JP2023133540A - 定量的撮像のための強度安定化のためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

【課題】顕微鏡サンプルを撮像するためのシステムの提供【解決手段】顕微鏡サンプルを撮像するためのシステム（９０）は、少なくとも１つのサンプルからの蛍光を励起させるための光源（３１）と、ビームスプリッタ（２０）によって、サンプルに指向される光学励起経路から偏向される光を検出し、サンプルへの光束の電気信号を出力するように構成される光センサ（４０）と、サンプルから放出される蛍光の画像を受信および形成するように構成される、カメラ（３０）と、光検出器からの電気信号を積分するように構成される積分器（１２２）と、積分された出力を所定の閾値と比較するように構成される比較器とを備えるコントローラ（１３４）とを備え、コントローラは、各サンプルが、総光束を表す所定の閾値が満たされると終了される、カメラ露光の持続時間の間、入射光の実質的に同一の総光束を受光するように、カメラの露光時間を制御するように構成される。【選択図】なし

Description

（発明の背景）
（関連出願の相互参照）
本願は、その内容が、参照することによって全体として本明細書に組み込まれる、２０１８年１月２６日に出願された、米国仮出願第６２／６２２，３１１号の優先権を主張する。

（発明の分野）
本発明は、概して、蛍光を発するサンプルの顕微鏡撮像の分野に関する。

（関連技術）
蛍光分析は、医薬品産業において非常に重要であって、薬学的に着目される化学種との相互作用のために、種々の組織タイプをスクリーニングするために使用される。

これらのタイプの分析では、細胞は、典型的には、複数のウェルプレートまたはマイクロプレート内で培養される。マイクロプレートは、分析研究および臨床診断試験実験室における標準的ツールとなりつつある。

細胞の蛍光画像を測定するために、細胞または細胞培養物は、第１の波長の光で照明され、第２の波長における光放出が、光学検出器、通常、カメラによって監視される。二次放出（例えば、蛍光）の波長および／または強度ならびに／もしくは空間分布は、細胞数、細胞生存能力、細胞形状、ある薬物の取込率、ならびに細胞および細胞培養物の多くの他の機能パラメータと相関し得る。

（要約）
本発明の一実施形態では、顕微鏡サンプルを撮像するためのシステムが、提供される。本システムは、少なくとも１つのサンプルからの蛍光を励起させるための光源と、光源からの光を少なくとも１つのサンプルと一致する対物面に指向する１つ以上の対物レンズを備える、励起光学経路と、励起光学経路に沿って配置され、励起光学経路からの光の一部を分離するように構成される、ビームスプリッタと、励起光学経路から分離される光の一部を検出し、少なくとも１つのサンプルへの光束を表す電気信号を出力するように構成される、光センサと、像面に配置され、少なくとも１つのサンプルから放出される蛍光の画像を得るように構成される、カメラと、光センサからの電気信号を積分し、総計された出力を生成するように構成される、積分器と、積分された出力を所定の閾値と比較するように構成される、比較器とを備える、コントローラとを備え、コントローラは、各サンプルが、所定の閾値が到達されると終了される、カメラ露光の持続時間の間、実質的に同一の総光束を受光するように、少なくともカメラの露光時間を制御する。

本発明の一実施形態では、顕微鏡サンプルを撮像するための方法が、提供される。本方法は、光源からの光を少なくとも１つのサンプルと一致する対物面に指向することと、光の一部を光センサに分離し、少なくとも１つのサンプルへの光束を表す電気信号を出力することと、光源からの入射光への露光に応じて、少なくとも１つのサンプルから放出される蛍光の画像を形成することと、得られた複数の画像に関して、各サンプルが入射光の実質的に同一の総光束を受光するように、少なくとも１つのサンプルから得られた各画像の露光時間を制御することとを含む。

本発明の一実施形態では、顕微鏡サンプルを撮像するためのシステムが、提供される。本システムは、光源からの光を少なくとも１つのサンプルと一致する対物面に指向するための手段と、光の一部の強度を測定するための手段と、光源からの入射光への露光に応じて、少なくとも１つのサンプルから放出される蛍光を撮像するための手段と、得られた複数の画像に関して、各サンプルが入射光の実質的に同一の総光束を受光するように、少なくとも１つのサンプルから得られた各画像の露光時間を制御するための手段とを備える。

本発明の他のシステム、方法、特徴、および利点は、以下の図および発明を実施するための形態の精査に応じて、当業者に明白である、または明白となるであろう。全てのそのような付加的システム、方法、特徴、および利点は、本説明内に含まれ、本発明の範囲内にあって、付随の請求項によって保護されることが意図される。本発明の前述の一般的説明および以下の発明を実施するための形態は両方とも、例示的であって、本発明の制限ではないことを理解されたい。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
顕微鏡サンプルを撮像するためのシステムであって、
少なくとも１つのサンプルからの蛍光を励起させるための光源と、
前記光源からの光を前記少なくとも１つのサンプルと一致する対物面に指向する、１つ以上の対物レンズを備える、光学励起経路と、
前記光学励起経路に沿って配置され、前記光学励起経路からの前記光の一部を分離するように構成されている、ビームスプリッタと、
前記光学励起経路から分離された前記光の一部を検出し、前記少なくとも１つのサンプルへの光束を表す電気信号を出力するように構成されている、光センサと、
前記少なくとも１つのサンプルから放出される蛍光の画像を捕捉するように構成されている、カメラと、
前記光センサからの前記電気信号を積分し、積分された出力を生成するように構成されている、積分器と、前記積分された出力を所定の閾値と比較するように構成された比較器とを備える、コントローラと
を備え、
前記コントローラは、各サンプルが、前記所定の閾値が到達されると終了される、カメラ露光の持続時間の間、実質的に同一の総光束を受光するように、少なくとも、前記カメラの露光時間を制御する、システム。
（項目２）
前記コントローラは、電子回路またはプログラムコード、もしくは前記２つの組み合わせのうちの１つによって実装され、前記電気信号を積分し、前記積分された出力を生成し、前記積分された出力を前記所定の閾値と比較する、項目１に記載のシステム。
（項目３）
前記コントローラは、前記光源がオンに切り替えられる前またはそれと同時に、前記カメラ露光を開始するように構成され、
前記光源がオンに切り替えられた後、前記積分器は、前記光センサからの前記電気信号を積分し
前記所定の閾値が到達されると、前記カメラの露光時間は、終了される、項目２に記載のシステム。
（項目４）
前記所定の閾値が到達されると、前記光源は、オフに切り替えられる、項目３に記載のシステム。
（項目５）
前記所定の閾値が到達されると、前記光源は、オフに切り替えられる、項目１に記載のシステム。
（項目６）
蛍光測定のためのフィルタセットをさらに備える、項目１に記載のシステム。
（項目７）
前記光源は、発光ダイオードを備える、項目１に記載のシステム。
（項目８）
前記光源は、光ファイバを伴う顕微鏡設定の中に結合されている、項目１に記載のシステム。
（項目９）
前記光ファイバは、ファイバガイドまたはファイバ束を備える、項目７に記載のシステム。
（項目１０）
前記１つ以上の対物レンズは、前記少なくとも１つのサンプルの複数の倍率を可能にする、項目１に記載のシステム。
（項目１１）
複数のサンプルを保持するマイクロプレートのためのホルダをさらに備え、前記カメラは、複数のサンプルを測定する、項目１に記載のシステム。
（項目１２）
前記コントローラは、１つのサンプルから別のサンプルへのシーケンスにおいて、前記サンプルの測定を指示する、項目１１に記載のシステム。
（項目１３）
前記コントローラは、同一サンプルを複数回測定する、時間経過シーケンスを指示する、項目１１に記載のシステム。
（項目１４）
前記コントローラは、異なるサンプル間で複数回測定する、時間経過シーケンスを指示する、項目１に記載のシステム。
（項目１５）
前記ビームスプリッタは、前記カメラが配置されている顕微鏡設定の内側に配置されている、項目１に記載のシステム。
（項目１６）
前記ビームスプリッタは、前記カメラが配置されている顕微鏡設定の外側に配置されている、項目１１に記載のシステム。
（項目１７）
前記カメラによって撮像される前記蛍光は、前記ビームスプリッタを通して通過しない、項目１に記載のシステム。
（項目１８）
顕微鏡サンプルを撮像するためのシステムであって、
光源からの光を少なくとも１つのサンプルに指向する、光学励起経路と、
前記少なくとも１つのサンプルへの光束を表す電気信号を出力するように構成されている、光センサと、
前記少なくとも１つのサンプルから放出される蛍光の画像を受信するように構成されている、カメラと、
各サンプルが、総光束を表す所定の閾値が到達されると終了される、カメラ露光の持続時間の間、実質的に同一の前記総光束を受光するように、前記カメラの露光時間を制御するように構成されている、コントローラと
を備える、システム。
（項目１９）
サンプルを撮像するためのシステムであって、
光源からの光を少なくとも１つのサンプルと一致する対物面に指向するための手段と、
前記光の一部の強度を測定するための手段と、
前記光源からの入射光への露光に応じて、前記少なくとも１つのサンプルから放出される蛍光を撮像するための手段と、
得られた複数の画像に関して、各サンプルが前記入射光の実質的に同一の総光束を受光するように、前記少なくとも１つのサンプルから得られた各画像の露光時間を制御するための手段と
を備える、システム。
（項目２０）
顕微鏡サンプルを撮像するための方法であって、
光源からの光を少なくとも１つのサンプルと一致する対物面に指向することと、
前記光の一部を光センサに分離し、前記少なくとも１つのサンプルへの光束を表す電気信号を出力することと、
前記光源からの入射光への露光に応じて、前記少なくとも１つのサンプルから放出される蛍光の画像を形成することと、
得られた複数の画像に関して、各サンプルが前記入射光の実質的に同一の総光束を受光するように、前記少なくとも１つのサンプルから得られた各画像の露光時間を制御することと
を含む、方法。
（項目２１）
前記光センサからの電気信号を積分し、総計された出力を生成することと、
前記総計された出力を所定の閾値と比較することと
をさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記光源がオンに切り替えられる前またはそれと同時に、前記カメラ露光を開始することと、
前記光源がオンに切り替えられた後、前記光センサからの前記電気信号を積分することと、
前記所定の閾値が到達されると、前記カメラの前記露光時間を終了することと
をさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記所定の閾値が到達されると、前記光源をオフにすることをさらに含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記所定の閾値が到達されると、前記光源をオフにすることをさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
１つのサンプルから別のサンプルへのシーケンスにおいて、前記サンプルを測定することをさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
同一サンプルを複数回測定する、時間経過シーケンスにおいて測定することをさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２７）
異なるサンプル間で複数回測定する、時間経過シーケンスにおいて測定することをさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２８）
プログラムコードを有するコンピュータ可読媒体であって、前記プログラムコードは、項目１－１９のいずれか１項に記載のシステム内のプロセッサ上で実行されると、以下のステップ：
光源をオンまたはオフにし、光を少なくとも１つのサンプルと一致する対物面に指向するステップと、
前記光の一部を受光する光センサから出力される電気信号を測定するステップと、
前記光源からの入射光への露光に応じて、カメラから前記少なくとも１つのサンプルから放出される蛍光の画像を受信するステップと、
得られた複数の画像に関して、各サンプルが前記入射光の実質的に同一の総光束を受光するように、前記カメラによって、前記少なくとも１つのサンプルから得られた各画像の露光時間を制御するステップと
を実施する、コンピュータ可読媒体。

本発明は、以下の図を参照することによってより深く理解され得る。図中の構成要素は、必ずしも、正確な縮尺ではなく、代わりに、本発明の原理を図示することに強調が置かれている。図中、同様の参照番号は、異なる図全体を通して対応する部品を指す。

図１Ａは、本発明による、光学経路設定を示す、光学概略図である。

図１Ｂは、図１Ａに示されるシステムのハードウェア実装を描写する、略図である。

図２は、サンプルの光束露光を制御するための電子構成を示す、概略図である。

図３は、従来の露光および本発明の束制御露光の結果を描写する、グラフである。

図４は、本発明による、サンプル撮像のための例示的方法を描写する、フローチャートである。

（発明の詳細な説明）
複数の顕微鏡サンプルの定量的スクリーニングのために、得られた画像が、信頼性があって、正確に同一励起電力レベルに対して効率的に参照されることが不可欠である。１つの従来のアプローチは、例えば、フォトダイオードを用いて、入手の間、強度を検出し、測定された値を使用して、その後スナップ撮影された画像を数値的に補正していた。

しかし、蛍光性サンプルの励起のための最先端の高出力ＬＥＤ源は、その放出出力において強ドリフトを呈する。ドリフト（特に、ＬＥＤの準備相の間、顕著である）は、異なるサンプル間の蛍光透視比較を困難にする。

本発明は、光源または光学経路内の上記のドリフトもしくは他の変化が、励起強度を変化させ、したがって、蛍光強度を変化させる、異なるサンプル間の蛍光透視比較の問題に対処する。

生物学者は、ますます、データセットの正確な定量化および比較能力に関心を持ちつつある。特に、自動化された顕微鏡検査の分野では、多くのサンプルを伴うより大きいデータセットの収集の間、測定条件が変動しないことが重要である。本発明を用いることで、サンプルホルダ内の最初のウェルからサンプルホルダ内の最後のウェルまでの全てのサンプルが、同一量（または実質的に同一量）の光で照明される。したがって、本発明の一実施形態では、蛍光的に標識されたサンプルに関して、放出される蛍光信号は、器具不安定性またはドリフトではなく、生物学的変動のみに依存する。

図１Ａは、本発明による、光学経路設定を示す、光学概略図である。図１に示されるように、励起光が、左から（照明視野絞り１０において）システムに進入する。励起光は、例えば、ＬＥＤ源（下記に議論される）から、ファイバガイドを介して、生じ得る（両方とも、本図１Ａには図示せず）が、また、自由空間光学系を用いて、直接、システムの中にも結合され得る。図１Ａに示されるように、照明経路上のある固定割合の励起光が、基準ビームスプリッタ２０によって、基準フォトダイオード２２に指向される、または別様に、照明もしくは光学経路から分離される。ＬＥＤをオンに切り替えるのと同時に、またはその若干前に、カメラ３０が、光がフォトダイオード２２に衝打するのと同時に、露光を開始するようにトリガされる。フォトダイオード信号は、所定の閾値が到達されるまで積分される。本閾値は、フォトダイオード２２およびサンプル４０の両方に衝打する光の正確な量を表す。閾値が到達されるとすぐ、カメラ露光は、停止され、ＬＥＤは、オフに切り替えられることができる。別の実施形態によると、カメラ露光またはＬＥＤのいずれか一方が、閾値が到達されると、オフに切り替えられ、他方の構成要素が、その後、オフに切り替えられる場合、十分である。本発明の一実施形態によると、従来通り、一定時間量にわたって、サンプル４０を励起光に露光させる代わりに、各ウェル内のサンプルは、ここでは、一定の全体的量の光エネルギーに露光される。本露光を実現するための制御スキームおよび電子機器は、図２に示され、下記に議論される。

記録された、または別様に既知の補正因子を用いた、従来の数値補正と比較して、本発明は、基準レベルを記録し、後に、画像データを数値的に補正する必要はない。他の従来の実践と対照的に、カメラのフルダイナミックレンジが、事実上、数値補正に起因したダイナミックレンジの一部を失うことなく、使用されることができる。加えて、本発明の束制御された露光を用いることで、定量的測定、例えば、用量応答曲線またはＺ因子判定が、非常に正確に実施されることができる。定量的細胞生物学では、定量的測定および／または比較は、蛍光信号によってタンパク質レベルを確認するために重要である（例えば、発現レベル、分子計数、光漂白後の蛍光回復、蛍光分極顕微鏡検査、タンパク質共局在性研究、タンパク質動態、タンパク質移動度、薬物濃度のために重要である）。さらに、定量的測定および／または比較は、区画化、３Ｄボリュームレンダリング、および逆畳み込みにおいて重要である。それらの使用分野では、蛍光強度レベルが、異なるサンプル、時間点、およびプローブ間で比較される。

例えば、数メガピクセルのデータ（例えば、４以上のメガピクセル）を含有する画像上で、得られたデータ画像を補償するための付加的数値計算（および時間）がないため、本発明は、特に、速度を最適化するために有用である。

図１Ａに関するさらなる詳細では、視野絞り１０を通して進入した光が、焦光レンズ１２上に入射し、それによってコリメートされる。励起フィルタ１４（下記に説明される）が、レンズ１２とダイクロイックビームスプリッタ１６（下記に説明される）との間の線内に設置されることができる。ビームスプリッタ１６からの光は、光学経路に沿って、基準ビームスプリッタ２０に指向され、そこで、光の一部は、基準検出器２２に通過し、光の別の部分は、サンプル４０に通過する。基準開口２４が、基準ビームスプリッタ２０と基準検出器２２との間に設置され、基準検出器２２の測定に影響を及ぼす他の源からの光を排除する役割を果たすことができる。顕微鏡瞳２６および顕微鏡対物レンズ２８が、光をサンプル４０上に集束させ、放出された光（例えば、蛍光または燐光）を収集するために使用される。サンプルから（例えば、マイクロプレート内のサンプルウェルから）収集された光は、鏡筒を通して後方に進行し、カメラが位置付けられる、像面３０に到着する前に、基準ビームスプリッタ２０、ビームスプリッタ１６、随意に、放出フィルタ３２、顕微鏡チューブレンズ３４を通して通過する。

本発明の一実施形態では、ビームスプリッタ２０は、図１Ａに示されるように、その上にカメラが配置される、顕微鏡設定の内側に配置される。本発明の別の実施形態では、ビームスプリッタ２０は、顕微鏡の外側に配置される。本発明の別の実施形態では、ビームスプリッタ２０は、顕微鏡設定の外側に配置され、カメラによって撮像される蛍光（または燐光）は、ビームスプリッタを通して通過せず、サンプルを照明するための第１の光学経路（基準検出器２２を含む）と、蛍光を撮像するための別の（または第２の）光学経路とが存在する。

図１Ｂは、図１Ａに示されるシステムのハードウェア実装を描写する、概略図である。図１Ｂに示される顕微鏡設定９０では、励起光源３１からの光は、光導波路３３によって、集光器１２に伝達される。光導波路３３は、ガラス、プラスチック、石英ファイバから成り得る、液体光導波路であり得る、またはファイバ束から成り得る。光源３１は、１つ以上のＬＥＤ（発光ダイオード）、ランプ、またはレーザを含んでもよい。励起光源３１が、図１Ｂにおける実施形態に示されるように、複数のＬＥＤを備える場合、異なる放出波長を伴うＬＥＤが、撮像されている蛍光性標識の異なる励起スペクトルに合致するように使用され得る。

集光器１２から退出すると、励起光は、次いで、励起フィルタ１４を通して、次いで、ダイクロイックビームスプリッタ１６（別様に、「ダイクロイック」と称される）に通過する。便宜上、図１Ｂに示されるように、干渉フィルタ１４（または他のスペクトルフィルタ）が、フィルタキューブ３６内に格納されてもよく、これ自体は、フィルタが異なるフィルタまたは異なるフィルタのセット間で自動的に切り替えられ得るように、フィルタターレット３８上に位置する。ビームスプリッタ１６（フィルタキューブ３６内に含まれる）に遭遇する光は、ａ）サンプルを露光させるための指定された励起波長と、ｂ）励起および撮像されているサンプルの蛍光性標識から放出される放出波長とに分離される。ダイクロイックビームスプリッタの代わりに、スペクトル的に中立、例えば、５０：５０である、ビームスプリッタもまた、ビームスプリッタ１６のために使用され得る。フィルタキューブ３６は、典型的には、ダイクロイックと、励起および放出フィルタとを保持する。本発明の一実施形態では、励起フィルタ、放出フィルタ、およびダイクロイック（１つのフィルタキューブ内に群化される）のスペクトル特性は、典型的には、励起および撮像されているサンプルの蛍光性標識のスペクトル特性に合致する。フィルタおよびダイクロイックは、代替として、フィルタホイールまたはフィルタスライダ内に設置され得る。光源３１が、レーザまたはレーザダイオードのもの等のモノクロ光源である場合、励起のためのスペクトルフィルタは、必要とされなくてもよい。

Ｚ－段４２に取り付けられる、図１Ｂに示されるビームスプリッタ２０は、光をサンプルに向かって通過させる一方、その小かつ一定の割合を図１Ｂにおける基準検出器４０等の検出器に向かって分離する。基準検出器４０は、その中に、シリコンフォトダイオードまたは別のタイプの安定光検出器を含むことができる。光積分器１２２が、光検出器からの電気信号を受信および積分する。光積分器１２２は、光源３１およびカメラ３０のうちの１つ以上と電気連通する。

図１Ｂに示されるコントローラ１３４は、積分器１２２、光源３１、カメラ３０、Ｚ－段４２、およびＸ－Ｙ段４４と電気連通することができる。サンプルと対物レンズ２８の焦点面を合致させるためのＺ移動は、対物レンズターレット３９をｚ－方向に移動させることによって実現される。Ｚ－移動は、代替として、また、ＸＹＺ段を用いても実現され得る。図１Ｂに描写されるように、Ｘ－Ｙ段４４は、マイクロプレート内の各ウェルが、露光され得、そこから放出される光が、カメラ３０によって捕捉され得るように、可動ホルダ４８（マイクロプレート４６をＸ－Ｙ段４４上に保持する）を用いて、マイクロプレート４６を平行移動させる。サンプルから放出される蛍光（または燐光）は、光学経路を通して、図１Ａに示される像面Ｚに位置するカメラ３０に、後方下方に指向される。ミラーでもあり得る、図１Ｂに示されるプリズム２８は、空間コンパクト性のために、光学経路を偏向させる。

積分器１２２は、各サンプルが、所定の閾値が到達されるときに終了される、カメラ露光の持続時間の間、実質的に同一の総光束を受光するように、カメラ（上記に説明される）の露光モードが制御されるため、マイクロプレート４６内の最初のウェルから最後のウェルまでの全てのサンプルが、同一量（または実質的に同一の量）の光または光エネルギーで照明されるように使用される。

故に、撮像されているサンプル（または組成物）は、化合物、混合物、表面、溶液、乳剤、懸濁液、細胞培養物、発酵培養物、細胞、組織、分泌物、および／またはその誘導体ならびに／もしくは抽出物を含むことができる。組成物の分析は、そのような組成物中の光活性検体の存在、濃度、または物理的性質（相互作用を含む）の測定を伴ってもよい。組成物は、アッセイに応じて、単一マイクロプレートウェルまたはいくつかのマイクロプレートウェルの内容物を指し得る。

サンプルまたは組成物は、マイクロプレート、バイオチップ、または既知のフォーマットにおける任意のサンプルのアレイ内に設置されることができる。図１Ｂに示される装置では、サンプル担体は、マイクロプレート４６であって、これは、組成物を保持するための複数のマイクロプレートウェルを含む。別の典型的サンプル担体は、顕微鏡スライドまたはペトリ皿であり得る。マイクロプレートは、通常、円筒形形状であるが、長方形または他の形状のウェルも、時として、使用される、マルチウェル（典型的には、長方形）ホルダである。サンプルウェルは、典型的には、規則的アレイ内に配置される。「標準的」マイクロプレートは、中心間が９ミリメートルの８×１２の長方形アレイに配置される、９６個の円筒形サンプルウェルを含む。

マイクロプレートは、典型的には、２：３の長方形行列に配列される、６、１２、２４、４８、９６、３８４、または１，５３６個のサンプルウェルを有する。

図２を参照すると、図２は、同一総束が各サンプルウェルに送達されるように、サンプルの光束露光を制御するための電子構成を示す、概略図である。図２では、ＬＥＤ電流制御部２００が、ＬＥＤ２１０に流動する電流を制御する。ＬＥＤ２１０から放出される光は、顕微鏡の光学経路２２０の中に放出され、そこで、光の一部は、基準検出器２２として機能する、光センサ２３０に方向転換される。図２に示されるように、光センサ２３０は、束コントローラ２４０の一部である。束コントローラ２４０とともに含まれるのは、積分器２５０であって、これは、光センサ２３０からの電圧信号または出力信号を積分または総計する。積分器２５０の出力は、比較器２６０によって、所定の閾値と比較される。

露光を開始するために、ＡＮＤゲート２７０への１つの入力として、「開始サンプル」信号が、高状態に設定される。ＡＮＤゲートへの他の入力は、比較器２６０から生じる反転「低」信号である。本論理下、カメラ２８０は、正の「開始露光」信号を得る。カメラ２８０のカメラストロボ出力が、電流コントローラ２００によってＬＥＤをオンに切り替えるために使用される。基準光センサ２３０は、光の収集を開始し、その電気出力は、積分器２５０によって積分される。積分の間、比較器２６０は、所定の閾値が到達されるとすぐに、その出力を高状態に設定するであろう。ＡＮＤゲート２７０を介して、カメラ露光入力が、低に設定され、カメラ２８０は、画像収集を停止し、その「カメラストロボ」信号もまた、低に切り替わる。その結果、ＬＥＤ２１０もまた、オフに切り替えられる。本制御スキームは、各サンプルウェルおよび異なるマイクロプレート間の各ウェルが、正確に、所定の全体的量の励起エネルギーに露光されることを確実にする。

本発明の一実施形態では、積分器の感度制御もまた、考慮される。積分器のダイナミックレンジは、本随意の感度制御によって拡張され得る。測定されるべきサンプルは、非常に広範囲の濃度を網羅し得、これは、非常に広ダイナミックレンジの信号、すなわち、最大５桁をもたらす。したがって、励起エネルギーの量は、適宜、適合される必要がある。励起エネルギーの量は、積分器の蓄積された信号、次いで、閾値比較に変換される。

試験

束制御のためのプロトタイプシステムが、上記に説明されるもの等のマイクロプレート内の９６個を上回る顕微鏡検査標的サンプルを撮像することが可能であった、自動化された顕微鏡の中に統合された。（図２を参照して上記に説明される）本発明のハードウェアベースの制御は、複数のサンプルに関して、かつマイクロプレート内の各ウェルが露光の前に同一サンプルを堆積された、マイクロプレート全体の複数の読取の間、安定した信号出力をもたらした。

図３は、本設定を用いて測定された、典型的データを示す。その９６個のウェル内に蛍光的に標識されたビーズを伴う、マイクロプレートのウェルが、図２のエネルギー制御された（総束が制御された）設定を用いて、１００回測定され、従来の持続時間が制御された（＝一定露光時間）設定を伴う測定スキームと比較された。（主に、測定毎に行われる自動集束に起因する）ある程度の統計的変動は別として、総束が制御された手順を用いた強度（上側の点集合）は、比較的に一定の蛍光によって認められるように、実験全体を通して、実質的に一定のままである。一方、従来の持続時間が制御された露光（下側の点集合）では、約２０％の強度減少が、観察された。

本発明の一実施形態では、顕微鏡サンプルを撮像するためのシステム（顕微鏡設定の一部として）が、提供される。本システムは、光源からの光を少なくとも１つのサンプルに指向する、光学励起経路と、少なくとも１つのサンプルへの光束を表す電気信号を出力するように構成される、光センサと、少なくとも１つのサンプルから放出される蛍光の画像を捕捉するように構成される、カメラと、各サンプルが、総光束を表す所定の閾値が到達されると終了される、カメラ露光の持続時間の間、実質的に同一の総光束を受光するように、カメラの露光時間を制御するように構成される、コントローラとを備える。本システムは、少なくとも１つのサンプルからの蛍光を励起させるための少なくとも１つの光源を含むことができる。光学励起経路は、光源からの光を少なくとも１つのサンプルと一致する対物面に指向する１つ以上の対物レンズを備えることができる。本システムは、複数のサンプルを保持する、（上記に記載のような）マイクロプレートを備えることができる。

カメラは、複数のサンプルを測定することができる。コントローラは、１つのサンプルから別のサンプルへのシーケンスにおいて、サンプルの測定を指示することができる。代替として、コントローラは、同一サンプルを複数回測定する、時間経過シーケンスを指示することができる。

本システムでは、光センサは、光学励起経路から分離されるが、必ずしも、ビームスプリッタから分離されない、光に露光される。代替として、１つ以上のサンプルに指向される光は、カメラが配置される顕微鏡設定の内側（または外側）に配置される、ビームスプリッタによって、分離されることができる。本システムでは、カメラによって撮像される蛍光は、ビームスプリッタを通して通過する場合とそうではない場合がある。

システム制御

本発明の一実施形態では、サンプル撮像のための方法が、提供される。図４は、本発明による、サンプル撮像のための例示的方法を描写する、フローチャートである。１００１では、（源からの）光束は、光学経路に沿って、サンプルに指向される。１００３では、カメラ露光、すなわち、ＬＥＤと、サンプルへの光学光束を表す測定の両方が、同時に開始される。１００５では、光学光束を表す測定は、サンプルを光束に露光させる間、積分（合計または総計）される。１００７では、カメラ露光および／または光源は、積分された光束が所定の合計（すなわち、所定の閾値）を満たす（またはそれに到達する）と終了される。

一般に、顕微鏡サンプルを撮像するための方法は、少なくとも１つのサンプルと一致する、対物面（例えば、対物面３０）に光を指向し、少なくとも１つのサンプルに指向される光の一部を光センサ（例えば、基準検出器２２）に分離し、少なくとも１つのサンプルへの光束を表す電気信号を出力し、少なくとも１つのサンプルから放出される蛍光（または燐光）の画像を形成し、得られた複数の画像に関して、各サンプルが、実質的に同一の総光束を受光するように、カメラ（例えば、カメラ３０および２８０）によって少なくとも１つのサンプルから得られた各画像の露光を制御することができる。

顕微鏡サンプルを撮像するための方法は、（図２におけるように）光センサ２３０からの電気信号を積分し、総計または積分された出力を生成し、総計または積分された出力を所定の閾値と比較することができる。本方法は、光源２１０がオンに切り替えられる前またはそれと同時に、カメラ（例えば、カメラ２８０）を露光モードに設定することができる。本方法は、光源２１０がオンに切り替えられた後、光センサからの電気信号の積分を開始し、所定の閾値が到達されると、カメラをオフにすることができる。本方法は、所定の閾値が到達されると、光源２１０をオフにすることができる。

顕微鏡サンプルを撮像するための方法は、１つのサンプルから別のサンプルへのシーケンスにおいて、サンプルを測定することができる、または同一サンプルを（または異なるサンプル間で）複数回測定する、時間経過シーケンスにおいて、測定することができる。

本発明の一実施形態では、ハードウェア／電子機器内に実装される１つ以上のコントローラまたはソフトウェアプログラムコードが、上記に説明される機能のいずれかまたは全てを実施するために使用されてもよい。例えば、適切な電子回路またはソフトウェアプログラムコードを有する、コントローラが、光積分器１２２、コントローラ１３４、カメラ３０または２８０、ＬＥＤコントローラ２００、および束コントローラ２４０内のハードウェアと別個に、またはそれと併せて使用され、上記に説明される機能の一部または全部を実施することができる。故に、そのようなプロセッサは、メモリ（例えば、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ、静的メモリ、ＤＲＡＭ、ＳＤＲＡＭ、およびその均等物）内に含まれるプログラムコードを有する、コンピュータ可読媒体を用いて動作することができ、これは、サンプルを撮像するためのシステム内で実行されると、以下のステップ：光源をオンまたはオフにし、光を少なくとも１つのサンプルと一致する対物面に指向するステップと、少なくとも１つのサンプルに指向される光の一部を受光する光センサから出力される電気信号を測定するステップと、カメラから、少なくとも１つのサンプルから放出される蛍光または燐光の画像を受信するステップと、得られた複数の画像に関して、各サンプルが、実質的に同一の総光束を受光するように、カメラによって少なくとも１つのサンプルから得られた各画像の露光を制御するステップとを実施する。

プログラムコードはさらに、電子回路と別個に、またはそれと併せて、光センサからの電気信号を積分し、総計された出力を生成するステップと、総計された出力を所定の閾値と比較するステップとを実行してもよい。プログラムコード（または電子回路）はさらに、光源がオンに切り替えられる前またはそれと同時に、カメラ露光を開始してもよい。プログラムコード（または電子回路）はさらに、光源がオンに切り替えられた後、光センサからの電気信号の積分を開始し、所定の閾値が到達されると、カメラをオフにしてもよい。プログラムコード（またはハードウェア）はさらに、所定の閾値が到達されると、光源をオフにしてもよい。

本発明は、したがって、一実施形態では、顕微鏡サンプルを撮像するためのシステムを含む。本システムは、光を少なくとも１つのサンプルと一致する対物面に指向するための手段と、少なくとも１つのサンプルに指向される光の一部の強度を測定するための手段と、少なくとも１つのサンプルから放出される蛍光を撮像するための手段と、得られた複数の画像に関して、各サンプルが、実質的に同一の総光束を受光するように、カメラによって少なくとも１つのサンプルから得られた各画像の露光を制御するための手段とを備える。

本発明は、したがって、別の実施形態では、顕微鏡サンプルを撮像するためのシステムを含む。本システムは、光源をオンまたはオフにし、光を少なくとも１つのサンプルと一致する対物面に指向するための手段と、少なくとも１つのサンプルに指向される光の一部を受光する光センサから出力される電気信号を測定するための手段と、カメラから少なくとも１つのサンプルから放出された蛍光または燐光の画像を受信するための手段と、得られた複数の画像に関して、各サンプルが、実質的に同一の総光束を受光するように、カメラによって少なくとも１つのサンプルから得られた各画像の露光を制御するための手段とを備える。

前の説明は、種々の実装の特定の実施例を例証するにすぎないが、本発明は、前述の例証的実施例に限定されない。当業者は、添付の請求項によって定義されるような本発明が、種々のさらなる実装および修正において適用され得ることを認知する。特に、説明される実装の種々の特徴の組み合わせが、これらの特徴が相互に矛盾しない限り可能である。故に、前述の実装の説明は、例証目的および説明のために提示されている。包括的ではなく、請求される発明を開示される精密な形態に限定するものでもない。修正および変形例が、上記の説明に照らして可能性として考えられる、または本発明を実践することから得られ得る。したがって、添付の請求項の範囲内において、本発明は、本明細書に具体的に説明される通り以外で実践されてもよいことを理解されたい。請求項およびその均等物が、本発明の範囲を定義する。

Claims (28)

1. 複数の顕微鏡サンプルを撮像するためのシステムであって、
   前記複数の顕微鏡サンプルからの蛍光を励起させるための光源と、
   前記光源からの光を前記複数の顕微鏡サンプルと一致する対物面に指向する、１つ以上の対物レンズを備える、光学励起経路と、
   前記光学励起経路に沿って配置され、前記光学励起経路からの前記光の一部を分離するように構成されている、基準ビームスプリッタと、
   前記光学励起経路から分離された前記光の前記一部を検出し、前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルへの光束を表す電気信号を出力するように構成されている、光センサと、
   前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルから放出される蛍光の画像を捕捉するように構成されている、カメラと、
   光を前記光学励起経路に沿って前記基準ビームスプリッタに指向するように構成されている、第２のビームスプリッタであって、前記基準ビームスプリッタにおいて、前記光の一部が前記光センサに進み、前記光の別の部分が前記複数の顕微鏡サンプルに進み、前記複数の顕微鏡サンプルから放出される前記光は、前記光学励起経路を通って逆行し、前記カメラの像面に到着する前に、前記基準ビームスプリッタ、前記第２のビームスプリッタ、および顕微鏡チューブレンズを通過する、第２のビームスプリッタと、
   前記光センサからの前記電気信号を積分し、積分された出力を生成するように構成されている、積分器と、前記積分された出力を所定の閾値と比較するように構成されている比較器とを備える、コントローラと
   を備え、
   前記コントローラは、前記カメラの露光の持続時間の間、実質的に同一の総光束を前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルが受光するように、前記カメラの前記露光を制御し、前記カメラの前記露光は、前記所定の閾値が到達されると終了され、
   前記１つ以上の対物レンズは、前記カメラが前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルを撮像することを可能にする、システム。
2. 前記コントローラは、電子回路もしくはプログラムコードのうちの１つ、または前記２つの組み合わせによって、前記電気信号を積分し、前記積分された出力を生成し、前記積分された出力を前記所定の閾値と比較するように実装される、請求項１に記載のシステム。
3. 前記コントローラは、前記光源がオンに切り替えられる前またはそれと同時に、前記カメラの前記露光を開始するように構成され、
   前記光源がオンに切り替えられた後、前記積分器は、前記光センサからの前記電気信号を積分し、
   前記所定の閾値が到達されると、前記カメラの前記露光は、終了される、請求項２に記載のシステム。
4. 前記所定の閾値が到達されると、前記光源は、オフに切り替えられる、請求項３に記載のシステム。
5. 前記所定の閾値が到達されると、前記光源は、オフに切り替えられる、請求項１に記載のシステム。
6. 蛍光測定のためのフィルタセットをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
7. 前記光源は、発光ダイオードを備える、請求項１に記載のシステム。
8. 前記光源は、光ファイバで前記システムの中に結合されている、請求項１に記載のシステム。
9. 前記光ファイバは、ファイバガイドまたはファイバ束を備える、請求項８に記載のシステム。
10. 前記１つ以上の対物レンズは、前記複数の顕微鏡サンプルの複数の倍率を可能にする、請求項１に記載のシステム。
11. 複数のサンプルを保持するマイクロプレートのためのホルダをさらに備え、前記カメラは、複数のサンプルを測定する、請求項１に記載のシステム。
12. 前記コントローラは、１つのサンプルから別のサンプルへのシーケンスにおいて、前記サンプルの測定を指示する、請求項１１に記載のシステム。
13. 前記コントローラは、同一サンプルを複数回測定する、時間経過シーケンスを指示する、請求項１１に記載のシステム。
14. 前記コントローラは、異なるサンプル間で複数回測定する、時間経過シーケンスを指示する、請求項１に記載のシステム。
15. 前記基準ビームスプリッタは、前記カメラが配置されている前記システムの内側に配置されている、請求項１に記載のシステム。
16. 前記基準ビームスプリッタは、前記カメラが配置されている前記システムの外側に配置されている、請求項１１に記載のシステム。
17. 前記カメラによって撮像される前記蛍光は、前記基準ビームスプリッタを通過しない、請求項１に記載のシステム。
18. 複数の顕微鏡サンプルを撮像するためのシステムであって、
    光源からの光を前記複数の顕微鏡サンプルに指向する、光学励起経路と、
    前記光学励起経路に沿って配置され、前記光学励起経路からの前記光の一部を分離するように構成されている、基準ビームスプリッタと、
    前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルへの光束を表す電気信号を出力するように構成されている、光センサと、
    前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルから放出される蛍光の画像を受信するように構成されている、カメラと、
    光を前記光学励起経路に沿って前記基準ビームスプリッタに指向するように構成されている、第２のビームスプリッタであって、前記基準ビームスプリッタにおいて、前記光の一部が前記光センサに進み、前記光の別の部分が前記複数の顕微鏡サンプルに進み、前記複数の顕微鏡サンプルから放出される前記光は、前記光学励起経路を通って逆行し、前記カメラの像面に到着する前に、前記基準ビームスプリッタ、前記第２のビームスプリッタ、および顕微鏡チューブレンズを通過する、第２のビームスプリッタと、
    前記カメラの露光の持続時間の間、実質的に同一の前記総光束を前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルが受光するように、前記カメラの前記露光を制御するように構成されているコントローラであって、前記カメラの前記露光は、前記総光束を表す所定の閾値が到達されると終了される、コントローラと
    を備える、システム。
19. 複数の顕微鏡サンプルを撮像するためのシステムであって、
    光源からの光を前記複数の顕微鏡サンプルと一致する対物面に指向するための第１の手段と、
    光を指向するための前記第１の手段からの前記光の一部を分離するための手段と、
    前記光の一部の強度を測定するための手段と、
    前記光源からの入射光への露光に応じて、前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルから放出される蛍光を撮像するための手段と、
    光を前記第１の手段に沿って前記光の一部を分離するための手段に指向するための第２の手段であって、前記光の一部を分離するための手段において、前記光の一部が前記強度を測定するための手段に進み、前記光の別の部分が前記複数の顕微鏡サンプルに進み、前記複数の顕微鏡サンプルから放出される前記光は、前記第１の手段を通って逆行し、前記蛍光を撮像するための手段の像面に到着する前に、前記光の一部を分離するための手段、前記第２の手段、および顕微鏡チューブレンズを通過する、第２の手段と、
    得られた複数の画像に関して、前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルが前記入射光の実質的に同一の総光束を受光するように、前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルから得られた各画像の露光を制御するための手段と
    を備える、システム。
20. 複数の顕微鏡サンプルを撮像するための方法であって、
    光源からの光を前記複数の顕微鏡サンプルと一致する対物面に指向することと、
    前記光の一部を光センサに分離し、前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルへの光束を表す電気信号を出力することと、
    前記光源からの入射光への露光に応じて、前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルから放出される蛍光の画像を形成することであって、前記複数の顕微鏡サンプルから放出される前記光は、光学励起経路を通って逆行し、カメラの像面に到着する前に、基準ビームスプリッタ、第２のビームスプリッタ、および顕微鏡チューブレンズを通過する、ことと、
    得られた複数の画像に関して、前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルが前記入射光の実質的に同一の総光束を受光するように、前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルから得られた各画像の露光を制御することと
    を含む、方法。
21. 前記光センサからの電気信号を積分し、総計された出力を生成することと、
    前記総計された出力を所定の閾値と比較することと
    をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記光源がオンに切り替えられる前またはそれと同時に、前記カメラの前記露光を開始することと、
    前記光源がオンに切り替えられた後、前記光センサからの前記電気信号を積分することと、
    前記所定の閾値が到達されると、前記カメラの前記露光を終了することと
    をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記所定の閾値が到達されると、前記光源をオフにすることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記所定の閾値が到達されると、前記光源をオフにすることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
25. １つのサンプルから別のサンプルへのシーケンスにおいて、前記サンプルを測定することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
26. 同一サンプルを複数回測定する、時間経過シーケンスにおいて測定することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
27. 異なるサンプル間で複数回測定する、時間経過シーケンスにおいて測定することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
28. プログラムコードを有するコンピュータ可読媒体であって、前記プログラムコードは、請求項１－１９のいずれか１項に記載のシステム内のプロセッサ上で実行されると、以下のステップ：
    光源をオンまたはオフにし、光を複数の顕微鏡サンプルと一致する対物面に指向するステップと、
    前記光の一部を受光する光センサから出力される電気信号を測定するステップと、
    前記光源からの入射光への露光に応じて、カメラから前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルから放出される蛍光の画像を受信するステップと、
    得られた複数の画像に関して、複数の顕微鏡サンプルの各サンプルが前記入射光の実質的に同一の総光束を受光するように、前記カメラによって、前記複数の顕微鏡サンプルの各サンプルから得られた各画像の露光を制御するステップと
    を実施する、コンピュータ可読媒体。