CN111919107B - 用于定量成像的强度稳定的系统和方法 - Google Patents

Abstract

一种用于对显微样品进行成像的系统(90)，该系统包括：光源(31)，其用于从至少一个样品激发荧光；光传感器(40)，其构造为检测通过分束器(20)而从引导到样品的光激发路径偏转的光，并且对到样品的光通量的电信号进行输出；相机(30)，其构造为接收并形成从样品发出的荧光的图像；以及控制器(134)，该控制器包括构造为对来自光检测器的电信号进行积分的积分器以及对积分输出和预定阈值进行比较的比较器，其中，控制器构造为控制相机的曝光时间，使得在相机曝光持续时间内每个样品接收基本上相同的光通量，在满足表示总光通量的预定阈值时相机曝光终止。

Description

用于定量成像的强度稳定的系统和方法

技术领域

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年1月26日提交的美国临时申请No.62/622311的优先权，该美国临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。

本发明一般涉及荧光样品的显微成像领域。

背景技术

荧光分析在制药工业中用于筛选各种组织类型以与制药所关注的化学物种相互作用是非常重要的。

在分析这些类型时，细胞通常培养在多孔板或微板中。微板已成为分析研究和临床诊断检测实验室的标准工具。

为了测量细胞的荧光图像，用第一波长的光照射细胞或细胞培养物，并且通过光学检测器(通常是相机)监测第二波长的光发射。二次发射(如荧光)的波长和/或强度和/或空间分布可能与细胞数量、细胞活力、细胞形状、某些药物的摄取以及细胞和细胞培养物的许多其它功能参数相关。

发明内容

在本发明的一个实施例中，提供了一种用于对显微样品进行成像的系统。该系统包括：光源，其用于从至少一个样品激发荧光；光激发路径，其包括一个或多个物镜，所述一个或多个物镜将来自所述光源的光引导到与所述至少一个样品重合的物平面；分束器，其沿所述光激发路径布置并构造为将所述光的一部分从所述光激发路径分离；光传感器，其构造为检测从所述光激发路径分离的所述光的所述一部分，并输出表示到所述至少一个样品的光通量的电信号；相机，其布置在像平面处并构造为拍摄从所述至少一个样品发出的荧光的图像；以及控制器，其包括积分器和比较器，所述积分器构造为对来自所述光传感器的所述电信号进行积分并产生累加输出，所述比较器构造为将所述积分输出与预定阈值进行比较，其中，所述控制器至少控制所述相机的曝光时间，使得在相机曝光持续时间内每个样品接收基本上相同的光通量，在达到所述预定阈值时所述相机曝光终止。

在本发明的一个实施例中，提供了一种对显微样品进行成像的方法。该方法包括：将来自光源的光引导到与至少一个样品重合的物平面；将所述光的一部分分离到光传感器，所述光传感器输出表示到所述至少一个样品的光通量的电信号；形成所述至少一个样品在曝光于来自所述光源的入射光后而发出的荧光的图像；以及控制从所述至少一个样品获取的每个图像的曝光时间，使得对于所获取的多个图像，每个样品接收基本上相同的所述入射光的总光通量。

在本发明的一个实施例中，提供一种用于对显微样品进行成像的系统。该系统包括：用于将来自光源的光引导到与至少一个样品重合的物平面的装置；测量所述光的一部分的强度的装置；用于对所述至少一个样品在曝光于来自所述光源的入射光后而发出的荧光进行成像的装置；以及用于控制从所述至少一个样品获取的每个图像的曝光时间的装置，使得对于所获取的多个图像，每个样品接收基本上相同的所述入射光的总光通量。

在查看以下附图和详细描述后，本发明的其它系统、方法、特点和优点对于本领域的技术人员将变得显而易见。所有这些附加的系统、方法、特征和优点均应包括在本说明内，并应在本发明的范围内，并受所附权利要求书的保护。应理解的是，上述对本发明的一般描述和以下的详细描述都是示例性的，但对本发明不具有限制性。

附图说明

通过参考以下附图可以更好地理解本发明。附图中的构件不一定是成比例的，相反，重点放在说明本发明的原理上。在附图中，在不同视图中，相同的附图标记表示相应的部分。

图1A是示出根据本发明的光路系统的光学示意图。

图1B描绘图1A所示的系统的硬件实施方式的示意图。

图2是示出用于控制样品曝光的光通量的电子构造的示意图。

图3是描绘常规曝光和本发明的通量受控的曝光的结果的图。

图4是描绘根据本发明的样品成像的示例性方法的流程图。

具体实施方式

对于多个显微样品的定量筛选，至关重要的是所获取的图像可靠且有效地参考完全相同的激发功率水平。传统的方法在采集过程中例如用光电二极管检测强度，并且使用所测值对随后的拍摄图像进行数值校正。

然而，用于激发荧光样品的现有技术的高功率LED光源的状态在其发射输出中表现出强烈的漂移。这种漂移(在LED的预热阶段尤为明显)使得不同样品之间的荧光比较变得困难。

本发明解决了在上述漂移或者光源或光路的其它变化使激发强度改变从而使荧光强度改变的情况下不同样品之间的荧光比较的问题。

生物学家对数据组的精确量化和可比性越来越感兴趣。特别是在自动显微镜领域，重要的是，测量条件在收集大量样品的较大数据组时不变化。使用本发明，从样品保持件中的第一孔(well)到样品保持件中的最后孔的所有样品都受到相同量(或基本上相同量)的光照。因此，在本发明的一个实施例中，对于荧光标记的样品，所发射的荧光信号仅取决于生物变化，而不取决于仪器的不稳定性或漂移。

图1A是示出根据本发明的光路系统的光学示意图。如图1所示，激发光从左侧(在照明视场光阑10处)进入系统。激发光可以来自例如LED光源(在下文中所讨论的)并经由光纤波导(LED光源和光纤波导均未在图1A中示出)进入系统，激发光也可以直接与自由空间光学器件耦合并进入系统。如图1A所示，照明路径上的固定比例的激发光通过基准分束器20被引导到基准光电二极管22，或者固定比例的激发光能够以其它方式与照明路径或光路分离。在打开LED的同时或在打开LED稍前的时间触发相机30，以在光照射光电二极管22的同时开始曝光。对光电二极管信号进行积分，直到达到预定阈值。该阈值表示照射到光电二极管22和样品40两者的确切光量。一旦达到阈值，就停止相机曝光，并且可以关闭LED。根据另一实施例，当达到阈值时关闭相机曝光和LED中的任一个，然后再关闭另一构件就足够了。根据本发明的一个实施例，与传统的将样品40曝光在激发光下一段固定的时间不同，现在将每个孔(well)中的样品曝光在总量恒定的光子能量下。实现这种曝光的控制方案和电子设备如图2所示，并在下文进行讨论。

与具有已记录的或其它已知的校正因子的常规数值校正相比，本发明不需要记录参考电平和后来的数值校正图像数据。与其它常规做法相比，可以使用相机的整个动态范围，而不会由于数值校正而实际上损失部分动态范围。另外，使用本发明的通量受控曝光，可以非常精确地进行定量测量，例如，剂量响应曲线或Z'因子测定。在定量细胞生物学中，定量测量和/或比较对于通过荧光信号确定蛋白质水平非常重要(例如，对表达水平、分子计数、光漂白后的荧光恢复、荧光偏振显微镜检查、蛋白质共定位研究、蛋白质动力学、蛋白质流动性、药物浓度等都很重要)。此外，定量测量和/或比较在分割、三维体绘制和反褶积中是重要的。在这些领域的使用中，在不同样品、时间点和检测之间对荧光强度水平进行比较。

不需要额外的数值计算(和时间)来对从例如包含百万像素数据(例如，4百万以上像素)的图像获取的数据图像进行补偿，本发明对于优化速度特别有用。

利用与图1A有关的更多细节，进入视场光阑10的光入射到聚光透镜12上并通过聚光透镜12准直。激发滤波器14(将在下文中描述)可以放置在透镜12与二向色分束器16(将在下文中描述)之间并与透镜12和二向色分束器16成一直线。光从分束器16沿着光路被引导到基准分束器20，在基准分束器20处，光的一部分通过基准检测器22，并且光的另一部分通过样品40。可以在基准分束器20和基准检测器22之间放置基准孔24，用于消除来自其它光源的杂散光，这些杂散光会影响基准检测器22的测量。显微镜光瞳26和显微镜物镜28用于将光聚焦在样品40上，并收集发射光(例如荧光或磷光)。从样品(例如，从微板中的样品孔)收集的光在到达定位有相机的像平面30之前，向后传播通过光柱，该光柱通过基准分束器20、分束器16、可选的发射滤波器32、以及显微镜镜筒透镜34。

在本发明的一个实施例中，如图1A所示，分束器20布置在布置有相机的显微镜系统的内部。在本发明的另一实施例中，分束器20布置在显微镜的外部。在本发明的另一实施例中，分束器20布置在显微镜系统的外部，并且通过相机成像的荧光(或磷光)不通过分束器，这是因为存在用于照明样品的第一光路(包括基准检测器22)以及用于成像荧光的另一(第二)光路。

图1B是描述图1A所示系统的硬件实施方式的示意图。在如图1B所示的显微镜系统90中，来自激发光源31的光通过光波导33传输到聚光器12。光波导33可以包括玻璃、塑料、石英光纤，光波导33可以是液体光波导，也可以包括光纤束。光源31可以包括一个或多个LED(发光二极管)、灯或激光器。如果激发光源31包括多个LED，如图1B所示的实施例中那样，则具有不同发射波长的LED可用于匹配被成像的荧光标记的不同的激发光谱。

激发光离开聚光器12，然后通过激发滤波器14，并且随后到达二向色分束器16(或称为“二向色镜”)。为了方便起见，如图1B所示，可以将干涉滤波器14(或其它光谱滤波器)容纳在滤波器块36中，滤波器块36本身位于滤波器转台38上，使滤波器可以在不同的滤波器或不同组滤波器之间自动切换。遇到分束器16(包含在滤波器块36中)的光被分离为：a)用于曝光样品的指定激发波长和b)从被激发和成像的样品的荧光标记发出的发射波长。除了二向色分束器，光谱中性的分束器，例如50：50的分束器也可以用于分束器16。滤波器块36通常保持有二向色镜以及激发和发射滤波器。在本发明的一个实施例中，激发滤波器、发射滤波器和二向色镜(分组在一个滤波器块中)的光谱特性通常与被激发和成像样品的荧光标记的光谱特性匹配。滤波器和二向色镜可以交替地放置在滤波器轮或滤波器滑块中。如果光源31是单色光源，诸如激光器或激光二极管的单色光源，则可能不需要用于激发的光谱滤波器。

图1B所示的附接于Z台42上的分束器20在将光的小且占恒定比例的部分朝向诸如图1B中的基准检测器40等检测器分离的同时使光朝向样品通过。基准检测器40中可以包括硅光电二极管或其它类型的稳定光电检测器。光积分器122接收并积分来自光电检测器的电信号。光积分器122与一个或多个光源31和相机30电通信。

如图1B所示的控制器134可以与积分器122、光源31、相机30、Z台42和XY台44进行电通信。使样品与物镜28的焦平面匹配的Z移动通过沿Z方向移动物镜转台39来实现。作为替代，Z移动也可以通过XYZ台实现。如图1B所描述的，XY台44通过移动保持件48(将微板46保持在XY台44上)来平移微板46，使得微板中的每个孔都可以被曝光，从微板中发出的光可以被相机30拍摄到。从样品发出的荧光(或磷光)通过光路返回到位于图1A所示的像平面Z处的相机30。图1B中所示的棱镜28(也可以是反射镜)为了空间紧凑而使光路偏转。

当相机(如上所述)的曝光模式被控制为使得在相机曝光持续期间(相机曝光在达到预定阈值时终止)每个样品接收基本相同的总光通量时，使用积分器122使得从微板46中的第一孔到最后孔中的所有样品都受到相同量(或基本上相同量)的光或光能照射。

因此，被成像的样品(或组分)可以包括化合物、混合物、表面标志物(surfaces)、溶液、乳剂、悬浮液、细胞培养物、发酵培养物、细胞、组织、分泌物和/或其衍生物和/或提取物。组分的分析可能涉及测量光活性分析物在该组分中的存在、浓度或物理性质(包括相互作用)。组分可以是指单个微板孔或多个微板孔的内容物，这取决于试验方法。

样品或组分可以以已知的方式放置在微板、生物芯片或任何样品阵列中。在图1B所示的装置中，样品载体为微板46，微板46包括用于保持组分的多个微板孔。另一种典型的样品载体可以是显微镜载玻片或皮氏培养皿(有盖培养皿)。微板是多孔(通常为矩形)保持件，该保持件通常为圆柱形，有时也使用矩形或其它形状的保持件。样品孔通常布置成规则的阵列。“标准”微板包括布置成8×12的矩形阵列的直径为9毫米(on 9millimetercenters)的96个圆筒形样品孔。

微板通常具有布置成2：3的矩形矩阵的6、12、24、48、96、384或1536个样品孔。

参照图2，图2是示出用于控制样品的光通量曝光使得相同的总光通量被分配到每个样品孔的示意图。在图2中，LED电流控制器200控制流向LED 210的电流。LED 210发出的光被发射到显微镜的光路220，在光路220处，光的一部分被转移到作为基准检测器22的光传感器230。如图2所示，光传感器230是通量控制器240的一部分。通量控制器240包括积分器250，积分器250对来自光传感器230的电压信号或输出信号进行积分或累加。通过比较器260将积分器250的输出与预定阈值进行比较。

为了开始曝光，作为输入到与门270的信号，“开始采样”信号被设定为高电平状态。输入到与门的另一个信号是来自比较器260的反向“低电平”信号。在该逻辑下，相机280得到正“开始曝光”信号。相机280的闪光输出用于通过电流控制器200打开LED开关。基准光传感器230开始收集光，并且其电输出由积分器250积分。在积分期间，一旦达到预定阈值，比较器260将其输出设定为高电平状态。经由与门270，相机曝光输入被设定为低电平，相机280停止图像采集，并且相机的“相机闪光”信号也切换到低电平。因此，LED 210也被关闭。这种控制方案确保每个样品孔和不同微板之间的每个孔都恰好曝光于预定的总激发能。

在本发明的一个实施例中，还考虑了积分器的灵敏度控制。通过这种可选的灵敏度控制可以扩展积分器的动态范围。待测样品可以覆盖非常广泛的浓度范围，从而产生非常广泛的动态信号范围，即多达5个数量级。因此，激发能的量必须相应地调整。激发能的量转化为积分器的累积信号，然后进行阈值比较。

测试

用于通量控制的原型系统已经集成到自动显微镜中，它能够在微板(诸如上文所述的那些微板)中成像超过九十六(96)个显微镜目标样品。本发明的基于硬件的控制(如上所述，参考图2)实现多个样品和对整个微板进行多次读取时的稳定信号输出，其中微板中的每个孔在曝光前都有相同的样品存积。

图3示出了使用该系统测量的典型数据。使用图2的能量受控系统(总通量受控)对在微板的96个孔中均带有荧光标记珠的微板孔进行100次测量，并与常规持续时间受控(＝恒定曝光时间)系统的测量方案进行比较。从相对恒定的荧光可以看出，除了一些统计上的变化(主要是由于每次测量的自动对焦)，总通量受控过程的强度(上部点群)在整个实验中基本上保持恒定。而在常规的持续时间受控曝光(下部点群)中，观察到强度下降了约20％。

在本发明的一个实施例中，提供了用于对显微样品进行成像的系统(作为显微系统的一部分)。该系统包括：光激发路径，其将来自光源的光引导到至少一个样品；光传感器，其构造为输出表示到至少一个样品的光通量的电信号；相机，其构造为拍摄从至少一个样品发出的荧光的图像；以及控制器，其构造为控制相机的曝光时间，使得在相机曝光的持续期间每个样品接收基本相同的总光通量，其中，相机曝光在达到表示总光通量的预定阈值时终止。该系统可以包括用于从至少一个样品激发荧光的至少一个光源。光激发路径可以包括一个或多个物镜，该一个或多个物镜将来自光源的光导向与至少一个样品重合的物平面。该系统可以包括(如上所述)保持多个样品的微板。

相机可以测量多个样品。控制器可以依照从一个样品到另一样品的顺序直接测量样品。或者，控制器可以指示多次测量同一样品的延时序列。

在该系统中，光传感器暴露在从光激发路径分离的光中，但不一定是来自分束器的光。或者，导向到一个或多个样品的光可以通过布置在布置有相机的显微镜系统内部(或外部)的分束器分离。在该系统中，通过相机成像的荧光可以通过或可以不通过分束器。

系统控制

在本发明的一个实施例中，提供了用于样品成像的方法。图4是描绘根据本发明的样品成像的示例性方法的流程图。在1001处，光通量(来自光源)被沿光路引导到样品。在1003处，同时开始相机曝光、LED和表示到样品的光通量的测量。在1005处，在使样品曝光于光通量的同时，对表示光通量的测量进行积分(累计或累加)。在1007处，当积分的光通量满足(或达到)预定的总光通量(即，预定阈值)时，相机曝光和/或光源终止。

一般来说，对显微样品进行成像的方法可以将光引导到与至少一个样品重合的物平面(例如，物平面30)，使被引导到至少一个样品的光的一部分分离到光传感器(例如，基准检测器22)，输出表示到至少一个样品的光通量的电信号，形成从至少一个样品发出的荧光(或磷光)的图像，以及通过相机(例如相机30和280)控制从至少一个样品获取的每个图像的曝光，使得对于所获取的多个图像，每个样品接收基本上相同的总光通量。

对显微样品成像的方法(如图2所示)对来自光传感器230的电信号进行积分，以产生累加或积分输出；并将累加或积分输出与预定阈值进行比较。该方法可以在光源210打开之前或打开同时将相机(例如相机280)设定为曝光模式。该方法可以在光源210打开之后，开始对来自光传感器的电信号进行积分，并在达到预定阈值时关闭相机。该方法可在达到预定阈值时关闭光源210。

用于对显微样品进行成像的方法可以依照从一个样品到另一样品的顺序测量样品，或者可以测量用于多次测量同一样品(或在不同样品之间多次测量)的延时序列。

在本发明的一个实施例中，可以使用在硬件/电子或软件程序代码中实现的一个或多个控制器来执行上述任何或所有功能。例如，具有适当电子电路或软件程序代码的控制器可单独使用或与光积分器122、控制器134、相机30或280、LED控制器200和通量控制器240中的硬件一起使用，以执行上述部分或全部功能。因此，这样的处理器可以与具有包含在存储器(如ROM、EPROM、EEPROM、闪存，静态存储器、DRAM、SDRAM，及其等同物)中的程序代码的计算机可读介质一起运行，当在用于对样品进行成像的系统中执行时，执行以下步骤：打开或关闭光源以将光引导到与至少一个样品重合的物平面；测量从光传感器输出的电信号，其中，光传感器接收光的被引导到至少一个样品的一部分光；从相机接收从至少一个样品发出的荧光或磷光的图像；以及控制通过相机从至少一个样品获取的每个图像的曝光，使得对于所获取的多个图像，每个样品接收基本上相同的总光通量。

程序代码还可以单独或结合电子电路执行以下步骤：将来自光传感器的电信号积分以产生累加输出；以及将累加输出与预定阈值进行比较。程序代码(或电子电路)还可以在光源打开之前或打开同时开始相机曝光。程序代码(或电子电路)还可以在光源打开之后，开始对来自光传感器的电信号进行积分，并且当达到预定阈值时，关闭相机。程序代码(或硬件)还可以在达到预定阈值时关闭光源。

因此，本发明在一个实施例中包括用于对显微样品进行成像的系统。该系统包括：用于将光引导到与至少一个样品重合的物平面的装置；用于测量光的被引导到至少一个样品的一部分的强度的装置；用于对从至少一个样品发出的荧光进行成像的装置；以及这样的装置，该装置控制通过相机从至少一个样品获取的每个图像的曝光，使得对于所获取的多个图像，每个样品接收基本上相同的总光通量。

因此，本发明在另一实施例中包括用于对显微样品进行成像的系统。该系统包括：用于打开或关闭光源以将光引导到与至少一个样品重合的物平面的装置；用于测量从光传感器输出的电信号的装置，其中，光传感器接收光的被引导到至少一个样品的一部分；用于从相机接收从至少一个样品发出的荧光或磷光的图像的装置；以及这样的装置，该装置控制通过相机从至少一个样品获取的每个图像的曝光，使得对于所获取的多个图像，每个样品接收基本上相同的总光通量。

尽管前面的描述仅说明了各种实施方式的特定实例，但本发明不限于前面的说明性实例。本领域技术人员应知道的是，所附权利要求书所限定的本发明可以应用于各种其它实施方式和变型。特别是，所述实施方式的各种特征的组合是可能的，只要这些特征不相互矛盾。因此，前面对实施方式的描述是为了说明和描述。该描述不是详尽无遗的，也没有将所述保护的发明限制为所披露的精确形式。可以根据上述说明进行变型和修改，也可以通过实施本发明而获得变型和修改。因此，应当理解，在所附权利要求书的范围内，本发明可以不按照本发明的具体规定实施。权利要求书及其等同物限定。

Claims (27)

1.一种用于对多个显微样品进行成像的系统，包括：

光源，其用于从所述多个显微样品激发荧光；

光激发路径，其包括一个或多个物镜，所述一个或多个物镜将来自所述光源的光引导到与所述多个显微样品重合的物平面，其中所述一个或多个物镜使得相机能够对所述多个显微样品中的每个样品进行成像；

基准分束器，其沿所述光激发路径布置并构造为将所述光的一部分从所述光激发路径分离；

光传感器，其构造为检测从所述光激发路径分离的所述光的所述一部分，并输出表示到所述多个显微样品中的每个样品的光通量的电信号；

所述相机，其构造为拍摄从所述多个显微样品中的每个样品发出的荧光的图像；

第二分束器，其构造为将光沿着所述光激发路径引导到所述基准分束器，在所述基准分束器处，所述光的一部分通过所述光传感器，并且所述光的另一部分通过至少一个样品，其中从所述至少一个样品发出的光在到达所述相机的像平面之前，向后传播通过所述光激发路径，所述光激发路径通过所述基准分束器、所述第二分束器以及显微镜镜筒透镜；

控制器，其包括：

积分器，所述积分器构造为对来自所述光传感器的所述电信号中的每个电信号进行积分并产生来自所述多个显微样品中的每个样品的光通量的积分输出，以及

比较器，所述比较器构造为将来自所述多个显微样品中的每个样品的光通量的所述积分输出与预定的光通量阈值进行比较，

其中所述控制器控制所述相机的曝光时间和所述光源的发射时间中的至少一个，使得在所述相机的曝光期间所述多个显微样品中的每个样品接收相同的总光通量，

并且其中在所述多个显微样品中的每个样品达到所述预定的光通量阈值时所述相机的曝光时间和所述光源的发射时间中的至少一个终止。

2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述控制器由电子电路和程序代码中的一者或两者的组合来实现，以对所述电信号进行积分，产生所述积分输出，并将所述积分输出与所述预定的光通量阈值进行比较。

3.根据权利要求2所述的系统，其中：

所述控制器构造为在所述光源打开前或在所述光源打开时启动所述相机曝光，

在所述光源打开之后，所述积分器对来自所述光传感器的所述电信号进行积分，并且

当达到所述预定的光通量阈值时，所述相机的曝光时间终止。

4.根据权利要求3所述的系统，其中，

当达到所述预定的光通量阈值时，关闭所述光源。

5.根据权利要求1所述的系统，其中，

当达到所述预定的光通量阈值时，关闭所述光源。

6.根据权利要求1所述的系统，还包括用于荧光测量的滤波器组。

7.根据权利要求1所述的系统，其中，所述光源包括发光二极管。

8.根据权利要求1所述的系统，其中，所述光源利用光纤器件耦合到显微镜系统。

9.根据权利要求7所述的系统，其中，所述光纤器件包括光纤波导或光纤束。

10.根据权利要求1所述的系统，其中，所述一个或多个物镜允许对所述多个显微样品进行多倍放大。

11.根据权利要求1所述的系统，还包括用于微板的保持件，所述保持件保持所述多个显微样品。

12.根据权利要求11所述的系统，其中，所述控制器指示依照从所述多个显微样品中的一个样品到所述多个显微样品中的另一个样品的顺序进行所述样品的测量。

13.根据权利要求11所述的系统，其中，所述控制器指示多次测量所述多个显微样品中的同一样品的延时序列。

14.根据权利要求1所述的系统，其中，所述控制器指示在所述多个显微样品中的不同样品之间多次测量的延时序列。

15.根据权利要求1所述的系统，其中，所述第二分束器布置在布置有所述相机的显微镜系统的内部。

16.根据权利要求11所述的系统，其中，所述第二分束器布置在布置有所述相机的显微镜系统的外部。

17.根据权利要求1所述的系统，其中，通过所述相机成像的所述荧光不通过所述第二分束器。

18.一种用于对多个显微样品进行成像的系统，包括：

光激发路径，其将来自光源的光引导到所述多个显微样品；

光传感器，其构造为输出表示到所述多个显微样品的光通量的电信号；

相机，其构造为接收从所述多个显微样品中的每个样品发出的荧光的图像；以及

控制器，其构造为控制所述相机的曝光，使得在所述相机的曝光期间所述多个显微样品中的每个样品接收相同的总光通量，

其中在所述多个显微样品中的每个样品达到预定的光通量阈值时所述相机的曝光终止，其中每个样品的所述预定的光通量阈值是由所述多个显微样品中的第一样品接收的总光通量。

19.一种对多个显微样品进行成像的方法，包括：

将来自光源的光引导到与所述多个显微样品重合的物平面；

将所述光的一部分分离到光传感器，所述光传感器输出表示到所述多个显微样品中的每个样品的光通量的电信号；

形成所述多个显微样品中的每个样品在曝光于来自所述光源的入射光后而发出的荧光的图像；以及

控制获取的所述多个显微样品中的每个样品的每个图像的曝光，使得对于所获取的多个图像，所述多个显微样品中的每个样品接收相同的所述入射光的总光通量，其中每个样品的所述入射光的总光通量是由所述多个显微样品中的第一样品接收的总光通量。

20.根据权利要求19所述的方法，还包括：

对来自所述光传感器的电信号进行积分以产生累加输出；以及

将所述累加输出与预定阈值进行比较。

21.根据权利要求20所述的方法，还包括：

在所述光源打开前或打开时，启动相机的曝光，

在所述光源打开后，对来自所述光传感器的电信号进行积分，以及

当达到所述预定阈值时，终止所述相机的曝光时间。

22.根据权利要求21所述的方法，还包括：

当达到所述预定阈值时，关闭所述光源。

23.根据权利要求20所述的方法，还包括：

当达到所述预定阈值时，关闭所述光源。

24.根据权利要求19所述的方法，还包括依照从所述多个显微样品中的一个样品到所述多个显微样品中的另一个样品的顺序测量所述样品。

25.根据权利要求19所述的方法，还包括以多次测量所述多个显微样品中的同一样品的延时序列进行测量。

26.根据权利要求19所述的方法，还包括以在所述多个显微样品中的不同样品之间多次测量的延时序列进行测量。

27.一种计算机可读介质，所述计算机可读介质具有程序代码，所述程序代码在根据权利要求1至18中任一项所述的系统中的处理器上执行时，执行以下步骤：

打开或关闭光源，以将光引导到与多个显微样品重合的物平面；

测量接收有所述光的一部分的光传感器所输出的电信号；

从相机接收所述多个显微样品中的每个样品在曝光于来自所述光源的入射光时而发出的荧光的图像；以及

控制通过所述相机获取的所述多个显微样品中的每个样品的每个图像的曝光，使得对于所获取的多个图像，所述多个显微样品中的每个样品同时地接收相同的所述入射光的总光通量。