微 鏡下で観察した結果を示す。 図 6 および図 6巳とは、 連結箇所のへリック スの巻き数が異なる。
［図 7八］図 7八は、 〇 一 3 干◦ とナノボディとの融合タンパク質の連結 方法を図解するものである。
［図 78］図 7巳は、 図 7八の連結方法で連結した〇 一 3 干◦ とビメンチ ンに結合するナノボディとの融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微 鏡下で観察した結果を示す。
［図 7（：］図 7（3は、 図 7 と同様の連結方法で連結した、 ビメンチンに結合す るナノボディと〇 1 7 6— 1 7 2〇1 \/ 6 11リ 3との融合タンパク質を発現 する細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
［図 8八］図 8八は、 八 丨 6とナノボディとの融合タンパク質の連結方法 を図解するものである。
［図 88］図 8巳は、 図 8八の連結方法で連結した 八 丨 6とビメンチンに 結合するナノボディとの融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微鏡下 で観察した結果を示す。
［図 9八］図 9八は、 〇 一 3 干〇 と 3〇 との融合タンパク質の連結方 法を図解するものである。
［図 98］図 9巳は、
Figure imgf000008_0001
と非筋ミオ シン I I に結合する 3〇 Vとの融合タンパク質を発現する細胞を蛍光偏 光顕微鏡下で観察した結果を示す。
［図％］図 9〇は、 図 7〇と同じ連結方法で連結した、 ミオシンに結合する 3 \¥0 2020/175502 7 卩（：171? 2020 /007568
〇 と〇 1 7 6— 1 7 2〇1 \/ 6 11リ 3との融合タンパク質を発現する細 胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
［図 10］図 1 0は、 表 1 に記載のユトロフィンのアクチン結合部位と 01巳〇 との融合タンパク質 （配列番号 3 5） の立体構造モデルと、 当該融合タン パク質を発現する細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
［図 1 1］図 1 1は、 アクチンに結合するアフィマーと 01 3 0 8 「 丨 ㊀ との融 合タンパク質の 3次元構造モデルと、 当該融合タンパク質を用いて細胞を蛍 光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
［図 12］図 1 2は、 アクチンに結合するアフィマーと〇1 6〇 1^〇 「㊀㊀门と の融合タンパク質の 3次元構造モデルと、 当該融合タンパク質を用いて細胞 を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
［図 13］図 1 3は、 八 !_ 八タグに結合するナノボディと〇 1 7 6 - 1 7 2 m V e n u 3との融合タンパク質の 3次元構造モデルと、 当該融合タンパク 質と、 アフィマーと八 !_ 八タグとの融合タンパク質 （すなわち、 アクチン に結合するアフィマーの 1\!末端のアルファヘリックスを削り、 アルファヘリ ックスを連続させる形で八 !_ 八タグ配列をつないだ融合タンパク質） を共 発現させた細胞を蛍光偏光顕微鏡下で観察した結果を示す。
［図 14］図 1 4は、 八 !_ 八タグを連結させたアクチンに結合するアフィマー の 3次元構造モデルを示す。 図中、 八!_ 八タグは、 暗いグレーで示され、 アフィマーは、 明るいグレーで示されている。
発明の詳細の説明
［0009］ 本明細書では、 「抗原結合タンパク質」 とは、 ある特定の物質に結合する タンパク質を意味する。 抗原結合タンパク質は、 改変されたタンパク質もし くは非天然のタンパク質またはその抗原結合性断片であり得る。 抗原結合夕 ンパク質としては、 アミノ酸配列を改変することによって抗原に対する結合 親和性を付与でき、 かつ、 1\1末端もしくは（3末端の/ 3シート構造またはヘリ ックス構造を有するタンパク質 （例えば、 スキヤフォルドタンパク質） であ る限り特に限定されないが例えば、 抗体、 抗体の抗原結合断片 （例えば、 3 c F v） 、 ラクダやラマの重鎖抗体の単鎖可変ドメイン （VHHドメイン） （ 例えば、 ナノボディ （商標） ） 、 細菌のアルブミン結合ドメインを基本骨格 とするスキヤフォルドタンパク質 （例えば、 ABD （商標） ） 、 ヒトフィブ ロネクチンの 1 〇番目のドメインを基本骨格とするスキヤフォルドタンパク 質 （例えば、 アドネクチン （Ad n e c t i n （商標） 、 F i n g R （商標 ） またはモノボディ （商標） ） ） 、 ブドウ球菌タンパク質 Aの Zドメインを 基本骨格とするスキヤフォルドタンパク質 （例えば、 アフィボディー （A f f i b o d y （商標） ） ） 、 ヒトアーB-クリスタリンを基本骨格とするス キヤフォルドタンパク質 （例えば、 アフィリン （A f f i 丨 i n （商標） ）
） 、 古細菌の D N A結合タンパク質 S a c 7 dを基本骨格とするスキヤフォ ルドタンパク質 （例えば、 アフィチン （A f f i t i n （商標） ） ） 、 三重 逆平行へリックスを基本骨格とするスキヤフォルドタンパク質 （例えば、 ア ルファボディ （A I p h a b o d y （商標） ） ） 、 ヒトまたは昆虫のリポカ リンを基本骨格とするスキヤフォルドタンパク質 （例えば、 アンチカリン （ A n t i c a 丨 i n （商標） ） ） 、 アルマジロタンパク質を基本骨格とする スキヤフォルドタンパク質 （例えば、 アルマジロリピートタンパク質） 、 ヒ 卜 C型レクチンドメイン CT L D3を基本骨格とするスキヤフォルドタンパク 質 （例えば、 アトリマー （A t r i m e r （商標） ） ） 、 重合化 L D L R - Aモジユールを基本骨格とするスキヤフォルドタンパク質 （例えば、 アビマ - （A V i m e r （商標） ） ） 、 ヒトテネイシン Cの F n 3 ドメインを基本 骨格とするスキヤフォルドタンパク質 （例えば、 センチリン （C e n t y r i n （商標） ） ） 、 ヒト F y nチロシンキナーゼの S H 3 ドメインを基本骨 格とするスキヤフォルドタンパク質 （例えば、 フィノマー （F y n〇 m e r （商標） ） ） 、 ヒト B PT I /LAC I -D 1 / I T I -D 2/A P P I を 基本骨格とするスキヤフォルドタンパク質 （例えば、 クニッツドメイン （k n i t z d om a i n （商標） ） ） 、 バイロバキユラム エロフィルムの アスパルチル t R N A合成酵素の〇 B形状を基本骨格とするスキヤフォルド タンパク質 （例えば、 才ーボディー （O b o d y （商標） ） ） 、 ヒトフィブ ロネクチン 丨 丨 丨の 1 4番目の細胞外ドメインを基本骨格とするスキヤフォ ルドタンパク質 （例えば、 プロネクチン （P r〇 n e c t i n （商標） ） ）
、 無顎類の可変リンパ球受容体のロイシンリッチリピートモジュールを基本 骨格とするスキヤフォルドタンパク質 （例えば、 レべボディ （R e p e b o d y （商標） ） ） 、 ヒトアンキリンリピートタンパク質を基本骨格とするス キヤフォルドタンパク質 （例えば、 DAR P i n （商標） ） 及びステフィン Aまたはシスタチンを基本骨格とするスキヤフォルドタンパク質 （例えば、 アフィマー （商標） ） が挙げられ （S k r l e c, K. e t a I . , 「 r e n d s i n B i o t e c h n o l o g y, V〇 I . J J , N o. 7 : 408— 4 1 8, 201 5） 、 これらのタンパク質の N 末端もしくは C末端の/ Sシート構造またはヘリックス構造が本発明の融合夕 ンパク質における連結に用いられ得る。 上記のスキヤフォルドタンパク質に おいて、 抗原への結合親和性に関与するアミノ酸の存在部位は、 周知であり 、 当該部位のアミノ酸に関して、 リボソームディスプレイやファージディス プレイによって抗原への結合に適したものを選択することによって、 所望の 抗原結合特性を有するスキヤフォルドタンパク質を得ることができる。 その 他、 抗原結合タンパク質としては、 N末端または C末端にヘリックスまたは /Sシートを有する抗原結合タンパク質は、 本発明において蛍光タンパク質と の融合タンパク質において用いることができる。 スキヤフォルドタンパク質 とは、 パラトープを保持する （特にその立体形状を保持する） 機能を有する 、 親タンパク質 （改変前のタンパク質） と 3次構造において類似した骨格を 有するタンパク質をいう。 基本骨格とは、 スキヤフォルドタンパク質におい て、 意図された改変部位 （例えば、 パラトープ） 以外の部分を意味する。 パ ラトープとは、 抗原結合タンパク質において、 抗原と結合する部分を意味す る。
[0010] 本明細書では、 「蛍光タンパク質」 とは、 短波長の電磁波を照射すること によって、 そのエネルギーを吸収して電子が励起し、 これが基底状態に戻る 際に、 より長波長の電磁波を放出するタンパク質をいう。 蛍光タンパク質に \¥0 2020/175502 10 卩（：171? 2020 /007568
は、 可視光を放出する蛍光タンパク質、 および近赤外光を放出する近赤外蛍 光タンパク質が挙げられる。 蛍光偏光観察に適する蛍光タンパク質は、 蛍光 偏光観察に好ましく用いられ得る。 蛍光偏光観察に適する蛍光タンパク質お よび蛍光偏光観察に適さない蛍光タンパク質は、 単なる蛍光観察に用いられ 得る。
[001 1 ] 本明細書では、 「アフィマー」 （八干 干 丨 01 6 〇 とは、 生物学的に不活 性であり、 物理的に安定なステフィン八またはシスタチンの改変体を基本骨 格として有するタンパク質であり、 当該基本骨格が有する 4本の/ 3シート構 造から同一側に提示される 2つのループに抗原結合部位を有するタンパク質 である。 前記ループ部分のアミノ酸配列に多様性を持たせることができる。 そして、 前記ループ部分のアミノ酸配列に多様性を持たせることによって、 様々な抗原に対する結合性を有するアフィマーを取得することがファージデ ィスプレイによって可能となっている。 アフィマーの基本骨格としては、 例 えば、 0 2 0 0 9 / 1 3 6 1 8 2において開示された配列番号 1 に対応す るアミノ酸配列を有するステフィン八の改変体を用いることができ、 ステフ ィン八の 4番目のグリシンがアルギニンで置換されていてもよいステフィン 八の改変体は当該基本骨格が有する 4本の/ 3シート構造から同一側に提示さ れる 2つのループ （例えば、 ステフィン八の 4 6〜 5 4番目のアミノ酸部位 および 6 7〜 8 4番目のアミノ酸部位） に異種アミノ酸配列を有するタンパ ク質である。 アフィマーは、 1\1末端に《ヘリックス構造を有する。 アフィマ —はまた、 植物由来のシスタチンを基本骨格として有するタンパク質であり 得、 当該基本骨格が有する 4本の/ 3シート構造から同一側に提示される 2つ のループに抗原結合部位を有するタンパク質である場合もある。 シスタチン を基本骨格とするアフィマーとしては、 例えば、 \^/〇2 0 1 4 / 1 2 5 2 9 0において開示された配列番号 1〜 6のいずれか 1つの配列が挙げられる。 アフィマ _の分子童は、
Figure imgf000012_0001
り得る。
[0012] 本発明では、 「ナノボディ」 とは、 抗体が重鎖と軽鎖とからなるのに対し て、 ある種の動物において発見された重鎖のみからなる抗体の可変領域ドメ \¥0 2020/175502 1 1 卩（：171? 2020 /007568
インに基づく抗原結合タンパク質である。 この重鎖のみからなる抗体は、 ヒ トコブラクダ、 フタコブラクダ、 ラマ、 およびアルパカに共通して見られる 抗体であり、 上記重鎖の可変領域ドメインのみで抗原に結合することができ る。 近年では、 軟骨魚類 （サメ等） においても類似した重鎖のみからなる抗 体が発見されている。 ナノボディは、
Figure imgf000013_0001
を有 し、 この 3つの 0 0 で抗原と結合する。 ナノボディは、 上記の重鎖のみか らなる抗体を産生する動物を抗原で免疫し、 免疫された動物から巳細胞を単 離し、 可変領域を含む〇
Figure imgf000013_0002
八ライブラリを得て、 1\/1 1 3ファージを用いた ファージディスプレイライブラリに組み込み、 抗原でスクリーニングするこ とによって得ることができる。 ナノボディは、 1\1末端および（3末端に、 本発 明で蛍光物質を接続できる/ 3シート構造を有する。 本発明では、 ナノボディ の 末端および/または〇末端の 0シート構造、 例えば、 〇末端の 0シート 構造を蛍光タンパク質や蛍光標識されるタグの/ 3シート構造と連結させるこ とができる。
[0013] 本明細書では、
Figure imgf000013_0003
」 は、 抗体の重鎖可変領域 （ 〇 と軽鎖可変領 域 （V とをフレキシブルなペプチドリンカーで連結した単鎖の抗原結合夕 ンパク質である。 重鎖可変領域と軽鎖可変領域とで抗原認識をすることによ って元となる抗体の抗原特異性を保持しながら、 重鎖可変領域と軽鎖可変領 域との会合を促進するためにフレキシブルなリンカーによって両者を接続し たものである。 フレキシブルなリンカーは、 3〇 Vと抗原との会合状態等 に応じて自由に構造を変化させることができるものが用いられ、 例えば、 約 1 5アミノ酸のグリシンリッチな配列 （例えば、 親水性を確保するためにセ リンが揷入されることがある） が好ましく用いられ得る。 フレキシブルなリ ンカーとしては、 例えば、 一
Figure imgf000013_0004
3 -のアミノ酸配列を有するリン 力一が用いられ得る。 3〇 Vは、 フレームワーク配列を有する 3〇 V （ 例えば、 ヒトなどの哺乳動物のフレームワーク配列） の抗原結合部位をラン ダム化したファージライブラリーから所望の抗原結合性を有することを指標 として選択して得ることができる。 3〇 は、 ！\!末端および（3末端に本発 明で蛍光物質を接続できる/ sシート構造を有する。 本発明では、 s c F vの N末端および/または C末端の 0シート構造、 例えば、 C末端の /Sシート構 造を蛍光タンパク質や蛍光標識されるタグの/ Sシート構造と連結させること ができる。
[0014] 本明細書では、 「DAR P i n」 とは、 Mo l e c u l a r p a r t n e r s AG社が開発した抗原結合タンパク質である。 DAR P i nは、 ア ンキリン反復単位 （通常、 2〜 30個程度） を有する人エタンパク質であっ て、 各反復単位は骨格残基および標的相互作用残基を含む （例えば、 W02 002/020565参照） 。 アンキリン反復単位は、 2つの逆平行 aヘリ ックスとそれに続く /Sヘアピン ｛ここで/ Sペアピンは次の反復単位に結合す るループを有する｝ からなる共通の折りたたみ構造を有する。 アンキリン反 復単位が積み重なることで、 DAR P i nは、 湾曲した構造を形成する。 標 的相互作用残基は、 アンキリン反復単位の/ Sヘアピンおよび第一の aへリッ クスの露出した部分に存在し得る。 DAR P i nは、 抗原に対する結合性に 基づいて選択することにより得ることができる。 DAR P i nは、 例えば、 ファージディスプレイ、 リポソームディスプレイ、 プラスミ ドディスプレイ などの方法を用いて得ることができる。 DAR P i nは、 末端に aヘリック スおよび他端に/ Sシートを有し、 本願発明で、 蛍光物質を接続する部位を提 供する。
[0015] 本明細書では、 「モノボディ」 とは、 F i n g Rまたはアドネクチン （A d n e c t i n） とも呼ばれ、 ヒトフィブロネクチンの 1 〇番目のドメイン （フィブロネクチン 丨 丨 丨型ドメイン） を基本骨格とするスキャフォルドタ ンパク質である。 このドメインは、 抗体の可変ドメインと同様の構造を有し 、 すなわち、 /Sサンドイッチを形成する 7本の/ Sシート構造と 3つの相補性 決定領域に対応する 3つのループを両側に有する。 抗原への結合特異性は、
2本目と 3本目の/ Sシートの間のループ B C、 4本目と 5本目の/ Sシートの 間のループ D E、 および 6本目と 7本目の/ Sシートの間のループ F Gのアミ ノ酸配列によって改変し得る。 あるいは、 3本目と 4本目の/ Sシートの間の \¥0 2020/175502 13 卩（：171? 2020 /007568
ループ〇〇および 6本目と 7本目の/ 3シ _卜の間のル _プ ◦に加えて 3本 目、 4本目、 6本目および 7本目の/ 3シートへのアミノ酸配列によって改変 し得る。 モノボディは、 1\1末端および（3末端に/ 3シートを有し、 蛍光物質を 接続する部位を提供し得る。
[0016] 本明細書では、 「あるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する」 と は、 当該アミノ酸配列に加えて、 そのアミノ酸配列に対応する同じ機能を保 持したアミノ酸配列を有するものを包含する意味で用いられる。 例えば、 種 間で配列が異なる場合、 特定の種のアミノ酸配列だけでなく、 近縁の種にお ける同じ機能を保持したアミノ酸配列は、 前記特定の種のアミノ酸配列を類 似性の高いアミノ酸配列を有する。 「あるアミノ酸配列に対応するアミノ酸 配列を有する」 とは、 このようなそのアミノ酸配列に対応する同じ機能を保 持したアミノ酸配列を有することを意味し得るものである。 例えば、 タンパ ク質では、 当該あるアミノ酸配列を有するタンパク質と才ーソログの関係を 有する他の種のタンパク質を意味し得る。
[0017] 本発明では、 蛍光タンパク質が有する <3末端のへリックス構造 （例えば、
«ヘリックス、 3 / 1 0ヘリックス） とアフィマーが有する 1\!末端のへリッ クス構造を連結することができる。 連結された 2つのへリックスは、 一つの 大きなヘリックス構造を形成し得るが、 本発明の融合タンパク質は、 このよ うにして連結された蛍光タンパク質とアフィマーとの融合タンパク質を提供 し得る。 連結は、 ヘリックス構造同士を直接的に結合することによって行っ てもよいし、 またはリンカーを介して行ってもよい。 リンカーとしては、 例 えば、 ヘリックス構造を有するリンカー （ヘリックスリンカー） を用いるこ とができる。 ヘリックス構造同士を連結させる場合には、 ヘリックス構造の 長さ、 および/またはヘリックスリンカーの長さを調整することによって、 蛍光タンパク質と抗原結合性タンパク質との結合角を調整することが可能と なる。 ヘリックスリンカーとしては、 特に限定されないが例えば、 配列番号 3、 1 0、 1 2、 1 4、 および 2 3のいずれかに記載のアミノ酸配列を有し うる。 [0018] 本発明では、 蛍光タンパク質が有する N末端の/ Sシート構造とナノボディ または s c F Vが C末端に有する/ Sシート構造を連結することができる。 連 結された 2つの/ Sシートは、 1つの大きな/ Sシート構造を形成し得るが、 本 発明の融合タンパク質は、 このようにして連結された蛍光タンパク質とナノ ボディまたは s c F Vとの融合タンパク質を提供する。 連結は、 /3 -シート 同士を直接的に結合することによって行ってもよいし、 またはリンカーを介 して行ってもよい。 リンカーとしては、 例えば、 /Sシート構造を有するリン 力一を用いるか、 または 1 もしくは 2〜数個のバリン （V） などの構造的に フレキシブルではないアミノ酸をリンカーとして用いることができる。
[0019] C末端にヘリツクス構造を有する蛍光タンパク質としては、 G F Pの円順 列変異体 （C PG F P） が用いられ得る。 G F Pの改変体蛍光タンパク質が 各種知られている。 円順列変異体蛍光タンパク質とは、 タンパク質の N末端 と C末端をリンカーを介してまたは介さずに連結し、 他の適当な部分で 2分 することによって、 N末端と C末端の配列の位置を変更させた変異体である 。 円順列変異体は、 N末端および C末端が立体構造上で近傍に位置している ことが重要な条件となり得るが、 多くの蛍光タンパク質がこの条件を満たし 、 円順列変異体による蛍光タンパク質の改変は、 標準的な蛍光タンパク質の 改変技術となっている。 本発明では、 円順列変異体により、 C末端にへリツ クス構造を有する蛍光タンパク質がアフィマーとの融合タンパク質の作製に 用いられ得る。 本発明ではまた、 円順列変異体により、 N末端に/ Sシート構 造を有する蛍光タンパク質が、 ナノボディまたは s c F Vとの融合タンパク 質の作製に用いられ得る。
[0020] G F Pの改変体蛍光タンパク質 ｛より具体的には、 例えば、 G F P G
F P様の/ Sバレル構造を有する蛍光タンパク質 （すなわち、 G F P様タンパ ク質） とその点変異体、 もしくはこれらの円順列変異体が挙げられる｝ とし ては例えば、 s u p e r f o l d e r G F P （s f G F P） 、 EG F P 、 C i t r i n e、 Ve n u s、 mVe n u s、 Y F P、 mA p p l e、 m 〇 r a n g e、 mC h e r r y、 B F P、 T a g B F P、 mT u r q u o i \¥02020/175502 15 卩（：171? 2020 /007568
Figure imgf000017_0001
リ 01、 013〇 3 「 1 6 1：、 01 6 〇 门〇 「 6 6 |·!、 01 6 1： リ 11 6および 1\1 丨 「 などの◦ 様蛍光タンパク質、 並びにこれらの改変体蛍光タン パク質の円順列変異体 （例えば、 〇末端にヘリックス構造を有する円順列変 異体である蛍光タンパク質；タンパク質名の接頭辞として表記 “
Figure imgf000017_0002
” を 付与することにより、 当該タンパク質が円順列変異体であることが明示され る） を用いることができる。 ◦ の改変体蛍光タンパク質としては、 /3バ レルを構成する/ 3シートの順番を交換した置換体や、 / 3シートの数を減らし た/ 3バレル構造をもつ蛍光タンパク質が多数知られており、 これらは本発明 の融合タンパク質に用い得る。 0末端にヘリックス構造を有する蛍光タンパ ク質としては、 01丁リ 「 9リ 1 〇 36の円順列変異体 （〇 01丁リ 「 9リ〇 1 36） を用いることができる。 01丁リ 「 リ I 056は、 1\1末端にへリッ クス構造を有するため、 円順列変異体である <3末端にヘリックス構造を有す る〇 01丁 リ 「 リ I 036を用い得る。 01丁リ 「 リ I 036としては、
Figure imgf000017_0005
および 01丁
Figure imgf000017_0003
丨 036 - 1 463, 並びにこれらの改変体蛍光タンパ ク質が知られ、 これらからなる群から選択される 1以上を <3末端にヘリック ス構造を有する円順列変異体に変換して用いることができる。 これらのタン パク質の結晶構造は、 例えば、 P r o t e i n 0 a t a B a n k （9 06） において公開されており、 これらのタンパク質の 1\1末端もしくは〇末 端に存在する/ 3シート構造またはへリックス構造を、 本発明の融合タンパク 質の連結のために用いることができる。
本発明で用いられる〇末端にヘリックス構造を有する
Figure imgf000017_0004
と しては、 〇末端にヘリックス構造を有する限り特に限定されないが、 例えば 、 配列番号 1のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する〇 _ 3 干◦ を用いることができる。
[0021] C末端にヘリックス構造を有する蛍光タンパク質としては、 フィ トクロム 系の近赤外蛍光タンパク質が挙げられる。 フィ トクロム系の近赤外蛍光タン パク質としては、 i R F Pおよび m i R F Pが挙げられる。 i R F Pは、 h o d o p s e u d omo n a s p a l u s t r i sの/、クテリオフィ トク ロム R p B p h P 2の PAS ドメインおよび G A F ドメイン (PAS-GA F) を含み、 ピリべルジン 丨 X aを取り込むことで近赤外の蛍光を発し、 二 量体化に必要な C末端の aヘリックスを欠き、 かつ、 S 1 3 L、 A92 T、 V 1 04 I、 V 1 1 4 I、 E 1 6 1 K、 Y 1 93 K、 F 1 98Y、 D 202 T、 1 203 V、 Y258 F、 A283V、 K288T、 および N 290 Y の変異を有する (F i I o n o v e t a I . , N a t . B i o t e c h n o l . , 29 (8) : 757 - 76 1 , 201 1参照) 。 m i
R F Pは、 R h o d o p s e u d omo n a s p a l u s t r i sのバクテ リオフィ トクロム R p B p h P Iの PAS ドメインおよび G A F ドメイン ( P AS-GA F) を含み、 ピリべルジン 丨 X aを取り込むことで近赤外の蛍 光を発し、 二量体化に必要な C末端の aヘリックスを欠き、 かつ、 各種変異 を有する (S h c h e r b a k o v a DM e t a I . , N a t u r e Comm u n i c a t i o n, 7 , A r t i c l e n u m b e r : 1 2405, 201 6参照) 。 m i R F Pとしては、 特に限定されな いが例えば、 m i R F P 670 (e x c i t a t i o n/e m i s s i o n a t 642/670 n m) 、 m i R F P 709 (e x c i t a t i o n/e m i s s i o n a t 683/709 n m) 、 および m i R F P 703 (e x c i t a t i o n/e m i s s i o n a t 673/ 703 n m) 、 並びにこれらの m i R F Pから誘導された m i R F Pが挙 げられる。 m i R F P 670は、 例えば配列番号 22に記載のアミノ酸配列 に対応するアミノ酸配列を有し得る。 これらのフィ トクロム系の近赤外蛍光 タンパク質は、 G A F ドメインの C末端にヘリックス構造を有し、 アフィマ —との融合タンパク質の作製に用いられ得る。 また、 N o s t o c p u n \¥02020/175502 17 卩（：171? 2020 /007568
〇 I I 干〇 「 01㊀由来のシアノバクテリオクロム [¾3784の〇八 ド メインに由来する、
Figure imgf000019_0001
例えば 1 R F P 670 n a n oも本発明 の融合タンパク質の作製に用いられ得る。
Figure imgf000019_0002
R F P 670 n a n oとして は、 3784の◦八 ドメインに、 71\/1, 25〇， 1\/126
Figure imgf000019_0003
51 丁 571 丨 72丫， 0821\1, 1~187丫， N 99 1 , 】 ] ? !·!, 〇 1 1 91_, 1_ 1 36〇， 〇 1 39 Vの 1 8個の変異を 導入したものを用いることができる。 m i R F P 670 n a n oは、 1\1末端 にヘリックス構造を有し、 本発明において蛍光タンパク質との連結に用いる ことができる。
[0022] (3末端にヘリックス構造を有する蛍光標識されるタグタンパク質としては
、 ロドコッカス属細菌のハロアルカンデハロゲナーゼの脱ハロゲン化ドメイ ンに由来する改変タンパク質が挙げられる。 ハロアルカンデハロゲナーゼの 脱ハロゲン化ドメインでは、 活性中心の八 3 1 06付近にリガンドが揷入 されるポケッ トを有する。 このポケッ トにリガンドが有する基一 1~1—〇1~12 〇1~12—〇一〇1~12〇1_12—〇一 (01~12) 6—〇 丨が挿入される。 リガンドを虽 光物質とし、 これに基一 1\] 1~1-〇1~12〇1~12-〇一〇1~12〇1~12-〇一 (〇1~12) 6 - 0 I を導入することにより、 上記タグを付与したタンパク質に蛍光物質が 結合することができるようになる。 このような目的に用い得るハロアルカン デハロゲナーゼの脱/ \ロゲン化ドメインとしては、 脱ハロゲン化酵素活性を 喪失したハロアルカンデハロゲナーゼの脱/、ロゲン化ドメインが挙げられ、 例えば、 活性中心のヒスチジンがフエニルアラニンに変換された活性変異体 (1~1272 ) を用いることができ、 例えば、 配列番号 9または 29に記載 のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する脱/ヽロゲン化ドメインが挙 げられる。 このハロアルカンデハロゲナーゼの脱ハロゲン化ドメインは、 〇 末端に《ヘリックスを有している。 リガンドと当該脱ハロゲン化ドメインと の結合は、 偏光観察に適する。 本発明では、 ハロアルカンデハロゲナーゼの 脱ハロゲン化ドメインおよびその活性変異体の蛍光偏光観察における使用が 提供され得る。 リガンドに用いられ得る蛍光物質としては、 クマリン、 オレ ゴングリーン、 d i A c F AM、 テトラメチルローダミン (TM R) 、 S T E L LA F l u o r 650、 ST E L LA F l u o r 700、 ST E L L A F l u o r 720、 インドシアニングリーン、 A l e x a F I u o r 488、 および A I e x a F l u o r 660が挙げられ、 それ それが H a 丨 o t a gリガンドとして市販されている。
[0023] ヘリックス構造の長さは、 ヘリックス構造が形成される限り特に限定され ない。 ヘリックス構造同士の連結においては、 連結部位のへリックスのアミ ノ酸の長さを変えることによって、 アフィマーとの結合角を変化させること ができ、 これによって蛍光タンパク質の偏光面をアフィマーに対して変化さ せることが可能である。 aヘリックスの場合には、 約 3. 5アミノ酸で 1周 するため、 aヘリックスを 1 アミノ酸長くすることによって、 結合角は約 1 00度変更される。 3/ 1 0ヘリックスにおいては、 約 3アミノ酸で 1周す るため、 ヘリックスを 1 アミノ酸長くすることによって結合角は約 1 20度 変更される。 ヘリックスの長さは、 アミノ酸の付加、 欠失、 および揷入から 選択される 1以上によって調節することができる。 また、 ヘリックスは、 そ の目的に応じて適宜その長さを調節することができる。 調節の方法は、 特に 限定されないが例えば、 融合タンパク質のいずれかのヘリックスの長さを変 更することによって行ってもよいし、 融合タンパク質の連結部位にヘリック ス構造を有するぺプチドを揷入することによって行ってもよい。 いずれの場 合にも、 連結部位の前後の領域を含むヘリックス構造が新たに形成されて、 これにより融合タンパク質が、 より硬く連結することとなる。
[0024] /Sシート構造の長さは、 /Sシート構造が形成される限り特に限定されない 。 /Sシート構造同士の連結においては、 連結後に連結部前後の/ Sシート構造 を含む構造的にフレキシブルでない構造が新たに形成されて、 これにより融 合タンパク質が、 より硬く連結することとなる。
[0025] 本発明の融合タンパク質は、 例えば、 以下であり得る ：
(A) C末端にヘリックス構造を有する蛍光タンパク質と N末端にヘリック \¥0 2020/175502 19 卩（：171? 2020 /007568
ス構造を有するアフィマーとの融合タンパク質 ｛但し、 2つのタンパク質は ヘリックス構造同士が連結される｝ ;
（巳） 〇末端にヘリックス構造を有するハロアルカンデハロゲナーゼの脱ハ ロゲン化ドメインと 1\1末端にヘリックス構造を有するアフィマーとの融合夕 ンパク質 ｛但し、 2つのタンパク質はヘリックス構造同士が連結される｝ ; （〇） ＜3末端に /3シート構造を有するナノボディと 1\1末端に /3シート構造を 有する蛍光タンパク質との融合タンパク質 ｛但し、 2つのタンパク質は /3シ —卜構造同士が連結される｝ ;および
（〇） （3末端に /3シート構造を有する 3〇 Vと 1\1末端に /3シート構造を有 する蛍光タンパク質との融合タンパク質 ｛但し、 2つのタンパク質は /3シー 卜構造同士が連結される｝ 。
［0026］ 本発明によれば、 本発明の融合タンパク質をコードする核酸 （例えば、 口 八である） が提供される。 本発明の融合タンパク質をコードする核酸は、 少なくとも 1つの制御配列 （例えば、 プロモーター） と作動可能に連結され ていることができる。 本発明によれば、 少なくとも 1つの制御配列 （例えば 、 プロモーター） と作動可能に連結された本発明の融合タンパク質をコード する核酸を含む発現べクター （例えば、 哺乳動物の細胞に当該融合タンパク 質を発現させるベクター） が提供される。 制御配列としては、 特に限定され ないが例えば、 ［¾ 八ポリメラーゼ丨 丨のプロモーターが挙げられ、 例えば 、 〇1\/1 即時早期、 1~1 3 チミジンキナーゼ、 早期および後期 3 4 0、 レ トロウイルスの！-丁［¾、 メタロチオネイン 丨などのプロモーターが挙げられ る。 大腸菌で発現させるためのプロモーターとしては、 例えば、 I 3〇, I
Figure imgf000021_0001
、 3 -ホスホグリセリン酸キナーゼ、 などのプロモーターが挙げられる。 植 物で発現させるためのプロモーターとしては、 例えば、 カリフラワーモザイ クウイルス （〇 3 1\/1 ） 3 5 3転写開始領域、 アグロバクテリウム ツメフ ァシエンスの丁一 0 八由来の 1’ または 2’ プロモーター、 および才ーキ シンなどのプロモーターが挙げられる。 出芽酵母で発現させるためのプロモ \¥0 2020/175502 20 卩（：171? 2020 /007568
-夕一としては、 例えば、 八0 1~1 1、 丁0 1~1 3、 〇［＜ 1、 〇八1_ 1が挙げ られる。 分裂酵母で発現させるためのプロモーターとしては、 例えば、 3 、 1 0†, n m t 1、 および〇1\/1 等のプロモーターが挙げられる。 発現 ベクターとしては、 プラズミ ド、 ファージ、 ファージミ ド、 コスミ ド、 フォ スミ ド、 人工染色体、 レトロウイルス、 レンチウイルス、 麻疹ウイルス、 ワ クシニアウイルス、 アデノウイルス、 アデノ随伴ウイルス、 およびセンダイ ウイルスなどが挙げられる。 本発明によれば、 これらの発現カセッ トをゲノ ム中に含む、 細胞 （例えば、 動物細胞、 植物細胞、 細菌、 古細菌、 および菌 類の細胞） が提供される。 その他、 制御配列に作動可能に連結した本発明の 融合タンパク質をコードする直鎖状または環状口 を細胞に導入する方法 （導入後に安定発現株を取得してもよい） 、 ゲノム編集技術 （例えば、 丁八 !_巳 1\1、 1\1、 または〇
Figure imgf000022_0001
システム等） を用いて、 制 御配列に作動可能に連結した本発明の融合タンパク質をコードする直鎖状ま たは環状口 八を細胞のゲノムに導入する方法などを用いてもよい。
細胞に対して遺伝子発現べクターを用いずに核酸を導入する方法や核酸に コードされるタンパク質を発現させる方法も知られている。 制御配列 （例え ば、 プロモーター） を作動可能に連結した本発明の融合タンパク質をコード する核酸 （例えば、 直鎖状核酸、 例えば、 直鎖状口 八） を細胞に導入して 本発明の融合タンパク質を細胞内に発現させることができる。 本発明の融合 タンパク質をコードする
Figure imgf000022_0002
八を細胞に導入して本発明の融合タンパク質 を細胞内に発現させることもできる。
［0027］ 本発明によれば、 本発明の融合タンパク質をコードする核酸は、 〇 八ま たはメッセンジャー［¾ 八
Figure imgf000022_0003
であり得る。
［0028］ 本発明によれば、 本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む組成物 が提供される。 本発明によれば、 本発明の融合タンパク質をコードする核酸 を含む遺伝子発現べクターを含む組成物が提供される。 これらの組成物には 、 核酸および/または遺伝子発現べクターと賦形剤とを含み得る。 賦形剤と しては、 核酸および/または遺伝子発現べクターを安定化させるための賦形 \¥0 2020/175502 21 卩（：171? 2020 /007568
剤が挙げられる。 賦形剤としては、 塩、 キレート剤、 および 1~1調整剤が挙 げられる。
[0029] 本発明の融合タンパク質は、 タンパク質であるので、 細胞に導入するか、 または細胞に融合タンパク質をコードする核酸を導入して強制発現させるこ とができる。 従って、 本発明の融合タンパク質は、 細胞内での抗原の観察に 用いることができる。 本発明によれば、 本発明の融合タンパク質を含む、 組 成物 （例えば、 本発明の融合タンパク質の細胞導入用の組成物） が提供され うる。 本発明によれば、 本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む、 組成物 （例えば、 本発明の融合タンパク質の細胞内発現用の組成物） が提供 されうる。
[0030] 本発明によれば、 抗原の観察方法 （以下、 「本発明の融合タンパク質の観 察方法」 とも読み替えることができる） が提供される。 抗原の観察方法は、 本発明の融合タンパク質と結合した抗原を観察することを含み得る。 ここで 「抗原」 とは、 特に限定されないが、 抗体の免疫原となり得る物質、 アフィ マーの免疫原となり得る物質、 ナノボディの免疫原となり得る物質、 または 3〇 Vの免疫原となり得る物質を意味し得るものであり、 このような抗原 であれば、 例えば、 溶液中または細胞中において、 または細胞表面で、 本発 明の融合タンパク質との結合を形成し得る。 抗原は、 他のタンパク質と複合 体を形成していてもよく、 他のタンパク質と複合体を形成していなくてもよ い。 観察は通常、 溶液中または細胞中、 または細胞表面の本発明の融合タン パク質に結合した抗原に対して行われ得る。 観察は、 顕微鏡 （例えば、 蛍光 顕微鏡および蛍光偏光顕微鏡） 下で行われ得る。 本発明の融合タンパク質は 、 蛍光タンパク質と抗原結合タンパク質とが一定の回転角で結合し、 蛍光が 有する偏光が抗原結合タンパク質に対して一定する。 従って、 本発明の融合 タンパク質は、 好ましくは、 蛍光偏光顕微鏡下で観察されうる。
[0031 ] 本発明によれば、 抗原としては、 動物、 植物、 細菌、 菌類、 および古細菌 の抗原が挙げられる。 抗原としては、 細胞内の抗原、 細胞外の抗原、 および 細胞膜上の抗原が挙げられる。 抗原は、 遊離型でもよいし、 何らかの他の構 \¥02020/175502 22 卩（：171? 2020 /007568
成成分と複合体を形成していてもよい。 抗原は、 モノマー形態の抗原でもよ いし、 ポリマー形態の抗原でもよい。 本発明では、 細胞は、 受精卵、 多能性 幹細胞、 幹細胞、 前駆細胞、 体細胞、 および生殖細胞 （例えば、 卵細胞） の いずれであってもよい。 本発明では、 抗原は、 生物における細胞以外の構成 体、 例えば、 鞭毛 （例えば、 精子や微生物の鞭毛） の構成要素であってもよ い。 本発明によれば、 抗原は、 アクチン、 微小管、 セプチン、 および中間径 フィラメント等の細胞内骨格であり得る。 本発明によれば、 抗原は、 細胞内 のアクチン （例えば、 《 -アクチン、 /3 -アクチン、 および· ^ -アクチン）
、 微小管のチューブリン （例えば、
Figure imgf000024_0002
チューブリン、
Figure imgf000024_0001
チューブリン、 お よび· チューブリン） 、 セプチン、 および中間径フィラメント （例えば、 ケラチン、 〇 八 （グリア細胞線維性酸性蛋白質） 、 ビメンチン、 ニュー ロフイラメントー IV!、 ニューロフイラメントー！-、 ニューロフイラメントー 1~1、 インターネキシン、 ラミン巳 1、 ラミン巳 2、 ラミン八） 等の細胞 内骨格であり得る。 本発明によれば、 抗原としては、 特に限定されないが例 えば、 ミオシン （例えば、 ミオシン 丨、 ミオシン 丨 丨、 ミオシン 丨 丨 丨、 ミ オシン 丨 V、 ミオシン V、 ミオシン V I、 ミオシン V I 丨 丨、 およびミオシ ン 丨 X等のミオシン、 並びにこれらの重鎖または軽鎖） 、 ダイニン （例えば 、 軸糸ダイニンおよび細胞質ダイニン） 、 キネシン （特に限定されないが例 えば、 ［＜ 1 1 八、 K \ F ］ Bas ［＜ 1 1 巳/3、 ＜ 1 1 〇、 ＜ 1 2八 、 ［＜ 丨 3、 ［＜ 丨 4、 ［＜ 丨 5、 ［＜ 丨 1 3巳、 ［＜ 丨 1 7、 ［＜ 丨 26 八、
Figure imgf000024_0003
〇 2、 および＜ 丨 〇 3、 並びにキネシンスーパー ファミリーに属する他のキネシン） が挙げられる。 本発明によれば、 抗原は 、 特に限定されないが例えば、 膜タンパク質 （例えば、 受容体タンパク質、 ◦タンパク質、 イオン輸送体 （イオンチヤンネル、 イオンポンプ） 、 および トランスポータータンパク質が挙げられる。 本発明によれば、 抗原は、 特に 限定されないが例えば、 巳八［¾ドメインタンパク質 （八 丨
Figure imgf000024_0004
1
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\¥0 2020/175502 23 卩（：171? 2020 /007568
〇 1~1 1\/1 ? 4巳、 〇 1~1 1\/1 ? 4〇） が挙げられる。 その他、 特に抗原 は、 上記に限られず、 様々な生体分子 （例えば、 タンパク質、 脂質、 核酸、 ホルモン、 および糖など） であり得る。 本発明によれば、 抗原は、 特に限定 されないが例えば、 脂質膜や脂質膜ドメインであり得る ｛例えば、 脂溶性の 蛍光色素や脂質結合モチーフを用い得る｝ 。 本発明によれば、 細胞内骨格以 外の細胞の構成要素も観察対象であり得る。 例えば、 本発明において偏光蛍 光相関分光または偏光蛍光相互相関分光を実施する場合には、 細胞内骨格以 外の細胞の構成要素の回転拡散を評価することができる。
[0032] 本発明によれば、 抗原の観察方法は、 蛍光相関分光 （ 0 3） を含み得る 。 蛍光相関分光は、 蛍光物質の分子運動を顕微鏡 （例えば、 共焦点顕微鏡ま たは 2光子顕微鏡など） 下で観察することを含み得る。 蛍光相関分光は、 本 発明の融合タンパク質に光 （例えば、 レーザー光） を照射して蛍光強度のゆ らぎを測定することを含み得る。 虽光相関分光は、 強度スペクトル （時間ス ぺクトル） を逆フーリエ変換して時間的自己相関を得ることを含み得る。 虽 光相関分光は、 得られた結果から、 本発明の融合タンパク質の拡散運動 （並 進拡散運動） 、 および測定領域内の分子数を評価することができる。 本発明 の方法は、 本発明の融合タンパク質の拡散係数を求めることを含み得る。 本 発明によれば、 複数種の蛍光分子由来の蛍光強度変化の同時測定は、 本発明 の複数種の融合タンパク質間の結合の検出に用いられ得る。 本発明によれば 、 抗原の観察方法は、 ある態様では、 蛍光偏光を観察することを含み得る。 虽光偏光は、 虽光偏光顕微鏡下にて観察され得る。 偏光は、 偏光板を通して その強度を解析する等することにより、 融合タンパク質の回転拡散運動を評 価することができる。 本発明の方法は、 本発明の融合タンパク質の流体回転 半径を求めることを含み得る。 本発明によれば、 流体回転半径は、 本発明の 融合タンパク質の構造揺らぎ ·周囲の微視的環境の揺らぎの評価、 本発明の 融合タンパク質と他のタンパク質の結合の評価、 または本発明の複数種の融 合タンパク質間の結合の評価に用いられ得る。
[0033] 本発明によれば、 抗原の観察方法は、 ある態様では、 本発明の融合タンパ \¥0 2020/175502 24 卩（：171? 2020 /007568
ク質である第一の融合タンパク質と結合した抗原と、 本発明の融合タンパク 質である第二の融合タンパク質 ｛但し、 第一の融合タンパク質と第二の融合 タンパク質の蛍光波長は異なる｝ と結合した第二の抗原とのそれぞれを観察 することを含み得る。 本発明によれば、 抗原の観察方法は、 本発明の融合夕 ンパク質である第一の融合タンパク質と結合した抗原と、 本発明の融合タン パク質である第二の融合タンパク質 ｛但し、 第一の融合タンパク質と第二の 融合タンパク質の蛍光波長は異なる｝ と結合した第二の抗原と蛍光相関分光 （ 〇3） を含み得る。 本発明によれば、 抗原の観察方法は、 2つ以上の抗 原の蛍光強度の揺らぎの同時性を解析すること （蛍光相互相関分光 （ 〇〇 3） ） を含み得る。 2つ以上の抗原の蛍光強度を測定するためには、 2つ以 上の本発明の融合タンパク質 （すなわち、 第一の融合タンパク質、 第二の融 合タンパク質を用いることができ、 例えば、 第三の融合タンパク質を用いて もよく、 第四の融合タンパク質をさらに用いてもよく、 更にまた必要に応じ てそれ以上の本発明の融合タンパク質を用いてもよい （但し、 それぞれの蛍 光波長は異なることが好ましい） 。 本発明によれば、 抗原の観察方法は、 あ る態様では、 虽光偏光を観察することを含み得る。 虽光偏光は、 虽光偏光顕 微鏡下にて観察され得る。 蛍光相関分光 （ 0 3） 、 および蛍光相互相関分 光 （ （3〇3） を偏光蛍光顕微鏡下で行うメリッ トは、 蛍光の回転拡散運動 を検出することができることである。 従って、 本発明では、 抗原の観察方法 は、 ある態様では、 蛍光偏光を観察して分子の回転拡散運動を検出すること をさらに含んでいてもよい。 回転拡散運動は、 粒子径の変化に対して感受性 であるため、 偏光蛍光相関分光によれば、 2つ以上の抗原の結合状態をより 精密に評価することができると期待される。 本発明では、 抗原の観察方法は 、 ある態様では、 細胞内の 2つ以上の抗原の結合状態を評価すること、 また は溶液中の 2つ以上の抗原の結合状態を評価することを含み得る。
[0034] 蛍光の偏光観察は、 蛍光偏光顕微鏡を用いて当業者が適宜行うことができ る。 偏光は、 例えば、 第一の偏光面と第二の偏光面を含む 2つまたはそれ以 上の偏光面に関して観察することができる。 偏光は、 第一の偏光面と第二の \¥02020/175502 25 卩（：171? 2020 /007568
偏光面と第三の偏光面と第四の偏光面を含む 4つまたはそれ以上の偏光面に 関して観察することができる。 観察する偏光面を増やすにつれて、 蛍光分子 の回転の検出感度が高まると期待できる。
[0035] 本発明では、 本発明の融合タンパク質の観察は、 超解像度顕微鏡法により 行うことができる。 超解像度顕微鏡法としては、 例えば、 誘導放出抑制顕微
Figure imgf000027_0001
光活性化局在性顕微鏡法 （ 八1_1\/1） 、 確率的光学再構 築顕微鏡法、 走査型近接場光顕微鏡法
Figure imgf000027_0002
、 構造化照明顕微鏡法、 共焦点レーザー顕微鏡法、 および 2光子励起顕微鏡法によるものが挙げられ る。 超解像度顕微鏡法では、 光の回折限界以下の分解能 （例えば、 200 以下の分解能） で観察対象物を観察することができる。 更に全反射照明 下等、 適切な観察条件下では、 蛍光分子を 1分子レベルで輝点として検出す ることができる。 超解像度顕微鏡法においても、 蛍光相関分光 （ 03） お よび蛍光相互相関分光 （ （3〇3） 、 並びに蛍光に代えて発光物質を用いる 前記方法と同様に、 抗原の観察が可能である。 従来の超解像度顕微鏡法では 抗原の位置を計測するのみであったが、 本発明では複数の抗原の位置に加え て偏光の方向を同時に観察することで、 各抗原の構造上の相関関係を評価す ることが可能である。 これは、 超解像度顕微鏡法において従来存在しなかっ た点像変換アルゴリズムの実験的基盤となることが期待できる。
[0036] 本発明によれば、 配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、
1 1、 1 2、 1 3、 1 4、 1 5、 1 6、 1 7、 1 8、 1 9、 20、 2 1、 2 2、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 3 1、 32、 33 、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 4 1、 42、 および 43か らなる群から選択される 1つの配列番号に記載のアミノ酸配列を有するタン パク質、 およびこれをコードする核酸が提供される。 本発明によれば、 上記 核酸を含む、 細胞内発現用のベクターが提供される。
[0037] 本発明によれば、 融合タンパク質のアミノ酸配列を設計する方法であって 抗原結合タンパク質のアミノ酸配列である第一のアミノ酸配列と蛍光タン \¥0 2020/175502 26 卩（：171? 2020 /007568
パク質のアミノ酸配列である第二のアミノ酸配列を用意することと、 ここで 、 第一のアミノ酸配列の 1\1末端および第二のアミノ酸配列の〇末端、 または 、 第一のアミノ酸配列の〇末端および第二のアミノ酸配列の 1\1末端が、 共に ヘリックス構造であるか、 1\1末端または（3末端の一部を切除することで共に ヘリックス構造となるものであり、
第一のアミノ酸配列の 1\1末端および第二のアミノ酸配列の〇末端、 または 、 第一のアミノ酸配列の〇末端および第二のアミノ酸配列の 1\1末端を連結し 、 これによって、 連結箇所がヘリックス構造の一部となるアミノ酸配列を得 ることとを含む、 方法が提供される。 設計されたアミノ酸配列を有する融合 タンパク質は、 蛍光偏光観察に適したものであり得る。 好ましくは、 1\1末端 または＜3末端の一部を切除することは、 抗原結合タンパク質の結合特性およ び蛍光タンパク質の蛍光特性を消失させない。
[0038] 本発明によれば、 融合タンパク質のアミノ酸配列を設計する方法であって 抗原結合タンパク質のアミノ酸配列である第一のアミノ酸配列と蛍光タン パク質のアミノ酸配列である第二のアミノ酸配列を用意することと、 ここで 、 第一のアミノ酸配列の 1\1末端および第二のアミノ酸配列の〇末端、 または 、 第一のアミノ酸配列の〇末端および第二のアミノ酸配列の 1\1末端が、 共に /3シートであるか、 1\1末端または〇末端の一部を切除することで共に/ 3シー 卜となるものであり、
第一のアミノ酸配列の 1\1末端および第二のアミノ酸配列の〇末端、 または 、 第一のアミノ酸配列の〇末端および第二のアミノ酸配列の 1\1末端を連結し 、 これによって、 連結箇所が/ 3シート構造の一部となるアミノ酸配列を得る こととを含む、 方法が提供される。 設計されたアミノ酸配列を有する融合夕 ンパク質は、 蛍光偏光観察に適したものであり得る。 好ましくは、 1\1末端ま たは＜3末端の一部を切除することは、 抗原結合タンパク質の結合特性および 蛍光タンパク質の蛍光特性を消失させない。
[0039] 本発明によれば、 融合タンパク質を設計する方法であって、 \¥0 2020/175502 27 卩（：171? 2020 /007568
タンパク質のアミノ酸配列を用意することと、 ここで、 当該アミノ酸配列 の少なくとも 1\1末端または（3末端がヘリックス構造を有し、
当該へリックスと八 1_ 八タグ （八 1_ 八タグは、 例えば、 配列番号 4 0 に記載のアミノ酸配列または対応する し タグのアミノ酸配列を有し得 る） のへリックスのアミノ酸配列とを連結し、 これによって、 連結箇所がへ リックス構造の一部となるアミノ酸配列を得ることとを含む、 方法が提供さ れる。 設計されたアミノ酸配列を有する融合タンパク質は、 八1_ 八タグに 結合する抗原結合タンパク質と硬く連結した蛍光タンパク質によって検出さ れ得、 蛍光偏光観察に用い得る。 好ましくは、 1\1末端または（3末端の一部を 切除することは、 タンパク質の機能性領域を欠失させない。 ある態様では、 上記タンパク質は、 抗原結合タンパク質であり得る。 ある態様では、 上記夕 ンパク質は、 観察対象であるタンパク質であり得る。 八1_ 八タグに結合す る抗原結合タンパク質としては、 八 1_ 八タグに結合するナノボディ、 3〇 、 アフィマーおよび上記で例示した抗原結合タンパク質が挙げられ、 蛍 光タンパク質も上記で例示した蛍光タンパク質が挙げられ、 これらがへリッ クス構造同士、 または/ 3シート同士で連結された融合タンパク質 （例えば、 上記 （へ） 〜 （口） のいずれかの融合タンパク質であって、 八1_ 八タグに 結合する融合タンパク質） を、 八1_ 八タグを検出するために用いることが できる。 また、 検出されるタンパク質は、 1\1末端または〇末端にヘリックス 構造を有することが好ましく、 八 1_ 八タグのヘリックス構造と連結されて 、 連結部がヘリックス構造の一部となった、 融合タンパク質とすることがで きる。
[0040] 本発明によれば、 設計されたアミノ酸配列に基づいて、 当該融合タンパク 質をコードする核酸配列を得ることを含む、 方法が提供される。 本発明によ れば、 設計されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する核酸を製造す る方法が提供され得る。 本発明によれば、 設計されたアミノ酸配列をコード する核酸配列を有する核酸 （例えば、 口
Figure imgf000029_0001
八） が提供され得 る。 本願発明によればまた、 得られた核酸配列を有する核酸を含む遺伝子発 \¥0 2020/175502 28 卩（：171? 2020 /007568
現べクターが提供される。 遺伝子発現べクターにおいては、 核酸は、 プロモ —ターに作動可能に連結させることができる。 得られた遺伝子発現べクター は、 細胞に発現可能に導入されることによって、 細胞内で設計されたアミノ 酸配列を有する融合タンパク質を合成することに用いることができる。 得ら れた融合タンパク質が、 蛍光偏光観察に適したものである場合には、 当該融 合タンパク質およびこれをコードする核酸は、 蛍光偏光観察に有用であり得 る。
[0041 ] 本発明によれば、 上記によって設計されたアミノ酸配列に基づいて、 融合 タンパク質を製造する方法が提供される。
実施例
[0042] 実施例 1 :円順列変異体〇 〇 _ 5 チ◦ とアフィマーとの融合タンパク質 の設計と観察
本実施例では、 円順列変異体〇
Figure imgf000030_0001
とアフィマーとの融合タン パク質を設計した。
[0043] アフィマーは、 ステフィン由来またはシスタチン由来のタンパク質であり 、 《ヘリックスとそれに接する 4本の折り返し シート構造とからなるタン パク質である。 4本の折り返し /3シートは、 《ヘリックスによって安定化さ れており、 固い 3次構造を有する。 4本の/ 3シートによって 3箇所のループ が形成されるが、 そのうち同じ側の 2箇所のループには、 アミノ酸を導入す ることができることが知られている。 導入するアミノ酸によってアフィマー が、 抗体のような抗原に対する選択的な結合親和性を獲得できることも知ら れている。 また、 ファージディスプレイなどの技法によって、 所望の抗原に 対して結合親和性を示すアフィマーを設計することができることも明らかに なっている。
[0044] 本実施例では、 〇末端にヘリックス （3 / 1 0ヘリックスと考えられる） を有する〇 一 3 干〇 と、 1\1末立 に《ヘリックスを有するアフィマーと を、 当該〇末端のヘリックスと 1\!末端のヘリックスとをヘリックスりンカー を介して連結させて、 融合タンパク質を得た （図 1 八参照） 。 \¥0 2020/175502 29 卩（：171? 2020 /007568
[0045] 得られる融合タンパク質の予想される立体構造モデルは、 図 1 巳に示され る通りであった。
[0046]
Figure imgf000031_0001
としては、 配列番号 1 に記載のアミノ酸配列を有する〇 一 3 干〇 を用いた。 また、 アフイマーとしては、 配列番号 2に記載の アミノ酸配列を有するアフイマーを用いた。 このアフイマーは、 アクチン線 維 （ _アクチン） に選択的に結合することができる。 遺伝子工学的手法に より、 配列番号 1 に記載のアミノ酸配列と配列番号 2に記載のアミノ酸配列 とを、 配列番号 3に記載のアミノ酸配列を有するヘリックスリンカーを介し て、 インフレームで連結し、 これによって配列番号 4に記載のアミノ酸配列 を有する融合タンパク質を設計した。 配列番号 4は、 0末端に !~1八タグのア ミノ酸配列を含む。
[0047] 設計した融合タンパク質を大腸菌に産生させて精製し、 得られた融合タン パク質を結晶化し、 X線結晶構造解析に供した。 得られた X線回折像から、 当該融合タンパク質は、 図 1 <3に示される結晶構造を有することが明らかと なった。 図 1 〇に示されるように、 〇 一 3 干◦ とアフイマーとは、 当 該〇末端のヘリックスと 1\!末端のヘリックスとが連結して 1本のヘリックス を新たに形成させたことが明らかとなった。
[0048] 設計した融合タンパク質をコードする口 八を適切なプロモーター下に配 置した発現べクターをリポフエクシヨン法 （リポフエクタミン 3 0 0 0試薬 ） によって導入することにより、 1~1 6 !_ 3細胞に上記融合タンパク質を発現 させた。 蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。 融 合タンパク質がアクチン繊維に結合したときに、 結合した融合タンパク質の 蛍光の偏光面が揃っていれば、 蛍光の偏光 （異方性） が観察されると予想さ れる。 偏光ビームスプリッタを用いて縦の観察偏光面と横の観察偏光面の像 を同時に取得し、 比較した。 結果は図 2に示される通りであった。 図 2に示 されるように、 観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察されるアク チン線維束 （矢尻参照） が、 観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観 察される一方で、 観察偏光面が横であるときに蛍光強度が強く観察されるア \¥0 2020/175502 30 卩（：171? 2020 /007568
クチン線維束 （矢印参照） が、 観察偏光面が縦であるときに弱く観察された 。 このことは、 アクチン繊維に結合した融合タンパク質の偏光面が揃ってい ることを意味する。 同様の実験を、 1~1 6 !_ 3細胞に代えて !_ !_（3 _ < 1細 胞、 1< 2細胞、 酵母細胞やヒトデの卵母細胞、 または受精卵を用いて実 施し、 上記融合タンパク質の偏光を細胞内において観察することができるこ とを確認した。
[0049] アフィマーは、 アクチン線維に対して揃った向きで結合すると考えられる 。 アクチン線維は、 アクチンモノマーの繰り返しにより構成されたポリマー であるからである。 融合タンパク質の偏光面が揃っているということは、 融 合タンパク質における
Figure imgf000032_0001
ていることを示すものである。 従って、 本発明の融合タンパク質において、
〇末端のヘリックスと 1\1末端のヘリックスとを連結させる方法は、 〇 _ 3
Figure imgf000032_0002
ィマーに対して固定化する方法論を提供するものである。 アフィマーの 1\1末 端の《ヘリックスと連結するように、 3 干◦ の1\1末端のヘリックスを〇 末端に移動させる円順列変異体の作製がこの固定化のための方法論に役立ち 得ることが示された。
[0050] これによって、 所望の抗原に対して結合して、 偏光を発する蛍光標識法が 構築できる。 この蛍光偏光標識法の戦略の有効性を以下実施例によりさらに 確認した。
[0051 ] 実施例 2 :円順列変異体〇
Figure imgf000032_0003
11 リ 5とアフィマーとの鬲虫合タンパク質 の設計と観察
実施例 1 に開示した戦略を用いて、 〇 P m V 6 n u 3とアフィマーとを連 結させた。 具体的には、
Figure imgf000032_0004
ックスと、 アフィマーの 1\1末端に存在する《ヘリックスとをインフレームで 連結させて融合タンパク質を設計した。
[0052] c p m V e n u sとしては、 配列番号 5に記載のアミノ酸配列を有する蛍 光タンパク質を用いた。 アフィマーとしては、 実施例 1 と同じアミノ酸配列 \¥0 2020/175502 31 卩（：171? 2020 /007568
を有するアフイマーを用いた。 遺伝子工学的手法により、 配列番号 5に記載 のアミノ酸配列と配列番号 2に記載のアミノ酸配列とを、 アラニン （ ） を 介してインフレームで連結し、 これによって配列番号 6に記載のアミノ酸配 列を有する〇 01 6 11 リ 3とアフイマーとの融合タンパク質を設計した。 配列番号 6は、 0末端に 1~1八タグのアミノ酸配列を含む。
[0053] 設計した融合タンパク質をコードする口 八を適切なプロモーター下に配 置した発現べクターをリポフエクシヨン法 （アバランシエーエブリデートラ ンスフエクシヨン試薬） によって導入することにより、
Figure imgf000033_0001
細胞に上記 融合タンパク質を発現させた。 蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現し た細胞を観察した。 結果は、 図 3に示される通りであった。 図 3に示される ように、 観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察されるアクチン線 維束が、 観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観察される一方で、 観 察偏光面が横であるときに蛍光強度が強く観察されるアクチン線維束が、 観 察偏光面が縦であるときに弱く観察される様子が認められた。 このことから 、
Figure imgf000033_0002
の〇末端に存在する 3 / 1 0ヘリックスと、 アフイマー の 1\!末端に存在する《ヘリックスとをインフレームで直接的に連結させて得 た融合タンパク質もまた、 偏光を示すものであった。
[0054] 実施1（列 3 :円川頁歹 1|変 :異体〇〇 5 6 2とアフイマーとの鬲虫合
Figure imgf000033_0003
タンパク質の設計と観察
実施例 1 に開示した戦略を用いて、 〇 〇1丁 リ 「 リ 〇 I 3 6 2とアフイ マーとを連結させた。 具体的には、 〇 01丁 リ 「 リ 〇 I 3 6 2の〇末端に 存在する 3 / 1 0ヘリックスと、 アフイマーの 1\]末端に存在する《ヘリック スとをインフレームで連結させて融合タンパク質を設計した。
[0055] 〇 〇1丁リ 「 リ〇 I 3 6 2としては、 配列番号 7に記載のアミノ酸配列 を有する蛍光タンパク質を用いた。 アフイマーとしては、 実施例 1 と同じア ミノ酸配列を有するアフイマーを用いた。 遺伝子工学的手法により、 配列番 号 7に記載のアミノ酸配列と配列番号 2に記載のアミノ酸配列とをアラニン （八） を介してインフレームで連結し、 これによって配列番号 8に記載のア \¥0 2020/175502 32 卩（：17 2020 /007568
ミノ酸配列を有する〇 111丁 11 「 リ〇 1 3 6 2とアフイマーとの融合タン パク質を設計した。 配列番号 8は、 0末端に 八タグのアミノ酸配列を含む
[0056] 設計した融合タンパク質をコードする口 八を適切なプロモーター下に配 置した発現べクターをリポフエクシヨン法 （アバランシエーエブリデートラ ンスフエクシヨン試薬） によって導入することにより、
Figure imgf000034_0001
細胞に上記 融合タンパク質を発現させた。 蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現し た細胞を観察した。 結果は、 図 4に示される通りであった。 図 4に示される ように、 観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察されるアクチン線 維束が、 観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観察される一方で、 観 察偏光面が横であるときに蛍光強度が強く観察されるアクチン線維束が、 観 察偏光面が縦であるときに弱く観察される様子が認められた。 このことから 、 〇 〇1丁リ 「 9リ〇 1 3 6 2の〇末端に存在する 3 / 1 0ヘリックスと、 アフイマーの 1\1末端に存在する《ヘリックスとをインフレームで連結させて 得た融合タンパク質もまた、 偏光を示すものであった。
[0057] 上記実施例 1〜 3から、 蛍光タンパク質の <3末端のへリックスと、 アフイ マーの 末端のヘリックスとを連結する戦略は、 虽光の偏光面をアフイマー に対して固定することができ、 標的タンパク質 （すなわち、 アフイマーの抗 原） を蛍光偏光観察する新しい手法を提供するものとなる。
[0058] 実施例 4 :蛍光標識されるタグとアフイマーとの融合タンパク質の設計と観 皇
上記実施例に開示した戦略を用いて、 蛍光標識されるタグとアフイマーと を連結させた。 蛍光標識されるタグとしてはハロタグを用いた。 ハロタグは 、 細胞膜透過性の様々な蛍光リガンドと結合することができるタンパク質標 識技術である。 ハロタグとアフイマーとを連結させることによって、 所望の 抗原に対してハロタグを導入することができるが、 上記実施例に開示した戦 略を用いることで虽光偏光観察への適用を試みた。
[0059] （1） 融合タンパク質 （1つ目） \¥0 2020/175502 33 卩（：171? 2020 /007568
ハロタグとしては、 配列番号 9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質 を用いた。 アフィマーとしては、 実施例 1 と同じアミノ酸配列を有するアフ ィマーを用いた。 遺伝子工学的手法により、 配列番号 9に記載のアミノ酸配 列と配列番号 2に記載のアミノ酸配列とを配列番号 1 〇のアミノ酸配列を有 するヘリックスリンカーを介してインフレームで連結し、 これによって配列 番号 1 1 に記載のアミノ酸配列を有するハロタグとアフィマーとの融合タン パク質を設計した。 ハロタグは、 図 5に示されるように 0末端に《ヘリック ス構造を有する。 本実施例では、 この〇末端の《ヘリックスとアフィマーの 1\1末端の《ヘリックスとを上記ヘリックスりンカーを介して連結させた （図 5参照） 。
[0060] 設計した融合タンパク質をコードする口 八を適切なプロモーター下に配 置した発現べクターをリポフエクシヨン法 （リポフエクタミン 3 0 0 0試薬 ） によって導入することにより、 1~1 6 !_ 3細胞に上記融合タンパク質を発現 させた。 ハロタグリガンドとしては、 オレゴングリーンリガンドを用いて、 蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。 結果は、 図 6八に示される通りであった。 図 6八に示されるように、 観察偏光面が横で あるときに蛍光強度が弱く観察されるアクチン線維束が、 観察偏光面が縦で あるときに蛍光強度が強く観察される一方で、 観察偏光面が横であるときに 蛍光強度が強く観察されるアクチン線維束が、 観察偏光面が縦であるときに 弱く観察される様子が認められた。 このことから、 ハロタグの〇末端に存在 する《ヘリックスと、 アフィマーの 1\!末端に存在する《ヘリックスとをイン フレームで直接的に連結させて得た融合タンパク質もまた、 偏光を示すもの であった。 偏光を示すということから、 蛍光色素とハロタグ、 アフィマーと の相互の結合がタイ トに固定されており、 その結合には柔軟性がほとんどな いものと考えられる。
[0061 ] このことから、 本実施例の戦略によってハロタグの〇末端に存在する《へ リックスと、 アフィマーの 1\1末端に存在する《ヘリックスとを連結させると 、 アフィマーに対してハロタグが硬く結合することによって、 ハロタグに結 \¥0 2020/175502 34 卩（：171? 2020 /007568
合する蛍光標識を介して蛍光偏光観察が可能となることが明らかとなった。
[0062] （2） 融合タンパク質 （2つ目 ；巻き数変更）
«ヘリックスは、 3 . 5アミノ酸で 1巻きするタンパク質の二次構造であ る。 《ヘリックス同士をアミノ酸をずらして連結させること （巻き数変更） によって、 偏光面が回転するのかを確認した。
[0063] ハロタグとしては、 配列番号 9に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパ ク質を用いた。 アフィマーとしては、 実施例 1 と同じアミノ酸配列を有する アフィマーを用いた。 遺伝子工学的手法により、 配列番号 9に記載のアミノ 酸配列と配列番号 2に記載のアミノ酸配列とを配列番号 1 2のアミノ酸配列 を有するヘリックスリンカーを介してインフレームで連結し、 これによって 配列番号 1 3に記載のアミノ酸配列を有するハロタグとアフィマーとの融合 タンパク質を設計した。 図 6八に示された融合タンパク質とはヘリックスり ンカーの長さが 1 アミノ酸相違する （すなわち回転角が約 1 0 0度異なる）
。 図 6八と図 6巳とを比較すると理解できるように、 ハロタグに対するアフ ィマーの結合角が図 6八と図 6巳の融合タンパク質では異なる。
[0064] 設計した融合タンパク質をコードする口 八を適切なプロモーター下に配 置した発現べクターをリポフエクシヨン法 （リポフエクタミン 3 0 0 0試薬 ） によって導入することにより、 1~1 6 !_ 3細胞に上記融合タンパク質を発現 させた。 ハロタグリガンドとしては、 オレゴングリーンリガンドを用いて、 蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。 結果は、 図 6巳に示される通りであった。 図 6巳に示されるように、 観察偏光面が横で あるときに蛍光強度が弱く観察されるアクチン線維束が、 観察偏光面が縦で あるときに蛍光強度が強く観察される一方で、 観察偏光面が横であるときに 蛍光強度が強く観察されるアクチン線維束が、 観察偏光面が縦であるときに 弱く観察される様子が認められた。 このことから、 ハロタグの〇末端に存在 する《ヘリックスと、 アフィマーの 1\!末端に存在する《ヘリックスとをイン フレームで直接的に連結させて得た融合タンパク質もまた、 偏光を示すもの であった。 \¥0 2020/175502 35 卩（：171? 2020 /007568
[0065] このことから、 ハロタグの〇末端に存在する《ヘリックスと、 アフィマー の 1\1末端に存在する《ヘリックスとは、 巻き数を変更して連結させても蛍光 偏光標識戦略として成立することが明らかとなった。 図 6八および図 6巳に 開示されたモデルによれば、 巻き数を変更することによって、 偏光の回転角 を自由に変えることが原理的に可能であることが明らかである。
[0066] （3） 融合タンパク質 （3つ目 ；更なる巻き数変更）
«ヘリックス同士をアミノ酸を更にずらして連結させた （更なる巻き数変 更） 。
[0067] ハロタグとしては、 配列番号 9に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパ ク質を用いた。 アフィマーとしては、 実施例 1 と同じアミノ酸配列を有する アフィマーを用いた。 遺伝子工学的手法により、 配列番号 9に記載のアミノ 酸配列と配列番号 2に記載のアミノ酸配列とを配列番号 1 4のアミノ酸配列 を有するヘリックスリンカーを介してインフレームで連結し、 これによって 配列番号 1 5に記載のアミノ酸配列を有するハロタグとアフィマーとの融合 タンパク質を設計した。 図 6八に示された融合タンパク質とはヘリックスり ンカーの長さが 2アミノ酸相違する （すなわち回転角が約 2 0 0度異なる）
。 図 6八と図 6巳と図 6〇とを比較すると理解できるように、 ハロタグに対 するアフィマーの結合角が図 6八と図 6巳と図 6〇の融合タンパク質では異 なる。
[0068] 設計した融合タンパク質をコードする口 八を適切なプロモーター下に配 置した発現べクターをリポフエクシヨン法 （リポフエクタミン 3 0 0 0試薬 ） によって導入することにより、 1~1 6 !_ 3細胞に上記融合タンパク質を発現 させた。 ハロタグリガンドとしては、 オレゴングリーンリガンドを用いて、 蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した。 結果は、 図 6〇に示される通りであった。 図 6 <3に示されるように、 観察偏光面が横で あるときに蛍光強度が弱く観察されるアクチン線維束が、 観察偏光面が縦で あるときに蛍光強度が強く観察される一方で、 観察偏光面が横であるときに 蛍光強度が強く観察されるアクチン線維束が、 観察偏光面が縦であるときに 弱く観察される様子が認められた。 このことから、 ハロタグの C末端に存在 する aヘリックスと、 アフィマーの N末端に存在する aヘリックスとをイン フレームで直接的に連結させて得た融合タンパク質もまた、 偏光を示すもの であった。 なお、 ハロタグリガンドとして、 オレゴングリーンリガンドに代 えて、 TMRリガンド、 HMS i Rリガンドを用いても強い偏光が観察され 、 ハロタグリガンドに用いられる蛍光物質によらずに偏光の観察が可能であ った。
[0069] このことから、 ハロタグの C末端に存在する aヘリックスと、 アフィマー の N末端に存在する aヘリックスとは、 巻き数を変更して連結させても蛍光 偏光標識戦略として成立することがさらに確認された。
[0070] 実施例 5 :円順列変異体 c p- s f G F Pとナノボディとの融合タンパク質 の設計と観察
本実施例では、 蛍光タンパク質とナノボディの融合タンパク質を設計した
[0071] ナノボディは、 ヒト、 ウサギ、 及びマウスなどに見られる一般的な抗体 （ 重鎖と軽鎖を有する抗体） とは異なり、 重鎖のみからなる抗体 （例えば、 サ メやギンザメなどの軟骨魚類やラクダ、 ヒトコブラクダ、 ラマ、 アルパカな どの抗体） は、 重鎖可変領域のみで抗原に結合することができるものと、 重 鎖可変領域と軽鎖可変領域とに由来するものがある。 これらの可変領域を含 むべプチドは、 分子量が通常の丨 g G抗体の 1 0分の 1ほど （おおよそ 1 2 〜 1 5 k D a） であり、 ナノボディと呼ばれる。 ファージディスプレイなど の技法によって、 所望の抗原に対して結合親和性を示すナノボディを設計す ることができることも明らかになっている。
[0072] s f G F P （s u p e r f o l d e r G F P） は、 オワンクラゲから得 られる G F Pの改変体である。 細胞内で迅速に構造形成 （f o l d i n g） することが特徴とされる。 本実施例では、 この s f G F Pとナノボディとを 13シート同士で連結することを試みた。 ナノボディは C末端に/ Sシートを有 するので、 N末端に/ Sシートを有する円順列変異体 c p_ s f G F P （詳細 \¥0 2020/175502 37 卩（：171? 2020 /007568
には、 〇 1 0 / 8 （1 0 / 9） 3 干〇 ） を構築した。
[0073]
Figure imgf000039_0001
配列番号 1 に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質を用いた。 ナノボディとして は、 配列番号 1 6に記載のアミノ酸配列を有する、 ビメンチンに結合するナ ノボディを用いた。 遺伝子工学的手法により、 配列番号 1 に記載のアミノ酸 配列を有する
Figure imgf000039_0002
配列番号 1 6に記載 のアミノ酸配列を有する、 ビメンチンに結合するナノボディの〇末端の/ 3シ —卜とを連結させて、 配列番号 1 7に記載のアミノ酸配列を有する融合タン パク質を設計した。 配列番号 1 7に記載のアミノ酸配列は、 1\1末端に 1~1 丨 3 タグと丁 7タグを有する。 図 7八に予想される融合タンパク質の構造モデル を示す。 このモデルでは、 ナノボディが抗原に結合する部位は、 蛍光タンパ ク質とは反対方向に存在し、 抗原への接近可能性が担保されている。
[0074] 設計した融合タンパク質をコードする口 八を適切なプロモーター下に配 置した発現べクターをリポフエクシヨン法 （アバランシエーエブリデートラ ンスフエクシヨン試薬） によって導入することにより、
Figure imgf000039_0003
細胞に上記 融合タンパク質を発現させた。 蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現し た細胞を観察した。 結果は、 図 7巳に示される通りであった。 図 7巳に示さ れるように、 観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察されるビメン チン繊維が、 観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観察される一方で 、 観察偏光面が横であるときに蛍光強度が強く観察されるビメンチン繊維が 、 観察偏光面が縦であるときに弱く観察される様子が認められた。 このよう に、 作製した融合タンパク質は、 ビメンチン繊維を染色することができた上 に、 その虽光は偏光を示した。
[0075] このことから、
Figure imgf000039_0004
端の/ 3シートとを連結させて融合タンパク質を得る戦略は、 蛍光偏光標識に 有用であり得ることが示唆された。
[0076] 実施例 6 :ナノボディと 7 6— 1 7 2〇1 \/ 6 11リ 5との鬲虫合タンパク 質の設計と観察 \¥0 2020/175502 38 卩（：171? 2020 /007568
また、 ビメンチンに結合するナノボディ （配列番号 1 6） と〇 1 7 6— 1 7 2 m V e n u s （配列番号 3 0） とを V Vを介して連結した融合タンパ ク質 （配列番号 3 1、 配列番号 3 1 に記載のアミノ酸配列は、 1\!末端に 1~1 I 3タグと丁 7タグを有する。 ） を設計し （図 7〇の上のパネル参照） 、 実施 例 5と同様に 1~1 6 !_ 3細胞に発現させた。 蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク 質を発現した細胞を観察したところ、 図 7（3に示されるように、 細胞内のビ メンチンを観察することができ、 かつ、 その蛍光は偏光を示した。 その偏光 の方向は、 先の〇 一 3 干◦ の場合と異なっていた。 実施例 5の〇 一 3 干◦ と本実施例で用いた〇 1 7 6 - 1 7 2 m V e n u sとは、 基本 的に同じタイプの蛍光タンパク質であるが、 〇 の位置において相違する。 従って、 本実施例では、 様々な場所で蛍光タンパク質の円順列変異体を作成 することで、 偏光の角度を変えることができることが示された。
[0077] 実施例 7 : 八〇〇 I 6とナノボディとの融合タンパク質の設計と観察
そこで次に、 別の蛍光タンパク質である 八 丨 ㊀とナノボディとの融 合タンパク質を設計した。
[0078] 八 丨 6は、 配列番号 1 8に記載のアミノ酸配列を有する蛍光タンパ ク質を用いた。 ナノボディとしては、 配列番号 1 6に記載のアミノ酸配列を 有する、 ビメンチンに結合するナノボディを用いた。 遺伝子工学的手法によ り、 配列番号 1 8に記載のアミノ酸配列を有する 八 丨 6の1\1末端の/ 3 シートと、 配列番号 1 6に記載のアミノ酸配列を有する、 ビメンチンに結合 するナノボディの〇末端の/ 3シートとを、 フレキシブルではないリンカー （ 「硬いリンカー」 ） を介して連結させて、 配列番号 1 9に記載のアミノ酸配 列を有する融合タンパク質を設計した。 配列番号 1 9に記載のアミノ酸配列 は、 1\1末端に 1~1 丨 3タグと丁 7タグを有する。 図 8八に予想される融合タン パク質の構造モデルを示す。 このモデルでは、 ナノボディが抗原に結合する 部位は、 蛍光タンパク質とは反対方向に存在し、 抗原への接近可能性が担保 されている。
[0079] 設計した融合タンパク質をコードする口 八を適切なプロモーター下に配 \¥0 2020/175502 39 卩（：171? 2020 /007568
置した発現べクターをリポフエクシヨン法 （アバランシエーエブリデートラ ンスフエクシヨン試薬） によって導入することにより、
Figure imgf000041_0001
細胞に上記 融合タンパク質を発現させた。 蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現し た細胞を観察した。 結果は、 図 8巳に示される通りであった。 図 8巳に示さ れるように、 観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察されるビメン チン繊維が、 観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観察される一方で 、 観察偏光面が横であるときに蛍光強度が強く観察されるビメンチン繊維が 、 観察偏光面が縦であるときに弱く観察される様子が認められた。 このよう に、 作製した融合タンパク質は、 ビメンチン繊維を染色することができた上 に、 その虽光は偏光を示した。
[0080] このように、 ナノボディの〇末端の/ 3シート構造を利用し、 蛍光タンパク 質の 1\1末端に存在する/ 3シート構造と連結させることにより、 偏光性を喪失 することなく、 ナノボディの蛍光タンパク質標識が可能であることが明らか である。
[0081 ] 実施例 8 : 〇 13 - 3 干〇 と 〇 Vとの融合タンパク質の設計と観察
本実施例では、 1\1末端に/ 3 シート構造を有する を設計し 、 3〇 の〇末端に存在する/ 3シート構造と連結させて、 融合タンパク質 を得た。
[0082] 3〇 Vは、 抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをフレキシブルなリン 力一で連結した構造を有するタンパク質である。 抗体から遺伝子工学的手法 により作製する場合には、 当該抗体の結合特性を維持させることができる。 現在では、 3〇 Vをファージディスプレイで作製する手法が周知であり、 これにより所望の抗原に対して所望の結合特性を有する 3〇 Vを入手する ことができる。
[0083]
Figure imgf000041_0002
としては、 配列番号 1 に記載のアミノ酸配列を有する 3 干◦ の円順列変異体を用いた。 3〇 Vとしては、 配列番号 2 0に記載 のアミノ酸配列を有する、 非筋ミオシン 丨 丨 八に結合する 3〇 Vを用いた 。 遺伝子工学的手法によって、 配列番号 1 に記載のアミノ酸配列を有する \¥0 2020/175502 40 卩（：171? 2020 /007568
干◦ の1\1末端の/ 3シート構造と、 配列番号 2 0に記載のアミノ酸配列を 有する 3〇 Vの（3末端の/ 3シート構造とを直接的に連結させて、 配列番号 2 1 に記載のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を設計した。 配列番号 2 1 に記載のアミノ酸配列は、 1\1末端に 1~1 丨 3タグと丁 7タグを有する。 この 融合タンパク質の予想される立体構造は図 9 にされる。 3〇 Vの融合夕 ンパク質の抗原認識部位は、 融合させた〇 _ 3 チ◦ とは反対側に露出 しており、 抗原認識部位に対する抗原の接近可能性は担保された。
[0084] 設計した融合タンパク質をコードする口 八を適切なプロモーター下に配 置した発現べクターをリポフエクシヨン法 （アバランシエーエブリデートラ ンスフエクシヨン試薬） によって導入することにより、
Figure imgf000042_0001
細胞に上記 融合タンパク質を発現させた。 蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現し た細胞を観察した。 結果は、 図 9巳に示される通りであった。 図 9巳に示さ れるように、 観察偏光面が横であるときに蛍光強度が弱く観察される部分が 、 観察偏光面が縦であるときに蛍光強度が強く観察される一方で、 観察偏光 面が横であるときに蛍光強度が強く観察される部分が、 観察偏光面が縦であ るときに弱く観察される様子が認められた。 このように、 作製した融合タン パク質は、 ミオシンを染色することができた上に、 その蛍光は偏光を示した
[0085] さらに、 3〇 V （配列番号 2 0） と〇 1 7 6 - 1 7 2〇1 6门リ 3 （ 配列番号 3 0） とを ^を介して連結した融合タンパク質 （配列番号 3 2） を設計し （図 9（3の上のパネル参照） 、 同様に
Figure imgf000042_0002
蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察したところ、 図 9 〇に示されるように、 細胞内のミオシンを観察することができ、 かつ、 その 蛍光は偏光を示した。 その偏光の方向は、 先の〇 _ 3 チ◦ の場合と異 なっていた。 本実施例の〇 一 3 干〇 と。 1 7 6— 1 7 2〇1 \/ 6 11リ 3とは、 基本的に同じタイプの蛍光タンパク質であるが、 〇 の位置におい て相違する。 従って、 本実施例では、 様々な場所で蛍光タンパク質の円順列 変異体を作成することで、 偏光の角度を変えることができることが示された \¥0 2020/175502 41 卩（：17 2020 /007568
[0086] このように、 3〇 の〇末端の/ 3シート構造を利用し、 蛍光タンパク質 の 1\1末端に存在する/ 3シート構造と連結させることにより、 偏光性を喪失す ることなく、 3〇 Vの蛍光タンパク質標識が可能であることが明らかであ る。
[0087] 実施例 9 : アフイマーと 3〇 3 「 I ㊀ 1:の融合タンパク質の設計と観察
3 「 I 6 の 1\1末端を削り、 アフイマーの〇末端の/ 3シートと連結 させて、 アフイマーと
Figure imgf000043_0001
8 「 丨 ㊀ との融合タンパク質を得た。
Figure imgf000043_0002
3〇 3 「 丨 6 としては、 1\1末端のアミノ酸を削り込んで作成した配列番号 3 6 に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を用いた。 アフイマーとしては、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するアクチンに結合するアフイマーを 用いた。 遺伝子工学的手法によって、 これらを連結させ、 配列番号 3 7に記 載されたアミノ酸配列を有する融合タンパク質を設計した。
[0088] 得られた融合タンパク質は、 図 1 1 に記載の 3次元構造モデルにより示さ れている。 設計した融合タンパク質をコードする口 八を適切なプロモータ —下に配置した発現べクターをリポフエクシヨン法 （リポフエクタミン 3 0 0 0試薬） によって導入することにより、 1~1㊀ !_ 3細胞に上記融合タンパク 質を発現させた。 蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察 した。
[0089] 結果は、 図 1 1 に示される通りであった。 図 1 1 に示されるように、 縦の 偏光および横の偏光による観察像が異なる結果となり、 このことから、 得ら れた融合タンパク質は、 偏光顕微鏡観察下において抗原 （アクチン） に結合 して偏光を示す蛍光タンパク質であることが明らかとなった。
[0090] 実施例 1 0 : アフイマーと 01 6 0 11〇 「 6 6 11の融合タンパク質の設計と 観察
01 6〇 11〇 「 6 6 の 1\1末端の/ 3シートを露出させ、 アフイマーの〇末 端の/ 3シートと連結させて、 アフイマーと
Figure imgf000043_0003
との融合夕 ンパク質を得た。 01 6〇 11〇 「 6 6 |·!としては、 末端のアミノ酸を削り \¥0 2020/175502 42 卩（：171? 2020 /007568
込んで作成した配列番号 3 8に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を用 いた。 アフィマーとしては、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するアク チンに結合するアフィマーを用いた。 遺伝子工学的手法によって、 これらを 連結させ、 配列番号 3 9に記載されたアミノ酸配列を有する融合タンパク質 を設計した。
[0091 ] 得られた融合タンパク質は、 図 1 2に記載の 3次元構造モデルにより示さ れている。 図 1 2では、 アフイマーの〇末端の/ 3シートと、 〇1 6〇 1^〇 「 ㊀㊀ の 末端の /3シートが一連の /3シートを形成しているようすが認めら れる。 設計した融合タンパク質をコードする口 八を適切なプロモーター下 に配置した発現べクターをリボフエクシヨン法 （リポフエクタミン 3 0 0 0 試薬） によって導入することにより、 1~1 6
Figure imgf000044_0001
3細胞に上記融合タンパク質を 発現させた。 蛍光偏光顕微鏡下で融合タンパク質を発現した細胞を観察した
[0092] 結果は、 図 1 2に示される通りであった。 図 1 2に示されるように、 縦の 偏光および横の偏光による観察像が異なる結果となり、 このことから、 得ら れた融合タンパク質は、 偏光顕微鏡観察下において抗原 （アクチン） に結合 して偏光を示す蛍光タンパク質であることが明らかとなった。
[0093] 実施例 1 1 :タンパク質に八 !_ 八タグを導入して偏光蛍光観察をする丰法
本実施例では、 観察対象のタンパク質に対する結合タンパク質を取得する ことなく、 当該タンパク質の蛍光偏光観察を可能とする手法の構築を試みた 。 具体的には、 観察対象のタンパク質を八 !_ 八タグ （アルファタグ） で標 識し、 八 !_ 八タグに結合するナノボディでこれを検出する系を構築した。
[0094] 具体的には、 上記検出系の検証のためのモデル系として、 ーアクチンに 結合するアフィマー （配列番号 2） に八 !_ 八タグ （配列番号 4 0） を導入 して、 配列番号 4 1 に記載のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を得た。 この融合タンパク質の 3次元構造モデルは、 図 1 3に示される通りであった 。 この融合タンパク質を 1~1 6 !_ 3 IV!細胞に発現させた。 これに対して、 抗八 !- 八タグナノボディ （配列番号 4 2） と〇 1 7 6 - 1 7 2〇1 6门リ 3 \¥0 2020/175502 43 卩（：171? 2020 /007568
の融合タンパク質 （配列番号 4 3） と接触させ、 蛍光偏光観察を行った。 抗 八1_ 八タグナノボディと〇 1 7 6 - 1 7 2〇1 6门リ 3の融合タンパク 質は、 ナノボディと〇
Figure imgf000045_0001
く連結した融合 タンパク質であり、 蛍光偏光観察に適したものである （参考：実施例 5） 。
[0095] 結果は、 図 1 3に示される通りであった。 図 1 3に示されるように、 縦の 偏光および横の偏光による観察像が異なる結果となり、 このことから、 得ら れた融合タンパク質は、 偏光顕微鏡観察下において抗原 （ァクチン） に結合 して偏光を示す蛍光タンパク質であることが明らかとなった。 本実施例の実 施形態においてはまず、 ーアクチンをアフィマーが硬く認識している。 次 に、 アフィマーと八 !_ 八タグが硬く連結しており、 かつ、 八!_ 八タグを ナノボディが硬く認識している。 これにより、 いずれのタンパク間相互作用 も、 タンパク質間の連結も硬いものとなっていて、 ーアクチンを〇 1 7 6 - 1 7 2 m V e n U 3の蛍光偏光を用いて観察できたということが結論で きた。
[0096] 実施例 1 2 :他の実施例
その他、 以下表 1の融合タンパク質を設計して同様に蛍光偏光標識が可能 かを確認した。 下記のいずれにおいても、 抗原を蛍光標識することができた 上に、 その蛍光は明らかに偏光を示し、 蛍光偏光標識として利用可能である ことが確認された。 また、 抗原結合タンパク質としてアフィマー、 ナノボデ ィ、 および 3〇 Vを用いることができた。 なお、 表 1 において、 ユトロフ ィンは、 アクチンに結合するタンパク質として知られたタンパク質である。
\¥02020/175502 44 卩（：171? 2020 /007568
[表 1]
表 1 :蛍光偏光標識の実施例
Figure imgf000046_0002
[0097] 以上の通り、 本実施例で設計した融合タンパク質は、 いずれも抗原の蛍光 観察に適する上に、 いずれも蛍光の偏光観察に適していた。 偏光観察におい ては、 虽光標識と抗原とが硬く （00113 1：
Figure imgf000046_0001
に連結している ことが有利であると考えられる。 \¥0 2020/175502 45 卩（：171? 2020 /007568
[0098] 本実施例の結果によれば、 蛍光偏光標識をする際に、 蛍光タンパク質もし くは蛍光標識されるタグタンパク質の末端のへリックス構造と抗原結合タン パク質の末端のへリックス構造とを連結させること、 および蛍光タンパク質 の末端の/ 3シート構造と抗原結合タンパク質の末端の/ 3シート構造とを連結 させることが有効であり得る。 また、 末端にヘリックスまたは/ 3シート構造 を有しない蛍光タンパク質に関しては、 例えば、 末端にヘリックスまたは/ 3 シート構造を有するように蛍光タンパク質の円順列変異体を作製することは 、 有用なタンパク質改変技術であり得る。
さらには、 ヘリックス同士は、 直接連結してもよく、 ヘリックス構造を有 しうるリンカーを介して連結してもよいことが明らかとなった。 ヘリックス 構造を有しうるリンカーを介して連結する場合には、 その長さを 1 アミノ酸 変更することによって、 融合タンパク質における 2つのタンパク質部分の結 合角を約 1 0 0度回転させることができ、 融合タンパク質の作製技術の戦略 の幅を広げるものとなり得る。 また、
Figure imgf000047_0001
シート構造同士を連結する場合にも 、 直接連結してもよく、 末端を削除して連結してもよく、 または、 バリン （ V） などの硬いアミノ酸残基を介して連結してもよいことが明らかとなった 。 偏光観察においては、 蛍光標識と抗原とが硬く （c o n s t 「 3 丨 n e d ） に連結していることが有利であるが、 偏光観察に対しては、 本実施例で示 した様々な連結方法がいずれも有効であることが明らかとなった。
[0099] 配列表
配列番号 1
Figure imgf000047_0002
のアミノ酸配列の一例
配列番号 2 : アクチンに結合するアフイマーのアミノ酸配列の一例 配列番号 3 :ヘリックスリンカーのアミノ酸配列の一例
配列番号 4 : 〇 一 3 干〇 ？とアフイマーとの融合タンパク質のアミノ酸 配列の一例
配列番号
Figure imgf000047_0003
のアミノ酸配列の一例
配列番号 6 : 〇 01 6 11 リ 3とアフイマーとの融合タンパク質のアミノ酸 配列の一例 \¥0 2020/175502 46 卩（：171? 2020 /007568
配列番号 7 : 〇 01丁リ 「 リ〇 I 3 6 2のアミノ酸配列の一例
配列番号 8 : 〇 01丁リ 「 リ〇 I 5 6 2とアフィマーとの融合タンパク質 のアミノ酸配列の一例
配列番号 9 :ハロタグのアミノ酸配列の一例
配列番号 1 0 :ヘリックスリンカー 2のアミノ酸配列の一例
配列番号 1 1 :ハロタグとアフィマーとの融合タンパク質のアミノ酸配列の
_例
配列番号 1 2 :ヘリックスリンカー 3のアミノ酸配列の一例
配列番号 1 3 :ハロタグとアフィマーとの融合タンパク質のアミノ酸配列の
_例
配列番号 1 4 :ヘリックスリンカー 4のアミノ酸配列の一例
配列番号 1 5 :ハロタグとアフィマーとの融合タンパク質のアミノ酸配列の
_例
配列番号 1 6 : ビメンチンに結合するナノボディのアミノ酸配列の一例 配列番号 1 7 :ナノボディと〇 _ 3 干◦ との融合タンパク質のアミノ 酸配列の _例
配列番号 1 8 : 〇1八 丨 ㊀のアミノ酸配列
配列番号 1 9 :ナノボディと 八 丨 6との融合タンパク質のアミノ酸配 列の一例
配列番号 2 0 :非筋ミオシン 丨 丨 に結合する 3〇 Vのアミノ酸配列の一 例
配列番号 2 1 : 3〇 と〇 一 3 干〇 との融合タンパク質のアミノ酸 配列の一例
配列番号 2 2 : 01 1 [¾ 6 7 0のアミノ酸配列
配列番号 2 3 :ヘリックスリンカー 5のアミノ酸配列の一例
配列番号 2 4 :
Figure imgf000048_0001
6 7〇とアフィマーとの融合タンパク質のアミノ 酸配列の _例
配列番号 2 5 :ナノボディと〇 〇1丁リ 「 リ〇 I 5 6 2との融合タンパク 質のアミノ酸配列の一例
配列番号 26 :ナノボディと c pmVe n u sとの融合タンパク質のアミノ 酸配列の _例
配列番号 27 : s c F vと c pmT u r q u o i s e 2との融合タンパク質 のアミノ酸配列の一例
配列番号 28 : H a l 〇 a I k a n e d e h a I o g e n a s eのアミノ 酸配列
配列番号 29 : H a l o a l k a n e d e h a l o g e n a s eの H 27 2 F変異体のアミノ酸配列
配列番号 30 : c p 1 76— 1 72mVe n u sのアミノ酸配列の一例 配列番号 3 1 :ナノボディと c p 1 76- 1 72mVe n u sとの融合タン パク質のアミノ酸配列の一例
配列番号 32 : s c FVと c p 1 76- 1 72mVe n u sとの融合タンパ ク質のアミノ酸配列の一例
配列番号 33 :ユトロフィンのアクチン結合部位のアミノ酸配列の一例 配列番号 34 : mEG F Pのアミノ酸配列の一例
配列番号 35 :ユトロフィンのアクチン結合部位と m EG F Pとの融合タン パク質のアミノ酸配列の一例
配列番号 36 : N末端を切除した mS c a r 丨 e tの断片のアミノ酸配列の _例
配列番号 37 : アクチンに結合するアフィマーと m S c a r l e tとの融合 タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号 38 : N末端を切除した mN e〇 n G r e e nの断片のアミノ酸配 列の一例
配列番号 39 : アクチンに結合するアフィマーと mN e o n G r e e nとの 融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
配列番号 40 : A L F Aタグのアミノ酸配列の一例
配列番号 4 1 : AL F Aタグが導入されたアフィマーのアミノ酸配列の一例 \¥02020/175502 48 卩（：17 2020 /007568 配列番号 42 :抗 1_ タグナノボディのアミノ酸配列の一例 配列番号 43 :抗八 1_ 八タグナノボディと〇 1 76- 1 72 111
Figure imgf000050_0001
3との融合タンパク質のアミノ酸配列の一例

Claims

\¥0 2020/175502 49 卩（：17 2020 /007568 請求の範囲
[請求項 1 ] 抗原結合タンパク質と蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグと の融合タンパク質であって、
抗原結合タンパク質は、 末端にヘリックス構造または/ 3シート構造 を有する抗原結合タンパク質であり、
蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグは、 末端にヘリックス構 造または/ 3シート構造を有する蛍光タンパク質または蛍光標識される タグであり、
当該末端のヘリックスと末端のヘリックスとが連結されている、 ま たは
当該末端の /3シート構造と末端の /3シート構造とが連結されている 融合タンパク質。
[請求項 2] 抗原結合タンパク質が、 末端にヘリックス構造を有し、
蛍光タンパク質または蛍光標識されるタグが、 0末端にヘリックス 構造を有し、
抗原結合タンパク質の末端のヘリックスと蛍光タンパク質または蛍 光標識されるタグの末端のヘリックスとが連結されている、 請求項 1 に記載の融合タンパク質。
[請求項 3] 抗原結合タンパク質が、 アフィマーである、 請求項 2に記載の融合 タンパク質。
[請求項 4] 蛍光タンパク質が、 ◦ ？及び◦ ？様の/ 3バレル構造を有する蛍 光タンパク質と点変異体の円順列変異体から選択される 0末端にヘリ ックス構造を有する蛍光タンパク質である、 請求項 2または 3に記載 の融合タンパク質。
[請求項 5] 抗原結合タンパク質が、 ＜3末端に/ 3シート構造を有し、
蛍光タンパク質が、 ！\1末端に/ 3シート構造を有し、
当該＜3末端の/ 3シート構造と !\1末端の/ 3シート構造とが連結されて \¥0 2020/175502 50 卩（：171? 2020 /007568
いる、
請求項 1 に記載の融合タンパク質。
[請求項 6] 抗原結合タンパク質が、 ナノボディまたは 3〇 Vである、 請求項
5に記載の融合タンパク質。
[請求項 7] 蛍光タンパク質が、 ◦ 及び◦ 様の/ 3バレル構造を有する蛍 光タンパク質および点変異体、 並びにこれらの円順列変異体および欠 失変異体からなる群から選択される、 1\!末端に/ 3シート構造を有する 蛍光タンパク質である、 請求項 5または 6に記載の融合タンパク質。
[請求項 8] 蛍光標識されるタグが、 0末端にヘリックス構造を有する配列番号
9または 2 9に記載されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有 するハロアルカンデハロゲナーゼの脱ハロゲン化ドメインである、 請 求項 2または 3に記載の融合タンパク質。
[請求項 9] 蛍光タンパク質が、 0末端にヘリックス構造を有するフィ トクロム 系もしくはシアノバクテリオクロム系の近赤外蛍光タンパク質である 、 請求項 2または 3に記載の融合タンパク質。
[請求項 10] 請求項 1〜 9のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、 組成 物。
[請求項 1 1 ] 請求項 1〜 9のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする 核酸。
[請求項 12] 請求項 1 1の核酸を含み、 前記核酸は、 制御配列に作動可能に連結 したものである、 細胞内で融合タンパク質を発現させることに用いる ための遺伝子発現べクター、 または当該べクターで形質転換された細 胞、 もしくは
Figure imgf000052_0001
八を導入された細胞。
[請求項 13] 抗原の観察方法であって、
請求項 1〜 9のいずれか一項に記載の融合タンパク質と結合した抗 原を観察することを含む、 方法。
[請求項 14] 抗原が、 水溶液内または細胞内もしくは細胞表面の抗原である、 請 求項 1 3に記載の方法。 \¥0 2020/175502 51 卩（：171? 2020 /007568
［請求項 15］ 請求項 1 3または 1 4に記載の方法であって、
請求項 1〜 9のいずれか一項に記載の融合タンパク質である第一の 融合タンパク質と結合した第一の抗原と、
請求項 1〜 9のいずれか一項に記載の融合タンパク質である第二の 融合タンパク質 ｛但し、 第一の融合タンパク質と第二の融合タンパク 質の蛍光波長は異なる｝ と結合した第二の抗原と
のそれぞれを観察することを含む、 方法。
［請求項 16］ 請求項 1 5に記載の方法であって、
第一の融合タンパク質および第二の融合タンパク質の蛍光相関分光 、 虽光相互相関分光を実施することを含む、 方法。
［請求項 17］ 虽光相関分光、 および虽光相互相関分光が、 偏光虽光相関分光であ る、 請求項 1 6に記載の方法。
［請求項 18］ 融合タンパク質のアミノ酸配列を設計する方法であって、
抗原結合タンパク質のアミノ酸配列である第一のアミノ酸配列と蛍 光タンパク質のアミノ酸配列である第二のアミノ酸配列を用意するこ とと、 ここで、 第一のアミノ酸配列の 1\1末端および第二のアミノ酸配 列の〇末端、 または、 第一のアミノ酸配列の〇末端および第二のアミ ノ酸配列の 1\］末端が、 共にヘリックス構造であるか、 共に/ 3シート構 造であるか、 1\1末端または（3末端の一部を切除することで共にへリッ クス構造となるものであるか、 末端または〇末端の一部を切除する ことで共に/ 3シート構造となるものであり、
第一のアミノ酸配列の 1\!末端および第二のアミノ酸配列の〇末端、 または、 第一のアミノ酸配列の〇末端および第二のアミノ酸配列の 末端を連結し、 これによって、 連結箇所がヘリックス構造または/ 3シ -卜構造の一部となるアミノ酸配列を得ることとを含む、 方法。
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