JP5566055B2

JP5566055B2 - 画像解析方法および画像解析装置

Info

Publication number: JP5566055B2
Application number: JP2009163992A
Authority: JP
Inventors: 明美鈴木
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2009-07-10
Filing date: 2009-07-10
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2029-07-10
Also published as: JP2011017677A

Description

本発明は、画像解析方法および画像解析装置に関する。

従来、ラスターイメージ相関分光法（ＲＩＣＳ：Raster Image Correlation Spectroscopy）として非特許文献１，２に示すような方法が提案されている。この画像解析方法において、１フレーム以上のラスター走査画像からなる蛍光画像を取得する。つまり、画像解析したい試料において、興味を持っている領域を決め、その領域をラスター走査方式で繰り返し走査し、複数フレームの蛍光強度からなる画像を取得する。フレーム中の蛍光強度はピクセル単位でデータとして表わされている。

これらのピクセル単位のデータ（ピクセルのデータ）は、それぞれ取得された時間および取得された位置が異なるため、各データに対応する取得時間および取得位置はずれている。

したがって、これらのピクセルのデータを用いて、空間相関解析することで、分子の揺らぎによる相関特性を得ることができる。ここで、分子の相関特性からは、拡散定数や分子数を求めることができる。

このように、空間相関解析することで、分子拡散時間や、分子数等を評価することができるため、分子間の相互作用を観察することが可能である。

「Measuring Fast Dynamics in Solutions and Cells with a Laser Scanning Microscope」, Michelle A. Digman, Claire M. Brown, Parijat Sengupta, Paul W. Wiseman, Alan R. Horwitz, and Enrico Gratton, Biophysical Journal, Vol.89, P1317-1327, August 2005. 「Fluctuation Correlation Spectroscopy with a Laser-Scanning Microscope: Exploiting the Hidden Time Structure」, Michelle A. Digman, Parijat Sengupta, Paul W. Wiseman, Claire M. Brown, Alan R. Horwitz, and Enrico Gratton, Biophysical Journal: Biophysical Letters, L33-36, 2005.

従来、ＲＩＣＳの空間相関解析において、一つのＲＩＣＳの解析結果を得るためには、１フレームの画像を構成するピクセルのデータだけを用いる。これは、１フレーム以上の画像を取得した場合であっても同様で、一つのＲＩＣＳの解析結果を得るためには、１フレームの画像を構成するピクセルのデータだけを用いる。すなわち、一つの画像を構成するピクセルのデータと、他の画像を構成するピクセルのデータを用いて、一つのＲＩＣＳの解析結果を得ていない。

しかし、細胞観察のような細胞の核、膜、質などの異なる局所的な解析領域に限定してＲＩＣＳの解析を行なう場合、当該解析領域に含まれるピクセル数が少ない（ピクセル数は例えば８×８である）。このような領域について、空間相関解析を行う場合、ＲＩＣＳの空間相関解析に用いるデータ数が少なすぎるため、解析結果の精度が低下するという問題が生じる。何故なら、ＲＩＣＳの空間相関演算は統計計算の一種で、データ数が多いほど精度が高く、データ数が少ないほど誤差が大きくなるためである。つまり、空間相関解析をする領域に含まれるデータ数が少なすぎると、統計計算の結果としてのＲＩＣＳの解析精度が低下してしまう。

本発明の目的は、ピクセル数の少ない解析領域に対しても高い精度で空間相関解析を行なえるＲＩＣＳの画像解析方法を提供することである。

本発明による画像解析方法は、各画像のピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる複数フレームの画像を時系列的に取得する画像取得ステップと、前記画像に対して解析領域を設定する解析領域設定ステップと、前記画像の中から解析に利用する２フレーム以上の画像を選定する画像選定ステップと、前記選定画像の各々の前記解析領域内の取得時間間隔が同じ二つのピクセルからその各々がなる複数のデータペアを抽出し、前記データペアの各々の積和計算を前記選定画像の全てについて行なって相関値を算出する演算ステップとを有している。前記演算ステップは、次式（１）または次式（２）を用いて、２次元または３次元の観察領域の自己相関または相互相関演算を行う。

ここで、Ｇ _ｓａはＲＩＣＳの空間自己相関値、ｎは計算に使用するフレーム数、ηはフレームを特定するパラメータ（η＝１，２，…，ｎ）、Ｉ _η はηフレーム目のピクセルのデータ、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ _１１はデータ積和計算の回数、Ｍ _η はηフレーム目のデータ総数であり、

ここで、Ｇ _ｓｃはＲＩＣＳの空間相互相関値、ｎは計算に使用するフレーム数、ηはフレームを特定するパラメータ（η＝１，２，…，ｎ）、Ｉ _１η はチャンネル１のηフレーム目の蛍光強度データ、Ｉ _２η はチャンネル２のηフレーム目の蛍光強度データ、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ _１２はデータ積和計算の回数、Ｍ _１η はチャンネル１のηフレーム目のデータ総数、Ｍ _２η はチャンネル２のηフレーム目のデータ総数である。

本発明によれば、ピクセル数の少ない解析領域に対しても高い精度で空間相関解析を行なえるＲＩＣＳの画像解析方法が提供される。

本発明の実施形態による画像解析装置を概略的に示している。図１に示される制御部の機能ブロックを示している。本発明の実施形態による画像解析のフローチャートである。図３のフローチャート中のステップ４における計算手順を示している。時系列的に取得された複数フレームの蛍光画像を示している。観察領域と解析領域を示している。複数グループに分類された複数フレームの蛍光画像による空間相関演算の積和計算部分を模式的に示している。小さい分子に対するＲＩＣＳによる空間相関値の算出結果を輝度で示した画像である。小さい分子に対するＲＩＣＳによる空間相関値のフィッティング結果を示している。大きい分子に対するＲＩＣＳによる空間相関値の算出結果を輝度で示した画像である。大きい分子に対するＲＩＣＳによる空間相関値のフィッティング結果を示している。ＥＧＦＰ溶液の拡散定数（Ｄ）を解析領域のＲＯＩサイズを変えながら比較した結果を示している。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

図１は、本発明の実施形態による画像解析装置を概略的に示している。この画像解析装置は、試料の蛍光観察のための走査型共焦点光学顕微鏡をベースに構成されている。

図１に示すように、画像解析装置１００は、試料Ｓに励起光を照射する光照射部１１０と、試料Ｓ内の測定点から発せられる光を検出する光検出部１３０と、画像解析に必要な制御を行なう制御部１６０と、試料Ｓを支持する試料ステージ１９０とを有している。

試料Ｓはマイクロプレートやスライドガラスなどの試料容器に収容され、試料ステージ１９０に載置される。試料ステージ１９０は、例えば、試料Ｓを光照射部１１０および光検出部１３０に対して横方向（ｘｙ方向）および高さ方向（ｚ方向）に移動可能に支持する。例えば、試料ステージ１９０は、出力軸が互いに直交する三つのステッピング・モーターを含んでおり、これらのステッピング・モーターによって試料Ｓをｘｙｚ方向に移動し得る。

画像解析装置１００は、多重光照射・多重光検出型である。このため、光照射部１１０はｎチャンネルの光源系１１１を含み、これに対応して光検出部１３０はｎチャンネルの検出系１３１を含んでいる。ｎチャンネルの検出系１３１は、それぞれ、ｎチャンネルの光源系１１１から射出された励起光によって生成された蛍光を検出する。ここで、ｎチャンネルは、チャンネル１、チャンネル２、・・・チャンネルｎによって構成される。チャンネルは、励起光の種類によってそれぞれ異なる。

光照射部１１０のｎチャンネルの光源系１１１は、光源１１２ａ，…，１１２ｎとコリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎとダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎとを含んでいる。光源１１２ａ，…，１１２ｎは、試料Ｓに含まれる蛍光色素を励起して試料Ｓから光（蛍光）を発せさせるための励起光を発する。光源１１２ａ，…，１１２ｎから発せられる励起光の波長は、試料Ｓに含まれる蛍光色素の種類に対応して、互いに相違している。光源１１２ａ，…，１１２ｎは、例えば、試料Ｓ中の蛍光色素に合った発振波長のレーザー光源で構成される。コリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎは、それぞれ、光源１１２ａ，…，１１２ｎから発せられた励起光をコリメートする。ダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎは、それぞれ、コリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎを通過した励起光を同じ方向に反射する。ダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎは、それぞれ、図１の上方から入射する励起光を透過し、図１の右方から入射する励起光を反射する。その結果、光源１１２ａ，…，１１２ｎからそれぞれ射出された異なる波長の励起光は、ダイクロイックミラー１１６ａの通過後に一本のビームに合成される。ダイクロイックミラー１１６ｎは、励起光を透過する必要がないので、単なるミラーに変更されてもよい。

光照射部１１０はさらに、ダイクロイックミラー１２２とガルバノミラー１２４と対物レンズ１２６と対物レンズ駆動機構１２８を含んでいる。ダイクロイックミラー１２２は、光源系１１１からの励起光をガルバノミラー１２４に向けて反射し、試料Ｓから発せられる蛍光を透過する。ガルバノミラー１２４は、励起光を対物レンズ１２６に向けて反射するとともに、その反射方向を変更する。対物レンズ１２６は、励起光を収束して試料Ｓ内の測定点に照射するとともに、試料Ｓ内の測定点からの光を取り込む。対物レンズ１２６には、微小な共焦点領域（測定点）の形成のために、ＮＡ（開口数）の大きいものが使用される。これにより得られる共焦点領域の大きさは、直径０．６μｍ程度、長さ２μｍ程度の略円筒状となる。ガルバノミラー１２４は、測定点をｘｙ方向に走査するｘｙ走査手段を構成している。ｘｙ走査手段は、ガルバノミラーを使用して構成するほかに、音響光学変調素子（ＡＯＭ）やポリゴンミラー、ホログラムスキャナーなどを使用して構成してもよい。対物レンズ駆動機構１２８は、対物レンズ１２６を光軸に沿って移動させる。これにより、測定点がｚ方向に移動される。つまり、対物レンズ駆動機構１２８は、測定点をｚ方向に走査するｚ走査手段を構成している。

光検出部１３０は、対物レンズ１２６とガルバノミラー１２４とダイクロイックミラー１２２を光照射部１１０と共有している。光検出部１３０はさらに、収束レンズ１３２とピンホール１３４とコリメートレンズ１３６とを含んでいる。収束レンズ１３２は、ダイクロイックミラー１２２を透過した光を収束する。ピンホール１３４は、収束レンズ１３２の焦点に配置されている。つまり、ピンホール１３４は、試料Ｓ内の測定点に対して共役な位置にあり、測定点からの光だけを選択的に通す。コリメートレンズ１３６は、ピンホール１３４を通過した光を平行にする。コリメートレンズ１３６を通過した光は、ｎチャンネルの検出系１３１に入射する。

ｎチャンネルの検出系１３１は、ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｎと蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｎと光検出器１４２ａ，…，１４２ｎとを含んでいる。
ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｎは、それぞれ、光源１１２ａ，…，１１２ｎからの励起光によって試料Ｓから生成された蛍光の波長域付近の波長の光を選択的に反射する。ダイクロイックミラー１３８ｎは、光を透過する必要がないので、単なるミラーに変更されてもよい。蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｎは、それぞれ、ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｎによって反射された光から、不所望な波長成分の光を遮断し、光源１１２ａ，…，１１２ｎからの励起光によって生成された蛍光だけを選択的に透過する。蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｎを透過した蛍光はそれぞれ光検出器１４２ａ，…，１４２ｎに入射する。光検出器１４２ａ，…，１４２ｎは、入射した光の強度に対応した信号を出力する。すなわち、光検出器１４２ａ，…，１４２ｎは、試料Ｓ内の測定点からの蛍光強度信号を出力する。

制御部１６０は例えばパーソナルコンピューターで構成される。制御部１６０は、試料Ｓの観察領域の蛍光画像の取得と記憶と表示、取得する蛍光画像のフレーム数（枚数）や解析領域の設定の入力待ち、画像解析（相関値の算出）、拡散時間の推定などを行なう。また制御部１６０は、ｘｙ走査手段であるガルバノミラー１２４、ｚ走査手段である対物レンズ駆動機構１２８、試料ステージ１９０などの制御を行なう。

図１に示される制御部の機能ブロックを図２に示す。制御部１６０は、図２に示すように、走査制御部１６２と画像形成部１６４と記憶部１６６と表示部１６８と入力部１７０と解析領域設定部１７２と画像選定部１７４とデータ抽出部１７６と解析部１７８とステージ制御部１８０とを含んでいる。ここで、走査制御部１６２と画像形成部１６４と記憶部１６６とステージ制御部１８０と上述したガルバノミラー１２４と対物レンズ駆動機構１２８と試料ステージ１９０と光検出器１４２とが画像取得部を構成し、データ抽出部１７６と解析部１７８とが演算部を構成する。

走査制御部１６２は、試料Ｓの蛍光画像を取得する際、励起光の照射位置を試料Ｓに対してラスター走査するようにガルバノミラー１２４を制御する。走査制御部１６２はまた、必要であれば、励起光の照射位置を試料Ｓに対してｚ走査するように対物レンズ駆動機構１２８を制御する。画像形成部１６４は、走査制御部１６２から入力される励起光の照射位置の情報と光検出器１４２ａ，…，１４２ｎの出力信号とから試料Ｓの蛍光画像を形成する。これにより、蛍光画像が取得される。記憶部１６６は、画像形成部１６４で形成された蛍光画像を順次記憶する。表示部１６８は、試料Ｓの蛍光画像や解析結果を表示する。入力部１７０は、例えばマウスやキーボードを含み、表示部１６８と共同してＧＵＩを構成する。このＧＵＩは、取得フレーム数や観察領域や解析領域の設定などに利用される。ステージ制御部１８０は、例えば観察領域を設定するために、入力部１７０からの入力情報に従って試料ステージ１９０を制御する。解析領域設定部１７２は、入力部１７０からの入力情報に従って解析領域を設定する。画像選定部１７４は、入力部１７０からの入力情報に従って、解析に利用する２フレーム以上の蛍光画像を選定する。データ抽出部１７６は、解析領域設定部１７２と画像選定部１７４からの入力情報に基づいて、記憶部１６６に記憶されている蛍光画像から必要なデータを抽出する。必要なデータは、画像選定部１７４によって選定された蛍光画像の各々の解析領域内の取得時間間隔が同じ二つのピクセルからその各々がなる複数のデータペアである。これら複数のデータペアに含まれるデータは、例えば、記憶部１６６に記憶されているすべての蛍光画像のすべてのピクセルのデータまたは一部のピクセルのデータであってよく、あるいは、記憶部１６６に記憶されている一部の蛍光画像のすべてのピクセルのデータまたは一部のピクセルのデータであってもよい。解析部１７８は、データ抽出部１７６によって抽出されたデータに対して後述する相関値の演算を行なう。

図１において、光源１１２ａ，…，１１２ｎから発せられた励起光は、コリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎとダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎとダイクロイックミラー１２２とガルバノミラー１２４と対物レンズ１２６を経て試料Ｓ内の測定点に照射される。励起光が照射される測定点は、ガルバノミラー１２４によってｘｙ方向にラスター走査される。さらに必要であれば、対物レンズ駆動機構１２８によってｚ走査される。励起光を受けた試料Ｓは測定点から蛍光を発する。試料Ｓからの光（蛍光のほかに不所望な反射光などを含む）は、対物レンズ１２６とガルバノミラー１２４とダイクロイックミラー１２２と収束レンズ１３２を経てピンホール１３４に至る。ピンホール１３４は測定点と共役な位置にあるため、試料Ｓ内の測定点からの光だけがピンホール１３４を通過する。ピンホール１３４を通過した光すなわち試料Ｓ内の測定点からの光はコリメートレンズ１３６を経てｎチャンネルの検出系１３１に入射する。ｎチャンネルの検出系１３１に入射した光は、ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｎによって波長に従って分離される（つまり分光される）とともに、蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｎによって不所望な成分が除去される。その結果、光源１１２ａ，…，１１２ｎからの励起光によって生成された蛍光だけが光検出器１４２ａ，…，１４２ｎにそれぞれ入射する。光検出器１４２ａ，…，１４２ｎは、それぞれ、入射光すなわち試料Ｓ内の測定点から発せられた蛍光の強度を示す蛍光強度信号を出力する。この蛍光強度信号は画像形成部１６４に入力される。画像形成部１６４は、１回のラスター走査（およびｚ走査）ごとに、入力される蛍光強度信号をｘｙ方向（およびｚ方向）の位置情報に同期させて処理して、試料Ｓ内の焦点面（測定点が移動した平面または曲面）の１フレームの蛍光画像を形成する。形成された蛍光画像は、記憶部１６６に保存される。ここに述べた一連の動作は、設定された取得するフレーム数だけ繰り返され、設定されたフレーム数の蛍光画像が取得される。各蛍光画像は、ピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる。

記憶部１６６に保存された蛍光画像は、必要に応じて処理され、表示部１６８に表示される。例えば、測定点のｚ位置を変えて複数フレームの蛍光画像を取得し、それらを合成して三次元画像を形成し、これを表示部１６８に表示することも可能である。

以下、図３と図４を参照しながら画像解析の手順について説明する。また、各ステップについて、適宜、図５〜図７を参照しながら説明する。

＜ステップＳ１＞：
試料Ｓの観察領域と取得する蛍光画像のフレーム数を設定する。設定した観察領域の設定したフレーム数の蛍光画像を時系列的に取得する。蛍光画像の取得は、同一の観察領域に対して同一の走査方法によって行なう。すなわち、所定の方向に向けて光を照射した後、再び当該所定の方向に向けて光を照射するまでを１セットの走査とした場合、少なくとも２セット以上、解析領域が走査される。

取得した複数フレームの蛍光画像を模式的に図５に示す。図５において、Ｆ_ｋは、一つのチャンネルにおけるｋフレーム目の蛍光画像を表している。各蛍光画像は、ピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる。ピクセルのデータは、たとえば、２次元または３次元の観察領域から得られた蛍光強度である。

＜ステップＳ２＞：
図６に示すように、取得した蛍光画像の領域（観察領域）Ｒ１に対して解析する領域（解析領域）Ｒ２を設定する。解析領域Ｒ２は、観察領域Ｒ１の一部に限定されるものではなく、観察領域Ｒ１に一致していてもよい。解析領域Ｒ２は、アプリケーション的にはデフォルトで観察領域Ｒ１すなわちステップＳ１における走査領域に設定されている。観察領域Ｒ１の全体を解析する場合には、このステップは不要である。

＜ステップＳ３＞：
解析に利用する２フレーム以上の蛍光画像を選定する。選定する蛍光画像は、ステップＳ１において取得した蛍光画像の全てであってもよいし、ステップＳ１において取得した蛍光画像の一部であってもよい。また、ステップＳ１において取得した蛍光画像の一部は、時系列的に連続していてもよいし、時系列的に連続していていなくてもよい。

＜ステップＳ４＞：
ステップＳ３において選定した蛍光画像の各々の解析領域Ｒ２内のピクセルのデータの中から、取得された時間の間隔が同じであるデータペアを複数抽出する。そして、データペアの各々の積和計算を、選定した蛍光画像の全てについて行なって相関値を算出する。抽出するデータペアの各々は、それに対応するピクセルのデータそのものであってもよいし、それに対応するピクセルを含む複数のピクセルのデータの統計値であってもよい。複数のピクセルは、たとえば、注目のピクセルおよびこれに隣接するピクセルであってよい。統計値は、たとえば、ピクセルのデータの平均値、最大値、最小値、相対差、絶対差、相対比のいずれかであってよい。どのような統計値を使用するかは、ＲＩＣＳの解析によってどのような情報を得たいかによって決める。

また相関値の演算は、ピクセルのデータに基づいて画像をそれぞれ構成し直し、構成し直した画像について相関値を演算してもよい。例えば、隣のピクセルのデータ同士を足して、ピクセルのデータの数を半分にする。または、一つのピクセルのデータを複数に分割する。本来ならば、一度画像を取得するとピクセルのデータの数は増えないが、取得したピクセルのデータの強度がそのピクセルのデータの周囲にガウシアン分布で広がっていると仮定して、本来取得できていないピクセルのデータを補う。本質的にピクセルのデータの数が増えている訳ではないが、見た目が良くなる。

相関値の演算は、例えば、次式（１）を用いて空間自己相関値を算出する。

ここで、Ｇ_ｓａはＲＩＣＳの空間自己相関値、ｎは計算に使用するフレーム数であり、ηはフレームを特定するパラメータ（η＝１，２，…，ｎ）、Ｉ_ηはηフレーム目のピクセルのデータ、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ_１１はデータ積和計算の回数、Ｍ_ηはηフレーム目のデータ総数である。計算に使用するフレーム数ｎは、２以上かつ取得した蛍光画像のフレーム数以下の整数で表される。

または、相関値の演算は、例えば、次式（２）を用いて空間相互相関値を算出する。

ここで、Ｇ_ｓｃはＲＩＣＳの空間相互相関値、ｎは計算に使用するフレーム数、ηはフレームを特定するパラメータ（η＝１，２，…，ｎ）、Ｉ_１ηはチャンネル１のηフレーム目の蛍光強度データ、Ｉ_２ηはチャンネル２のηフレーム目の蛍光強度データ、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ_１２はデータ積和計算の回数、Ｍ_１ηはチャンネル１のηフレーム目のデータ総数、Ｍ_２ηはチャンネル２のηフレーム目のデータ総数である。式（２）は、チャンネル１とチャンネル２との間の空間相互相関値の算出式であるが、チャンネルは適宜変更されてよい。計算に使用するフレーム数ｎは、２以上かつ取得した蛍光画像のフレーム数以下の整数で表される。

ここで、式（１）または式（２）による計算の手順について図４と図７を参照して説明する。図７は、Ｇ_ｓ（２，４）中の積和計算を模式的に示している。

まず、η＝１とし、１フレーム目の蛍光画像の解析領域に対して、空間ずれ（２，４）を有する二つのピクセルのデータのペアについて積和計算を行なう。なお、ＲＩＣＳの解析では、ラスター走査方式で繰り返し解析領域を走査しているため、空間ずれ（２，４）を有する二つのピクセルのデータのペアとは、データが取得された時間の間隔が所定時間であるデータのペアを意味する。

次に、ηに１を加算し、η＝２とし、２フレーム目の蛍光画像の解析領域に対して、空間ずれ（２，４）を有する二つのピクセルのデータのペアについて積和計算を継続して行なう。

その後、ηに１を加算した値がｎ以下である限り、ηフレーム目の蛍光画像の解析領域に対して、空間ずれ（２，４）を有する二つのピクセルのデータのペアについて積和計算を継続して行なう。

最終的に、このようにｎフレームの蛍光画像の全ての解析領域に対して積和計算を継続的に行なうことにより相関値を算出する。

このように、本実施形態では、η＝１のときの、データペアについて積和計算を行った後、その積和計算の結果のみに基づいて一つの相関解析結果を得るのではなく、ηが１からｎのときの、データペアについて積和計算を行った後、それらの積和計算の結果に基づいて一つの相関解析結果を得る。

また、別の言い方をすれば、ｎセットの走査により得られたそれぞれのピクセルのデータから、任意の２つのピクセルのデータの組み合わせであって、光が照射された時間の間隔が、所定時間である組み合わせを全て抽出し、抽出されたデータの全ての組み合わせについて一つの相関解析結果を得る。

＜ステップＳ５＞：
上記ステップＳ４の空間相関値の算出結果を式（３）によってフィッティングする。

ここで、Ｇ_ｓはＲＩＣＳの空間相関値、ＳはＲＩＣＳの解析における走査の影響、ＧはＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、δ_ｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、Ｗ_０は励起レーザビームの横方向の半径、Ｗ_Ｚは励起レーザビームの縦方向の半径、τ_ｐはピクセル時間、τ_ｌはライン時間、γは任意の定数である。

なお、γについては、システムに応じて適宜設定することができる。例えば、γ＝１としてフィッティングしてよい。

また、ピクセル時間とは、ピクセル間の取得時間のずれを意味する。また、ライン時間とは、任意のラインの最初のピクセルと、その次のラインの最初のピクセルと、の間の取得時間のずれを意味する。すなわち、ライン時間は、一ライン走査するのに要する時間を意味する。

このように式（３）を用いてフィッティングすることで、拡散時間の推定をする。具体的には、式（１）または式（２）を用いて、異なる遅延時間に対する相関値Ｇ_ｓａまたは相関値Ｇ_ｓｃをそれぞれ求める。ここで、遅延時間とは、一の画素の取得時間と、別の画素の取得時間と、の差を意味している。例えば、（ξ，ψ）＝（１，１）と、（ξ，ψ）＝（４，２）と、の遅延時間は、（４−１）τ_ｐ＋（２−１）τ_ｌで表される。

ここで、式（３）において、遅延時間がゼロのときは（ξ＝０、ψ＝０）、Ｓは１であり、Ｇ_ｓは１／Ｎで表せる。従って、分子数を求めることができる。これを新たに、式（３）に代入する。

そして、未知数である拡散定数Ｄと分子数Ｎを変動させながら、測定値として得られる相関値Ｇ_ｓａまたは相関値Ｇ_ｓｃと、理論値として得られるＧ_ｓと、の差が最小となるように、適切な拡散定数Ｄと分子数Ｎを求める。このように、式（３）によるフィッティングとは、拡散定数Ｄと分子数Ｎを変動させながら、２次元または３次元の観察領域における、最適な、分子数または拡散定数を推定することである。

そして、拡散定数からは、拡散時間を求めることができる。

すなわち、拡散定数と、拡散時間との関係は、次式（４）で表される。

ここで、Ｄは拡散定数、τは拡散時間、Ｗ_０は励起レーザビームの横方向の半径を意味する。

＜ステップＳ６＞：
解析結果を表示するとともに適宜保存する。具体的には、ステップＳ４で得た空間相関値の算出結果と、ステップＳ５で得た空間相関値のフィッティング結果を表示する。解析結果の一例を図８〜図１１に示す。図８は、小さい分子に対する空間相関値の算出結果を輝度で示した画像であり、図９は、そのフィッティング結果を示している。また図１０は、大きい分子に対する空間相関値の算出結果を輝度で示した画像であり、図１１は、そのフィッティング結果を示している。

従来、ＲＩＣＳのような画像データを計算の元とする空間的相関解析では、１フレームの画像の解析領域中のピクセルのデータを用いて一つの相関値を算出する。解析領域が小さくなると、積和計算に利用できるデータペアの数が減少する。このため、解析領域が非常に小さくなると、相関値が適切に算出できなくなる。図１２は、ＥＧＦＰ溶液（色素液を蒸留水で希釈したもの）の拡散定数（Ｄ）を解析領域のＲＯＩサイズを変えながら比較した結果を示している。図１２において、ＲＯＩサイズ＝２５６は、解析領域内に２５６×２５６のピクセル数が含まれていることを意味する。図１２から分かるように、解析領域のＲＯＩサイズが大きいほど、ＥＧＦＰ溶液の拡散定数９０（理論値）に近い値を示し、解析領域のＲＯＩサイズが小さいほど、ＥＧＦＰ溶液の拡散定数９０（理論値）から遠い値を示している。すなわち、ピクセルのデータが多いほど、正しい結果（理論値）に近い値（測定値）が得られることが分かる。

これに対して、本実施形態では、ＲＩＣＳのような画像データを計算の元とする空間的相関解析において、１フレームの画像の解析領域内の二つのピクセルに対する積和計算によって一つの相関値を算出するのではなく、複数フレームの画像の解析領域内の二つのピクセルに対して積和計算を継続的に行なって一つの相関値を算出する。このため、一つの相関値の算出に用いるデータが１フレームの画像中のデータに制限されず、一つの相関値の算出に用いる画像のフレーム数が増加される。その結果として、相関値の算出に用いるデータの数が増大する。このため、高い精度でＲＩＣＳの解析を行なえる。

これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。

また実施形態では、ラスター走査によって取得された画像について説明したが、画像は、ラスター走査によって取得されたものに限定されるものではなく、ピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる画像であればよく、他の走査方法によって取得されたものであってもよい。

１００…画像解析装置、１１０…光照射部、１１２ａ，…，１１２ｎ…光源、１１４ａ，…，１１４ｎ…コリメートレンズ、１１６ａ，…，１１６ｎ…ダイクロイックミラー、１２２…ダイクロイックミラー、１２４…ガルバノミラー、１２６…対物レンズ、１２８…対物レンズ駆動機構、１３０…光検出部、１３２…収束レンズ、１３４…ピンホール、１３６…コリメートレンズ、１３８ａ，…，１３８ｎ…ダイクロイックミラー、１４０ａ，…，１４０ｎ…蛍光フィルター、１４２ａ，…，１４２ｎ…光検出器、１６０…制御部、１６２…走査制御部、１６４…画像形成部、１６６…記憶部、１６８…表示部、１７０…入力部、１７２…解析領域設定部、１７４…画像選定部、１７６…データ抽出部、１７８…解析部、１８０…ステージ制御部、１９０…試料ステージ、Ｒ１…観察領域、Ｒ２…解析領域。

Claims

各画像のピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる複数フレームの画像を時系列的に取得する画像取得ステップと、
前記画像に対して解析領域を設定する解析領域設定ステップと、
前記画像の中から解析に利用する２フレーム以上の画像を選定する画像選定ステップと、
前記選定画像の各々の前記解析領域内の取得時間間隔が同じ二つのピクセルからその各々がなる複数のデータペアを抽出し、前記データペアの各々の積和計算を前記選定画像の全てについて行なって相関値を算出する演算ステップとを有し、
前記演算ステップは、次式（１）または次式（２）を用いて、２次元または３次元の観察領域の自己相関または相互相関演算を行う、画像解析方法。

ここで、Ｇ _ｓａはＲＩＣＳの空間自己相関値、ｎは計算に使用するフレーム数、ηはフレームを特定するパラメータ（η＝１，２，…，ｎ）、Ｉ _η はηフレーム目のピクセルのデータ、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ _１１はデータ積和計算の回数、Ｍ _η はηフレーム目のデータ総数であり、

ここで、Ｇ _ｓｃはＲＩＣＳの空間相互相関値、ｎは計算に使用するフレーム数、ηはフレームを特定するパラメータ（η＝１，２，…，ｎ）、Ｉ _１η はチャンネル１のηフレーム目の蛍光強度データ、Ｉ _２η はチャンネル２のηフレーム目の蛍光強度データ、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ _１２はデータ積和計算の回数、Ｍ _１η はチャンネル１のηフレーム目のデータ総数、Ｍ _２η はチャンネル２のηフレーム目のデータ総数である。
前記選定画像は、前記画像のすべてからなる、請求項１に記載の画像解析方法。
前記選定画像は、前記画像の一部からなる、請求項１に記載の画像解析方法。
前記データペアの各々は、前記ピクセルのデータの統計値であり、前記統計値は、前記ピクセルのデータの平均値、最大値、最小値、相対差、絶対差、相対比のいずれかである、請求項１ないし請求項３のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
前記ピクセルのデータは、２次元または３次元の観察領域から得られた蛍光強度である、請求項１ないし請求項４のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
前記演算ステップは、前記ピクセルのデータに基づいて、前記複数の画像をそれぞれ構成し直し、構成し直した画像について相関値を演算する、請求項１ないし５のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
前記画像は、走査型顕微鏡によって得られたものである、請求項１ないし６のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
前記演算ステップは、次式（３）を用いて、前記空間相関値の算出結果をフィッティングし、分子数または拡散定数を推定する。

ここで、Ｇ_ｓはＲＩＣＳの空間相関値、ＳはＲＩＣＳの解析における走査の影響、ＧはＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、δ_ｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、Ｗ_０は励起レーザビームの横方向の半径、Ｗ_Ｚは励起レーザビームの縦方向の半径、τ_ｐはピクセル時間、τ_ｌはライン時間、γは任意の定数である、請求項１に記載の画像解析方法。
各画像のピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる複数フレームの画像を時系列的に取得する画像取得手段と、
前記画像に対して解析領域を設定する解析領域設定手段と、
前記画像の中から解析に利用する２フレーム以上の画像を選定する画像選定手段と、
前記選定画像の各々の前記解析領域内の取得時間間隔が同じ二つのピクセルからその各々がなる複数のデータペアを抽出し、前記データペアの各々の積和計算を前記選定画像の全てについて行なって相関値を算出する演算手段とを有し、
前記演算手段は、次式（１）または次式（２）を用いて、２次元または３次元の観察領域の自己相関または相互相関演算を行う、画像解析装置。

ここで、Ｇ _ｓａはＲＩＣＳの空間自己相関値、ｎは計算に使用するフレーム数、ηはフレームを特定するパラメータ（η＝１，２，…，ｎ）、Ｉ _η はηフレーム目のピクセルのデータ、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ _１１はデータ積和計算の回数、Ｍ _η はηフレーム目のデータ総数であり、

ここで、Ｇ _ｓｃはＲＩＣＳの空間相互相関値、ｎは計算に使用するフレーム数、ηはフレームを特定するパラメータ（η＝１，２，…，ｎ）、Ｉ _１η はチャンネル１のηフレーム目の蛍光強度データ、Ｉ _２η はチャンネル２のηフレーム目の蛍光強度データ、ｘ，ｙは測定点の空間的座標、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ _１２はデータ積和計算の回数、Ｍ _１η はチャンネル１のηフレーム目のデータ総数、Ｍ _２η はチャンネル２のηフレーム目のデータ総数である。
前記選定画像は、前記画像のすべてからなる、請求項９に記載の画像解析装置。
前記選定画像は、前記画像の一部からなる、請求項９に記載の画像解析装置。
前記データペアの各々は、前記ピクセルのデータの統計値であり、前記統計値は、前記ピクセルのデータの平均値、最大値、最小値、相対差、絶対差、相対比のいずれかである、請求項９ないし１１のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
前記ピクセルのデータは、２次元または３次元の観察領域から得られた蛍光強度である、請求項９ないし１２のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
前記演算ステップは、前記ピクセルのデータに基づいて、前記複数の画像をそれぞれ構成し直し、構成し直した画像について相関値を演算する、請求項９ないし１３のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
前記画像は、走査型顕微鏡によって得られたものである、請求項９ないし１４のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
前記演算手段は、次式（３）を用いて、前記空間相関値の算出結果をフィッティングし、分子数または拡散定数を推定する、

ここで、Ｇ_ｓはＲＩＣＳの空間相関値、ＳはＲＩＣＳの解析における走査の影響、ＧはＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、ξ，ψは測定点からの空間的座標の変化量、δ_ｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、Ｗ_０は励起レーザビームの横方向の半径、Ｗ_Ｚは励起レーザビームの縦方向の半径、τ_ｐはピクセル時間、τ_ｌはライン時間、γは任意の定数である、請求項９に記載の画像解析装置。