JP5259207B2 - 細胞画像解析装置及びその方法並びにそのソフトウェア - Google Patents
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Description
図1は、本発明による細胞の膜トランスロケーション反応を判定する細胞画像解析装置の好ましい実施形態を組み込んだ蛍光顕微鏡観察システムを模式的に表したものである。なお、説明の簡単化のため、本発明の構成に特に関りのない部分については、省略されている。
図2は、トランスロケーション分子が蛍光標識された或る一つの細胞の膜トランスロケーション反応の前後の蛍光像を模式的に表したものである(なお、細胞は、マイクロタイタープレートのウェルの底面に張り付いた状態の接着性細胞である。)。同図を参照して、膜トランスロケーション反応前の細胞(図2(A))に於いては、トランスロケーション分子は、細胞質全体に遊離して存在しているので、細胞の蛍光強度分布は、図2(B)に示されている如く形状となる。かかる細胞に於いて、或る特定の刺激が与えられ、膜トランスロケーション反応が発生すると、トランスロケーション分子が細胞膜近傍に集積し、図2(C)、(D)に示されている如く、蛍光像に於いて細胞の外周の蛍光強度が相対的に増大する(実際には、トランスロケーション分子は、細胞の上下面を含めて細胞の全表面に集積するが、蛍光像における蛍光強度は、図2(E)に示されている如く、対物レンズの焦点深度方向について積算されるので、蛍光像で観て細胞の外周のみの蛍光強度が増大される。)。
上記の本発明の膜トランスロケーション反応を判定する装置又は方法に於いては、「発明の開示」の欄に於いて既に触れたように、細胞に刺激を与えることにより該細胞の細胞質内に遊離しているタンパク質が該細胞の細胞膜に集積する反応や、又は、細胞に刺激を与えることにより該細胞内の細胞小器官に存在するタンパク質が該細胞の細胞膜に集積する反応について判定することができる。例えば、子宮頚癌細胞株化細胞の一種であるHeLa細胞に於いて、PMA(ホルポールミリスチルアセテート)や放射線の刺激により、細胞質内に浮遊するプロテインカイネースC(PKC)が細胞膜へ移動する反応(細胞質から細胞膜への膜トランスロケーション反応の例)や、脂肪細胞株3T3−L1に於いて、インスリン非存在下ではトランスゴルジ膜上に存在している分子GLUT4が、インスリンに刺激されることにより細胞膜表面に急激に移動する反応(細胞小器官の膜から細胞膜への膜トランスロケーション反応の例。なお、GLUT4は、かかる反応によりグルコースを細胞内に取り込む活性を発揮することとなる。)などの反応の判定を行うことが可能である。
図3(A)は、上記の蛍光顕微鏡観察システムに於いて上記の如く調製された細胞試料標本Pの蛍光像を画像データとして取得するまでの処理過程をフローチャートの形式にて表したものである。同図を参照して、まず、観察者又は実験者が画像解析装置100(及びマルチコントローラー)の電源を投入し、画像解析装置100に於いて、キーボード102を操作して専用ソフトウェアを起動すると、蛍光顕微鏡1の各部の設定の初期化が実行され、モニター上に蛍光顕微鏡観察システムの種々の設定と作動を指示するための画面が映し出される(ステップ10)。この段階に於いて、観察者又は実験者は、画像解析装置100から、上記の如く調製された細胞試料が分注されたマイクロタイタープレートPの撮影すべきウェル、1つのウェルについての撮影枚数、励起光波長等の種々の設定が入力される(ステップ20)。また、この時点で、ウェル内の任意の細胞試料に対物レンズ4の焦点が合うように対物レンズ4とマイクロタイタープレートPの底面との距離を確定するべくオートフォーカスユニットにて維持されるべき対物レンズの高さが決定されてよい。また、対物レンズ4の補正環6もマイクロタイタープレートPの底面のカバーガラスの厚みに合うように自動的に調節されてよい。
図3(B)は、図3(A)で得られた細胞試料標本の蛍光像(図4(A))から膜トランスロケーション反応の判定を行う処理過程をフローチャートの形式で表したものである。なお、以下に説明する画像解析は、蛍光像の取込みに続けて実行されるが、別の装置又はシステムにより調製され保存された画像データを画像解析装置100に取り込んで行ってもよい。
(輪郭線の領域の輝度平均値)/(輪郭線のより内側の輝度平均値)>X
が成立するとき、細胞膜近傍にトランスロケーション分子が集積し、膜トランスロケーション反応が発生したと判定される(ステップ150)。なお、所定値Xは、観察者又は実験者により予め設定されてよい。また、上記の膜トランスロケーション反応の判定に於いて、輝度平均値の比の大小の評価は、複数の異なる値によりなされ、膜トランスロケーション反応の進行の程度が数段階に分類されてもよい。所定値Xは、少なくとも現在検査されている細胞の全てについて固定的に用いられるので、判定基準のばらつきは回避される。
(膜トランスロケーション反応発生細胞数)/(細胞の総数)
により、膜トランスロケーション反応の反応率が算出されてよい(ステップ160)。
2…電動ステージ
3…透過光観察用光源
4…対物レンズ
5…対物電動駆動機構
6…蛍光観察用励起光光源
7…ダイクロイックミラー
8…カメラ
10…マルチコントローラー
20…オートフォーカスユニット
100…コンピュータ(画像解析装置)
Claims (21)
- 任意の刺激を細胞に与えることにより前記細胞内に発生する膜トランスロケーション反応の有無を判定する細胞画像解析装置であって、
前記膜トランスロケーション反応の際に細胞膜へ移動するトランスロケーション分子が蛍光標識された細胞の前記刺激が与えられた後の蛍光顕微鏡像を画像データとして取得する手段と、
前記トランスロケーション分子の蛍光標識の発する蛍光の強度に基づいて前記細胞の蛍光顕微鏡像の画像データに於ける前記細胞の存在する領域を決定する手段と、
前記細胞の存在する領域の外縁から内向きに所定の画素数の幅を有する該細胞の輪郭線を決定する手段と、
前記細胞の蛍光顕微鏡像の画像データに於いて前記細胞の輪郭線上に於ける輝度値と前記細胞の輪郭線より内側の輝度値とに基づいて膜トランスロケーション反応の有無を判定する手段と
を含むことを特徴とする装置。 - 請求項1の装置であって、前記膜トランスロケーション反応の有無を判定する手段が、前記細胞の輪郭線上に位置する全画素の輝度値の平均と前記細胞の輪郭線より内側に位置する画素の輝度値の平均とを算出し、前記細胞の輪郭線より内側の平均に対する前記細胞の輪郭線上の平均の比が所定値を越えたときに前記膜トランスロケーション反応が発生した判定することを特徴とする装置。
- 請求項1又は2の装置であって、前記蛍光顕微鏡像が複数個の細胞の蛍光顕微鏡像を含み、前記細胞の存在する領域を決定する手段が前記複数個の細胞の各々の存在する領域を決定し、前記細胞の輪郭線を決定する手段が前記複数個の細胞の各々の輪郭線を決定し、前記膜トランスロケーション反応の有無を判定する手段が前記複数個の細胞の各々の輪郭線上に於ける輝度値と該輪郭線より内側の輝度値とに基づいて膜トランスロケーション反応の有無を判定することを特徴とする装置。
- 請求項3の装置であって、前記細胞の存在する領域に基づいて前記蛍光顕微鏡像内の複数個の細胞の個数をカウントする手段を有していることを特徴とする装置。
- 請求項4の装置であって、更に、前記蛍光顕微鏡像内の複数個の細胞のうち前記膜トランスロケーション反応が発生した細胞の個数の割合を算出することを特徴とする装置。
- 請求項1乃至5の装置であって、前記細胞の輪郭線を決定する手段に於いて決定される前記輪郭線の所定の幅が使用者により設定可能であることを特徴とする装置。
- 請求項1乃至6の装置であって、前記細胞が前記細胞の蛍光顕微鏡像を得るための蛍光顕微鏡内に配置される観察試料容器の底面又は上面に接着する細胞であり、更に、前記蛍光顕微鏡の対物レンズの焦点を前記観察試料の底面又は上面に自動的に合わせることにより前記細胞に前記対物レンズの焦点を合わせるよう前記対物レンズの位置を制御する手段が設けられていることを特徴とする装置。
- 任意の刺激を細胞に与えることにより前記細胞内に発生する膜トランスロケーション反応の有無を判定する細胞画像解析用コンピュータプログラムであって、
前記膜トランスロケーション反応の際に細胞膜へ移動するトランスロケーション分子が蛍光標識された細胞の前記刺激が与えられた後の蛍光顕微鏡像を画像データとして取得する手順と、
前記トランスロケーション分子の蛍光標識の発する蛍光の強度に基づいて前記細胞の蛍光顕微鏡像の画像データに於ける前記細胞の存在する領域を決定する手順と、
前記細胞の存在する領域の外縁から内向きに所定の画素数の幅を有する該細胞の輪郭線を決定する手順と、
前記細胞の蛍光顕微鏡像の画像データに於いて前記細胞の輪郭線上に於ける輝度値と前記細胞の輪郭線より内側の輝度値とに基づいて膜トランスロケーション反応の有無を判定する手順と
をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。 - 請求項8のコンピュータプログラムであって、前記膜トランスロケーション反応の有無を判定する手順に於いて、前記細胞の輪郭線上に位置する全画素の輝度値の平均と前記細胞の輪郭線より内側に位置する画素の輝度値の平均とを算出し、前記細胞の輪郭線より内側の平均に対する前記細胞の輪郭線上の平均の比が所定値を越えたときに前記膜トランスロケーション反応が発生した判定することを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項8又は9のコンピュータプログラムであって、前記蛍光顕微鏡像が複数個の細胞の蛍光顕微鏡像を含み、前記細胞の存在する領域を決定する手順に於いて前記複数個の細胞の各々の存在する領域を決定し、前記細胞の輪郭線を決定する手順に於いて前記複数個の細胞の各々の輪郭線を決定し、前記膜トランスロケーション反応の有無を判定する手順に於いて前記複数個の細胞の各々の輪郭線上に於ける輝度値と該輪郭線より内側の輝度値とに基づいて膜トランスロケーション反応の有無を判定することを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項10のコンピュータプログラムであって、前記蛍光顕微鏡像内の複数個の細胞の個数をカウントし、前記蛍光顕微鏡像内の複数個の細胞のうち前記膜トランスロケーション反応が発生した細胞の個数の割合を算出することを特徴とするコンピュータプログラム。
- 任意の刺激を細胞に与えることにより前記細胞内に発生する膜トランスロケーション反応の有無を判定する方法であって、
前記膜トランスロケーション反応の際に細胞膜へ移動するトランスロケーション分子が蛍光標識された細胞の前記刺激が与えられた後の蛍光顕微鏡像を画像データとして取得する過程と、
前記トランスロケーション分子の蛍光標識の発する蛍光の強度に基づいて前記細胞の蛍光顕微鏡像の画像データに於ける前記細胞の存在する領域を決定する過程と、
前記細胞の存在する領域の外縁から内向きに所定の画素数の幅を有する該細胞の輪郭線を決定する過程と、
前記細胞の蛍光顕微鏡像の画像データに於いて前記細胞の輪郭線上に於ける輝度値と前記細胞の輪郭線より内側の輝度値とに基づいて膜トランスロケーション反応の有無を判定する過程と
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項12の方法であって、前記膜トランスロケーション反応の有無を判定する過程に於いて、前記細胞の輪郭線上に位置する全画素の輝度値の平均と前記細胞の輪郭線より内側に位置する画素の輝度値の平均とを算出し、前記細胞の輪郭線より内側の平均に対する前記細胞の輪郭線上の平均の比が所定値を越えたときに前記膜トランスロケーション反応が発生した判定することを特徴とする方法。
- 請求項12又は13の方法であって、前記蛍光顕微鏡像が複数個の細胞の蛍光顕微鏡像を含み、前記細胞の存在する領域を決定する過程に於いて前記複数個の細胞の各々の存在する領域を決定し、前記細胞の輪郭線を決定する過程に於いて前記複数個の細胞の各々の輪郭線を決定し、前記膜トランスロケーション反応の有無を判定する過程に於いて前記複数個の細胞の各々の輪郭線上に於ける輝度値と該輪郭線より内側の輝度値とに基づいて膜トランスロケーション反応の有無を判定することを特徴とする方法。
- 請求項14の方法であって、前記細胞の存在する領域に基づいて、前記蛍光顕微鏡像内の複数個の細胞の個数をカウントすることを特徴とする方法。
- 請求項15の方法であって、更に、前記蛍光顕微鏡像内の複数個の細胞のうち前記膜トランスロケーション反応が発生した細胞の個数の割合を算出することを特徴とする方法。
- 請求項12乃至16の方法であって、判定される前記膜トランスロケーション反応が前記細胞に刺激を与えることにより該細胞の細胞質内に遊離しているタンパク質が該細胞の細胞膜に集積する反応である方法。
- 請求項12乃至17の方法であって、判定される前記膜トランスロケーション反応が前記細胞に刺激を与えることにより該細胞内の細胞小器官に存在するタンパク質が該細胞の細胞膜に集積する反応である方法。
- 請求項12乃至18の方法であって、前記細胞が接着性細胞である方法。
- 請求項12乃至19の方法であって、前記細胞の蛍光顕微鏡像を取得する過程に先立って、前記膜トランスロケーション反応の際に細胞膜へ移動するトランスロケーション分子が蛍光タンパク質と融合した状態にて発現するための遺伝子を前記細胞に導入する過程と、前記細胞に於いて前記蛍光タンパク質と融合したトランスロケーション分子を発現させる過程とを含むことを特徴とする方法。
- 請求項12乃至19の方法であって、前記細胞の蛍光顕微鏡像を取得する過程に先立って、前記膜トランスロケーション反応の際に細胞膜へ移動するトランスロケーション分子にタグ分子を導入するための遺伝子を前記細胞に導入する過程と、前記細胞に於いて前記タグ分子が導入されたトランスロケーション分子を発現させる過程と、前記細胞に前記タグ分子と特異的に結合する蛍光色素を導入しこれにより前記トランスロケーション分子を蛍光標識する過程とを含むことを特徴とする方法。
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