JP2006058237A - 分光装置及びスペクトルレーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 マルチチャンネル光検出器の感度補正をリアルタイムに実行可能にする分光装置及びスペクトルレーザ顕微鏡を提供すること。
【解決手段】 レーザ顕微鏡１０１と、前記レーザ顕微鏡１０１からの光をスペクトル測光する複数の光検出器１３ｉからなるマルチチャンネル光検出器１３を有する分光測定手段１０３とからなり、前記スペクトルと前記マルチチャンネル光検出器１３の相対位置を前記スペクトルの波長分散方向に沿って変更する前後の第１の輝度データと第２の輝度データとから、前記複数のチャンネル１３ｉそれぞれの感度ばらつきを算出して、前記第１または前記第２の輝度データを補正するスペクトルレーザ顕微鏡１００。
【選択図】 図１

Description

本発明は、標本からの光をスペクトルに分解して検出する分光装置及びスペクトルレーザ顕微鏡に関し、特にマルチチャンネル光検出器の光検出器間の感度ばらつきを補正可能な分光装置及びスペクトルレーザ顕微鏡に関する。

生物学、医学の分野において細胞内情報伝達に関する研究が盛んに行われている。そこでは生物を生きたまま自然に近い状態（大気中、水分を含んだままで）で動的に観察することができることに加え、細胞よりも小さい機能分子（例えば、タンパク質や無機質等）を選択的に視覚化し、複数の機能分子の相互作用をも観察できる特徴を生かした蛍光顕微鏡が利用されている。蛍光顕微鏡の中でも、蛍光共焦点レーザ顕微鏡は、光学的に標本の断層像が取得でき、またコントラストの良い画像が得られる特徴を有することから近年広く普及しつつある。標本から発せられる蛍光は、蛍光試薬の種類、蛍光試薬と標本との結合状態、励起する波長など様々な状態、条件に依存して特有の波長領域の光として発せられる。つまり、蛍光の波長から標本内の物質の存在、状態、反応等が確認でき、また蛍光の強度からこれらの量的な評価が可能となる。

最近では、蛍光をスペクトルに分解して、厳密に物質の同定をし、生体内で生じる現象を解明するために複数の光検出器（チャンネルとも言う）からなるマルチチャンネル光検出器を使ってスペクトルの波長領域を一時に検出するレーザ顕微鏡が提案されている。この様なレーザ顕微鏡でスペクトルを取得することは、標本の蛍光スペクトル情報が二次元画像として視覚的に得られる点で、単一波長を検出する蛍光顕微鏡に比べ優れている（例えば、特許文献１参照。）。
特表２００４−５０６１９２号公報

しかし、特許文献１に開示されているレーザ顕微鏡では、スペクトルを検出するマルチチャンネル光検出器（アノード型ＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅの略）の各光検出器（以後、チャンネルと記す）（例えば、３２チャンネル）それぞれの感度（量子効率、増倍率に起因する）が均一ではなく、またマルチチャンネル光検出器に印加する電圧を変化させた際に微弱な蛍光のスペクトルの強度を所望の精度で取得することができず、厳密な物質の同定を行うことが難しいと言う問題がある。

本発明は上記問題に鑑みて行われたものであり、蛍光の測定時にマルチチャンネル光検出器の感度補正をリアルタイムで実行可能にする分光装置及びスペクトルレーザ顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は、顕微鏡からの光を測定する分光測定手段を有し、前記分光測定手段は、前記顕微鏡からの光をスペクトルに分光する分光手段と、複数の光検出器から成り前記スペクトルを一括して検出するマルチチャンネル光検出手段と、前記スペクトルと前記マルチチャンネル光検出手段の相対位置を前記スペクトルの波長分散方向に沿って変化させる移動手段と、前記複数の光検出器からのそれぞれの輝度データを処理する演算処理手段を有し、前記演算処理手段は、前記移動手段で前記スペクトルと前記マルチチャンネル光検出手段の相対位置を変更する前の第１の輝度データと変更後の第２の輝度データとから前記複数の光検出器それぞれの感度ばらつきを算出して、前記第１または前記第２の輝度データを補正することを特徴とする分光装置を提供する。

また、本発明の分光装置では、前記移動手段は、前記マルチチャンネル検出手段に設けられていることが好ましい。

また、本発明の分光装置では、前記移動手段は、前記分光手段の光軸に対する傾き角度を変更することが好ましい。

また、本発明の分光装置では、前記第２の輝度データは、前記移動手段により前記スペクトルと前記マルチチャンネル光検出手段との相対位置を前記複数の光検出器中の１光検出器分移動して検出され、前記演算処理手段は、前記スペクトルの同じ波長域に対応する光検出器からの前記第１の輝度データと前記第２の輝度データより前記複数の光検出器中の基準光検出器に対する前記複数の光検出器それぞれの感度ばらつきを算出して、前記第１または前記第２の輝度データを補正することが好ましい。

また、本発明は、レーザ顕微鏡と、前記レーザ顕微鏡からの光を測定する分光測定装置とからなり、前記分光測定装置は、前記レーザ顕微鏡からの光をスペクトルに分光する分光手段と、複数の光検出器から成り前記スペクトルを一括して検出するマルチチャンネル光検出手段と、前記スペクトルと前記マルチチャンネル光検出手段の相対位置を前記スペクトルの波長分散方向に沿って変化させる移動手段と、前記複数の光検出器からのそれぞれの輝度データを処理する演算処理手段を有し、前記演算処理手段は、前記移動手段で前記スペクトルと前記マルチチャンネル光検出手段の相対位置を変更する前の第１の輝度データと変更後の第２の輝度データとから前記複数の光検出器それぞれの感度ばらつきを算出して、前記第１または前記第２の輝度データを補正することを特徴とするスペクトルレーザ顕微鏡を提供する。

また、本発明のスペクトルレーザ顕微鏡では、前記演算処理手段は、前記マルチチャンネル検出手段の感度ばらつきに起因する感度補正データによる補正に加えて、さらに、前記レーザ顕微鏡の光学系に起因する前記輝度データの光学補正データにより前記輝度データを補正することが好ましい。

また、本発明のスペクトルレーザ顕微鏡では、前記光学補正データは、固定値であり、前記感度補正データは、変数値であることが好ましい。

本発明によれば、蛍光の測定時にマルチチャンネル光検出器の感度補正をリアルタイムで実行可能にする分光装置及びスペクトルレーザ顕微鏡を提供することができる。

以下、本発明の一実施の形態に関し図面を参照しつつ説明する。

図１は、本発明の実施の形態にかかかるスペクトルレーザ顕微鏡の概略構成図を示す。図２は、本発明の実施の形態にかかるスペクトルレーザ顕微鏡における輝度データＩａｎ、Ｉｂｎの取得状態を説明する図であり、（ａ）は輝度データＩａｎの、（ｂ）は輝度データＩｂｎの取得状態を示す。図３は、本発明の実施の形態にかかるスペクトルレーザ顕微鏡における感度補正フローチャートを示す。図４は、本発明の実施の形態にかかるスペクトルレーザ顕微鏡における感度補正の一例を示す。

（実施の形態）
図１において、本発明の実施の形態にかかるスペクトルレーザ顕微鏡１００は、レーザ顕微鏡１０１、リレー光学系１０２、及びスペクトル検査装置（分光装置）１０３とから構成されている。

レーザ顕微鏡１０１は、ステージ７に載置された標本（又は基準標本）８に照射する励起光を発するレーザ光源１と、レーザ光源１からのレーザ光を略平行光にするコリメートレンズ３と、レーザ光源１とコリメートレンズ３の間に配置されたシャッタ２と、コリメートレンズ３からの略平行光のレーザ光から所定の励起波長のレーザ光を対物レンズ５の方向に反射し、標本８で発生する蛍光を透過するダイクロイックミラー４と、ダイクロイックミラー４と対物レンズ５の間に配置された二次元走査手段（以後、ＸＹスキャナと記す）６と、ＸＹスキャナ６でＸＹ方向に二次元スキャンされ、対物レンズ５を介してステージ７に載置された標本８に点状に集光された励起光で励起されて発生した蛍光を、対物レンズ５で集光され、ＸＹスキャナ６、及びダイクロイックミラー４を介して焦点位置ｆに集光するレンズ９で構成されている。

リレー光学系１０２は、集光レンズ９で集光された蛍光を光路偏向ミラー１０２ｂ、１０２ｂとリレーレンズ１０２ａ、１０２ａを用いてレーザ顕微鏡１０１からスペクトル検査装置１０３にリレーするように構成されている。なお、リレー光学系１０２は、光ファイバーを用いることも可能である。

スペクトル検査装置（分光装置）１０３は、リレー光学系１０２からの蛍光を入射する光軸に配置された、コリメートレンズ１０と、スリット１１と、分光素子１２（例えば、回折格子、プリズム等）と、分光素子１２で分光された蛍光のスペクトルを検出する複数のチャンネル（光検出器）１３ｉ（ｉ＝１〜ｎ）を有するマルチチャンネル光検出器１３と、マルチチャンネル光検出器１３を各チャンネル１３ｉの方向に沿って移動させる移動手段１４と、マルチチャンネル光検出器１３にＣＰＵ１５の指示によってＩ／Ｏ１６を介して高電圧を印加する高圧電源１７と、各チャンネル１３ｉからの信号をそれぞれ処理するアナログ処理回路１８ｉ（ｉ＝１〜ｎ）、及びＡ／Ｄ変換器２０ｉ（ｉ＝１〜ｎ）と、処理された信号を記憶するフレームメモリ２２と、ＣＰＵ１５の指示によりＸＹスキャナ６とフレームメモリ２２へのデータの記憶を同期させる同期信号発生回路１９と、フレームメモリ２２に記憶された蛍光画像データをモニタ２４に表示させるためのＤ／Ａ変換器２３とから構成されている。

なお、分光素子１２で分光されたスペクトルとマルチチャンネル光検出器１３との相対位置の変更は、マルチチャンネル光検出器１３を固定し入射光に対する分光素子１２の角度を変える、あるいは分光素子１２に対する入射光の位置を変えることでも可能である。

シャッタ２はＩ／Ｏ１６を介して、ＸＹスキャナ６はＸＹスキャナ駆動回路２１を介してＣＰＵ１５により制御される。この様にして、スペクトルレーザ顕微鏡１００が構成されている。

（スペクトルレーザ顕微鏡の初期化）
始めに、スペクトルレーザ顕微鏡１００全体の初期化手順に関して説明する。スペクトルレーザ顕微鏡１００全体の初期化は、スペクトル分布（波長及び輝度値）が既知の基準光を用いて行う。

図１において、ステージ７上に基準標本８を配置する。レーザ光源１から出射されたレーザ光は、シャッタ２が開の時コリメートレンズ３を介してダイクロイックミラー４に入射される。入射されたレーザ光はダイクロイックミラー４で対物レンズ５の方向に反射されダイクロイックミラー４と対物レンズ５の間に配置されたＸＹスキャナ６でＸＹ方向にスキャニングされ、対物レンズ５を介してステージ７に載置された基準標本８に点状に集光される。基準標本８が発する基準光は、対物レンズ５で集光され光路を逆行してＸＹスキャナ６でデスキャニングされた後、ダイクロイックミラー４を透過してレンズ９で焦点位置ｆに集光される。焦点位置ｆに集光された基準光は、リレー光学系１０２を介してスペクトル検査装置１０３に入射される。

スペクトル検査装置１０３に入射した基準光は、レンズ１０で略平行光にされスリット１１のスリット部１１ａで分光に適した幅のスリット光にされ分光素子１２に入射される。分光素子１２に入射された基準光は分光素子１２でマルチチャンネル光検出器１３の各チャンネル１３ｉ（ｉ＝１〜ｎ）方向に沿って分光されたスペクトルとなり、マルチチャンネル光検出器１３の各チャンネル１３ｉに入射される。入射されたスペクトルは、スペクトルの回折幅とマルチチャンネル光検出器１３の各チャンネル１３ｉの配置間隔による波長分解能Δλで検出される。

マルチチャンネル光検出器１３には微弱な光を検出するためにアノード型ＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅの略、例えば浜松ホトニクス社製ＨＡ７２６０等）が使用される。ＨＡ７６２０は、各チャンネル１３ｉ（ｉ＝１〜３２、以後３２チャンネルの場合について説明する）が１ｍｍ間隔で３２個配置されている。また、ＨＡ７６２０は印加する電圧によって感度を変更することができ、ＣＰＵ１５からの指令によって、Ｉ／Ｏ１６を介して高圧電源１７を制御し、所望の感度を得るように高電圧をマルチチャンネル光検出器１３に印加する。なお、マルチチャンネル光検出器１３はスペクトルの強度に応じて分割型固体撮像素子（ＳＰＤ（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｐｈｏｔｏ Ｄｉｏｄｅの略）、ＡＰＤ（Ａｖａｌａｎｃｈｅ Ｐｈｏｔｏ Ｄｉｏｄｅの略）等を使用することも可能である。

各チャンネル１３ｉは入射されたスペクトルの輝度を電気信号に変換する。電気信号はアナログ処理回路１８ｉ（ｉ＝１〜３２）で電流電圧変換及び増幅され、同期信号発生回路１９からのＸＹスキャナ６の走査に同期したサンプリングクロックでＡ／Ｄ変換器２０ｉ（ｉ＝１〜３２）によりデジタルデータに変換される。なお、ＸＹスキャナ６は同期信号発生回路１９からの同期信号を受けＸＹスキャナ駆動回路２１が駆動制御を行っている。各チャンネル１３ｉは、同等のアナログ処理回路１８ｉ及びＡ／Ｄ変換器２０ｉを有し、これらにより３２チャンネル同時に処理を行い、各チャンネル１３ｉの輝度データをＣＰＵ１５のメモリに記録する。なお、３２チャンネルの同時性が不要な場合、Ａ／Ｄ変換器２０ｉを１つにしてマルチプレクサ（不図示）で各チャンネル１３ｉを切換えてアナログ信号をデジタル信号に変換することも可能である。

この様にして、基準標本８からの基準光のスペクトルに対する各チャンネル１３ｉの輝度値が求められ、基準光の既知の輝度値データと求められた輝度値データとの比からスペクトルレーザ顕微鏡１００の光学系及び検出系全体の波長に対する補正データαが得られる。この補正データαは、レーザ顕微鏡１０１の光学系のように経時的に変化しない特性（以後、光学補正データγと記す）と、マルチチャンネル光検出器１３の様に使用条件（例えば、印加電圧値等）によって変化する特性（以後、感度補正データβと記す）の両方を含めた補正データ（α＝γ×β）となっている。

通常、この補正データα（α＝γ×β）は、工場出荷前に検査されて求められ、スペクトルレーザ顕微鏡１００内（レーザ顕微鏡１０１とスペクトル検査装置１０３とのシステム）に組込まれる。この補正データαは、径時変化のない光学補正データγと、径時変化のある感度補正データβとから構成されているため、定期的なメンテナンスを必要とし、ユーザには大きな負担がかかる。

即ち、マルチチャンネル光検出器１３を備えるスペクトル検査装置１０３の感度補正データβは、使用条件、環境条件によって変化（径時変化）することから、その変化により補正データαの値が変化してしまう。その変化により適切な補正ができなくなることから、ユーザは定期的にメーカに補正データαの書き換え（更新）を依頼しなければならず、その間、装置の使用ができない事態となってしまう不都合がある。

本実施の形態では、この様な不都合を解消した装置を提供する。

上述したように、工場出荷前、補正データαを求めた後に、後述する手法によりスペクトル検査装置１０３の感度補正データβを求め、補正データαと感度補正データβとからレーザ顕微鏡１０１側の光学補正データγ（この補正データγは径時変化のほとんどないデータである）を算出する。この算出された光学補正データγを、スペクトルレーザ顕微鏡１００のＣＰＵ１５のメモリに格納しておけば、その後、感度補正データβのみを定期的に測定して求めれば、スペクトルレーザ顕微鏡１００で得られた輝度データを適正に補正することができる。即ち、この輝度データが補正データαにより補正されたことになる。

なお、基準標本８を用いる代わりに、着脱可能な基準光源をステージ７の下部に設け、対物レンズ５の焦点位置に基準光源からの基準光を集光するように構成することで同様の効果を奏する。

（光学補正データγを求める手法）
光学補正データγを求めるために、マルチチャンネル光検出器１３の各チャンネル１３ｉの感度補正データβの算出に関し説明する。マルチチャンネル光検出器１３として用いられる高感度のマルチアノード型ＰＭＴは、印加する高電圧を変える事で感度を変更することができるが、この際各チャンネル１３ｉの感度が不均一に変化してしまう。特に微弱な蛍光を検出する時は、入射する蛍光の強度に対して最適な感度となるように印加電圧を調整する必要があるので、印加電圧を変更した際の各チャンネル１３ｉの感度補正データが必要となる。本実施の形態にかかるスペクトルレーザ顕微鏡１００では、以下に述べる手段によって印加電圧を変えた際の各チャンネル１３ｉの感度補正データβを取得することが可能となる。

マルチチャンネル光検出器１３の印加電圧を変更した時における各チャンネル１３ｉの感度補正データβの収集に関して図２、図３に基づき説明する。基準光をマルチチャンネル光検出器１３に入射するところまでは上述と同じであり説明を省略する。

レーザ光源１のシャッタ２を開け基準標本８に励起光を照射し基準光をスペクトル検査装置に入射する（Ｓ１）。ＣＰＵ１５からＩ／Ｏ１６を介してマルチチャンネル光検出器１３に所望の電圧を印加するように設定し（Ｓ２）、３２チャンネル全ての輝度データＩａｎ（ｎ＝１〜３２）を取得し、ＣＰＵ１５のメモリに記憶する（Ｓ３）。得られた輝度レベルが適当かどうかを判断し（Ｓ４）、輝度データＩａｎの中で信号が飽和している値があったり、最大輝度値が低すぎたりして輝度データとして不適当な場合、高圧電源１７を介して印加電圧を可変し（Ｓ５）、輝度データＩａｎの取得を繰り返す（Ｓ３〜Ｓ５）。各チャンネル１３ｉの輝度データＩａｎとスペクトルの波長位置との関係を模式的に図２（ａ）に示す。なお、輝度調整は高圧電源１７の印加電圧の代わりにレーザ光源１のパワーを調整しても良い。

次に、移動手段１４でマルチチャンネル光検出器１３を１チャンネル分シフト（例えば、同じ波長の光の入射するチャンネル番号が大きくなる方向にシフト）させる（Ｓ６）（図２（ｂ）参照）。この状態で再度３２チャンネル全ての輝度データＩｂｎを取得し、ＣＰＵ１５のメモリに記憶する（Ｓ７）。各チャンネル１３ｉの輝度データＩｂｎとスペクトルの波長位置との関係を模式的に図２（ｂ）に示す。輝度データＩｂｎの中で信号が飽和している値があったり、最大輝度値が低すぎたりしてデータとして不適当な場合（Ｓ８）、高圧電源１７を介して印加電圧を変更し（Ｓ９）、移動手段１４によりマルチチャンネル光検出器１３の位置を１チャンネル分戻し（Ｓ１０）、３２チャンネル全ての輝度データＩａｎ、Ｉｂｎを取得することを繰り返す（Ｓ３〜Ｓ１０）。所望の輝度データＩａｎとＩｂｎを取得した後、シャッタ２を閉じて（Ｓ１１）、マルチチャンネル光検出器１３に光が入射していない状態にして３２チャンネル全ての輝度データＩｏｎを取得しＣＰＵ１５のメモリに記憶する（Ｓ１２）。なお、輝度データＩｏｎが無視できるほど小さいときにはＩｏｎデータの取得作業を省略しても良い。

次に、輝度データＩａｎ、Ｉｂｎ、及びＩｏｎとから各チャンネル１３ｉにおける感度補正データβを以下の手順で算出する。

各チャンネル１３ｉに対して、１つ前のチャンネルに対する感度比[Ｇｎ／Ｇｎ−１]を次の式から求める（Ｓ１３）。
[Ｇｎ／Ｇｎ−１]＝（Ｉｂｎ−Ｉｏｎ）／（Ｉａ（ｎ−１）−Ｉｏ（ｎ−１））
これは、図２（ａ），（ｂ）に示すように、スペクトルの同じ波長域を輝度データＩａｎ取得時はチャンネル（ｎ−１）で、輝度データＩｂｎ取得時はチャンネル（ｎ）で検出しているので、両者の比がチャンネル（ｎ）とチャンネル（ｎ−１）との感度比[Ｇｎ／Ｇｎ−１]となることを示している。

各チャンネルに対してチャンネル１に対する感度補正データβである感度比[Ｇｎ／Ｇ１]を次の式から求めＣＰＵ１５のメモリに格納する（Ｓ１４）。
[Ｇｎ／Ｇ１]＝[Ｇ２／Ｇ１]×[Ｇ３／Ｇ２]×・・・×[Ｇｎ／Ｇｎ−１] （ｎ＞１）
出荷時の光学補正データγを求める工程であると判断されると（Ｓ１７）、基準標本８を使って求めた補正データαと、ステップＳ１４で求められた感度補正データβとから光学補正データγ（γ＝α／β）を算出し、ＣＰＵ１５のメモリに格納する（Ｓ１８）。

なお、上述の感度補正ではチャンネル１を基準に補正をしたが、マルチチャンネル光検出器１３のシフト方向を逆にして最終チャンネル（３２チャンネル）を基準にしたり、途中の任意のチャンネルを基準にして補正することも可能である。

図４は補正例を示している。図４（ａ）は基準光から得られた各チャンネルのチャンネル１に対する感度補正データβである感度比［Ｇｎ／Ｇ１］を示している。

この様にして、マルチチャンネル光検出器１３に印加する高電圧を変えた場合でも、スペクトル検査装置１０３に入射する光のスペクトルをマルチチャンネル光検出器１３の位置を変えてそれぞれ輝度データＩａｎ，Ｉｂｎを取得し、それぞれの輝度データＩａｎ，Ｉｂｎを用いて感度補正データβを求めることができ、所定の精度でスペクトル分析を行うことが可能になる。

なお、上述の説明は光学補正データγを求めるために基準光を用いた場合についてしたが、光学補正データγを求めた後には、特別な基準光を必要とせず測定対象の標本からの光を用いて輝度補正を行うことができる。

以上、本実施の形態にかかるスペクトルレーザ顕微鏡１００では、スペクトルレーザ顕微鏡１００全体の補正データαと唯一使用条件（例えば、印加電圧等）により大きく変化するマルチチャンネル光検出器１３の感度補正データβを予め取得することで、スペクトル分布が使用条件により変化しない光学補正データγを算出することができるため、使用条件が変わる場合でもマルチチャンネル光検出器１３の感度補正データβを取得するだけで良く、既知のスペクトル分布の基準光を使ってスペクトルレーザ顕微鏡１００全体の再初期化を行う必要が無い。また、光学系の変更等が無い場合には、上記の補正データαを用いることで初期化操作をスキップすることができる。

なお、この補正データαはＣＰＵ１５内のメモリや外部メモリに保存しておくことで、必要に応じて補正データを呼び出すことも可能である。また、専用の基準光源や基準標本の代わりに測定標本を使ってスペクトルレーザ顕微鏡１００の補正も可能である。

上述したように、一旦光学補正データγを求めメモリした後は、経時的変化があるスペクトル検査装置１０３の感度補正データβのみを定期的に求め更新すれば良い。以下に感度補正データβを求め、スペクトルレーザ顕微鏡１００で測定された輝度データを適正補正し、測定標本８からの蛍光のスペクトル分析について説明する。

（標本から感度補正データβを求める手法）
測定の手順は、前述の基準標本８を用いた場合と同様であり同じ符号を使って説明する。

図１において、ステージ７に載置された標本８にレーザ光源１からの励起光がＸＹスキャナ６でスキャニングされて対物レンズ５を介して照射され、標本８から蛍光が発生する。標本８からの蛍光は、対物レンズ５で集光され光路を逆行してＸＹスキャナ６でデスキャニングされた後、ダイクロイックミラー４を透過してレンズ９で焦点位置ｆに集光される。集光された蛍光は、リレー光学系１０２を介してスペクトル検査装置１０３に入射される。

スペクトル検査装置１０３に入射された蛍光は、レンズ１０で略平行光にされスリット１１のスリット部１１ａで分光に適した幅のスリット光にされ分光素子１２に入射される。分光素子１２に入射された蛍光は分光素子１２でマルチチャンネル光検出器１３のチャンネル１３ｉ（ｉ＝１〜３２）方向に沿って分光されたスペクトルとなり、マルチチャンネル光検出器１３の各チャンネル１３ｉに入射される。入射されたスペクトルは、スペクトルの回折幅とマルチチャンネル光検出器１３のチャンネル１３ｉの配置間隔による波長分解能Δλで検出される。

マルチチャンネル光検出器に蛍光が入射した後、図３に示すフローチャートに従って蛍光のスペクトル分析が行われる。

蛍光をスペクトル検査装置１０３に入射する（Ｓ１）。ＣＰＵ１５からＩ／Ｏ１６を介してマルチチャンネル光検出器１３に所望の電圧を印加するように設定し（Ｓ２）、３２チャンネル全ての輝度データＩａｎ（ｎ＝１〜３２）を取得し、ＣＰＵ１５のメモリに記憶する（Ｓ３）。得られた輝度レベルが適当かどうかを判断し（Ｓ４）、輝度データＩａｎの中で信号が飽和している値があったり、最大輝度値が低すぎたりして輝度データとして不適当な場合、高圧電源１７を介して印加電圧を可変し（Ｓ５）、輝度データＩａｎの取得を繰り返す（Ｓ３〜Ｓ５）。各チャンネル１３ｉの輝度データＩａｎとスペクトルの波長位置との関係を模式的に図２（ａ）に示す。なお、輝度調整は高圧電源１７の印加電圧の代わりにレーザ光源１のパワーを調整しても良い。

次に、移動手段１４でマルチチャンネル光検出器１３を１チャンネル分シフト（例えば、同じ波長の光の入射するチャンネル番号が大きくなる方向にシフト）させる（Ｓ６）（図２（ｂ）参照）。この状態で再度３２チャンネル全ての輝度データＩｂｎを取得し、ＣＰＵ１５のメモリに記憶する（Ｓ７）。各チャンネル１３ｉの輝度データＩｂｎとスペクトルの波長位置との関係を模式的に図２（ｂ）に示す。輝度データＩｂｎの中で信号が飽和している値があったり、最大輝度値が低すぎたりしてデータとして不適当な場合（Ｓ８）、高圧電源１７を介して印加電圧を変更し（Ｓ９）、移動手段１４によりマルチチャンネル光検出器１３の位置を１チャンネル分戻し（Ｓ１０）、３２チャンネル全ての輝度データＩａｎ、Ｉｂｎを取得することから繰り返す（Ｓ３〜Ｓ１０）。所望の輝度データＩａｎとＩｂｎを取得した後、シャッタ２を閉じて（Ｓ１１）、マルチチャンネル光検出器１３に光が入射していない状態にして３２チャンネル全ての輝度データＩｏｎを取得しＣＰＵ１５のメモリに記憶する（Ｓ１２）。なお、輝度データＩｏｎが無視できるほど小さいときにはＩｏｎデータの取得作業を省略しても良い。

次に、輝度データＩａｎ、Ｉｂｎ、及びＩｏｎとから各チャンネル１３ｉにおける感度補正データβを以下の手順で算出する。

各チャンネル１３ｉに対して、１つ前のチャンネルに対する感度比[Ｇｎ／Ｇｎ−１]を次の式から求める（Ｓ１３）。
[Ｇｎ／Ｇｎ−１]＝（Ｉｂｎ−Ｉｏｎ）／（Ｉａ（ｎ−１）−Ｉｏ（ｎ−１））
これは、図２（ａ），（ｂ）に示すように、スペクトルの同じ波長域を輝度データＩａｎ取得時はチャンネル（ｎ−１）で、輝度データＩｂｎ取得時はチャンネル（ｎ）で検出しているので、両者の比がチャンネル（ｎ）とチャンネル（ｎ−１）との感度比[Ｇｎ／Ｇｎ−１]となることを示している。

各チャンネルに対してチャンネル１に対する感度補正データβである感度比[Ｇｎ／Ｇ１]を次の式から求めＣＰＵ１５のメモリに格納する（Ｓ１４）。
[Ｇｎ／Ｇ１]＝[Ｇ２／Ｇ１]×[Ｇ３／Ｇ２]×・・・×[Ｇｎ／Ｇｎ−１] （ｎ＞１）
チャンネル１を基準として感度補正した補正後の輝度データＩｎを次の式から求める（Ｓ１５）。
Ｉｎ＝[Ｇｎ／Ｇ１]×Ｉａｎ、 （但しｎ＝１の補正は不要）
感度補正後の輝度データＩｎは、チャンネル１を基準として規格化された輝度データを示している。この様にして、蛍光から得られた各チャンネルのチャンネル１に対する感度比［Ｇｎ／Ｇ１］（図４（ａ）に示す）と、図４（ｂ）に示す蛍光の輝度データＩａｎが得られ、リアルタイムで輝度データＩａｎが補正されて、図４（ｃ）に示す感度補正データβによる補正後の輝度データＩｎが得られる。続いて、ＣＰＵ１５のメモリから光学補正データγが読み出され、輝度データＩｎは光学補正データγによって補正され、適正な輝度データＩｎが求められる。

この輝度データＩｎは、フレームメモリ２２に記録され、Ｄ／Ａ変換器２３を解してモニタ２４に画像として表示される。なお、補正前の輝度データとしてＩｂｎを用いることも可能である。この様に種々のスペクトルに同様の規格化処理を施すことにより、得られた蛍光スペクトルの比較検討が可能となる。

この後、マルチチャンネル光検出器１３を１チャンネル分元に戻してスペクトル測定を終了する（Ｓ１６）。

なお、上述の補正ではチャンネル１を基準に補正をしたが、マルチチャンネル光検出器１３のシフト方向を逆にして最終チャンネル（３２チャンネル）を基準にしたり、途中の任意のチャンネルを基準にして補正することも可能である。

この様にして、マルチチャンネル光検出器１３に印加する高電圧を変えて入射する蛍光の強度に最適な感度に設定し、蛍光のスペクトルに対するマルチチャンネル光検出器１３の位置を変えてそれぞれ感度データＩａｎ，Ｉｂｎを取得し、両者の感度データＩａｎ，Ｉｂｎを用いて感度補正データβを求め、感度補正データβと光学補正データγとによる補正後のスペクトルデータＩｎを取得することができる。

上述の実施の形態の変形例としては、感度補正データβを求めた後に、光学補正データγを用いて全体の系の補正データαを算出することで、輝度データＩｎを補正データαを用いて求めることができる。

また、感度補正データβを求める際に、測定標本８を使わずに、単に透過照明光をスペクトル検出装置１０３へ導くことでも同様に求めることができる。

本実施の形態におけるスペクトルレーザ顕微鏡は、初期化段階で光学系と光検出器を含む装置全体の波長特性が補正され、蛍光を測定するためにマルチチャンネル光検出器の高電圧を変更した場合は、図４に示す感度補正ルーチンで感度補正後の輝度データを取得することができるため、標本からの蛍光を所定の精度でリアルタイムにスペクトル分析することが可能になる。

なお、スペクトルレーザ顕微鏡１００の光学系の波長依存性は、初期化段階で補正されており光学系の部材等の変更を行わなければ測定毎に初期化処理を行う必要は無い。

なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。

本発明の実施の形態にかかかるスペクトルレーザ顕微鏡の概略構成図を示す。 本発明の実施の形態にかかるスペクトルレーザ顕微鏡における輝度データＩａｎ、Ｉｂｎの取得状態を模式的に説明する図であり、（ａ）は輝度データＩａｎの、（ｂ）は輝度データＩｂｎの取得状態を示す。 本発明の実施の形態にかかるスペクトルレーザ顕微鏡における感度補正フローチャートを示す。 本発明の実施の形態にかかるスペクトルレーザ顕微鏡における感度補正の一例を示す。

符号の説明

１ レーザ光源
２ シャッタ
３ コリメートレンズ
４ ダイクロイックミラー
５ 集光レンズ
６ 二次元走査手段（ＸＹスキャナ）
７ ステージ
８ 標本（基準標本）
９ レンズ
１０ レンズ
１１ スリット
１２ 分光素子
１３ マルチチャンネル光検出器
１４ 移動手段
１５ ＣＰＵ
１６ Ｉ／Ｏ
１７ 高圧電源
１８ アナログ処理回路
１９ 同期信号発生回路
２０ Ａ／Ｄ変換器
２１ ＸＹスキャナ駆動回路
２２ フレームメモリ
２３ Ｄ／Ａ変換器
２４ モニタ
１００ スペクトルレーザ顕微鏡
１０１ レーザ顕微鏡
１０２ リレー光学系
１０３ スペクトル検査装置

Claims (7)

1. 顕微鏡からの光を測定する分光測定手段を有し、
   前記分光測定手段は、前記顕微鏡からの光をスペクトルに分光する分光手段と、複数の光検出器から成り前記スペクトルを一括して検出するマルチチャンネル光検出手段と、前記スペクトルと前記マルチチャンネル光検出手段の相対位置を前記スペクトルの波長分散方向に沿って変化させる移動手段と、前記複数の光検出器からのそれぞれの輝度データを処理する演算処理手段を有し、
   前記演算処理手段は、前記移動手段で前記スペクトルと前記マルチチャンネル光検出手段の相対位置を変更する前の第１の輝度データと変更後の第２の輝度データとから前記複数の光検出器それぞれの感度ばらつきを算出して、前記第１または前記第２の輝度データを補正することを特徴とする分光装置。
2. 前記移動手段は、前記マルチチャンネル検出手段に設けられていることを特徴とする請求項１に記載の分光装置。
3. 前記移動手段は、前記分光手段の光軸に対する傾き角度を変更することを特徴とする請求項１に記載の分光装置。
4. 前記第２の輝度データは、前記移動手段により前記スペクトルと前記マルチチャンネル光検出手段との相対位置を前記複数の光検出器中の１光検出器分移動して検出され、
   前記演算処理手段は、前記スペクトルの同じ波長域に対応する光検出器からの前記第１の輝度データと前記第２の輝度データより前記複数の光検出器中の基準光検出器に対する前記複数の光検出器それぞれの感度ばらつきを算出して、前記第１または前記第２の輝度データを補正することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の分光装置。
5. レーザ顕微鏡と、
   前記レーザ顕微鏡からの光を測定する分光測定装置とからなり、
   前記分光測定装置は、前記レーザ顕微鏡からの光をスペクトルに分光する分光手段と、複数の光検出器から成り前記スペクトルを一括して検出するマルチチャンネル光検出手段と、前記スペクトルと前記マルチチャンネル光検出手段の相対位置を前記スペクトルの波長分散方向に沿って変化させる移動手段と、前記複数の光検出器からのそれぞれの輝度データを処理する演算処理手段を有し、
   前記演算処理手段は、前記移動手段で前記スペクトルと前記マルチチャンネル光検出手段の相対位置を変更する前の第１の輝度データと変更後の第２の輝度データとから前記複数の光検出器それぞれの感度ばらつきを算出して、前記第１または前記第２の輝度データを補正することを特徴とするスペクトルレーザ顕微鏡。
6. 前記演算処理手段は、前記マルチチャンネル検出手段の感度ばらつきに起因する感度補正データによる補正に加えて、さらに、前記レーザ顕微鏡の光学系に起因する前記輝度データの光学補正データにより前記輝度データを補正することを特徴とする請求項５に記載のスペクトルレーザ顕微鏡。
7. 前記光学補正データは、固定値であり、
   前記感度補正データは、変数値であることを特徴とする請求項６に記載のスペクトルレーザ顕微鏡。

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