JP2010250102A - 顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】多チャネル光検出器により検出した輝度データを合算して表示する顕微鏡において、標本から発せられた蛍光を正確な強度で観察することのできる顕微鏡を提供する。
【解決手段】標本Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ１１４と、集光された蛍光をスペクトル成分に分光する分光素子１１８と、分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のチャネルを有する多チャネル光検出器１１９と、複数のチャネルにより検出されたスペクトル成分を合算して蛍光強度を算出するとともに、各チャネルにより検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えたか否かを判定するＣＰＵ１２２と、少なくとも１つのチャネルの輝度値が所定の閾値を超えたと判定された場合に、その判定結果を表示するディスプレイ３０２とを備える顕微鏡１を採用する。
【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡に関するものである。

従来、試料から発せられた蛍光をスペクトル成分へ波長別に分割し、多チャネル光検出器で検出を行う顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。
この顕微鏡では、検出器の数量が多いほど波長分解能が高くなり、例えば３２ｃｈの光検出器を用いた場合、可視領域をカバーするために、１ｃｈあたり１０ｎｍを受け持つことになる。

一方、色素の放射帯域は、数１００ｎｍの波長領域に渡っているため、使用色素の蛍光帯域に相応して各チャネルの合算が行われ、ＧＵＩ（Graphical User Interface）上において合算された画像が表示される。このような顕微鏡によれば、ダイクロイックフィルタなどを用いて分光検出する場合に比べて、観測する波長範囲の切り替えを高速に行うことができる。

特開２００６−１１９１５２号公報

ところで、合算しているチャネルのうち、あるチャネルの出力が飽和していても、合算した結果は飽和していない場合がある。この場合、特許文献１に開示されている顕微鏡では、合算した結果のみを表示しているため、ユーザは、チャネルの出力が飽和したことを知ることができない。そのため、光検出器の感度を上げすぎてしまい、結果として、不正確な輝度データの画像が表示されてしまうという問題がある。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、多チャネル光検出器により検出した輝度データを合算して表示する顕微鏡において、標本から発せられた蛍光を正確な強度で観察することのできる顕微鏡を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光をスペクトル成分に分光する分光素子と、該分光素子により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のチャネルを有する光検出器と、該光検出器の複数のチャネルにより検出されたスペクトル成分を合算して蛍光強度を算出する蛍光強度算出部と、前記光検出器の各チャネルにより検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えたか否かを判定する判定部と、該判定部により少なくとも１つのチャネルの輝度値が所定の閾値を超えたと判定された場合に、その判定結果を報知する報知手段とを備える顕微鏡を採用する。

本発明によれば、標本において発生して対物レンズにより集光された蛍光が、分光素子によりスペクトル成分に分光される。分光されたスペクトル成分は、複数のチャネルを有する光検出器によりそれぞれ検出され、蛍光強度算出部により合算されて、その蛍光強度が算出される。この場合において、判定部により、光検出器の各チャネルにより検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えたか否かが判定され、少なくとも１つのチャネルの輝度値が所定の閾値を超えたと判定された場合に、その判定結果が報知手段により報知される。

これにより、ユーザは、少なくとも１つのチャネルの輝度値が飽和したことを知ることができる。したがって、光検出器の感度を調整することによって、全てのチャネルにおけるスペクトル成分を飽和させずに正確に検出することができ、標本から発せられた蛍光の正確な強度による観察を行うことができる。

上記発明において、前記光検出器の感度を調整する感度調整手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、全てのチャネルにおけるスペクトル成分が飽和しないように、感度調整手段により光検出器の感度を調整することができ、標本から発せられた蛍光の正確な強度による観察を行うことができる。

上記発明において、前記蛍光強度算出部により算出された蛍光強度に基づいて画像を生成する画像生成部と、該画像生成部により生成された画像を表示する表示部とを備え、前記報知手段が、前記表示部に表示された画面において、前記光検出器により検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えた領域を視認可能に表示することとしてもよい。

このようにすることで、蛍光強度算出部により算出された蛍光強度に基づいて、画像生成部により生成された画像が、表示部に表示される。この際に、報知手段により、表示部に表示された画面において、輝度値が所定の閾値を超えた領域が視認可能に表示される。これにより、画面上においてどの領域の輝度値が所定の閾値を超えているかを知ることができ、ユーザが注目する領域について、輝度値が飽和しているか否かを知ることができる。

上記発明において、前記蛍光強度算出部により算出された蛍光強度に基づいて画像を生成する画像生成部と、該画像生成部により生成された画像を表示する表示部とを備え、前記報知手段が、前記表示部に表示された画面において、前記光検出器により検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えた領域の周辺領域を視認可能に表示することとしてもよい。

報知手段により、輝度値が所定の閾値を超えた領域の周辺領域を視認可能に表示することで、前記領域が画面上において微小な場合にも、該領域を目立つようにでき、その視認性を向上することができる。

上記発明において、前記蛍光強度算出部の合算対象とするチャネルを選択可能であることとしてもよい。
このようにすることで、蛍光強度算出部により合算するスペクトル範囲を選択することができる。

本発明によれば、多チャネル光検出器により検出した輝度データを合算して表示する顕微鏡において、標本から発せられた蛍光を正確な強度で観察することのできるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡の概略構成図である。 図１のＣＰＵの機能ブロック図である。 図１の顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。 図１の顕微鏡の効果を説明する図である。 図１の変形例に係る顕微鏡の効果を説明する図である。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡について、図面を参照して説明する。
図１は、本実施形態の顕微鏡１の構成図である。図１に示すように、本実施形態の顕微鏡１は、レーザ光を標本Ａに照射して標本Ａにおいて発生した蛍光を検出するレーザ走査型顕微鏡であり、顕微鏡本体１００と、レーザ光を出射する光源２００と、パーソナルコンピュータ（以降では「ＰＣ」と表記する。）３００と、コントローラ４００とを主な構成要素として備えている。

光源２００は、コントローラ４００により制御され、レーザ光を射出するようになっている。このレーザ光は、標本Ａ内の蛍光指示薬を励起させ、蛍光を発生させるようになっている。

顕微鏡本体１００は、光源２００からのレーザ光を標本Ａに照射する照射光学系１０と、照射系１０によりレーザ光を照射することで標本Ａにおいて発生した蛍光を検出する検出光学系２０とを備えている。

照射光学系１０は、ダイクロイックミラー１１１、ミラー１１２、走査光学ユニット１１３、対物レンズ１１４、およびステージ１１５から構成されている。
検出光学系２０は、共焦点ピンホール１１６、ミラー１１７、分光素子１１８、多チャネル光検出器（光検出器）１１９、増幅器１２０、Ａ／Ｄ変換器１２１、およびＣＰＵ（蛍光強度算出部、判定部）１２２から構成されている。

ダイクロイックミラー１１１は、光源２００からのレーザ光を反射する一方、標本Ａにおいて発生して対物レンズ１１４により集光された蛍光を透過するようになっている。このような構成を有することで、ダイクロイックミラー１１１は、レーザ光の光路と標本Ａからの蛍光の光路とを分岐するようになっている。

走査光学ユニット１１３は、例えばアルミコートされた一対のガルバノミラー１１３ａ，１１３ｂを有しており、これら一対のガルバノミラー１１３ａ，１１３ｂの角度を変化させ、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。これにより、光源２００からのレーザ光を標本Ａ上において二次元的に走査させるようになっている。

対物レンズ１１４は、走査光学ユニット１１３により走査されたレーザ光を標本Ａ上に照射する一方、標本Ａから発生した蛍光を集光するようになっている。

共焦点ピンホール１１６は、標本Ａ上におけるレーザ光の焦点位置から発生した蛍光のみを通過させるようになっている。すなわち、対物レンズ１１４により集光されてダイクロイックミラー１１１を透過した蛍光は、共焦点ピンホール１１６を通過することによりレーザ光の焦点位置（測定点）から光軸方向にずれた位置からの光がカットされる。これにより、光軸方向に焦点位置と同一な面からの蛍光だけがミラー１１７に入射する。

分光素子１１８は、例えばプリズムや回折格子であり、標本Ａにおいて発生し、ミラー１１７により反射された蛍光を波長毎のスペクトル成分に分光し、分光したスペクトル成分を多チャネル光検出器１１９に入射させるようになっている。

多チャネル光検出器１１９は、分光素子１１８により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のチャネルを有しており、検出したスペクトル成分の輝度を電気信号へ変換する素子である。この場合は、波長毎に分割されたスペクトル成分が入射されるため、各チャネルにはそれぞれ異なる波長の光が入射される。この多チャネル光検出器１１９の具体例として、例えば浜松ホトニクス（株）製のＨ７２６０（３２チャネルフォトマルチプライヤ）を用いることができる。なお、多チャネル検出器１１９は、外部から感度調整を行うことができるが、感度は全チャネル一括でしか調整できないものである。

多チャネル光検出器１１９の後段には、電気信号を増幅する増幅器（ＡＭＰ）１２０がチャネル毎に設けられている。増幅器１２０は、多チャネル光検出器１１９により変換された微弱信号を増幅することができる。また、増幅器１２０の後段には、Ａ／Ｄ変換器１２１がチャネル毎に設けられている。Ａ／Ｄ変換器１２１は、増幅器１２０により増幅された電気信号をデジタル信号に変換するものである。

Ａ／Ｄ変換器１２１の後段には、ＣＰＵ１２２が接続されている。ＣＰＵ１２２は、多チャネル光検出器１１９の複数のチャネルにより検出され、デジタル信号化されて送られてきた輝度信号を合算して蛍光強度を算出するようになっている。また、ＣＰＵ１２２は、送られてきた輝度信号と閾値との比較判定を行う機能を有しており、多チャネル光検出器１１９の各チャネルにより検出されたスペクトル成分の輝度値が予め設定された所定の閾値を超えたか否かを判定するようになっている。

ＣＰＵ１２２には、ＰＣ３００の内部にあるＰＣ本体（画像生成部）３０１が接続されている。このＰＣ本体３０１には、ディスプレイ（表示部）３０２および入力装置（感度調整手段）３０３が接続されている。

入力装置３０３は、ユーザにより感度調整、色素選択、閾値設定についての入力が行われるようになっており、その入力結果をＰＣ本体３０１に送信するようになっている。
入力装置３０３によりユーザが感度調整を行うと、ＰＣ本体３０１、ＣＰＵ１２２を介して多チャネル光検出器１１９の感度が調整されるようになっている。

また、入力装置３０３によりユーザが色素選択についての入力を行うと、図２に示すように、その設定がＰＣ本体３０１を介してＣＰＵ１２２に送られ、ＣＰＵ１２２内では選択した色素に対応する合算チャネルを決定し、決定したチャネルにより検出されたスペクトル成分の合算処理が行われるようになっている（色素選択処理）。

また、入力装置３０３によりユーザが閾値設定についての入力を行うと、図２に示すように、その設定がＰＣ本体３０１を介してＣＰＵ１２２に送られ、ＣＰＵ１２２内では設定した閾値と合算対象であるチャネルそれぞれとの比較が行われるようになっている（飽和検出処理）。

ＰＣ本体３０１は、ＣＰＵ１２２により算出された蛍光強度に基づいてスキャン画像を生成するようになっている。
ディスプレイ３０２は、ＰＣ本体３０１に接続されており、ＰＣ本体３０１により生成されたスキャン画像の表示が行われるようになっている。

また、ＰＣ本体３０１は、ディスプレイ３０２に表示された画面において、多チャネル光検出器１１９により検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えた領域（飽和部分）を視認可能に表示するようになっている。具体的には、例えば図４に示すように、所定の閾値を超えた領域を、周辺領域に対する補色で着色して表示するようになっている。

コントローラ４００は、走査ミラー１１３、ＣＰＵ１２２、および光源２００を制御して、これら装置間の同期をとるようになっている。

上記構成を有する顕微鏡１の作用について以下に説明する。
光源２００から出射されたレーザ光は、顕微鏡装置本体１００内にあるダイクロイックミラー１１１およびミラー１１２によりそれぞれ反射され、走査光学ユニット１１３に入射し、走査光学ユニット１１３の動作によって偏向され、標本Ａ上において二次元的に走査される。

走査されたレーザ光は、対物レンズ１１４に入射し、ステージ１１５上に置かれた標本Ａ上に集光されて照射される。標本Ａの焦点面においては、レーザ光により標本Ａ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。

標本Ａから発せられた蛍光は、対物レンズ１１４により集光され、走査光学ユニット１１３及びミラー１１２を通過して、ダイクロイックミラー１１１に入射する。ダイクロイックミラー１１１に入射した蛍光は、ダイクロイックミラー１１１を透過し、共焦点ピンホール１１６へ導光される。

共焦点ピンホール１１６では、標本Ａの焦点面において発生した蛍光のみを通過させ、レーザ光の焦点位置（測定点）に対して光軸方向にずれた位置からの光がカットされる。これにより、光軸方向に測定点と同一な面からの蛍光だけがミラー１１７に入射される。

ミラー１１７で反射された蛍光は、分光素子１１８に入射し、波長毎のスペクトル成分に分解される。分解されたスペクトル成分は、多チャネル光検出器１１９の各チャネルに入射し、各チャネルによりそれぞれの波長成分についての輝度に応じた電気信号に変換される。

これらの電気信号は、増幅器１２０によりそれぞれ増幅され、Ａ／Ｄ変換器１２１によりアナログ信号からデジタル信号に変換される。デジタル信号となった電気信号はＣＰＵ１２２に送られる。ここで、階調の不足によりＡ／Ｄ変換器の出力が飽和する場合がある。この場合、以下のように飽和判定とその表示が行われる。

この飽和判定について、図３に示すフローチャートを用いて以下に説明する。
図３において、ステップＳ１では、ユーザが入力装置３０３を操作することによって、色素の選択と閾値の設定が行われる。ここで、ユーザは、観察対象に応じて使用している色素を選択することができる。また、設定する閾値は飽和値と同じ値でもよいし、ほぼ飽和する値（例えば飽和値の９０％）でもよい。

上記の設定は、ＰＣ本体３０１を介してＣＰＵ１２２へ送られる。ステップＳ２以降は、ＣＰＵ１２２内での処理である。
ステップＳ２では、ＣＰＵ１２２は色素情報を受け取り、データテーブルを呼び出して合算すべきチャネルが決定される。ステップＳ３では、ＣＰＵ１２２により、合算の対象となるチャネル一つ一つに対して、閾値との比較が行われる。

ステップＳ４では、合算の対象となるチャネルのうち、１つでも閾値を超えたチャネルがあったか否かが判定される。判定の結果、合算の対象となるチャネルのうち、いずれのチャネルも飽和していない場合には、後述するステップＳ５およびステップＳ６の処理が実行され、１つでも閾値を超えるチャネルがあった場合には、後述するステップＳ７およびステップＳ８の処理が実行される。

いずれのチャネルも飽和していない場合には、ステップＳ５において、合算の対象となるチャネルについての合算が行われる。そして、ステップＳ６において、二次元画像の１画素のデータとして合算した値がＰＣ本体３０１へ出力される。

一方、一つでも閾値を超えるチャネルがあった場合には、ステップＳ７において、飽和を示すためのデータが生成される。そして、ステップＳ８において、二次元画像の１画素データとしてＰＣ本体３０１へ出力される。

上記のステップＳ３〜Ｓ６またはステップＳ３〜Ｓ８までの処理が、二次元画像を得るために、画素数分繰り返される（ステップＳ９）。これにより、ＰＣ本体３０１ではＣＰＵ１２２から受け取ったデータに基づいてスキャン画像が生成され、ディスプレイ３０２にそのスキャン画像が表示される。この際、いずれのチャネルも閾値を超えていなければそのまま表示し、１つでも閾値を超えるチャネルがあった場合には、図４に示すように、飽和している画素については色を変えて表示される。

以上のように、本実施形態に係る顕微鏡１によれば、標本Ａにおいて発生した蛍光が、分光素子１１８によりスペクトル成分に分光され、多チャネル光検出器１１９によりスペクトル成分毎に検出され、ＣＰＵ１２２により合算されてその蛍光強度が算出される。この場合において、ＣＰＵ１２２により、多チャネル光検出器１１９の各チャネルにより検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えたか否かが判定され、少なくとも１つのチャネルの輝度値が所定の閾値を超えたと判定された場合に、その判定結果がユーザに報知される。

これにより、ユーザは、少なくとも１つのチャネルの輝度値が飽和したことを知ることができる。したがって、入力装置３０３により多チャネル光検出器１１９の感度を調整することによって、全てのチャネルにおけるスペクトル成分を飽和させずに正確に検出することができ、標本Ａから発せられた蛍光の正確な強度による観察を行うことができる。

また、本実施形態に係る顕微鏡１によれば、ＣＰＵ１２２により算出された蛍光強度に基づいて、ＰＣ本体３０１により生成されたスキャン画像が、ディスプレイ３０２に表示される。この際に、図４に示すように、ディスプレイ３０２に表示されたスキャン画像において、輝度値が所定の閾値を超えた領域（飽和部分）が視認可能に表示される。これにより、ユーザは、スキャン画像上において標本Ａのどの領域で輝度値が飽和しているか分かるため、自分が注目している領域に関して飽和しているか知ることができる。なお、この表示を行うか否かは、ＧＵＩ等によりユーザが選択することが可能としてもよい。

つまり、もし注目していない領域において飽和していれば、見たいところに感度を合わせて観察を行い、後に注目領域だけ切り出せばよい。例えば、図４において、領域ＲＯＩ２の中では飽和している部分があるが、領域ＲＯＩ１に注目しているのであれば、そのまま領域ＲＯＩ１に感度を合わせて観察を続行すればよい。

なお、本実施形態に係る顕微鏡１の変形例として、図５に示すように、ディスプレイ３０２に表示されたスキャン画面において、多チャネル光検出器１１９により検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えた領域（飽和部分）の周辺領域を視認可能に表示することとしてもよい。
このようにすることで、飽和部分がスキャン画像において微小な場合にも、該飽和部分を目立つようにでき、その視認性を向上することができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、本実施形態において、スペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えたことをディスプレイ３０２に表示することでユーザに報知することとして説明したが、これに代えて、例えばアラーム等によってユーザに報知することとしてもよい。

また、ディスプレイ３０２において飽和部分を表示する方法として、周辺領域に対する補色で飽和部分を着色することとして説明したが、飽和部分を視認可能に表示することができればよく、例えば、飽和部分を点滅あるいは拡大することとしてもよい。

また、図３で説明した処理方法は一例であり、異なる構成で処理を行ってもよい。例えば、ステップＳ７においては、ステップＳ５と同様に合算処理を行うこととしてもよい。その場合、次のステップＳ８において、飽和を示すためのデータを生成し、合算した結果と置き換える処理が行われる。

Ａ 標本
１ 顕微鏡
１０ 照射光学系
２０ 検出光学系
１００ 顕微鏡本体
１１１ ダイクロイックミラー
１１２ ミラー
１１３ 走査光学ユニット
１１４ 対物レンズ
１１５ ステージ
１１６ 共焦点ピンホール
１１７ ミラー
１１８ 分光素子
１１９ 多チャネル光検出器
１２０ 増幅器
１２１ Ａ／Ｄ変換器
１２２ ＣＰＵ
２００ 光源
３００ パーソナルコンピュータ（ＰＣ）
４００ コントローラ

Claims (5)

1. 標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
   該対物レンズにより集光された蛍光をスペクトル成分に分光する分光素子と、
   該分光素子により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のチャネルを有する光検出器と、
   該光検出器の複数のチャネルにより検出されたスペクトル成分を合算して蛍光強度を算出する蛍光強度算出部と、
   前記光検出器の各チャネルにより検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えたか否かを判定する判定部と、
   該判定部により少なくとも１つのチャネルの輝度値が所定の閾値を超えたと判定された場合に、その判定結果を報知する報知手段とを備える顕微鏡。
2. 前記光検出器の感度を調整する感度調整手段を備える請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記蛍光強度算出部により算出された蛍光強度に基づいて画像を生成する画像生成部と、
   該画像生成部により生成された画像を表示する表示部とを備え、
   前記報知手段が、前記表示部に表示された画面において、前記光検出器により検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えた領域を視認可能に表示する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
4. 前記蛍光強度算出部により算出された蛍光強度に基づいて画像を生成する画像生成部と、
   該画像生成部により生成された画像を表示する表示部とを備え、
   前記報知手段が、前記表示部に表示された画面において、前記光検出器により検出されたスペクトル成分の輝度値が所定の閾値を超えた領域の周辺領域を視認可能に表示する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
5. 前記蛍光強度算出部の合算対象とするチャネルを選択可能である請求項３または請求項４に記載の顕微鏡。
   

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