JP2001211896A - 画像解析方法、装置、及び記録媒体 - Google Patents

画像解析方法、装置、及び記録媒体

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JP2001211896A
JP2001211896A JP2000360050A JP2000360050A JP2001211896A JP 2001211896 A JP2001211896 A JP 2001211896A JP 2000360050 A JP2000360050 A JP 2000360050A JP 2000360050 A JP2000360050 A JP 2000360050A JP 2001211896 A JP2001211896 A JP 2001211896A
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English (en)
Inventor
Midori Hatanaka
Yuichi Kawada
Susumu Kikuchi
Kunihiko Miura
Takatomo Sato
邦彦 三浦
卓朋 佐藤
雄一 河田
みどり 畑中
奨 菊地
Original Assignee
Olympus Optical Co Ltd
オリンパス光学工業株式会社
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Abstract

(57)【要約】 【課題】有核細胞中の染色体異常、すなわち間期細胞中
のDNA損傷を、小核を指標として客観的かつ効率良く
自動解析する画像解析方法、装置、及び記録媒体を提供
すること。 【解決手段】生物学的染色を施された有核細胞からなる
観察対象を観察するための顕微鏡(A)と、この顕微鏡
(A)から画像を取り込む画像入力手段(10)と、こ
の画像入力手段(10)で取り込まれた画像に対して多
段階の閾値を設定する閾値設定手段(31)と、この閾
値設定手段(31)により閾値を設定された前記有核細
胞の各画像について輪郭形状解析を行なう輪郭形状解析
手段(33)と、この輪郭形状解析手段(33)で解析
された細胞群のうち指定された形状を有する特定細胞を
選択的に計数する計数手段(34)と、を具備する。

Description

【発明の詳細な説明】

【0001】

【発明の属する技術分野】本発明は、生物の有核細胞に
対する画像解析に関し、特に、環境変異原により誘発さ
れた有核細胞中の染色体の異常を解析する画像解析方
法、装置、及び記録媒体に関する。

【0002】

【従来の技術】染色体を有するあらゆる生物には、遺伝
的要因または環境変異原等により、種々の染色体異常が
発生し得ることが知られている。染色体異常の検出の多
くは、核型(karyotype)の分析に依存してい
る。核型を分析するためには、有核生物の細胞の細胞周
期において、分裂中期(metaphase)の細胞を
必要とする。

【0003】分裂中期の細胞の標本を作製する際には、
細胞内の個々の染色体群の全てが、重なりが無く分離さ
れるように、且つ、個々の染色体が充分に伸展するよう
に、慎重な調製を必要とする。しかし例えば、24種類
の異なる染色体群から成るヒトの染色体について、上述
したような完全な標本を多数得ることは困難である。ま
た、核型分析は、細胞内で個々に分かれた染色体の全て
を検証し、健常人の正常な核型と異なる核型を染色体異
常として、異常の種類を分類するという作業が要求され
る。

【0004】一方、分裂中期細胞の染色体に欠失、切
断、不分離等の形態的な異常が生じた場合には、その後
の間期(interphase)における細胞核の一部
が分離して微少な核が形成されることが知られており、
このような微少な核を小核(micronucleu
s)と呼んでいる。これに対して、小核を生じた親の核
を主核(main nucleus)と呼んで区別す
る。従って、小核の出現は、間期細胞における染色体異
常の発生を意味するものである。

【0005】小核の研究には、ヒトでは主に末梢血中の
リンパ球が用いられている。正常なリンパ球では、小核
の出現頻度は極めて低いが、有害な薬剤等の刺激によ
り、その出現頻度は劇的に増加することが知られている
(Heddle,J.A.ら、Mutat.Res.4
4,63−69,1977)。従って、小核の出現とそ
の頻度は、何らかの遺伝的要素、環境変異原、ウイルス
等の影響により、DNA損傷による染色体異常が生じた
ことを示す指標となり得る。また、今日、げっ歯類や培
養細胞を用いる小核試験は、ヒトに対する変異原性の有
無や程度を実験的に予測するための研究に寄与してい
る。

【0006】このように、生体から採取した有核細胞ま
たは培養細胞における小核の出現頻度を解析すること
で、環境変異原等の影響によるDNA損傷の結果とし
て、染色体異常が生じた度合いを評価することができ
る。この小核解析の実際の適用場面としては、1)生物
学的環境モニタリングと、2)安全性スクリーニングの
大きく二つの分野が想定される。上記1)としては、環
境中に生息する生物から採取した有核細胞を用いること
で、環境汚染度を推測したり、または、特定の労働環境
や生活習慣を有するヒト集団から採取した血液中のリン
パ球などを解析することで、ヒトにおけるDNA損傷の
度合いを直接評価する場合がある。一方、上記2)は主
として、新規に合成された化学物質のDNA損傷性を評
価するものであり、哺乳類培養細胞に被験物質を処理
し、細胞増幅率がほとんど低下しない低濃度処理条件か
ら、細胞毒性が生じて細胞増幅率が著しく低下する高濃
度処理条件までの広範囲に亘って、小核の出現の有無を
解析するものである。

【0007】上述した従来の小核の解析は、顕微鏡観察
を基本として行なわれてきた。この場合、観察者の目に
よる小核の出現頻度の判定においては、各人が潜在的に
もつ主観による判定であるため、データにバラツキが生
じ、必ずしも信頼性のあるデータが得られるとはいえな
い。また、検出精度を確保するために数多くの細胞を観
察する必要があるとともに、微細構造体である小核を肉
眼により長時間に亘って観察することは、かなりの労力
や工数を必要とし、観察者に対して大きな負担が生ずる
といった問題がある。従って、細胞中のDNA損傷性を
小核出現頻度によって定量的に評価しようとする場合に
は、より客観的かつ効率的な小核の検出技術、即ち、自
動解析技術が必要とされる。

【0008】これまで、無核細胞であるげっ歯類の赤血
球を対象とした小核の自動解析技術としては、特開平9
−89886号公報に顕微鏡画像処理を用いる解析法、
また特許第2893613号公報にフローサイトメトリ
を用いる解析法が開示されている。しかしながら、ヒト
をはじめとする多くの体細胞は有核であり、このような
有核細胞中の小核解析には、上記の無核細胞を対象とし
た解析技術は適用できない。

【0009】一方従来では、有核細胞中の小核を肉眼で
識別するために、ギムザ染色標本が用いられてきた。こ
うした標本を対象とした顕微鏡画像解析技術も考案され
ている(Tates AD.,et al.,Int.
J.Radiat.Biol.58:813−825,
1990;Castelain PP.,et a
l.,Mutagenesis 8:285−293,
1993,Verhaegen F.,et al.,
Cytometry 17:119−127,199
4;Bocker W.,et al.,Cytome
try 19:283−294,1995;Friea
uff W.et al.,MutationRe
s.,413:57−68,1998)。

【0010】しかし、今日では、細胞中の細胞質(RN
A)/核(DNA)に対して、より特異的な蛍光色素と
してアクリジンオレンジ(AO)が好んで採用され、A
O染色標本の観察が主流となりつつあり(Matsuo
ka A.et al.,Mutation Re
s.,272:223−236,1993)、蛍光染色
された有核細胞標本における小核の解析が重要視されて
いる。

【0011】

【発明が解決しようとする課題】有核細胞の蛍光顕微鏡
画像を対象とした小核自動検出技術に関しては、特開平
10−185911号公報に開示されているが、顕微鏡
画像がカラー画像で撮り込まれ、その後にDNAとRN
Aの画像にそれぞれ分割して画像処理を行なうため、著
しい画像の劣化が生じ、ごく微細な小核は検出が困難に
なる。また、蛍光の色度・明度・彩度の定量的解析が、
ある一定の閾値を設定した画像を対象として行なわれて
いるため、生物試料特有の蛍光輝度のバラツキを正確に
反映できず、結果的に、近接した細胞や主核・小核が正
確に分離・認識できないことになる。従って、目視判定
結果と比較した場合においても、著しい差異が生じてし
まうという大きな問題があった。

【0012】本発明の第1の目的は、有核細胞中の染色
体異常、すなわち間期細胞中のDNA損傷を、小核を指
標として客観的かつ効率良く自動解析する画像解析方
法、装置、及び記録媒体を提供することにある。

【0013】本発明の第2の目的は、主核の輝度にバラ
ツキがある細胞の画像に対しても、適切な基準閾値を設
定可能とし、精度の高い画像解析を行なえる画像解析方
法を提供することにある。

【0014】本発明の第3の目的は、有核細胞にて起こ
り得る細胞の形状変化に適応した基準閾値の設定を、客
観的かつ効率よく行なえる画像解析方法を提供すること
にある。

【0015】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決し目的を
達成するために、本発明の画像解析方法、装置、及び記
録媒体は以下の如く構成されている。

【0016】(1)本発明の画像解析方法は、顕微鏡で
得られた有核細胞の画像を基に染色体に発生した異常を
解析する画像解析方法において、細胞周期が間期に相当
する有核細胞の細胞質と核を蛍光色素で標識して観察対
象とし、顕微鏡により得られた前記観察対象の蛍光画像
に対して、その画像の明暗に応じて前記観察対象の形状
を把握し、形状を把握した前記観察対象において所定の
形状を有する特定細胞を検出し、その個数を計数する。

【0017】(2)本発明の画像解析方法は上記(1)
に記載の方法であり、かつ前記顕微鏡により得られた前
記観察対象の蛍光画像に対して多段階の閾値設定を行な
い、前記観察対象の形状を把握する。

【0018】(3)本発明の画像解析方法は上記(1)
に記載の方法であり、かつ前記顕微鏡により得られた前
記観察対象の蛍光画像に対して、その画像の明暗に応じ
て輪郭形状解析を行なうことで、前記観察対象の形状を
把握する。

【0019】(4)本発明の画像解析方法は上記(2)
に記載の方法であり、かつ前記特定細胞を検出する過程
で、前記核の蛍光画像について多段階の閾値設定を行な
う。

【0020】(5)本発明の画像解析方法は上記(1)
に記載の方法であり、かつ前記特定細胞が間期細胞であ
り、かつ小核の有無を検出する工程と、検出した小核の
個数を主核と対応付けて計数する工程とを有する。

【0021】(6)本発明の画像解析方法は上記(5)
に記載の方法であり、かつ前記小核を計数する過程で、
前記核の蛍光画像について多段階の閾値設定を行なう。

【0022】(7)本発明の画像解析方法は上記(3)
に記載の方法であり、かつ前記特定細胞を検出する過程
で、前記細胞質及び核の少なくとも一方の蛍光画像につ
いて輪郭形状解析を行なう。

【0023】(8)本発明の画像解析方法は上記(1)
に記載の方法であり、かつ前記有核細胞の蛍光画像につ
いて多段階の閾値設定を行ない、かつ輪郭形状解析を行
なうことにより、前記細胞質と前記核を認識する。

【0024】(9)本発明の画像解析装置は、顕微鏡で
得られた有核細胞の画像を基に染色体に発生した異常を
解析する画像解析装置において、生物学的染色を施され
た有核細胞からなる観察対象を観察するための顕微鏡
と、この顕微鏡から画像を取り込む画像入力手段と、こ
の画像入力手段で取り込まれた画像に対して多段階の閾
値を設定する閾値設定手段と、この閾値設定手段により
閾値を設定された前記有核細胞の各画像について輪郭形
状解析を行なう輪郭形状解析手段と、この輪郭形状解析
手段で解析された細胞群のうち指定された形状を有する
特定細胞を選択的に計数する計数手段と、から構成され
ている。

【0025】(10)本発明の画像解析装置は上記
(9)に記載の装置であり、かつ前記顕微鏡は、前記観
察対象を自動的に走査する走査手段を備えている。

【0026】(11)本発明の画像解析装置は上記
(9)に記載の装置であり、かつ前記顕微鏡は、前記観
察対象の複数の細胞群に対して、自動的に合焦を行なう
合焦手段を備えている。

【0027】(12)本発明の画像解析装置は上記
(9)に記載の装置であり、かつ前記顕微鏡と前記画像
入力手段との間に、細胞質と核の蛍光波長を特異的に吸
収・励起するためのフィルタを自動的に変換する変換手
段を備えている。

【0028】(13)本発明の記録媒体は、コンピュー
タ読み取り可能であり、コンピュータを、顕微鏡で得ら
れた有核細胞の画像に対して多段階の閾値を設定する閾
値設定手段、この閾値設定手段により閾値を設定された
前記有核細胞の各画像について輪郭形状解析を行なう輪
郭形状解析手段、この輪郭形状解析手段で解析された細
胞群のうち指定された形状を有する特定細胞を選択的に
計数する計数手段、として機能させるためのプログラム
を記録している。

【0029】(14)本発明の画像解析方法は、顕微鏡
で得られた有核細胞の画像を基に染色体に発生した異常
を解析する画像解析方法において、細胞周期が間期に相
当する有核細胞の細胞質と核を蛍光色素で標識して観察
対象とし、顕微鏡により得られた前記観察対象の主核の
蛍光画像に対して、中間輝度の分布または面積を指標と
することで、前記有核細胞が細胞毒性を受けているか否
かを識別し、この識別の結果に応じて基準閾値を設定
し、前記有核細胞の画像を解析する。

【0030】(15)本発明の画像解析方法は上記(1
4)に記載の方法であり、かつ前記有核細胞における前
記主核の画像の全画素数に対する前記画像の中間輝度を
有する画素数の比率が所定値以上である場合に、前記有
核細胞は細胞毒性を受けている細胞であると識別して、
前記基準閾値を所定閾値より低く設定する。

【0031】(16)本発明の画像解析方法は上記(1
4)に記載の方法であり、かつ前記有核細胞における前
記主核の画像に対して閾値を上昇させながら得た2値化
画像の画素数の減少の比率が所定値以上である場合に、
前記有核細胞は細胞毒性を受けている細胞であると識別
して、前記基準閾値を所定閾値より低く設定する。

【0032】(17)本発明の画像解析方法は、顕微鏡
で得られた有核細胞の画像を基に染色体に発生した異常
を解析する画像解析方法において、細胞周期が間期に相
当する有核細胞の細胞質と核を蛍光色素で標識して観察
対象とし、顕微鏡により得られた前記観察対象における
前記細胞質と前記核の各蛍光画像に対して、前記観察対
象ごとに画像を構成する高輝度の画素の占める割合を解
析し、前記細胞質と前記核の各蛍光画像に対して所定閾
値を設定することにより得た各2値化画像を基に、前記
所定閾値を前記割合と対比させることで基準閾値を設定
し、前記有核細胞の画像を解析する。なお、ここで高輝
度とは、画像を構成する階調のうち、最高輝度から下位
約20%までの範囲の輝度を示す。

【0033】(18)本発明の画像解析方法は上記(1
7)に記載の方法であり、かつ前記細胞質または前記核
の蛍光画像中で、前記高輝度の画素の占める割合の減少
度に応じて前記基準閾値を低いものに変更する。

【0034】(19)本発明の画像解析方法は上記(1
4)または(17)に記載の方法であり、かつ前記基準
閾値の設定後、前記観察対象の蛍光画像に対して多段階
の閾値設定を行ない、小核の個数を主核と対応づけて計
数する。

【0035】上記手段を講じた結果、それぞれ以下のよ
うな作用を奏する。

【0036】(1)本発明の画像解析方法によれば、有
核細胞中の染色体異常、すなわち特定細胞中のDNA損
傷を、例えば小核の客観的な判定と自動計測により、客
観的かつ効率良く自動解析することができる。

【0037】(2)本発明の画像解析方法によれば、多
段階の閾値設定を行なうことで、単一の閾値により観察
対象の形状を把握した場合に生ずる細胞間での蛍光輝度
のバラツキの問題が解消され、例えば主核と小核の判定
を正確に行なうことができる。

【0038】(3)本発明の画像解析方法によれば、輪
郭形状解析を行なうことで、近接した細胞質や主核の形
状を正確に認識でき、主核に小核が近接している場合
も、それらの輪郭形状の遷移パターンの特徴を基に、主
核と小核の判定を正確に行なうことができる。

【0039】(4)本発明の画像解析方法によれば、細
胞間での蛍光輝度のバラツキを解消でき、小核を保有す
る細胞の自動識別をきわめて有効に行なうことができ
る。

【0040】(5)本発明の画像解析方法によれば、間
期細胞中のDNA損傷を、小核の客観的な判定と自動計
測により、客観的かつ効率良く自動解析することができ
る。

【0041】(6)本発明の画像解析方法によれば、複
数の画像の中から、より多くの主核を検出する閾値を選
択することができる。すなわち、多段階の閾値設定を行
ない、小核がより多く存在する閾値を選択することで、
従来の如きある一定の閾値において画像解析をすること
による小核保有細胞の見落としを防ぐことができる。

【0042】(7)本発明の画像解析方法によれば、近
接した細胞質及び核の少なくとも一方を効率良く分離す
ることができる。

【0043】(8)本発明の画像解析方法によれば、近
接した細胞質と主核を効率良く分離することができると
ともに、細胞間での蛍光輝度のバラツキを解消でき、小
核を保有する細胞の自動識別をきわめて有効に行なうこ
とができる。

【0044】(9)本発明の画像解析装置によれば、有
核細胞中の染色体異常、すなわち特定細胞中のDNA損
傷を、例えば小核の客観的な判定と自動計測により、客
観的かつ効率良く自動解析することができる。

【0045】(10)本発明の画像解析装置によれば、
多量の解析対象細胞を効率よく検出することができる。

【0046】(11)本発明の画像解析装置によれば、
画像処理に最適な蛍光輝度を有する画像を効率よく入力
することができる。

【0047】(12)本発明の画像解析装置によれば、
細胞質と核の分離した画像を連続的に効率良く解析する
ことができる。

【0048】(13)本発明の記憶媒体によれば、コン
ピュータにより、有核細胞中の染色体異常、すなわち間
期細胞中のDNA損傷を、例えば小核の客観的な判定と
自動計測により、客観的かつ効率良く自動解析すること
ができる。

【0049】(14)本発明の画像解析方法によれば、
有核細胞中の染色体異常、すなわち間期細胞中のDNA
損傷を、客観的かつ正確に解析することができる。

【0050】(15)本発明の画像解析方法によれば、
主核の輝度に著しいバラツキのある細胞画像に対して
も、正確な画像判定を実施することができる。

【0051】(16)本発明の画像解析方法によれば、
主核の輝度に著しいバラツキのある細胞画像に対して
も、正確な画像判定を実施することができる。

【0052】(17)本発明の画像解析方法によれば、
有核細胞中の染色体異常、すなわち間期細胞中のDNA
損傷を、客観的かつ正確に解析することができる。

【0053】(18)本発明の画像解析方法によれば、
細胞毒性をより強く受け、核部の輝度に著しいバラツキ
のある細胞の画像に対しても、正確な画像判定を実施す
ることができる。

【0054】(19)本発明の画像解析方法によれば、
細胞毒性を受けている細胞についても、小核の有無を客
観的かつ正確に解析することができる。

【0055】

【発明の実施の形態】(第1の実施の形態)図1は、本
発明の第1の実施の形態に係る画像解析装置の構成を示
す図である。図1に示す画像解析装置は、顕微鏡で得ら
れた、細胞周期が間期に相当する有核細胞の画像を基
に、染色体に発生した異常を解析するものである。この
装置は、主に、細胞を顕微鏡的に画像化する画像入力部
をなす蛍光顕微鏡Aと画像解析部をなすパーソナル・コ
ンピュータ(PC)Bとで構成されている。

【0056】蛍光顕微鏡Aの本体1には、二次元上で自
動的に走査されるステージ2が設けられており、このス
テージ2には蛍光標識(生物学的染色)を施された細胞
からなる標本Sが載置されている。また、本体1とステ
ージ2には、標本Sに焦点を合わせるようステージ2を
観察光軸a方向へ駆動するオートフォーカス装置3が連
結されている。

【0057】蛍光顕微鏡Aの観察光軸a上には、標本S
が位置するとともに、レボルバー4に取り付けられた対
物レンズ5、本体1内に設けられたダイクロイックミラ
ー6、細胞質(RNA)/核(DNA)で発した蛍光を
特異的に検出するために、観察光軸a上に配置されるフ
ィルターを変換するフィルター変換部7、鏡筒8内に設
けられたハーフミラー9、及び顕微鏡画像の入力用のC
CDカメラ10が配置されている。鏡筒8には接眼レン
ズ11が取り付けられている。また、本体1には、標本
S上に励起光を投射するための光源12が設けられてい
る。

【0058】パーソナル・コンピュータ(PC)Bは、
制御部20と細胞質・核計測部30を備えており、細胞
質・核計測部30は、閾値設定部31、ブロブ解析部3
2、輪郭形状解析部33、及び画像判定部34を有して
いる。なお、細胞質・核計測部30はプログラムとして
図示しないメモリーに記憶されており、制御部20によ
り実行される。

【0059】制御部20には、細胞質・核計測部30を
記憶した上記メモリーが接続されているとともに、入力
部21と表示部22が接続されている。また制御部20
には、ステージ2、オートフォーカス装置3、フィルタ
ー変換部7、及びCCDカメラ10が接続されている。
また、細胞質・核計測部30を記憶した上記メモリーは
CCDカメラ10に接続されている。

【0060】光源12から発した光がダイクロイックミ
ラー6にて反射され、対物レンズ5を介して標本Sを励
起すると、標本Sで発せられた蛍光が、対物レンズ5、
ダイクロイックミラー6、及びハーフミラー9を介して
CCDカメラ10に取込まれる。

【0061】CCDカメラ10に取り込まれた細胞の画
像情報は、細胞質・核計測部30に送られ、後に詳述す
る解析処理が実行される。閾値設定部31では基準閾値
と多段階閾値の設定がなされ、ブロブ解析部32では細
胞画像に対して従来から知られているブロブ解析が行な
われ、輪郭形状解析部33では細胞の輪郭形状が解析さ
れ、画像判定部34では輪郭形状解析部33で解析され
た細胞群のうち小核を形成した間期細胞が主核と対応付
けて計数される。

【0062】制御部20はCPUからなり、本画像解析
装置の全ての構成ユニットの動作を連続的に実行させる
ものである。入力部21はキーボード、タッチパネル、
マウス等からなり、制御部20に対して、解析したい情
報の種類の追加、変更等が行なわれる。表示部22はC
RT、プリンタ等からなり、制御部20により統計処理
された統計データが表示される。

【0063】なお、制御部20を、適宜通信回線を介し
て遠隔地にある検査センター、病院、大学、メーカー等
に対して、各種データの送信/受信を行なえる構成とす
れば、より高度な解析ソフトウェアの実行や、熟練検査
者等による解析方法や情報の交流を迅速に行なうことが
でき、さらに有効な構成になる。

【0064】図2及び図3は、上述した構成をなす画像
解析装置による画像解析方法の処理手順を示すフローチ
ャートである。また図4は、図2及び図3のフローチャ
ートによる処理工程を模式的に示した図である。

【0065】以下、本画像解析装置による細胞質(RN
A)の画像解析方法を図2を基に説明する。まずステッ
プS1で、制御部20はフィルター変換部7にて、細胞
質(RNA)の蛍光波長を特異的に吸収・励起するため
のフィルター(赤色用フィルター)を観察光軸a上に配
置させる。これにより、標本Sにおける細胞質(RN
A)の画像がCCDカメラ10に取込まれ、画像データ
として細胞質・核計測部30に入力される。

【0066】次に細胞質・核計測部30は、入力した細
胞質(RNA)画像に対して画像の輝度補正を行ない、
ステップS2で、閾値設定部31にて基準閾値(基準輝
度)を設定し、図4の画像41に示すように細胞質(R
NA)411,412の画像データを2値化することに
より、解析対象画像を抽出する。

【0067】次にステップS3で、ブロブ解析部32は
従来のブロブ解析法により、細胞質411,412の画
像の重心・面積(ピクセル数の総和)・体積(各ピクセ
ルの蛍光輝度の総和)・真円度・長さと幅の比率などを
分析する。ここで、真円度、及び長さと幅の比率から、
単独の細胞(細胞質411)ではなく複数の細胞が重な
り合った疑いがあるもの(細胞質412)については、
ステップS4で、輪郭形状解析部33にて後述する輪郭
形状解析を行なう。

【0068】これにより、ステップS5で、図4の画像
42に示すように、近接した複数の細胞が独立した個々
の細胞に分離される。例えば、図4にpで示すように、
近接した細胞質が輪郭形状解析によって二つの細胞質に
分離される。

【0069】以下、本画像解析装置による核(DNA)
の画像解析方法を図3を基に説明する。まずステップS
11で、制御部20はフィルター変換部7にて、核(D
NA)の蛍光波長を特異的に吸収・励起するためのフィ
ルター(緑色用フィルター)を観察光軸a上に配置させ
る。これにより、標本Sにおける核(主核・小核:DN
A)の画像がCCDカメラ10に取込まれ、画像データ
として細胞質・核計測部30に入力される。

【0070】次に細胞質・核計測部30は、入力した核
(DNA)画像に対して画像の輝度補正を行ない、ステ
ップS12で、閾値設定部31にて閾値(輝度)を設定
し、図4の画像43に示すように核(DNA)413〜
417の画像データを2値化することにより、解析対象
画像を抽出する。

【0071】次にステップS13で、ブロブ解析部32
は従来のブロブ解析法により、核413〜417の画像
の矩形・面積・体積・真円度・長さと幅の比率などを分
析する。ここで、面積比(細胞質/核)を算出して、あ
る一定の値以上のものを観察対象細胞としてラベル化す
る。また、ステップS14で、体積比(核/細胞)を算
出して、ある一定の値以上のものを主核、前記一定の値
未満のものを小核としてラベル化する。

【0072】さらにステップS15で、輪郭形状解析部
33にて後述する輪郭形状解析を行なうことにより、ス
テップS16で、図4の画像44に示すように近接した
複数個の主核が分離される。例えば、図4にqで示すよ
うに、近接した主核が輪郭形状解析によって二つの主核
に分離される。そして細胞質・核計測部30は、主核の
個数を認識し、図4の45に示すように主核の数が1個
・2個またはそれ以上の細胞を分類し、ステップS17
で、それらを観察対象の細胞として決定する。

【0073】そしてステップS18で、上述した画像解
析処理の結果、小核が存在する場合、図4の45に示す
ように、画像判定部34はその小核の個数を主核と対応
付けるとともに、主核と小核を画像解析された細胞質と
対応付け、各観察対象の細胞ごとに小核を計数し、全観
察対象の細胞中における小核を保有する間期細胞の出現
頻度を集計する。

【0074】その後、ステップS19で、予め設定され
ている段階数(例えば5段階)分の画像解析処理が終了
するまで、上記閾値に対して予め指定されている差分を
順次加えて新たな閾値とし、上記ステップS12〜S1
8の画像解析処理を行なう。以上のような多段階閾値に
よる核の解析が行なわれることで、小核が細胞中により
多く存在する結果が取得される。例えば、図4の画像4
3で検出されなかった小核416が画像44に示すよう
に検出されることになる。

【0075】以上の処理手順のうち、輪郭形状解析につ
いて以下に説明する。輪郭形状解析は、対象画像の輪郭
形状を解析する方法である。本実施の形態では、この方
法を生物試料の画像を対象として、特に細胞質や核の形
状認識に応用している。

【0076】図5は、輪郭形状解析の基本原理を示す図
である。輪郭形状解析では、画像51中の解析対象物5
2の輪郭上のピクセル(図中斜線部分)を追跡し、該輪
郭上の座標を示す座標リストを生成する。次に、前記座
標リスト中の任意の1点Pi、及びその点Piから前後
にそれぞれsだけ離れた2点Pi+s,Pi−sの合計
3点を用いて導かれる特徴量を、前記座標リストのすべ
ての座標について算出し、その遷移パターンを求める。

【0077】ここで特徴量とは、上記した任意の1点P
iと2点Pi+s,Pi−sとで形成される3角形の面
積であり、2点Pi+s,Pi−sの間を結ぶ直線を底
辺とした場合の頂点の向きを正負で定義している。ま
た、上記の遷移パターンとは、上記特徴量の大きさにつ
いて閾値Tvを越えている部分の連続数Ttに基づくも
のであり、パターンの遷移における閾値Tvを越えてい
る部分と下回っている部分の出現順序に基づき、検出部
位(複数の細胞質または複数の核の接触部位)の凹凸を
判断するための基準となるものである。

【0078】図6の(a)〜(b)は、主核・小核の輪
郭形状解析の結果例を示す図である。図6の(a)に示
すように、1個の核を有する細胞61における核の輪郭
形状の遷移パターンは、その特徴量が常に閾値Tvを下
回るが、図6の(b)に示すように、近接した2個の核
を有する細胞62における核の輪郭形状の遷移パターン
では、その特徴量において、閾値Tvを上回るピーク
(くびれ)が2個所生じることになる。また、図6の
(c)に示すように、近接した3個の核を有する細胞6
3においては、特徴量が閾値Tvを上回るピーク(くび
れ)が3個所生じることになる。

【0079】この手法を用いれば、図6の(d)に示す
ように、細胞64における主核に近接した小核について
も、その輪郭形状の遷移パターンの特徴によって検出可
能となる。この場合、主核と小核で生じる2箇所のピー
クの間隔は、図6の(b)に示した主核同士で生じる2
箇所のピークの間隔より狭くなる。

【0080】以上のように解析された画像におけるくび
れ(欠け)の検出数と主核・小核の存在様式は、例え
ば、次のように分類することができる。

【0081】

【表1】

【0082】なお、「くびれの個数」が‘その他’であ
る場合は、その旨を保留としてメモリに記憶しておき、
後に操作者が目視により細胞分類の判定を行なう。

【0083】さらに、本第1の実施の形態においては、
主核・小核の画像について多段階閾値を設定し画像解析
を実施しているが、これは、細胞間での蛍光輝度のバラ
ツキの問題を解消する手段である。例えば、高い閾値で
画像処理を実施した場合には、主核に対して輝度が低い
小核は、画像として認識されなくなってしまう。このよ
うに、主核・小核の細胞間または細胞内の輝度のバラツ
キに起因する判定ミスを解消するために、複数の閾値を
設定した画像について解析することにより、小核の見落
としが非常に少ない結果を得ることが可能となる。

【0084】なお、本第1の実施の形態では、輪郭形状
解析を行なうとともに多段階閾値を設定して画像解析を
実施しているが、これらのうち輪郭形状解析のみまたは
多段階閾値の設定のみを行なった場合でも、従来の手法
に比べて、近接した細胞質や主核・小核の分離・認識を
正確に行なうことができる。

【0085】本第1の実施の形態によれば、第1に、A
O染色された有核細胞標本の画像入力時に細胞質(RN
A)画像と核(DNA)画像を別々に入力した場合に、
従来のような画像の圧縮が避けられるため、画像劣化を
低減でき、その後の画像処理をスムーズに行なえる。第
2に、画像解析処理により主核や小核を識別する工程に
おいて、画像の閾値を可変にすることにより、生物試料
がゆえに生じる蛍光のバラツキを解消できる。第3に、
画像解析のプロセスの中に細胞質と核の輪郭情報を解析
する独自のアルゴリズムを採用することにより、近接し
た細胞や核を効率よく分離・認識することができる。以
上の結果、従来に比べて、小核をより客観的に判定で
き、かつ効率の良い計測を実施できる。

【0086】本発明では、通常の小核解析に用いられる
ヒトリンパ球以外にも、生体組織や各種細胞株などから
得た任意の有核細胞を適用することができる。また、解
析対象としては、既に何らかの原因で染色体異常が起こ
っている可能性のある被検生物由来の細胞であっても、
特定の環境変異原に暴露された細胞であってもよい。

【0087】本発明によれば、観察対象となる有核細胞
中の主核が単核・2核・それ以上の核数を有していて
も、それぞれを識別して、小核保有細胞を計数できる。
ヒト末梢血リンパ球を対象とした小核解析には、サイト
カラシンBなどの薬剤を培養液中に処理して、誘発され
た2核細胞を観察対象とする方法がよく用いられており
(Fenech M.and Morley AA.,
Mutation Res.147:29−36,19
85)、特に、ヒト細胞を対象としたモニタリング(健
康度や変異原性物質への暴露度を経時的に評価する)を
実施する場合に極めて有効である。

【0088】(第1の実施の形態の実施例)本発明にお
ける画像解析装置による実施例を以下に示す。本実施例
では、細胞質と核におけるブロブ解析の基準値を次のよ
うに設定する。

【0089】

【表2】

【0090】

【表3】

【0091】その後、細胞質の閾値を100とし、核の
基準閾値を200、差分を±50、段階数を2回とした
多段階閾値解析と輪郭形状解析を併用した画像判定結果
を肉眼による目視判定結果と比較した。ここでは、ヒト
リンパ球の2核細胞を観察対象細胞とした。

【0092】従来のように閾値を1つに限定して得られ
た結果は、いずれにおいても目視判定結果との一致率
が、25.6〜55.8%となり、かなり低いことが分
かった。これは細胞間での蛍光輝度のバラツキと画像間
のバラツキの問題に起因する。それに対して、多段階閾
値を採用した本実施例の場合は、上記のバラツキの問題
が解消され、76.7%と非常に高い一致率が得られ
た。従って、多段階閾値の設定と輪郭形状解析を併用し
た画像解析法が、小核を保有する細胞の自動識別におい
てきわめて有効であると結論できた。

【0093】参考として、本実施例と従来方法において
目視判定結果と一致しなかった画像判定結果の例とその
原因を以下に示す。以下の結果は、いずれも細胞標本の
状態に起因するものであり、標本作製法の改良により、
今後更なる一致率の向上が期待できる。

【0094】

【表4】

【0095】(第2の実施の形態)上記第1の実施の形
態の画像解析装置による画像解析方法では、顕微鏡画像
を対象としており、ブロブ解析・輪郭形状解析・多段階
閾値解析を効果的に組み合わせた。しかしながら、安全
性スクリーニングのような利用場面においては、特に化
学物質を高濃度で細胞に処理した場合,細胞の核を構成
する画素の輝度が著しくばらつく現象が生じる。これ
は、化学物質がもたらす細胞毒性による核内クロマチン
構造の変化に起因すると考えられる。このような現象
は、人為的に細胞に対して何ら処理を行なわない生物学
的環境モニタリングのような利用場面においては、極め
て希に生じる現象である。上記第1の実施の形態の多段
階閾値設定は、こうした状況に鑑みた手法である。しか
し、小核そのものの輝度のバラツキに対しては極めて効
果的であるものの、化学物質の高濃度処理における主核
の輝度のバラツキには、必ずしも対応できていなかっ
た。こうした問題を解決するためには、輝度のバラツキ
の大きい主核の画像に対しても、適切な基準閾値を設定
可能とする必要がある。

【0096】図7の(a),(b)は、上記第1の実施
の形態の画像解析方法による判定画像を示す図である。
ここでは、核画像の基準閾値(基準輝度)を200と
し、さらに閾値の差分を10、段階数を±4回とした多
段階閾値解析を実施した。画像の取得にあたっては、A
Oにて核(DNA)を緑色(G)に、細胞質(RNA)
を赤色(R)に染色した。次に、40倍の対物レンズを
使用して、核(DNA)と細胞質(RNA)の顕微鏡像
をそれぞれ一定の撮像時間でCCDカメラに取り込み、
両者の画像を合成した。

【0097】図7の(a),(b)では、G成分を白
色、R成分を灰色で表している。ヒト培養細胞に対して
染色体異常誘発物質を処理した場合、図7の(a)に示
すように、正常な単核細胞(1NUC)以外に、小核を
1つ持つ細胞(1NUC+1MN)が検出されている。
ただし、化学物質の処理濃度が高く、細胞毒性が強く表
れる場合には、本来正常な単核細胞と判定すべき画像
が、小核を持つ細胞として誤って判定される場合が多
い。図7の(b)における‘a’は、その誤判定がされ
る典型的な画像である。ここでは、実際には小核を持た
ない細胞が、3つの小核をもつ単核細胞(1NUC+3
MN)として誤判定されている。一方、‘b’は正常な
単核細胞(1NUC)として判定された典型的な画像で
ある。そこで、図7の(b)における‘a’のような誤
判定を招く原因を明らかにするために、‘a’と‘b’
の画像特性について比較分析した。

【0098】図8の(a),(b)は、上記‘a’と
‘b’について、それぞれの画像のR成分上に存在する
G成分を構成する画素の輝度分布を示したヒストグラム
である。横軸は輝度を、縦軸は相対度数を示す。‘a’
と‘b’の両者において、輝度が100以下の画素のほ
とんどはバックグラウンドのノイズを示すことを画像上
で確認した。従って、核画像のG成分は輝度100以上
の画素で構成されているといえる。さらに、‘a’と
‘b’の各核画像を構成する画素の分布パターンを比較
すると、100から220の輝度(中間輝度)をもつ画
素の分布において、両者の間で明らかな違いが認められ
た。すなわち、‘a’では中間輝度をもつ画素が画像の
約25%を占めるのに対し、bでは約7%とごくわずか
であり、輝度220以上の画素が圧倒的多数を占めてい
た。

【0099】図9の(a),(b)は、上記‘a’と
‘b’のG成分について、閾値を150から240まで
差分10で変更した場合の2値化画像の面積の推移を示
した図である。‘a’では、閾値を上昇させるに従い、
著しい面積の減少が認められるの対し、‘b’では、面
積の減少はごくわずかである。単に、閾値150と24
0の2点での面積値の減少度を比較しても、‘a’では
約80%と明らかな減少であるのに対して、‘b’では
ごく20%以下に過ぎない。

【0100】さらに‘a’の閾値上昇に伴う画像推移を
分析すると、閾値210,220,240の各画像にお
いて小核候補のブロブ(矢印で示した疑似小核)がそれ
ぞれ1つずつ認められる。この現象が、3つの小核をも
つ単核細胞(1NUC+3MN)として誤判定した原因
であった。この細胞のG画像に対しては、より低い基準
閾値(例えば150など)を設定することで、判定を正
常な単核細胞(1NUC)と正解に導くことができる。

【0101】図10は、上記‘a’と‘b’の各2値化
画像の閾値変更に伴う面積推移の回帰曲線を示す図であ
る。両者の傾きを比較すると、‘a’では約−2.6で
あるのに対し、‘b’では約−8.7であり、両者の傾
きには、約3倍以上の明らかな違いが認められる。例え
ば‘a’では、閾値150と200の2点間で面積値が
30%以上減少している。

【0102】以上に示したようなG画像の特性の違い
(例えば中間輝度の画素構成や2値化後の面積値など)
を指標とすることで、細胞毒性を受けた細胞(‘a’)
と細胞毒性を受けていない細胞(‘b’)とが識別可能
であり、‘a’ではより低い基準閾値を設定し、‘b’
ではより高い基準閾値を設定することで、小核保有細胞
の画像解析精度の向上が期待できる。

【0103】具体的には、G画像の全画素数に対する1
00から220の輝度(中間輝度)をもつ画素数の比率
が、例えば20%以上である場合に、その細胞は細胞毒
性を受けている細胞であると識別して、基準閾値を例え
ば150より低く設定する。あるいは、G画像に対して
閾値を150と200の間で上昇させながら得た2値化
画像の画素数の減少の比率が30%以上である場合に、
その細胞は細胞毒性を受けている細胞であると識別し
て、基準閾値を例えば150より低く設定する。

【0104】なお、細胞毒性を受けた主核における画像
特性の違いは、核の染色ムラが反映されたことに起因す
るといえる。こうした染色ムラは、核内DNAのあらゆ
る箇所で生じた潜在的なDNA損傷(ニックや切断)の
結果、クロマチンレベルでの立体構造中に弛緩部位と凝
縮部位が混在することにより生じる可能性がある。

【0105】従って、化学物質の安全性スクリーニング
において小核の画像解析を実施するためには、特に化学
物質の高濃度処理において生ずる上記の染色ムラを検出
して、より低い基準閾値を設定することが重要であるこ
とが明らかとなった。

【0106】図11は、本第2の実施の形態における画
像解析装置による画像解析方法の処理手順を示すフロー
チャートである。なお、本第2の実施の形態における画
像解析装置の構成は上記第1の実施の形態で図1に示し
たものと同一である。

【0107】以下、本画像解析装置による核(DNA)
の画像解析方法を、図11を基に説明する。まずステッ
プS21で、図1の制御部20はフィルター変換部7に
て、核(主核・小核:DNA)の蛍光波長を特異的に吸
収・励起するためのフィルター(緑色用フィルター)を
観察光軸a上に配置させる。これにより、標本Sにおけ
る核(DNA)の画像がCCDカメラ10に取込まれ、
画像データとして細胞質・核計測部30に入力される。

【0108】次に細胞質・核計測部30は、入力した核
(DNA)画像に対して画像の輝度補正を行ない、ステ
ップS22で、前述した中間輝度の画素構成や2値化後
の面積値などのG画像の特性の違いを指標とすること
で、細胞毒性による画像特性(染色ムラ)を検出する。
そしてステップS23で、閾値設定部31にて適切な基
準閾値(基準輝度)を設定し、核(DNA)の画像デー
タを2値化することにより、解析対象画像を抽出する。

【0109】次にステップS24で、ブロブ解析部32
は従来のブロブ解析法により、核の画像の矩形・面積・
体積・真円度・長さと幅の比率などを分析する。ここ
で、面積比(細胞質/核)を算出して、ある一定の値以
上のものを観察対象細胞としてラベル化する。また、ス
テップS25で、体積比(核/細胞)を算出して、ある
一定の値以上のものを主核、前記一定の値未満のものを
小核としてラベル化する。

【0110】さらにステップS26で、輪郭形状解析部
33にて上述した輪郭形状解析を行なうことにより、ス
テップS27で、近接した複数個の主核が分離される。
そして細胞質・核計測部30は、主核の個数を認識し、
主核の数が1個・2個またはそれ以上の細胞を分類し、
ステップS28で、それらを観察対象の細胞として決定
する。

【0111】そしてステップS29で、上述した画像解
析処理の結果、小核が存在する場合、画像判定部34は
その小核の個数を主核と対応付けるとともに、主核と小
核を画像解析された細胞質と対応付け、各観察対象の細
胞ごとに小核を計数し、全観察対象の細胞中における小
核を保有する間期細胞の出現頻度を集計する。

【0112】その後、ステップS30で、予め設定され
ている段階数分の画像解析処理が終了するまで、上記閾
値に対して予め指定されている差分を順次加えて新たな
閾値とし、上記ステップS22〜S29の画像解析処理
を行なう。以上のような多段階閾値による核の解析が行
なわれることで、小核が細胞中により多く存在する結果
が取得される。

【0113】なお、本第2の実施の形態では、細胞毒性
を受けている細胞と受けていない細胞における画像特性
(染色ムラ)の違いを検出するために、核画像を構成す
る中間輝度を有する画素の割合や、閾値を変更した場合
の画素数(2値化画像の面積)の推移について分析した
が、その他、核画像の周囲長・重心・真円度などといっ
た種々の画像特徴量を基に違いを検出することもでき
る。 (第2の実施の形態の実施例)本発明における画像解析
装置による実施例を以下に示す。本実施例では、ヒト培
養細胞に対して、代表的な染色体異常誘発物質であるマ
イトマイシンC(MMC)を0.06μg/mlといっ
た高濃度で24時間処理したシリーズと、無処理のシリ
ーズとを準備した。

【0114】スライド標本を作製してAOにて染色後、
40倍の対物レンズを使用して撮像した約250画像の
それぞれについて、画像解析による判定結果を分析し
た。ここでの分析対象は、1NUC(小核の無い正常な
単核細胞)または1NUC+MN(小核を持つ細胞)と
目視判定された細胞の画像とし、以下の表(1)(2)
に示すように、分析対象の細胞数に対する画像解析判定
の正誤数(○×)を計数して、正解率を算出した。

【0115】

【表5】

【0116】表(1)は、上記第1の実施の形態のよう
に基準閾値を200に設定して、差分10で±4回の多
段階閾値解析した結果を示している。この場合は、無処
理・処理群のそれぞれにおいて、1NUCではほぼ10
0%に近い正解率が得られた。それに対して、1NUC
+MNでは、無処理群で75.0%,処理群で70.8
%の正解率であり、誤判定の細胞画像が約3割程度を占
めていた。

【0117】一方、表(2)は、上記第2の実施の形態
による結果を示している。この場合、閾値を150と2
00の2点に設定しており、核画像の面積値に明らかな
減少が認められた核画像(ここでは25%以上の減少)
に関しては基準閾値を150に、面積値の減少が比較的
小さい核画像(ここでは25%未満の減少)に関しては
基準閾値を200に設定して、かつ多段階閾値解析を行
なっている。この場合では、無処理・処理群のすべての
ケースにおいて、正解率は90%以上となり、表(1)
に示す従来の結果に比べて、精度上での明らかな向上が
認められた。

【0118】従って、上記第2の実施の形態に示した細
胞毒性に応じた基準閾値の設定と多段階閾値解析を併用
した画像解析法が、化学物質の安全性スクリーニングに
おける小核保有細胞の自動識別にきわめて有効であると
結論できる。

【0119】(第3の実施の形態)上述したように、上
記第1の実施の形態の画像解析装置による画像解析方法
では、顕微鏡画像を対象としており、ブロブ解析・輪郭
形状解析・多段階閾値解析を効果的に組み合わせ、染色
された小核を検出している。しかしながら、安全性スク
リーニングのような利用場面においては、細胞の核部の
みならず、細胞質部を示す画素の輝度も著しくばらつく
現象が生じる。例えば、新規に合成された化学物質のD
NA損傷性を評価する場合には、哺乳類培養細胞を化学
物質により高濃度で処理し、細胞の異常を評価する。こ
のため、その化学物質がもたらす細胞毒性による核内ク
ロマチン構造の変化に起因する染色むらや、細胞質部を
構成する種々のタンパク質や微小器官の機能への何らか
の異常に起因する染色むらが生じる。

【0120】上記第1の実施の形態の多段階閾値設定
は、小核そのものの輝度の変動に対しては極めて効果的
ではあるものの、前述した化学物質の高濃度処理におけ
る核部、細胞質部の輝度のバラツキには、必ずしも対応
できていなかった。これは、基準閾値の設定が、得られ
た画像とは独立して判断されスポットごとに設定されて
おり、輝度分布の異なる細胞画像ごとに対応していない
ためである。従って、スクリーニング試験のように被験
物質の濃度を変えて毒性を評価する場合、毒性を受けた
細胞特有の形状変化を考慮しなくてならない。このよう
な問題を解決するためには、染色むらによる輝度のバラ
ツキが大きい核部、細胞質部の画像に対しても、細胞ご
とに適切な基準閾値を自動設定可能とする必要がある。

【0121】そこで、上記第2の実施の形態と同様に、
取得された細胞画像から画像特性について比較分析し
た。ここでは、それぞれの画像に存在するG成分を構成
する画素の分布から200以上の輝度の割合を集計し
た。また、画像のR成分についても、G成分同様、一定
輝度の割合を集計した。細胞画像の特性の違いを一定輝
度の割合として表し、画像を構成する画素の分布パター
ンを比較すると、200以上の輝度をもつ画素の分布に
おいて,細胞画像ごとに明らかな違いが認められた。ま
た、細胞画像が崩れてくるほど、200以上の輝度の割
合が下がってくることが認められた。

【0122】図12は、G成分における各細胞像の画像
の輝度分布を示すヒストグラムであり、(a)は正常な
細胞、(b)は細胞毒性を受けた細胞の場合を示してい
る。細胞像を画像解析する場合、化学物質で処理をしな
い正常細胞の画像におけるG成分の輝度分布を見ると、
図12の(a)に示すように輝度255にほとんどの画
素が集中している。また、化学物質を処理した染色ムラ
のある細胞の画像は、図12の(b)に示すように輝度
255以下の領域にも広く分布している。これらの輝度
分布から200〜255の高輝度を示す画素数の全画素
数に占める割合を求めると、図12の(a)は80%、
図12の(b)は40%となり、染色ムラのある細胞に
おいて、輝度200〜255を示す画素の割合は低下し
てくる。発明者らの検討により、輝度200〜255の
領域に分布する画像数の割合は、G画像、R画像共に、
細胞毒性の変化に比例して低下していことが確認されて
いる。

【0123】以上に示したようなG画像、R画像の特性
の違い(ここでは、高輝度の割合)を指標とすること
で、細胞毒性を受けていない細胞と細胞毒性を受けた細
胞とが識別可能であり、高輝度の割合が高い場合は高い
基準閾値を設定し、高輝度の割合が低下してくるほどよ
り低い基準閾値を設定することで、小核保有細胞の画像
解析精度の向上が期待できる。

【0124】従って,化学物質の安全性スクリーニング
において小核の画像解析を実施するためには,特に化学
物質の高濃度処理において生ずる上記の染色ムラを検出
して、より適切な基準閾値を設定することが重要である
ことが明らかとなった。

【0125】図13は、本第3の実施の形態における画
像解析装置による閾値設定方法の処理手順を示すフロー
チャートである。なお、本第3の実施の形態における画
像解析装置の構成は上記第1の実施の形態で図1に示し
たものと同一である。

【0126】以下、本画像解析装置による画像の閾値設
定手順を、図13を基に説明する。以下では、ヒト培養
細胞に対して代表的な染色体異常誘発物質を処理した細
胞画像について、小核解析を開始するまでの手順を説明
する。

【0127】まずステップS31で、制御部20はフィ
ルター変換部7にて、核(主核・小核:DNA)の蛍光
波長を特異的に吸収・励起するためのフィルター(緑色
用フィルター)を観察光軸a上に配置させる。これによ
り、標本Sにおける核(DNA)の画像(G画像)がC
CDカメラ10に取込まれ、画像データとして細胞質・
核計測部30に入力される。この際、標本Sから、細胞
の形状、染色ムラ等の異なる細胞画像が撮り込まれ、画
像データとして細胞質・核計測部30に入力される。こ
の場合、図14の(a)に示すように、細胞毒性の度合
いが異なる四つの細胞像‘a’‘b’‘c’‘d’が撮
り込まれたとする。なお、図14の(a)では、G成分
を白色、R成分を灰色で表している。

【0128】次にステップS32で、細胞質・核計測部
30は、取得した各細胞像‘a’‘b’‘c’‘d’の
核(DNA)の画像(G画像)に対して、それを構成す
る画素の輝度を解析し、輝度度数分布(ヒストグラム)
を作成し、ステップS33で、これら輝度度数分布から
輝度相対度数分布(ヒストグラム)を作成する。そして
ステップS34で、細胞質・核計測部30は、これら輝
度相対度数分布から、各細胞像‘a’‘b’‘c’
‘d’について、図15の(a)に示すように、一定の
高輝度(200〜255)を有する画素の輝度相対度数
の割合を求める。

【0129】続いて、細胞質(RNA)の画像(R画
像)に対しても、上記ステップS31〜S34と同様の
処理を行なう。この場合、上記ステップS34で求めら
れるR画像における一定の高輝度(200〜255)を
有する画素の輝度相対度数の割合は、図15の(b)に
示すようになる。

【0130】次にステップS35で、細胞質・核計測部
30は、各細胞像‘a’‘b’‘c’‘d’のG画像と
R画像について、閾値を200から50まで差分50で
変更した場合、すなわち閾値を200,150,10
0,50とした場合の2値化画像を得る。そして細胞質
・核計測部30は、各細胞像‘a’‘b’‘c’‘d’
について、閾値が同一であるG画像の2値化画像とR画
像の2値化画像との合成画像を得る。このステップS3
5は、所望により使用者が画像で閾値別に確認したい場
合に選択的に行なえばよく、ステップS34以降のいつ
でも行なってよく、また必須なステップではない。

【0131】ここで、図14の(b)は、便宜上、同じ
閾値同士の2値化画像を合成した例を示しており、G成
分を白色、R成分を灰色で表している。図14の(b)
から、細胞像‘a’については、G画像では閾値が20
0、R画像では閾値が150である各2値化画像が、図
14の(a)に示した細胞画像に近いことが分かる。細
胞像‘b’については、G画像では閾値が150、R画
像では閾値が150である各2値化画像が、図14の
(a)に示した細胞画像に近いことが分かる。細胞像
‘c’については、G画像では閾値が100、R画像で
は閾値が100である各2値化画像が、図14の(a)
に示した細胞画像に近いことが分かる。細胞像‘d’に
ついては、G画像では閾値が50、R画像では閾値が5
0である各2値化画像が、図14の(a)に示した細胞
画像に近いことが分かる。

【0132】従って、ステップS36で、細胞質・核計
測部30は、上記に示したような各細胞像‘a’‘b’
‘c’‘d’のG画像とR画像に対する適切な各閾値
を、図15の(a),(b)に示した輝度相対度数の割
合(高輝度のヒストグラムの割合)を用いて、図16の
(a),(b)に示すように各基準閾値を設定する。こ
の場合、高輝度の画素の割合が低下するほど基準閾値の
設定値を低く設定することにより、元の細胞画像に近い
画像で小核解析が行なわれることになる。

【0133】そしてステップS37で、細胞質・核計測
部30は、複数の基準閾値の設定値を自身のデータファ
イルに記憶した後、小核解析を開始する。このように、
一つの基準閾値を導き出すために、予め輝度相対度数と
複数の基準閾値の設定値との相対関係を示す情報を細胞
質・核計測部30に入力しておくことにより、輝度相対
度数の割合が変化するごとに、基準閾値の設定が変更さ
れることになる。すなわち、輝度相対度数の割合が減少
するごとに、基準閾値が低いものに変更される。このよ
うに、画像のヒストグラム解析を加えることで、細胞ご
とに基準閾値の設定が自動化され、適切な基準閾値によ
る小核解析が行なえ、誤判定を回避できる。

【0134】本第3の実施の形態では、細胞毒性を受け
ていない細胞と受けている細胞における画像特性(輝度
ムラ)の違いを、核部と細胞部の画像を構成する高輝度
を有する画素の割合の推移を分析することで識別してい
る。そして、対象となる細胞ごとに基準閾値の設定を自
動的に換えて小核解析をすることが可能になる。この手
法によれば、高輝度を有する画素数の割合を基に基準閾
値の設定を自動化することができ、問題となっていた細
胞毒性による形状変化を伴う輝度のバラツキのある細胞
画像に対しても、正確な画像判定を実施することがで
き、誤判定結果を解消することができる。

【0135】本手法によれば、小核試験に自動計測機を
使用した場合、蛍光画像の画像から一定基準閾値の相対
度数を解析し、それを基に画像解析のための適切な基準
閾値を設定していくことが可能になる。これにより、こ
れまでスポットごとになされていた閾値の設定が、細胞
毒性による細胞の形状変化に対応して細胞ごとに可能と
なり、小核試験の計測誤判定を解消することができる。

【0136】また本手法は、in vitro小核試験
のみならず、染色された細胞像を電子的に取得し、その
画像を元に個々の細胞を認識する種々の場面に適用可能
である。例えば、in vitro小核試験の他、間期
細胞FISHシグナルカウント、小核以外の有核細胞
(各種白血球、幼者赤血球、ガン細胞等)の分類などに
適用できる。この場合、細胞質・核計測部30は、細胞
の種類に応じて適切な閾値設定及び各種解析を行なうよ
う設定されているのが好ましく、さらに入力部21によ
って、解析したい細胞の種類を任意に選択できるように
して外部から指示する構成にするのが、より好ましい。

【0137】なお、本発明は上記各実施の形態及び実施
例のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適時変形
して実施できる。

【0138】

【発明の効果】本発明の画像解析方法、装置、及び記録
媒体によれば、有核細胞中の染色体異常、すなわち間期
細胞中のDNA損傷を、小核を指標として客観的かつ効
率良く自動解析することができる。すなわち、従来自動
検出が困難であった小核の解析が可能となり、損傷判定
結果の精度が向上する。

【0139】本発明の画像解析方法によれば、DNA損
傷性を評価する有核細胞の小核画像解析処理において、
主核の輝度にバラツキがある細胞の画像に対しても、そ
れが有する画像特性を認識して、適切な基準閾値を設定
可能とし、精度の高い画像解析を実現することができ、
多段階閾値解析の効果を最大限に引き出すことができ
る。

【0140】本発明の画像解析方法によれば、DNA損
傷性を評価する有核細胞の小核画像解析において、細胞
毒性に伴い核部、細胞部の輝度にバラツキがある細胞の
画像に対しても、それが有する画像特性を認識して、適
切な基準閾値を自動設定可能とし、精度の高い画像解析
での自動計測を実現することができ、多段階閾値解析の
効果を最大限に引き出すことができる。すなわち、有核
細胞中にて起こり得る細胞の形状変化に適応した基準閾
値の設定を、客観的に効率よく行なえる。

【図面の簡単な説明】

【図1】本発明の実施の形態に係る画像解析装置の構成
を示す図。

【図2】本発明の実施の形態に係る画像解析装置による
画像解析方法の処理手順を示すフローチャート。

【図3】本発明の実施の形態に係る画像解析装置による
画像解析方法の処理手順を示すフローチャート。

【図4】本発明の実施の形態に係る画像解析装置による
画像解析方法の処理工程を模式的に示した図。

【図5】本発明の実施の形態に係る輪郭形状解析の基本
原理を示す図。

【図6】本発明の実施の形態に係る主核・小核の輪郭形
状解析の結果例を示す図。

【図7】本発明の実施の形態に係る画像解析方法による
判定画像を示す図。

【図8】本発明の実施の形態に係る画像のR成分上に存
在するG成分を構成する画素の輝度分布を示したヒスト
グラム。

【図9】本発明の実施の形態に係る閾値を変更した場合
の2値化画像の面積の推移を示した図。

【図10】本発明の実施の形態に係る2値化画像の閾値
変更に伴う面積推移の回帰曲線を示す図。

【図11】本発明の実施の形態に係る画像解析装置によ
る画像解析方法の処理手順を示すフローチャート。

【図12】本発明の実施の形態に係る細胞像の画像の輝
度分布を示すヒストグラム。

【図13】本発明の実施の形態に係る画像解析装置によ
る閾値設定方法の処理手順を示すフローチャート。

【図14】本発明の実施の形態に係る細胞画像と2値化
した細胞画像の合成画像を示す図。

【図15】本発明の実施の形態に係る高輝度ヒストグラ
ムの割合を示す図。

【図16】本発明の実施の形態に係る高輝度ヒストグラ
ムの割合に対する基準閾値を示す図。

【符号の説明】

A…蛍光顕微鏡 B…パーソナル・コンピュータ(PC) 1…本体 2…ステージ 3…オートフォーカス装置 4…レボルバー 5…対物レンズ 6…ダイクロイックミラー 7…フィルター変換部 8…鏡筒 9…ハーフミラー 10…CCDカメラ 11…接眼レンズ 12…光源 20…制御部 21…入力部 22…表示部 30…細胞質・核計測部 31…閾値設定部 32…ブロブ解析部 33…輪郭形状解析部 34…画像判定部 S…標本

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 21/64 G01N 21/64 F 33/48 33/48 P G02B 21/36 G02B 21/36 //(C12Q 1/02 (C12Q 1/02 C12R 1:91) C12R 1:91) (C12M 1/34 (C12M 1/34 B C12R 1:91) C12R 1:91) (C12Q 1/68 (C12Q 1/68 Z C12R 1:91) C12R 1:91) (72)発明者 三浦 邦彦 東京都渋谷区幡ヶ谷2丁目43番2号 オリ ンパス光学工業株式会社内 (72)発明者 畑中 みどり 東京都渋谷区幡ヶ谷2丁目43番2号 オリ ンパス光学工業株式会社内 (72)発明者 河田 雄一 千葉県柏市東山2丁目1番2号

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】顕微鏡で得られた有核細胞の画像を基に染
    色体に発生した異常を解析する画像解析方法において、 細胞周期が間期に相当する有核細胞の細胞質と核を蛍光
    色素で標識して観察対象とし、 顕微鏡により得られた前記観察対象の蛍光画像に対し
    て、その画像の明暗に応じて前記観察対象の形状を把握
    し、 形状を把握した前記観察対象において所定の形状を有す
    る特定細胞を検出し、その個数を計数することを特徴と
    する画像解析方法。
  2. 【請求項2】前記顕微鏡により得られた前記観察対象の
    蛍光画像に対して多段階の閾値設定を行ない、前記観察
    対象の形状を把握することを特徴とする請求項1に記載
    の画像解析方法。
  3. 【請求項3】前記顕微鏡により得られた前記観察対象の
    蛍光画像に対して、その画像の明暗に応じて輪郭形状解
    析を行なうことで、前記観察対象の形状を把握すること
    を特徴とする請求項1に記載の画像解析方法。
  4. 【請求項4】前記特定細胞を検出する過程で、前記核の
    蛍光画像について多段階の閾値設定を行なうことを特徴
    とする請求項2に記載の画像解析方法。
  5. 【請求項5】前記特定細胞が間期細胞であり、かつ小核
    の有無を検出する工程と、検出した小核の個数を主核と
    対応付けて計数する工程とを有することを特徴とする請
    求項1に記載の画像解析方法。
  6. 【請求項6】前記小核を計数する過程で、前記核の蛍光
    画像について多段階の閾値設定を行なうことを特徴とす
    る請求項5に記載の画像解析方法。
  7. 【請求項7】前記特定細胞を検出する過程で、前記細胞
    質及び核の少なくとも一方の蛍光画像について輪郭形状
    解析を行なうことを特徴とする請求項3に記載の画像解
    析方法。
  8. 【請求項8】前記有核細胞の蛍光画像について多段階の
    閾値設定を行ない、かつ輪郭形状解析を行なうことによ
    り、前記細胞質と前記核を認識することを特徴とする請
    求項1に記載の画像解析方法。
  9. 【請求項9】顕微鏡で得られた有核細胞の画像を基に染
    色体に発生した異常を解析する画像解析装置において、 生物学的染色を施された有核細胞からなる観察対象を観
    察するための顕微鏡と、 この顕微鏡から画像を取り込む画像入力手段と、 この画像入力手段で取り込まれた画像に対して多段階の
    閾値を設定する閾値設定手段と、 この閾値設定手段により閾値を設定された前記有核細胞
    の各画像について輪郭形状解析を行なう輪郭形状解析手
    段と、 この輪郭形状解析手段で解析された細胞群のうち指定さ
    れた形状を有する特定細胞を選択的に計数する計数手段
    と、 を具備したことを特徴とする画像解析装置。
  10. 【請求項10】前記顕微鏡は、前記観察対象を自動的に
    走査する走査手段を備えたことを特徴とする請求項9に
    記載の画像解析装置。
  11. 【請求項11】前記顕微鏡は、前記観察対象の複数の細
    胞群に対して、自動的に合焦を行なう合焦手段を備えた
    ことを特徴とする請求項9に記載の画像解析装置。
  12. 【請求項12】前記顕微鏡と前記画像入力手段との間
    に、細胞質と核の蛍光波長を特異的に吸収・励起するた
    めのフィルタを自動的に変換する変換手段を備えたこと
    を特徴とする請求項9に記載の画像解析装置。
  13. 【請求項13】コンピュータを、 顕微鏡で得られた有核細胞の画像に対して多段階の閾値
    を設定する閾値設定手段、 この閾値設定手段により閾値を設定された前記有核細胞
    の各画像について輪郭形状解析を行なう輪郭形状解析手
    段、 この輪郭形状解析手段で解析された細胞群のうち指定さ
    れた形状を有する特定細胞を選択的に計数する計数手
    段、 として機能させるためのプログラムを記録したコンピュ
    ータ読み取り可能な記録媒体。
  14. 【請求項14】顕微鏡で得られた有核細胞の画像を基に
    染色体に発生した異常を解析する画像解析方法におい
    て、 細胞周期が間期に相当する有核細胞の細胞質と核を蛍光
    色素で標識して観察対象とし、 顕微鏡により得られた前記観察対象の主核の蛍光画像に
    対して、中間輝度の分布または面積を指標とすること
    で、前記有核細胞が細胞毒性を受けているか否かを識別
    し、 この識別の結果に応じて基準閾値を設定し、前記有核細
    胞の画像を解析することを特徴とする画像解析方法。
  15. 【請求項15】前記有核細胞における前記主核の画像の
    全画素数に対する前記画像の中間輝度を有する画素数の
    比率が所定値以上である場合に、前記有核細胞は細胞毒
    性を受けている細胞であると識別して、前記基準閾値を
    所定閾値より低く設定することを特徴とする請求項14
    に記載の画像解析方法。
  16. 【請求項16】前記有核細胞における前記主核の画像に
    対して閾値を上昇させながら得た2値化画像の画素数の
    減少の比率が所定値以上である場合に、前記有核細胞は
    細胞毒性を受けている細胞であると識別して、前記基準
    閾値を所定閾値より低く設定することを特徴とする請求
    項14に記載の画像解析方法。
  17. 【請求項17】顕微鏡で得られた有核細胞の画像を基に
    染色体に発生した異常を解析する画像解析方法におい
    て、 細胞周期が間期に相当する有核細胞の細胞質と核を蛍光
    色素で標識して観察対象とし、 顕微鏡により得られた前記観察対象における前記細胞質
    と前記核の各蛍光画像に対して、前記観察対象ごとに画
    像を構成する高輝度の画素の占める割合を解析し、 前記細胞質と前記核の各蛍光画像に対して所定閾値を設
    定することにより得た各2値化画像を基に、前記所定閾
    値を前記割合と対比させることで基準閾値を設定し、前
    記有核細胞の画像を解析することを特徴とする画像解析
    方法。
  18. 【請求項18】前記細胞質または前記核の蛍光画像中
    で、前記高輝度の画素の占める割合の減少度に応じて前
    記基準閾値を低いものに変更することを特徴とする請求
    項17に記載の画像解析方法。
  19. 【請求項19】前記基準閾値の設定後、前記観察対象の
    蛍光画像に対して多段階の閾値設定を行ない、小核の個
    数を主核と対応づけて計数することを特徴とする請求項
    14または17に記載の画像解析方法。
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