JP2006119437A - 走査型レーザ顕微法及び走査型レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 屈折率の空間不均一性をレーザ光の伝搬方向の屈折を検出することにより可視化する走査型レーザ顕微法及び走査型レーザ顕微鏡。
【解決手段】 試料Ｓ上に集束光を照射し、その試料Ｓの透過側に離間して配置した光ビーム位置検出器３により、試料Ｓを透過した光束の中心位置を表す信号を検出して、その信号から映像信号を得ると共に、試料Ｓに対して走査ステージ８で集束光を相対的に２次元走査させ、その走査信号と映像信号に基づいて試料Ｓの屈折率勾配分布像又はブラウン運動分布像を画像化する。
【選択図】 図３

Description

本発明は、走査レーザ顕微法及び走査型レーザ顕微鏡に関し、特に、屈折率の空間不均一性を検出して可視化する走査型レーザ顕微法及び走査型レーザ顕微鏡に関するものである。

レーザ光は２０世紀に開発された指向性の高い単色光であり、白色光を用いた光計測より遙かに高精度な計測が達成できる。しかしながら、細胞組織の観測は、ほとんどの場合、白色光で試料を照らす光学顕微鏡により行われている。白色光顕微鏡は、Robert Hooke以来、３００年以上の開発の歴史があり、性能は光を用いて達成できる理論限界に至っている（非特許文献１）。

このような中にあって、レーザ光を利用した顕微鏡が如何にあるべきかは、光計測の研究者にとって慎重な熟考を必要とする課題である。レーザ光が単色光ゆえに干渉性が高いことは、高精度計測に適している反面、画像化には不利である。光を物体に照射すると僅かではあっても一部の光は乱反射して迷光となる。白色光であれば、迷光は、画像の背景を僅かに明るくするだけであり、それほど大きな障害にはならない。しかし、レーザ光は干渉性が高いので、迷光が画像形成光と干渉し、見苦しい干渉縞が生じる。このような不必要な干渉を最小限に抑えるためには、レーザ光の照射領域を最小限にすること、すなわち、レーザビームを回折限界まで集光して試料に照射する必要がある。そのため、レーザ顕微鏡は走査型にならざるを得ない。走査型レーザ顕微鏡として様々な方法が考えられるが、白色光顕微鏡よりも優れた顕微鏡を作り上げるのは困難であった。

実用化されているレーザ顕微鏡の原型は、１９５７年にミンスキー（特許文献１）が提案した共焦点レーザ走査顕微鏡（非特許文献２、３）である。対物レンズを用いて集光したレーザ光を試料に照射し、後方散乱された照射光若しくは蛍光を同じ対物レンズを用いて集め、空間フィルター（ピンホール）を用いて余分な光を除去した後、光電変換を行う方式である。この方式は、分解能、感度、迷光等の点で、白色光顕微鏡と同じかそれ以上である。しかしながら、彼らの考案した共焦点レーザ走査顕微鏡は、後方散乱を検出する方式であり、後方散乱が生じる場合しか動作しない。生きている細胞組織は、ほとんどの場合無色透明で、屈折率もなめらかに変化しているので、後方散乱がほとんど生じない。無染色では、蛍光も発生しない。一方、透過光を利用した共焦点顕微鏡（非特許文献４）も提案されているが、光学系が複雑な上に、透明な物体の可視化には向いていない。このような訳で、この方式により完璧なレーザ顕微鏡が完成したということはできない。
米国特許第３，０１３，４６７号明細書 M.Pluta:Advanced light Microscopy(Elsevier,New York 1988). P.Davidovits and M.D.Egger:Nature,223(1969)831. P.Davidovits and M.D.Egger:Appl.Opt.10(1971)1615. A.E.Dixon,D.Damaskiiinos and M.R.Atkinson:Nature,351(1991)p.551. E.M.Slayter and H.S.Slayter:Light and Electron Microscopy pp.154(Cambridge University Press,Cambridge 1992). S.Terakawa,J.H.Fan,K.Kumakura and M.Ohhara-Imaizumi:Neurosci.Lett.123(1991)82. F.Zernike:Z.tech.phys.16(1935)p.454.

本発明は従来技術のこのような現状に鑑みてなされたものであり、その目的は、屈折率の空間不均一性をレーザ光の伝搬方向の屈折を検出することにより可視化する走査型レーザ顕微法及び走査型レーザ顕微鏡を提案することである。

上記目的を達成する本発明の走査型レーザ顕微法は、試料上に集束光を照射し、その試料の透過側に離間して配置した光ビーム位置検出器により、試料を透過した光束の中心位置を表す信号を検出して、その信号から映像信号を得ると共に、前記試料に対して前記集束光を相対的に２次元走査させ、その走査信号と前記映像信号に基づいて前記試料の屈折率勾配分布像又はブラウン運動分布像を画像化することを特徴とする方法である。

本発明のもう１つの走査型レーザ顕微法は、試料の裏面に平面鏡を配置し、試料の表面から試料上に集束光を照射し、その試料の表面の反射側に離間して配置した光ビーム位置検出器により、試料を透過し前記平面鏡で反射され再び試料を透過した光束の中心位置を表す信号を検出して、その信号から映像信号を得ると共に、前記試料に対して前記集束光を相対的に２次元走査させ、その走査信号と前記映像信号に基づいて前記試料の屈折率勾配分布像又はブラウン運動分布像を画像化することを特徴とする方法である。

本発明の走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光源からのレーザ光を試料載置台上に載置された試料に集束させる対物レンズと、試料の透過側であって試料から離間した位置に配置され、前記試料を透過したレーザ光を受けてその光束の中心位置を表す信号を出す光ビーム位置検出器と、前記光ビーム位置検出器から出力された光束の中心位置を表す信号から映像信号を出す映像信号発生手段と、前記試料に対して集束光を相対的に２次元走査させる走査手段と、前記走査手段を駆動する走査信号と前記映像信号に基づいて前記試料の屈折率勾配分布像又はブラウン運動分布像を画像化して表示する表示手段とを備えていることを特徴とするものである。

本発明のもう１つの走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光源からのレーザ光を試料載置台上に載置された試料に集束させると共に、試料を透過し試料の裏面に配置された平面鏡で反射され再び試料を透過した光束を反対側に導く対物レンズと、前記対物レンズの試料と反対側の光路中に配置され試料から戻った光束を分離する分離手段で分離された光路中に配置され、前記試料から戻った光束を受けてその光束の中心位置を表す信号を出す光ビーム位置検出器と、前記光ビーム位置検出器から出力された光束の中心位置を表す信号から映像信号を出す映像信号発生手段と、前記試料に対して集束光を相対的に２次元走査させる走査手段と、前記走査手段を駆動する走査信号と前記映像信号に基づいて前記試料の屈折率勾配分布像又はブラウン運動分布像を画像化して表示する表示手段とを備えていることを特徴とするものである。

これらにおいて、前記走査手段が、前記試料載置台を試料面に沿って２次元走査させる試料載置台走査手段からなっていてもよく、あるいは、前記対物レンズに入射するレーザ光の角度を２次元走査させる２次元光偏向手段からなっていてもよい。

なお、前記２次元光偏向手段は、前記光ビーム位置検出器と光学的に共役な位置に配置されていることが望ましい。

また、前記映像信号発生手段は、前記光ビーム位置検出器から出力された光束の中心位置を表す信号の周波数成分を分割し、その直流成分又は特定の周波数帯成分に基づいて映像信号を出すように構成されていることが望ましい。

また、前記光ビーム位置検出器は、例えば４分割フォトダイオードで構成することができる。

以上の本発明の走査型レーザ顕微法及び走査型レーザ顕微鏡においては、試料の屈折率の空間不均一性に伴うレーザ光の伝搬方向の屈折を検出している。したがって、生きている細胞組織のようにほとんど無色透明な物体であってもわずかな屈折率変化があるので、そのような物体を無染色で観察することができる。また、光ビーム位置検出器による光電変換器は高速（＞７ＭＨｚ）なので、細胞組織のブラウン運動の可視化も可能になる。

本発明の走査型レーザ顕微鏡と同様な目的で、白色光顕微鏡を改良した微分干渉顕微鏡（非特許文献５、６）や位相差顕微鏡（非特許文献７）もまた屈折率の空間不均一性を可視化している。これらの従来の顕微鏡と比較すると、本発明の走査型レーザ顕微鏡は、ブラウン運動やタンパク質等の分子の濃度揺らぎも可視化可能である。

以下、本発明の走査型レーザ顕微鏡をその原理と実施例に基づいて説明する。

図１は、本発明の走査型レーザ顕微鏡の原理を説明するための図であり、対物レンズ１に入射したレーザ光４は対物レンズ１の焦点面２上の焦点に集光する。その焦点位置に細胞組織のような物体Ｔが存在しな場合は、レーザ光４は一旦集光した後入射レーザ光４と同じ方向に等方的に広がる発散光５として焦点面２の背後に配置した光ビーム位置検出器としての４分割フォトダイオード３に入射する。このとき、光の回折効果により、レーザ光４は焦点に波長程度の広がりとなって集光する。これに対して、焦点面２上に細胞組織等の周囲の液体と屈折率が異なる物体Ｔがあると、物体Ｔのレーザ光４の集光位置の空間的屈折率勾配によってその物体Ｔを透過した後の発散光は符号５’で示したような発散光となり、この発散光５’は、その集光位置の空間的屈折率勾配に応じて物体Ｔが存在しな場合の発散光５に対して屈折偏向され、４分割フォトダイオード３に入射する。

図２に、光ビーム位置検出器としての４分割フォトダイオード３の正面図を示す。４分割フォトダイオード３は、同一平面にｘ方向、ｙ方向それぞれに２等分分割して配置した４つのフォトダイオードａ，ｂ，ｃ，ｄからなるものであり、物体Ｔが存在しな場合の発散光５の中心が４分割フォトダイオード３の４つのフォトダイオードａ，ｂ，ｃ，ｄの間の中心に入射するように、対物レンズ１に対して４分割フォトダイオード３の位置を調節しておくと、物体Ｔが存在しな場合の発散光５は、各フォトダイオードａ，ｂ，ｃ，ｄに等しい光強度で入射する。これに対して、物体Ｔが存在する場合の発散光５’は、物体Ｔでの屈折角に応じて何れかのフォトダイオードａ，ｂ，ｃ，ｄに偏って入射し、最も偏りの大きいフォトダイオードに最大の光強度で入射する。

いま、フォトダイオードａ，ｂ，ｃ，ｄそれぞれからの光検出信号をＩ_a ，Ｉ_b ，Ｉ_c ，Ｉ_d とすると、−Ｉ_a −Ｉ_b ＋Ｉ_c ＋Ｉ_d は、発散光５’のｘ方向への偏りの程度、すなわちｘ方向の屈折率勾配を示す値であり、Ｉ_a −Ｉ_b −Ｉ_c ＋Ｉ_d は、発散光５’のｙ方向への偏りの程度、すなわちｙ方向の屈折率勾配を示す値である。したがって、焦点における屈折率勾配のｘ成分とｙ成分を同時に測定することができる。また、物体Ｔが細胞組織である場合、熱エネルギーにより物体Ｔ内でブラウン運動を行うと、集束レーザ光の屈折角が変化し、４分割フォトダイオード３の各フォトダイオードａ，ｂ，ｃ，ｄの出力もその運動に応じて変化する。各フォトダイオードａ，ｂ，ｃ，ｄの出力の交流成分を検出すれば、集光位置でのブラウン運動を検出することがができる。

このようにして、屈折率の空間不均一性や熱運動を検出しながら、焦点面２にある試料を走査することにより、それらの物理量の画像化が可能になる。

図３は、以上のような原理に基づく本発明の走査型レーザ顕微鏡の１実施例の構成を示す図である。この走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光源６と、そのレーザ光源６からのレーザ光を反射するダイクロイックミラー７と、ダイクロイックミラー７で反射したレーザ光を集光する対物レンズ１と、対物レンズ１の集光位置に配置され試料Ｓを載置して２次元走査する透明な走査ステージ８と、走査ステージ８をｘｙｚ方向に走査移動させる走査移動手段としてのピエゾ素子９と、走査ステージ８の射出側に近接して配置された４分割フォトダイオード３と、４分割フォトダイオード３の各フォトダイオードａ，ｂ，ｃ，ｄからの光検出信号Ｉ_a ，Ｉ_b ，Ｉ_c ，Ｉ_d の加算と減算を施してｘ方向屈折率勾配信号Ｉ_x ＝−Ｉ_a −Ｉ_b ＋Ｉ_c ＋Ｉ_d 、ｙ方向屈折率勾配信号Ｉ_y ＝Ｉ_a −Ｉ_b −Ｉ_c ＋Ｉ_d 、検出総和信号Ｉ_sum ＝Ｉ_a ＋Ｉ_b ＋Ｉ_c ＋Ｉ_d を出すオペアンプ１３と、ｘ方向屈折率勾配信号Ｉ_x 、ｙ方向屈折率勾配信号Ｉ_y それぞれの各周波数帯の信号を出すバンドパスフィルター・ローパスフィルター群１４ｘ、１４ｙと、バンドパスフィルター・ローパスフィルター群１４ｘ、１４ｙのそれぞれの通過信号を増幅する増幅器群１５ｘ、１５ｙとからなる。

また、走査ステージ８上の試料Ｓの観察域の選択と焦点合わせのために、白色光源１０と、その白色光源１０からの白色光を反射して対物レンズ１にレーザ光と同軸に入射させるハーフミラー１１と、試料Ｓからの反射像を対物レンズ１とダイクロイックミラー７とハーフミラー１１を介して撮像するＣＣＤカメラ１２とを備えている。

さらに、図４（ａ）に、図３の構成で得られたｘ方向屈折率勾配信号Ｉ_x 、ｙ方向屈折率勾配信号Ｉ_y のバンドパスフィルター・ローパスフィルター通過後のそれぞれの信号Ｉ_x5MHz 、Ｉ_x500kHz 、Ｉ_x50kHz、Ｉ_x5kHz 、Ｉ_xDC （それぞれ、５ＭＨｚ、５００ｋＨｚ、５０ｋＨｚ、５ｋＨｚ、ＤＣ成分。Ｉ_y についても同じ。）、Ｉ_y5MHz 、Ｉ_y500kHz 、Ｉ_y50kHz、Ｉ_y5kHz 、Ｉ_yDC から、屈折率勾配分布像、ブラウン運動分布像を画像化する構成の例を示す。図３の増幅器群１５ｘ、１５ｙからの各周波数帯のｘ方向屈折率勾配信号Ｉ_x5MHz 、Ｉ_x500kHz 、Ｉ_x50kHz、Ｉ_x5kHz 、Ｉ_xDC 、ｙ方向屈折率勾配信号Ｉ_y5MHz 、Ｉ_y500kHz 、Ｉ_y50kHz、Ｉ_y5kHz 、Ｉ_yDC は、アナログ・デジタル変換器１６を経て計算機１７に入力される。計算機１７からは、それぞれデジタル・アナログ変換器１９ｘ、１９ｙを通じて、ピエゾ素子９に走査ステージ８の主走査信号（ｘ方向走査信号）Ｖ_X と副走査信号（ｙ方向走査信号）Ｖ_Y を出力する。この主走査信号Ｖ_X と副走査信号Ｖ_Y は、例えばそれぞれ図４（ｂ）、（ｃ）のような波形の信号である。また、計算機１７には、表示装置１８が接続されており、図４（ｂ）、（ｃ）のような走査信号Ｖ_X 、Ｖ_Y と選択した帯域のｘ方向屈折率勾配信号又はｙ方向屈折率勾配信号あるいは両者の二乗平均等とを同期して表示装置１８に入力することにより、屈折率勾配分布像や選択した帯域のブラウン運動の分布像が表示されるように構成されている。

本発明の１実施例の走査型レーザ顕微鏡はこのような構成であるので、まず、白色光源１０から白色光をハーフミラー１１と対物レンズ１を介して走査ステージ８上の試料Ｓに照射し、その反射像を対物レンズ１を通し、ダイクロイックミラー７とハーフミラー１１を介しＣＣＤカメラ１２で撮像観察しながら、ピエゾ素子９に入力しているｚ方向駆動信号を調節して焦点合わせと観察域の選択を行う。

その状態で、レーザ光源６からのレーザ光をダイクロイックミラー７で反射させ後に対物レンズ１で焦点合わせした試料Ｓに集光させ、同時に計算機１７からピエゾ素子９へ走査ステージ８の主走査信号Ｖ_X と副走査信号Ｖ_Y を送り、試料Ｓの載った走査ステージ８の選択域全面をｘｙ走査させると、透過側の４分割フォトダイオード３の各フォトダイオードａ，ｂ，ｃ，ｄからそれぞれ走査位置の屈折率勾配とブラウン運動の情報を含む信号Ｉ_a ，Ｉ_b ，Ｉ_c ，Ｉ_d が検出され、その信号をオペアンプ１３に入力し、オペアンプ１３からｘ方向屈折率勾配信号Ｉ_x ＝−Ｉ_a −Ｉ_b ＋Ｉ_c ＋Ｉ_d 、ｙ方向屈折率勾配信号Ｉ_y ＝Ｉ_a −Ｉ_b −Ｉ_c ＋Ｉ_d 、検出総和信号Ｉ_sum ＝Ｉ_a ＋Ｉ_b ＋Ｉ_c ＋Ｉ_d が出力される。この中のｘ方向屈折率勾配信号Ｉ_x とｙ方向屈折率勾配信号Ｉ_y をそれぞれバンドパスフィルター・ローパスフィルター群１４ｘ、１４ｙ、増幅器群１５ｘ、１５ｙを経ることにより、各周波数帯に分けられたそれぞれ信号Ｉ_x5MHz 、Ｉ_x500kHz 、Ｉ_x50kHz、Ｉ_x5kHz 、Ｉ_xDC 、信号Ｉ_y5MHz 、Ｉ_y500kHz 、Ｉ_y50kHz、Ｉ_y5kHz 、Ｉ_yDC が出力される。

これら信号Ｉ_x5MHz 、Ｉ_x500kHz 、Ｉ_x50kHz、Ｉ_x5kHz 、Ｉ_xDC と信号Ｉ_y5MHz 、Ｉ_y500kHz 、Ｉ_y50kHz、Ｉ_y5kHz 、Ｉ_yDC をアナログ・デジタル変換器１６を経て計算機１７に入力し、計算機１７中で画像化に必要な入力を選択し、かつ、所定の処理を施して映像信号とした信号と主走査信号Ｖ_X 、副走査信号Ｖ_Y とを同期して表示装置１８に入力することにより、屈折率勾配分布像や選択した帯域のブラウン運動の分布像が表示される。

例えば、ｘ方向屈折率勾配信号の直流成分Ｉ_xDC とｙ方向屈折率勾配信号の直流成分Ｉ_yDC の二乗平均：√（Ｉ_xDC ² ＋Ｉ_yDC ² ）を画像化することにより、直交する２方向の屈折率勾配を平均化した画像が得られる。また、ｘ方向屈折率勾配信号の５ＭＨｚ成分Ｉ_x5MHz とｙ方向屈折率勾配信号の５ＭＨｚ成分Ｉ_y5MHz の二乗平均：√（Ｉ_x5MHz ² ＋ＩＩ_y5MHz ² ）を画像化することにより、ブラウン運動の直交する２方向の５ＭＨｚ成分を平均化した画像が得られる。また、これらの選択帯域成分のｘ方向成分、ｙ方向成分の一方のみを映像信号として画像化することにより、ｘ方向又はｙ方向の屈折率勾配分布像あるいはブラウン運動分布像が得られる。なお、検出総和信号Ｉ_sum ＝Ｉ_a ＋Ｉ_b ＋Ｉ_c ＋Ｉ_d についても、同様にアナログ・デジタル変換器１６を経て計算機１７に入力し、表示装置１８で画像化することにより、透過型光学顕微鏡で得られる試料Ｓの透過像と類似の画像が得られる。

ところで、図１の原理は、本発明の走査型レーザ顕微鏡を透過型で構成する場合の原理であったが、簡単な変形で本発明の走査型レーザ顕微鏡を反射型に構成することができる。その原理を図５に示す。図１の場合に対して、物体Ｔの透過側に平面鏡２０が密着される点が大きな相違である。すなわち、偏光ビームスプリッター２２と４分の１波長板２１を透過して対物レンズ１に入射したレーザ光４は対物レンズ１の焦点面上の物体Ｔに集光する。レーザ光４は一旦集光して透過後、平面鏡２０で反射されてその集光位置の空間的屈折率勾配に応じて偏った発散光５’として対物レンズ１に反対側から入射し、４分の１波長板２１を通ることにより偏光面が９０°回転され、今度は偏光ビームスプリッター２２で反射され、４分割フォトダイオード３に入射する。４分割フォトダイオード３の各フォトダイオードａ，ｂ，ｃ，ｄには、物体Ｔが存在しな場合には均等に反射光が入射するが、発散光５’は屈折率勾配に応じて何れかの方向に偏っているため、最も偏りの大きいフォトダイオードに最大の光強度で入射する。したがって、図１の場合と同様に、屈折率の空間不均一性や熱運動を検出しながら、焦点面にある試料を走査することにより、それらの物理量の画像化が可能になる。

図６は、図５の原理に基づく本発明の反射型の走査型レーザ顕微鏡の１実施例の構成を示す図である。図３の構成と異なる部分のみを説明する。なお、オペアンプ１３以降と、図４の構成は同じで、図示は省いてある。この場合、４分割フォトダイオード３へ至る光は、レーザ光源６とダイクロイックミラー７の間に分岐光路として設けられ、レーザ光源６とダイクロイックミラー７の間のダイクロイックミラー７側に４分の１波長板２１が、レーザ光源６側に偏光ビームスプリッター２２が配置され、偏光ビームスプリッター２２で反射した光路中の対物レンズ１の焦点と共役な位置にピンホール２３が配置され、その透過側に４分割フォトダイオード３が配置されている。

この場合、焦点合わせと観察域の選択は図３の場合と同様に行われる。そして、レーザ光源６からのレーザ光は、偏光ビームスプリッター２２、４分の１波長板２１を順に透過後、ダイクロイックミラー７で反射され、対物レンズ１で焦点合わせした試料Ｓに集光される。同時に、計算機１７からピエゾ素子９へ走査ステージ８の主走査信号Ｖ_X と副走査信号Ｖ_Y を送り、試料Ｓの載った走査ステージ８の選択域全面をｘｙ走査させると、試料Ｓ透過後、平面鏡２０で反射されて偏った発散光となって対物レンズ１を反対側から通り、ダイクロイックミラー７、４分の１波長板２１、偏光ビームスプリッター２２、ピンホール２３を順に経た光は、４分割フォトダイオード３に入射し、４分割フォトダイオード３の各フォトダイオードａ，ｂ，ｃ，ｄからそれぞれ走査位置の屈折率勾配とブラウン運動の情報を含む信号Ｉ_a ，Ｉ_b ，Ｉ_c ，Ｉ_d が検出され、その信号がオペアンプ１３に入力される。以後の動作は、図３、図４の場合と同様である。この場合も、図３、図４の場合と同様に、試料Ｓの屈折率勾配分布像や選択した帯域のブラウン運動の分布像を画像化することができる。

ところで、以上の実施例の本発明の走査型レーザ顕微鏡は、透過型、反射型何れも試料Ｓの２次元走査は、集光ビームを試料Ｓに対して移動させるのではなく、集光ビームを固定し、試料Ｓを載置した試料台（走査ステージ８）を移動させるものであった。この場合は走査時間が長く必要である。高速掃引（走査）を可能にするため、試料Ｓを固定し、集光ビームを移動させるようにすることが望ましい。そのための基本構成を図７に示す。

図７（ａ）は、本発明の透過型の走査型レーザ顕微鏡を集光ビームを走査するようにする場合であり、対物レンズ１に対して４分割フォトダイオード３と共役な入射側光路位置にｘ方向、ｙ方向にレーザ光４を偏向するｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５を配置する。このような配置にすると、ｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５の偏向角（集光位置）に依存せずに、試料Ｓの集光位置の屈折率勾配に応じた分布のレーザ光４が４分割フォトダイオード３に入射するようになる。したがって、試料台を固定して図３の場合と同様の試料Ｓの屈折率勾配分布像や選択した帯域のブラウン運動の分布像を画像化することができる。なお、この場合には、計算機１７から出力される主走査信号（ｘ方向走査信号）Ｖ_X と副走査信号（ｙ方向走査信号）Ｖ_Y は、ｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５のドライバーに入力される。

図７（ｂ）は、本発明の反射型の走査型レーザ顕微鏡を集光ビームを走査するようにする場合であり、偏光ビームスプリッター２２と４分割フォトダイオード３の間の光路上に、集光レンズ２６を配置し、対物レンズ１、平面鏡２０（試料Ｓの透過側に配置される。）、集光レンズ２６からなる光学系に対して、４分割フォトダイオード３と共役な入射側光路位置にｘ方向、ｙ方向にレーザ光４を偏向するｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５を配置する。このような配置にすると、図７（ａ）の場合と同様に、ｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５の偏向角（集光位置）に依存せずに、試料Ｓの集光位置の屈折率勾配に応じた分布のレーザ光４が４分割フォトダイオード３に入射するようになり、試料台を固定して図６の場合と同様の試料Ｓの屈折率勾配分布像や選択した帯域のブラウン運動の分布像を画像化することができる。この場合も、計算機１７から出力される主走査信号（ｘ方向走査信号）Ｖ_X と副走査信号（ｙ方向走査信号）Ｖ_Y は、ｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５のドライバーに入力される。

図８と図９に、図７のような試料Ｓを固定しｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５で集光ビームを偏向走査させるそれぞれ透過型と反射型の走査型レーザ顕微鏡の実施例を説明する。

図８は、図３の透過型に対応する実施例であり、図３の構成と異なる部分のみを説明する。なお、バンドパスフィルター・ローパスフィルター群１４ｘ、１４ｙ、増幅器群１５ｘ、１５ｙ以降の構成は図３の実施例は同じである。この場合、対物レンズ１は無限遠結像型のものを用いており、レーザ光源６からダイクロイックミラー７に至る光路中にｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５が配置されており、固定された試料Ｓの透過側に配置される４分割フォトダイオード３は、対物レンズ１に対してｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５と共役な位置に配置されている。

この場合、試料Ｓの反射像は対物レンズ１とハーフミラー１１の観察側に配置された結像レンズ２７とを通してＣＣＤカメラ１２の撮像面上に結像され、対物レンズ１を光軸方向（ｚ方向）に位置調節することで焦点合わが行われる。そして、レーザ光源６からのレーザ光はｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５で反射され、ダイクロイックミラー７で反射され、対物レンズ１で焦点合わせした試料Ｓに集光される。同時に、計算機１７からｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５のドライバーへ主走査信号Ｖ_X と副走査信号Ｖ_Y を送り、ｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５で反射され、試料Ｓに集光される光をｘ方向とｙ方向へ走査させると、試料Ｓの各走査点を通った発散光は４分割フォトダイオード３に入射し、４分割フォトダイオード３の各フォトダイオードａ，ｂ，ｃ，ｄからそれぞれ走査位置の屈折率勾配とブラウン運動の情報を含む信号Ｉ_a ，Ｉ_b ，Ｉ_c ，Ｉ_d が検出され、その信号がオペアンプ１３に入力される。以後の動作は、図３、図４の場合と同様である。この場合も、図３、図４の場合と同様に、試料Ｓの屈折率勾配分布像や選択した帯域のブラウン運動の分布像を画像化することができる。しかも、図３の試料Ｓを移動させて走査する場合に比べてより高速に走査することができる。

図９は、図６の反射型に対応する実施例であり、図６の構成と異なる部分のみを説明する。なお、なお、オペアンプ１３以降の構成は図６の実施例は同じである。この場合、対物レンズ１は無限遠結像型のものを用いており、レーザ光源６から偏光ビームスプリッター２２に至る光路中にｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５が配置されており、また、偏光ビームスプリッター２２で反射された光路中のピンホール２３より前に集光レンズ２６が配置されている。そして、ピンホール２３の後に配置される４分割フォトダイオード３は、ダイクロイックミラー７、対物レンズ１、平面鏡２０（試料Ｓの透過側に配置される。）、ダイクロイックミラー７、偏光ビームスプリッター２２、集光レンズ２６からなる光学系に対して、共役な位置に配置されている。

この場合、図８と同様、試料Ｓの反射像は対物レンズ１とハーフミラー１１の観察側に配置された結像レンズ２７とを通してＣＣＤカメラ１２の撮像面上に結像され、対物レンズ１を光軸方向（ｚ方向）に位置調節することで焦点合わが行われる。そして、レーザ光源６からのレーザ光はｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５で反射され、偏光ビームスプリッター２２、４分の１波長板２１を順に透過後、ダイクロイックミラー７で反射され、対物レンズ１で焦点合わせした試料Ｓに集光される。同時に、計算機１７からｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５のドライバーへ主走査信号Ｖ_X と副走査信号Ｖ_Y を送り、ｘｙ方向走査用ガルバノミラー２５で反射され、試料Ｓに集光される光をｘ方向とｙ方向へ走査させると、試料Ｓ透過後、平面鏡２０で反射されて偏った発散光となって対物レンズ１を反対側から通り、ダイクロイックミラー７、４分の１波長板２１、偏光ビームスプリッター２２、集光レンズ２６、ピンホール２３を順に経た光は、４分割フォトダイオード３に入射し、４分割フォトダイオード３の各フォトダイオードａ，ｂ，ｃ，ｄからそれぞれ走査位置の屈折率勾配とブラウン運動の情報を含む信号Ｉ_a ，Ｉ_b ，Ｉ_c ，Ｉ_d が検出され、その信号がオペアンプ１３に入力される。以後の動作は、図３、図４の場合と同様である。この場合も、図６の場合と同様に、試料Ｓの屈折率勾配分布像や選択した帯域のブラウン運動の分布像を画像化することができる。しかも、図６の試料Ｓを移動させて走査する場合に比べてより高速に走査することができる。

以上、本発明の走査型レーザ顕微法及び走査型レーザ顕微鏡をその原理と実施例に基づいて説明したが、本発明はこれら実施例に限定されず種々の変形が可能である。例えば、光ビーム位置検出器として用いた４分割フォトダイオードの代わりに、光ビーム中心位置を検出する各種の半導体素子あるいはＣＣＤ等を用いることができる。なお、本発明の走査型レーザ顕微鏡による屈折率勾配分布像の観察の際、透過型の場合は幾何学的な凹凸、例えばガラス表面の凹凸も観察することができる。また、反射型の場合も幾何学的な凹凸、例えば金属表面の凹凸も観察することができる。

本発明の走査型レーザ顕微鏡の原理を説明するための図である。 光ビーム位置検出器としての４分割フォトダイオードの正面図である。 本発明の透過型の走査型レーザ顕微鏡の１実施例の構成を示す図である。 本発明の走査型レーザ顕微鏡の画像化のための構成と走査信号発生のための構成とを説明するための図である。 本発明の走査型レーザ顕微鏡を反射型に構成する場合の原理を説明するための図である。 図５の原理に基づく本発明の反射型の走査型レーザ顕微鏡の１実施例の構成を示す図である。 試料を固定し集光ビームを移動させるための基本構成を示す図である。 試料を固定し集光ビームを偏向走査させる透過型の走査型レーザ顕微鏡の実施例の構成を示す図である。 試料を固定し集光ビームを偏向走査させる反射型の走査型レーザ顕微鏡の実施例の構成を示す図である。

符号の説明

Ｔ…物体
Ｓ…試料
ａ，ｂ，ｃ，ｄ…フォトダイオード
１…対物レンズ
２…焦点面
３…４分割フォトダイオード
４…レーザ光
５…発散光（物体なし）
５’…発散光（物体あり）
６…レーザ光源
７…ダイクロイックミラー
８…走査ステージ
９…ピエゾ素子
１０…白色光源
１１…ハーフミラー
１２…ＣＣＤカメラ
１３…オペアンプ
１４ｘ、１４ｙ…バンドパスフィルター・ローパスフィルター群
１５ｘ、１５ｙ…増幅器群
１６…アナログ・デジタル変換器
１７…計算機
１８…表示装置
１９ｘ、１９ｙ…デジタル・アナログ変換器
２０…平面鏡
２１…４分の１波長板
２２…偏光ビームスプリッター
２３…ピンホール
２５…ｘｙ方向走査用ガルバノミラー
２６…集光レンズ
２７…結像レンズ

Claims (9)

1. 試料上に集束光を照射し、その試料の透過側に離間して配置した光ビーム位置検出器により、試料を透過した光束の中心位置を表す信号を検出して、その信号から映像信号を得ると共に、前記試料に対して前記集束光を相対的に２次元走査させ、その走査信号と前記映像信号に基づいて前記試料の屈折率勾配分布像又はブラウン運動分布像を画像化することを特徴とする走査型レーザ顕微法。
2. 試料の裏面に平面鏡を配置し、試料の表面から試料上に集束光を照射し、その試料の表面の反射側に離間して配置した光ビーム位置検出器により、試料を透過し前記平面鏡で反射され再び試料を透過した光束の中心位置を表す信号を検出して、その信号から映像信号を得ると共に、前記試料に対して前記集束光を相対的に２次元走査させ、その走査信号と前記映像信号に基づいて前記試料の屈折率勾配分布像又はブラウン運動分布像を画像化することを特徴とする走査型レーザ顕微法。
3. レーザ光源からのレーザ光を試料載置台上に載置された試料に集束させる対物レンズと、試料の透過側であって試料から離間した位置に配置され、前記試料を透過したレーザ光を受けてその光束の中心位置を表す信号を出す光ビーム位置検出器と、前記光ビーム位置検出器から出力された光束の中心位置を表す信号から映像信号を出す映像信号発生手段と、前記試料に対して集束光を相対的に２次元走査させる走査手段と、前記走査手段を駆動する走査信号と前記映像信号に基づいて前記試料の屈折率勾配分布像又はブラウン運動分布像を画像化して表示する表示手段とを備えていることを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
4. レーザ光源からのレーザ光を試料載置台上に載置された試料に集束させると共に、試料を透過し試料の裏面に配置された平面鏡で反射され再び試料を透過した光束を反対側に導く対物レンズと、前記対物レンズの試料と反対側の光路中に配置され試料から戻った光束を分離する分離手段で分離された光路中に配置され、前記試料から戻った光束を受けてその光束の中心位置を表す信号を出す光ビーム位置検出器と、前記光ビーム位置検出器から出力された光束の中心位置を表す信号から映像信号を出す映像信号発生手段と、前記試料に対して集束光を相対的に２次元走査させる走査手段と、前記走査手段を駆動する走査信号と前記映像信号に基づいて前記試料の屈折率勾配分布像又はブラウン運動分布像を画像化して表示する表示手段とを備えていることを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
5. 前記走査手段が、前記試料載置台を試料面に沿って２次元走査させる試料載置台走査手段からなることを特徴とする請求項３又は４記載の走査型レーザ顕微鏡。
6. 前記走査手段が、前記対物レンズに入射するレーザ光の角度を２次元走査させる２次元光偏向手段からなることを特徴とする請求項３又は４記載の走査型レーザ顕微鏡。
7. 前記２次元光偏向手段は、前記光ビーム位置検出器と光学的に共役な位置に配置されていることを特徴とする請求項６記載の走査型レーザ顕微鏡。
8. 前記映像信号発生手段が、前記光ビーム位置検出器から出力された光束の中心位置を表す信号の周波数成分を分割し、その直流成分又は特定の周波数帯成分に基づいて映像信号を出すように構成されていることを特徴とする請求項３から７の何れか１項記載の走査型レーザ顕微鏡。
9. 前記光ビーム位置検出器が４分割フォトダイオードからなることを特徴とする請求項３から８の何れか１項記載の走査型レーザ顕微鏡。

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