JP3984132B2

JP3984132B2 - 蛍光分光分析装置

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Publication number: JP3984132B2
Application number: JP2002270530A
Authority: JP
Inventors: 養親石橋; 嘉明堀川
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2002-09-17
Filing date: 2002-09-17
Publication date: 2007-10-03
Anticipated expiration: 2022-09-17
Also published as: JP2004108892A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は蛍光分光分析装置に関し、とくに複数の測定点で同時に蛍光相関分光分析が可能な蛍光分光分析装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の光学技術やデータ解析技術の進歩に伴い、蛍光の強度を統計的に解析して、蛍光分子の特性に関する情報を得る解析手法が開発されてきている。このような技術としては、蛍光相関分光分析法(Fluorescence Correlation Spectroscopy)、光子計数ヒストグラム解析法(Photon Counting Histogram Analysis)、蛍光寿命解析(Fluorescence Decay Time Analysis)等が知られている。
【０００３】
蛍光相関分光分析法は蛍光強度の揺らぎを解析し、分子毎の拡散時間や平均分子数を求める手法で、Single molecule Detection in Solution,69P,Ch.Zander,J.Enderleing,R.A.keIler等に詳述されている。
【０００４】
また、光子計数ヒストグラム解析は蛍光揺らぎデータから観測領域内の分子毎の光子計数(明るさ)や平均分子数を求める手法であり、The Photon Counting Histogram in Fluorescence Fluctuation Spectroscopy, Yan Chan et.al., Biophysical Journal Vol.177 July 1999 553-567、Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Hong Qian and Elliot L.Elson.Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.87,pp.5479-5483,july 1990等に記載されている。
【０００５】
蛍光寿命解析法は、蛍光の減衰時間を解析することにより、分子毎の蛍光寿命や平均の分子数を求める手法で、Single molecule Detection in Solution,59p,Ch.Zander,J.Enderleing,R.A.keller等に記載されている。
【０００６】
蛍光相関分光分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy)は特によく知られており、国内外の研究機関で各種分子の解析、特に生物由来の分子の解析に多く用いられている。前述のように、蛍光相関分光分析は蛍光分子のブラウン運動に基づく蛍光強度の時間的な揺らぎを測定し、この自己相関関数を求めることにより、測定領域に於ける蛍光分子の固有の特性値を得る測定方法である。
【０００７】
蛍光強度の揺らぎの実測値から自己相関関数を求めるには式（１）が用いられる。
【０００８】
【数１】

蛍光強度の測定には、走査型レーザ顕微鏡等で採用されている共焦点光学系が一般に用いられる。図１５に共焦点光学系の構成を示す。この光学系では高い空間解像度が得られるという特徴を備えている。
【０００９】
この共焦点光学系を用いた蛍光分光分析では測定領域内の励起光分布や検出器の感度プロファイルをガウス分布と近似することにより、自己相関関数は式（２）の関係で記述されることが知られている。
【００１０】
【数２】

蛍光強度の実測値を式（１）に代入して求めた自己相関関数を用い、式（２）へのフィッティング演算を行うことにより、当該分子の拡散時間を表すτ。や、平均の個数Ｎと言った目的の分子に対する特性値を求めることができる。この拡散時間の違いを利用すると、分子の会合、他の分子との結合等、観察される分子の状態を推定することが可能となる。現在では蛍光相関分光分析法は、特に生物学的な物質の各種研究に応用が拡がってきている。「蛍光相関分光法によるＤＮＡ検出」精密工学会誌(1999)Vbl.65,No.2,175-180には、このような測定の例が記載されている。
【００１１】
この蛍光相関分光分析法は、当初は溶液状態の試料に対して用いられたが、測定が非侵襲に行える利点が注目され、近年では細胞系などの不均質な試料にも用いられるようになってきている。例えば、"Ligand-Receptor Interaction in the Membrane of Cultured Cells Monitored by Fluorescence Correlation Spectroscopy"Bio.Chem.,vo1382,pp.371-378には、細胞膜上のリガンドレセプター反応の測定が記載されている。
【００１２】
試料が溶液状態となっている溶液系では基本的に全ての場所が均一と考えられるため、吸着等の特異現象が発生しやすい容器界面の近傍を避けると、溶液中の１点を測定すれば系全体の様子を把握することができた。しかし、細胞の様に不均質な系では、個々の場所で発生している事象が異なり、測定結果は測定場所に大きく依存する。換言すると、測定場所は測定結果の一部とも言える。
【００１３】
また、このような系、特に細胞系では、異なる地点間の事象が互いに関連をもっており、ある地点のある事象が別の地点の別の事象を引き起すと言った時間的空間的な関連を持っている場合が多い。このような系を的確に把握するためには、異なる地点間で同時に測定を行うことが不可欠である。近年研究者の間からは異なる地点間で同時に測定を行うことの要望が上がってきている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
現在入手可能な蛍光分光分析装置は、一度に測定できる観測点の数は１点のみである。複数の測定点で測定したいという要望に応えるため、１点の測定が終ると次の地点に移り、逐次的に複数の測定地点を測定する装置があるに過ぎない。
【００１５】
相関分光分析において、精度の良いデータを得るためには観測対象物質の拡散時間に対し、最低１０００倍の長さのデータを蓄積することが必要とされる。例えば、拡散時間が５０ｍｓの物質の分析を行う場合、約５０秒間の測定が必要である。この場合、１ヶ所の測定に５０秒必要であるため、複数の地点を測定する際には５０秒ずつの間隔でしか測定できない。測定の各地点で起る事象の間に時間的な関連性がない場合には、このような方法も適用可能だが、このような逐次的な多点測定では時間的に早い関連を持った事象間の関連性は解析することが不可能である。
【００１６】
複数の測定点を同時に測定するためには、複数の測定系を準備し平行して測定する方法も考えられる。しかし、蛍光相関分光分析で用いられる測定系は、レーザを光源に用いる共焦点光学系を単光子計測可能な超高感度の検出器と組合わせて用いるため高価である。複数の測定系を得る為には測定装置が高価になるととともに、大型化してしまうと言う欠点がある。
【００１７】
また、細胞を測定する場合、複数の測定点相互の間隔は非常に狭く、複数の対物レンズを用いることができない。従って、測定系を複数準備したとしても、１個の対物レンズで複数のヶ所を励起し、かつ、そこからの蛍光を補足する必要がある。即ち、対物レンズの数は１個として増加しないように構成しても、励起光を１本にまとめるためのミラー系、補足された蛍光を測定系毎に分離するミラー系が必要であり、その結果、励起光量および蛍光の減少、目的とする波長が自由に選べない等の設計上の制限が多く発生する。
【００１８】
本発明は係る事情に鑑みてなされたもので、安価でかつ複数の測定点で同時に蛍光相関分光分析が可能な装置を供給することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解消するための本発明は、前記励起光学系は、前記試料の複数の測定点を照射対象とし、励起光を順次複数の測定点に移動しつつ、それぞれの測定点においては励起光を照射したまま所定時間停止する一連の動作を繰り返し実行する走査系と、前記検出器から出力された蛍光強度の時系列信号を前記それぞれの測定点に対応づけて演算を行い、それぞれの測定点に対応した統計解析を実施する統計解析装置とを備えた蛍光分光分析装置である。
【００２１】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、測定点に於ける停止時間は、１ミリ秒以上、かつ１秒以下である蛍光分光分析装置である。
【００２２】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、走査系は、測定点に於ける停止時間を変化させながら走査する蛍光分光分析装置である。
【００２３】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、前記統計解析装置は、前記検出器のそれぞれの測定点での蛍光強度の時系列信号を抽出し、抽出された蛍光強度の時系列信号から時間経過に対応付けた断続する信号で構成される出力信号を作成し、この出力信号に基いて、抽出された前記蛍光強度の時系列信号のみを用いた統計解析を行うことにより、それぞれの測定点毎に統計関数を求める機能を有する蛍光分光分析装置である。
【００２４】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、統計解析装置は、統計関数において生ずるブラインド範囲での関数値を、このブラインド範囲の前後の関数値に基づいた補間演算によって生成し、ブラインド範囲の生じていない新たな統計関数を求める機能を有する蛍光分光分析装置である。
【００２５】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、測定点での蛍光強度の時系列信号は、測定位置またはその近傍を含めた実質的に同位置とみなせる位置に対応する前記検出器からの蛍光強度の時系列信号である蛍光分光分析装置である。
【００２６】
また本発明は、上記記載の発明である蛍光分光分析装置において、統計関数は、自己相関関数である蛍光分光分析装置である。
【００２７】
【発明の実施の形態】
図１は本発明に係る蛍光分光分析装置の第１の実施の形態を示す図である。
【００２８】
レーザ光源１から出射したレーザ光はダイクロイックミラー２で反射された後ＸＹスキャナ３に入射する。ここで、光軸はＸ軸、Ｙ軸方向に偏向され、対物レンズ４に入る。これによって視野内の焦点面上にある試料５の任意の位置に、測定領域（焦点領域）を位置することができる。
【００２９】
焦点領域内の蛍光分子から発した蛍光は同じ対物レンズ４で補足され、逆の光路を通りダイクロイックミラー２に導かれる。ダイクロイックミラー２では、励起光と比べ波長の長い蛍光を透過するように設計されており、蛍光は光検出器６に到達する。光検出器６としてはＡＰＤ（アバランシェフォトダイオード）、あるいは光電子増倍管などが好適である。
【００３０】
光検出器６で光電変換された蛍光の強度信号は、相関解析装置７に入力される。相関解析装置７にはまた、測定領域の位置情報がＸＹスキャナー駆動装置８より入力される。相関解析装置７は検出器６からの蛍光強度信号と、ＸＹスキャナ駆動装置８からの測定位置の位置情報と対応づけて相関演算を行い、測定位置に対応した相関関数を演算する。
【００３１】
次に本蛍光分光分析装置の動作を説明する。
本実施の形態において、ＸＹスキャナ３は対物レンズ４の視野内において測定領域をラスタースキャンすることもできるし、任意の一つまたは複数の測定位置を順次走査したり停止させることもできる。そこで、３つの測定点Ａ、Ｂ、Ｃを順次走査する動作について説明する。
【００３２】
図２、図３は、ＸＹスキャナによる測定点の走査の様子を説明する図である。ＸＹスキャナ３は、一つの測定地点で一定時間（ｔｗ）、例えば１０ｍｓ停止したのち、次の地点に移動し、そこで一定時間停止した後、次の点に移り、これを周期（ｔｃ）、例えば４０ｍｓで繰り返す。
【００３３】
尚、各測定点における停止時間は一定である必要は無く、測定点毎に停止時間を変化させても良く、また同一測定点においても測定時間を繰り返す毎に変化させながら走査させても良い。
【００３４】
図４は、測定点の走査によって得られる蛍光強度信号の推移を示す図である。測定点が測定地点Ａ，Ｂ，Ｃを順次移動しながら測定を行っているため、検出器６から出力される蛍光の強度信号は、それぞれ測定地点Ａ、Ｂ、Ｃからの蛍光強度信号、及び測定地点間の移動の無効データが時分割的に混在している。相関解析装置７では、この複数の測定地点間からの信号が混ざった信号を入力信号とし、ＸＹスキャナ駆動装置８から供給される測定点の位置情報と組合せて演算を行うことにより、それぞれの測定地点の信号に相当する自己相関関数を求める。
【００３５】
続いて自己相関関数を求める方法について説明する。
【００３６】
第１の方法は、個々の測定地点に属する範囲内でのみ自己相関の演算を集積する方法である。簡単の為に、測定地点Ａに注目して説明する。測定地点Ａの自己相関関数は、測定地点Ｂ、Ｃ、及び移動中のデータとは無関係であり、Ａ地点の自己相関関数を求めるために使用できるのは、測定地点Ａで取得された測定データのみである。
【００３７】
図５は、ＸＹスキャナ駆動装置８より供給される測定位置情報を用い、測定地点Ａのデータのみを抽出したものであり、測定地点Ａのデータは幅ｔｗ、周期ｔｃのウインドウ内にのみ存在する断続的なデータをなっている。
【００３８】
自己相関関数の変数であるτがｔｗより小さい範囲では、式（１）の積演算に使用されている２点即ち、Ｉ（ｔ）とＩ（ｔ＋τ）の両方が同一のウインドウ内に存在し得る。そこで、この２点が同一のウインドウ内で得られる範囲内で、即ち０＜ｔ≦ｔｗ一τの範囲で積演算を行ってその結果を集積する。この集積操作を次のウインドウ、また次のウインドウと繰返すことによりデータの確度を上げることができ、連続的に取ったデータと遜色のない有意なデータを得ることができる。式（３）はこの集積方法を記述する式である。
【００３９】
【数３】

τがｔｗを越えた範囲では自己相関関数は連続的には求まらず、式（１）で積演算に使用される２点が異なるウインドウ内に存在する範囲のτに関して、部分的に求めることができる。この様子を図６に示す。τがｔｗを越える場合、自己相関関数は式（５）を用いることにより、式（４）で示される範囲について求めることができる。換言すれば、τが求めることが出来ないブラインドの範囲が断続的に発生する。
【００４０】
【数４】

【数５】

しかし、この問題は、測定したい分子の拡散時間がこのブラインド範囲にかからないように、ｔｗやｔｃの幅を選択することで対処が可能であり、さらに、ブラインドの範囲を前後の曲線より補間する方法や、有効なデータ範囲でのみフィッティングを行うことにより、この問題を回避することが可能である。
【００４１】
図７はｔｗを測定したい分子の拡散時間よりも長く取った場合の自己相関関数を示す図である。即ち本図７は、測定したい分子の自己相関関数成分の殆どすべてがｔｗ内に収るように設定した場合を示している。目的分子の自己相関成分がほぼ完全に得られるので、式（２）を用いてそのままフィッティングを行っても殆ど誤差が生じない。また、この場合フィッティング範囲はｔｗ以下とすることが望ましい。尚、図７では時間軸が対数表記となっているが、これは取扱い時間範囲が広範囲に及ぶためであり、一般に自己相関関数の表記には対数軸が使われることが多いためである。
【００４２】
また逆に、ｔｗを測定対象分子の拡散時間よりも十分に小さく設定することによっても、誤差の少ないデータが得られる。図８は、ｔｗを測定したい分子の拡散時間よりも小さく取った場合の自己相関関数を示す図である。
【００４３】
ｔｗよりτが大きな範囲では離散的に自己相関関数が得られるが、間隔が十分に小さいため、実質上連続データと遜色のない自己相関関数が求まる。フィッティングを行う際には、自己相関関数が得られている部分のみ選択的にフィッティングする方法と、一旦これらの間隔のデータを補間法で補った後に、フィッティングをかける方法とがある。
【００４４】
上記の様に測定の分子の拡散時間に対して、ｔｗを十分に大きな値、または小さな値に取ることができず、拡散時間の近くに取る必要がある場合にも同様に適応できる。図９は、ｔｗを測定したい分子の拡散時間の近くに取った場合の自己相関関数を示す図である。この場合、上述の場合と同様、フィッティングを行う際に自己相関関数が得られている部分のみ選択的にフィッティングする方法と、一旦これらの間隔のデータを補間法で補った後に、フィッティングをかける方法とがある。
【００４５】
次に、複数の測定地点間からの信号が混在した信号から、それぞれの地点の自己相関関数を求める、第２方法について述べる。図１０は、自己相関関数を求める第２の方法を説明する図である。
【００４６】
図１０の▲１▼は相関解析装置７への入力信号を表し、全ての測定地点からのデータが時分割的に混在している。この信号と、測定地点Ａからのデータと見なせる場合には１でそれ以外では０であるようなウインドウ関数（図１０中の▲２▼）、との積を取り、測定地点Ａからのみの信号を選び出す（図１０中の▲３▼）。この積演算はオペアンプ等によりアナログ演算で求めても良いし、信号をＡＤ変換した後、デジタル演算で求めても良い。
【００４７】
次に、図１０の▲３▼の信号に対して自己相関関数を求める処理を行う。使用するデータが部分的であるため、自己相関演算で得られる自己相関関数（Ｃｄ（τ））は、図１１に示すようにデータの欠如と変形が生じた形で得られる。入力信号はブラウン運動に基づくランダム信号であり、周期関数であるウインドウ関数との間に特別な相関関係はない。
【００４８】
この場合には、得られた自己相関関数（Ｃｄ（τ））は、目的信号の自己相関関数とウインドウ関数（図１０の▲２▼）の自己相関関数（Ｃｍ（τ））の積となる。このウインドウ関数の自己相関関数を用いることにより、欠損区間を除いて元の自己相関関数（Ｃｓ（τ））を復元することができる。尚、図１０、１１においては、説明を分り易くする目的で、時間軸はリニアスケールとしてある。
【００４９】
この方法で得られる自己相関関数は、第１の方法で得られる自己相関関数と基本的に同じであり、ｔｃ、ｔｗの組合せによりデータの欠損が発生する。これに対する対応も全く同様であり、図７、図８、図９で示した対応が可能である。
【００５０】
以上の説明では、測定点数が３点の場合について行ったが、測定点の数は２点でも、また４点以上でも構わない。また、測定は停止して行うことが望ましいが、条件によっては動かしながら（走査しながら）データを採集し、特定の測定点の近傍と見なせる領域からのデータを特定地点のデータと見なして演算してもよい。また逆に、ＸＹスキャナ３の停止時にリンギングが大きい場合には、目的位置に停止後、リンギングが収ってからのデータを採用することが望ましい。
【００５１】
図１２は、本発明に係る蛍光分光分析装置の第２の実施の形態を示す図である。第１の実施の形態と同様の機能を備えた部分には同一番号を付してその詳細の説明を省略する。本実施の形態では、画像処理装置１０を新たに設けて、試料５の蛍光像を生成するように構成した点が異なっている。
【００５２】
本実施の形態の測定系は、顕微鏡画像取得系と組合わせて用いるとその効果が大きく発揮できる。特に、光学系が類似であるため、共焦点レーザ走査型顕微鏡と組合わせると一層効果が大きい。尚、本発明は、この実施の形態に限定されず、複数の光学系を重ねる系に対して用いてもよい。
【００５３】
一般に生物由来の試料を使用する場合、拡散時間は小型分子で１００μ秒程度、大型の分子で数１０ミリ秒程度である。図７に見るように、測定の停止時間幅（ｔｗ）を、拡散時間の１０倍、できれば１００倍取るとその分子の自己相関成分の殆どを含むことができる。ｔｗを目的分子の拡散時間より長くとる手法を適用する場合は、ｔｗは１ミリ秒から１秒の範囲にその最適値が存在する。
【００５４】
今までの例では、ウインドウの間隔ｔｃが固定の場合を述べてきたが、ｔｃは可変にしても用いることができる。上述のようにデータ欠損区間はｔｃに依存するので、ｔｃを可変することにより、データの欠損区間をほとんどなくすことが可能である。例えば、ｔｃ／ｔｗ＝４に保ちつつ、ｔｃを１倍から４倍の範囲で可変すると、欠損区間を全くなくすことが可能である。図１３、１４にこの様子を示す。可変区間の条件としては、式（６）に示すように、最短時の周期（ｔｃ（ｍｉｎ））が最長時のウインドウ幅（ｔｗ（ｍａｘ））と同じかそれ以下にすると欠損をなくすことが可能である。
【００５５】
【数６】

今までの説明では、蛍光の解析方法をして、蛍光相関分光分析法に対する応用例について説明してきたが、その他の蛍光解析手法、例えば、光子計数ヒストグラム解析や蛍光寿命解析法に対しても全く同様に用いることが出来、１つの光学系で多数の測定点で、これらの蛍光分析法による観測を可能にする。
【００５６】
本実施の形態によると、複数の測定点で、各測定点間に時間的に早い関連性がある場合にも適応可能な蛍光相関分光分析の装置を提供することが可能になる。また、装置の大型化を防ぎ、低コストな測定装置を提供することが可能となる。また、測定点の数に制限がないため必要に応じた測定点を設定すれば良く、用途に応じた測定システムを提供できる。
【００５７】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の蛍光分光分析装置によれば、安価でかつ複数の測定点で同時に蛍光相関分光分析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る蛍光分光分析装置の第１の実施の形態を示す図。
【図２】ＸＹスキャナによる測定点の走査の様子を説明する図。
【図３】ＸＹスキャナによる測定点の走査の様子を説明する図。
【図４】測定点の走査によって得られる蛍光強度信号の推移を示す図。
【図５】測定地点Ａのデータのみを抽出した図。
【図６】自己相関関数を求める方法を説明する図。
【図７】ｔｗを測定したい分子の拡散時間よりも長く取った場合の自己相関関数を示す図。
【図８】ｔｗを測定したい分子の拡散時間よりも小さく取った場合の自己相関関数を示す図。
【図９】ｔｗを測定したい分子の拡散時間の近くに取った場合の自己相関関数を示す図。
【図１０】自己相関関数を求める第２の方法を説明する図。
【図１１】自己相関関数を示す図。
【図１２】本発明に係る蛍光分光分析装置の第２の実施の形態を示す図。
【図１３】ウインドウの間隔ｔｃの可変を説明する図。
【図１４】ウインドウの間隔ｔｃの可変を説明する図。
【図１５】共焦点光学系の構成を示す図。
【符号の説明】
１…レーザ光源
２…ダイクロイックミラー
３…ＸＹスキャナ
４…対物レンズ
５…試料
６…光検出器
７…相関解析装置
８…ＸＹスキャナ駆動装置
９…コンピュータ
１０…画像処理装置

Claims

試料に励起光を照射する励起光学系、該励起光を照射された試料より発する蛍光を検出する検出器、該検出器に蛍光を導く検出光学系を備えた蛍光分光分析装置であって、
前記励起光学系は、前記試料の複数の測定点を照射対象とし、励起光を順次複数の測定点に移動しつつ、それぞれの測定点においては励起光を照射したまま所定時間停止する一連の動作を繰り返し実行する走査系と、
前記検出器から出力された蛍光強度の時系列信号を前記それぞれの測定点に対応づけて演算を行い、それぞれの測定点に対応した統計解析を実施する統計解析装置と
を備えたことを特徴とする蛍光分光分析装置。
前記測定点に於ける停止時間は、１ミリ秒以上、かつ１秒以下であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
前記走査系は、前記測定点に於ける停止時間を変化させながら走査することを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光分光分析装置。
前記統計解析装置は、前記検出器のそれぞれの測定点での蛍光強度の時系列信号を抽出し、抽出された蛍光強度の時系列信号から時間経過に対応付けた断続する信号で構成される出力信号を作成し、この出力信号に基いて、抽出された前記蛍光強度の時系列信号のみを用いた統計解析を行うことにより、それぞれの測定点毎に統計関数を求める機能を有することを特徴とする請求項１乃至３の内いずれか１の請求項に記載の蛍光分光分析装置。
前記統計解析装置は、前記統計関数において生ずるブラインド範囲での関数値を、このブラインド範囲の前後の関数値に基づいた補間演算によって生成し、ブラインド範囲の生じていない新たな統計関数を求める機能を有することを特徴とする請求項４に記載の蛍光分光分析装置。
前記測定点での蛍光強度の時系列信号は、測定位置またはその近傍を含めた実質的に同位置とみなせる位置に対応する前記検出器からの蛍光強度の時系列信号であることを特徴とする請求項４または５に記載の蛍光分光分析装置。
前記統計関数は、自己相関関数であることを特徴とする請求項１乃至６の内いずれか１の請求項に記載の蛍光分光分析装置。