KR20110029475A - 공초점 레이저 주사 현미경 - Google Patents

Abstract

본 발명은 공초점 레이저 주사 현미경에 관한 것이다. 보다 상세하게는 시료에 대한 3차원 이미지를 관찰하는 것이 가능한 공초점 레이저 주사 현미경에 관한 것이다. 본 발명은 여기광을 생성하여 관찰하고자 하는 시료 측으로 조사하는 여기광 생성부, 상기 시료 측으로 조사되는 여기광의 조사각을 조절하여 상기 시료 측으로 조사되는 여기광이 시료 면을 스캔하도록 하는 광스캔부, 상기 입사각이 조절된 여기광을 집광한 후 상기 시료 측으로 콜리메이팅(Collimating)하는 콜리메이션부, 상기 콜리메이션부의 중간 초점 거리에 위치하여 상기 집광된 여기광이 상기 시료의 미리 결정된 영역에만 조사되도록 하는 광마스크부, 상기 콜리메이션부를 통과한 여기광을 집광한 후 상기 시료 측으로 조사하여 상기 시료 상에 시료 초점면을 형성하는 대물렌즈부, 상기 여기광 생성부와 상기 광스캔부 사이에 위치하여 상기 시료 측으로 조사되는 여기광과 상기 시료에 조사된 여기광에 의해 발생되어 상기 시료로부터 상기 여기광 생성부 측으로 조사되는 신호광을 분리하는 광분배부, 및 상기 광분배부에서 분리된 신호광을 검출하여 상기 시료의 이미지를 획득하는 광검출부를 포함하는 것을 특징으로 한다.

공초점, 현미경, 레이저 주사, 광마스크

Description

공초점 레이저 주사 현미경{Confocal laser scanning microscope}

본 발명은 공초점 레이저 주사 현미경에 관한 것이다. 보다 상세하게는 관찰하고자 하는 시료에 빛을 스캔한 후 이에 따라 발생하는 광신호를 검출하여 시료에 대한 3차원 이미지를 관찰하는 것이 가능한 공초점 레이저 주사 현미경에 관한 것이다.

일반적으로 생물학 분야에서 미세한 시료의 표면 관찰을 목적으로 광학 현미경이 주로 사용되었으나, 최근에는 생물학 분야뿐만 아니라 신약 개발과 의학 응용분야를 포함한 생명과학 분야가 활발해짐에 따라 살아있는 세포나 조직을 관찰하기 위하여 광학 현미경을 대체한 형광 현미경이 주로 사용되고 있는 추세이다.

형광 현미경은 시료의 고유 형광 특성이 없을 때 특정 파장의 빛만 흡수할 수 있는 형광 물질을 관찰하고자 하는 시료의 영역에 부착시키고 빛을 비추면 형광을 발하는 원리를 이용하여 광신호를 발생시키는 빛인 여기광보다 긴 파장에서 발생하는 형광을 검출하여 시료의 형광 물질 분포 이미지를 얻는 방식으로 살아있는 세포나 조직을 관찰한다.

또한, 시료에 대한 3차원 이미지를 획득한 후 분석하여 시료의 구조적인 이 해와 실시간으로 살아있는 시료에 대한 생리학적 기능 연구를 수행할 목적으로 형광 형미경의 일종인 공초점 레이더 주사 현미경과 같은 스캔 방식의 현미경이 필수적으로 사용된다.

이러한 공초점 레이저 주사 현미경은 레이저와 광검출기가 하나의 초점면을 공유하도록 광검출기 앞쪽의 시료 초점면에 대한 이미지면에 조리개를 위치시켜 시료 초점면과 맞지 않는 광신호를 제거한 후 시료 초점면과 일치하는 광신호만 검출하는 방식을 사용한다.

따라서, 기존의 형광 현미경과는 달리 공초점 레이저 주사 현미경의 경우 분해능이 향상되고 광 절편이 가능하게 되어 시료에 대한 3차원 이미지를 얻을 수 있으며, 이광자 흡수나 간섭성 반-스톡스 라만 산란(Coherent anti-strokes raman scattering)과 같은 비선형 현상을 이용하여 기존의 형광 현미경으로 관찰하기 힘든 다양한 시료를 관찰할 수 있다.

그러나, 공초점 레이저 주사 현미경은 초점면 상의 한 점의 광신호만 조리개를 통과하여 광검출기에 의해 검출되므로 시료에 대한 이미지를 생성하려면 시료의 관찰 영역에 여기광을 주사하는 광스캐너나 시료를 움직이는 스테이지 스캐너가 필수적으로 요구된다.

또한, 공초점 레이저 주사 현미경의 경우 여기광이 대물렌즈에 의해 상대적으로 좁은 면적에 높은 에너지로 조사되기 때문에 시료에 염색된 형광물질이나 시료 자체가 높은 에너지에 의해 변형되거나 손상될 확률이 높아져 시료에 대한 장시간의 관찰이 용이하지 못한 문제점이 있다.

따라서, 상기와 같은 문제점을 해결함으로써 여기광에 의한 시료의 광독성과 시료에 염색된 형광물질의 형광 성질을 잃게 되는 광탈색을 최소화하여 외부 자극에 민감하게 반응하는 세포의 분열과정, 생리활동 등을 지속적으로 실시간 이미징 할 수 있도록 하기 위하여 공초점 레이저 주사 현미경에 기계적인 셔터, 광변조기, 또는 펄스 여기광 등을 사용하여 스캔 구간에서 공간적 또는 시간적으로 시료에 흡수되는 여기광을 조절하는 방법이 개발되었다.

먼저, 광변조기를 사용하는 경우는 이미지의 라인을 구성하는 각 엑스축 스캔 구간 단위로 여기광의 세기를 변조시켜 여기광이 통과하는 스캔 구간동안 데이터를 수집하게 되는데, 일반적으로 데이터 수집이 이루어지는 순방향의 엑스축 스캔 구간동안 여기광의 세기를 유지시키고 데이터 수집이 이루어지지 않는 역방향(회귀)의 엑스축 스캔 구간동안 여기광의 세기를 줄여 시료나 형광 물질의 손상을 줄이는 방식을 사용한다.

다음으로, 펄스 여기광을 사용하는 경우는 형광 물질의 전자가 여기되면 여기 상태일 때 산소분자와 쉽게 반응하게 되고 그 결과로 형광성을 잃게 되는 현상을 고려하여 형광 물질의 전자를 지속적으로 여기시키지 않으므로 확률적으로 여기 상태의 전자가 산소 분자와 결합하는 것을 줄여 형광 물질의 분자 구조적 변형을 줄이는 방식을 사용한다.

또한, 시간에 따라 에너지가 변하는 펄스 여기광은 앞에 언습한 공간상 에너지의 흡수를 조절하는 방법과 조합하므로 여기광에 의한 시료의 손상인 광독성과 형광 물질의 변형인 광탈색을 최소화하는 것이 가능해진다.

그러나, 상기 방법들의 경우에도 시료에 대한 스캔 속도를 빠르게 하기 위하여 고속 스캔 거울을 사용하는 공초점 레이저 조사 현미경의 특성상 엑스축 스캔 영역의 좌측 끝과 우측끝 다시 말해서 엑스축 스캔 거울의 방향 전환점에서 큰 회전력이 발생하여 고속 스캔 거울의 회전 속도가 느려지는 현상이 발생하는 경우 이미지의 왜곡과 시료의 불균일한 손상을 방지하는 것이 용이하지 못한 문제점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서 광마스크를 이용하여 시료에 대한 스캔 중 스캔 방향 전환 지점에서 발생하는 시료 이미지의 왜곡 현상과 시료의 손상을 최소화하는 것이 가능한 공초점 레이저 주사 현미경을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 공초점 레이저 주사 현미경은 여기광을 생성하여 관찰하고자 하는 시료 측으로 조사하는 여기광 생성부, 상기 시료 측으로 조사되는 여기광의 조사각을 조절하여 상기 시료 측으로 조사되는 여기광이 시료 면을 스캔하도록 하는 광스캔부, 상기 입사각이 조절된 여기광을 집광한 후 상기 시료 측으로 콜리메이팅(Collimating)하는 콜리메이션부, 상기 콜리메이션부의 중간 초점 거리에 위치하여 상기 집광된 여기광이 상기 시료의 미리 결정된 영역에만 조사되도록 하는 광마스크부, 상기 콜리메이션부를 통과한 여기광을 집광한 후 상기 시료 측으로 조사하여 상기 시료 상에 시료 초점면을 형성하는 대물렌즈부, 상기 여기광 생성부와 상기 광스캔부 사이에 위치하여 상기 시료 측으로 조사되는 여기광과 상기 시료에 조사된 여기광에 의해 발생되어 상기 시료로부터 상기 여기광 생성부 측으로 조사되는 신호광을 분리하는 광분배부, 및 상기 광분배부에서 분리된 신호광을 검출하여 상기 시료의 이미지를 획득하는 광검출부를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 광마스크부는 상기 여기광이 상기 시료의 미리 결정된 영역에만 조사되도록 상기 여기광을 통과시키는 광통과부와 상기 광통과부의 외주면을 감싸는 형태로 구비되고 상기 제1 렌즈와 상기 제2 렌즈의 공통 초점 거리에 위치하여 상기 여기광이 상기 시료 측으로 조사되는 것을 차단하는 광차단부를 포함할 수 있다.

또한, 상기 광차단부는 상기 광차단부에서 반사되는 여기광이 상기 광스캔부 측으로 조사되는 것을 방지하도록 미리 결정된 측면각을 갖는 광반사턱이 형성될 수 있다.

또한, 상기 미리 결정된 측면각은 40도에서 50도 사이의 각일 수 있다.

또한, 상기 광통과부는 상기 시료 스캔 면적의 80 퍼센트에서 90 퍼센트 사이의 면적을 가질 수 있다.

본 발명에 의하면 시료의 미리 결정된 영역에만 여기광이 조사되도록 하는 광마스크를 이용하여 시료 평면에 대한 스캔 과정 중 스캔 방향 전환시 발생가능한 이미지의 왜곡과 과도한 여기광의 조사로 인한 시료의 광독성과 광탈색을 최소화할 수 있다.

또한, 시료 평면에 대한 좌우측 방향 스캔이 좌측에서 우측으로 이루어진 후 다시 우측에서 좌측으로 두번 이루어지므로 종래의 공초점 레이저 주사 현미경에 비해 시료에 대한 이미지 생성 속도를 2배 향상시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면들을 참조하여 상세하게 설명한다. 우선 각 도면의 구성 요소들에 참조 부호를 첨가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호들을 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명할 것이나, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정되거나 제한되지 않고 당업자에 의해 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 공초점 레이저 주사 현미경의 블록도 이다.

도 1에 도시된 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 공초점 레이저 주사 현미경(1)은 여기광 생성부(10), 광분배부(20), 광스캔부(30), 콜리메이션부(40), 광마스크부(50), 대물렌즈부(60), 광검출부(70), 제3 렌즈(80), 및 조리개(90)를 포함한다.

여기광 생성부(10)는 여기광(L1)을 생성하여 관찰하고자 하는 시료(S) 측으로 조사한다.

이때, 여기광(L1)은 가시 영역 또는 자외선 영역의 레이저일 수 있으며, 시료(S)는 여기광(L1)에 의해 여기되는 형광 물질이 부착될 수 있다.

광분배부(20)는 시료(S) 측으로 조사되는 여기광(L1)과 여기광(L1)이 시료(S)에 조사된 후 시료(S) 상에 형성되는 시료 초점면에 부착된 형광 물질이 여기 광(L1)에 의해 여기되어 생성되며, 상기 시료 초점면으로부터 여기광 생성부(10) 측으로 조사되는 신호광을 분리한다.

이때, 광분배부(20)는 여기광 생성부(10)와 광스캔부(30)사이에 위치할 수 있다.

광스캔부(30)는 광분배부(20)에서 분배되어 시료(S) 측으로 조사되는 여기광(L1)의 조사각을 조절하여 시료(S) 측으로 조사되는 여기광(L1)이 시료(S) 면을스캔하도록 한다.

이때, 광스캔부(30)는 미리 결정되어 있는 제어 신호에 따라 회전하여 여기광(L1)의 조사각을 조절하는 방식으로 여기광(L1)이 시료(S) 면에 대한 좌우측 방향 스캔을 수행하도록 하는 제1 스캔 거울(32)과 제1 스캔 거울(32)로부터 이격되며 상기 미리 결정되어 있는 제어 신호에 따라 회전하여 여기광(L1)이 시료(S) 면에 대한 상하측 방향 스캔을 수행하도록 하는 제2 스캔 거울(34)을 포함한다.

예를 들어, 광스캔부(30)로 여기광(L1)이 조사되는 경우 제2 스캔 거울(34)을 회전시켜 여기광(L1)의 조사각을 조절하게 되면 여기광(L1)의 조사 경로가 L2와 같이 변경될 수 있다.

또한, 상기 미리 결정되어 있는 제어 신호는 4KHz, 8KHz, 또는 16KHz 등의 주파수를 갖는 정현파 신호일 수 있다.

또한, 시료(S) 면에 대한 좌우측 방향 스캔은 상기 정현파 신호의 반주기 동안 제1 스캔 거울(32)이 회전하여 여기광(L1)의 시료(S) 면에 대한 조사 위치가 좌측에서 우측으로 이동함에 따라, 여기광(L1)에 의해 시료(S) 상에 형성되는 시료 초점면의 위치 또한 좌측에서 우측 방향으로 이동하여 시료(S) 면에 대한 1차 좌우측 방향 스캔이 수행될 수 있다.

그리고, 상기 정현파 신호의 다음 반주기 동안 제1 스캔 거울(32)이 다시 회전하여 여기광(L1)의 시료(S) 면에 대한 조사 위치가 우측에서 좌측으로 이동함에 따라, 여기광(L1)에 의해 시료(S) 상에 형성되는 시료 초점면의 위치 또한 우측에서 좌측 방향으로 이동하여 시료(S) 면에 대한 2차 좌우측 방향 스캔이 수행될 수 있다.

또한, 시료(S) 면에 대한 1차 좌우측 방향 스캔과 2차 좌우측 방향 스캔이 수행된 후 상기 정현파 신호의 반주기 동안 제2 스캔 거울(34)이 회전하여 여기광(L1)의 시료(S) 면에 대한 조사 위치가 상측에서 하측으로 이동하여 시료(S) 면에 대한 상하측 방향 스캔이 수행된 후 다시 제1 스캔 거울(32)이 회전하여 시료(S) 면에 대한 1차 좌우측 방향 스캔과 2차 좌우측 방향 스캔을 수행하는 방식으로 이루어진다.

또한, 시료(S1)에 대한 3차원 스캔을 수행하는 경우에는 광스캔부(30)의 동작에 따라 시료(S)가 놓여있는 플레이트(P)나 대물렌즈부(60)의 높이를 조절하여 여기광(L1)에 의해 시료(S)에 형성되는 시료 초점면의 깊이를 조절하는 방식을 사용하는 것이 가능하다.

또한, 제1 스캔 거울(32)과 제2 스캔 거울(34)은 갈바노미터 미러(Galvanometer Mirror)일 수 있다.

또한, 도면 상에 도시되지는 않았지만 광스캔부(30)는 제1 스캔 거울(32)과 제2 스캔 거울(34)의 회전을 위한 구동부와 상기 미리 결정된 제어 신호를 상기 구동부에 전송하기 위한 제어 신호 전송부를 더 포함할 수 있다.

콜리메이션부(40)는 광스캔부(30)를 통과하여 입사각이 조절된 여기광(L1)을 집광한 후 시료(S) 측으로 콜리메이팅(Collimatiing)한다.

이때, 콜리메이션부(40)는 광스캔부(30)를 통과하여 입사각이 조절된 여기광(L1)을 집광하는 제1 렌즈(42)와 제1 렌즈(42)로부터 이격되어 제1 렌즈(42)에서 집광된 여기광(L1)을 콜리메이팅하는 제2 렌즈(44)를 포함한다.

또한, 제1 렌즈(42)와 제2 렌즈(44)는 스캔 렌즈와 튜브 렌즈일 수 있다.

광마스크부(50)는 콜레메이션부(40)의 중간 초점 거리에 위치하여 제1 렌즈(42)에서 집광된 여기광(L1)이 시료(S)의 미리 결정된 영역에만 조사되도록 한다.

이때, 상기 중간 초점 거리는 제1 렌즈(42)와 제2 렌즈(44)의 공통 초점 거리일 수 있으며, 광마스크부(50)의 상세한 구조는 이하 도 2a와 도 2b에서 설명하도록 한다.

대물렌즈부(60)는 콜리메이션부(40)를 통과한 여기광(L1)을 집광한 후 시료(S) 측으로 조사하여 시료(S) 상에 시료 초점면을 형성한다.

이때, 대물렌즈부(60)는 색수차를 고려한 형광용 대물렌즈일 수 있다.

광검출부(70)는 광분배부(20)로부터 분리된 상기 신호광을 검출하여 시료(S)의 이미지를 획득한다.

이때, 광검출부(70)는 PMT(Photo-Multiplier Tube), APD(Avalanche Photo Diode), 또는 CCD(Charge-Coupled Device)일 수 있다.

제 3 렌즈(80)는 광분배부(20)와 광검출부(70) 사이에 위치하여 광분배부(20)에서 분리된 상기 신호광을 집광하며, 제3 렌즈(80)는 볼록렌즈일 수 있다.

조리개(90)는 제3 렌즈(80)의 초점거리만큼 광검출부(70) 측으로 이격되어 상기 집광된 신호광을 선택적으로 광검출부(70) 측으로 조사한다.

도 2a는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 광마스크부의 평면도, 도 2b는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 광마스크부의 단면도이다.

도 2a와 도 2b에 도시된 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 광마스크부(50)는 광통과부(52)와 광차단부(54)를 포함한다.

광통과부(52)는 여기광(L1)이 시료(S)의 미리 결정된 영역에만 조사되도록 여기광(L1)을 통과시키고, 광차단부(54)는 광통과부(52)의 외주면을 감싸는 형태로 구비되고 콜리메이션부(40)의 중간 초점 거리인 제1 렌즈(42)와 제2 렌즈(44)의 공통 초점 거리에 위치하여 여기광(L1)이 시료(S) 측으로 조사되는 것을 차단한다.

이때, 광차단부(54)는 광차단부(54)에서 반사되는 여기광(L1)이 제1 렌즈(42)를 거쳐 광스캔부(30) 측으로 조사되는 것을 방지하기 위하여 미리 결정된 측면각을 갖는 광반사턱(56)이 형성될 수 있다.

여기에서, 광차단부(54)에 광반사턱(56)을 형성하는 이유는 광차단부(54)에서 반사되는 여기광(L1)이 제1 렌즈(42)를 거쳐 광스캔부(30) 측으로 조사되면 광검출부(70)에서 획득되는 시료(S)의 이미지에 노이즈가 발생할 수 있어 이를 방지하기 위함이다.

또한, 상기 미리 결정된 측면각 Φ는 제1 렌즈(42)에 의해 집광되는 여기광(L1)의 집광각 θ에 의해 결정될 수 있으며 40도에서 50도 사이의 각인 것이 바람직하며, 예를 들어 상기 미리 결정된 측면각 Φ는 45도 일 수 있다.

이때, 상기와 같이 제시된 측면각 Φ의 범위는 광차단부(54)에서 반사되는 여기광(L1)이 광스캔부(30) 측으로 조사되지 않고 광반사턱(56)에 의해 광마스크부(50)에 대하여 수평으로 반사되어 광스캔부(30) 측으로 조사되는 것을 방지하기 위한 최소한의 범위로써 제시하는 각도이다.

또한, 광통과부(52)는 광스캔부(30)에서 조사각이 조절되는 여기광(L1)에 의해 스캔이 이루어지는 시료(S)의 스캔 면적의 80 퍼센트에서 90 퍼센트 사이의 면적을 갖는 것이 바람직하며, 예를 들어 광통과부(52)의 면적은 시료(S)의 스캔 면적의 88 퍼센트 일 수 있다.

이때, 상기와 같이 제시된 광통과부(54)의 면적 범위는 이미지의 왜곡이 발생하지 않은 시료(S)의 이미지를 획득가능한 정확한 범위로써 제시하는 면적이다.

또한, 광통과부(52)의 형태를 도 2a에 도시된 바와 같은 사각 형태가 아닌 원형 형태 또는 삼각 형태와 같은 다양한 형태로 형성하거나 시료(S)의 특정 지점을 관찰하고자 하는 경우 시료(S)의 특정 지점에 맞게 적어도 한 개 이상의 광통과부(52)를 구비하는 것이 또한 가능하다.

여기에서, 도 2a와 도 2b에 도시된 바와 같은 구조를 갖는 광마스크부(50)를 제1 렌즈(42)와 제2 렌즈(44)의 공통 초점 거리에 위치시키는 이유는 다음과 같다.

광스캔부(30)에서 제1 스캔 거울(32)과 제2 스캔 거울(34)을 이용하여 시 료(S) 면에 대한 좌우측 방향 스캔을 수행하는 과정에서 스캔 방향이 좌측에서 우측 또는 우측에서 좌측으로 변화하는 방향 전환점에서 제1 스캔 거울(32)에 큰 회전력이 발생하여 제1 스캔 거울(32)의 회전 각속도가 상기 방향 전환점이 아닌 지점에 비해 4배 정도 느려지는 현상이 발생할 수 있다.

일반적으로 시료(S)의 이미지를 획득하는 과정에 있어서, 일정한 시간 간격으로 시료(S)의 스캔 영역에 대한 샘플링 과정을 거친 후 샘플링 데이터들로부터 시료(S)에 대한 이미지를 획득하게 되는데 상기와 같이 제1 스캔 거울(32)의 회전 속도가 느려지는 방향 전환점에서 획득되는 시료(S)에 대한 이미지의 숫자가 방향 전환점을 제외한 다른 영역에서 획득되는 이미지의 숫자보다 많아지므로 시료(S)의 이미지에 대한 왜곡 현상이 발생할 수 있다.

또한, 시료(S) 면 중 상기 방향 전환점에 매칭되는 스캔 영역에 조사되는 여기광(L1)의 입사량이 상기 방향 전환점을 제외한 영역의 여기광(L1)의 입사량에 비증가하므로 시료(S)에 대한 광탈색 정도가 커질 수 있다.

따라서, 제1 스캔 거울(32)의 회전 속도가 느려지는 스캔 영역의 방향 전환점에 여기광(L1)이 조사되는 것을 차단하는 광차단부(54)를 형성하고 상기 스캔 영역의 방향 전환점을 제외한 시료(S) 면의 다른 스캔 영역에는 여기광(L1)이 조사되도록 광통과부(52)를 형성함으로써 광검출부(70)에서 획득되는 시료(S) 이미지에 대한 왜곡 현상이나 여기광(L1)의 과도한 조사로 인한 시료(S)의 손상을 방지할 수 있다.

또한, 시료(S)의 좌우측 스캔 영역에 대한 스캔을 좌측에서 우측으로 수행한 후 다시 우측에서 좌측으로 수행하여 시료(S) 이미지의 생성 속도를 2배 향상시키는 것이 가능하다.

이때, 시료(S)의 좌우측 스캔 영역에 대한 스캔을 우측에서 좌측으로 수행하는 경우에 광검출부(70)에서 검출되는 신호광을 시간상 역순으로 다시 정렬하여 이미지를 생성해야 한다.

또한, 광검출부(70)에서 검출된 신호광을 고속 이미지 생성이 가능한 프레임 그래버(Frame grabber)를 이용하여 데이터를 수집하는 경우 상기 검출된 신호광은 교류 커플링된 아날로그 신호이므로 상기 아날로그 신호를 디지털 신호로 변환하기 위한 양자화 과정에서 아날로그 신호의 영전압 레벨의 기준이 요구된다.

광검출부(70)를 CCD로 사용하는 경우 영 전압레벨의 정보가 포함된 표준화된 비디오 신호 형식으로 출력 신호를 프레임 그래버에 전송하게 되지만 광검출부(70)를 PMT 또는 APD로 사용하는 경우 상기 검출된 아날로그 신호는 프레임 그래버가 정확히 표시할 수 있는 비디오 신호인 영 전압 레벨의 정보가 포함된 신호가 아니다.

그러나, 광마스크부(50)의 광차단부(54)의 경우 여기광(L1)이 통과하지 않는 부분이므로 광검출부(70)를 PMT 또는 APD로 사용하는 경우에도 상기 검출된 후 프래임 그래버로 출력되는 출력 신호의 맨 앞과 끝이 자연적으로 영 전압 레벨이 되기 때문에 프레임 그래버가 인식할 수 있는 비디오 신호로 출력 신호의 전송이 가능해진다.

도 1 내지 도 2b를 참조하여 공초점 레이저 주사 현미경(1)의 동작 과정을 설명하면 다음과 같다.

여기광 생성부(10)에서 여기광(L1)을 생성하여 관찰하고자 하는 시료(S) 측으로 조사하면 여기광(L1)은 광분배부(20)를 통과한 후 광스캔부(30)에 조사된다.

광스캔부(30)에 조사된 여기광(L1)은 미리 결정되어 있는 제어 신호에 따라 회전하는 제1 스캔 거울(32)과 제2 스캔 거울(34)에 의해 조사각이 조절된 후 콜리메이션부(40)에 조사된다.

콜리메이션부(40)에 조사된 상기 조사각이 조절된 여기광(L1)은 제1 렌즈(42)에서 집광된 후 제1 렌즈(42)와 제2 렌즈(44)의 공통 초점면에 위치한 광마스크부(50)로 도달하여 광통과부(52)에 도달한 여기광(L1)은 광마스크부(50)를 통과하여 제2 렌즈(42)에 도달한 후 제2 렌즈(44)에서 콜리메이팅되어 대물렌즈부(60)에 조사된다.

그리고, 광차단부(54)에 도달한 여기광(L1)은 광차단부(54)에 형성된 광반사턱(56)에 의해 광마스크부(50)에 대하여 수평 방향으로 반사되므로 광차단부(54)에 도달한 여기광(L1)이 제1 렌즈(42)를 거쳐 광스캔부(30) 측으로 조사되는 것을 방지할 수 있다.

대물렌즈부(60)에 조사된 여기광(L1)은 대물렌즈부(60)에서 집광되어 시료(S) 상에 시료 초점면을 형성하며, 여기광(L1)에 의해 시료(S)에 첨가된 형광 물질이 여기되어 상기 시료 초점면으로부터 발생하는 신호광이 대물렌즈부(60)에서 집광된 후 여기광(L1)이 조사된 방향과 반대 방향으로 제2 렌즈(44), 광마스크부(50)의 광통과부(52), 제1 렌즈(44), 제2 회전 거울(34), 및 제1 회전 거울(32) 을 통과하여 광분배부(20)에 조사된다.

광분배부(20)는 여기광 생성부(10)로부터 조사되는 여기광(L1)과 여기광(L1)이 조사된 시료(S)로부터 조사되는 신호광을 분리하여 신호광이 광검출부(70) 측으로 조사되도록 하며 광검출부(70) 측으로 조사된 신호광은 제3 렌즈(80)에서 집광된 후 제3 렌즈(80)의 초점거리만큼 이격된 조리개(90)에서 공초점의 원리에 의해 대물렌즈부(60)의 초점면이 아닌 곳에서 발생한 노이즈가 제거되어 광검출부(70)로 조사되며, 광검출부(70)에서는 상기 신호광을 검출한 후 광스캔부(30)의 좌우측 방향 스캔 제어 신호와 상하측 방향 스캔 제어 신호에 맞추어 상기 검출된 신호광을 시간 순서대로 배열하여 시료(S)의 이미지를 획득할 수 있다.

도 3은 종래의 공초점 레이저 주사 현미경과 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 공초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 관찰된 시료 이미지의 비교도 이다.

도 3의 (a)에 도시된 공초점 종래의 레이저 주사 현미경을 이용하여 관찰된 시료 이미지의 경우 시료에 대한 스캔 과정에서 방향 전환점에 해당하는 시료 이미지의 좌우 양끝에서 광탈색이 심하게 일어나는 반면, 도 3의 (b)에 도시된 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 공초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 관찰된 시료 이미지의 경우 시료에 대한 스캔 과정에서 방향 전환점에 해당하는 시료 이미지의 좌우 양끝에 조사되는 여기광(L1)이 광마스크부(52)에 의해 차단되므로 도 3의 (a)와 비교시에 광탈색 현상이 거의 관찰되지 않는 것을 확인할 수 있다.

본 발명의 공초점 레이저 주사 현미경(1)은 콜리메이션부(40)의 중간 초점 거리에 위치하여 여기광 생성부(10)로부터 시료(S) 측으로 조사되는 여기광(L1)을 시료(S)의 미리 결정된 영역에만 조사되도록 하는 광마스크부(50)를 설치한 구조로써 광스캔부(30)의 동작에 의해 여기광(L1)의 조사각이 조절되어 이루어지는 시료(S) 면에 대한 스캔 과정 중 방향 전환점에서 발생하게 되는 스캔 속도의 저하에 따른 시료(S) 이미지의 왜곡과 과도한 여기광(L1)의 조사에 따른 시료(S)의 손실을 방지하는 것이 가능해진다.

이상의 설명은 본 발명의 기술적 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정, 변경, 및 치환이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예 및 첨부된 도면들에 의해서 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구 범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

본 발명에 의하면 시료를 스캔하는 여기광에 의한 시료의 손상을 줄이고 데이터 수집 속도를 향상시켜 시료에 대한 실시간 이미징의 정확도를 높이는 것이 가능하므로 살아있는 세포 또는 조직 내부의 단백질 또는 칼슘 이온의 빠른 변화를 관찰하기 위한 공초점 레이저 조사 현미경으로 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 공초점 레이저 주사 현미경의 블록도,

도 2a는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 광마스크부의 평면도,

도 2b는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 광마스크부의 단면도, 및

도 3은 종래의 공초점 레이저 주사 현미경과 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 공초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 관찰된 시료 이미지의 비교도 이다.

<도면의 주요 부위에 대한 간단한 설명>

(1) : 공초점 레이저 주사 현미경 (10) : 여기광 생성부

(20) : 광분배부 (30) : 광스캔부

(32) : 제1 스캔거울 (34) : 제2 스캔거울

(40) : 콜리메이션부 (42) : 제1 렌즈

(44) : 제2 렌즈 (50) : 광마스크부

(52) : 광통과부 (54) : 광차단부

(56) : 광반사턱 (60) : 대물렌즈부

(70) : 광검출부 (80) : 제3 렌즈

(90) : 조리개

Claims (5)

1. 여기광을 생성하여 관찰하고자 하는 시료 측으로 조사하는 여기광 생성부;

   상기 시료 측으로 조사되는 여기광의 조사각을 조절하여 상기 시료 측으로 조사되는 여기광이 시료 면을 스캔하도록 하는 광스캔부;

   상기 입사각이 조절된 여기광을 집광한 후 상기 시료 측으로 콜리메이팅(Collimating)하는 콜리메이션부;

   상기 콜리메이션부의 중간 초점 거리에 위치하여 상기 집광된 여기광이 상기 시료의 미리 결정된 영역에만 조사되도록 하는 광마스크부;

   상기 콜리메이션부를 통과한 여기광을 집광한 후 상기 시료 측으로 조사하여 상기 시료 상에 시료 초점면을 형성하는 대물렌즈부;

   상기 여기광 생성부와 상기 광스캔부 사이에 위치하여 상기 시료 측으로 조사되는 여기광과 상기 시료에 조사된 여기광에 의해 발생되어 상기 시료로부터 상기 여기광 생성부 측으로 조사되는 신호광을 분리하는 광분배부; 및

   상기 광분배부에서 분리된 신호광을 검출하여 상기 시료의 이미지를 획득하는 광검출부를 포함하는 것을 특징으로 하는 공초점 레이저 주사 현미경.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 광마스크부는 상기 여기광이 상기 시료의 미리 결정된 영역에만 조사되도록 상기 여기광을 통과시키는 광통과부와 상기 광통과부의 외주면을 감싸는 형태 로 구비되고 상기 제1 렌즈와 상기 제2 렌즈의 공통 초점 거리에 위치하여 상기 여기광이 상기 시료 측으로 조사되는 것을 차단하는 광차단부를 포함하는 것을 특징으로 하는 공초점 레이저 주사 현미경.
3. 제 2항에 있어서,

   상기 광차단부는 상기 광차단부에서 반사되는 여기광이 상기 광스캔부 측으로 조사되는 것을 방지하도록 미리 결정된 측면각을 갖는 광반사턱이 형성되는 것을 특징으로 하는 공초점 레이저 주사 현미경.
4. 제 3항에 있어서,

   상기 미리 결정된 측면각은 40도에서 50도 사이의 각인 것을 특징으로 하는 공초점 레이저 주사 현미경.
5. 제 2항에 있어서,

   상기 광통과부는 상기 시료 스캔 면적의 80퍼센트에서 90퍼센트 사이의 면적을 갖는 것을 특징으로 하는 공초점 레이저 주사 현미경.

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