JP2005180931A - 分光処理装置 - Google Patents

Abstract

【課題】測定対象物に影響を与えることなく、測定対象物の各部位の高精度な分光情報及び画像情報を取得できる分光処理装置を提供する。
【解決手段】光源３０から出力された励起光１４をスリット部材３４及び結像レンズ４４を介して測定対象物１２に照射してスリット像とし、測定対象物１２から得られた測定光１８を回折格子６６によって分光し、ＣＣＤセンサ２６により分光画像情報を取得する。この場合、スリット部材３４と測定対象物１２との間に配設した結像レンズ４４を移動させることにより、スリット像を測定対象物１２上で移動させ、測定対象物１２の全体の分光画像情報を取得することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、測定対象物に照明光を照射して得られる測定光を分光し、前記測定対象物の分光情報を取得する分光処理装置に関する。

測定対象物からの測定光を分光器を用いて分光し、その分光情報に基づいて測定対象物の成分分析等を行う装置として、例えば、特許文献１に開示されたポリクロメータがある。このポリクロメータは、照明光が照射されることで測定対象物から得られた測定光を入射スリットを介して回折格子に導いて回折分散させ、その回折分散光をＣＣＤ（Charge Coupled Device）等の二次元光センサによって電気信号に変換するように構成されており、広い波長範囲の分光情報を一度に得ることができる。

一方、生化学分野では、例えば、癌細胞等の生体組織を蛍光色素で染色し、その蛍光色素を含む測定対象物に励起光を照射することで得られる蛍光を測定することにより、生体組織の状態を調べる蛍光測光法が知られている。この場合、異なる複数の蛍光色素を用いて生体組織を染め分けることにより、生体組織を色によって弁別して観察することができる。なお、異なる蛍光色素から得られる異なる波長の蛍光を分離して観察するためには、各波長に応じた透過特性を有する光学フィルタを切り替えて用いればよい。

特開平９−２２９８４９号公報（図１）

ところで、従来のポリクロメータは、測定対象物の特定部位の測定光を分光して分光情報を得るものであり、測定対象物の全体の分光情報を一度に得ることができるようには構成されていなかった。

一方、蛍光測光法では、測定対象物の全体に励起光を照射することで得られる蛍光を観察していたため、励起光による蛍光色素の退色が著しく、長時間に亘る観察には不適当であった。従って、測定対象物の全体の画像を観察することはできるが、生体組織等の測定対象物の経時的状態を観察することは事実上不可能であった。

本発明は、前記の不具合に鑑みなされたものであり、測定対象物の各部位の高精度な分光情報及び画像情報を取得できる分光処理装置を提供することを目的とする。

また、本発明は、測定対象物に影響を与えることなく、測定対象物の時分割画像情報を取得できる分光処理装置を提供することを目的とする。

本発明の分光処理装置は、照明光を出力する光源と、
前記照明光をスリット光に変換するスリット部材と、
前記スリット光を測定対象物に導く光学系と、
前記スリット部材に形成されたスリットの長手方向と直交する方向に前記スリット光を移動させて前記測定対象物を走査する走査手段と、
前記スリット光が照射されることで前記測定対象物から得られた測定光を分光する分光器と、
二次元状に配列された複数の光電変換部を有し、分光された前記測定光を受光して電気信号に変換する二次元光センサと、
前記電気信号に基づいて前記測定対象物の分光情報及び画像情報を処理する情報処理手段と、
を備えることを特徴とする（請求項１記載の発明）。

この場合、光源から出力された照明光は、スリット部材のスリットを通過した後、光学系を介して測定対象物にスリット光として導かれる。スリット光が照射されることで測定対象物から得られた測定光は、分光器によって分光され、二次元光センサに導かれて電気信号に変換される。情報処理手段は、二次元光センサ上での測定光の位置情報と電気信号とから、測定対象物のスリット光が照射される部位における分光情報を取得する。

また、測定対象物に沿ってスリット光を走査させることで得られた電気信号から、測定対象物の画像情報を取得する。さらに、所定の時間間隔でスリット光を複数回走査させることにより、測定対象物の経時的状態を表す時分割画像情報を取得することができる。この場合、測定対象物には、測定する部位にのみスリット光が照射されているため、例えば、測定対象物を蛍光色素によって染色して観察するような場合であっても、蛍光色素が退色しない良好な状態で測定対象物の経時的状態に係る画像情報を取得することができる。

なお、光学系を構成する結像レンズをその光軸と直交する方向に移動させることにより、測定対象物を移動させることなく、スリット光を測定対象物に沿って移動させることができるため、例えば、生体組織等の動的な測定対象物に影響を与えることなく、高精度な分光情報及び画像情報を取得することができる（請求項２記載の発明）。

測定光を分光する分光器としては、所定の波長範囲の分光情報を一度に取得することができるポリクロメータを用いることができる（請求項３記載の発明）。

また、光学系としては、顕微鏡光学系を適用することができる（請求項４記載の発明）。

また、測定対象物を染色する蛍光色素を励起して蛍光を生成する励起光を照明光とすることにより、蛍光測光法を適用することのできる分光処理装置を提供することができる（請求項５記載の発明）。

本発明の分光処理装置では、測定対象物に沿ってスリット光を走査し、得られた測定光を分光して二次元光センサで検出することにより、測定対象物の各部位の高精度な分光情報及び画像情報を取得することができる。

また、測定対象物を移動させる代わりに、走査手段によりスリット光を測定対象物に沿って移動させることにより、分光情報及び画像情報を測定対象物に影響を与えることなく取得することができる。

さらに、照明光をスリット光として測定対象物の必要部分にのみ照射しているため、照明光により測定対象物が退色等の影響を受ける不具合を抑制することができる。従って、測定対象物に影響を与えることなく、スリット光により測定対象物を所定の時間間隔で繰り返し走査して複数の時分割画像を取得し、測定対象物の経時的な状態を分析することができる。

図１は、本実施形態の分光処理装置１０の構成ブロック図である。また、図２は、分光処理装置１０を構成する光学系における主要要素の配置関係説明図である。

分光処理装置１０は、測定対象物１２を照明する照明光である励起光１４を出力する光源部１６と、励起光１４を測定対象物１２に導き、拡大された測定対象物１２に係る測定光１８を得る顕微鏡光学系２０と、測定光１８を所望の波長範囲に分光するポリクロメータ２２（分光器）と、励起光１４を測定対象物１２に導く一方、測定光１８をポリクロメータ２２に導く光学系２４と、二次元状に配列された複数の光電変換部を有し、ポリクロメータ２２により分光された測定光１８を受光して電気信号に変換するＣＣＤセンサ２６（二次元光センサ）と、ポリクロメータ２２及び光学系２４を制御するとともに、ＣＣＤセンサ２６からの電気信号に従って分光情報を処理する情報処理部２８とを備える。

なお、測定対象物１２は、例えば、生体組織等からなり、蛍光測光法による分析を行うために所定の蛍光色素によって染色されているものとする。また、光源部１６から出力される励起光１４は、前記蛍光色素を励起して蛍光を得ることのできる波長を含むものとする。

光源部１６は、励起光１４を出力するキセノンランプ等からなる光源３０と、励起光１４を反射集光する集光ミラー３２と、集光ミラー３２により反射された励起光１４を整形してスリット光とするスリット部材３４とを備える。なお、図２に示すように、スリット部材３４のスリット３６は、測定対象物１２上に矢印Ｙ方向に長尺となるスリット像３８を形成するように設定されているものとする。

光学系２４は、スリット部材３４を介して光源部１６から供給された励起光１４を、測定対象物１２の染色に用いた蛍光色素を励起する適切な波長範囲とするためのバンドパスフィルタ４０と、バンドパスフィルタ４０を透過した励起光１４を反射して顕微鏡光学系２０に導く一方、顕微鏡光学系２０からの測定光１８をポリクロメータ２２に導くビームスプリッタ４２と、ビームスプリッタ４２により反射された励起光１４をコリメートする結像レンズ４４とを備える。なお、ビームスプリッタ４２は、励起光１４を反射する一方、測定光１８を透過させるダイクロイックミラーを用いると好適である。

結像レンズ４４（走査手段）は、移動ステージ４６に載置されている。移動ステージ４６は、モータ４８によって回転するボールねじ等を介して矢印Ｎ方向に移動可能に構成される。なお、矢印Ｎ方向は、図２に示す測定対象物１２の矢印Ｙ方向と直交する方向に対応して設定されているものとする。

顕微鏡光学系２０は、光学系２４から導かれた励起光１４を反射するプリズム５０と、プリズム５０により反射された励起光１４を測定対象物１２に集光する対物レンズ５２と、プリズム５０を図１に示す点線の位置に退避させた状態で、測定対象物１２からの測定光１８を観察者５４に導く接眼レンズ５６とを備える。

ポリクロメータ２２は、光学系２４から導かれた測定光１８のスリット像３８が結像されるスリット部材５８と、スリット部材５８のスリット６０を通過した測定光１８を反射する反射ミラー６２と、反射ミラー６２により反射された測定光１８をコリメートする第１凹面鏡６４と、第１凹面鏡６４により反射された測定光１８を多数の格子６５により回折分散する回折格子６６と、回折分散された測定光１８をＣＣＤセンサ２６に集光させる第２凹面鏡６８とを備える。なお、図２に示すように、スリット部材５８のスリット６０及び回折格子６６の格子６５は、スリット像３８と同一方向に長尺となるように設定されているものとする。

回折格子６６は、モータ７０によって回転する回転ステージ７２に載置されており、測定光１８の回折格子６６に対する入射角を調整することで、ＣＣＤセンサ２６に０次回折光（正反射光）又はｎ次回折光（ｎ：１以上の整数）を導くことができるように構成されている。

情報処理部２８は、制御部７４によって分光処理装置１０の制御を行うもので、例えば、パーソナルコンピュータにより構成することができる。制御部７４は、測定対象物１２から得られた測定光１８に基づき、測定対象物１２の分光情報及び画像情報を取得する情報処理手段として機能する。

制御部７４には、測定のための設定条件の入力や測定結果を表示するための指示を行う入力部７６と、設定画面を表示するとともに測定対象物１２の分光情報及び画像情報を表示する表示部７８と、光学系２４を構成する結像レンズ４４を移動させるための結像レンズ駆動部８０と、ポリクロメータ２２を構成する回折格子６６を回転させるための回折格子駆動部８２と、ＣＣＤセンサ２６から供給された電気信号の処理を行う信号処理部８４と、測定対象物１２の分光情報及び画像情報を記憶する分光画像情報記憶部８６とが接続される。

本実施形態の分光処理装置１０は、基本的には以上のように構成されるものであり、次に、分光処理装置１０を用いた測定対象物１２の分光処理方法について説明する。

先ず、図３に示すフローチャートに従って準備処理を説明する。

所定の蛍光色素により染色された生体組織等からなる測定対象物１２を、顕微鏡光学系２０を構成する対物レンズ５２の焦点位置に配置する。次いで、観察者５４は、プリズム５０を図１の点線で示す位置に移動させた後、接眼レンズ５６を介して測定対象物１２を観察しながら、顕微鏡光学系２０の位置を調整して測定対象物１２の位置合わせを行う（ステップＳ１）。

次に、プリズム５０を実線で示す位置に移動させ、光源部１６のスリット部材３４及びポリクロメータ２２のスリット部材５８を全開状態に設定するとともに（ステップＳ２）、回折格子駆動部８２によりモータ７０を駆動して回転ステージ７２を回転させ、回折格子６６が測定光１８の０次回折光をＣＣＤセンサ２６に導く状態に設定する（ステップＳ３）。なお、スリット部材３４及び５８を全開状態に設定する代わりに、これらを取り外してもよい。

分光処理装置１０を以上のように設定した後、光源３０を駆動して励起光１４を出力する。光源３０から出力された励起光１４は、全開状態のスリット部材３４を通過し、集光ミラー３２によって集光された後、バンドパスフィルタ４０により蛍光色素に応じた波長成分が選択されてビームスプリッタ４２に導かれる。ビームスプリッタ４２によって反射された励起光１４は、結像レンズ４４、プリズム５０及び対物レンズ５２を介して測定対象物１２に照射される（ステップＳ４）。

励起光１４が照射された測定対象物１２の蛍光色素は、励起光１４によって励起されることで、蛍光としての測定光１８を出力する。この測定光１８は、対物レンズ５２、プリズム５０、結像レンズ４４及びビームスプリッタ４２を介してポリクロメータ２２に導かれる。測定光１８は、全開状態のスリット部材５８を通過した後、反射ミラー６２、第１凹面鏡６４、回折格子６６及び第２凹面鏡６８を介してＣＣＤセンサ２６に集光される。この場合、回折格子６６は、測定光１８を全反射する状態に設定されているため、ＣＣＤセンサ２６には、測定光１８からなる測定対象物１２の蛍光画像が結像される。

そこで、制御部７４は、ＣＣＤセンサ２６に導かれた測定光１８を信号処理部８４により電気信号に変換した後、測定対象物１２の蛍光画像を表示部７８に表示する（ステップＳ５）。オペレータは、表示部７８に表示された測定対象物１２の蛍光画像を確認しながら顕微鏡光学系２０を調整し、ＣＣＤセンサ２６に対する測定対象物１２の焦点合わせを行う（ステップＳ６）。

ここで、焦点合わせを行う間、測定対象物１２の全体に励起光１４が照射されているが、焦点合わせに要する時間が短時間であるため、励起光１４によって蛍光色素が退色することは殆ど問題にならない。なお、光源３０から出力される励起光１４を焦点合わせに必要な必要最小限の光量に調整するとさらに好適である。

焦点合わせが完了した後、光源部１６のスリット部材３４及びポリクロメータ２２のスリット部材５８を所定のスリット幅に設定する（ステップＳ７）。このとき、光源３０から出力された励起光１４は、スリット部材３４のスリット３６によって絞られ、測定対象物１２上に励起光１４からなるスリット像３８が形成される（図２参照）。

スリット像３８の形成位置に対応して測定対象物１２から得られた測定光１８の蛍光画像は、ポリクロメータ２２の入口に設けられたスリット部材５８のスリット６０の位置に結像される。次いで、スリット部材５８を通過した測定光１８は、反射ミラー６２、第１凹面鏡６４、回折格子６６及び第２凹面鏡６８を介してＣＣＤセンサ２６に結像する。制御部７４は、このスリット状の測定光１８からなる蛍光画像（スリット画像）を表示部７８に表示する（ステップＳ８）。

この状態において、制御部７４が結像レンズ駆動部８０によりモータ４８を駆動し、移動ステージ４６を介して結像レンズ４４を矢印Ｎ方向に移動させると、測定対象物１２上に形成されたスリット像３８が矢印Ｎ方向に移動するため、表示部７８に表示されているスリット画像も移動する。

そこで、オペレータは、表示部７８に表示されているスリット画像の位置を確認しながら、測定対象物１２の矢印Ｎ方向に対する計測範囲を設定する（ステップＳ９）。なお、ステップＳ５で焦点合わせのために表示した測定対象物１２の全体の蛍光画像と、ステップＳ８のスリット画像とを重ねて表示すれば、計測範囲の設定を一層容易に行うことができる。

以上の準備処理が終了した後、測定対象物１２の分光計測処理を開始する。その処理について、図４に示すフローチャートに従って説明する。

先ず、回折格子駆動部８２によりモータ７０を駆動して回転ステージ７２を回転させ、回折格子６６が入射した測定光１８を分光してその１次回折光を第２凹面鏡６８に導く状態に設定する（ステップＳ１１）。

次いで、結像レンズ駆動部８０によりモータ４８を駆動して移動ステージ４６を移動させ、結像レンズ４４をステップＳ９で設定した計測範囲の初期位置に位置決めする（ステップＳ１２）。

前記の状態において、光源３０から出力された励起光１４をスリット部材３４を介して測定対象物１２に導くことにより、結像レンズ４４の初期位置に対応した測定対象物１２の部位に励起光１４からなるスリット像３８が形成される。この励起光１４によって励起された測定対象物１２からの蛍光である測定光１８は、顕微鏡光学系２０及び光学系２４を介してポリクロメータ２２に導かれ、回折格子６６によって分光された後、第２凹面鏡６８を介してＣＣＤセンサ２６に分光画像として結像する（ステップＳ１３）。なお、この分光画像は、図２に示す矢印Ｘ方向に対しては、測定対象物１２のスリット像３８から得られる蛍光の波長情報を表し、矢印Ｙ方向に対しては、スリット像３８から得られる蛍光の画像情報を表す。

波長情報及び画像情報を含む分光された測定光１８は、ＣＣＤセンサ２６を構成する各光電変換部によって電気信号に変換され、信号処理部８４で信号処理された後、分光画像情報として分光画像情報記憶部８６に記憶される（ステップＳ１４）。

次に、結像レンズ駆動部８０によりモータ４８を駆動して移動ステージ４６を矢印Ｎ方向に微小距離だけ移動させる（ステップＳ１５）。そして、結像レンズ４４の位置がステップＳ９で設定した計測範囲の終端位置に到達するまで、ステップＳ１３及びＳ１４の処理を繰り返す（ステップＳ１６）。これにより、測定対象物１２の全体の分光画像情報が取得されて分光画像情報記憶部８６に記憶される。

さらに、測定対象物１２の経時的状態を計測する必要があり、次の分光画像情報を取得する場合（ステップＳ１７）、ステップＳ１２からの処理を繰り返す。すなわち、結像レンズ４４を再び初期位置まで戻した後、矢印Ｎ方向に微小距離移動させながら各スリット像３８の分光画像情報を取得して分光画像情報記憶部８６に記憶させる。

以上のようにして、分光画像情報記憶部８６には、測定対象物１２の全体の分光画像情報が所定の計測時間毎に記憶される。

ここで、測定対象物１２の全体の分光画像情報を取得する際、測定対象物１２の全体に励起光１４を照射するのではなく、スリット像３８としての励起光１４を測定対象物１２に照射して測定光１８を得るようにしているため、測定に関与しない部位に励起光１４が照射されることがなく、その分、蛍光色素の励起光１４による退色が抑制される。従って、所定の計測時間毎に励起光１４を測定対象物１２に照射して分光情報を得る場合であっても、蛍光色素の退色が大幅に軽減されるため、分光画像情報を極めて高精度に取得することができる。

また、測定対象物１２にスリット像３８としての励起光１４を照射するために、測定対象物１２を移動させるのではなく、結像レンズ４４を移動させているため、例えば、外力が付与されることで状態が変化するおそれのある生体組織のような測定対象物１２であっても、その状態に影響を与えることなく分光画像情報を取得することができる。

この場合、例えば、時刻Ｔにおいて、励起光１４が測定対象物１２の矢印Ｎ方向の位置Ｎを照射しているとき、ＣＣＤセンサ２６のＸ列、Ｙ行目の光電変換部によって取得した分光画像情報をＰ（Ｘ，Ｙ，Ｎ，Ｔ）とすると（図５参照）、この分光画像情報Ｐは、時刻Ｔにおける測定対象物１２の座標（Ｎ，Ｙ）での座標Ｘに対応する波長の蛍光出力値を表している。従って、この分光画像情報Ｐに基づき、表示部７８に対して、測定対象物１２の任意の座標（Ｎ，Ｙ）の任意の時刻Ｔにおける分光情報を表示させ、また、測定対象物１２の任意の時刻Ｔにおける全体の画像情報を表示させることができる。

本実施形態の分光処理装置の構成ブロック図である。 図１に示す分光処理装置を構成する光学系における主要要素の配置関係説明図である。 図１に示す分光処理装置における準備処理のフローチャートである。 図１に示す分光処理装置における分光計測処理のフローチャートである。 図１に示す分光処理装置によって取得した分光画像情報の説明図である。

符号の説明

１０…分光処理装置 １２…測定対象物
１４…励起光 １６…光源部
１８…測定光 ２０…顕微鏡光学系
２２…ポリクロメータ ２４…光学系
２６…ＣＣＤセンサ ２８…情報処理部
３０…光源 ３４、５８…スリット部材
４４…結像レンズ ４６…移動ステージ
６６…回折格子 ７２…回転ステージ
７４…制御部 ７６…入力部
７８…表示部 ８０…結像レンズ駆動部
８２…回折格子駆動部 ８４…信号処理部
８６…分光画像情報記憶部

Claims (5)

1. 照明光を出力する光源と、
   前記照明光をスリット光に変換するスリット部材と、
   前記スリット光を測定対象物に導く光学系と、
   前記スリット部材に形成されたスリットの長手方向と直交する方向に前記スリット光を移動させて前記測定対象物を走査する走査手段と、
   前記スリット光が照射されることで前記測定対象物から得られた測定光を分光する分光器と、
   二次元状に配列された複数の光電変換部を有し、分光された前記測定光を受光して電気信号に変換する二次元光センサと、
   前記電気信号に基づいて前記測定対象物の分光情報及び画像情報を処理する情報処理手段と、
   を備えることを特徴とする分光処理装置。
2. 請求項１記載の装置において、
   前記走査手段は、光軸と直交する方向に移動することで前記スリット光を前記測定対象物に沿って移動させる結像レンズからなることを特徴とする分光処理装置。
3. 請求項１記載の装置において、
   前記分光器は、ポリクロメータからなることを特徴とする分光処理装置。
4. 請求項１記載の装置において、
   前記光学系は、顕微鏡光学系からなることを特徴とする分光処理装置。
5. 請求項１記載の装置において、
   前記照明光は、前記測定対象物を染色する蛍光色素を励起して蛍光を生成する励起光からなることを特徴とする分光処理装置。
   
   

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