JP2013242260A - 蛍光検出装置および蛍光検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】波長ごとの正しい蛍光量を検出する。
【解決手段】標本において発生した蛍光を集光する対物レンズ１と、対物レンズ１により集光された蛍光をスペクトル成分に分光する回折格子９と、回折格子９により分光された蛍光の所望の波長域のスペクトル成分をそれぞれ検出する多チャンネルＰＭＴ１３と、多チャンネルＰＭＴ１３により検出されるスペクトル成分に所望の波長域以外の波長域由来の高次回折光が混入することを阻止するバンドパスフィルタ７とを備える蛍光検出装置１０を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光検出装置および蛍光検出方法に関するものである。

従来、試料から発せられた蛍光を分光素子により波長別にスペクトル成分に分光し、そのスペクトル成分を多チャンネル光検出器により検出する顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。

特開２０１０−２５０１０２号公報

しかしながら、特許文献１に記載の顕微鏡のように、分光素子により蛍光をスペクトル成分に分光すると、ある波長の２次回折光とその波長の２倍の波長の１次回折光とが多チャンネル光検出器における同一箇所にスポットを結ぶことがある。そのため、分光されたスペクトル成分を検出しようとすると、分光されたときに発生する２次回折光の影響により、波長ごとに正しい蛍光量を検出することができないという不都合がある。

本発明は、波長ごとの正しい蛍光量を検出することができる蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された前記蛍光をスペクトル成分に分光する分光素子と、該分光素子により分光された前記蛍光の所望の波長域のスペクトル成分をそれぞれ検出する光検出器と、該光検出器により検出される前記スペクトル成分に前記所望の波長域以外の波長域由来の高次回折光が混入することを阻止する波長遮断部とを備える蛍光検出装置を提供する。

本発明によれば、標本において発生し対物レンズにより集光されて分光素子により分光された蛍光の所望の波長域のスペクトル成分が光検出器により検出される。この場合において、波長遮断部により、光検出器によって検出されるスペクトル成分に、所望の波長域以外の波長域由来の高次回折光が混入することを阻止することで、所望の波長域に含まれるスペクトル成分ではないにもかかわらず、高次回折光によりあたかも所望の波長域に含まれるスペクトル成分であるかのように光検出器によって検出されてしまう誤検出を防ぐことができる。これにより、標本から発せられる蛍光における波長ごとの正しい蛍光量を検出することができる。

上記発明においては、前記波長遮断部が、前記所望の波長域の最大波長の半分以下の波長域の蛍光を遮断することとしてもよい。
このように構成することで、検出しようとする所望の波長域のスペクトル成分に含まれる高次回折光を精度よく取り除くことができる。

また、上記発明においては、前記光検出器が、前記分光素子による前記スペクトル成分の分光方向に沿って配列された複数の光検出部を有することとしてもよい。
このように構成することで、分光素子により分光されたスペクトル成分を無駄なく複数の光検出部に入射させ、これらの光検出部により所望のスペクトル成分を選択的に１度に検出することができる。これにより、迅速かつ効率的に分光検出を行うことができる。

また、上記発明においては、前記分光素子により分光された前記スペクトル成分の所定の波長域のみを通過させるスリットを備え、前記光検出器が、前記スリットを通過した前記所定の波長域のスペクトル成分を検出可能な単一の光検出部からなることとしてもよい。
このように構成することで、光検出器を小型化することができる。

また、上記発明においては、遮断可能な蛍光の波長域が異なる複数の前記波長遮断部と、これらの複数の波長遮断部を光路上に選択的に挿脱可能な挿脱切替部とを備えることとしてもよい。
このように構成することで、挿脱切替部により光路上に挿入する波長遮断部を切替えるだけで、光検出器により検出するスペクトル成分を簡易に切替えることができる。

また、上記発明においては、前記波長遮断部が、前記所望の波長域の蛍光から該所望の波長域以外の波長域の蛍光を分離し、該波長遮断部により分離された蛍光を検出する他の光検出器を備えることとしてもよい。
このように構成することで、一方の光検出器により検出する波長域のスペクトル成分以外の蛍光を、無駄にすることなく他の光検出器により検出して有効に活用することができる。

また、上記発明においては、前記波長遮断部が、一方の前記光検出器により検出する蛍光を透過して前記他の光検出器により検出する蛍光を反射し、または、前記一方の光検出器により検出する蛍光を反射して前記他の光検出器により検出する蛍光を透過することとしてもよい。
このように構成することで、一方の光検出器によるスペクトル成分の検出と、他の光検出器による蛍光の検出とを同時に行うことができる。

また、上記発明においては、前記他の光検出器が、前記蛍光を検出可能な単一の他の光検出部からなることとしてもよい。
このように構成することで、他の光検出器を小型化することができる。

また、上記発明においては、前記波長遮断部により分離された蛍光をスペクトル成分に分光する他の分光素子を備え、前記他の光検出器が、前記他の分光素子により分光された蛍光のスペクトル成分をそれぞれ検出する複数の他の光検出部を有し、該複数の他の光検出部が、前記他の分光素子による前記スペクトル成分の分光方向に沿って配列されていることとしてもよい。

このように構成することで、他の分光素子により分光されたスペクトル成分を無駄なく複数の他の検出部に入射させ、これらの他の検出部により、所望のスペクトル成分を選択的に１度に検出することができる。これにより、一方の光検出器により検出する波長域のスペクトル成分以外の蛍光を、他の光検出器により迅速かつ効率的に分光検出することができる。

本発明は、標本において発生した蛍光を対物レンズにより集光する集光ステップと、該集光ステップにより集光された前記蛍光をスペクトル成分に分光する分光ステップと、該分光ステップにより分光された前記蛍光の所望の波長域のスペクトル成分をそれぞれ検出する検出ステップと、前記所望の波長域以外の波長域の蛍光を遮断し、前記検出ステップにより検出される前記スペクトル成分に前記所望の波長域以外の波長域由来の高次回折光が混入することを阻止する波長遮断ステップとを含む蛍光検出方法を提供する。

本発明によれば、標本において発生し、集光ステップにより対物レンズによって集光されて分光ステップにより分光された蛍光の所望の波長域のスペクトル成分が、検出ステップにより検出される。この場合において、波長遮断ステップにより、所望の波長域以外の波長域の蛍光が遮断されて、分光ステップによって分光される蛍光の所望の波長域のスペクトル成分にその所望の波長域以外の波長域由来の高次回折光が混入するのが阻止される。

したがって、所望の波長域に含まれるスペクトル成分ではないにもかかわらず、高次回折光によりあたかも所望の波長域に含まれるスペクトル成分であるかのように検出ステップよって検出されてしまう誤検出を防ぐことができる。これにより、標本から発せられる蛍光における波長ごとの正しい蛍光量を検出することができる。

本発明によれば、波長ごとの正しい蛍光量を検出することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る蛍光検出装置を示す概略構成図である。 図１のバンドパスフィルタの透過特性を示す図である。 図１のバンドパスフィルタにより所望の波長域以外の蛍光を遮断する様子を示す図である。 本発明の一実施形態の第２変形例に係る蛍光検出装置を示す概略構成図である。 本発明の一実施形態の第３変形例に係る蛍光検出装置を示す概略構成図である。 本発明の一実施形態の第４変形例に係る蛍光検出装置を示す概略構成図である。

本発明の一実施形態に係る蛍光検出装置および蛍光検出方法について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光検出装置１０は、図１に示されるように、標本（図示略）において発生した蛍光を集光する対物レンズ１と、対物レンズ１により集光された蛍光の一部を通過させる共焦点ピンホール３と、共焦点ピンホール３を通過した蛍光を平行光に変換するコリメートレンズ５と、平行光に変換された蛍光の内、所望の波長域の蛍光を透過しそれ以外の波長域の蛍光を遮断するバンドパスフィルタ（波長遮断部）７と、バンドパスフィルタ７を通過した蛍光をスペクトル成分に分光する回折格子（分光素子）９と、分光された蛍光を集光する結像レンズ１１と、結像レンズ１１により集光された蛍光のスペクトル成分をそれぞれ検出する多チャンネルＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ、光電子増倍管、光検出器）１３とを備えている。

対物レンズ１は、図示しない光源から発せられた励起光を標本に照射することができるようになっている。
共焦点ピンホール３は、対物レンズ１の焦点位置と共役な位置に配置されており、標本における対物レンズ１の焦点位置において発生した蛍光のみを通過させるようになっている。共焦点ピンホール３の配置位置は、コリメートレンズ５の焦点位置でもある。

バンドパスフィルタ７は、コリメートレンズ５により平行光に変換された蛍光から、所望の波長域以外の波長域の蛍光を遮断することにより、所望の波長域に、所望の波長域以外の波長域の蛍光由来の２次回折光、３次回折光等の高次回折光が混入するのを阻止するようになっている。本実施形態においては、バンドパスフィルタ７は、所望の波長域の最大波長の半分の波長以下の波長域の蛍光を遮断するようになっている。

回折格子９は、バンドパスフィルタ７を通過した蛍光のスペクトル成分を一方向に分光するようになっている。
結像レンズ１１は、回折格子９により分光された蛍光をスペクトル成分ごとに多チャンネルＰＭＴ１３の受光面上に集光させるようになっている。

多チャンネルＰＭＴ１３は、回折格子９による蛍光のスペクトル成分の分光方向に沿って１次元的に配列された複数（例えば、３２個）のセル（検出部）１４を備えている。各セル１４は、結像レンズ１１により、それぞれの受光面上にスポットが形成された蛍光のスペクトル成分を検出するようになっている。

このように構成された蛍光検出装置１０の作用について説明する。
本実施形態に係る蛍光検出装置１０により蛍光を検出するには、まず、多チャンネルＰＭＴ１３により検出する蛍光の波長域に対応する透過特性を有するバンドパスフィルタ７を設定する。

例えば、検出する蛍光の波長域を４００〜７９９ｎｍとした場合は、図２に示すように、最大波長の１／２以下、すなわち、３９９ｎｍ以下の波長域の蛍光と８００ｎｍ以上の波長域の蛍光をそれぞれカットする特性を有するバンドパスフィルタ７を採用する。このようにすることで、回折格子９に入射させる蛍光から、４００〜７９９ｎｍの波長域に、４００〜７９９ｎｍの波長域以外の波長域の蛍光由来の高次回折光が混入するのを回避することができる。図２において、縦軸は透過率（％）を示し、横軸は波長（ｎｍ）を示している。

次いで、図示しない光源から励起光を発生させ、その蛍光を対物レンズ１により標本に照射して蛍光を発生させる。標本において発生した蛍光は、対物レンズ１により集光され（集光ステップ）、その内の対物レンズ１の焦点位置において発生した蛍光のみが共焦点ピンホール３を通過してバンドパスフィルタ７に入射される。バンドパスフィルタ７においては、その波長特性により、図３に示すように、３９９．５ｎｍ以下の波長域の蛍光と８００ｎｍ以上の波長域の蛍光がカットされ、４００〜７９９ｎｍの波長域の蛍光が通過させられる（波長遮断ステップ）。

バンドパスフィルタ７を通過した波長域が４００〜７９９ｎｍの蛍光は、回折格子９によりスペクトル成分に分光され（分光ステップ）、結像レンズ１１により集光されて多チャンネルＰＭＴ１３の各セル１４の受光面上にそれぞれ集光させられる。これにより、セル１４ごとにそれぞれスペクトル成分が検出される（検出ステップ）。

この場合において、回折格子９により蛍光をスペクトル成分に分光すると、ある波長の２次回折光とその波長の２倍の波長の１次回折光とが多チャンネルＰＭＴ１３のセル１４における同一箇所にスポットを結ぶことがある。そうすると、２次回折光の影響により、波長ごとに正しい蛍光量を検出することができなくなる。同様に、３次回折光、４次回折光等も蛍光量の検出に影響することがある。

本実施形態に係る蛍光検出装置１０および蛍光検出方法においては、バンドパスフィルタ７により、回折格子９により分光される蛍光から所望の波長域以外の波長域の蛍光を遮断し、検出する蛍光のスペクトル成分に所望の波長域以外の波長域由来の高次回折光が混入するのを阻止することで、所望の波長域に含まれるスペクトル成分ではないにもかかわらず、高次回折光によりあたかも所望の波長域に含まれるスペクトル成分であるかのように各セル１４によって検出されてしまう誤検出を防ぐことができる。したがって、標本から発せられる蛍光における波長ごとの正しい蛍光量を検出することができる。

また、多チャンネルＰＭＴ１３により、回折格子９によって分光されたスペクトル成分を無駄なく複数のセル１４に入射させ、これらのセル１４により所望のスペクトル成分を選択的に１度に検出することができる。これにより、迅速かつ効率的に分光検出を行うことができる。

本実施形態においては、バンドパスフィルタ７により所望の波長域以上の波長域（８００ｎｍ以上の波長域）の蛍光もカットすることとしたが、所望の波長域の最大波長の半分以下の波長域の蛍光を遮断すればよく、所望の波長域の長波長側の領域の蛍光についてはカットしないこととしてもよい。

本実施形態は、以下のように変形することができる。
本実施形態においては、光検出器として多チャンネルＰＭＴ１３を例示して説明したが、第１変形例としては、光検出器として、単一のセル（光検出部、図示略）からなる単チャンネルＰＭＴ（図示略）を採用することとしてもよい。

この場合、回折格子９と単チャンネルＰＭＴとの間の光路上に、回折格子９により分光されたスペクトル成分の所定の波長域のみを通過させるスリット（図示略）を配置し、スリットを通過した所定の波長域のスペクトル成分を単チャンネルＰＭＴにより検出することとすればよい。

このように構成することで、複数のセル１４を有する多チャンネルＰＭＴ１３と比較して、光検出器を小型化することができる。
スリットは、例えば、蛍光の光束を制限する絞りの大きさが機械的に変更可能であることが好ましい。

第２変形例としては、例えば、図４に示すように、バンドパスフィルタ７に代えて、遮断可能な蛍光の波長域が互いに異なる複数のバリアフィルタ（波長遮断部）２７Ａ，２７Ｂと、これらの複数のバリアフィルタ２７Ａ，２７Ｂを光路上に選択的に挿脱可能なフィルタホイール（挿脱切替部）２８とを備えることとしてもよい。図４においては、２つのバリアフィルタ２７Ａ，２７Ｂが示されている。

この場合、フィルタホイール２８は、コリメートレンズ５と回折格子９との間に配置され、コリメートレンズ５の光軸に平行な回転軸回りに回転可能に設けられていることとすればよい。また、フィルタホイール２８には、回転軸周りに周方向に間隔をあけて複数のバリアフィルタ２７Ａ，２７Ｂが配置され、フィルタホイール２８を回転軸回りに回転させることにより、バリアフィルタ２７Ａ，２７Ｂのいずれかを蛍光の光路上に配置することができるようにすればよい。

このようにすることで、フィルタホイール２８により光路上に挿入するバリアフィルタ２７Ａ，２７Ｂを切替えるだけで、多チャンネルＰＭＴ１３により検出する所望の波長域のスペクトル成分を簡易に切替えることができる。

本変形例においては、第１変形例と同様に、多チャンネルＰＭＴ１３に代えて単チャンネルＰＭＴ（光検出器、図示略）を採用し、さらに、回折格子９と単チャンネルＰＭＴとの間の光路上に、蛍光の光束を制限する絞りの大きさを機械的に変更可能なスリットを設けることとしてもよい。

また、本変形例においては、フィルタホイール２８がコリメートレンズ５の光軸に平行な回転軸回りに回転可能に設けられていることとしたが、フィルタホイール２８の回転軸はコリメートレンズ５の光軸に平行でなくてもよい。

第３変形例としては、図５に示すように、バンドパスフィルタ７に代えて、所定の波長域の蛍光を透過してそれ以外の波長域の蛍光を反射するダイクロイックミラー（波長遮断部）３７を採用することとしてもよい。また、蛍光検出装置１０が、さらに、ダイクロイックミラー３７により反射された蛍光を検出する単チャンネルＰＭＴ（他の光検出器）３５を備えることとしてもよい。

この場合、ダイクロイックミラー３７により、コリメートレンズ５によって平行光に変換された蛍光の内、例えば、４００〜７９９ｎｍの所望の波長域の蛍光を回折格子９に向けて透過させ、３９９．５ｎｍ以下の波長域の蛍光と８００ｎｍ以上の波長域の蛍光を単チャンネルＰＭＴ３５に向けて反射することとすればよい。これにより、ダイクロイックミラー３７によって、所望の波長域以外の波長域の蛍光を分離させて、検出する蛍光のスペクトル成分に所望の波長域以外の波長域由来の高次回折光が混入するのを阻止することができる。

このようにすることで、多チャンネルＰＭＴ１３によって検出する波長域のスペクトル成分以外の蛍光を、無駄にすることなく単チャンネルＰＭＴ３５により検出して有効に活用することができる。また、ダイクロイックミラー３７の透過または反射により所望の波長域の蛍光と所望の波長域以外の波長域の蛍光とを分離させることで、多チャンネルＰＭＴ１３によるスペクトル成分の検出と、単チャンネルＰＭＴ３５による蛍光の検出とを同時に行うことができる。

本変形例においては、ダイクロイックミラー３７において、所望の波長域の蛍光を透過させて、それ以外の波長域の蛍光を反射させることとしたが、回折格子９、結像レンズ１１および多チャンネルＰＭＴ１３と単チャンネルＰＭＴ３５とを入替えるとともに、ダイクロイックミラー３７により所望の波長域の蛍光を反射させて、それ以外の波長域の蛍光を透過させることで、多チャンネルＰＭＴ１３により検出する所望の波長域のスペクトル成分に所望の波長域以外の波長域由来の高次回折光が混入するのを阻止することとしてもよい。

第４変形例としては、図６に示すように、第３変形例に係る蛍光検出装置１０が、ダイクロイックミラー３７により所望の波長域の蛍光から分離された蛍光をスペクトル成分に分光する回折格子（他の分光素子）３９と、回折格子３９によりスペクトル成分に分光された蛍光を集光する結像レンズ４１と、単チャンネルＰＭＴ３５に代えて、結像レンズ４１により集光された蛍光のスペクトル成分をそれぞれ検出する多チャンネルＰＭＴ（他の光検出器）４３とを備えることとしてもよい。

この場合、多チャンネルＰＭＴ４３は、回折格子３９による蛍光のスペクトル成分の分光方向に沿って１次元的に配列された複数（例えば、３２個）のセル（他の光検出部）４４を備えることとすればよい。また、各セル４４は、結像レンズ４１により、それぞれの受光面上にスポットが形成された蛍光のスペクトル成分を検出することとすればよい。

また、ダイクロイックミラー３７により、多チャンネルＰＭＴ１３によって検出する所望の波長域の最大波長の半分の波長から最小波長の半分の波長までの波長域の蛍光を反射して分離させることとすればよい。例えば、多チャンネルＰＭＴ１３により６００〜１２００ｎｍの波長域の蛍光を検出することとした場合は、ダイクロイックミラー３７により、６００〜１２００ｎｍの波長域の蛍光を回折格子９に向けて透過させ、３００〜５９９ｎｍの波長域の蛍光を回折格子３９に向けて反射することとすればよい。これにより、回折格子９に入射させる蛍光から、６００〜１２００ｎｍの波長域のスペクトル成分に所望の波長域以外の波長域由来の高次回折光が混入するのを阻止することができる。

そして、ダイクロイックミラー３７を透過した６００〜１２００ｎｍの波長域の蛍光は、回折格子９によりスペクトル成分に分光して、結像レンズ１１を介して多チャンネルＰＭＴ１３の各セル１４によりそれぞれ検出することとすればよい。また、ダイクロイックミラー３７により反射された３００〜５９９ｎｍの波長域の蛍光は、回折格子３９によりスペクトル成分に分光して、結像レンズ４１を介して多チャンネルＰＭＴ４３の各セル４４によりそれぞれ検出することとすればよい。

このようにすることで、多チャンネルＰＭＴ１３により検出する波長域のスペクトル成分以外の蛍光を、多チャンネルＰＭＴ４３により迅速かつ効率的に分光検出することができる。これにより、分光レンジを拡大することができる。

本変形例においても、ダイクロイックミラー３７により、回折格子９および回折格子３９により分光される蛍光から所望の波長域以外の波長域の蛍光を遮断し、検出するスペクトル成分に所望の波長域以外の波長域由来の高次回折光が混入することを阻止することで、所望の波長域に含まれるスペクトル成分ではないにもかかわらず、高次回折光によりあたかも所望の波長域に含まれるスペクトル成分であるかのように多チャンネルＰＭＴ１３または多チャンネルＰＭＴ４３によって検出されてしまう誤検出を防ぐことができる。

以上、本発明の一実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の一実施形態およびその変形例に適用したものに限定されることなく、上記の一実施形態およびその変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

１ 対物レンズ
７ バンドパスフィルタ（波長遮断部）
９ 回折格子（分光素子）
１０ 蛍光検出装置
１３ 多チャンネルＰＭＴ（光検出器）
１４ セル（光検出部）
２７ バリアフィルタ（波長遮断部）
２８ フィルタホイール（挿脱切替部）
３５ 単チャンネルＰＭＴ（他の光検出器）
３９ 回折格子（他の分光素子）
４３ 多チャンネルＰＭＴ（他の光検出器）
４４ セル（他の光検出部）

Claims (10)

1. 標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
   該対物レンズにより集光された前記蛍光をスペクトル成分に分光する分光素子と、
   該分光素子により分光された前記蛍光の所望の波長域のスペクトル成分をそれぞれ検出する光検出器と、
   該光検出器により検出される前記スペクトル成分に前記所望の波長域以外の波長域由来の高次回折光が混入することを阻止する波長遮断部とを備える蛍光検出装置。
2. 前記波長遮断部が、前記所望の波長域の最大波長の半分以下の波長域の蛍光を遮断する請求項１に記載の蛍光検出装置。
3. 前記光検出器が、前記分光素子による前記スペクトル成分の分光方向に沿って配列された複数の光検出部を有する請求項１または請求項２に記載の蛍光検出装置。
4. 前記分光素子により分光された前記スペクトル成分の所定の波長域のみを通過させるスリットを備え、
   前記光検出器が、前記スリットを通過した前記所定の波長域のスペクトル成分を検出可能な単一の光検出部からなる請求項１または請求項２に記載の蛍光検出装置。
5. 遮断可能な蛍光の波長域が異なる複数の前記波長遮断部と、
   これらの複数の波長遮断部を光路上に選択的に挿脱可能な挿脱切替部とを備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の蛍光検出装置。
6. 前記波長遮断部が、前記所望の波長域の蛍光から該所望の波長域以外の波長域の蛍光を分離し、
   該波長遮断部により分離された蛍光を検出する他の光検出器を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の蛍光検出装置。
7. 前記波長遮断部が、一方の前記光検出器により検出する蛍光を透過して前記他の光検出器により検出する蛍光を反射し、または、前記一方の光検出器により検出する蛍光を反射して前記他の光検出器により検出する蛍光を透過する請求項６に記載の蛍光検出装置。
8. 前記他の光検出器が、前記蛍光を検出可能な単一の他の光検出部からなる請求項６または請求項７に記載の蛍光検出装置。
9. 前記波長遮断部により分離された蛍光をスペクトル成分に分光する他の分光素子を備え、
   前記他の光検出器が、前記他の分光素子により分光された蛍光のスペクトル成分をそれぞれ検出する複数の他の光検出部を有し、該複数の他の光検出部が、前記他の分光素子による前記スペクトル成分の分光方向に沿って配列されている請求項６または請求項７に記載の蛍光検出装置。
10. 標本において発生した蛍光を対物レンズにより集光する集光ステップと、
    該集光ステップにより集光された前記蛍光をスペクトル成分に分光する分光ステップと、
    該分光ステップにより分光された前記蛍光の所望の波長域のスペクトル成分をそれぞれ検出する検出ステップと、
    前記所望の波長域以外の波長域の蛍光を遮断し、前記検出ステップにより検出される前記スペクトル成分に前記所望の波長域以外の波長域由来の高次回折光が混入することを阻止する波長遮断ステップとを含む蛍光検出方法。

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