CN112292394A

CN112292394A - 用于改善的功能性和可制造性的通用或归一化抗体框架

Info

Publication number: CN112292394A
Application number: CN201980038135.8A
Authority: CN
Inventors: F·J·R·D·库托; M·S·李
Original assignee: Ventana Medical Systems Inc
Current assignee: Ventana Medical Systems Inc
Priority date: 2018-06-08
Filing date: 2019-06-04
Publication date: 2021-01-29
Also published as: US20210221915A1; JP2023025031A; WO2019233984A1; EP3802588A1; JP2021525779A

Abstract

本发明提供了设计和制造用于兔单克隆抗体的通用或归一化序列模板的方法，所述兔单克隆抗体用于诊断应用。本发明进一步提供了优化期望的抗体特性的方法，所述期望的抗体特性为诸如热稳定性、长期稳定性、表达、脱氨基作用/氧化作用及/或聚集作用。本发明进一步提供了通用或归一化兔单克隆抗体模板或框架以及由其衍生的抗体。

Description

用于改善的功能性和可制造性的通用或归一化抗体框架

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2018年6月8日提交的美国临时专利申请No.62/682,795的优先权，该美国临时专利申请的内容全文以引用方式并入本文。

作为符合ASCII的文本文件(.TXT)提交的序列表的引用

以符合ASCII的文本文件(标题为“P34814WO_Sequence_ST25”)的形式创建于2019年4月26日且大小为22104字节)的序列表与本申请同时提交，并且序列表的全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本发明提供了通过修饰可变区来设计用于制造兔单克隆抗体的通用或归一化序列模板的方法，该兔单克隆抗体用于诊断应用。本发明进一步提供了优化期望的抗体特性的方法，该期望的抗体特性为诸如热稳定性、长期稳定性、表达、脱氨基作用/氧化作用及/或聚集作用，该特性会对诊断测定产生不利影响，但不会对与靶标的结合特异性产生不利影响。本发明进一步提供了通用或归一化抗体模板或框架以及由其衍生的兔单克隆抗体。

背景技术

目前持续需要开发改善可重复的缀合比的方法以及用于针对稳定性和可开发性的标准化抗体框架区的方法，以用于诊断测定(诸如免疫组织化学)。

原则上，抗体工程方法可用于使抗体模板(诸如框架和恒定区)标准化，同时也保持抗体特异性和亲和力。

抗体互补决定区(“CDR”)通常不经修饰，因为它们是针对靶抗原的抗体特异性和亲和力的主要决定因素。然而，在一些情况下，CDR序列本身可能为抗体不稳定性的来源。

实际上，积累的抗体工程知识中的大部分涉及人和小鼠抗体。然而，兔单克隆抗体在若干诊断应用中既用作一级抗原检测试剂，也用作二级信号生成或放大试剂。

一级抗体用于选择具有异常特异性的特定肿瘤标志物，并且二级抗体用于生成检测信号。每种抗体在特异性、亲和力、生产水平、稳定性和缀合适宜性方面均是独特的。此独特性源于氨基酸序列并对诊断测定开发和制造标准化提出了挑战。本发明人已利用蛋白质工程以解决此问题，并且特别将他们的努力集中在标准化抗体框架区域，以用于稳定性以及，更普遍的抗体可开发性。

使用兔单克隆抗体具有许多优点。通过使用兔单克隆抗体，这样就避免了某些蛋白质在人和小鼠中被识别为自身抗原的问题。此外，兔单克隆抗体对小表位具有改善的免疫应答，识别更加多样范围的表位，并且对小鼠抗原的反应更好。因此，兔单克隆抗体比来自其他宿主(诸如小鼠)的单克隆抗体对抗原的反应更好。

此外，使用兔单克隆抗体可使得免疫组织化学结果更准确，这可归因于兔子的独特免疫系统。兔子可比小鼠生成更大范围的高亲和力抗体。因此，与找到相似的合适的小鼠抗体相比，更有可能找到可在一系列应用中发挥作用的兔抗体。另外，许多在小鼠中引起差的应答的较小的肽在兔子中生成有利的应答。由于这些原因，兔单克隆抗体在研究和临床应用中变得更优选。

以引用方式并入本文的US2004/0086979公开了一种用于对兔抗体进行表面重塑的方法，所述方法包括：(a)通过将所述亲本兔抗体的所述框架区的氨基酸序列与所述非兔抗体的所述框架区的氨基酸序列进行比较，鉴定与非兔抗体对应位置的氨基酸不同的亲本兔抗体框架区表面暴露的氨基酸；以及(b)以非兔抗体的所述相应位置处的氨基酸取代所述鉴定的氨基酸，以对所述兔抗体进行表面重塑。

以引用方式并入本文的US2005/0033031公开了一种人源化兔单克隆抗体方法，所述方法包括：(a)将亲本兔抗体的重链、轻链可变域的氨基酸序列与相似人抗体的重链和轻链可变域的氨基酸序列进行比较；以及(b)改变所述兔抗体的所述重链和轻链可变域的框架区内的氨基酸，使得改变后的框架区与所述相似人抗体的等效框架区在序列方面更加相似；其中，所述改变后的氨基酸不参与互补决定区(CDR)接触、链间接触，或者为具有实质不同侧链的隐蔽残基。

以引用方式并入本文的美国专利No.7,462,697公开了一种用于人源化兔抗体的方法，包括：a)通过将亲本兔抗体的氨基酸序列与多个相关抗体的氨基酸序列进行比较来鉴定该亲本兔抗体中的变异耐受位置，所述多个相关抗体与所述亲本兔抗体一样从相同兔中获得，其中所述亲本兔抗体和所述相关抗体：i.)与相同抗原结合；ii.)各自包含重链可变域，该重链可变域相对于彼此的总体氨基酸序列同一性至少为90％；iii.)各自包含轻链可变域，该轻链可变域相对于彼此的总体氨基酸序列同一性至少为90％；iv.)除了相对于彼此的0、1或2个氨基酸取代外，H3 CDR长度相同且序列相同；v.)除了相对于彼此的0、1或2个氨基酸取代外，L3 CDR长度相同且序列相同；b)将所述亲本兔抗体的氨基酸序列与人抗体的氨基酸序列进行比对，其中所述人抗体为与所述亲本兔抗体同源性最强的十种人抗体中的一个；以及c)将存在于所述变异耐受位置处的氨基酸以所述人抗体的相应氨基酸加以取代，以产生人源化抗体。

因此，需要提供优化期望的抗体特征(诸如热稳定性)的标准化、通用或归一化(可互换使用)兔单克隆抗体框架或模板。热稳定性增加和聚集性降低导致保质期增加，这对于标准化诊断测定非常重要。

发明内容

本发明提供了设计和制造归一化兔抗体的方法，该方法包括选择野生型兔抗体，以及对所述野生型兔抗体进行突变以获得归一化兔抗体，以便优化期望的特性。

在本公开的一方面为一种制备通用或归一化兔抗体的方法，该方法包括选择野生型兔抗体，将野生型抗体序列与归一化抗体序列进行比较，该归一化抗体序列在可变框架和/或结合区中包含一组氨基酸残基，该组氨基酸残基最常出现在已知是热稳定的和/或具有至少12个月的长期稳定性的兔抗体中的相同位置处，并确定野生型抗体中与归一化序列不同的一个或多个氨基酸残基；并且将在步骤(b)中鉴定的野生型抗体的所述一个或多个氨基酸残基突变为归一化序列的相应氨基酸残基，以得到通用或归一化兔抗体，其中当与未修饰的野生型抗体的结合亲和力相比时，该抗体与其靶标的结合亲和力保持在可接受范围内。在一些实施例中，通用或归一化兔抗体在VH链中包含根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在一些实施例中，通用或归一化兔抗体在Vk链中包含根据SEQ ID NO：2、SEQID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的氨基酸序列。在一些实施例中，通用或归一化兔抗体包含根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列以及根据SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的氨基酸序列。在一些实施例中，与野生型兔抗体相比，通用或归一化兔抗体表现出改善的热稳定性。在一些实施例中，与野生型兔抗体相比，通用或归一化兔抗体表现出改善的长期稳定性。在一些实施例中，与野生型兔抗体相比，通用或归一化兔抗体表现出改善的脱氨基作用。在一些实施例中，与野生型兔抗体相比，通用或归一化兔抗体表现出改善的表达。在一些实施例中，通用或归一化兔抗体为一级兔抗体。在一些实施例中，突变在κ链的J1区中。在一些实施例中，突变在κ链的FR4区中。在一些实施例中，突变在重链的J2、J4和/或J6区中。在一些实施例中，当与未修饰的野生型抗体的结合亲和力相比时，抗体与其靶标的结合亲和力保持在可接受范围内。在一些实施例中，突变在互补决定区中。

在一方面，本发明突出了一种通过本公开的方法获得的通用或归一化兔抗体。

在本公开的一方面为一种通用或归一化兔抗体，其在VH区中包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。

在本公开的一方面为一种通用或归一化兔抗体，其在Vk区中包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。

在本公开的一方面为一种通用或归一化兔抗体，其在VH区中包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10并且在Vk区中包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。

在本发明所公开的方法的一些实施例中，突变的通用或归一化抗体具有用于诊断用途的改善的特性。在一些实施例中，改善的特性选自由以下项组成的组：热稳定性、长期稳定性、降低的聚集作用以及降低的氧化作用/脱酰胺基作用。在本发明所公开的方法的一些实施例中，突变不在互补决定区中。

在本公开的一方面为一种改善用于诊断用途的抗体中的一种或多种特性的方法，该方法包括：选择野生型兔抗体，该野生型兔抗体缺乏选自由以下项组成的组的一种或多种特征：重组表达、热稳定性、长期稳定性、聚集作用以及氧化作用/脱酰胺基作用；将野生型抗体序列与归一化抗体序列进行比较，该归一化抗体序列在可变框架和/或结合区中包含一组氨基酸残基，该组氨基酸残基最常出现在已知具有在可接受范围内的特征的一组兔抗体中的相同位置处；以及鉴定与归一化序列不同的野生型抗体中的一个或多个氨基酸残基；以及将所述鉴定的野生型抗体的一个或多个氨基酸残基突变为归一化序列的相应氨基酸残基，其中一种或多种特征相对于未修饰的野生型抗体得到改善。

在本公开的一方面为一种制造重组兔单克隆抗体的方法，该方法包括：选择野生型兔抗体，将野生型抗体序列与归一化抗体序列进行比较，该归一化抗体序列在可变框架和/或结合区中包含一组氨基酸残基，该组氨基酸残基最常出现在已知具有在可接受范围内的特征的一组兔抗体中的相同位置处，该特征选自由以下项组成的组：热稳定性、长期稳定性、降低的聚集作用以及降低的氧化作用/脱酰胺基作用；以及鉴定与归一化序列不同的野生型抗体中的一个或多个氨基酸残基；以及制备编码互补决定区的标准表达载体，该互补决定区包含对在鉴定的一个或多个残基中的野生型序列的改变；在合适的宿主细胞中表达所述载体；以及从该步骤纯化所述抗体。在一些实施例中，归一化序列的所述一组氨基酸残基最常出现在至少50个具有相关特征的兔抗体中的相同位置处。在一些实施例中，归一化序列的所述一组氨基酸残基最常出现在至少100个具有相关特征的兔抗体中的相同位置处。在一些实施例中，归一化序列的所述一组氨基酸残基最常出现在至少150个具有相关特征的兔抗体中的相同位置处。在一些实施例中，归一化序列的所述一组氨基酸残基最常出现在至少200个具有相关特征的兔抗体中的相同位置处。在一些实施例中，归一化序列的所述一组氨基酸残基最常出现在至少250个具有相关特征的兔抗体中的相同位置处。在一些实施例中，归一化序列的所述一组氨基酸残基最常出现在至少300个具有相关特征的兔抗体中的相同位置处。

本发明人惊讶地发现，由本发明获得的抗体在不实质性影响与靶标的结合亲和力和特异性的情况下，表现出优越的特性。

本公开进一步提供了通过选择一种野生型兔抗体并对所述野生型兔抗体进行突变而得到的归一化单克隆兔抗体。

从下面的详细描述中，本发明的其他目标、特征和优点将变得明显。

附图简要说明

专利或申请文件包含至少一幅彩色绘图。在提出请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有一幅或多幅彩图的本专利或专利申请公布的拷贝。

图1描绘了(A)根据本发明采用的蛋白质工程策略的概述，以及(B)方法的示意性概述，其中使用脚本程序生成基于通用模板的变体。在瞬时转染HEK293细胞之前，用于轻链(粉红色)和重链(紫色)的这些变体经基因合成，然后克隆至pTT5或pDV3a载体中。培养物在摇瓶中生长六天，并且根据需要收获并纯化抗体上清液。抗体上清液经连续稀释以确定抗体浓度，并且用于确定结合亲和力。抗体上清液的热稳定性由ELISA加以测试。纯化的Ab用于解链和聚合温度的测量。在对照组织上执行免疫组织化学。

图2描绘了(A)兔(黄色)和小鼠(绿色)抗体的VH域，和(B)VH域中Tyr角的特写视图。

图3描绘了兔抗体序列中的氨基酸的分布。

图4描绘了本发明的通用或归一化抗体模板。行：(NO)编号系统(主要是IMGT)以及FR和CDR的大概位置；(IK)重要的Vk位置；(TK)通用或归一化Vk模板；(IH)重要的VH链位置；(TH)通用或归一化VH模板。IK和IH行：(c)可能的CDR接触；(d)隐蔽的和可能的CDR接触；(2)隐蔽极区2；(b)隐蔽；(0)无氨基酸残基。(-)无偏好；(i)可能的链间接触；(t)隐蔽的酪氨酸角；(v)转角；(x)可改变的表面残基，改变亲和力的风险很低；(u/c/b)经模糊限定的CDR，这些残基可保守地改变，尽管改变亲和力的风险较高；(s)信号肽之后的第一位置(可能的CDR接触)或D-E环中的残基VH84，这不存在于一些兔VH链中。

图5描绘了(A)VH和Vk系列突变体和(B)VH变体与WT Vk配对的结合曲线和(C)Vk变体与WT VH配对的结合曲线，以及(D)合成致死性的决定因素。

图6描绘了(A)针对野生型(“WT”)Vk与VH突变体的热稳定性曲线、(B)针对WT VH和Vk突变体的热稳定性曲线以及(C)针对xCD2 WT对比突变程度最高的VH和Vk的热稳定性曲线。

图7描绘了(A)转换为通用或归一化模板对表达水平、熔点和聚集温度的影响(“T_agg266”和“T_agg473”)，以及(B)转换为本发明的通用或归一化模板的WT xCD2抗体和xCD2抗体的相似染色模式。

缩写

“FR”是指“框架区。”

“CDR”是指“互补决定区。”

“V”是指可变区。

“Vk”是指可变κ链(轻链)。

“Vλ”是指可变λ链(轻链)。

“VH”是指可变重链。

“J”是指“连接区。”

具体实施方式

为了便于审视本公开的各种实施例，提供了对特定术语的如下解释：

抗体：包括至少轻链或重链免疫球蛋白可变区并特异性结合抗原表位的多肽。抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体或抗体的片段以及本领域中已知的其他抗体。在一些实例中，抗体与另一分子诸如纳米颗粒(例如，金纳米颗粒)或酶(例如，碱性磷酸酶)连接或缀合。

抗体由重链和轻链组成，每条重链和轻链均具有可变区，称为可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区。VH区和VL区共同负责结合由抗体识别的抗原。这包括完整的免疫球蛋白及其在本领域中众所周知的变体和部分，诸如Fab′片段、F(ab)′2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫键稳定性Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白为融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链变异区和免疫球蛋白的重链变异区由接头结合，而在dsFv中，已对链进行突变以引入二硫键以稳定链的联合。该术语还包括重组形式，诸如嵌合抗体(例如，人源化小鼠抗体)和复共轭对配合物抗体(例如，双特异性抗体)。另见Pierce Catalog and Handbook，1994-1995(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)；Kuby，Immunology，第3版，W.H.Freeman&Co.，NewYork，1997。

“单克隆抗体”为由来自小鼠或兔的B淋巴细胞的单一克隆或由单一抗体的轻链和重链基因已转染其中的细胞(例如HEK293细胞)而产生的抗体。单克隆抗体通过本领域普通技术人员已知的方法(例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合中制备杂交抗体形成细胞)产生。这些融合细胞及其后代称为“杂交瘤”。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。

一级(1°)抗体为对生物样品的一种或多种成分具有免疫特异性的抗体。它们经常用于需要检测和分析样品中的生物标志物的诊断应用中，例如，免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术等。二级(2°)抗体为对另一抗体(或另一抗体的成分)具有免疫特异性的抗体，并且经常用于依靠间接检测目标生物标志物的诊断应用中。例如，在免疫组织化学和免疫细胞化学应用中，一级抗体用于介导可检测部分在组织学或细胞学样品上沉积在紧邻与该一级抗体结合的生物标志物。在一些情况下，可检测部分与一级抗体直接缀合，因此在生物标志物特异性试剂与其标靶结合时沉积在样品上(通常称为直接标记方法)。在其他实施例中，可检测部分的沉积通过将二级抗体与结合至样品上的一级抗体结合，随后通过以影响可检测部分的沉积的方式与二级抗体结合或以其他方式与该二级抗体反应的一组检测试剂来实现(通常称为间接标记方法)。用于间接组织化学或细胞化学检测方法的市售试剂或试剂盒的非限制性实例包括：VENTANA ultraView检测系统(与酶缀合的二级抗体，所述酶包括HR和AP)；VENTANA iVIEW检测系统(生物素化的抗物种二级抗体和链霉亲和素缀合的酶)；VENTANA OptiView检测系统(OptiView)(与半抗原缀合的抗物种二级抗体和与酶多聚体缀合的抗半抗原三级抗体)；VENTANA扩增试剂盒(未缀合的二级抗体，该未缀合的二级抗体可与前述VENTANA检测系统中的任何一种一起使用，以扩增沉积在一级抗体结合位点处的酶的数量)；VENTANA OptiView扩增系统(与半抗原缀合的抗物种二级抗体、与酶多聚体缀合的抗半抗原三级抗体以及与相同半抗原缀合的酪胺。在使用中，将二级抗体与样品接触，以实现与一级抗体的结合。然后使用抗半抗原抗体孵育样品，以实现酶与二级抗体的联合。然后使用酪胺孵育样品，以实现额外的半抗原分子的沉积。然后使用抗半抗原抗体再次孵育样品，以实现额外的酶分子的沉积。然后使用可检测部分孵育样品以实现染料沉积)；VENTANA DISCOVERY、DISCOVERY OmniMap、DISCOVERY UltraMap抗半抗原抗体、二级抗体、色原、荧光团和染料试剂盒，上述产品中的每种均可从Ventana Medical Systems，Inc.(Tucson，Arizona)获得；PowerVision和PowerVision+IHC检测系统(直接与HR或AP聚合成携带高比例的酶比抗体的紧凑型聚合物的二级抗体)；以及DAKO EnVision^TM+系统(与二级抗体缀合的酶标记聚合物)。

无论使用哪种类型抗体或检测系统，每种Ab在特异性、亲和力、生产水平、稳定性和缀合适宜性方面均是独特的，这对测定开发和制造标准化提出了挑战。本发明人使用蛋白质工程以解决此问题，并且已专注于a)克隆杂交瘤以用于转换为重组抗体，b)修饰抗体序列以适应更高且可重复性更强的缀合比，以及c)标准化抗体框架区域，以用于稳定性以及，更普遍的，抗体可开发性。

本发明人惊讶地发现，本发明的方法可用于制造归一化抗体，以用于改善可重复性和开发性。

图1A示出了示例性蛋白质工程策略的概述。杂交瘤可随着时间的推移而丧失抗体生产力，因此，对于某些克隆，转换为抗体的重组版本可能是必要的。重组抗体也可使蛋白质工程能够引入位点特异性缀合以用于可靠地进行标记，并且能够优化抗体组成以用于下游应用所需的可开发性、稳定性以及其他所期望的特性。当前用于缀合的方法依靠抗体中可用的天然特性，从而产生随机分布的生物共轭体。引入位点特异性缀合位点可极大地改善可制造性和产品组成。掌握了经工程设计的重组抗体，最终可能将抗体克隆引入基于CHO细胞的靶向整合系统。这样可允许大规模的表达、生产和制造，这与由杂交瘤生产的抗体量相当。

图1B示出了现有的抗体载体或来自杂交瘤克隆的cDNA可用作起始模板，从该起始模板中使用特别设计的引物和聚合酶链式反应来扩增轻链(粉红色)和重链(紫色)。在瞬时转染HEK293细胞之前，将抗体链克隆至pTT5或pDV3a载体中，并且培养物在摇瓶中生长六天。收获并纯化抗体上清液，并且使用ELISA测定对纯化的抗体进行表征，以便确定抗原结合和免疫组织化学以验证功能。

本发明人制成了一种“通用或归一化稳定支架模板”，并且提出了其面向稳定兔单克隆Ab的应用。特别地，本发明人已发现a)不需要延长杂交瘤的使用和由于杂交瘤不稳定而产生的特异性抗体表达的风险损失，b)可将抗体的可变区进行重新工程，以引入期望的配方特性(诸如稳定性)而不丧失特异性和亲和力。

尽管原则上工程化可用于标准化抗体支架，同时保持抗体特异性和亲和力，但实际上，积累的抗体工程知识中的大部分涉及人和鼠抗体。本发明人检查了兔抗体的结构和序列并发现其与人和鼠抗体有许多相似之处，并且针对兔可变重(VH)链和可变κ轻(Vk)链创建了稍加修改的IMGT编号系统以生成结构比对。框架(FR)序列中最常出现的氨基酸(Aa)可能导致稳定性更高。因此，针对对于结合不重要的位置，经常出现的Aa或存在于没有已知稳定性问题的兔抗体中的那些Aa可用于构建通用或归一化抗体支架，该支架可用作转换不稳定抗体的模板。

本发明人调查了兔抗体中的种系衍生的和经常出现的氨基酸序列，认为这些序列将导致更高的稳定性和其他期望的特性。对于没有强烈偏向性的序列位置，本发明人使用了经常出现的氨基酸。另外，本发明人使用存在于没有已知稳定性问题的抗体中的氨基酸。限定宽松的CDR通常可保持完整。

本发明人首先将兔Vk和VH区的序列和结构与它们的人和小鼠对应物进行比较，并且验证了各个兔抗体氨基酸残基具有与它们相应的人和小鼠对应物相似的结构性作用。

本发明人首先将兔Vk和VH区的序列和结构与它们的人和小鼠对应物进行比较。

从一种或多种通用或归一化抗体模板中制造根据本发明的抗体，该模板覆盖κ和重链可变区(分别为Vk、

和VH)的框架。框架区存在于抗体可变链中的高变区之间。框架区形成了β-折叠(β-桶状)结构，该结构用作支架以将高变区固持在接触抗原或靶标的位置。

本发明的这些通用或归一化抗体模板是基于现有兔单克隆抗体的可变区的结构和序列分析生成的。

在一个实施例中，本公开提供了这样的方法，技术人员通过该方法可将尽可能多的来自候选抗体中的残基改变为通用或归一化模板中的相应的残基，以改善所期望的特性而不损失相当大的结合亲和力。在另一个实施例中，根据本发明的方法可应用于CDR序列，由此增加稳定性而不损失亲和力。

在一个实施例中，通过评估抗体与靶标的结合的解离常数(K_D)来确定结合亲和力。可使用基于表面的(异质)方法来评估结合对的K_D，该方法包括表面等离子体共振(SPR)、生物层干涉法(BLI)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。Schuck 1997；Gauglitz 2008；Friguet等人，1985。

通常地，通用或归一化抗体的K_D将在10^-6至10^-12(M)的范围内，但在任何情况下可相对于野生型抗体得到改善。

本发明人从由Spring Bioscience独立分离的针对各种抗原的抗体和来自抗体的肽中收集了大约300个氨基酸序列。本发明人进一步收集了已发表的兔抗体结构的九(9)个VH/Vk序列：4HBC、4HT1、4JO1、4JO4、4MA3、4O4Y、4ZTP、5C0N、5DRN，这些序列是从RCSB蛋白质数据库中下载的。在图3中描绘了这些序列中的氨基酸的分布，其中绿色着色的强度与指示位置处的氨基酸的发生率百分比成正比。

本发明人进一步收集了39个VH和65个Vk1功能种系序列(图3中未分析)。

然后，主要使用IMGT编号系统(参见Lefranc等人，2003，“IMGT unique numberingfor immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains”)和针对小鼠和人抗体发表的结构比对(参见Honegger和Pluckthun，2001，“Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains：anautomatic modelling and analysis tool”)对VH和Vk序列进行比对。

如先前描述的(Chothia等人，1998；Narciso等人，2011)，注释并验证了通常可应用于所有人、小鼠和兔抗体的所有框架氨基酸位置和位置相关的结构特性，除了a)经常存在额外的二硫键，该二硫键在VH FR2 C40与C55之间形成，b)数个Vk1序列中的内部CDR3二硫键，c)介于Vk FR3(kabbat C80)或FR4(最后一个位置)中的Cys残基与CK中的Cys残基之间的域间二硫键以及d)许多兔VH FR3区域中的截短的DE环，该截短的DE环可缺乏残基VH85或缺乏残基VH84和VH85两者。

本发明人将这些编号系统一起使用，然后计算每个VH和Vk结构比对位置处的二十个标准氨基酸残基中的每个的出现频率。提出的通用或归一化Vk和VH模板在图4中示出。

对于κ链框架4(“FR4”)，选择FGGGTEVVVK(SEQ ID NO：18)的示例性序列，该示例性序列衍生自J1连接区。

对于重链，选择WGPGTLVTVSS(SEQ ID NO：19)的示例性序列，该示例性序列衍生自连接区J2、J4和J6。

在大部分没有已知的稳定性问题的克隆抗体中发现了这些Vk和VH FR4序列。

在图4中也描绘了所采用的编号系统，该编号系统应用于VH和Vk链。深蓝色着色表示在种系中100％保守。对于FR4，序列分别对应于兔种系KJ1和HJ2/4/6。深绿色着色表示在由Spring Bioscience提供的抗体中89％出现。浅绿色表示在没有已知的稳定性问题的抗体中常见的残基。最后，“-”表示应如在原野生型序列中一样加以保留的氨基酸位置。

在一个实施例中，本发明的重组的通用或归一化抗体由任何适合于产生诊断抗体的宿主物种产生。在一个实施例中，宿主细胞为哺乳动物细胞。在一个特定实施例中，宿主细胞为HEK293F细胞。在另一个特定实施例中，宿主细胞为CHO细胞。在进一步的实施例中，宿主细胞是酵母、细菌(例如大肠杆菌)或丝状真菌细胞。在进一步的实施例中，宿主细胞为昆虫细胞。可使用任何已知的方法实现重组的通用或归一化抗体的纯化，该方法包括色谱法和亲和色谱法。

在另一个实施例中，本发明的抗体为兔、小鼠或人抗体。

在另一个实施例中，本发明的抗体为兔抗体。

在一个实施例中，本发明的抗体为一级兔抗体。

在一个实施例中，本发明的抗体为二级兔抗体。

在一个实施例中，本发明的抗体为可人源化的。

在另一个实施例中，抗体为包括Fab和单链Fv(scFv)的抗体片段或单链抗体。

在另一个实施例中，抗体为具有来自不同抗体和/或物种的恒定区的嵌合抗体。

在一个实施例中，本发明的抗体为包括IgA、IgM、IgG(所有亚型)、IgA和IgE的任何同种型。

在一个实施例中，本发明的抗体相对于野生型、未修饰的抗体表现出改善的热稳定性、长期稳定性、重组表达/效价、脱氨基作用/氧化作用及/或聚集作用。

本领域中已知的稳定性测定可用于测量热稳定性/变性。在一个实施例中，可使用免疫组织化学。在另一个实施例中，可使用ELISA。在另一个实施例中，可使用双向电泳。在另一个实施例中，可使用差示扫描量热法和/或圆二色光谱法。在进一步的实施例中，可使用纳米差示扫描荧光测定法。参见例如Vermeer和Norde，2000；Svilenov等人，2018；Strutz2016，Amin等人，2014。在一个实施例中，增加的解链温度与改善的热稳定性相关。

可使用各种已知技术测量蛋白质聚集，该技术包括质谱分析法、尺寸排除色谱法(SEC)、动态光散射(DLS)、光阻法(LO)、动态成像颗粒分析(DIPA)技术，诸如微流成像(MFI)和库尔特计数器(CC)。Engelsman等人，Strategies for the Assessment of ProteinAggregates in Pharmaceutical Biotech Product Development；Pharm.Res.2011；28(4)：920-33。

在一个实施例中，本发明的抗体表现出改善的热稳定性。

在另一个实施例中，本发明的抗体表现出改善的长期稳定性。长期稳定性包括在-20与-70℃之间的温度下至少6个月，优选地至少1年，更优选地至少2年，最优选地至少3年。在一个实施例中，抗体为冻干的。

在另一个实施例中，本发明的抗体表现出改善的表达，该改善的表达如通过例如与相应的未修饰的野生型抗体相比，从重组表达的增加的滴度所确定。在一个实施例中，效价为至少0.5g/L，更优选地为至少0.75g/L。在另一个实施例中，可通过读取OD280读数来测量增加的表达。在其他实施例中，表面等离子体共振(SPR)也可用于测量浓度，并且也可使用具有标准品的蛋白质凝胶电泳以确定抗体浓度。

在另一个实施例中，本发明的抗体表现出改善的脱氨基作用/氧化作用(即，较小的脱酰胺基作用/氧化作用)。脱酰胺基作用为当天冬酰胺的侧链与谷氨酰胺的侧链经修饰时发生的自发反应，并且可产生环状中间化合物。氧化作用主要发生在含硫残基半胱氨酸和蛋氨酸上，这导致链内或链间二硫键的形成。在Yan.2009中详细描述了评估氧化作用的方法。色氨酸也易于氧化。色氨酸的损失可通过鉴定Trp降解化合物来阐明，该Trp降解化合物包括氧代吲哚基丙氨酸(Oia)、3a-羟基-1，2，3，3a，8,8a-六氢吡咯并[2，3-b]吲哚-2-羧酸(PIC)、N-甲酰基犬尿氨酸(NFK)、二氧代吲哚基丙氨酸(DiOia)、犬尿氨酸(Kyn)和5-羟基色氨酸(5-OH-Trp)。

在另一个实施例中，本发明的抗体表现出改善的聚集作用(即，较小的聚集作用)。

在一个实施例中，本发明的抗体包含根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列，其阐述了一种通用或归一化或者归一化Vk模板(SEQ ID NO：1)及其突变体。

在一个实施例中，本发明的抗体包含根据SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17氨基酸序列，其阐述了一种通用或归一化VH模板(SEQ ID NO：2)及其突变体。

在一个实施例中，本发明的抗体包含根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列以及根据SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16或SEQ ID NO：17的氨基酸序列。

在一个实施例中，本发明的抗体包含根据SEQ ID NO 1的氨基酸序列。

在一个实施例中，本发明的抗体包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

在一个实施例中，本发明的抗体包含根据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

本文公开的前述氨基酸序列可以通过一个或多个残基的取代进一步加以修饰。此类取代可具有保守性质，例如，其中一个氨基酸由结构和特征相似的氨基酸加以替换，诸如，其中一个疏水氨基酸由另一个疏水氨基酸加以替换。

甚至更保守的为大小和化学性质相同或相似的氨基酸的替换，诸如亮氨酸由异亮氨酸加以替换。在对天然存在的同源蛋白家族中的序列变异的研究中，某些氨基酸取代比其他氨基酸取代更经常得到耐受，并且这些取代经常示出与原氨基酸及其替换物之间在大小、电荷、极性和疏水性方面的相似性相关，并且这就是定义“保守性取代”的基础。

保守性取代可在以下五组中的一组内交换：组1-小脂肪族、非极性或微极性残基(Ala、Ser、Thr、Pro、Gly)；组2-极性、带负电荷的残基及其酰胺(Asp、Asn、Glu、Gln)；组3-极性、带正电荷的残基(His、Arg、Lys)；组4-大的、脂肪族、非极性残基(Met、Leu、Ile、Val、Cys)；以及组5-大的、芳香族残基(Phe、Tyr、Trp)。

较不保守的取代可能涉及用另一个具有类似特征但大小有些不同的氨基酸替换一个氨基酸，例如用异亮氨酸残基替换丙氨酸。

高度非保守性替换可能涉及用酸性氨基酸取代极性氨基酸，或甚至取代碱性特征的氨基酸。然而，这种“自由基”取代不能当作可能无效的而不予理会，因为化学效应是不能完全预测的，并且自由基取代很可能引起以其他方式无法从简单化学原理预测的偶然发现的效应。

在一个实施例中，本发明包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中的任何一个或者SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19中的任何一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％百分比同一性的氨基酸序列。例如，可通过使用GAP计算机程序6.0版(由Devereux等人于1984年编制，可从威斯康星大学遗传学计算机课题组(UWGCG)获得)通过比较序列信息来确定百分比同一性。GAP程序利用Neddleman和Wunsch于1970年提出的比对方法，该比对方法由Smith和Waterman于1981年修订。在另一个实施例中，本发明包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中的任何一个或者SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQID NO：19中的任何一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％百分比同一性的氨基酸序列，并且表现出改善的特性，诸如热稳定性、长期稳定性和表达。

在一个特定实施例中，通用或归一化或者归一化抗体包含野生型Vk链和具有至少一个突变的VH链。

在一个特定实施例中，通用或归一化或者归一化抗体包含野生型Vk链和具有Y52W突变的VH链。

在另一个特定实施例中，通用或归一化或者归一化抗体包含野生型Vk链和具有所有以下突变的VH链：V4L；_83S；S96T；A54G；N101T；和Y52W，其中_表示应如在原野生型序列中一样加以保留的氨基酸位置。在又一个特定实施例中，通用或归一化或者归一化抗体1抗体包含野生型Vk链和具有所有以下突变的VH链：V4L；R48K；_83S；S96T；A54G；和N101T。

在一个特定实施例中，通用或归一化抗体包括具有仅一个突变的Vk链和野生型VH链。在另一个实施例中，通用或归一化或者归一化抗体包含野生型Vk或Vλ链和突变的VH链。在另一个特定实施例中，通用或归一化抗体包含野生型Vk或Vλ链和具有以下突变中的一个或多个的VH链：V4L；R48K；_83S；S96T；A54G、N101T；或Y52W。

在另一个实施例中，通用或归一化抗体包括具有至少一个突变的Vk或Vλ链和具有至少一个突变的VH链。在一个特定实施例中，Vk链突变为A2Q；S20T；S46P、A40S、Q52L或P69S。在另一个特定实施例中，Vk链包括前述突变中的至少两个，其条件为该突变不为S20T和Q52L两者。在另一个特定实施例中，Vk链包括所有以下突变：A2Q、S20T、S46P、A40S和P69S。在另一个特定实施例中，Vk链包括以下突变中的全部：A2Q；S46P、A40S、Q52L和P69S。

在另一个实施例中，通用或归一化抗体包括具有以下突变中的一个或多个的Vk链：A2Q；S20T；A40S、S46P、Q52L或P69S，其条件为该突变不为S20T和Q52L两者；并且VH链具有以下突变中的一个或多个：V4L；R48K、_83S；S96T；A54G、N101T；和Y52W。

在另一个实施例中，通用或归一化抗体包括具有至少一个突变的Vk或

链和具有所有以下突变的VH链：V4L；R48K、_83S；S96T；A54G、N101T；和Y52W。

在另一个实施例中，通用或归一化抗体用于诊断测定。在一个实施例中，该测定为免疫组织化学(IHC)。在另一个实施例中，该测定为酶联免疫吸附测定(ELISA)。在另一个实施例中，诊断测定为免疫细胞化学(ICC)。在进一步的实施例中，诊断测定为流式细胞术或FACS。在其他进一步的实施例中，诊断测定为放射免疫测定(RIA)。

本发明的方法不限于用于已知或发现的具有稳定性或聚集性或上述其他特性问题的抗体。在另一个实施例中，本发明的方法可用于标准化用于免疫测定的多组抗体。

以下实例是为了阐明本公开的某些实施例，并非旨在限制本公开的内容。事实上，相同的方法可用于修饰其他兔抗体。

实例

实例1-转换为通用或归一化模板的突变

针对9-mer肽，选择由Spring Bioscience提出的兔单克隆抗体。T_M为73.1℃，T_agg266为73.4℃，T_agg473为73.8℃，并且表达产量为0.51mg/ml。

所选择的兔单克隆抗体的Vk和VH编码DNA序列从Spring Bioscience获得，并且构建表达载体。

表达载体基于经修饰以表达兔IgG恒定区，而不是原人类序列的pDV2/pRK-Fc系统(Shang等人，2015；Tesar和

2013)。

通过比较在若干稀释度处确定的样品抗体的吸光度值与标准曲线的吸光度值来确定浓度。

合成了一系列VH和Vk链，其具有从原野生型抗体至通用或归一化模板的单个和多个序列变化(参见图5A，该图描绘了VH和Vk系列)。

CDR3和FR4区、过去的IMGT残基C104如在野生型抗体中一样加以保持。野生型FR4序列完全匹配通用或归一化模板。FR4与通用或归一化模板相同。如图5中的(N0、IM、TH)。VH变体：(hwt)WT HC。Vk变体：(kwt)wt轻链。

VH和Vk系列在HEK293F细胞中表达，使得每条突变的重链与野生型κ链组合，反之亦然。

如下所述，ELISA用于测量兔抗体浓度并且比较所有变体之间的抗体结合。

实例2-ELISA测定

经由ELISA确定抗体浓度和EC50。

在克隆至pTT5或pDV3a载体之前，使用基因合成以生成不同的VH和Vk单一和组合突变体。CDR3和FR4保持不变，并且FR4与通用或归一化模板相同。

表1列出了测定的野生型和突变体序列。

值得注意，具有所有通用或归一化VH模板的变化的克隆(图6，“h.all”)具有与野生型抗体相同的亲和力。

相反，如图6C所示，虽然Vk单一突变不影响结合，但所有Vk突变(“k.all”)的组合消除了结合。假设Vk突变中的至少两个为合成致死的，并且通过测试已经鉴定为A40S和Q52L。如图6D所示，不具有Q52L(-Q52L)的k.all和不具有A40S(-A40S)的k.all并不恢复具有所有突变的Vk(k.all)的结合，而不具有A40S和Q52L(-A40S-Q52L)两者的k.all使结合恢复至与野生型Vk(kwt)相似的水平。

将山羊抗兔IgG(从Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.of WestGrove，Pennsylvania(“Jackson Imm”)获得；411-005-003)在磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)中的3μg/ml溶液以100ul/孔的量添加至圆底微量滴定板(Greiner 650061)的孔。然后密封该板并在4℃下储存过夜。

将孔清空并重新填充150μl的在PBS中的3％牛血清白蛋白(“BSA”)，并且在室温下摇动孵育一小时。然后将孔清空，并且添加100μl/孔的标准Chromopure兔IgG全分子(从Jackson Imm获得；011.000.003)和样品培养上清液的连续稀释液。

允许标准品和未知品在室温下摇动结合两小时。然后将孔清空，使用PBS+0.5％Tween 20(“PBST”)洗涤至少四次。将辣根过氧化物酶(“HRP”)缀合的山羊抗兔IG(JacksonImm 111-035-046)在PBS中稀释1/2000并以100μl/孔的量添加。

将HRP缀合物在室温下摇动孵育45分钟。然后将孔清空，使用PBST洗涤至少四次。

以100μl/孔的量添加TMB(Thermo Fisher cat#002023))，并且在室温下孵育该板而无需摇动，直至蓝色的显色得到稳定(大约30分钟后)。

使用微量滴定板读板器在650nm处读取信号，该微量滴定板读板器设置为读取前先摇动该板3-5秒。

除了微量滴定板最初通过将在PBS中0.5μg/ml特异性抗原的溶液以100μl/孔的量进行铺板来加以制备，抗体结合曲线按照上述ELISA方案生成。

实例3-热稳定性分析

为了测试上述突变体和野生型序列的稳定性，选择热稳定性作为用于优化的期望的特性。

可快速而准确地测量热稳定性。缺乏热稳定性会导致与抗体相关联的额外的问题，诸如聚集作用或降解作用。

将细胞培养上清液稀释至10ng/ml，并且将20μ等分试样分配至PCR8联管中。每条联管包含至多八种不同的细胞培养上清液。若干联管以相同方式制备，在PCR联管离心机上旋转并置于冰中。

将热循环仪编程为具有若干连续的10分钟保温时间。将联管连续放入热循环仪中，每次移除前一个联管并以新联管将其替换，该新联管在孵育之后，进行离心并放回冰中。

对照联管留在冰中，经处理的联管在4℃下储存过夜。

第二天使用涂覆有特异性抗原的微量滴定板执行ELISA。

观察到VH中的若干单一突变改善了热稳定性。值得注意，如图6A所示，点突变Y52W特别导致热稳定性改善。然而，稳定性的益处是加成的；即使在不存在Y52W的情况下，倘若同时包括所有其他突变，则能够实现最大稳定性。

图6B示出了WT VH和Vk突变体的热稳定性曲线。结果示出，Vk变体赋予了很少改善或未赋予改善。图6C示出了xCD2 WT对比突变程度最高的VH和Vk序列。结果示出，通过将完全突变的具有高允许突变的VH和Vk加以组合实现了最大稳定性。

稳定性的改善是出乎意料的，因为远离结合位点的残基的修饰对结合亲和力可具有显著影响。

转换为通用或归一化模板也会导致表达水平和T_m增加。图7A示出了制备抗体，该抗体使通用或归一化模板抗体(17.3mg)的产量高于野生型抗体(4.5mg)的产量，即使用通用或归一化模板克隆的产率高3倍；通用或归一化模板抗体的T_m(75.5℃)高于野生型抗体的T_m(73.1℃)，通用或归一化模板抗体的T_agg266(77.8℃)高于野生型抗体的T_agg266(73.4℃)，并且通用或归一化模板抗体的T_agg473(78.4℃)高于野生型抗体的T_agg473(73.8℃)。图7B示出了通用或归一化模板抗体的染色强度与野生型抗体的染色强度相当。

本发明的优点可包括重组抗体，该重组抗体提供了可靠的产品来源和用于蛋白质工程尝试的起点，以改善生物共轭、稳定性和可制造性。

参考文献

以下参考文献全文以引用方式并入本文。

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序列表

<110> Ventana Medical Systems, Inc.

<120> 用于改善的功能性和可制造性的通用抗体框架

<130> P34814-WO

<150> US 62/682,795

<151> 2018-06-08

<160> 19

<170> PatentIn 3.5 版

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TH / h.all（通用 VH 模板）； (V4L; R48K, _83S; S96T; A54G,

N101T; and Y52W)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(30)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(38)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (40)..(40)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(55)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (57)..(66)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (84)..(84)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (105)..(116)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<400> 1

Xaa Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Xaa Arg Leu Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Xaa Xaa Xaa Leu Xaa

20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

50 55 60

Xaa Xaa Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Xaa Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys

65 70 75 80

Thr Ser Ser Xaa Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr Ser Pro Thr Thr

85 90 95

Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

100 105 110

Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TK / k.all（通用 Vk 模板）； (A2Q; S20T; S46P, Q52L and

P69S)

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(38)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (58)..(64)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (81)..(82)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (105)..(116)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (127)..(127)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<400> 2

Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

50 55 60

Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Xaa Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly

65 70 75 80

Xaa Xaa Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys

85 90 95

Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

100 105 110

Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Xaa

115 120 125

<210> 3

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hwt（野生型 VH 链）

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<400> 3

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Asp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Tyr Ile Ala

35 40 45

Ser Ile Ser Ile Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Xaa Thr Thr Val Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Ser Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Ala Ile Leu

85 90 95

Ala Val Gly Asp Ser Glu Thr Met Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hV4L（VH 链突变体）

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<400> 4

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Asp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Tyr Ile Ala

35 40 45

Ser Ile Ser Ile Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Xaa Thr Thr Val Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Ser Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Ala Ile Leu

85 90 95

Ala Val Gly Asp Ser Glu Thr Met Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hR48k（VH 链突变体）

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<400> 5

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Asp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Ala

35 40 45

Ser Ile Ser Ile Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Xaa Thr Thr Val Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Ser Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Ala Ile Leu

85 90 95

Ala Val Gly Asp Ser Glu Thr Met Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hY52W（VH 链突变体）

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<400> 6

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Asp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Ala

35 40 45

Ser Ile Ser Ile Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Xaa Thr Thr Val Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Ser Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Ala Ile Leu

85 90 95

Ala Val Gly Asp Ser Glu Thr Met Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hA54G （VH 链突变体）

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<400> 7

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Asp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Ile Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Xaa Thr Thr Val Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Ser Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Ala Ile Leu

85 90 95

Ala Val Gly Asp Ser Glu Thr Met Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h_83S （VH 链突变体）

<400> 8

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Asp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Tyr Ile Ala

35 40 45

Ser Ile Ser Ile Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Ser Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Ala Ile Leu

85 90 95

Ala Val Gly Asp Ser Glu Thr Met Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hS96T （VH 链突变体）

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<400> 9

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Asp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Tyr Ile Ala

35 40 45

Ser Ile Ser Ile Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Xaa Thr Thr Val Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Ala Ile Leu

85 90 95

Ala Val Gly Asp Ser Glu Thr Met Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hN101T （VH 链突变体）

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<400> 10

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Asp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Tyr Ile Ala

35 40 45

Ser Ile Ser Ile Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Xaa Thr Thr Val Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ile Leu

85 90 95

Ala Val Gly Asp Ser Glu Thr Met Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> kwt （野生型 Vk 链）

<400> 11

Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val His His Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Gln

35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val

65 70 75 80

Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Leu Tyr Asn Ser

85 90 95

Gly Ser Asp Ile Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> kA2QA （Vk 链突变体）

<400> 12

Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val His His Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Gln

35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val

65 70 75 80

Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Leu Tyr Asn Ser

85 90 95

Gly Ser Asp Ile Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> kS20T （Vk 链突变体）

<400> 13

Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val His His Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Gln

35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val

65 70 75 80

Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Leu Tyr Asn Ser

85 90 95

Gly Ser Asp Ile Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> kA40S （Vk 链突变体）

<400> 14

Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val His His Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Gln

35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val

65 70 75 80

Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Leu Tyr Asn Ser

85 90 95

Gly Ser Asp Ile Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S46P （Vk 链突变体）

<400> 15

Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val His His Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln

35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val

65 70 75 80

Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Leu Tyr Asn Ser

85 90 95

Gly Ser Asp Ile Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Q52L （Vk 链突变体）

<400> 16

Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val His His Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val

65 70 75 80

Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Leu Tyr Asn Ser

85 90 95

Gly Ser Asp Ile Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P69S （Vk 链突变体）

<400> 17

Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val His His Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Gln

35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val

65 70 75 80

Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Leu Tyr Asn Ser

85 90 95

Gly Ser Asp Ile Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自 J1 连接区的示例性序列

<400> 18

Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自连接区 J2、J4 和 J6 的示例性序列

<400> 19

Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

Claims

1.一种制备通用或归一化兔抗体的方法，其包括：

(a)选择野生型兔抗体；

(b)将所述野生型抗体序列与归一化抗体序列进行比较，所述归一化抗体序列在可变框架和/或结合区中包含一组氨基酸残基，所述一组氨基酸残基最常出现在已知是热稳定的和/或具有至少12个月的长期稳定性的兔抗体中的相同位置处；并且鉴定与归一化序列不同的所述野生型抗体中的一个或多个氨基酸残基；以及

(c)将在步骤(b)中鉴定的所述野生型抗体的所述一个或多个氨基酸残基突变为所述归一化序列的相应氨基酸残基，以得到通用或归一化兔抗体，

其中当与未修饰的野生型抗体的结合亲和力相比时，所述抗体与其靶标的结合亲和力保持在可接受范围内。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述通用或归一化兔抗体在VH链中包含根据SEQID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述通用或归一化兔抗体在Vk链中包含根据SEQID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQID NO:17的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述通用或归一化兔抗体包含：

(a)根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及

(b)根据SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸序列。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中与所述野生型兔抗体相比，所述通用或归一化兔抗体表现出改善的热稳定性。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中与所述野生型兔抗体相比，所述通用或归一化兔抗体表现出改善的长期稳定性。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中与所述野生型兔抗体相比，所述通用或归一化兔抗体表现出改善的脱氨基作用。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中与所述野生型兔抗体相比，所述通用或归一化兔抗体表现出改善的表达。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述通用或归一化兔抗体为一级兔抗体。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变在所述κ链的J1区中。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变在所述κ链的FR4区中。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变在所述重链的J2、J4和/或J6区中。

13.根据权利要求1所述的方法，其中当与所述未修饰的野生型抗体的结合亲和力相比时，所述抗体与其靶标的结合亲和力保持在可接受范围内。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变在互补决定区中。

15.一种通用或归一化兔抗体，其通过根据权利要求1-14中任一项所述的方法获得。

16.一种通用或归一化兔抗体，其在VH区中包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9和SEQ ID NO:10。

17.一种通用或归一化兔抗体，其在Vk区中包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。

18.一种通用或归一化兔抗体，其在所述VH区中包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，并且在所述Vk区中包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变的通用或归一化抗体具有用于诊断用途的改善的特性。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述改善的特性选自由以下项组成的组：热稳定性、长期稳定性、降低的聚集作用以及降低的氧化作用/脱酰胺基作用。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变不在所述互补决定区中。

22.一种改善用于诊断用途的抗体中的一种或多种特性的方法，其包括

(a)选择野生型兔抗体，所述野生型兔抗体在选自由以下项组成的组的一种或多种特征中具有缺陷：重组表达、热稳定性、长期稳定性、聚集作用以及氧化作用/脱酰胺基作用；

(b)将所述野生型抗体序列与归一化抗体序列进行比较，所述归一化抗体序列在可变框架和/或结合区中包含一组氨基酸残基，所述一组氨基酸残基最常出现在已知具有在可接受范围内的(a)的所述特征的一组兔抗体中的相同位置处；并且鉴定与归一化序列不同的所述野生型抗体中的一个或多个氨基酸残基；以及

(c)将在步骤(b)中鉴定的所述野生型抗体的一个或多个氨基酸残基突变为所述归一化序列的相应氨基酸残基，其中步骤(a)中的一种或多种特征相对于所述未修饰的野生型抗体得到改善。

23.一种制造重组兔单克隆抗体的方法，其包括

(a)选择野生型兔抗体；

(b)将所述野生型抗体序列与归一化抗体序列进行比较，所述归一化抗体序列在可变框架和/或结合区中包含一组氨基酸残基，所述一组氨基酸残基最常出现在已知具有在可接受范围内的特征的一组兔抗体中的相同位置处，所述特征选自由以下项组成的组：热稳定性、长期稳定性、降低的聚集作用以及降低的氧化作用/脱酰胺基作用；并且鉴定与归一化序列不同的所述野生型抗体中的一个或多个氨基酸残基；以及

(c)制备编码互补决定区的标准表达载体，所述互补决定区包含在步骤(b)中鉴定的一个或多个残基中对野生型序列的改变；

(d)在合适的宿主细胞中表达所述载体；以及

(e)从步骤(d)纯化所述抗体。

24.根据权利要求1-14或19-23中任一项所述的方法，其中所述归一化序列的所述一组氨基酸残基最常出现在至少50个具有相关特征的兔抗体中的相同位置处。

25.根据权利要求1-14或19-23中任一项所述的方法，其中所述归一化序列的所述一组氨基酸残基最常出现在至少100个具有所述相关特征的兔抗体中的相同位置处。

26.根据权利要求1-14或19-23中任一项所述的方法，其中所述归一化序列的所述一组氨基酸残基最常出现在至少150个具有所述相关特征的兔抗体中的相同位置处。

27.根据权利要求1-14或19-23中任一项所述的方法，其中所述归一化序列的所述一组氨基酸残基最常出现在至少200个具有所述相关特征的兔抗体中的相同位置处。

28.根据权利要求1-14或19-23中任一项所述的方法，其中所述归一化序列的所述一组氨基酸残基最常出现在至少250个具有所述相关特征的兔抗体中的相同位置处。

29.根据权利要求1-14或19-23中任一项所述的方法，其中所述归一化序列的所述一组氨基酸残基最常出现在至少300个具有所述相关特征的兔抗体中的相同位置处。