CN117242094A - 蛋白酶可切割的前药 - Google Patents

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CN117242094A CN202280027641.9A CN202280027641A CN117242094A CN 117242094 A CN117242094 A CN 117242094A CN 202280027641 A CN202280027641 A CN 202280027641A CN 117242094 A CN117242094 A CN 117242094A
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Abstract

本申请涉及前药，这些前药包含通过蛋白酶可切割的肽接头连接至结合物的药物分子，该结合物可逆地抑制该药物分子的生物活性，并且涉及抑制性结合物本身。还描述了编码本文所述的重组蛋白的核酸，和制备所述重组蛋白的方法，以及这些重组蛋白的治疗方法和医学用途。

Description

蛋白酶可切割的前药
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年3月9日提交的US 63/158,785和于2021年3月10日提交的US63/159,043的优先权权益。这些专利申请的公开内容以引用方式整体并入本文用于所有目的。
技术领域
本申请涉及前药，这些前药包含通过蛋白酶可切割的肽接头连接至结合物的药物分子，该结合物可逆地抑制该药物分子的生物活性，并且涉及抑制性结合物本身。还描述了编码本文所述的重组蛋白的核酸，和制备所述重组蛋白的方法，以及这些重组蛋白的治疗方法和医学用途。
背景技术
药物候选物必须满足某些功效标准，但它们也必须表现出可接受的安全特性。许多药物分子具有一些不良的脱靶(off-target)和/或靶上(on-target)副作用，并且一些药物分子也可能由于对药物分子的预期靶标的夸大的和不良的药理学作用而导致不利的靶上作用。对于某些药物种类，不良作用不能避免，因此它们必须被减轻。对此有几种选择。例如，非类固醇类抗炎药(NSAID)可损害胃的内层，因此它们通常与保护胃的药剂(诸如质子泵抑制剂奥美拉唑(omeprazole))共施用。对于其他药物分子，不良作用或其风险可使用特定剂量方案来减轻，使得药物以多剂量或在较长时间内连续地施用于患者。这种情况的示例可以包括每天多次服用药物，或静脉内(IV)输注药物。
尽管分次剂量和IV药物输注是公认的和可接受的给药方式，但它们并非没有缺点。对患者而言繁重的剂量方案，诸如在相对短的时间段内需要多次用药的那些剂量方案，与差的患者依从性以及因此更差的治疗结果相关。尽管IV输注方法不太可能遭受差的患者依从性，但患者必须在医疗护理下。这对于患者是破坏性的，并且导致对医疗保健系统增加的负担。因此，本领域需要减轻不良药物作用的改进方式。
一类通常与不良作用相关的药物是抗癌剂。T细胞接合剂药物(TCE)通过同时与靶细胞上的肿瘤相关抗原(TAA)和T细胞上的CD3受体结合，从而形成人工免疫突触，来引导细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的应答。它们已被证明是非常有效的抗肿瘤药物，如通过博纳吐单抗(blinatumomab)(一种α-CD19×α-CD3双特异性抗体)所例示的。然而，针对血液肿瘤和实体瘤的TCE的开发受到几个因素的阻碍。除了抗肿瘤活性外，TCE也与全身性内皮活化和大量淋巴细胞再分布以及神经毒性相关，特别是在首次剂量施用后(Velasquez,Blood,2018,131(1),30-38)。TCE还与由T细胞的靶上/肿瘤外募集和细胞因子释放综合征(CRS)和高细胞因子血症(也称为“细胞因子风暴”)引起的严重毒性相关。
CRS或高细胞因子血症通常在第一剂药物后迅速发生，并且其特征在于体内细胞因子的不受控制的过量释放。虽然细胞因子释放是正常免疫功能的关键部分，但是过多的细胞因子过快地释放到血液中会导致诸如高热、发炎、严重疲劳、恶心以及有时甚至是多器官衰竭和死亡的症状。在参与者发展出严重的高细胞因子血症后，不得不放弃意欲用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病和类风湿关节炎的药物西拉利珠单抗(Theralizumab)的临床试验。症状的发作在给药一小时内发生，并且试验中的所有参与者都需要紧急的医院护理。CRS还由受免疫疗法影响的免疫细胞向血液中大量、快速释放细胞因子引起。CRS的症状包括发烧、恶心、头痛、皮疹、快速心跳、低血压和呼吸困难。有时，CRS可能是严重的或威及生命的。
在肿瘤和健康组织两者上表达靶抗原的患者中出现了由于靶上/肿瘤外毒性导致的免疫疗法的严重不良作用。这种表达模式对于用于靶向癌症疗法的许多靶抗原是典型的，诸如例如表皮生长因子受体(EGFR)家族的某些成员。这种抗原的一个示例是Her2，其是用于癌症疗法的有吸引力的靶标，因为它可以在肿瘤中过表达40倍至100倍。长期以来，使用单克隆抗体诸如曲妥珠单抗对Her2进行靶向治疗。Her2也已被免疫疗法靶向。一种基于曲妥珠单抗序列的Her2 CAR-T细胞疗法被用于治疗患有结肠直肠癌的患者，并且不幸的是，对患者的心肺系统的肿瘤外靶向引起致死毒性(Morgan等人,MolTher.,2010；18(4):843–851)。细胞输注后的血清样品显示出各种细胞因子的显著增加，这与细胞因子风暴一致，并且这种细胞因子风暴可能是由所施用的细胞对肺上皮细胞上低水平的Her2的识别所触发的。基于曲妥珠单抗的临床研究或基于临床前动物研究，没有预见到这种不良作用。
这些毒性经常影响临床试验设计和剂量递增策略，并且已经证明尤其是在具有高疾病负荷的患者中，由于严重程度而具有剂量限制。也可能需要预先用药和/或主动干预，最终导致复杂的临床试验设计。已经设计了几种策略用于与施用T细胞接合剂药物相关的CRS的临床管理。这些策略包括逐步给药(逐步剂量递增)、用类固醇(尤其是地塞米松(dexamethasone))预治疗或用托珠单抗(tocilizumab)(抗IL6受体抗体)治疗(参见例如Aldoss等人Current Oncology Reports，2019，21:4)。用类固醇的预治疗延迟了治疗的开始，这对于侵袭性疾病状态是不推荐的，并且在具有高体重指数(BMI)和/或血压的患者中使用类固醇可能是禁忌的。FDA在2017年批准用托珠单抗治疗以避免CRS。然而，这种药物的免疫抑制作用可使患者易受其他感染性疾病的伤害。
总之，仍然需要新的或改进的方法来避免、减少或减轻用于治疗疾病(包括癌症)的药物的不良作用或其风险。
发明内容
本申请寻求提供一种避免或减轻施用药物分子后的不良作用或其风险的新方法。本发明提供了一种通过结合部分抑制药物分子的生物活性的方法，该结合部分可逆地结合至该药物分子并且通过蛋白酶可切割的肽接头连接至该药物分子。被该结合部分抑制的该药物分子的生物活性可以是例如该药物分子与生物靶标的结合。在通过蛋白酶(诸如在肿瘤组织中表达的蛋白酶)切割肽接头时，该结合部分从该药物分子解离，从而在蛋白水解切割的位点处将活性药物分子释放到体内。这种方法避免了施用后不久体内活性药物分子浓度达到峰值，并将活性药物分子的释放定位于适当蛋白酶的表达位点。这种方法的有益应用的一个示例是在施用包含TCE和通过蛋白酶可切割的肽接头与其连接的抑制性结合部分的前药TCE蛋白之后，降低靶上/肿瘤外毒性和CRS的风险。
本申请描述了新的前药蛋白，这些前药蛋白包含(i)结合部分和(ii)药物分子；其中所述结合部分可逆地结合至所述药物分子；其中所述结合部分当结合时抑制所述药物分子的生物活性；其中所述结合部分和所述药物分子通过肽接头连接；并且其中所述肽接头包含一个或多个蛋白酶切割位点。优选地，可切割肽接头的蛋白酶在药物分子的靶组织(诸如肿瘤组织)中以升高的水平表达。在本申请中还描述了特异性结合部分，其可以与各种药物分子组合用于此类前药方法中。本发明的结合部分可以是药物分子的抗独特型结合物。在一些实施方案中，本发明的前药蛋白还包含血清半衰期延长部分。优选地，此类半衰期延长部分与该抑制性结合部分共价连接，使得在肽接头被蛋白水解切割时，该半衰期延长部分与该结合部分一起从药物分子上被切割下来。以这种方式，前药蛋白具有延长的血清半衰期，但在肽接头被蛋白水解切割时释放的活性药物分子没有延长的血清半衰期。因此，药物分子的生物活性的持续时间相对较短，从而进一步有助于避免在活性药物分子从肿瘤组织分布到体内其他部位时可能发生的靶上/肿瘤外毒性。
在这种前药方法的具体应用中，本发明提供了一种TCE前药(CD3-PDD)，该前药包含TAA结合物和CD3结合物，经由蛋白酶可切割的接头连接至抗独特型抗CD3结合物结合部分(下文称为结合物)，参见图1。这种α-TAA×α-CD3×结合物前药在其非切割状态下无法结合并募集T细胞，但被设计成在肿瘤微环境(TME)中在通过肿瘤相关蛋白酶切割接头时被活化。
此类蛋白酶可活化的前药的基本理念是利用肿瘤微环境中的蛋白酶的错误调节，即通过构建前药分子，该前药分子在循环和健康组织中是非活性的，但一旦进入TME，就会因肿瘤相关蛋白酶切割蛋白酶敏感性接头而被活化，参见图1。
前药的阻断概念依赖于“强制接近”现象，即接近CD3结合物的非常高浓度的结合物。这是由于接头所施加的距离约束，使得结合物只能接触CD3结合物周围的一定体积。当通过肿瘤相关蛋白酶切割接头时，强制接近被消除，并且结合物可以自由扩散开，仅受结合物与CD3结合物之间的解离速率限制。
在一个实施方案中，半衰期延长部分(诸如HSA结合物)附接至TCE前药分子的阻断部分(即，结合物)。这提供了另一层安全保障：在切割时，T细胞接合剂被赋予活性，但同时失去其半衰期延长部分。因此，从TME回漏到循环中的活性TCE由于其小尺寸和短半衰期而被快速从系统中清除。
总之，本文描述了一种可条件活化的TCE前药，其显示出与对应的组成型活性(即非阻断型)TCE类似的功效，但没有毒性。所描述的前药方法为未来前药TCE治疗剂的开发带来了希望，使得能够利用肿瘤相关抗原(TAA)作为高效TCE的靶标，即使这些肿瘤相关抗原也在一些非靶向组织(即健康组织)中表达。
综上所述，本发明提供了可条件活化的前药，这些前药包含通过蛋白酶可切割的肽接头连接至结合部分的药物分子，当结合时，该结合部分抑制该药物分子的生物活性。此外，本发明提供了可用于各种前药的抑制性结合部分本身。还提供了编码本文所述的重组蛋白的核酸，和使用宿主细胞制备所述重组蛋白的方法，以及使用该重组蛋白的医学用途和治疗方法。
基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将认识到或仅能够使用常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下实施方案(E)涵盖。
在第一实施方案中，本发明涉及一种重组蛋白，所述重组蛋白包含(i)结合部分和(ii)药物分子；
其中所述结合部分可逆地结合至所述药物分子；
其中所述结合部分当结合时抑制所述药物分子的生物活性；其中
所述结合部分和所述药物分子通过肽接头连接；并且其中所述肽接头包含蛋白酶切割位点。
在第二实施方案中，本发明涉及根据实施方案1所述的重组蛋白，其中所述结合部分包含抗体、替代性支架或多肽。
在第三实施方案中，本发明涉及根据实施方案1或2所述的重组蛋白，其中所述结合部分包含免疫球蛋白分子或其片段。
在第四实施方案中，本发明涉及根据实施方案1或2所述的重组蛋白，其中所述结合部分包含非免疫球蛋白分子。
在第五实施方案中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的重组蛋白，其中所述结合部分包含衍生自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单结构域抗体、重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)或可变结构域(VHH)的抗原结合结构域。
在第六实施方案中，本发明涉及根据实施方案1至4中任一项所述的重组蛋白，其中所述结合部分包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域衍生自以下项或与以下项相关：阿德耐汀(adnectin)、单抗体、亲和体(affibody)、阿菲林(affilin)、阿菲默(affimer)、适体、阿非汀(affitin)、α抗体(alphabody)、抗运载蛋白(anticalin)、重复蛋白结构域、犰狳重复结构域、阿去默(atrimer)、阿维默(avimer)、锚蛋白重复结构域、非诺莫(fynomer)、打结素(knottin)、库尼兹结构域(Kunitz domain)或T细胞受体(TCR)。
在第七实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述药物分子的所述生物活性是所述药物分子与生物靶标的结合。
在第八实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述药物分子的所述生物活性是酶活性。
在第九实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中当将所述重组蛋白施用于哺乳动物时，所述肽接头在所述蛋白酶切割位点处的切割允许所述药物分子从所述结合部分释放。
在第十实施方案中，本发明涉及根据实施方案9所述的重组蛋白，其中所述哺乳动物是人。
在第十一实施方案中，本发明涉及根据实施方案9和10中任一项所述的重组蛋白，其中所述肽接头的所述切割发生在肿瘤组织中。
在第十二实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶切割位点是被肿瘤组织中存在的蛋白酶识别的位点。
在第十三实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述结合部分以小于约1μM，诸如小于约1μM、小于约500nM、小于约250nM、小于约100nM或小于约50nM的解离常数(KD)结合所述药物分子。
在第十四实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述结合部分以约1μM与约10pM之间，诸如约1μM与约10pM之间、约1μM与约20pM之间、约1μM与约50pM之间或约1μM与约100pM之间的离解常数(KD)结合所述药物分子。
在第十五实施方案中，本发明涉及根据实施方案13或14所述的重组蛋白，其中所述解离常数(KD)是在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中测量的。
在第十六实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述结合部分包含经设计的锚蛋白重复结构域。
在第十七实施方案中，本发明涉及根据实施方案16所述的重组蛋白，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:45至64，以及(2)其中SEQ ID NO:45至64中的任一者中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
在第十八实施方案中，本发明涉及根据实施方案16或17所述的重组蛋白，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:1至12，以及(2)与SEQ ID NO:1至12中的任一者具有至少85％氨基酸序列同一性的序列。
在第十九实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含抗体、替代性支架或多肽。
在第二十实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含免疫球蛋白分子或其片段。
在第二十一实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含非免疫球蛋白分子。
在第二十二实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含衍生自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单结构域抗体、重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)或可变结构域(VHH)的抗原结合结构域。
在第二十三实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域衍生自以下项或与以下项相关：阿德耐汀、单抗体、亲和体、阿菲林、阿菲默、适体、阿非汀、α抗体、抗运载蛋白、重复蛋白结构域、犰狳重复结构域、阿去默、阿维默、锚蛋白重复结构域、非诺莫、打结素、库尼兹结构域或T细胞受体(TCR)。
在第二十四实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述药物分子对CD3具有结合特异性。
在第二十五实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含至少一个对肿瘤相关抗原(TAA)具有结合特异性的结合结构域。
在第二十六实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含经设计的锚蛋白重复结构域。
在第二十七实施方案中，本发明涉及根据实施方案26所述的重组蛋白，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域对CD3具有结合特异性。
在第二十八实施方案中，本发明涉及根据实施方案26和27中任一项所述的重组蛋白，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQID NO:13至17，以及(2)与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少85％氨基酸序列同一性的序列。
在第二十九实施方案中，本发明涉及根据实施方案27和28中任一项所述的重组蛋白，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域以小于约100nM的解离常数(KD)结合至CD3。
在第三十实施方案中，本发明涉及根据实施方案1至25中任一项所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含抗体。
在第三十一实施方案中，本发明涉及根据实施方案30所述的重组蛋白，其中所述抗体对CD3具有结合特异性。
在第三十二实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述药物分子是T细胞接合剂药物分子(TCE)。
在第三十三实施方案中，本发明涉及根据实施方案32所述的重组蛋白，其中所述TCE包含结合至CD3的结合结构域并且还包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域。
在第三十四实施方案中，本发明涉及根据实施方案32和33中任一项所述的重组蛋白，其中所述结合部分与所述TCE药物分子的结合抑制所述TCE药物分子与T细胞的结合和/或T细胞的活化。
在第三十五实施方案中，本发明涉及根据实施方案32至34中任一项所述的重组蛋白，其中所述TCE是双特异性或多特异性抗体。
在第三十六实施方案中，本发明涉及根据实施方案32至34中任一项所述的重组蛋白，其中所述TCE是双特异性或多特异性锚蛋白重复蛋白。
在第三十七实施方案中，本发明涉及根据实施方案33至36中任一项所述的重组蛋白，其中所述结合至CD3的结合结构域位于所述结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域的C-末端侧。
在第三十八实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述结合部分是所述药物分子的抗独特型结合物。
在第三十九实施方案中，本发明涉及根据实施方案38所述的重组蛋白，其中所述结合部分是对CD3具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域的抗独特型结合物。
在第四十实施方案中，本发明涉及根据实施方案38所述的重组蛋白，其中所述结合部分是对CD3具有结合特异性的所述抗体的抗独特型结合物。
在第四十一实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，其中所述结合部分、所述药物分子和所述肽接头从N-末端至C-末端按以下格式排列：药物分子–肽接头–结合部分。
在第四十二实施方案中，本发明涉及根据实施方案1至41中任一项所述的重组蛋白，其中所述结合部分、所述结合至CD3的结合结构域、所述结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域和所述肽接头从N-末端至C-末端按以下格式排列：结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域–结合至CD3的结合结构域–肽接头–结合部分。
在第四十三实施方案中，本发明涉及根据任一前述实施方案所述的重组蛋白，所述重组蛋白还包含延长重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂。
在第四十四实施方案中，本发明涉及根据实施方案43所述的重组蛋白，其中所述延长重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂具有对血清白蛋白的结合特异性。
在第四十五实施方案中，本发明涉及根据实施方案44所述的重组蛋白，其中所述延长重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂包含对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。
在第四十六实施方案中，本发明涉及根据实施方案45所述的重组蛋白，其中所述对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:65至67，以及(2)与SEQ ID NO:65至67中的任一者具有至少85％氨基酸序列同一性的序列。在另外的实施方案中，本发明涉及根据实施方案46所述的重组蛋白，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域以小于约100nM的解离常数(KD)结合至人血清白蛋白。
在第四十七实施方案中，本发明涉及根据实施方案43至46中任一项所述的重组蛋白，其中所述延长重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂与所述结合部分位于所述肽接头的同一侧。
在第四十八实施方案中，本发明涉及根据实施方案47所述的重组蛋白，其中所述结合部分和所述延长重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂均位于所述肽接头的C-末端侧。
在第四十九实施方案中，本发明涉及根据实施方案43至47中任一项所述的重组蛋白，其中所述延长重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂位于所述结合部分的C-末端侧。
在第五十实施方案中，本发明涉及根据实施方案43至49中任一项所述的重组蛋白，其中所述结合部分、所述结合至CD3的结合结构域、所述结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域、所述肽接头和所述延长重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂从N-末端至C-末端按以下格式排列：结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域–结合至CD3的结合结构域–肽接头–结合部分–延长重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂。
在第五十一实施方案中，本发明涉及一种核酸，所述核酸编码根据前述实施方案中任一项所述的重组蛋白。
在第五十二实施方案中，本发明涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案51所述的核酸分子。
在第五十三实施方案中，本发明涉及一种制备根据实施方案1至50中任一项所述的重组蛋白的方法，所述方法包括在其中表达所述重组蛋白的条件下培养根据实施方案52所述的宿主细胞。
在第五十四实施方案中，本发明涉及根据实施方案53所述的方法，其中所述宿主细胞是原核宿主细胞。
在第五十五实施方案中，本发明涉及根据实施方案53所述的方法，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
在第五十六实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1至50中任一项所述的重组蛋白或根据实施方案51所述的核酸，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
在第五十七实施方案中，本发明涉及根据实施方案1至50中任一项所述的重组蛋白、根据实施方案51所述的核酸或根据实施方案56所述的药物组合物，所述重组蛋白、所述核酸或所述药物组合物在疗法中使用。
在第五十八实施方案中，本发明涉及根据实施方案57所述使用的重组蛋白、核酸或药物组合物，所述使用的重组蛋白、核酸或药物组合物在治疗增殖性疾病中使用，任选地其中所述增殖性疾病是癌症。
在第五十九实施方案中，本发明涉及一种治疗方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据实施方案1至50中任一项所述的重组蛋白、根据实施方案51所述的核酸或根据实施方案56所述的药物组合物的步骤。
在第六十实施方案中，本发明涉及根据实施方案59所述的方法，其中所述方法是治疗增殖性疾病的方法，任选地其中所述增殖性疾病是癌症。
在第六十一实施方案中，本发明涉及一种在有需要的受试者中活化T细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案1至50中任一项所述的重组蛋白、根据实施方案51所述的核酸或根据实施方案56所述的药物组合物的步骤。
在第六十二实施方案中，本发明涉及一种控制体内活性药物分子释放的方法，所述方法包括将根据实施方案1至50中任一项所述的重组蛋白、根据实施方案51所述的核酸或根据实施方案56所述的药物组合物施用于有需要的受试者。
在第六十三实施方案中，本发明涉及根据实施方案59至62中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
在第六十四实施方案中，本发明涉及一种控制药物分子的生物活性的方法，所述方法包括将根据实施方案1至6、13至18和38至40中任一项所定义的结合部分与根据实施方案19至37中任一项所定义的药物分子用包含蛋白酶切割位点的肽接头连接起来，以形成重组蛋白，并将所述重组蛋白施用于有需要的患者，其中所述蛋白酶切割位点被肿瘤组织中存在的蛋白酶识别。
在第六十五实施方案中，本发明涉及根据实施方案64所述的方法，其中所述药物分子的所述生物活性是所述药物分子与生物靶标的结合。
在第六十六实施方案中，本发明涉及根据实施方案64所述的方法，其中所述药物分子的所述生物活性是酶活性。
在第六十七实施方案中，本发明涉及一种对药物分子具有结合特异性的结合部分，其中当通过肽接头与所述药物分子连接时，所述结合部分抑制所述药物分子的生物活性。
在第六十八实施方案中，本发明涉及根据实施方案67所述的结合部分，其中所述结合部分与所述药物分子的结合形成可逆地抑制所述药物分子的生物活性的复合物。
在第六十九实施方案中，本发明涉及根据实施方案67或68中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分是所述药物分子的抗独特型结合物。
在第七十实施方案中，本发明涉及根据实施方案67至69中任一项所述的结合部分，其中所述药物分子的所述生物活性是所述药物分子与生物靶标的结合。
在第七十一实施方案中，本发明涉及根据实施方案67至69中任一项所述的结合部分，其中所述药物分子的所述生物活性是酶活性。
在第七十二实施方案中，本发明涉及根据实施方案67至71中任一项所述的结合部分，所述结合部分对所述药物分子具有小于约1μM，诸如小于约1μM、小于约500nM、小于约250nM、小于约100nM或小于约50nM的结合亲和力(KD)。
在第七十三实施方案中，本发明涉及根据实施方案67至72中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分以约1μM与约10pM之间，诸如约1μM与约10pM之间、约1μM与约20pM之间、约1μM与约50pM之间或约1μM与约100pM之间的离解常数(KD)结合所述药物分子。
在第七十四实施方案中，本发明涉及根据实施方案72或73所述的结合部分，其中所述解离常数(KD)是在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中测量的。
在第七十五实施方案中，本发明涉及根据实施方案67至74中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含抗体、替代性支架或多肽。
在第七十六实施方案中，本发明涉及根据实施方案67至75中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含免疫球蛋白分子或其片段。
在第七十七实施方案中，本发明涉及根据实施方案67至76中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含非免疫球蛋白分子。
在第七十八实施方案中，本发明涉及根据实施方案67至77中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含衍生自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单结构域抗体、重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)或可变结构域(VHH)的抗原结合结构域。
在第七十九实施方案中，本发明涉及根据实施方案67至78中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域衍生自以下项或与以下项相关：阿德耐汀、单抗体、亲和体、阿菲林、阿菲默、适体、阿非汀、α抗体、抗运载蛋白、重复蛋白结构域、犰狳重复结构域、阿去默、阿维默、锚蛋白重复结构域、非诺莫、打结素、库尼兹结构域或T细胞受体(TCR)。
在第八十实施方案中，本发明涉及根据实施方案67至79中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含经设计的锚蛋白重复结构域。
在第八十一实施方案中，本发明涉及根据实施方案80所述的结合部分，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:45至64，以及(2)其中SEQ ID NO:45至64中的任一者中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
在第八十二实施方案中，本发明涉及根据实施方案80或81中任一项所述的结合部分，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQID NO:1至12，以及(2)与SEQ ID NO:1至12中的任一者具有至少85％氨基酸序列同一性的序列。
在第八十三实施方案中，本发明涉及一种核酸，所述核酸编码根据实施方案67至82中任一项所述的结合部分。
在第八十四实施方案中，本发明涉及一种核酸，所述核酸编码根据实施方案80至82中任一项所述的经设计的锚蛋白重复结构域。
在第八十五实施方案中，本发明涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案83或84所述的核酸分子。
在第八十六实施方案中，本发明涉及一种制备根据实施方案67至82中任一项所述的结合部分的方法，所述方法包括在其中表达所述结合部分的条件下培养根据实施方案85所述的宿主细胞。
在第八十七实施方案中，本发明涉及根据实施方案86所述的方法，其中所述宿主细胞是原核宿主细胞。
在第八十八实施方案中，本发明涉及根据实施方案86所述的方法，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
在第八十九实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案67至82中任一项所述的结合部分或根据实施方案83和84中任一项所述的核酸，以及药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
在第九十实施方案中，本发明涉及根据实施方案67至82中任一项所述的结合部分、根据实施方案83和84中任一项所述的核酸或根据实施方案89所述的药物组合物，所述结合部分、所述核酸或所述药物组合物在疗法中使用。
在第九十一实施方案中，本发明涉及一种治疗方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据实施方案67至82中任一项所述的结合部分、根据实施方案83和84中任一项所述的核酸或根据实施方案89所述的药物组合物。
附图说明
图1：可条件活化的前药方法的图解说明。前药分子包含：(1)药物分子(在所示示例中包含肿瘤相关抗原(TAA)结合结构域(α-TAA)和CD3结合结构域(α-CD3))；(2)能够可逆地结合至药物分子并且当结合时抑制药物分子的生物活性的结合部分(在所示示例中为针对α-CD3(结合物)的互补位的抗独特型结合结构域)；和(3)任选地，半衰期延长部分(在所示示例中为用于完整前药分子的半衰期延长的HSA结合结构域(α-HSA))。药物分子与结合部分之间的接头(在所示示例中为α-CD3与结合物之间的接头)包含可被蛋白酶(在所示示例中为存在于肿瘤微环境(TME)中的一种或多种蛋白酶)切割的肽接头。前药分子(在所示示例中为TCE前药(CD3-PDD))在注射到循环中时是无活性的，因为药物分子与其靶标的结合(在所示示例中为通过α-CD3与T细胞的结合)被共价连接的结合部分(在所示示例中为结合物)抑制。一旦到达药物分子的靶组织(在所示示例中为肿瘤组织)，药物分子与结合部分之间的肽接头(在所示示例中为α-CD3与结合物之间的肽接头)就被靶组织中存在的蛋白酶(在所示示例中为一种或多种肿瘤相关蛋白酶)切割。一旦肽接头被切割，结合部分就从药物分子扩散开并且药物分子可以发挥其生物活性(在所示示例中，通过其α-TAA臂与肿瘤细胞上的TAA结合并且通过其α-CD3臂与T细胞上的CD3结合，从而导致T细胞介导的肿瘤细胞杀伤)。
图2：四个不同的结合部分(结合物#1至结合物#4；SEQ ID NO:1至4，参见实施例1)对五个不同的CD3特异性结合结构域(SEQ ID NO:13至17)(在顶部)的亲和力(KD，以nM计)，如通过表面等离子体共振(SPR)在室温下所确定的。通过使用生物素化的结合物作为配体并使用CD3特异性结合结构域作为分析物，确定以nM计的KD值。亲本结合物#1(SEQ ID NO:1)对五个不同的CD3结合结构域显示出最高的亲和力，其次是结合物#4(SEQ ID NO:4)以及两个低亲和力结合部分结合物#2(SEQ ID NO:2)和结合物#3(SEQ ID NO:3)。
图3A和3B：使用来自一个代表性供体(三个供体中的一个)的HCT 116肿瘤细胞和泛T细胞并将具有两个不同抗CD3结合结构域(对CD3具有较低亲和力的C7v119(SEQ ID NO:15)或对CD3具有较高亲和力的C7v122(SEQ ID NO:16))的活性TCE构建体与其对应的、不可切割的CD3前药(CD3-PDD NCL)对应物(即含有不可切割的肽接头而不是蛋白酶可切割的肽接头)进行比较的标准肿瘤细胞杀伤测定。A)使用通过不可切割接头连接至CD3结合结构域的活性TCE(空正方形)、含有CD3-PDD NCL的结合物#3(SEQ ID NO:3)(空三角形，向下)或含有CD3-PDD NCL的结合物#4(SEQ ID NO:4)(空三角形，向上)，在CD3结合结构域C7v119的背景下，泛T细胞对HCT 116肿瘤细胞的T细胞介导的杀伤。与较低亲和力结合物#3相比，对CD3结合结构域具有更高亲和力的结合物#4(参见图2)显示出更高的掩蔽效率。B)与A)相同的实验设置，但在CD3结合结构域C7v122的背景下，使用活性TCE(实心正方形)或CD3-PDD NCL(实心三角形，向上和向下)。在C7v122 CD3结合结构域的情况下，结合物#3和#4的掩蔽效率高于A)中所示的构建体的掩蔽效率，这与图2中所示的亲和力一致。
图4：使用活性TCE(含有C7v14 CD3结合结构域(SEQ ID NO:13))和CD3-PDD NCL(含有C7v14 CD3结合结构域(SEQ ID NO:13)和结合物#3(SEQ ID NO:3))，使用具有约200k抗原结合位点(ABS)/细胞的EGFR高表达A431肿瘤细胞(EGFR+++)和具有约20k ABS/细胞的EGFR中表达HCT 116肿瘤细胞(EGFR+)的标准T细胞活化测定。与活性TCE相比，CD3-PDD NCL的掩蔽效率对于EGFR+HCT 116细胞(空心三角形对空心正方形)比对EGFR+++A431肿瘤细胞(实心三角形对实心正方形)高得多。
图5：在不添加蛋白裂解酶(matriptase)(凝胶左侧)以及在添加蛋白裂解酶后在37℃下温育24小时(凝胶右侧)的情况下，含有不同可切割接头的CD3-PDD NCL(三角形)和两个CD3-PDD(分别为CL、黑色和灰色圆圈)。具有不可切割接头的CD3-PDD NCL不受添加蛋白裂解酶的影响，而两个CD3-PDD CL实际上被完全切割成活性TCE(2个结构域；2D)和结合物(1个结构域；1D)。标明了全长3-结构域CD3-PDD(3D)、2-结构域活性TCE(2D)和1-结构域切割后结合物(1D)的条带。
图6：不可切割的CD3-PDD NCL和三种不同的可切割的CD3-PDD CL(在它们的可切割接头序列方面不同)的切割速率。在37℃下在2.5μM的底物浓度下研究五种不同的重组肿瘤相关蛋白酶(蛋白裂解酶、尿激酶、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-7(MMP-7)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9))的切割速率，并表示为切割速率(1/min)。
图7：使用活性TCE(正方形)、不可切割的CD3-PDD NCL(三角形)和可切割的CD3-PDD CL(圆形)，针对HCT 116野生型(wt)细胞或HCT 116EGFR敲除(KO)细胞作为靶细胞的标准肿瘤细胞杀伤(A)和T细胞活化(B)测定。对于HCT 116wt细胞上的活性TCE观察到有效的肿瘤细胞杀伤和T细胞活化，并且对于CD3-PDD CL观察到较低程度的肿瘤细胞杀伤和T细胞活化，据推测这是由于HCT 116细胞分泌的蛋白酶对CD3-PDD CL的切割(参见图7)。对于HCT116wt细胞，不可切割的CD3-PDD NCL没有显示肿瘤细胞杀伤和T细胞活化。在不存在TAA(HCT 116KO细胞)的情况下，对于任何构建体都没有观察到肿瘤细胞杀伤或T细胞活化。
图8：在使用泛T细胞和A431肿瘤细胞的T细胞活化测定(48小时)结束时，对不可切割和可切割的CD3-PDD(两种不同的可切割接头#2和#3，另见图6)样品的免疫沉淀-蛋白质印迹。对含有最高浓度化合物(10nM)的样品进行免疫沉淀，并在蛋白质印迹上可视化，其中通过抗DARPin抗体进行检测。CD3-PDD NCL在测定结束时没有显示出切割，而两个不同的可切割构建体显示出不同程度的切割，这与左图中描绘的两个构建体的相应T细胞活化掩蔽窗口大致对应。
图9：对连接在CD3-PDD NCL的C-末端处的α-HSA结合结构域的掩蔽效率的影响，如通过使用泛T-细胞和HCT 116肿瘤细胞的标准肿瘤细胞杀伤测定所确定的。活性TCE(正方形)与CD3-PDD NCL(三角形)或半衰期延长的(HLE)CD3-PDD NCL(菱形)之间的掩蔽效率在图A)所示的构建体中几乎没有变化。该图描绘了具有结合物#1(SEQ ID NO:1)的CD3-PDD构建体，其表现出对CD3结合结构域的高亲和力(<1nM KD)。B)在将α-HSA结合结构域添加到CD3-PDD NCL的C-末端时，含有较低亲和力结合物#3(SEQ ID NO:3)(>100nM KD)的构建体显示出掩蔽效率的轻微降低。
图10：用于体内实验的构建体的肿瘤细胞结合(HCT 116细胞)、T细胞结合(Jurkat细胞)、T细胞活化和肿瘤细胞杀伤体外数据(HCT 116细胞和泛T细胞)(示于图11中)。生成活性TCE(正方形)、不可切割的CD3-PDD NCL(三角形)、可切割的CD3-PDD CL(圆形)和含有CD3结合结构域C7v119(SEQ ID NO:15)(对CD3的亲和力较低)或C7v122(SEQ ID NO:16)(对CD3的亲和力较高)的预切割的CD3-PDD CL(半实心的圆形)的数据。对于所有CD3-PDD构建体，使用结合物#4(SEQ ID NO:4)来掩蔽CD3结合结构域C7v119或C7v122。与CD3-PDD NCL相比，可切割的CD3-PDD CL的T细胞活化和肿瘤细胞杀伤显示出减少的掩蔽，这是由于肿瘤细胞分泌的蛋白酶对构建体的切割(参见图8)。所示的活化和杀伤数据是用来自三个个体人供体的泛T细胞进行三次的代表性实验。
图11：在移植了HCT 116肿瘤细胞的人源化小鼠模型(用来自人脐带血的造血干细胞(CD34+)人源化)中，活性TCE、可切割的CD3-PDD CL和不可切割的CD3-PDD NCL的体内实验。由于构建体的EGFR结合结构域是人-小鼠交叉反应性的并且被证明在hHSC-人源化小鼠中引起强毒性，因此针对抗肿瘤功效和安全读出两者选择模型。A)研究设计为4组，每组每6只小鼠，每天治疗(媒介物对照、CD3-PDD CL和CD3-PDD NCL)或由于强毒性发现而间歇治疗(活性TCE)。所有构建体都是非半衰期延长的。B)四组的平均肿瘤生长曲线，在顶部用黑色箭头表示各组的治疗。误差条描绘了n＝6的SEM值，除了组#2(活性TCE)，其中由于强毒性，2只小鼠在第12天死亡，1只小鼠在第13天死亡。C)四组的单个肿瘤生长曲线，各图上方的黑色箭头表示治疗。D)在实验过程中体重(BW)的变化，每组的平均BW在第一次注射前的那天设定为100％。在图的顶部表示各组的治疗，以及治疗的开始和结束。哈希符号描绘由于不良临床评分而死亡或由于人道原因必须被处死的动物。E)各组的平均临床健康评分(由实验者观察到的不同临床体征的评分)，各组的治疗在图的顶部由箭头表示。较暗的区域表示更严重(即更差)的临床健康评分。F)肿瘤细胞移植前(给药前/基础)和第一次治疗后4小时的人细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6)。仅在活性TCE中观察到细胞因子水平升高，而CD3-PDD NCL和CD3-PDD CL均未显示显著升高的细胞因子水平。将各处理组与媒介物对照进行比较(***，p<0.001)。
具体实施方式
概述
本申请涉及前药，这些前药包含通过蛋白酶可切割的肽接头连接至结合物的药物分子，该结合物可逆地抑制该药物分子的生物活性，并且涉及抑制性结合物本身。还描述了编码本文所述的重组蛋白的核酸，和制备所述重组蛋白的方法，以及这些重组蛋白的治疗方法和医学用途。
本发明的蛋白酶可切割的前药包含通过蛋白酶可切割的接头连接的结合部分(例如抗独特型结合部分)和药物分子。结合部分可逆地结合至药物分子，并且当结合时，抑制药物分子的生物活性。体内施用时，蛋白酶(例如存在于肿瘤组织中的蛋白酶)切割结合部分与药物分子之间的接头，从而将药物分子释放到体内(参见图1)。施用时活性药物分子的有条件释放可使不良作用或其风险最小化，该不良作用或风险以其他方式与药物分子相关。
不希望受理论束缚，应理解，当结合至药物分子时，诸如当本文所述的结合部分通过肽接头连接至药物分子时，结合部分抑制药物分子的生物活性(即，作用模式)。在施用于患者时，蛋白酶(诸如存在于肿瘤组织中的蛋白酶)可以切割结合部分与药物分子之间的肽接头，从而由于结合部分从药物分子解离和扩散开而导致活性药物分子的释放。
本发明涉及包含通过蛋白酶可切割的接头连接的药物分子和结合部分的重组蛋白，并且涉及结合部分本身。
本发明还涉及包含所述前药的药物组合物以及所述组合物在疗法中的用途。例如，本发明涉及此类组合物在治疗增殖性疾病(诸如癌症)中的用途。
本发明还涉及编码所述结合部分的核酸以及使用宿主细胞制备这些核酸的方法。
定义
除非本文另外定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。一般来讲，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学使用的命名法以及其技术是本领域熟知的和常用的那些。
除非另外说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被理解为开放式术语。如果本发明的各方面被描述为“包括”特征，则还设想到“由该特征组成”或“基本上由该特征组成”的实施方案。除非另外提出权利要求，否则本文所提供的任何和全部实例或示例性语言(例如“诸如”)仅仅旨在更好地举例说明本公开，并且并不用来限制本公开的范围。说明书中的任何语言都不应理解为表示任何不受权利要求书保护的要素是实施本公开所必需的。除了在操作示例中，或在另外指明的情况下，本文所用的表示成分或反应条件的量的所有数字在所有情况下均应理解为由相关领域的技术人员将理解的术语“约”修饰。除非另有说明，否则如本文所用的术语“约”等同于给定数值的±10％。
除非本文另外说明，否则本文对值的范围的表述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值和每个端点的简略方法，并且每个单独值和端点并入本说明书中，如同其在本文中被单独地表述一样。
在本发明的上下文中，术语“蛋白质”是指包含多肽的分子，其中多肽的至少一部分通过在单个多肽链内和/或多个多肽链之间形成二级、三级和/或四级结构而具有或能够获得限定的三维排列。如果蛋白质包含两个或更多个多肽链，则单个多肽链可例如通过两个多肽之间的二硫键非共价连接或共价连接。通过形成二级和/或三级结构而单独具有或能够获得限定的三维排列的蛋白质部分被称为“蛋白质结构域”。这种蛋白质结构域是本领域技术人员熟知的。
术语“药物分子”(在本文中与术语“药物”可互换使用)是指包含多肽或蛋白质的治疗剂，其中所述多肽或蛋白质含有能够被结合部分结合的位点。用于本发明的优选药物分子是T细胞接合剂或TCE药物分子。
在重组蛋白、重组多肽等中使用的术语“重组”是指所述蛋白质或多肽是通过使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术产生的。例如，可将编码多肽的重组DNA分子(例如，通过基因合成产生)克隆到细菌表达质粒(例如pQE30，QIAgen公司)、酵母表达质粒、哺乳动物表达质粒或植物表达质粒，或者能够体外表达的DNA中。如果例如将此类重组细菌表达质粒插入适当的细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))中，则这些细菌可产生由该重组DNA编码的多肽。对应产生的多肽或蛋白质被称为重组多肽或重组蛋白。重组多肽或重组蛋白也可以从其他核酸分子表达，诸如编码所述多肽或蛋白质的mRNA。
在本发明的上下文中，术语“结合部分”或“结合物”是指包含多肽或蛋白质的结合物，其中所述多肽或蛋白质能够非共价结合至药物分子。结合部分不一定需要与药物分子的活性位点结合。然而，结合部分必须以抑制药物的作用模式的方式结合。这可以是通过与药物的活性位点结合，但也可以是通过与药物分子上的另一位点结合以改变所述药物的构象(即，变构抑制)或在空间上阻碍药物分子的活性位点。药物分子的活性位点参与药物分子的生物活性。生物活性可以是酶活性或与生物靶标的结合。结合部分与药物分子的结合抑制药物分子的生物活性。例如，结合部分与药物分子的结合抑制药物分子的酶活性或抑制药物分子与生物靶标的结合。结合部分与药物分子的结合可以是抗独特型。因此，结合部分可以是药物分子的抗独特型结合物。
用于本发明的结合部分包括抗体、替代性支架和多肽。如本文所用，术语“抗体”不仅是指完整的抗体分子，诸如当免疫系统检测到外源抗原时通常由免疫系统产生的那些抗体分子，而且也指保留抗原结合能力的抗体分子的任何片段、变体和合成或工程化类似物。此类片段、变体和类似物也是本领域熟知的，并且定期地在体外和体内使用。因此，术语“抗体”涵盖完整的免疫球蛋白分子、抗体片段，诸如例如Fab、Fab'、F(ab')2和单链V区片段(scFv)、双特异性或多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合蛋白、非常规抗体和包含衍生自免疫球蛋白分子的抗原结合结构域的蛋白质。如本文所用，术语“替代性支架”是指包含蛋白质或由蛋白质组成但不是抗体的任何分子。
任何这些不同结构类型的结合部分都可与药物分子结合，并且当结合时，抑制药物分子的作用模式。在一个优选的实施方案中，结合部分包含对药物分子具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在另一个优选的实施方案中，结合部分包含对药物分子具有结合特异性的抗体。在另一个优选的实施方案中，结合部分包含对药物分子具有结合特异性的替代性支架，其中该替代性支架不包含锚蛋白重复结构域。在一个优选的实施方案中，药物分子包含抗体，并且结合部分是对包含在所述药物分子中的所述抗体具有结合特异性的抗独特型抗体。在另一个优选的实施方案中，药物分子包含抗体，并且结合部分是对包含在所述药物分子中的所述抗体具有结合特异性的抗独特型替代性支架，诸如例如锚蛋白重复结构域。在另一个优选的实施方案中，药物分子包含替代性支架，诸如例如锚蛋白重复结构域，并且结合部分是对包含在所述药物分子中的所述替代性支架具有结合特异性的抗独特型抗体。在另一个优选的实施方案中，药物分子包含替代性支架，诸如例如锚蛋白重复结构域，并且结合部分是对包含在所述药物分子中的所述替代性支架具有结合特异性的抗独特型替代性支架，诸如例如锚蛋白重复结构域。
术语“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸分子，其可以是单链或双链的核糖核酸(RNA)分子或脱氧核糖核酸(DNA)分子，并且包括DNA或RNA的经修饰形式和人工形式。核酸分子可以以分离的形式存在，或者被包含在重组核酸分子或载体中。
术语“靶标”是指单个分子，诸如核酸分子、多肽或蛋白质、碳水化合物或任何其他天然存在的分子，包括此类单个分子的任何部分，或者两种或更多种此类分子的复合物，或整个细胞或组织样品，或任何非天然化合物。优选地，靶标是天然存在的或非天然的多肽或蛋白质，或含有化学修饰(例如天然或非天然的磷酸化、乙酰化或甲基化)的多肽或蛋白质。在一些实施方案中，生物靶标是免疫细胞，诸如T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞或另一种类型的免疫细胞。在一些其他实施方案中，生物靶标是肿瘤细胞。
在本发明的上下文中，术语“多肽”涉及由多个(即两个或更多个)经由肽键连接的氨基酸的链组成的分子。优选地，多肽由八个以上经由肽键连接的氨基酸组成。术语“多肽”还包括通过半胱氨酸的S-S桥连接在一起的氨基酸的多个链。多肽是本领域技术人员熟知的。
专利申请WO2002/020565和Forrer等人，2003(Forrer,P.,Stumpp,M.T.,Binz,H.K.,Plückthun,A.,2003.FEBS Letters 539,2-6)包含重复蛋白特征和重复结构域特征、技术和应用的一般描述。术语“重复蛋白”是指包含一个或多个重复结构域的蛋白质。优选地，重复蛋白包含一个、两个、三个、四个、五个或六个重复结构域。此外，所述重复蛋白可包含附加的非重复蛋白质结构域、多肽标签和/或肽接头。重复结构域可以是结合结构域。术语“重复结构域”是指包含两个或更多个连续重复模块作为结构单元的蛋白质结构域，其中所述重复模块具有结构和序列同源性。优选地，重复结构域还包含N-末端和/或C-末端的封端模块。为了清楚起见，封端模块可以是重复模块。本领域从业人员根据以下各项的示例熟知此类重复结构域、重复模块和封端模块、序列基序以及结构同源性和序列同源性：锚蛋白重复结构域(Binz等人，J.Mol.Biol.332,489–503,2003；Binz等人，Nature Biotech.22(5):575-582(2004)；WO2002/020565；WO2012/069655)、富含亮氨酸的重复结构域(WO2002/020565)、三角形四肽重复结构域(Main,E.R.,Xiong,Y.,Cocco,M.J.,D'Andrea,L.,Regan,L.,Structure 11(5),497-508,2003)和犰狳重复结构域(WO2009/040338)。本领域技术人员还熟知，此类重复结构域不同于包含重复氨基酸序列的蛋白质，其中每个重复氨基酸序列能够形成单个结构域(例如纤连蛋白的FN3结构域)。
术语“锚蛋白重复结构域”是指包含两个或更多个连续的锚蛋白重复模块作为结构单元的重复结构域。可使用标准重组DNA技术(参见例如Forrer,P.等人，FEBS letters，第539卷，第2页-第6页，2003，WO2002/020565、WO2016/156596、WO2018/054971)，将锚蛋白重复结构域模块化地组装成较大锚蛋白重复蛋白，任选地具有半衰期延长结构域。
如在经设计的锚蛋白重复蛋白和经设计的重复结构域等中所用，术语“经设计的”是指此类重复蛋白和重复结构域分别是人造的并且在自然界中不存在的性质。本文所述的经设计的重复蛋白包含至少一个经设计的重复结构域。优选地，该经设计的重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域。
术语“靶标相互作用残基”是指有助于与药物分子直接相互作用的结合部分的氨基酸残基。例如，如果结合部分是经设计的锚蛋白重复结构域，则术语“靶标相互作用残基”是指有助于与药物分子直接相互作用的经设计的锚蛋白重复结构域的氨基酸残基。
术语“框架残基”或“框架位置”是指有助于折叠拓扑结构、即有助于重复模块的折叠或有助于与相邻模块的相互作用的所述重复模块的氨基酸残基。此类贡献可为与重复模块中其他残基的相互作用，或是对如α-螺旋或β-片层中存在的多肽主链构象的影响，或是参与形成直链多肽或环的氨基酸延伸。此类框架和靶标相互作用残基可通过分析由物理化学方法(诸如X射线晶体学、NMR和/或CD光谱)获得的结构数据，或通过与结构生物学和/或生物信息学领域从业者熟知的已知和相关结构信息进行比较来鉴定。
术语“重复模块”是指经设计的重复结构域的重复氨基酸序列和结构单元，其最初来源于天然存在的重复蛋白的重复单元。包含在重复结构域中的每个重复模块来源于天然存在的重复蛋白家族或亚家族(优选地锚蛋白重复蛋白家族)的一个或多个重复单元。此外，包含在重复结构域中的每个重复模块可以包含从同源重复模块导出的“重复序列基序”，该同源重复模块从靶标上选择的重复结构域获得并且具有相同的靶标特异性。
因此，术语“锚蛋白重复模块”是指最初来源于天然存在的锚蛋白重复蛋白的重复单元的重复模块。锚蛋白重复蛋白是本领域技术人员熟知的。经设计的锚蛋白重复蛋白先前已有描述；参见，例如，国际专利公开号WO2002/020565、WO2010/060748、WO2011/135067、WO2012/069654、WO2012/069655、WO2014/001442、WO2014/191574、WO2014/083208、WO2016/156596和WO2018/054971，所有这些均全文以引用方式并入。通常，锚蛋白重复模块包含约31个至33个氨基酸残基，这些氨基酸残基形成由环隔开的两个α螺旋。
重复模块可以包含具有为了选择靶标特异性重复结构域而在文库中未被随机化的氨基酸残基的位置(“非随机化位置”或“固定位置”在本文中可互换使用)和具有为了选择靶标特异性重复结构域而在文库中已被随机化的氨基酸残基的位置(“随机化位置”)。非随机化位置包含框架残基。随机化位置包含靶标相互作用残基。“已被随机化”意指在重复模块的氨基酸位置处允许两个或更多个氨基酸，例如，其中允许通常二十种天然存在的氨基酸中的任一种，或者其中允许二十种天然存在的氨基酸中的大多数，诸如除半胱氨酸之外的氨基酸，或除甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸之外的氨基酸。
术语“重复序列基序”是指从一个或多个重复模块导出的氨基酸序列。优选地，所述重复模块来自对相同靶标具有结合特异性的重复结构域。此类重复序列基序包含框架残基位置和靶标相互作用残基位置。所述框架残基位置对应于重复模块的框架残基位置。同样，所述靶标相互作用残基位置对应于重复模块的靶标相互作用残基的位置。重复序列基序包含非随机化位置和随机化位置。
术语“重复单元”是指包含一种或多种天然存在的蛋白质的序列基序的氨基酸序列，其中所述“重复单元”存在于多个拷贝中，并且表现出确定蛋白质折叠的所有所述基序共有的限定的折叠拓扑结构。此类重复单元的示例包括富含亮氨酸的重复单元、锚蛋白重复单元、犰狳重复单元、三十四肽重复单元、HEAT重复单元和富含亮氨酸的变体重复单元。
如果结合部分与特定药物分子的反应或缔合比与替代性靶标(例如，细胞或物质)的反应或缔合更频繁、更迅速、持续时间更长、亲和力更高和/或亲合力更高，则结合部分“特异性结合”或“优先结合”(在本文中可互换使用)该药物分子。通过在给定的一组条件下比较与适当药物分子的结合和与替代药物分子的结合，可以测试结合部分的结合特异性。在一些实施方案中，如果结合分子与适当药物分子结合的亲和力比与替代药物分子结合的亲和力高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍或至少1000倍，则认为其是特异性的。通过阅读该定义还应当理解，例如，特异性或优先结合第一药物分子的结合部分可以或可以不特异性或优先结合第二药物分子。因此，“特异性结合”不一定需要(尽管其可包括)排他性结合。一般来讲，在指定的测定条件下，锚结合部分优先结合特定药物分子，并且不以显著量结合测试样品中存在的其他组分。
多种测定格式可用于选择或表征特异性结合所关注的药物分子的结合部分。例如，固相ELISA免疫测定法、免疫沉淀法、BIAcoreTM(GE Healthcare，Piscataway，NJ)、荧光活化细胞分选法(FACS)、OctetTM(ForteBio公司，Menlo Park，CA)和蛋白质印迹分析是可用于鉴定与靶药物分子特异性结合的结合部分的许多测定法。通常，特定或选择性结合将是背景信号或噪声的至少两倍，并且更典型地是背景信号的10倍以上。甚至特别地，当平衡解离常数(KD)值<1μΜ，诸如<500nΜ、<100nM、<10nM、<1nM、<100pM或<10pM时，结合部分被认为“特异性结合”靶标。
测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任一种均可用于本发明的目的。例如，如本文所示例的，特定结合部分对药物分子靶标的结合亲和力可表示为KD值，其是指结合部分和药物分子靶标的解离常数。KD是解离速率(也称为“解离率(koff)”)与缔合速率或“结合率(kon)”的比率。因此，KD等于koff/kon并且表示为摩尔浓度(M)，并且KD越小，结合的亲和力越强。
KD值可使用任何合适的方法测定。用于测量KD的一种示例性方法是表面等离子体共振(SPR)(参见例如Nguyen等人，Sensors(Basel).2015年5月5日；15(5):10481-510)。KD值可通过SPR使用生物传感器系统诸如系统来测量。BIAcore动力学分析包括例如分析抗原与其表面具有固定的分子(例如包含表位结合结构域的分子)的芯片的结合和解离。用于确定蛋白质的KD的另一种方法是通过使用生物层干涉测量法进行的(参见例如Shah等人，J Vis Exp.2014；(84):51383)。KD值可使用/>技术(Octet QKe系统，ForteBio)测量。或者或另外地，也可使用/>(动力学排除测定)测定，购自SapidyneInstruments(Boise，同上)。本文涵盖适用于评估两个结合配偶体之间的结合亲和力的任何方法。表面等离子体共振(SPR)是特别优选的。最优选地，在PBS中并通过SPR确定KD值。
术语“PBS”意指含有137mM NaCl、10mM磷酸盐和2.7mM KCl并且pH为7.4的磷酸盐缓冲水溶液。
术语“处理”以及与其相关的词语不一定暗示100％或完全固化。相反，存在本领域普通技术人员认为具有潜在的有益效果或治疗效果不同程度的治疗。在这方面，本文所述的治疗方法和医疗用途可提供任何量或任何水平的治疗。此外，由本公开的方法提供的治疗可包括治疗(即，缓解)一种或多种病症或症状。在示例性方面，本发明提供了用前药分子治疗的方法，该方法包括向患者施用该前药分子，其中与如果不以前药形式施用相同量的药物分子(即，不通过蛋白酶可切割的接头连接至本发明的结合部分)时患者将经历的不良作用或其风险相比，施用前药分子的患者经历的不良作用或其风险降低。因此，使用本发明的结合部分来形成前药分子允许具有降低的不良作用或降低的其风险的治疗方法，和/或使用更高剂量的药物分子或在缩短时间段内施用药物分子的治疗方法。
任何给定疾病或病症中的治疗应答可通过特定于该疾病或病症的标准化应答标准来确定。经历疗法的受试者可经历与疾病相关的症状的改善以及与施用治疗剂相关的不良作用或其风险的降低的有益作用。
如本文所用，术语“增殖性疾病”是指特征在于细胞过量产生的疾病。增殖性疾病的示例包括但不限于癌症、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、牛皮癣、特发性肺纤维化、硬皮病和肝硬化。在一个优选的实施方案中，增殖性疾病是癌症。
结合部分
本文所述的结合部分是具有多种不同结构的多肽或蛋白质，其可以特异性结合至药物分子。用于本发明的结合部分的示例包括抗体、替代性支架和多肽。
抗体包括包含衍生自抗体或免疫球蛋白分子的抗原结合结构域的任何多肽或蛋白质。抗原结合结构域可衍生自例如单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体和单结构域抗体，例如来自例如人或骆驼科动物来源的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH)。在一些情况下，有利的是抗原结合结构域衍生自结合部分最终将在其中使用的相同物种。例如，对于在人中的应用，本文所述的结合部分的抗原结合结构域包含人或人源化抗原结合结构域可能是有益的。抗体可使用本领域熟知的技术获得。
在一个实施方案中，结合部分是骆驼科动物纳米抗体。骆驼科动物纳米抗体(也称为骆驼科动物单一结构域抗体或VHH)衍生自哺乳动物的骆驼科家族，诸如美洲驼、骆驼和羊驼。与其他抗体不同，骆驼科动物抗体缺乏轻链并且由两条相同的重链构成。骆驼科动物抗体通常具有大约15kDa的相对低的分子量。
在一个实施方案中，结合部分是鲨鱼抗体结构域。鲨鱼抗体结构域，如骆驼科动物纳米抗体，也缺乏轻链。
替代性支架包括包含结合结构域的任何多肽或蛋白质，该结合结构域能够结合抗原(诸如药物分子)且不衍生自抗体或免疫球蛋白分子。替代性支架的结合结构域可包含或可衍生自多种不同的多肽或蛋白质结构。替代性支架包括但不限于阿德耐汀(单抗体)、亲和体、阿菲林、阿菲默和适体、阿非汀、α抗体、抗运载蛋白、基于犰狳重复蛋白的支架、阿去默、阿维默、基于锚蛋白重复蛋白的支架(诸如蛋白)、非诺莫、打结素和库尼兹结构域肽。替代性支架描述于以下中：例如Yu等人，Annu Rev Anal Chem(Palo Alto Calif).2017年6月12日；10(1):293–320.doi:10.1146/annurevanchem-061516-045205。
阿德耐汀最初衍生自人III型纤连蛋白蛋白的第十个细胞外结构域(10Fn3)。III型纤连蛋白结构域具有7个或8个β链，其分布在两个β片层之间，该两个β片层自身彼此堆积以形成蛋白质的核心，并且还含有环(类似于CDR)，该环将β链彼此连接并且暴露于溶剂。在β片层夹层的每个边缘处存在至少三个这样的环，其中边缘是垂直于β链方向的蛋白质的边界(参见美国专利号6,818,418)。由于这种结构，这种非抗体支架模拟在性质和亲和力上与抗体的性质和亲和力类似的抗原结合性质。这些支架可用于体外的环随机化和改组策略，其类似于体内抗体的亲和力成熟过程。
亲和体亲和配体由基于蛋白A的IgG结合结构域之一的支架的三螺旋束构成，该蛋白A是来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白。该支架结构域由58个氨基酸组成，其中13个氨基酸被随机化以产生具有大量配体变体的亲合体文库(参见例如美国专利号5,831,012)。亲和体分子模拟抗体，但与抗体的约150kDa的分子量相比，亲和体分子相当小，具有约6kDa的分子量。尽管大小不同，但亲和体分子的结合位点与抗体的结合位点相似。
阿菲林是结构上衍生自人泛素(历史上也衍生自γ-B晶体蛋白)的合成抗体模拟物。阿菲林由两个相同的结构域组成，主要具有β片层结构，总分子质量为约20kDa。它们含有几种适于修饰的表面暴露的氨基酸。阿菲林在其对抗原的亲和力和特异性方面类似于抗体，但在结构上不类似。
阿菲默是一种肽适体，具有已知为SQT(胱抑蛋白A四重突变体-Tracy)的结构。适体和阿菲默是负责与用于结构限制的惰性和刚性蛋白支架亲和结合的短肽，其中结合肽的N-末端和C-末端都嵌入惰性支架中。
阿非汀是DNA结合蛋白Sac7d的变体，其被工程化以获得特异性结合亲和力。Sac7d最初衍生自古细菌超嗜热菌嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)并与DNA结合以防止其热变性。阿非汀在商业上被称为纳米菲汀(Nanofitin)。
α抗体是小的(大约10kDa)蛋白质，其被工程化以结合多种抗原，因此是抗体模拟物。α抗体支架是基于卷曲螺旋结构计算设计的。标准α抗体支架含有三个α-螺旋，每个由四个七肽重复(7个残基的片段)构成，通过富含甘氨酸/丝氨酸的接头连接。标准七肽序列是“IAAIQKQ”。α抗体靶向细胞外和细胞内蛋白的能力以及它们的高结合亲和力可允许它们结合抗体不能达到的靶标。
抗运载蛋白是具有在脂质运载蛋白中发现的稳健且保守的β-桶结构的一组结合蛋白。脂质运载蛋白是一类包含一条肽链(150个-190个氨基酸)的细胞外蛋白，其负责识别、储存和运输各种生物分子，诸如信号传导分子。
基于犰狳重复蛋白的支架在真核生物中是丰富的，并且涉及广泛的生物过程，尤其是与核运输相关的那些过程。基于犰狳重复蛋白的支架通常由三至五个内部重复和两个封端元件组成。它们还具有串联伸长的超螺旋结构，其使得能够以延伸构象与其相应的肽配体结合。
阿去默是来源于称为四连蛋白的三聚血浆蛋白的支架，该四连蛋白属于由三个相同单元组成的C型凝集素家族。四连蛋白内的C型凝集素结构域(CTLD)的结构具有介导与靶向分子的相互作用的五个柔性环。
阿维默衍生自含有天然A结构域的蛋白质，诸如HER3，并且由通过氨基酸接头连接的许多不同的“A结构域”单体(2个-10个)组成。可使用例如美国专利申请公开号2004/0175756、2005/0053973、2005/0048512和2006/0008844中描述的方法产生可与靶抗原结合的阿维默。
在一个实施方案中，结合部分是锚蛋白重复蛋白。经设计或工程化的锚蛋白重复蛋白(诸如蛋白)可以像抗体模拟蛋白一样起作用，通常表现出高度特异性和高亲和力的靶结合。经设计的锚蛋白重复蛋白包含一个或多个经设计的锚蛋白重复结构域。经设计的锚蛋白重复结构域衍生自天然锚蛋白重复蛋白，并且每个经设计的锚蛋白重复结构域通常以高特异性和亲和力结合靶蛋白。由于它们的高特异性、稳定性、效力和亲和力，以及由于它们在形成单特异性、双特异性或多特异性蛋白方面的灵活性，经设计的锚蛋白重复蛋白特别适合用作高亲和力结合部分。经设计的锚蛋白重复蛋白药物候选物还展示出有利的开发性质，包括快速、低成本和高产率的制造以及在4℃下长达数年的贮存期限。经设计的锚蛋白重复蛋白是本发明结合部分的优选实施方案。/>是MolecularPartners AG拥有的注册商标。
非诺莫是从人Fyn酪氨酸激酶的Src同源结构域3(SH3)的氨基酸83-145进化而来的小的球状蛋白(大约7kDa)。非诺莫是有吸引力的结合分子，这是由于它们的高热稳定性、不含半胱氨酸的支架和人源，这降低了潜在的免疫原性。
打结素，也称为半胱氨酸结小蛋白，通常是长度为30个氨基酸的蛋白质，其包含三个反向平行的β-片层和由二硫键束缚的限制环，该二硫键产生半胱氨酸结。这种二硫键赋予高热稳定性，使得打结素成为有吸引力的抗体模拟物。
库尼兹结构域肽或库尼兹结构域抑制剂是一类具有不规则二级结构的蛋白酶抑制剂，该不规则二级结构含有具有三个二硫键和三个环的约60个氨基酸，其可在不使结构框架不稳定的情况下突变。
在一个实施方案中，结合部分是包含衍生自T细胞受体(TCR)的抗原结合结构域的多肽或蛋白质。
结合部分的示例
在本发明中用作结合部分的锚蛋白重复结构域的示例由SEQ ID NO:1至12提供。
SEQ ID NO:1至12的锚蛋白重复结构域特异性结合至具有选自SEQ ID NO:13至17的氨基酸序列的CD3特异性结合分子。例如，SEQ ID NO:1至12的锚蛋白重复结构域特异性结合至具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列或SEQ ID NO:14的氨基酸序列或SEQ ID NO:15的氨基酸序列或SEQ ID NO:16的氨基酸序列或SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CD3特异性结合分子。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:1至12的锚蛋白重复结构域特异性结合至具有SEQID NO:13的氨基酸序列的CD3特异性结合分子。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:1至12的锚蛋白重复结构域特异性结合至具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CD3特异性结合分子。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:1至12的锚蛋白重复结构域特异性结合至具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的CD3特异性结合分子。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:1至12的锚蛋白重复结构域特异性结合至具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CD3特异性结合分子。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:1至12的锚蛋白重复结构域特异性结合至具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CD3特异性结合分子。
因此，在一个实施方案中，本发明的结合部分是锚蛋白重复结构域，该锚蛋白重复结构域包含与选自由SEQ ID NO:1至12组成的组的锚蛋白重复结构域具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，结合部分是锚蛋白重复结构域，该锚蛋白重复结构域包含与选自由SEQ ID NO:1至12组成的组的锚蛋白重复结构域具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，结合部分是锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域选自由SEQ ID NO:1至12组成的组。
在一个实施方案中，结合部分是经设计的锚蛋白重复结构域，该经设计的锚蛋白重复结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:1至12，以及(2)与SEQID NO:1至12中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:45至64，以及(2)其中SEQ ID NO:45至64中的任一者中的至多9个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:45至64，以及(2)其中SEQ ID NO:45至64中的任一者中的至多8个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:45至64，以及(2)其中SEQ IDNO:45至64中的任一者中的至多7个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:45至64，以及(2)其中SEQ ID NO:45至64中的任一者中的至多6个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:45至64，以及(2)其中SEQ ID NO:45至64中的任一者中的至多5个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:45至64，以及(2)其中SEQ ID NO:45至64中的任一者中的至多4个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:45至64，以及(2)其中SEQ ID NO:45至64中的任一者中的至多3个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQID NO:45至64，以及(2)其中SEQ ID NO:45至64中的任一者中的至多2个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，结合部分是包含锚蛋白重复模块的经设计的锚蛋白重复蛋白，该锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:45至64，以及(2)其中SEQ ID NO:45至64中的任一者中的至多1个氨基酸被另一个氨基酸取代的序列。
本文所述的氨基酸序列可被一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，在本文所述的任何结合部分中进行至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2或至多1个取代。
在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者，在任何锚蛋白重复结构域中进行至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者，进行至多15个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者，进行至多14个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者，进行至多13个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者，进行至多12个取代。在一些实施方案中，相对于SEQID NO:1至12的序列中的任一者，进行至多11个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ IDNO:1至12的序列中的任一者，进行至多10个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者，进行至多9个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者，进行至多8个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者，进行至多7个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者，进行至多6个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者，进行至多5个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者，进行至多4个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者，进行至多3个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者，进行至多2个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者，进行至多1个取代。
在一些实施方案中，氨基酸取代全部在框架位置进行。在一些实施方案中，氨基酸取代全部在非随机位置进行。在经设计的锚蛋白重复结构域中随机位置的定位公开于例如Binz等人，Nature Biotech.22(5):575-582(2004)。
在一些实施方案中，与未取得的结合部分的KD值相比，氨基酸取代使KD值改变不超过约1000倍、不超过约100倍或不超过约10倍。例如，在一些实施方案中，与包含SEQ ID NO:1至12的序列中的任一者的结合部分与包含SEQ ID NO:13至17的序列中的任一者的CD3结合结构域的结合的KD值相比，氨基酸取代使KD值改变不超过约1000倍、不超过约300倍、不超过约100倍、不超过约50倍、不超过约25倍、不超过约10倍或不超过约5倍。
在某些实施方案中，结合部分中的氨基酸取代是根据下表1的保守取代。
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表1.氨基酸取代
当结合部分是锚蛋白重复结构域时，在一些实施方案中，可在锚蛋白重复结构域的结构核心残基之外、例如在连接α-螺旋的β环中进行取代。在其他实施方案中，可在锚蛋白重复结构域的结构核心残基内进行取代。例如，锚蛋白结构域可包含共有序列：xDxxGxTPLHLAxxxGxxxlVxVLLxxGADVNA(SEQ ID NO:68)，其中“x”表示任何氨基酸(优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸)；或xDxxGxTPLHLAAxxGHLEIVEVLLKzGADVNA(SEQ ID NO:69)，其中“x”表示任何氨基酸(优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸)，并且“z”选自由天冬酰胺、组氨酸或酪氨酸组成的组。在一个实施方案中，对命名为“x”的残基进行取代。在另一个实施方案中，在命名为“x”的残基之外进行取代。
另外，结合部分的任何锚蛋白重复结构域的倒数第二个位置可以是“A”或“L”，和/或最后一个位置可以是“A”或“N”。因此，在一些实施方案中，结合部分的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至12中的任一者至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，并且其中任选地倒数第二个位置处的A被L取代，和/或最后一个位置处的A被N取代。在一个示例性实施方案中，结合部分的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至12中的任一者至少约90％相同的氨基酸序列，并且其中任选地倒数第二个位置处的A被L取代，和/或最后一个位置处的A被N取代。此外，结合部分的任何锚蛋白重复结构域的序列可任选地在其N-末端包含G、S或GS(见下文)。
此外，结合部分的每个锚蛋白重复结构域可任选地在其N-末端包含“G”、“S”或“GS”序列。因此，在一些实施方案中，结合部分的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至12中的任一者至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，并且还任选地在其N-末端包含G、S或GS。在一个示例性实施方案中，结合部分的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至12中的任一者至少约90％相同的氨基酸序列，并且其中所述锚蛋白重复结构域还任选地在其N-末端包含G、S或GS。此外，结合部分的任何锚蛋白重复结构域的序列可以任选地在倒数第二个位置具有被L取代的A和/或在最后一个位置具有被N取代的A(见上文)。
N-末端和C-末端封端序列
当本文所述的结合部分包含锚蛋白重复结构域时，该锚蛋白重复结构域可包含N-末端或C-末端封端序列。封端序列是指融合到锚蛋白重复序列基序或模块的N-末端或C-末端的附加多肽序列，其中所述封端序列与锚蛋白重复结构域的相邻锚蛋白重复序列基元或模块形成紧密的三级相互作用(即三级结构相互作用)，从而提供保护一侧的锚蛋白重复结构域的疏水核免于暴露于溶剂的盖。
N末端和/或C末端封盖序列可来源于存在于邻近重复单元的天然存在的重复蛋白质中的封盖单元或其他结构单元。封端序列的示例描述于以下中：国际专利公开号WO2002/020565和WO2012/069655、美国专利公开号US2013/0296221以及Interlandi等人，J MolBiol.2008年1月18日；375(3):837-54。N-末端锚蛋白封端模块(即，N-末端封端重复)的示例包括SEQ ID NO:70至73，并且C-末端封端模块(即，C-末端封端重复)的示例包括SEQ IDNO:74至77。
药物分子
在本发明的上下文中，药物分子是包含多肽或蛋白质的治疗剂，其中所述多肽或蛋白质含有能够被结合部分结合的位点。对用于本发明的药物分子没有特别限制，只要这些药物分子可以通过结合部分结合即可。这意味着，例如，药物分子可以属于与结合部分相同的“类别”或属于与结合部分不同的“类别”，使得，例如，药物分子和结合部分都可以是抗体，或药物分子和结合部分都可以是替代性支架(例如锚蛋白重复蛋白)，或药物分子可以是抗体且结合部分可以是替代性支架(例如锚蛋白重复蛋白)，或药物分子可以是替代性支架(例如锚蛋白重复蛋白)且结合部分可以是抗体。这进一步意味着，例如，药物分子本身可以包含不同的结构部分，例如，组合抗体部分和替代性支架部分，或组合不同替代性支架结构的部分。在药物分子和结合部分都是抗体的情况下，本领域技术人员将清楚，抗体将彼此不同，包括关于结合特异性。类似地，在药物分子和结合部分都是替代性支架的情况下，本领域技术人员将清楚，替代性支架将彼此不同，包括关于结合特异性。
此外，用于本发明的药物分子可以含有半衰期延长部分。与不具有半衰期延长部分的相同分子相比，半衰期延长部分延长了药物分子的体内血清半衰期。半衰期延长部分的示例包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白质A、蛋白质G、免疫球蛋白结构域、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、人血清白蛋白(HSA)结合结构域或聚乙二醇(PEG)。在一些情况下，半衰期延长部分可包含对HSA具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在其他情况下，半衰期延长部分可包含免疫球蛋白结构域，诸如Fc结构域，例如人IgG1的Fc结构域，或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，用于本发明的药物分子包含替代性支架，其中这些替代性支架选自阿德耐汀(单抗体)、亲和体、阿菲林、阿菲默和适体、阿非汀、α抗体、抗运载蛋白、基于犰狳重复蛋白的支架、阿去默、阿维默、基于锚蛋白重复蛋白的支架(诸如蛋白)、非诺莫、打结素和库尼兹结构域肽。替代性支架描述于以下中：例如Yu等人，Annu RevAnal Chem(Palo Alto Calif).2017年6月12日；10(1):293–320.doi:10.1146/annurevanchem-061516-045205。
用于本发明的药物分子还包括但不限于目前批准用于临床用途的不同种类的药物，诸如：
(1)免疫检查点抑制剂(ICI)；
(2)双特异性抗体；并且
(3)遗传修饰的免疫细胞，诸如T细胞，特别是表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，诸如CAR-T细胞。
用于本发明的药物分子还包括但不限于上调或下调免疫检查点活性的药物分子，本文中称为“免疫检查点调节剂”。免疫检查点是免疫系统中增大(共刺激分子)或减小(抑制分子)免疫信号的分子。在癌症患者中，肿瘤可以使用这些免疫检查点来保护其自身免受免疫系统攻击，特别是T细胞攻击。用于免疫检查点疗法的药物分子可阻断抑制性免疫检查点分子或活化刺激性免疫检查点分子，从而恢复免疫系统功能。近年来，免疫检查点药物已经成为重要的新的癌症治疗选择。免疫检查点分子包括但不限于CD27、CD137、CD137L、2B4、TIGIT、CD155、ICOS、HVEM、CD40L、LIGHT、TIM-1、OX40、OX40L、DNAM-1、PD-L1、PD1、PD-L2、CTLA-4、CD8、CD40、CEACAMI、CD48、CD70、A2AR、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、BTLA、C5AR1、CCR8、CD226、CD28、CD33、CD38、CD3e、CD47、CD94、ETAR、NKG2A、SIRPα、TLR8、TNFRSF18、IDO1、IDO2、TDO、KIR、LAG-3、TIM-3、TIM-4和VISTA。在一个实施方案中，药物分子是免疫检查点调节剂。
在一个实施方案中，用于本发明的药物分子包含抗体。在另一个实施方案中，药物分子包含双特异性抗体。在另一个实施方案中，药物分子包含多特异性抗体。在另一个实施方案中，药物分子包含作为T细胞接合剂药物分子(TCE)的抗体。
双特异性抗体包括TCE。作为TCE的双特异性抗体的示例是被称为BiTeTM分子的分子。这些是由单个肽链上的两个单链可变片段(scFvs)组成的抗癌药物。这种TCE通过scFvs之一与T细胞表面上的CD3(分化簇3)分子结合，而另一种scFv与肿瘤细胞表面上的肿瘤相关抗原(TAA)结合。通过与CD3结合并且将T细胞与肿瘤细胞连接，T细胞被“活化”并且可以对肿瘤细胞发挥细胞毒性活性。作为TCE的双特异性抗体的一个示例是博纳吐单抗，其与T细胞表面上的CD3和B细胞表面上的CD19结合。博纳吐单抗被批准用于治疗急性淋巴母细胞白血病。
在一个实施方案中，用于本发明的药物分子包含替代性支架。在另一个实施方案中，药物分子包含双特异性替代性支架。在另一个实施方案中，药物分子包含多特异性替代性支架。在另一个实施方案中，药物分子包含作为T细胞接合剂药物分子(TCE)的替代性支架分子。在一个优选的实施方案中，所述替代性支架是锚蛋白重复结构域。在进一步优选的实施方案中，用于本发明的药物分子包含替代性支架，其中所述替代性支架是对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含选自SEQ ID NO:13至17的氨基酸序列。在进一步优选的实施方案中，药物分子包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含选自SEQ ID NO:13至17的氨基酸序列。在一个实施方案中，药物分子包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:13。在一个实施方案中，药物分子包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:14。在一个实施方案中，药物分子包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:15。在一个实施方案中，药物分子包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:16。在一个实施方案中，药物分子包含对CD3具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:17。
双特异性或多特异性替代性支架分子包括TCE。在一个实施方案中，药物分子是双特异性或多特异性替代性支架分子，其中所述替代性支架分子是TCE，该TCE包含(i)作为锚蛋白重复结构域的CD3特异性结合结构域，和(ii)作为锚蛋白重复结构域的TAA特异性结合结构域。类似于被称为BiTeTM分子的TCE，这种包含替代性支架的TCE是抗癌药物，其通过结合结构域之一结合T细胞表面上的CD3分子，而另一结合结构域结合肿瘤细胞表面上的肿瘤相关抗原(TAA)。通过与CD3结合并且将T细胞与肿瘤细胞连接，T细胞被“活化”并且可以对肿瘤细胞发挥细胞毒性活性。
当药物分子是TCE时，本发明的结合部分的优选结合位点是TCE的CD3特异性结合结构域。通过与TCE的CD3特异性结合结构域结合，结合部分通过阻止TCE与T细胞结合来阻断TCE的作用模式。在一个实施方案中，结合部分与TCE的CD3特异性结合结构域的结合是抗独特型。
已经描述了许多作为TCE的双特异性抗体，包括下面列出的那些，括号中提供了它们各自的结合靶标。例如，如上所述，博纳吐单抗(CD19xCD3；Amgen)与T细胞上的CD3抗原结合，并与由B细胞谱系产生的肿瘤细胞上的CD19抗原结合。作为TCE的其他双特异性抗体包括但不限于AMG330(CD33xCD3；Amgen)；伏妥珠单抗(flotetuzumab)(CD123xCD3；Macrogenics)；MCLA117(Clec12AXCD3；Merus)；AMG160(HLE PSMAxCD3，Amgen)；AMG427(HLEFLT3xCD3，Amgen)；AMG562(HLE CD19xCD3，Amgen)；AMG596(HLE EGFRvIIIxCD3，Amgen)；AMG673(HLE CD33xCD3，Amgen)；AMG701(HLE BCMAxCD3，Amgen)；AMG757(HLE DLL3xCD3，Amgen)；AMG910(HLE Claudin18.2xCD3，Amgen)；奥尼妥单抗(odronextamab)(CD20xCD3，Regeneron)；莫妥珠单抗(mosunetuzumab)(CD20xCD3，Roche)；格罗菲妥单抗(glofitamab)(CD20xCD3，Roche)；和艾可瑞妥单抗(epcoritamab)(CD20xCD3，Genmab)。任何此类TCE可用作本发明的重组结合蛋白中的药物分子。
在一个实施方案中，用于本发明的药物分子包含抗体和替代性支架。在另一个实施方案中，药物分子包含两种不同的替代性支架。在另一个实施方案中，药物分子包含T细胞受体(TCR)衍生的抗原识别结构域。
在一个实施方案中，用于本发明的药物分子包含遗传修饰的免疫细胞。在一个优选的实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。在一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的T细胞，诸如表达CAR的T细胞(CAR-T细胞)。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是遗传修饰的天然杀伤(NK)细胞，诸如表达CAR的NK细胞(CAR-NK细胞)。
结合亲和力
本发明的结合部分特异性结合至药物分子。
在某些实施方案中，结合部分对药物分子的结合亲和力以KD描述。在示例性实施方案中，KD为约10-6M、约10-6M或更少、约10-7M或更少、约10-8M或更少、约10-9M或更少、约10- 10M或更少、或约10-11M或更少、约10-6M至约10-11M、约10-6M至约10-10M、约10-6M至约10-9M、约10-6M至约10-8M、约10-6M至约10-7M、约10-7M至约10-11M、约10-7M至约10-10M、约10-7M至约10- 9M、约10-7M至约10-8M、约10-8M至约10-11M、约10-8M至约10-10M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-11M、或约10-9M至约10-10M、或约10-10M至约10-11M。
在示例性实施方案中，结合部分以等于或小于以下项的KD值结合至药物分子：约1μM、750nm、500nm、250nm、100nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM或约10pM。在一个示例性实施方案中，结合部分以小于或等于约1μM的KD值结合至药物分子。在另一个示例性实施方案中，结合部分以小于或等于约500nM的KD值结合至药物分子。在另一个示例性实施方案中，结合部分以小于或等于约100pM的KD值结合药物分子。在又另一个示例性实施方案中，结合部分以小于或等于约10pM的KD值结合至药物分子。在一个实施方案中，结合部分以小于约1μM，诸如小于约1μM、小于约500nM、小于约250nM、小于约100nM或小于约50nM的解离常数(KD)结合药物分子。在另一个实施方案中，结合部分以约1μM与约10pM之间，诸如约1μM与约10pM之间、约1μM与约20pM之间、约1μM与约50pM之间或约1μM与约100pM之间的离解常数(KD)结合药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:1具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合至所述药物分子：小于约1μM、750nm、500nm、250nm、100nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM或约10pM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:1具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1μM至约10pM范围内的KD值结合至所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:2具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合至所述药物分子：小于约1μM、750nm、500nm、250nm、100nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM或约10pM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:2具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1μM至约10pM范围内的KD值结合至所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:3具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合至所述药物分子：小于约1μM、750nm、500nm、250nm、100nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM或约10pM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:3具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1μM至约10pM范围内的KD值结合至所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:4具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合至所述药物分子：小于约1μM、750nm、500nm、250nm、100nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM或约10pM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:4具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1μM至约10pM范围内的KD值结合至所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:5具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合至所述药物分子：小于约1μM、750nm、500nm、250nm、100nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM或约10pM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:5具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1μM至约10pM范围内的KD值结合至所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:6具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合至所述药物分子：小于约1μM、750nm、500nm、250nm、100nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM或约10pM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:6具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1μM至约10pM范围内的KD值结合至所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:7具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合至所述药物分子：小于约1μM、750nm、500nm、250nm、100nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM或约10pM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:7具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1μM至约10pM范围内的KD值结合至所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:8具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合至所述药物分子：小于约1μM、750nm、500nm、250nm、100nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM或约10pM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:8具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1μM至约10pM范围内的KD值结合至所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:9具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合至所述药物分子：小于约1μM、750nm、500nm、250nm、100nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM或约10pM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:9具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1μM至约10pM范围内的KD值结合至所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:10具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合至所述药物分子：小于约1μM、750nm、500nm、250nm、100nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM或约10pM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:10具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1μM至约10pM范围内的KD值结合至所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:11具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合至所述药物分子：小于约1μM、750nm、500nm、250nm、100nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM或约10pM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:11具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1μM至约10pM范围内的KD值结合至所述药物分子。
在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:12具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以以下KD值结合至所述药物分子：小于约1μM、750nm、500nm、250nm、100nM、约50nM、约25nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约50pM、约25pM或约10pM。在一些实施方案中，结合部分包含具有与SEQ ID NO:12具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，并且药物分子包含具有与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域，其中所述结合部分以约1μM至约10pM范围内的KD值结合至所述药物分子。
当结合部分结合至药物分子时，药物分子不能发挥生物活性，诸如例如结合至生物靶分子。在本发明的重组蛋白中连接结合部分和药物分子的肽接头被蛋白水解切割时，活性药物被释放到受试者中。
重组结合蛋白
本发明的重组结合蛋白包含(i)如本文所定义的结合部分和(ii)如本文所定义的药物分子。所述结合部分可逆地结合至所述药物分子，并且结合的作用抑制所述药物分子的生物活性。如本文所述，结合部分和药物分子通过包含蛋白酶切割位点的肽接头连接。
“接头”或“连接部分”是连接两个单独实体的分子或分子组。本发明涵盖了两种类型的接头：蛋白酶可切割的接头和非蛋白酶可切割的接头。在本发明的重组蛋白中，结合部分与药物分子之间的接头应该是蛋白酶可切割的接头，以允许药物分子从与结合部分的结合中“释放”。然而，非蛋白酶可切割的接头可以存在于前药分子中，诸如在结合分子与半衰期延长部分之间，和/或在药物分子的不同结构域之间，诸如对CD3具有特异性的结合结构域和对肿瘤相关抗原(TAA)具有特异性的结合结构域。这些不同类型的接头的示例示于图1中。图1中示出了结合物与CD3结合部分之间的蛋白酶可切割的接头。如图1所示，α-CD3与结合物之间的接头由可被肿瘤微环境中的蛋白酶切割的肽接头构成。前药CD3-PDD在注射到循环中时是无活性的，因为经由其α-CD3臂与T细胞的结合被共价连接的结合物抑制。一旦进入肿瘤微环境(TME)，α-CD3与结合物之间的肽接头就会被肿瘤相关蛋白酶切割，然后药物分子可以通过经由其α-TAA臂与肿瘤细胞上的TAA结合并且经由其α-CD3臂与T细胞上的CD3结合来发挥其生物活性，从而导致T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。
在一些实施方案中，蛋白酶可切割的接头具有与选自由SEQ ID NO:18至20组成的组的氨基酸序列具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％序列同一性的氨基酸序列。
非蛋白酶可切割的接头可包括共价接头，例如，二硫键、多肽键或交联剂；或非共价接头，以产生异源二聚体蛋白质。非蛋白酶可切割的接头可存在于例如结合部分与半衰期延长部分之间。
在一些实施方案中，非蛋白酶可切割的接头是肽接头。在一些实施方案中，肽接头包含约1个至50个氨基酸残基。示例性接头包括例如富含甘氨酸的肽；包含甘氨酸和丝氨酸的肽；具有序列[Gly-Gly-Ser]n的肽，其中n为1、2、3、4、5或6；或者具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:83)的肽，其中n为1、2、3、4、5或6。富含甘氨酸的肽接头包含肽接头，其中至少25％的残基是甘氨酸。富含甘氨酸的肽接头是本领域熟知的(例如，Chichili等人Protein Sci.2013年2月；22(2):153-167)。
在一些实施方案中，肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，接头是SEQ ID NO:78至82中的任一者的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个示例性实施方案中，接头是SEQ ID NO:81的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在另一个示例性实施方案中，接头是SEQ ID NO:82的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。
在本发明的重组结合蛋白中，上面列出的任何结合部分可以与上面列出的任何药物分子组合，条件是该结合部分对该药物分子具有期望的结合亲和力和特异性。特别地，本发明涵盖了上述任何结合部分和药物分子，特别是具有明确公开的结合系数(诸如KD)的任何具体公开的组合。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:1和(2)与SEQID NO:1具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:1具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:1具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:1具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:1中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:1中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:1中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:1的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:13至17中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:1的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:15至16中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:2和(2)与SEQID NO:2具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:2具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:2具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:2具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:2中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:2中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:2中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:2的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:13至17中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:2的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:15至16中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:3和(2)与SEQID NO:3具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:3具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:3具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:3具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:3中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:3中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:3中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:3的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:13至17中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:3的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:15至16中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:4和(2)与SEQID NO:4具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:4具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:4具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:4具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:4中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:4中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:4中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:4的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:13至17中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:4的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:15至16中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:5和(2)与SEQID NO:5具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:5具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:5具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:5具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:5中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:5中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:5中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:5的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:13至17中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:5的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:15至16中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:6和(2)与SEQID NO:6具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:6具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:6具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:6具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:6中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:6中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:6中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:6的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:13至17中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:6的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:15至16中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:7和(2)与SEQID NO:7具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:7具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:7具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:7具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:7中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:7中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:7中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:7的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:13至17中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:7的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:15至16中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:8和(2)与SEQID NO:8具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:8具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:8具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:8具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:8中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:8中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:8中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:8的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:13至17中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:8的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:15至16中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:9和(2)与SEQID NO:9具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:9具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:9具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:9具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:9中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:9中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:9中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:9的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:13至17中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:9的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:15至16中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:10和(2)与SEQ ID NO:10具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:10具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:10具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:10具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:10中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:10中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:10中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:10的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:13至17中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:10的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:15至16中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:11和(2)与SEQ ID NO:11具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:11具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:11具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:11具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:11中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:11中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:11中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:11的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:13至17中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:11的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:15至16中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(i)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:12和(2)与SEQ ID NO:12具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列；和(ii)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:12具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:12具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含锚蛋白重复结构域的结合部分，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:12具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:12中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:13至17；和(2)与SEQ ID NO:13至17具有至少约85％氨基酸序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:12中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含锚蛋白重复结构域的药物分子，该锚蛋白重复结构域与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少约90％氨基酸序列同一性。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的锚蛋白重复结构域的结合部分，其中任选地SEQ ID NO:12中至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸已被其他氨基酸取代；和(2)包含SEQ ID NO:13至17中的任一者的药物分子。
在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:12的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:13至17中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。在另一个实施方案中，重组结合蛋白包含：(1)包含具有SEQ ID NO:12的锚蛋白重复结构域的结合部分；和(2)包含含有SEQ ID NO:15至16中的任一者的锚蛋白重复结构域的药物分子。
在一个实施方案中，包含在上述任何所述重组结合蛋白物中的所述药物分子是T细胞接合剂药物分子。
前药分子
本发明的前药分子包含本文所述的重组结合蛋白。因此，本发明的前药分子包含通过蛋白酶可切割的接头连接的结合部分和药物分子。在一个实施方案中，药物分子是包含CD3特异性结合结构域和肿瘤相关抗原(TAA)特异性结合结构域的T细胞接合剂(TCE)分子。本发明的前药分子可另外包含其他部分，诸如半衰期延长部分。
对可用于本发明的前药分子中的TAA特异性结合结构域的性质没有特别限制。可用于本发明前药分子中的TAA特异性结合结构域包括对TAA具有结合特异性的任何结合结构域。一个示例是EGFR特异性结合结构域，诸如SEQ ID NO:27的结合结构域。
用于本发明的前药分子可以含有半衰期延长部分。与不具有半衰期延长部分的相同分子相比，半衰期延长部分延长了药物分子的体内血清半衰期。半衰期延长部分的示例包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白质A、蛋白质G、免疫球蛋白结构域、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、人血清白蛋白(HSA)结合结构域或聚乙二醇(PEG)。在一些情况下，半衰期延长部分可包含对HSA具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在其他情况下，半衰期延长部分可包含免疫球蛋白结构域，诸如Fc结构域，例如人IgG1的Fc结构域，或其变体或衍生物。在一个实施方案中，半衰期延长部分包含对HSA具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:65至67中的任一者具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
前药分子的组分可以按任何顺序组合，条件是结合部分和药物分子通过蛋白酶可切割的接头连接。在一个实施方案中，前药分子中不同组分的取向为从N-末端至C-末端：(TAA结合结构域)-(CD3结合结构域)-(蛋白酶可切割的接头)-(结合部分)-(半衰期延长部分)。
核酸和方法
本发明还涉及一种核酸，该核酸编码包含如本文所定义的经设计的锚蛋白重复结构域的结合部分。此类核酸的示例由SEQ ID NO:21至24提供。本发明还涉及包含所述核酸的宿主细胞。
本发明还涉及制备本文所定义的结合部分的方法，该方法包括在表达所述重组结合蛋白的条件下培养本文所定义的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核宿主细胞。在其他实施方案中，所述宿主细胞是原核宿主细胞。在一个实施方案中，制备结合部分的方法包括在表达所述重组结合蛋白的条件下培养宿主细胞，其中所述结合部分包含经设计的锚蛋白重复结构域，并且其中所述宿主细胞是原核宿主细胞，诸如例如大肠杆菌。在另一个实施方案中，制备结合部分的方法包括在表达所述重组结合蛋白的条件下培养宿主细胞，其中所述结合部分包含抗体，并且其中所述宿主细胞是真核宿主细胞，诸如例如CHO细胞。
药物组合物
本发明还涉及药物组合物，这些药物组合物包含本文所述的结合部分、重组结合蛋白或前药，以及药学上可接受的载剂或赋形剂。本发明的药物组合物还可以包含本文所述的核酸和药学上可接受的载剂或赋形剂。
本文还描述了使用所述药物组合物的用途和治疗方法。下面更详细地描述本发明所包括的方法和用途。应注意，该药物组合物、方法和用途治疗由用于制备该药物组合物的药物分子治疗的疾病适应症。
本文所述的药物组合物可以使用本领域已知的方法制备。
药物组合物包含药学上可接受的载剂或赋形剂。标准药物载剂包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液诸如油/水或水/油乳液以及各种类型的润湿剂。
药物组合物可包含任何药学上可接受的成分，包括例如酸化剂、添加剂、吸附剂、气溶胶推进剂、空气置换剂、碱化剂、抗结块剂、抗凝剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、抗菌剂、基料、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、涂布剂、着色剂、干燥剂、洗涤剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、溶解增强剂、染料、润肤剂、乳化剂、乳液稳定剂、填料、成膜剂、风味增强剂、调味剂、流动增强剂、胶凝剂、粒化剂、湿润剂、润滑剂、粘膜粘附剂、膏剂基料、膏剂、含油溶媒、有机基料、锭剂基料、颜料、增塑剂、抛光剂、防腐剂、螯合剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基料、界面活性剂、表面活性剂、悬浮剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张度剂、毒性剂、增粘剂、吸水剂、水混溶性共溶剂、水软化剂或润湿剂。参见例如Handbook ofPharmaceutical Excipients第三版,A.H.Kibbe(Pharmaceutical Press，London，UK，2000年)，其全文以引用方式并入。Remington’s Pharmaceutical Sciences，第十六版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980年)，其全文以引用方式并入。
可配制药物组合物以实现生理上相容的pH。在一些实施方案中，药物组合物的pH可例如介于约4或约5和约8.0之间，或介于约4.5和约7.5之间，或介于约5.0和约7.5之间。在示例性实施方案中，药物组合物的pH介于约5.5与约7.5之间。
在一个实施方案中，本发明涉及在有需要的受试者中免疫细胞活化、诸如T细胞活化或NK细胞活化的方法，该方法包括向所述受试者施用如本文所述的药物组合物的步骤。
在另一个实施方案中，本发明涉及控制活性药物分子在体内释放的方法，该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗受试者的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本文所定义的药物组合物的步骤。在一些实施方案中，该方法是治疗增殖性疾病的方法。在一些实施方案中，该方法是治疗癌症的方法。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于疗法的如本文所定义的药物组合物。优选地，提供如本文所定义的药物组合物用于治疗增殖性疾病。在更优选的实施方案中，增殖性疾病是癌症。
通常将本发明的药物组合物施用于已被鉴定为具有明显不良作用风险的受试者，这些不良作用通常与药物分子有关。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在优选地实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，药物组合物的单次施用可能是足够的。在其他实施方案中，重复施用可能是必需的。各种因素将影响施用的次数和频率，诸如受试者的年龄和一般健康状况，以及药物分子的性质和典型的剂量方案。
本文所述的药物组合物可经由任何合适的施用途径施用给受试者，这些施用途径诸如肠胃外、鼻腔、口服、肺部、局部、阴道或直肠施用。适用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂，以及使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。另外的细节参见Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.LippincottCompany，Philadelphia，PA，Banker和Chalmers编辑，第238-250页，1982年，以及ASHPHandbook on Injectable Drugs，Toissel，第4版，第622-630页，1986年。
实施例
材料和方法
下文公开的起始材料和试剂是本领域技术人员已知的，是可商购获得的和/或可使用熟知的技术制备。
材料
化学品购自Sigma-Aldrich(USA)。寡核苷酸来自Microsynth(Switzerland)。除非另有说明，否则DNA聚合酶、限制酶和缓冲液来自New England Biolabs(USA)或Fermentas/Thermo Fisher Scientific(USA)。诱导型大肠杆菌表达菌株用于克隆和蛋白质产生，例如大肠杆菌XL1-blue(Stratagene，USA)或BL21(Novagen，USA)。用于SPR测量的NLC芯片来自BioRad(BioRad，USA)。HTRF试剂来自Cisbio(Cisbio，France)。泛T细胞分离试剂盒来自Miltenyi Biotec(Germany)。细胞毒性检测(通过LDH释放)试剂盒来自Roche。重组蛋白酶来自R&D Systems(Minneapolis，USA)或Sigma-Aldrich(USA)。
分子生物学
除非另有说明，否则根据已知方案执行方法(参见例如Sambrook J.、FritschE.F.和Maniatis T.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory 1989,New York)。
经设计的锚蛋白重复蛋白文库
用于生成经设计的锚蛋白重复蛋白文库的方法已经描述于以下中：例如，美国专利号7,417,130；Binz等人，2003，同前；Binz等人，2004，同前。通过此类方法，可构建具有随机化锚蛋白重复模块和/或随机化封端模块的经设计的锚蛋白重复蛋白文库。例如，此类文库可相应地基于固定的N-末端加帽模块或随机化的N-末端加帽模块、一个或多个随机化的重复模块、以及固定的C-末端加帽模块或随机化的C-末端加帽模块来组装。优选地，此类文库被组装成在重复或封端模块的随机化位置处不具有氨基酸C、G、M、N(在G残基前面)和P中的任一者。
此外，此类文库中的此类随机化模块可包含具有随机化氨基酸位置的附加的多肽环插入。此类多肽环插入的示例是抗体的互补决定区(CDR)环文库或从头生成的肽文库。例如，可以使用人核糖核酸酶L的N-末端锚蛋白重复结构域的结构(Tanaka,N.,Nakanishi,M,Kusakabe,Y,Goto,Y.,Kitade,Y,Nakamura,K.T.,EMBO J.23(30),3929-3938,2004)作为指导来设计这种环插入。类似于其中将十个氨基酸插入在靠近两个锚蛋白重复的边界存在的β-转角中的这种锚蛋白重复结构域，锚蛋白重复蛋白文库可以包含插入在锚蛋白重复结构域的一个或多个β-转角中的可变长度(例如，1个至20个氨基酸)的随机化环(具有固定位置和随机化位置)。
锚蛋白重复蛋白文库的N-末端封端模块优选具有RILLAA、RILLKA或RELLKA基序，并且锚蛋白重复蛋白文库的任何此类C-末端封端模块优选具有KLN、KLA或KAA基序。
此类锚蛋白重复蛋白文库的设计可由与靶标相互作用的锚蛋白重复结构域的已知结构来指导。由其蛋白质数据库(PDB)唯一登录号或识别码(PDB-ID)识别的此类结构的示例为1WDY、3V31、3V30、3V2X、3V2O、3UXG、3TWQ-3TWX、1N11、1S70和2ZGD。
已经描述了经设计的锚蛋白重复蛋白文库(诸如N2C和N3C经设计的锚蛋白重复蛋白文库)的示例(美国专利号7,417,130；Binz等人,2003,同前；Binz等人,2004,同前)。N2C和N3C中的数字描述了存在于N末端和C末端封端模块之间的随机化重复模块的数量。
用于定义重复单元和模块内部的位置的命名法基于Binz等人，2004(同前)，修改之处在于，锚蛋白重复模块和锚蛋白重复单元的边界移位一个氨基酸位置。例如，Binz等人2004(同前)的锚蛋白重复模块的位置1对应于本公开的锚蛋白重复模块的位置2，因而Binz等人2004(同前)的锚蛋白重复模块的位置33对应于本公开的以下锚蛋白重复模块的位置1。
EGFR特异性结合结构域
选择EGFR作为示例性TAA，因为可获得人-小鼠交叉反应性锚蛋白重复结合结构域，其允许在相同的体内模型中同时测试安全性和功效(即治疗窗口)。
通过核糖体展示(Ribosome Display)从文库中选择针对人EGFR(L25-S645)的生物素化的全长胞外结构域(ECD)的EGFR特异性结合物，其方式类似于Binz等人2004(同前)描述的方式。
从第1轮到第4轮，靶标浓度降低。对所得的DARPin分子的池进行PCR扩增，并连接到用于细菌表达的载体中。
用所得质粒池转化大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-Blue，用于如前所述(Ref)分离质粒DNA并接种表达培养物。对表达培养物进行收获、裂解，并通过ELISA筛选所得DARPin粗提取物结合至人EGFR和小鼠EGFR-Fc(L25-S647，RnD Systems)的ECD的能力。使用含有0.1％ Tween-20(Sigma)的PBS进行各温育步骤之间的自动洗涤。
通过均相时间分辨荧光(HTRF)鉴定针对EGFR亚结构域III内的未掩蔽表位的结合物。将生物素化的hEGFR(最终4nM)与10倍过量的(Merck)一起在室温下预温育1小时。将检测试剂MAb抗6HIS-Tb穴状化合物和链霉亲和素-d2(CisBio)根据制造商的推荐进行稀释，并与DARPin分子一起以10nM最终浓度进行添加。在660nm下测量结合信号，并用Infinite M1000 Pro仪器(Tecan)相对于620nm信号进行归一化。
通过表面等离子体共振(SPR)将EGFR特异性锚蛋白重复结构域结合至重组人和小 鼠EGFR
使用ProteOnTMXPR36蛋白质相互作用阵列系统(Bio-Rad)进行所有SPR测量。将生物素化的单价抗EGFR在NLC中性抗生物素蛋白传感器芯片上分别捕获至约48RU和约55RU，用于对hEGFR的亲和性测量，或捕获至约66RU和约127RU，用于对mEGFR(ACRObiosystems)的亲和性测量。将含有0.005％ Tween-20(Sigma)的PBS pH7.4用作流动缓冲液，在mEGFR靶标的情况下，其另外补充有1mg/ml BSA。将从0.74nM至60nM的hEGFR或mEGFR的三倍稀释系列以100ul/min的流速注射180秒，并记录离解，持续1800秒。将捕获的DARPin分子通过10mM甘氨酸-HCl，pH 2.5+1M NaCl的单脉冲再生。使用interspots(表面参考)和空白注射(缓冲液参考)对数据进行双重参考。将每个单独的稀释组拟合到兰格谬尔-1:1模型。
通过SPR测量人-小鼠交叉反应性EGFR结合物对人和小鼠EGFR ECD的亲和力。表2示出了单价格式的EGFR结合性的结合动力学数据，该数据表明对人EGFR ECD的KD为约470pM，并且对小鼠EGFR ECD的KD为约490pM。
表2：通过SPR对生物素化的单价DARPin分子与重组人和小鼠EGFR ECD的结合的分 析
用重组蛋白酶进行的切割实验
将基质金属蛋白酶(R&D Systems)在使用前按照制造商所述用对氨基苯汞乙酸盐(APMA)活化。将底物(CD3-PDD CL)在TBS-CB(50mM Tris，pH 7.4、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.05％ Brij-35)中稀释至5μM的2倍储备浓度。添加等体积的蛋白酶(10ng/mL-1000ng/ml浓度，取决于反应速度)以开始反应，在37℃下在适当回火的恒温器中进行。以规则的间隔取出反应样品并立即与含有SDS的LabChip缓冲液混合，以使混合物的所有蛋白质变性并因此停止反应。用LabChip HT Protein Express毛细管电泳系统(Perkin Elmer，USA)分析这些样品，以将3-结构域CD3-PDD切割成1-结构域结合物和2-结构域活性TCE。
通过FC结合至HCT 116肿瘤细胞上的人EGFR和Jurkat wt细胞上的人CD3
使用流式细胞仪Attune Nxt确定与Jurkat细胞上的人CD3的CD3结合情况，以及与HCT116肿瘤细胞上的hEGFR的结合情况。将一滴前药DARPin分子与每孔200'000个细胞(对于Jurkat和HCT116细胞两者)一起在4℃下温育30分钟。洗涤后，通过用1:1000稀释的抗抗体混合物(在4℃下温育1小时)与对应的二级抗体抗兔IgG Alexa Fluor 488(在4℃下温育30分钟)来检测/>分子的CD3结合情况，该二级抗体在洗掉过量的抗DARPin抗体后添加。随后洗涤细胞并进行livedead染色(aqua，1:1000，thermofisher)，并重悬于Cytofix固定缓冲液(BD Biosciences)中。通过流式细胞术测量结合在活细胞上的Alexa Fluor 488的平均荧光强度的中值，并使用GraphPad Prism 8对数据作图。
T细胞活化
通过对CD8+ T细胞上的CD25活化标志物进行FACS测量，在体外短期T细胞活化测定中评估与CD3接合的DARPin分子的特异性和效力。因此，在600μM人血清白蛋白的存在下，一式两份地将每孔100'000个人泛T效应细胞和20'000个HCT116靶细胞与前药样品的系列稀释液一起在37℃下共温育(E:T比率5:1)48小时。48小时候，洗涤细胞，并用1:5'000Live/Dead FITC(Thermo Fisher)、1:250小鼠抗人CD8 Pasific Blue(BD)和1:250小鼠抗人CD25PerCP-Cy5.5(BC96，eBiosciences)抗体在4℃下染色30分钟。洗涤和固定后，在流式细胞仪Attune Nxt上分析细胞。通过测量Live/Dead阴性和CD8阳性门控T细胞上的CD25阳性细胞来评估T细胞活化情况。使用FlowJo软件分析FACS数据，并使用GraphPad Prism 8对数据作图。用来自三个个体人供体的泛T细胞进行三次测定。
肿瘤细胞杀伤：通过LDH释放进行的体外短期细胞毒性测定。
通过LDH释放进行体外短期细胞毒性测定，评估与CD3接合的DARPin分子的特异性和效力。在600μM人血清白蛋白(以模拟生理浓度)的存在下，在96孔板中以5:1的E:T比率一式两份地共温育效应细胞和靶细胞。使用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi)从人PBMC中分离未接触的T细胞。将每孔100'000个纯化的泛T细胞(效应细胞)和20'000个HCT116细胞(靶细胞)与所选前药DARPin分子的系列稀释液一起温育。包括了各种对照(即，仅T细胞、仅肿瘤细胞、Triton对照、仅结合部分)。温育48小时后，将细胞离心，并将每孔100μl上清液和每孔100μl LDH反应混合物(LDH检测试剂盒；Roche Applied Science)温育30分钟。通过TECANinfinite M1000Pro读数器测量492nm-620nm处的吸光度。背景校正后，使用GraphPadPrism 8对OD值作图。用来自三个个体人供体的泛T细胞进行三次测定。
体内实验
体内实验由Transcure SA(TCS)(Archamps，France)使用雌性NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull免疫缺陷小鼠株(NCG)进行。按照TCS专有的人源化方案，使用从人脐带血分离的造血干细胞(CD34+、HLA-B35+)将小鼠人源化(hu-小鼠)。选择人源化小鼠，并通过在肿瘤细胞移植前一周接受基于人细胞因子IL-3、IL-4、IL-15、Flt3-L和GM-CSF的瞬时表达的水动力增强来增强T细胞、NK细胞和骨髓细胞群。仅使用人源化率(hCD45/总CD45)高于25％的小鼠。
按照ATCC推荐在体外扩增HCT-116肿瘤细胞。在存活率检查之后，将处于对数生长期的肿瘤细胞在PBS中皮下注射到动物的右胁腹中(3×106个细胞)。将肿瘤移植定义为实验第0天(D0)。
所有体内程序均已通过当地伦理委员会(CELEAG)的审查和批准。
实施例1：对CD3特异性结合结构域具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的选择
概要
使用核糖体展示(Hanes,J.和Plückthun,A.，PNAS 94,4937-42,1997)，以类似于Binz等人，2004(同前)描述的方式，以具体条件和附加的反选择步骤，从文库中选择对T细胞接合剂分子(TCE)的CD3特异性结合结构域具有结合特异性的多个锚蛋白重复结构域。通过大肠杆菌粗提取物均相时间分辨荧光(HTRF)，评估所选克隆对CD3特异性结合结构域的结合和特异性，指示成功选择了特异性结合CD3特异性结合结构域的多种结合蛋白。这些最初鉴定的结合蛋白被进一步开发以获得对TCE的CD3特异性结合结构域具有甚至更高亲和力和/或甚至更低解离速率的结合蛋白。例如，SEQ ID NO:1至12的锚蛋白重复结构域构成结合蛋白的氨基酸序列，该结合蛋白包含具有与双特异性T细胞接合剂分子的CD3特异性结合结构域的结合特异性和高结合亲和力和/或低解离速率的锚蛋白重复结构域。
CD3特异性结合结构域作为靶标和选择材料
双特异性TCE的CD3特异性结合结构域用作靶标和选择材料。此类靶结构域选自SEQ ID NO:13-17的多肽。使用标准方法将靶蛋白生物素化。
通过核糖体展示选择对CD3特异性结合结构域具有特异性的锚蛋白重复蛋白
经设计的锚蛋白重复蛋白文库(N2C和N3C)用于针对用作靶标的CD3特异性结合结构域(SEQ ID NO:13)的核糖体展示选择中(参见Binz等人,Nat Biotechnol 22,575-582(2004)；Zahnd等人,Nat Methods 4,269-279(2007)；Hanes等人,Proc Natl Acad Sci USA95,14130-14135(1998))。每个靶标和文库进行四轮选择。四轮选择采用标准核糖体展示选择，使用降低靶标浓度和增加洗涤严格性来增加从第1轮到第4轮的选择压力(Binz等人，2004，同前)。每轮选择后，逆转录(RT)-PCR循环数不断减少，从而由于结合物的富集而调整收率。然后对得到的3个池进行结合物筛选。
如通过粗提取物HTRF所示，所选克隆特异性结合TCE的CD3特异性结合结构域
使用标准方案，使用表达锚蛋白重复蛋白的大肠杆菌细胞的粗提取物，通过均相时间分辨荧光(HTRF)测定来鉴定溶液中特异性结合TCE的CD3特异性结合结构域的单独选择的锚蛋白重复蛋白。将通过核糖体展示选择的锚蛋白重复蛋白克隆克隆到pQE30(Qiagen)表达载体的衍生物中，格式为H-C-X，其中H表示人血清白蛋白(HSA)结合结构域，C表示CD3结合结构域(SEQ ID NO:13)，并且X表示所选的锚蛋白重复蛋白。将构建体转化到平板接种在LB-琼脂(含有1％葡萄糖和50μg/ml氨苄青霉素)上的大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)中，然后在37℃下温育过夜。将单个菌落挑取到含有200μl生长培养基(含有1％葡萄糖和50μg/ml氨苄青霉素的LB)的96孔板中(每个克隆在单个孔中)，并以800rpm振荡在37℃下温育过夜。将含有50μg/ml氨苄青霉素的150μl TB培养基与10μl过夜培养物一起接种于新鲜的96深孔板中。在37℃和850rpm下温育120分钟后，用IPTG(0.5mM最终浓度)诱导表达并持续6小时。通过将板离心来收获细胞，弃去上清液并将沉淀物在-20℃处冷冻过夜，然后重悬于10μl B-PERII(Thermo Scientific)中，并在室温下振荡(600rpm)温育一小时。然后，添加160μl PBS，并通过离心(3220g持续10分钟)去除细胞碎片。将每个裂解克隆的提取物作为PBSTB(补充有0.1％ Tween和0.1％(w/v)BSA的PBS，pH 7.4)中的1:800稀释液(最终浓度)与12.5nM(最终浓度)生物素化CD3结合结构域、1:300(最终浓度)的抗FLAG-D2 HTRF抗体-FRET受体缀合物(Cisbio)和1:300(最终浓度)的抗strep-Tb抗体FRET供体缀合物(Cisbio,France)一起施加到384孔板的孔中，并在室温下在黑暗中温育120分钟。使用340nm激发波长及用于背景荧光检测的620±10nm发射滤光片和用于检测特异性结合的荧光信号的665±10nm发射滤光片，在Tecan M1000上读出HTRF。将相同的裂解物与12.5nM(最终浓度)生物素化HSA、1:300(最终浓度)抗FLAG-D2 HTRF抗体-FRET受体缀合物(Cisbio)和1:300(最终浓度)抗strep-Tb抗体FRET供体缀合物(Cisbio，France)混合到384孔板的孔中，并在室温下在黑暗中温育120分钟。使用340nm激发波长及用于背景荧光检测的620±10nm发射滤光片和用于检测特异性结合的荧光信号的665±10nm发射滤光片，在Tecan M1000上读出HTRF。测试每个裂解克隆的提取物对与生物素化CD3结合靶结构域的结合和对生物素化HSA的不受阻碍的结合的抑制，以便评估与CD3结合结构域的特异性结合。
对靶蛋白具有较低亲和力的结合蛋白的进一步分析和选择
最初鉴定了总共744种结合蛋白。基于结合谱，选择176个候选物以在96孔格式中表达，并平行于DNA测序纯化至均一性。通过尺寸排阻色谱法对候选物进行生物物理表征。从中筛选出24种结合物，并以X格式克隆和生产。通过尺寸排阻色谱法、Sypro-Orange热稳定性评估(参见Niesen等人,Nat Protoc 2,2212-2221,(2007))、ProteOn表面等离子体共振(SPR)靶亲和力评估、ELISA、靶蛋白竞争HTRF实验和/或SDS-PAGE对纯化的单价结合物进行生物物理表征。从这些经表征的24种结合物中，选择结合物#1(SEQ ID NO:1)用于亲和力下调。
通过用丙氨酸替换结合物#1的所选氨基酸残基，产生一组下调的结合物，其结合CD3结合结构域的相同表位但具有不同亲和力。通过表面等离子体共振(SPR)验证下调的结合蛋白的亲和力。通过该方法产生衍生自亲本结合物#1的结合物#2至#12(SEQ ID NO:2至12)。总之，由这种方法产生的以下12种结合蛋白(SEQ ID NO:1至12)构成了本发明的结合部分：
结合物#1(SEQ ID NO:1)；结合物#2(SEQ ID NO:2)；结合物#3(SEQ ID NO:3)；结合物#4(SEQ ID NO:4)；结合物#5(SEQ ID NO:5)；结合物#6(SEQ ID NO:6)；结合物#7(SEQID NO:7)；结合物#8(SEQ ID NO:8)；结合物#9(SEQ ID NO:9)；结合物#10(SEQ ID NO:10)；结合物#11(SEQ ID NO:11)；结合物#12(SEQ ID NO:12)。
为了分析结合物#1至结合物#12的生物物理学性质以及为了确定它们对靶蛋白的结合亲和力(参见实施例2)，构建了编码结合部分的表达载体，这些结合部分具有融合在N-末端的His标签(SEQ ID NO:25)，以便于纯化。
选择用于分析的结合蛋白的高水平和可溶性表达
为了进一步分析，将结合物在大肠杆菌细胞中表达，并根据标准方案使用它们的His-标签纯化。使用50ml固定过夜培养物(TB，1％葡萄糖、50mg/l氨苄青霉素；37℃)接种1000ml培养物(TB，50mg/l氨苄青霉素，37℃)。在600nm处1.0至1.5的吸光度下，用0.5mMIPTG诱导培养物并在37℃处温育4小时-5小时，同时振荡。将培养物离心，并将所得沉淀物重悬于25ml TBS500(50mM Tris–HCl，500mM NaCl，pH 8)中并裂解(超声处理或弗氏压碎器)。裂解后，将样品与50KU DNA酶/ml混合，温育15分钟，然后在62.5℃热处理30分钟，离心并收集上清液并过滤。向匀浆中添加Triton X100(1％(v/v)最终浓度)和咪唑(20mM最终浓度)。根据本领域技术人员已知的标准方案和树脂，将蛋白质在镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱上进行纯化，随后在系统上进行尺寸排阻色谱法。从大肠杆菌培养物(每升培养物至多200mg锚蛋白重复蛋白)中纯化对TCE CD3结合结构域具有结合特异性的高度可溶性锚蛋白重复蛋白，如从4％-12％ SDS-PAGE估计的纯度>95％。
实施例2：SPR结合测定
本发明的结合部分的一个重要特征是其对药物分子的亲和力。相关方面包括结合部分从药物分子的解离速率和所得的阻断半衰期。使用表面等离子体共振(SPR)测定来确定锚蛋白重复结合结构域与TCE药物分子的CD3结合结构域的结合亲和力。使用Bio-RadProteOn XPR36仪器以PBS-T(0.005％ Tween 20)作为运行缓冲液生成所有SPR数据。根据Bio-Rad手册对新的中性抗生物素蛋白传感器芯片(NLC)进行空气初始化和条件化。针对捕获到NLC芯片上并与分别用作分析物的具有SEQ ID NO:13至17的CD3特异性结合结构域结合的生物素化结合物#1至#4(如上文实施例1中所列)生成SPR数据。数据通过以下方式生成：在25℃下，并且使用以50nM(结合物#1)或300nM(结合物#2、#3和#4)开始的靶标的1:3稀释系列，在40分钟期间测量结合速率(kon)、解离速率(koff)，并且导出结合物#1和#2的平衡解离常数(KD)。通过平衡拟合获得结合物#3和#4的解离常数(KD)。针对所有结合物-CD3特异性结合结构域组合获得的KD值显示在图2中，更详细的信息在表3中给出。
所有结合物均显示出两位数pM至三位数nM范围内的KD值。因此，这些实验显示，结合物#1至#4对用于TCE药物分子的CD3特异性结合结构域的亲和力范围很大。
表3：通过SPR对不同的结合物与不同的CD3结合结构域的结合的分析
实施例3：可使用抗CD3结合结构域和彼此具有不同亲和力的结合物来构建CD3- PDD
可使用对CD3具有不同亲和力的抗CD3结合结构域和这些结合结构域的不同结合物来构建CD3-PDD。图3示出了使用来自三个供体中一个代表性供体的HCT 116肿瘤细胞和泛T细胞的标准肿瘤细胞杀伤测定。将包含对CD3具有较低亲和力的抗CD3结合结构域C7v119或对CD3具有较高亲和力的抗CD3结合结构域C7v122的活性TCE(抗EGFR×抗CD3)与它们对应的含有抗CD3结构域的两种不同结合物(结合物#3或#4)的CD3-PDD NCL对应物进行比较。
与图2中所示的所测量的结合物对相应CD3结合结构域的亲和力一致，与较低亲和力的结合物#3相比，对两种CD3结合结构域具有更高亲和力的结合物#4显示出总体更高的掩蔽效率。此外，发现在C7v122 CD3结合结构域的背景下(图3B)的结合物#3和#4的掩蔽效率高于具有CD3结合结构域C7v119的构建体(图3A)的掩蔽效率。以pM计的EC50值在表4中给出。
表4：针对使用HCT 116肿瘤细胞和泛T细胞的肿瘤细胞杀伤测定获得的EC50值 (pM)。示出了三个供体中一个代表性供体的值。
实施例5：CD3-PDD的掩蔽效率取决于靶细胞上的抗原表达水平
为了理解肿瘤相关抗原(TAA)表达水平对掩蔽效率的影响，用两种不同的表达EGFR的肿瘤细胞系(即鳞状癌细胞系A431和结肠直肠癌细胞系HCT 116)进行T细胞活化测定。通过QUIFIKIT定量得到A431细胞上的约230k EGFR分子(EGFR+++)和HCT 116细胞上的约18k EGFR分子(EGFR+)。使用这两种细胞系和活性TCE或不可切割的CD3-PDD NCL(均含有CD3结合结构域结合物C7v14)的T细胞活化实验显示在图4中，并且证明对于EGFR中等至低表达性HCT 116细胞，掩蔽窗口(即活性TCE与CD3-PDD NCL之间的EC50差异)非常大，而对于EGFR高表达性A431细胞，掩蔽窗口仅为约200倍。Geiger等人(Nat Communication,2020)也描述了掩蔽效率对肿瘤抗原表达水平的这种依赖性，这是与本文所述类似的前药概念。
表5总结了在T细胞活化测定中测量的以pM计的EC50值。
表5：使用EGFR+++A431或EGFR+HCT 116肿瘤细胞和泛T细胞的T细胞活化测定中的 EC50值(pM)。示出了两个供体中一个代表性供体的值。
实施例6：重组蛋白酶在体外有效地切割CD3-PDDCL
将不可切割的前药CD3-PDD(NCL)以及含有可切割接头#2和CD3结合结构域C7v119或C7v122的可切割的CD3-PDD(CL)在有或没有蛋白裂解酶(1:10'000酶与底物比率)的情况下温育，并在37℃下温育20小时后在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分析切割情况(图5)。CD3-PDD NCL不受蛋白裂解酶影响，而包含C7v119或C7v122的两个CD3-PDD CL主要被切割成1-结构域(1D)结合物和2-结构域(2D)活性TCE。然后将切割后的CD3-PDD CL用作T细胞活化和肿瘤细胞杀伤测定中的预切割对照，如图10所示，并证明其功能几乎与活性TCE一样。
在下一步骤中，用五种不同的肿瘤相关蛋白酶(即蛋白裂解酶、尿激酶、MMP-2、-7和-9)对含有三种不同可切割接头序列(接头#1-#3)的CD3-PDD CL以及CD3-PDD NCL进行详细研究。通过记录切割进程曲线并在毛细管电泳分离装置(LabChip)上分析所得的1D和2D片段来确定每种蛋白酶对每种构建体的切割速率。计算切割速率(切割的CD3-PDD CL分子/酶分子/分钟)并示于图6中。接头#1仅表现出被蛋白裂解酶和尿激酶切割，基质金属蛋白酶(MMP)不能切割这些构建体。相反，除MMP-7外，接头#2被所有研究的蛋白酶有效切割，而接头#3被所有五种蛋白酶切割。由于接头#2的总切割速率优于接头#3，因此选择含有接头#2的构建体用于进一步研究。
实施例7：CD3-PDD仅在同时存在靶细胞上的TAA和接头切割的情况下才有活性
条件活化的CD3-前药的概念构成逻辑AND门的形式：仅当事件1(TAA结合结构域结合至TAA)以及事件2(肿瘤相关蛋白酶通过切割接头解除CD3结合物的阻断)同时存在时，药物可在T细胞、药物和靶细胞之间形成三分子复合物。因此，如果事件1或2缺失，则CD3-PDD将不能形成这种三分子复合物。
为了研究这种假设，我们检查了CD3-PDD NCL和CL是否在肿瘤细胞上不存在TAA(事件1)或具有掩蔽的CD3结合结构域(事件2)的情况下显示出T细胞活化和肿瘤细胞杀伤。因此，生成HCT 116的EGFR敲除细胞系，并与野生型细胞系一起测试肿瘤细胞杀伤和T细胞活化(分别参见图7A和7B)。在不存在TAA EGFR的情况下，没有构建体表现出肿瘤细胞杀伤或T细胞活化，这证实事件1是活性的先决条件。对于在CD3结合结构域与结合物之间含有不可切割接头的CD3-PDD NCL，在肿瘤细胞杀伤或T细胞活化方面没有观察到活性。相反，对于含有可切割接头#2的CD3-PDD CL，可观察到肿瘤细胞杀伤和T细胞活化，然而效力和功效水平较低。这一观察结果归因于在体外测定中细胞分泌的蛋白酶对CD3-PDD CL分子的部分切割(参见图8)。
表6总结了在使用一个代表性供体的EGFR+或EGFR KO HCT116肿瘤细胞和泛T细胞的肿瘤细胞杀伤和T细胞活化测定中测量的EC50值(以pM计)。
表6：在使用HCT116肿瘤细胞和泛T细胞的T细胞活化和肿瘤细胞杀伤测定中测量 的EC50值(pM)。示出了一个代表性供体的值。
n.a.：不适用
实施例8：在体外细胞测定中分泌的蛋白酶导致CD3-PDDCL的活化
已经观察到，与针对不可切割的CD3-PDD NCL观察到的T细胞活化和肿瘤细胞杀伤活性相比，CD3-PDD CL可再现地表现出更高的T细胞活化和肿瘤细胞杀伤活性。流行的假设是，肿瘤细胞或T细胞分泌的蛋白酶切割并因此活化CD3-PDD CL。为了证实这种假设，在实验结束时(即温育48小时后)收获泛T细胞和A431肿瘤细胞的T细胞活化实验的上清液，并通过免疫沉淀和蛋白质印迹进行分析(图8)。实际上，发现具有两个不同接头序列(接头#2和#3)的构建体在很大程度上被切割，如通过分别在35kDa和17kDa处存在1-结构域(1D)和2-结构域(2D)条带所例示的。切割的程度还与相应CD3-PDD CL构建体的EC50相关。相反，具有不可切割接头的CD3-PDD NCL没有显示出任何切割，并且显示出>100倍的掩蔽窗口(活性TCE与CD3-PDD NCL之间的EC50差异)。
实施例9：可通过将抗HSA结合结构域附接至CD3-PDD构建体的C-末端而延长其半 衰期
可通过将抗HSA结合结构域附接至CD3-PDD构建体的C-末端而容易地延长其半衰期(HLE)。这带来的优点是，长寿命的CD3-PDD分子在肿瘤相关蛋白酶切割蛋白酶可切割的接头时可转化为短寿命的活性TCE(抗TAA×抗CD3)。当离开肿瘤并进入循环时，短寿命的活性TCE将被快速清除，从而导致较少的副作用。
为了研究HSA对结合物在抗CD3结构域上的掩蔽效力的潜在负面立体效果，我们在存在600μM HSA的情况下使用泛T细胞和HCT 116肿瘤细胞在标准肿瘤细胞杀伤测定中比较了活性TCE、非半衰期延长的CD3-PDD NCL和半衰期延长的CD3-PDD NCL。在以下两种不同结合物的背景下对非HLE和HLE CD3-PDD构建体进行了研究，以便通过使阻断相互作用更紧密而潜在地抵消空间位阻：对CD3结合结构域表现出高亲和力(<1nM KD)的结合物#1和对CD3结合结构域表现出较低亲和力(>100nM KD)的结合物#3，分别参见图9A和9B。
发现含有较低亲和力的结合物#3(>100nM KD)的CD3-PDD构建体在C-末端附接抗HSA结合结构域后，掩蔽效率略有降低，这因此表明，HSA的存在可能对结合物-抗CD3结构域相互作用具有轻微的负面立体效果。然而，这种掩蔽效率的轻微损失可以通过为CD3-PDD构建体选择更高亲和力的结合物来克服。
实施例10：细胞结合
通过FC评估与HCT 116肿瘤细胞上的人EGFR和Jurkat wt细胞上的人CD3的结合，其中用荧光标记的抗DARPin抗体检测DARPin分子。为此目的，将活性TCE(抗EGFR×抗CD3)和具有CL或NCL的CD3-PDD构建体进行头对头比较。如所预期的，对于所有测试的构建体，与HCT 116细胞的结合效果相当，EC50值在350pM-600pM范围内(参见图10第一列和表7)。
与含有较低亲和力的CD3结合物C7v122(SEQ ID NO:15)(EC50>10nM；参见图10第二列)的活性TCE相比，发现含有较高亲和力的CD3结合物C7v119(SEQ ID NO:16)(EC50＝7.9nM)的活性TCE与Jurkat wt细胞的结合略强。具有CL或NCL的CD3-PDD构建体没有显示出通过CD3与T细胞的结合，这因此证实了掩蔽概念的功能性。
表7：活性TCE或CD3-PDD构建体与HCT116肿瘤细胞结合的EC50值(pM)和与Jurkat 细胞结合的EC50值(nM)。示出了三个供体中一个代表性供体的值。
实施例11：T细胞活化/杀伤测定
对于T细胞活化和肿瘤细胞杀伤测定，将靶肿瘤细胞和效应T细胞(来自健康血液供体的泛T细胞)以5:1的效应细胞与靶细胞比率组合，添加前药样品，并将混合物在37℃下温育48小时。分析上清液中杀伤的肿瘤细胞的LDH释放，并通过FACS(使用CD25单克隆抗体(BC96)，PerCP-Cyanine5.5，eBioscienceTM)确定CD8+ T细胞上的活化标志物(CD25)的水平。包括了各种对照(即，仅T细胞、仅肿瘤细胞、Triton对照、仅结合部分)。
用来自三个个体人供体的泛T细胞进行三次测定。
为此目的，将含有CD3结合结构域C7v119(SEQ ID NO:15)(对CD3具有较低亲和力)或C7v122(SEQ ID NO:16)(对CD3具有较高亲和力)的活性TCE(抗EGFR×抗CD3)、CD3-PDDNCL、CD3-PDD CL和预切割的CD3-PDD CL进行头对头比较。对于所有CD3-PDD构建体，使用结合物#4(SEQ ID NO:4)来掩蔽CD3结合结构域C7v119或C7v122。
活性TCE和预切割的CD3-PDD CL在T细胞活化(参见图10第三列和表8)和肿瘤细胞杀伤测定(参见图10第四列和表8)中显示出在单数位至低双数位pM范围内的EC50值。与活性TCE和预切割的CD3-PDD CL相比，CD3-PDD CL构建体在T细胞活化和肿瘤细胞杀伤测定中显示出约10倍-20倍高的EC50值，据推测这是由于它们被在测试的体外条件下存在的蛋白酶有限切割。
此外，与包含C7v119结构域的构建体(参见图10下排和表8)相比，对于包含CD3结合结构域C7v122的CD3-PDD CL构建体(参见图10上排和表8)观察到较低的效力和较低的功效。因此，将基于C7v122的构建体连同相应的对照一起移入PoC体内研究中。
CD3-PDD NCL构建体既未导致T细胞活化也未导致肿瘤细胞杀伤。
表8：使用HCT116肿瘤细胞和泛T细胞的T细胞活化和肿瘤细胞杀伤测定中的EC50 值(pM)。示出了三个供体中一个代表性供体的值。
实施例12：可切割的CD3-PDD在移植了HCT 116肿瘤细胞的CD34+hu小鼠中是有效 的和在体内良好耐受的
选择使用在实施例10和11中测试过的更高亲和力的CD3结合结构域C7v122(SEQID NO:16)进行T细胞结合、T细胞活化和肿瘤细胞杀伤(图10)的构建体用于体内概念验证研究。对于这种体内研究，所有分子的半衰期都没有延长。
体内研究的目的是评估可切割的CD3-PDD在人结肠癌异种移植模型(HCT 116)中的耐受性和功效，该模型使用用造血干细胞(CD34+)人源化且针对人骨髓细胞的存在而优化的免疫缺陷小鼠。由于EGFR结合物的小鼠交叉反应性，该动物模型允许评估治疗窗口，即同时评估抗肿瘤功效和安全性。在D0，用3×106个HCT-116细胞对二十四只hu小鼠进行皮下移植。在肿瘤细胞移植前7天进行流体动力学质粒递送(IL-3、IL-4、Flt3L、IL-15和GM-CSF的细胞因子加强)。当肿瘤的平均体积达到35mm3时，根据小鼠的肿瘤体积、hCD3 T细胞计数、人源化率和脐带血供体将小鼠随机分成4组，每组6只小鼠，如下所示：
·组1：媒介物对照(PBS+0.05％ Tween-20)
·组2：30nmol/kg的活性TCE对照
·组3：30nmol/kg的具有蛋白酶可切割接头(CL)的CD3-PDD
·组4：30nmol/kg的具有不可切割接头(NCL)的CD3-PDD
除了活性T细胞接合剂对照组由于诱导治疗相关毒性而在D8、D9、D11和D18仅接受4次注射之外，所有组在D8开始每日进行腹膜内注射，持续17天。在D-1和第一次治疗后4小时(D8)，在肿瘤细胞移植前收集血液，用于血浆收集和下游细胞因子测量。每周监测肿瘤体积三次。每周测量体重和临床健康评分三次直至治疗开始，并在治疗期间每天测量。
可切割的CD3-PDD显示出稳健的抗肿瘤活性，类似于用活性的、非阻断的TCE所观察到的(图11B)。CD3-NCL的抗肿瘤功效介于活性TCE与媒介物之间。然而，最重要的是，CD3-PDD CL和NCL都可以每天给药而没有毒性迹象，而活性TCE的给药由于强毒性而必须停止，甚至导致3/6动物的损失。这种毒性表现为在两次注射后用活性TCE治疗的组的体重(BW)的大幅下降(图11D)以及该组中动物的临床健康评分的快速恶化(图11E)。在注射之前和注射第一剂量后4小时从小鼠血清中确定的细胞因子对于用CD3-PDD CL和NCL治疗的组中的小鼠显示几乎没有细胞因子的升高，但是对于用活性TCE治疗的动物显示显著升高的水平。总之，用CD3-PDD CL治疗的动物显示出稳健的抗肿瘤功效，而没有活性TCE的不良毒性作用。
按照本说明书内引用的参考文献的教导内容最彻底地理解本说明书。本说明书内的实施方案提供了对本发明实施方案的说明，并且不应理解为限制本发明的范围。技术人员容易认识到，本发明涵盖许多其他实施方案。本公开中引用的所有出版物、专利和GenBank序列均全文以引用方式并入。在以引用方式并入的材料与本说明书矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何此类材料。对本文任何参考文献的引用不是承认此类参考文献是本发明的现有技术。
本领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的特定实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下权利要求涵盖。
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序列表
<110> MOLECULAR PARTNERS AG
<120> 蛋白酶可切割的前药
<130> P031
<160> 83
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 1
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Trp Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 2
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 2
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Val Ala Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Trp Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 3
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 3
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Ala Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 4
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 4
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Trp Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 5
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 5
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Trp Leu Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 6
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 6
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Val Ala Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Trp Leu Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 7
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 7
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Ala Leu Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 8
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 8
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Trp Leu Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 9
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 9
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Trp Leu Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 10
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 10
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Val Ala Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Trp Leu Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 11
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 11
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Ala Leu Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 12
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 12
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Lys Asp Trp Leu Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly
100 105 110
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
115 120 125
Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 13
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3特异性结合结构域
<400> 13
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn
20 25 30
Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
100 105 110
His Gly Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 14
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3特异性结合结构域
<400> 14
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Ser Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 15
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3特异性结合结构域
<400> 15
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn
20 25 30
Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 16
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3特异性结合结构域
<400> 16
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn
20 25 30
Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
100 105 110
His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 17
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3特异性结合结构域
<400> 17
Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Leu Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn
20 25 30
Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu
35 40 45
Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Asn Lys Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Arg Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly
100 105 110
His Arg Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 18
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可切割的接头序列#1
<400> 18
Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn
1 5 10 15
His Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
20 25
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可切割的接头序列#2
<400> 19
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro Gln Ala Ser Thr Gly Arg Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 20
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可切割的接头序列#3
<400> 20
Gly Ser Gly Ser Pro Gln Gly Ile Trp Gly Pro Leu Ser Gly Arg Ser
1 5 10 15
Asp Asn His Gly Ser Gly Ser
20
<210> 21
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码经设计的锚蛋白重复结构域的核酸
<400> 21
gacttaggaa agaaattgct gcaagccgca cgcgccggtc aacttgatga ggtgcgcgaa 60
ttattgaagg caggtgcaga cgtgaacgct aaagacgcta agggacttac tcctttacac 120
ttagcggcct atcatggtca tttggaaatt gtggaggtcc tgttgaaggc tggtgccgac 180
gtgaacgcca aagatgttta cggttggacc ccattacaca ttgctgccgc ctcgggacat 240
ctggaaattg ttgaggttct gcttaaagct ggcgcagacg ttaatgccaa ggactggttg 300
gggtggacgc ccttacacct ggccgcgtca catggacatt tagagattgt agaagtcctg 360
ttaaaggcgg gcgcggacgt taatgcccaa gacaaaagtg gcaaaacacc agcggatctg 420
gccgctcgtg ctggacacca ggacattgct gaagtgctgc agaaggcagc g 471
<210> 22
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码经设计的锚蛋白重复结构域的核酸
<400> 22
gacttaggaa agaaattgct gcaagccgca cgcgccggtc aacttgatga ggtgcgcgaa 60
ttattgaagg caggtgcaga cgtgaacgct aaagacgcta agggacttac tcctttacac 120
ttagcggcct atcatggtca tttggaaatt gtggaggtcc tgttgaaggc tggcgccgac 180
gtgaacgcca aagatgttgc aggttggacc ccattacaca ttgctgccgc ctcgggacat 240
ctggaaattg ttgaggttct gcttaaagct ggcgcagacg ttaatgccaa ggactggttg 300
gggtggacgc ccttacacct ggccgcgtca catggacatt tagagattgt agaagtcctg 360
ttaaaggcgg gcgcggacgt taatgcccaa gacaaaagtg gcaaaacacc agcggatctg 420
gccgctcgtg ctggacacca ggacattgct gaagtgctgc agaaggcagc g 471
<210> 23
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码经设计的锚蛋白重复结构域的核酸
<400> 23
gacttaggaa agaaattgct gcaagccgca cgcgccggtc aacttgatga ggtgcgcgaa 60
ttattgaagg caggtgcaga cgtgaacgct aaagacgcta agggacttac tcctttacac 120
ttagcggcct atcatggtca tttggaaatt gtggaggtcc tgttgaaggc tggcgccgac 180
gtgaacgcca aagatgttta cggttggacc ccattacaca ttgctgccgc ctcgggacat 240
ctggaaattg ttgaggttct gcttaaagct ggcgcagacg ttaatgccaa ggacgcattg 300
gggtggacgc ccttacacct ggccgcgtca catggacatt tagagattgt agaagtcctg 360
ttaaaggcgg gcgcggacgt taatgcccaa gacaaaagtg gcaaaacacc agcggatctg 420
gccgctcgtg ctggacacca ggacattgct gaagtgctgc agaaggcagc g 471
<210> 24
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码经设计的锚蛋白重复结构域的核酸
<400> 24
gacttaggaa agaaattgct gcaagccgca cgcgccggtc aacttgatga ggtgcgcgaa 60
ttattgaagg caggtgcaga cgtgaacgct aaagacgcta agggacttac tcctttacac 120
ttagcggcct atcatggtca tttggaaatt gtggaggtcc tgttgaaggc tggtgccgac 180
gtgaacgcca aagatgttta cggttggacc ccattacaca ttgctgccgc ctcgggacat 240
ctggaaattg ttgaggttct gcttaaagct ggcgcagacg ttaatgccaa ggactggttg 300
gggtggacgc ccttacacct ggccgcgtca gcaggacatt tagagattgt agaagtcctg 360
ttaaaggcgg gcgcggacgt taatgcccaa gacaaaagtg gcaaaacacc agcggatctg 420
gccgctcgtg ctggacacca ggacattgct gaagtgctgc agaaggcagc g 471
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-标签
<400> 25
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser
1 5 10
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-标签
<400> 26
Gly Ser His His His His His His
1 5
<210> 27
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-PDD构建体中使用的EGFR结合结构域
<400> 27
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
Asn Ala Lys Asp Tyr Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His
65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Val Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr
100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 28
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 不可切割接头
<220>
<221> 变体
<222> 1,2
<223> 其中Xaa Xaa表示GS或SG
<400> 28
Xaa Xaa Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
1 5 10 15
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser
20
<210> 29
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 活性TCE的全序列
<400> 29
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
Asn Ala Lys Asp Tyr Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His
65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Val Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr
100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Gly Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Gly Ser His His His His His His
275 280
<210> 30
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 活性TCE的全序列
<400> 30
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
Asn Ala Lys Asp Tyr Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His
65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Val Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr
100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Gly Ser His His His His His His
275 280
<210> 31
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 活性TCE的全序列
<400> 31
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
Asn Ala Lys Asp Tyr Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His
65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Val Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr
100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Gly Ser His His His His His His
275 280
<210> 32
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-PDD NCL的全序列
<400> 32
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
Asn Ala Lys Asp Tyr Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His
65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Val Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr
100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Gly Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
275 280 285
Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys
290 295 300
Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu
305 310 315 320
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr
325 330 335
Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val
340 345 350
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Tyr Gly Trp
355 360 365
Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu
370 375 380
Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Trp Leu Gly
385 390 395 400
Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly His Leu Glu Ile Val
405 410 415
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser
420 425 430
Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile
435 440 445
Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser His His His His His His
450 455 460
<210> 33
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-PDD NCL的全序列
<400> 33
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
Asn Ala Lys Asp Tyr Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His
65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Val Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr
100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Gly Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
275 280 285
Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys
290 295 300
Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu
305 310 315 320
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr
325 330 335
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340 345 350
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Tyr Gly Trp
355 360 365
Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu
370 375 380
Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Leu Gly
385 390 395 400
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405 410 415
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser
420 425 430
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435 440 445
Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser His His His His His His
450 455 460
<210> 34
<211> 612
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半衰期延长的CD3-PDD NCL的全序列
<400> 34
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
Asn Ala Lys Asp Tyr Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His
65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Val Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr
100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Gly Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
275 280 285
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290 295 300
Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu
305 310 315 320
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr
325 330 335
Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val
340 345 350
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Tyr Gly Trp
355 360 365
Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu
370 375 380
Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Trp Leu Gly
385 390 395 400
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405 410 415
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser
420 425 430
Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile
435 440 445
Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr
450 455 460
Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser
465 470 475 480
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
485 490 495
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
500 505 510
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
515 520 525
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
530 535 540
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His
545 550 555 560
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
565 570 575
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
580 585 590
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser His His
595 600 605
His His His His
610
<210> 35
<211> 612
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半衰期延长的CD3-PDD NCL的全序列
<400> 35
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
Asn Ala Lys Asp Tyr Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His
65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Val Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr
100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Gly Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
275 280 285
Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys
290 295 300
Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu
305 310 315 320
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr
325 330 335
Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val
340 345 350
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Tyr Gly Trp
355 360 365
Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu
370 375 380
Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Leu Gly
385 390 395 400
Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly His Leu Glu Ile Val
405 410 415
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser
420 425 430
Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile
435 440 445
Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr
450 455 460
Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser
465 470 475 480
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
485 490 495
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
500 505 510
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
515 520 525
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
530 535 540
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His
545 550 555 560
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
565 570 575
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
580 585 590
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser His His
595 600 605
His His His His
610
<210> 36
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-PDD NCL的全序列
<400> 36
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
Asn Ala Lys Asp Tyr Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His
65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Val Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr
100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
275 280 285
Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys
290 295 300
Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu
305 310 315 320
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr
325 330 335
Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val
340 345 350
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Tyr Gly Trp
355 360 365
Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu
370 375 380
Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Leu Gly
385 390 395 400
Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly His Leu Glu Ile Val
405 410 415
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser
420 425 430
Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile
435 440 445
Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser His His His His His His
450 455 460
<210> 37
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-PDD NCL的全序列
<400> 37
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
Asn Ala Lys Asp Tyr Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His
65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Val Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr
100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
275 280 285
Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys
290 295 300
Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu
305 310 315 320
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr
325 330 335
Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val
340 345 350
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Tyr Gly Trp
355 360 365
Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu
370 375 380
Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Leu Gly
385 390 395 400
Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly His Leu Glu Ile Val
405 410 415
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser
420 425 430
Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile
435 440 445
Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser His His His His His His
450 455 460
<210> 38
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-PDD NCL的全序列
<400> 38
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
Asn Ala Lys Asp Tyr Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His
65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Val Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr
100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
275 280 285
Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys
290 295 300
Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu
305 310 315 320
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr
325 330 335
Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val
340 345 350
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Tyr Gly Trp
355 360 365
Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu
370 375 380
Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Trp Leu Gly
385 390 395 400
Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val
405 410 415
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser
420 425 430
Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile
435 440 445
Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser His His His His His His
450 455 460
<210> 39
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-PDD NCL的全序列
<400> 39
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
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100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
275 280 285
Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys
290 295 300
Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu
305 310 315 320
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr
325 330 335
Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val
340 345 350
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Tyr Gly Trp
355 360 365
Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu
370 375 380
Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Trp Leu Gly
385 390 395 400
Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val
405 410 415
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser
420 425 430
Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile
435 440 445
Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser His His His His His His
450 455 460
<210> 40
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有可切割接头#1的CD3-PDD CL的全序列
<400> 40
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
Asn Ala Lys Asp Tyr Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His
65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
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100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
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210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Gly Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ser Gly Arg
275 280 285
Ser Asp Asn His Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Leu Gly
290 295 300
Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg
305 310 315 320
Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Lys Gly
325 330 335
Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu Glu Ile Val
340 345 350
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Tyr
355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser His His His His
450 455 460
His His
465
<210> 41
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有可切割接头#2的CD3-PDD CL的全序列
<400> 41
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
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275 280 285
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Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His
325 330 335
Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
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435 440 445
Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser His His His His His His
450 455 460
<210> 42
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有可切割接头#3的CD3-PDD CL的全序列
<400> 42
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
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100 105 110
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115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
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Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
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Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Gly Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Gly Ser Gly Ser Pro Gln Gly Ile Trp Gly Pro Leu Ser
275 280 285
Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu
290 295 300
Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu
305 310 315 320
Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr Pro
325 330 335
Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
340 345 350
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Tyr Gly Trp Thr
355 360 365
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370 375 380
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Leu Gly Trp
385 390 395 400
Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly His Leu Glu Ile Val Glu
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser His His His His His His
450 455 460
<210> 43
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有可切割接头#2的CD3-PDD CL的全序列
<400> 43
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
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Asn Ala Lys Asp Tyr Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His
65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Val Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr
100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Ser Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gln Ala Ser Thr Gly Arg
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln
290 295 300
Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala
305 310 315 320
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His
325 330 335
Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
340 345 350
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu
355 360 365
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405 410 415
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr
420 425 430
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435 440 445
Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser His His His His His His
450 455 460
<210> 44
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有可切割接头#2的CD3-PDD CL的全序列
<400> 44
Met Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Ala Ala Phe His Gly
1 5 10 15
Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala Lys Asp Leu Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Asn Ala Ala Trp Val
35 40 45
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
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65 70 75 80
Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Val Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Glu Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr
100 105 110
Asn Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly
115 120 125
Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
130 135 140
Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala
145 150 155 160
Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly
165 170 175
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr
180 185 190
Ala Ala Gln Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala
195 200 205
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln
260 265 270
Lys Ala Ala Ser Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gln Ala Ser Thr Gly Arg
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln
290 295 300
Ala Ala Arg Ala Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala
305 310 315 320
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His
325 330 335
Leu Ala Ala Tyr His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
340 345 350
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu
355 360 365
His Ile Ala Ala Ala Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu
370 375 380
Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Trp Leu Gly Trp Thr Pro
385 390 395 400
Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
405 410 415
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr
420 425 430
Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val
435 440 445
Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser His His His His His His
450 455 460
<210> 45
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 45
Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Ala
<210> 46
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 46
Lys Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 47
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 47
Lys Asp Trp Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 48
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 48
Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 49
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 49
Lys Asp Val Ala Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 50
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 50
Lys Asp Trp Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 51
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 51
Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 52
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 52
Lys Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Ala
<210> 53
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 53
Lys Asp Ala Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
1 5 10 15
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Ala
<210> 54
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 54
Lys Asp Ala Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 55
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 55
Lys Asp Val Tyr Gly Trp Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Ala Ser Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 56
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 56
Lys Asp Trp Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 57
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 57
Lys Asp Trp Leu Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 58
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 58
Lys Asp Trp Leu Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 59
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 59
Lys Asp Ala Leu Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 60
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 60
Lys Asp Trp Leu Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 61
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 61
Lys Asp Trp Leu Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 62
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 62
Lys Asp Trp Leu Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 63
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 63
Lys Asp Ala Leu Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 64
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 64
Lys Asp Trp Leu Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 65
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSA特异性结合结构域
<400> 65
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 66
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSA特异性结合结构域
<400> 66
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 67
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSA特异性结合结构域
<400> 67
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 68
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<220>
<221> 变体
<222> 1、3、4、6、13、14、15、17、18、19、22、26、27
<223> 其中Xaa表示任何氨基酸（优选地不是半胱氨酸、
甘氨酸或脯氨酸）
<400> 68
Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Xaa Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Leu Val Xaa Val Leu Leu Xaa Xaa Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 69
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<220>
<221> 变体
<222> 1、3、4、6、14、15、27
<223> 其中位置1、3、4、6、14、15中的Xaa表示任何氨基酸
（优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸），并且位置27中的Xaa选自由天冬酰胺、
组氨酸或酪氨酸组成的组
<400> 69
Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 70
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-封端
<400> 70
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 71
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-封端
<400> 71
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Leu Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 72
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-封端
<400> 72
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Leu Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 73
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-封端（随机化）
<220>
<221> 变体
<222> 6,13,14
<223> 其中Xaa表示任何氨基酸
其中Xaa表示任何氨基酸
<400> 73
Gly Ser Asp Leu Gly Xaa Lys Leu Leu Gln Ala Ala Xaa Xaa Gly Gln
1 5 10 15
Leu Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 74
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-封端
<400> 74
Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Asn Gly
1 5 10 15
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
20 25
<210> 75
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-封端
<400> 75
Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Ala Gly
1 5 10 15
His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 76
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-封端
<400> 76
Gln Asp Ser Ser Gly Phe Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu Val Gly
1 5 10 15
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 77
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-封端（随机化）
<220>
<221> 变体
<222> 3,4,6,15
<223> 其中Xaa表示任何氨基酸
<400> 77
Gln Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg Xaa Gly
1 5 10 15
His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 78
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 富含PT的肽接头
<400> 78
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
1 5 10 15
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr
20 25 30
Pro Thr Pro Thr Gly Ser
35
<210> 79
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 富含PT的肽接头
<400> 79
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 富含PT的肽接头
<400> 80
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Gly Ser
1 5 10
<210> 81
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 富含PT的肽接头
<400> 81
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
1 5 10 15
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser
20
<210> 82
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 富含PT的肽接头
<400> 82
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
1 5 10 15
Pro Thr Pro Thr Pro Thr
20
<210> 83
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有GS接头
<220>
<221> 变体
<222> 1..5
<223> [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n，其中n为1、2、3、4、5或6
<400> 83
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5

Claims (91)

1.一种重组蛋白，所述重组蛋白包含(i)结合部分和(ii)药物分子；
其中所述结合部分可逆地结合至所述药物分子；
其中所述结合部分当结合时抑制所述药物分子的生物活性；其中所述结合部分和所述药物分子通过肽接头连接；并且其中所述肽接头包含蛋白酶切割位点。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其中所述结合部分包含抗体、替代性支架或多肽。
3.根据权利要求1或2所述的重组蛋白，其中所述结合部分包含免疫球蛋白分子或其片段。
4.根据权利要求1或2所述的重组蛋白，其中所述结合部分包含非免疫球蛋白分子。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组蛋白，其中所述结合部分包含衍生自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单结构域抗体、重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)或可变结构域(VHH)的抗原结合结构域。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的重组蛋白，其中所述结合部分包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域衍生自以下项或与以下项相关：阿德耐汀、单抗体、亲和体、阿菲林、阿菲默、适体、阿非汀、α抗体、抗运载蛋白、重复蛋白结构域、犰狳重复结构域、阿去默、阿维默、锚蛋白重复结构域、非诺莫、打结素、库尼兹结构域或T细胞受体(TCR)。
7.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述药物分子的所述生物活性是所述药物分子与生物靶标的结合。
8.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述药物分子的所述生物活性是酶活性。
9.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中当将所述重组蛋白施用于哺乳动物时，所述肽接头在所述蛋白酶切割位点处的切割允许所述药物分子从所述结合部分释放。
10.根据权利要求9所述的重组蛋白，其中所述哺乳动物是人。
11.根据权利要求9和10中任一项所述的重组蛋白，其中所述肽接头的所述切割发生在肿瘤组织中。
12.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶切割位点是被肿瘤组织中存在的蛋白酶识别的位点。
13.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述结合部分以小于约1μM，诸如小于约1μM、小于约500nM、小于约250nM、小于约100nM或小于约50nM的解离常数(KD)结合所述药物分子。
14.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述结合部分以约1μM与约10pM之间，诸如约1μM与约10pM之间、约1μM与约20pM之间、约1μM与约50pM之间或约1μM与约100pM之间的离解常数(KD)结合所述药物分子。
15.根据权利要求13或14所述的重组蛋白，其中所述解离常数(KD)是在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中测量的。
16.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述结合部分包含经设计的锚蛋白重复结构域。
17.根据权利要求16所述的重组蛋白，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:45至64，以及(2)其中SEQ ID NO:45至64中的任一者中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
18.根据权利要求16和17中任一项所述的重组蛋白，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQID NO:1至12，以及(2)与SEQ ID NO:1至12中的任一者具有至少85％氨基酸序列同一性的序列。
19.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含抗体、替代性支架或多肽。
20.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含免疫球蛋白分子或其片段。
21.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含非免疫球蛋白分子。
22.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含衍生自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单结构域抗体、重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)或可变结构域(VHH)的抗原结合结构域。
23.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域衍生自以下项或与以下项相关：阿德耐汀、单抗体、亲和体、阿菲林、阿菲默、适体、阿非汀、α抗体、抗运载蛋白、重复蛋白结构域、犰狳重复结构域、阿去默、阿维默、锚蛋白重复结构域、非诺莫、打结素、库尼兹结构域或T细胞受体(TCR)。
24.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述药物分子对CD3具有结合特异性。
25.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含至少一个对肿瘤相关抗原(TAA)具有结合特异性的结合结构域。
26.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含经设计的锚蛋白重复结构域。
27.根据权利要求26所述的重组蛋白，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域对CD3具有结合特异性。
28.根据权利要求26和27中任一项所述的重组蛋白，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQID NO:13至17，以及(2)与SEQ ID NO:13至17中的任一者具有至少85％氨基酸序列同一性的序列。
29.根据权利要求27和28中任一项所述的重组蛋白，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域以小于约100nM的解离常数(KD)结合至CD3。
30.根据权利要求1至25中任一项所述的重组蛋白，其中所述药物分子包含抗体。
31.根据权利要求30所述的重组蛋白，其中所述抗体对CD3具有结合特异性。
32.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述药物分子是T细胞接合剂药物分子(TCE)。
33.根据权利要求32所述的重组蛋白，其中所述TCE包含结合至CD3的结合结构域并且还包含结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域。
34.根据权利要求32和33中任一项所述的重组蛋白，其中所述结合部分与所述TCE药物分子的结合抑制所述TCE药物分子与T细胞的结合和/或T细胞的活化。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的重组蛋白，其中所述TCE是双特异性或多特异性抗体。
36.根据权利要求32至34中任一项所述的重组蛋白，其中所述TCE是双特异性或多特异性锚蛋白重复蛋白。
37.根据权利要求33至36中任一项所述的重组蛋白，其中所述结合至CD3的结合结构域位于所述结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域的C-末端侧。
38.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述结合部分是所述药物分子的抗独特型结合物。
39.根据权利要求书38所述的重组蛋白，其中所述结合部分是对CD3具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域的抗独特型结合物。
40.根据权利要求书38所述的重组蛋白，其中所述结合部分是对CD3具有结合特异性的所述抗体的抗独特型结合物。
41.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，其中所述结合部分、所述药物分子和所述肽接头从N-末端至C-末端按以下格式排列：药物分子–肽接头–结合部分。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的重组蛋白，其中所述结合部分、所述结合至CD3的结合结构域、所述结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域和所述肽接头从N-末端至C-末端按以下格式排列：结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域–结合至CD3的结合结构域–肽接头–结合部分。
43.根据任一前述权利要求所述的重组蛋白，所述重组蛋白还包含延长所述重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂。
44.根据权利要求43所述的重组蛋白，其中所述延长所述重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂具有对血清白蛋白的结合特异性。
45.根据权利要求44所述的重组蛋白，其中所述延长所述重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂包含对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。
46.根据权利要求45所述的重组蛋白，其中所述对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:65至67，以及(2)与SEQ ID NO:65至67中的任一者具有至少85％氨基酸序列同一性的序列。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的重组蛋白，其中所述延长所述重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂与所述结合部分位于所述肽接头的同一侧。
48.根据权利要求47所述的重组蛋白，其中所述结合部分和所述延长所述重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂均位于所述肽接头的C-末端侧。
49.根据权利要求43至47中任一项所述的重组蛋白，其中所述延长所述重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂位于所述结合部分的C-末端侧。
50.根据权利要求43至49中任一项所述的重组蛋白，其中所述结合部分、所述结合至CD3的结合结构域、所述结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域、所述肽接头和所述延长所述重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂从N-末端至C-末端按以下格式排列：结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域–结合至CD3的结合结构域–肽接头–结合部分–延长所述重组蛋白在哺乳动物中的血清半衰期的药剂。
51.一种核酸，所述核酸编码根据前述权利要求中任一项所述的重组蛋白。
52.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求51所述的核酸分子。
53.一种制备根据权利要求1至50中任一项所述的重组蛋白的方法，所述方法包括在其中表达所述重组蛋白的条件下培养根据权利要求52所述的宿主细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述宿主细胞是原核宿主细胞。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
56.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至50中任一项所述的重组蛋白或根据权利要求51所述的核酸，并且另外包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
57.根据权利要求1至50中任一项所述的重组蛋白、根据权利要求51所述的核酸或根据权利要求56所述的药物组合物，所述重组蛋白、所述核酸或所述药物组合物在疗法中使用。
58.根据权利要求57所述使用的重组蛋白、核酸或药物组合物，所述使用的重组蛋白、核酸或药物组合物在治疗增殖性疾病中使用，任选地其中所述增殖性疾病是癌症。
59.一种治疗方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求1至50中任一项所述的重组蛋白、根据权利要求51所述的核酸或根据权利要求56所述的药物组合物的步骤。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述方法是治疗增殖性疾病的方法，任选地其中所述增殖性疾病是癌症。
61.一种在有需要的受试者中活化T细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至50中任一项所述的重组蛋白、根据权利要求51所述的核酸或根据权利要求56所述的药物组合物的步骤。
62.一种控制体内活性药物分子释放的方法，所述方法包括将根据权利要求1至50中任一项所述的重组蛋白、根据权利要求51所述的核酸或根据权利要求56所述的药物组合物施用于有需要的受试者。
63.根据权利要求59至62中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
64.一种控制药物分子的生物活性的方法，所述方法包括将根据权利要求1至6、13至18和38至40中任一项所述的结合部分与根据权利要求19至37中任一项所述的药物分子用包含蛋白酶切割位点的肽接头连接起来，以形成重组蛋白，并将所述重组蛋白施用于有需要的患者，其中所述蛋白酶切割位点被肿瘤组织中存在的蛋白酶识别。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述药物分子的所述生物活性是所述药物分子与生物靶标的结合。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述药物分子的所述生物活性是酶活性。
67.一种对药物分子具有结合特异性的结合部分，其中当通过肽接头与所述药物分子连接时，所述结合部分抑制所述药物分子的生物活性。
68.根据权利要求67所述的结合部分，其中所述结合部分与所述药物分子的结合形成可逆地抑制所述药物分子的生物活性的复合物。
69.根据权利要求67或68中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分是所述药物分子的抗独特型结合物。
70.根据权利要求67或69中任一项所述的结合部分，其中所述药物分子的所述生物活性是所述药物分子与生物靶标的结合。
71.根据权利要求67至69中任一项所述的结合部分，其中所述药物分子的所述生物活性是酶活性。
72.根据权利要求67至71中任一项所述的结合部分，所述结合部分对所述药物分子具有小于约1μM，诸如小于约1μM、小于约500nM、小于约250nM、小于约100nM或小于约50nM的结合亲和力(KD)。
73.根据权利要求67至72中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分以约1μM与约10pM之间，诸如约1μM与约10pM之间、约1μM与约20pM之间、约1μM与约50pM之间或约1μM与约100pM之间的离解常数(KD)结合所述药物分子。
74.根据权利要求72或73所述的结合部分，其中所述解离常数(KD)是在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中测量的。
75.根据权利要求67至74中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含抗体、替代性支架或多肽。
76.根据权利要求67至75中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含免疫球蛋白分子或其片段。
77.根据权利要求67至76中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含非免疫球蛋白分子。
78.根据权利要求67至77中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含衍生自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单结构域抗体、重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)或可变结构域(VHH)的抗原结合结构域。
79.根据权利要求67至78中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域衍生自以下项或与以下项相关：阿德耐汀、单抗体、亲和体、阿菲林、阿菲默、适体、阿非汀、α抗体、抗运载蛋白、重复蛋白结构域、犰狳重复结构域、阿去默、阿维默、锚蛋白重复结构域、非诺莫、打结素、库尼兹结构域或T细胞受体(TCR)。
80.根据权利要求67至79中任一项所述的结合部分，其中所述结合部分包含经设计的锚蛋白重复结构域。
81.根据权利要求80所述的结合部分，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:45至64，以及(2)其中SEQ ID NO:45至64中的任一者中的至多9个氨基酸被其他氨基酸取代的序列。
82.根据权利要求80或81中任一项所述的结合部分，其中所述经设计的锚蛋白重复结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(1)SEQID NO:1至12，以及(2)与SEQ ID NO:1至12中的任一者具有至少85％氨基酸序列同一性的序列。
83.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求67至82中任一项所述的结合部分。
84.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求80至82中任一项所述的经设计的锚蛋白重复结构域。
85.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求83或84所述的核酸分子。
86.一种制备根据权利要求67至82中任一项所述的结合部分的方法，所述方法包括在其中表达所述结合部分的条件下培养根据权利要求85所述的宿主细胞。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述宿主细胞是原核宿主细胞。
88.根据权利要求86所述的方法，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
89.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求67至82中任一项所述的结合部分或根据权利要求83和84中任一项所述的核酸，并且另外包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
90.根据权利要求67至82中任一项所述的结合部分、根据权利要求83和84中任一项所述的核酸或根据权利要求89所述的药物组合物，所述结合部分、所述核酸或所述药物组合物在疗法中使用。
91.一种治疗方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求67至82中任一项所述的结合部分、根据权利要求83和84中任一项所述的核酸或根据权利要求89所述的药物组合物的步骤。
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