KR20160007604A - 이중특이성 작제물 및 다양한 질병의 치료에서의 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역 주효 세포 및 동시에 IL23R-운반 타겟 세포에 특이적으로 결합하는 이중특이성 작제물, 및 이의 핵산, 벡터, 숙주 세포, 약학 조성물, 및 이중작제성 제조 그러한 이중특이성 작제물을 염증성 및/또는 자가면역 질환 및/또는 암을 치료하는 데 사용하는 것을 포함하는 사용 방법에 관한 것이다.

Description

이중특이성 작제물 및 다양한 질병의 치료에서의 이의 용도{BISPECIFIC CONSTRUCTS AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF VARIOUS DISEASES}
본 발명은 면역 주효 세포 및 동시에 IL23R-운반 타겟 세포에 특이적으로 결합하는 이중특이성 작제물, 및 이의 핵산, 벡터, 숙주 세포, 약학 조성물, 및 이중작제성 제조 그러한 이중특이성 작제물을 염증성 및/또는 자가면역 질환 및/또는 암을 치료하는 데 사용하는 것을 포함하는 사용 방법에 관한 것이다.
인터루킨 (IL)-23는 대략적인 분자량에 따라 p40 및 p19으로 명명된 두 개 단백질 서브유닛으로 구성된 이종이량체성 사이토카인이다. p40 단백질은 IL-12 및 IL-23 간에 공유되는 반면, p19 단백질 서브유닛은 IL-23에 독점적이다. IL-23는 p40에 결합하는 IL-12 수용체 베타-1 (IL-12Rβ1) 사슬, 및 IL-23-특이성 분자내 신호전달을 부여하는 유일한 IL-23 수용체 사슬 (IL23R)로 구성되는 이 사슬 수용체 복합체를 통해 신호를 보낸다.
IL-23은 순전한 CD4+ T 세포의 병원성 IL-17-생성 헬퍼 T (Th17 또는 ThIL -17) 세포로의 분화를 유도한다. 이러한 구별된 헬퍼 T 세포 소집단에 의해 분비되는 IL-17는 염증 작용 동안 주요한 효능체 사이토카인이다. IL-17의 증가된 수준이 류마티스 관절염, 염증성 장질환 (예, 크론병 및 궤양성 대장염), 및 건선을 위시한 다양한 자가면역질환 및 염증성 조건의 타겟 조직에서 발견되었다. 따라서, IL-23은 염증성 조건 및 자가면역-매개 질환에서 결정적인 인자로서 작용하였다.
지금까지 IL-23/IL-17 신호를 타겟하는 몇 가지 방법이 시험되었는데, 이는 염증성 및 자가면역 질환을 치료하는 잠재적 요법 방식으로서, IL-23 또는 상기 IL-23 수용체에 대하여 지향된 항원을 포함한다. 잠재적인 약학적 처리에 대한 타겟으로서 IL-23의 용도에 관하여는, IL-23의 p40 서브유닛에 지향된 다양한 중화 항체가 자가 면역 주도 질환을 치료에 잠재적으로 사용하도록 개발되었다. 예를 들어, "유스테키누맙" (얀센-시락)으로 알려진 단일클론성 항체는 IL-12 및 IL-23의 공통의 p40 서브유닛을 타겟하는 항체이다. 이것은 건선 및 건선성 관절염의 치료에 효과적인 것으로 나타난다. IL-23의 더 작은 p19 서브유닛을 타겟하는 다른 단일클론성 항체는 EP 2 548 577에 설명되어 있다.
IL-23 수용체-타겟 항체들에 의해 IL-23 수용체 기능을 차단하도록 의도하는 전략에 대하여, WO 2004/042009는 IL-17의 증가된 발현과 연관된 염증성 질환의 치료에 단일클론성 항-IL-23 수용체 항체 또는 이의 단편물 (Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2)을 사용하는 것을 개시하고 있다. 또한, WO 2008/106134에는 염증성 및 자가면역 질환의 치료에 적합한, 인간 IL-23 수용체의 IL23R 사슬을 인식하는 인간화된 항체들을 생성하는 것이 개시되어 있다. 이러한 항-IL23R 항체들은, 특히, 그 표면상에서 IL23R을 발현하는 세포들을 선택적으로 타겟하고 죽이는 면역요법에 사용될 수 있는 세포독성 탑재물과 접합된 항체들을 포함한다.
다양한 암 질병들의 항체-기반 치료에 대한 확실한 접근 방법은 이중특이성 항체를 사용하여, 타겟 세포를 특이적으로 용해하도록 면역 주효 세포를 재지향하는 것이다. 상기 이중특이성 항체들은 타겟 세포의 표면 상의 특정 항체를 인식하고 및, 동시에 자연 살해 (NK) 세포 또는 세포독성 T (Tc) 세포와 같은 면역 주효 세포의 활성화 표면 분자를 인식하여, 타겟 세포들을 죽인다.
* 상기 이중특이성 항체 개념은, 암세포상의 암 항체 및, 동시에, 예를 들어, 세포독성적 T 세포상에 제시된 CD3의 입실론 사슬에 결합하는 이중특이성 항체들이 사용되는 암요법에 사용된다. 그러한 이중특이성 항체 작제물의 잘 알려진 예는 비호지킨 임파종 및 급성 임파구성 백혈병의 치료용의 "블리나투모맙"으로, 이는, BiTE (bi-specific T cell engager) 형식의 항체이다. 블리나투모맙은 마이크로멧 (Micromet)에 의해 개발되었고 및 암 항원 CD19은 물론 세포독성적 T 세포의 표면상에 있는 CD3에 동시적으로 결합하여, 이러한 두 개 세포 유형을 서로 연결시키고 및 상기 세포독성적 T 세포를 활성화시켜 상기 타겟 암 세포를 분해하게 한다.
염증성 및/또는 자가면역 질환을 치료하는 데 현재까지 가장 성공적인 항체-기반 방식은 사이토카인들과 이들의 각자 수용체들의 상호작용을 방해하는 작용 기작을 개발하여 사이토카인 수용체들을 통한 신호전달을 방해하는 것이다. 그 예는, TNFα의 저해 (예, 인틀리시맙 및 아달리무맙), p40의 저해 (예, 유스테키누맙) 또는 IL6R의 저해 (예, 투실리주맙). 하지만, 이러한 항체들은 종종 여분의 경로를 통해 신호전달을 여전히 허용한다. 결론적으로, 상당수의 환자들이 효과적으로 치료받지 못한다. 예를 들어, 환자의 40%까지 TNFα 저해 항체들로 치료하는 데 감응되지 않는다.
따라서, 염증성 및/또는 자가면역 질환 및 암과 같은 다양한 질병을 치료하는 데 새롭고 향상된 치료 전략이 여전히 필요하다. 특히, 그러한 치료에 사용되기 위해 이중특이성 분자들은 안정하고, 생산하기 쉽고, 특정 타겟 항원에 매우 특이적이고 및 낮은 면역원성을 가질 것이 요구된다.
본 발명은 면역 주효 세포, 예 세포독성적 주효 T (Tc) 세포에 및, 동시적으로, IL-23 수용체 발현 타겟 세포, 예 병원성 IL-17-생성 헬퍼 T 세포 (Th17 세포)에 특이적으로 결합하여, IL-23 수용체 발현 타겟 세포를 죽이는 이중특이성 작제물을 제공함으로써 상기 제시된 필요를 충족시킨다.
일 관점에서, 본 발명은 IL23R-발현 종양 세포을 위시한 암의 치료에 사용하는, 적어도 하나의 제1 결합 분체 및 적어도 하나의 제2 결합 분체를 포함하는 이중특이성 작제물을 제공하는 것으로서, 상기 제1 결합 분체는 세포독성적 주효 T (Tc) 세포 상에 존재하는 제1 항원에 결합하고, 및 상기 제2 결합 분체는 IL-23 수용체 특이적 서브유닛 (IL23R)에 특이적으로 결합한다.
제2 관점에서, 본 발명은 적어도 하나의 제1 결합 분체 및 적어도 하나의 제2 결합 분체를 포함하는 이중특이성 작제물로서, 상기 제1 결합 분체는 세포독성적 주효 T (Tc) 세포 상에 존재하는 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 및 상기 제2 결합 분체는 타겟 세포의 표면에 존재하는 IL-23 수용체 특이성 서브유닛 (IL23R)에 특이적으로 결합하는 이중특이성 작제물을 제공한다.
본 발명은 또한, 다른 관점에서, 본 발명의 이중특이성 작제물을 암호화하는 핵산 또는 핵산들은 물론, 상기 핵산이나 핵산들을 포함하는 벡터나 벡터들, 및 상기 벡터나 벡터들을 포함하는 숙주 세포나 숙주 세포들을 제공한다.
본 발명의 다른 관점은 본 발명의 이중특이성 작제물을 제조하는 방법으로서, (i) 본 발명에 따른 핵산 또는 핵산들, 또는 본 발명에 따른 벡터나 벡터들을 제공하고, 상기 핵산 또는 핵산들 또는 상기 벡터나 벡터들을 발현시키고, 및 상기 이중특이성 작제물을 발현 시스템으로부터 수집하는 것, 또는 (ii) 본 발명의 숙주 세포나 숙주 세포들을 제공하고, 상기 숙주 세포나 숙주 세포들을 배양하고, 및 상기 이중특이성 작제물을 상기 세포 배양물로부터 수집하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 관점은 본 발명의 이중특이성 작제물 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 염증성 및/또는 자가면역 질환의 치료에, 또는 본 발명의 이중특이성 작제물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 염증성 및/또는 자가면역 질환을 치료하는 방법에 사용하는 본 발명의 이중특이성 작제물의 용도에 관한 것이다. 염증성 및/또는 자가면역 질환들의 예는 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선성 관절염, 궤양성 대장염, 크론병, 전신 홍반성 루프스, 연소자형 당뇨병, 자가면역 포도막염, 다발성 경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 허혈-재관류 손상을 포함한다.
본 발명의 특정 구체예는 첨부된 독립 청구항에 설정되어 있다.
본 발명은 면역 주효 세포, 예 세포독성적 주효 T (Tc) 세포에 및, 동시적으로, IL-23 수용체 발현 타겟 세포, 예 병원성 IL-17-생성 헬퍼 T 세포 (Th17 세포)에 특이적으로 결합하여, IL-23 수용체 발현 타겟 세포를 죽이는 이중특이성 작제물을 제공함으로써 상기 제시된 필요를 충족시킨다.
도 1: A: IL23 신호전달 및 Th1 항종양 반응; B: 이중특이성 항-IL23RxCD3ε 항체 상호작용의 제안된 기작.
도 2: 결장 암 세포주들 상에서의 IL23R의 발현. IL23R 발현은 일차 염소 다중클론성 항-IL23R 항체 및 PE-표지 항-염소 항체에 의해 검출되었다. 실선, IL23R 발현; 대쉬선, 이소타입 대조군. X-축, PE 강도; Y-축, 세포수.
도 3: 폐 선암 세포주 상에서의 IL23R 발현. IL23R 발현은 일차 염소 다중클론성 항-IL23R 항체 및 PE-표지 항-염소 항체에 의해 검출되었다. 실선, IL23R 발현; 대쉬선, 이소타입 대조군. X-축, PE 강도; Y-축, 세포수.
도 4: 임파종/백혈병 세포주 상의 IL23R 발현. IL23R 발현은 일차 염소 다중클론성 항-IL23R 항체 및 PE-표지 항-염소 항체에 의해 검출되었다. 실선, IL23R 발현; 대쉬선, 이소타입 대조군. X-축, PE 강도; Y-축, 세포수.
도 5: COBALT의 Neighbor Joining 알고리즘을 사용하여 유일한 CDR 집합들을 배열함으로써 생성된 계통수.
도 6: 차등 스캐닝 형광분석법 (differential scanning fluorimetry)에 의한 PRO165의 열적 언폴딩. 온도로 유도된 단백질 언폴딩의 이중 측정으로 형광 신호를 표준화하였다.
도 7: PRO165에 의해 유도된 DLD-1 결장 암종 세포의 T 세포 주도에 의한 용해. 초기 세포사멸성(apoptotic) 및 괴사성 DLD-1 세포들의 정량.
제1관점에서, 본 발명은 IL23R-발현 종양 세포를 포함하는 암의 치료에 사용하는, 적어도 하나의 제1 결합 분체 및 적어도 하나의 제2 결합 분체를 포함하는 이중특이성 작제물을 제공하는 것으로서, 상기 제1 결합 분체는 세포독성적 주효 T (Tc) 세포 상에 존재하는 제1 항원에 특이적으로 결합하며, 및 상기 제2 결합 분체는 IL-23 수용체 특이성 서브유닛 (IL23R)에 특이적으로 결합하는 작제물을 제공한다.
본 발명의 의미 내에서, 용어 "작제물"은 바람직한 결합 활성을 나타내는 한 임의의 화학적 실체를 지칭한다. 따라서, 용어 "작제물"은 가장 넓은 의미로 사용되고 및 하나 이상의 항체-기반 도메인 또는 이의 결합 단편물을 포함하는 재조합 항체들 및 이의 단편물을 위시한 단백질-기반 분자를 특히 망라한다. 특정 예는, 단일클론성 키메릭 항체들, 인간화된 항체들, 단일쇄 다이어바디들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 용어 "포함한다"는 본 발명에서 사용하는 바와 같이, 예를 들어 "포함한다" 및 "구성된다" 둘 다를 포함한다.
용어 "이중특이성"은, 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 두 개 상이한 항원 특이성 가지며, 및 조건적으로 Fc 수용체 또는 검출 및/또는 정제용 태그에 결합하는 분체와 같은, 각자의 결합 파트너에 결합하는 다른 결합 분체를 가지는, 작제물을 지칭하는 것으로 의도된다. 이는 이중특이성 작제물이 A와 B는 동일하지 않는, 적어도 하나의 항원 "A" 및 적어도 하나의 항원 "B"에 동시적으로 결합할 수 있는 것을 의미한다. 따라서, 두 개 상이한 항원 특이성을 가지면서, 본 발명의 이중특이성 작제물은 각자 타겟된 항원에 대한 것인, 오직 두 개 결합 분체만을 필수적으로 가질 필요는 없고, 두 개 이상의 결합 분체를 포함할 수 있다. 더욱이, 용어 "항원"은 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 넓은 의미에서 해석되어야 하며 본 발명의 이중특이성 작제물의 결합 분체에 의해 결합된 임의의 타겟 분체를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적" 또는 "특이적으로"는 상기 제1 및 제2 결합 분체들이 각자의 타겟 분자들 사이 (예 제1 및 제2 항원 사이) 및/또는 하나 이상의 참조 분자(들)을 구별할 수 있다는 것을 의미하도록 의도된다. 따라서, 가장 넓은 의미에서, "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 Tc 세포의 표면 상에 있는 제1 항원 및 타겟 세포의 표면 상에 있는 IL23R 제2 항원 사이 및/또는 상기 제1 항원 및/또는 제2 항원 (예, IL23R)에 관계되거나 관계되지 않는 다른 타겟 분자 사이를 구별할 수 있는 제1 및 제2 결합 분체의 능력을 지칭한다.
특이적 결합 분체의 결합 특이성은, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 예를 들어, 표면 플라즈마 공명 (SPR), 웨스턴 블랏, 효소 연계 면역흡수 분석법 (ELISA), 방사선면역분석법 (RIA 또는 IRMA), 향상된 화학발광법 (ECL), 및 펩타이드 스캔 분석법을 사용하여 결정될 수 있다.
ELISA 분석법이 사용되는 경우, 표준 색깔 발현 반응의 수단에 의해, 예를 들어 by using 고추냉이 페록시다제 (HRP)-접합 제2 항체들이 함유된 HRP, H202, 테트라메틸 벤지딘 시스템을 사용하여 점수화를 수행할 수 있다. 특정 파장에서 반응 용기 (예. 웰)내의 색깔 발현의 광학 밀도는 결합 특이성을 측정하는 수단이다. 전형적인 배경 신호 (음성 반응)은 약 0.1 OD일 수 있고, 반면 양성 반응에 대한 전형적인 신호는 약 1.0 OD 이상일 수 있고, 이는 10:1 이상의 신호 대 잡음 비를 결과한다. 전형적으로, 결합 특이성의 결정은, 단일 참조 생체 분자만을 사용하기 보다는, 분유, BSA, 트란스페린 등과 같이 약 셋 내지 다섯 개 비관련 생체분자들의 집단을 사용하여 수행된다.
특히, 본 발명은 IL23R-발현 종양 세포들을 포함하는 암의 치료 방법에 관한 것으로서, 대상체, 특히 인간 환자에게 본 발명의 이중특이성 작제물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
용어 "유효량"은 하기 단락에 설정된 바와 같이 정의된다. 전형적으로, 본 발명의 이중특이성 작제물의 유효량이 전술한 약학 조성물의 형태로 투여된다. 적절한 투여 경로는, 국소 및 비경구 투여, 특히, 피하 및 정맥내 주사를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 투여 방식은 특별히 제한되지 않고, 및 예를 들어, 일 주간, 이 주간 또는 사 주간에 걸쳐 연속 주입하는 것을 포함한다.
치료될 암은, 대장암, 폐암, 비인두암, 경구암, 식도암, 췌장암, 및 성인 T-세포 임파종 백혈병 (ATLL), 급성 골수 임파종 (AML), 미만형 B-세포 임파종 (DLBCL), 여포형 임파종 (FL), 소아 급성 림프구성 임파종 (B-ALL), 혈관면역모세포성 T-세포 임파종 (AITL), 미분화 대-세포 임파종 (ALCL), T-/자연 살해-세포 임파종, 및 말초 T-세포 임파종 (PTCL)을 위시한, B-세포 임파종, 및 T-세포 임파종을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예에서, 상기 암은 대장암, 폐암, 유방암, 비인두암, 경구암, 식도암, B-세포 임파종, 및 성인 T-세포 임파종 백혈병 (ATLL), 혈관면역모세포성 T-세포 임파종 (AITL), 미분화 대-세포 임파종 (ALCL), T-/자연 살해-세포 임파종, 및 말초 T-세포 임파종 (PTCL)과 같은 T-세포 임파종으로부터 선택된다.
인터루킨 (IL)-23 및 IL-12 사이의 균형은 항-종양 면역 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. IL-23 및 IL-12는 이들 도메인 중 하나(p40)를 공유하는 이종이량체성 사이토카인이다. IL-12 - 두 개 서브유닛 p35 및 p40으로 구성되는 -가 항종양 효과를 가지는 것으로 밝혀진 반면, p40 및 p19으로 구성되는 IL-23는 종양 세포 상에서의 직접적인 효과 및 종양 지지성 염증성 미세환경을 창출하는 간접적 기작에 의해 특정 종양의 성장을 조장하는 것으로 보인다. IL-12은 IFN-γ 생성 Th1 세포들의 발달을 이끌며, 상기 세포들은 항종양 면역성에 결정적이다 (Dunn, G.P. 등 2006. Nat. rev. lmmunol:6;836-848; Colombo, M.P. and Trinchieri, G.2002. Cytokine Growth Factor Rev;13:155-168). IL-12 및 IFN-γ는 Th1 세포의 활성을 길항하는 종양 내 T 조절성 세포 (Tregs)의 확장은 물론 종양 미세 환경내에서의 혈관생성을 저해할 수 있고, 따라서 종양 조절을 향상시킨다 (Cao, X 등2009. Cancer Res;69:8700-8709).
종양 미세환경 내 IL-23의 역효과와 부합하게, IL-23은 T 세포내에서 IL-12-의존성 IFN-γ 분비를 억제한다 (Sieve, A.N. 등 201O. Eur. J. lmmunol;40;2236-2247). 장에서, 세균 생성물, 세포성 스트레스 및 세포 사멸에 반응하여 수지상 세포 (DCs)에 의해 생성된 IL-23는 항종양 Th1 반응 대신에 Th17 세포의 형성을 주도할 수 있다. 이러한 Th17 세포들은 그 다음 또한 IL-23을 생성하고, 이는 종양으로 침투할 수 있고 (Ngiow, S.F.2013.Trend in lmmunology;34:548-555) 및 NK 세포들의 항종양 및 항전이성 능력에 영향을 주는 (Teng, M.W. 등 2010PNAS;107:8328-8333) 세포독성적 T 세포들의 능력을 잠재적으로 방해함으로써 그 세포들에 의해 매개되는 면역 감시 활성을 방해할 수 있다. IL-23 신호전달이 효과를 가진다는 견해와 일치하여, 특정 종양에서 종양 형성 및/또는 성장을 지지함으로써 오직 IL-12 신호전달만이 결핍된 마우스는 증가된 종양 성장을 보이는 반면 IL-12 및 IL-23 신호전달 둘 다가 결핍된 마우스는 종양 발달의 어떠한 증가된 위험도 나타내지 않는다는 것을 발견하였다 (Street, S.E. 등2002. J. Exp. Med; 196: 129-134; Airoldi, I, 등 2005.Blood;106:3846-3853). 더구나, IL-23 신호전달이 특이적으로 결핍된 - 하지만 IL-12 신호전달에서는 결핍되지 않은 - 마우스는 종양 형성에 거의 완벽하게 저항한다고 밝혀졌고 및 종양 성장의 감소를 나타냈다 (Langowski, J.L. 등 2008. Nature;442:461-465; Teng, M.W. 등 201 OPNAS; 107:8328-8333). 최근 연구에서, T-세포를 자극하는 항-CD40 항체를 Th17 반응을 약화시키는 항-IL-23 항체와 같이 공동 투여하는 것은, 가능하게는 Th17로부터 Th1로 균형을 이동시킴으로써, 항체 단독에 비해 더 나은 효능을 나타냈다 (von Scheldt, B. 등 2014. Cancer Res;DOI:10.1158/0008-5472. CAN-13-1646). 인간 상황에서, 독립적인 임상 연구에 따르면, IL-23의 혈청 농도는, 건강한 개인에 비해, 암환자에서 증가된 것이 보고되었다 (Li, J. 등 2012. PLoS ONE;7:e46264; Gangemi, S. 등2012. J. 세포. Biochem; 113:2122-2125; Ljujic, B. 등2010. Arch. Med. Res; 41 :182-189; He, S. 등 2011. Int. J. Mol. Sci; 12:7424-7437; Fukuda, M, 등2010. Int. J. Oncol; 36:1355-1365). 예를 들어, 췌장암에서, 증가된 IL-23 수준은 질병 단계와 연관되고 및 유방암에서는 좋지 않은 예후와 연관된다 (He, S. 등 2011. Int. J. Mol. Sci; 12:7424-7437). 일차성 간세포암종(HCC)에서, 암 미세 환경 내의 더 높은 IL-23 수준은 열악한 예후와 연계되었다. 또한 대장암에서, 혈액 IL-23 수준은 건강한 제공자에 비하여 환자한테서 증가되었다 (Stanilov, N.S.2009. Labmedicine; 41 :159-163). 또한, 대장안 조직 샘플에서 Th17 유전자 발현 양상은 물론 Th17 세포 침투는 Th1 유전자 발현 또는 Th1 세포 침투와는 대조적으로, 급격히 더 나빠진 예후와 연관되었다 (Tosolini et al, Cancer Res 2011 ;71 :1263-1271). 집단적으로, 이러한 데이터들은 IL-23가 친종양 염증화를 이끎으로써 항종양 주효 세포들을 억제하여 종양화를 촉진한다는 것을 나타낸다.
인간 IL23R은 활성화된 기억 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 및 선천적 임파구성 세포 (ILCs)에 주로 발견되고, 및 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포 (DCs)에서 더 낮은 수준으로 발견된다. 최근, 종양 세포에 대한 인터루킨 IL-23의 직접적인 효과가 설명 되었는데, IL23R이 특정 종양에서 또한 발현되는 것으로 제시되었다. 예를 들어 IL-23은 인간 구강 편평 세포 암종 (SSC) 세포주 (Fukuda, M 등2010. Int. J. Oncol;36: 1355-1365; Fukuda, M 등2010. Mol. Med. Rep,;3:89-93) 및 비소세포 폐암 (NSCLC) 세포주 (Baird, A.M. 등2013. 폐암;79:83-90)에서 친증식효과를 가지는 것으로 밝혀졌다. 전체 게놈과 연계한 연구를 사용하여, IL23R의 두 개 서열 변이체들은 몇가지 고형암의 위험과 연계되었고 및 동일한 다형성들은 개인들이 급성 골수 백혈병 (AML)에 걸릴 위험을 증가시키게 하는 소지가 있다는 것이 발견되었다 (Xu, Y, 등2013.J Gastroenterol;48: 125-131 ; Chu, H. 등2012.lnt. J. 암; 130:1093-1097; Chen, J. 등2010. mol. Carcinog;49:862-868; Qian, X. 등2013. PLoS ONE;8:e55473). IL23R 발현은 또한 소세포 폐암 (SCLC)의 일차 종양 세포에서, 폐 선암에서 (Li, J. 등2013. Carcinog;34:658-666), 여포형 임파종 (FL) 및 미만형 B 세포 임파종 (DLBCL)에서 (Cocco 등백혈병.2012:26: 1365-1374), 소아 B-ALL에서 (Cocco 등Blood.2010; 116:3887-3898)는 물론 대장암종 (CRC)에서 (Lan 등, Int J Colorectal Dis 2011 ;26:1511-1518; Suzuki 등, Oncology Letters 2012;4:199-204) 향상된 것이 발견되었다. CRC에서, 발현 수준과 병의 심각도/전이도 간의 상관관계가 발견되었다 (Carlsson 등 Br J Cancer 2012;106:517-524).
통합하면, IL-23은 한편으로는 종양 형성, 성장 및 전이에 유리하고 다른 한편으로 Th1 항종양 반응을 약화시킴으로써 종양 면역에서 탈출하도록 지지하는 염증성 미세환경을 창출하는 것으로 보인다 (참조 도 1A). 항-CD40 및 항-IL-23 항체들을 공동 투여하는 것을 이용한 예비임상 연구는 이러한 "밀고" (항-CD40 주도된 T 세포들의 활성화) 및 "당김" (항-IL-23 주도된 Th17 세포들의 약화)가 특정 종양 모델에서 효과적이라고 증명하였다. 그러나, 이러한 방식은 암 세포들을 특이적으로 타겟하지 않는다. 따라서, 특정 암 세포들은 여전히 상기 향상된 Th1 반응에서 탈출할 가능성이 있다. 또한, Th1 세포들의 전신적 활성화는 염증성 과정을 향상시키는 것과 같은 역효과를 이끌 수 있다. T 세포가 암세포들을 용해하도록 재정립하게 하는 이중특이성 항체들을 사용하는 다른 방식들은 상이한 암 모델에서, 또한 대장암과 같은 고형 종양에서 효능을 증명하였다 (Lutterbuese, R. 등2010.PNAS; 107:12605-12610; Osada T. 등 2010;British J Cancer; 102: 124-133).
여기서, 본 발명자들은 한편으로는 암세포를 특이적으로 타겟하고 다른 한편으로 항-종양 면역-반응을 국소적으로 자극함으로써 효능과 안전성을 최적으로 균형있게 하는 것을 목적으로한 신규 방법을 제공한다. 이를 성취하기 위해, 도 1B에 설명된 기작들을 통해서 작용하는 이중특이성 항-IL23RxCD3ε 항체를 사용한다:
a) CD3+ 세포독성적 T 세포들이 IL23R 발현 종양을 용해하도록 재정립하는 것;
b) 타겟 세포에 결합함에 따라CD3+ Th1 세포를 종양 미세환경에서 특이적으로 자극하는 것으로, 결론적으로 CD3 ε 결합도메인이 가교되는 것이 T 세포 자극에 필요하다;
*c) CD3+ 세포독성적 T 세포가 IL23R 발현 Th17 세포들을 용해하도록 재정립하고, 이럼으로써, Th1 저해 사이토카인들의 주요 원천을 제거한다;
d) CD3+ 세포독성적 T 세포들이 Th1 항-종양 반응을 저해하는 IL23R 발현 저해 T (Treg) 세포들을 용해하도록 재정립한다; 및
e) 조건적으로: 그 수용체 IL23R에 결합하는 IL-23과 경쟁함으로써 IL-23 신호전달을 차단한다.
특정 예에서, 상기 인간 환자는 고 Th17 반응을 가진 환자이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "고 Th17 반응"은 환자가 증가된 Th17 유전자 발현을 또는 증가된 Th17 세포수를 나타내는 상황을 지칭한다. 증가된 Th17 유전자 발현은 정상적인 원격의 대조군 조직과 비교할 때, 종양 조직에서의 증가된 수준의 Th17 유전자 mRNA에 의해 나타날 수 있다. 대장암에서, 그러한 증가는 유전자 IL17A 및 RORC에서는 종양 조직 및 정상적인 원격의 점막 간에 적어도 2-배, 구체적으로 4-배 및 가장 구체적으로 5- 내지 6-배이었다 (참조 Tosolini 등, Cancer Res 2011 ;71 :1263-1271). 종양 조직에서 또는 종양 인근 조직에서, 원격의 대조군 조직에 비하여, 증가된 Th17 세포수가 보여진다. 대장암에서, 그러한 증가된 수는 종양의 중앙이나 침투 가장자리, 구체적으로는 중앙 및 침투 가장자리 둘 다에서 관측된다 (참조 Tosolini 등, 상기 인용문).
제2 관점에서, 본 발명은 적어도 하나의 제1 결합 분체 및 적어도 하나의 제2 결합 분체를 가지는 이중특이성 작제물에 관한 것이다. 상기 제1 및 제2 결합 분체들은 제1 항원 및 제2 항원에 각각 특이적으로 결합한다. 상기 제1 항원은 면역 주효 세포, 즉 세포독성적 주효 T (Tc) 세포 (세포독성적 T 임파구 (CTL) 또는 T 살해 세포로 알려진)의 표면 상에 존재하는 항원이다. 상기 제2 항원은 타겟 세포의 표면 상에 존재하는, IL-23 수용체 특이성 서브유닛, IL23R이다.
본 발명 내에서, 하나의 타겟 세포 유형은 전형적으로는 병원성 세포, 특히 병원성 T 세포, 더 구체적으로 전사 인자 RORγ(t)를 발현하는 T 세포이다. RORγ(t)는 친-염증성 Th17 세포로의 흉선세포 분화를 촉진하고 및 또한 미분화된 T 세포들의 어팝토시스를 저해하는 데 및 이들의 Th17 세포로의 분화를 촉진하는 데 있어서, 십중팔구는 Fas 리간드 및 IL-2의 발현을 각각 하향 조절함으로써, 중용한 역할을 한다. 특정 구체예에서, 상기 세포들은 IL-17 생성 T 세포 (Th17 세포), γδ T 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포 및 불변 자연 살해 (iNK) 세포로 구성되는 군으로부터 선택된다. 가장 구체적으로, 본 발명 내에서 상기 타겟 세포들은 Th17 세포 및 γδ T 세포로부터 선택된다.
본 발명 내의 다른 타겟 세포는 종양 세포, 구체적으로 종양 세포 발현 IL23R이다. IL23R 발현은 결장암종 (CRC), 소-세포 폐암 (SCLC), 폐의 선종 (AC)과 같은 상피암에 대하여는 물론, 미만형 B- 세포 임파종 (DLBCL), 여포형 임파종 (FL), 소아성 B-ALL 및 급성 골수 임파종 (AML)으로 그 예를 든 다양한 B- 및 T-세포 종양 상에서 나타났다.
특정 구체예에서, 상기 이중특이성 작제물은 면역 주효 세포, 즉 세포독성적 주효 T (Tc) 세포 (또한, 세포독성적 T 임파구 (CTL) 또는 T 살해 세포로 알려진)의 표면 상에 존재하는 항원에 지향된 적어도 하나의 제1 결합 분체 및 종양 세포의 표면 상에 존재하는 IL-23 수용체 특이성 서브유닛, IL23R에 지향된 적어도 하나의 제2 결합 분체를 가지며, 상기 이중특이성 작제물은 또한 Th17 세포를 제거하고 및 Th1 반응을 자극할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 제1 항원은 CD3, 구체적으로 CD3ε이다.
상기 제1 및 제2 결합 분체들은, 이들이 바람직한 제1 및 제2 항원에 특이적으로 결합하는 한 구조적으로 제한되지 않는다. 그러나, 제1 및 제2 결합 분체들은 일반적으로 하나 이상의 올리고- 또는 폴리펩타이드 또는 이의 부분체로 구성되거나 형성된다. 일반적으로, 상기 제1 및 제2 결합 분체들은 항체-기반 결합 분체들이고, 이들은 적어도 하나의 항체 가변 도메인 또는 이의 결합 단편물을 포함한다.
* 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 제1 결합 분체는 CD3 및 CD28로부터 선택된 제1 항원에 특이적으로 결합한다. 상기 CD3 단백질은 T 세포 수용체 (TCR)와 연합하고 T 세포 활성화에 요구된다. CD3는 하나의 CD3γ, 하나의 CD3δ 및 두 개 CD3ε 사슬의 복합체이고 이는 TCR 및 ζ-사슬과 같이, TCR 수용체 복합체를 형성한다. CD28는 T 세포 활성화에 요구되는 공동 자극성 신호를 제공하는, T 세포상에서 발현되는 분자 중 하나이다. CD28를 통한 자극은 T 세포들에 강력한 공동 자극 신호를 제공할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 제1 결합 분체는 CD3에, 더 구체적으로 CD3의 입실론 사슬 (CD3ε)에, 및 가장 구체적으로 CD3의 작용성 (agonistic) 에피토프에 특이적으로 결합한다. 용어 "작용성 에피토프", 본 발명에서 사용되는 바와 같이, (a) 본 발명의 이중특이성 작제물의 결합시, 조건적으로, 동일 세포 상에서 몇 가지 이중특이성 작제물의 결합시, 상기 이중특이성 작제물이 TCR 신호전달을 활성화하게 하고 및 T 세포 활성화를 유도하게 하는 에피토프, 및/또는 (b) CD3의 입실론 사슬의 아미노산 잔기로만 구성되고 및 Tc 세포상에서 그의 천연적 맥락에서 제시될 때 (즉 TCR, CD3γ 사슬 등에 의해 감싸여질 때) 본 발명의 이중특이성 작제물에 의한 결합에 대하여 접근될 수 있는 에피토프, 및/또는 (c) 본 발명의 이중특이성 작제물의 결합시, CD3γ 대한 CD3ε의 공간적 위치의 안정화를 주도하지 않는 에피토프를 의미한다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, Tc 세포에 결합하는 대신에, 상기 제1 결합 분체는 C1q과 같은 보체 시스템의 성분에 특이적으로 결합한다. C1q는 혈액 보체 시스템을 활성화 시키는 상기 C1 효소 복합체의 서브 유닛이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 또한 Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체 (FcγR)에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분체의 용도에 관한 것이다. 상기 FcγR는 자연 살해 (NK) 세포의 표면 상에 존재하는 FcγRIII일 수 있거나 또는 대식세포, 단핵구, 호중구 및/또는 수지상 세포의 표면에 존재하는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIBI, FcγRIIB2, 및 FcγRIIIB 중 하나일 수 있다.
그러한 구체예에서, 상기 제1 결합 분체는 구체적으로 Fc 부위 또는 이의 기능적 단편물이다. 본 맥락에서, "기능적 단편물"은 FcR에, 특히 FcγR에, FcγR 함유 주효 세포, 특히 대식세포, 단핵구, 호중구 및/또는 수지상 세포가 세포독성적 분해 또는 식세포 작용으로 타겟 세포를 살해하도록 하는 충분한 특이성과 친화성으로 여전히 결합할 수 있는 항체 Fc 부위의 단편물을 지칭한다. 특히, 기능적 Fc 단편물은 원래의 전장 Fc 부분이 상기 활성화 FcγRI와 같은 FcR에 결합하는 것을 완전히 저해할 수 있다. 특히, 기능적 Fc 단편물은 활성화 FcγR에 대한 그의 친화도의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%를 유지한다.
본 발명의 그러한 구체예에서, 상기 Fc 부위 또는 이의 기능적 단편물은 구체적으로 향상된 Fc 부위 또는 이의 기능적 단편물이다. 용어 "향상된 Fc 부위"는, 본 발명에서 사용되는 바와 같이, Fc 수용체-매개 주효세포 기능, 특히 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체-의존성 세포독성 (CDC), 및 항체-매개 식세포작용을 향상하도록 개질된 Fc 부위를 지칭한다. 이것은 당해 분야에 공지된 바와 같이, 활성화 수용체 (예, 자연 살해 (NK) 세포 상에 발현된 FcγRIIIA (CD16A)) 및/또는 저해성 수용체 (예. FcγRIIB1/B2 (CD32B)으로의 저하된 결합)에 대하여 증가된 친화도를 이끄는 방식으로 Fc 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다.
본 발명 내에서 적절한 변경은 글리코실화 패턴들을 변경하는 것, 특히 퓨코실을 없애는 것 (또한 "탈퓨코실화"로 지칭되는), 변이 (점 돌연변이, 삭제, 삽입) 및 올리고- 또는 폴리펩타이드들과의 융합을 포함한다. 글리코실화 패턴들을 변경하는 공지된 기술은 항체-생성 세포에서 이종성 1,4-N-아세틸글루코사미닐트라스페라제 III의 과발현 (Glycart-Roche 기술로 알려짐) 및 항체-생성 세포에서 α-1,6-퓨코실트란스페라제 (FUT8)을 암호화하는 유전자의 녹아웃 (쿄와 하코 기린의 Potelligent 기술)을 포함한다. Fc 부분에서 변이를 향상시키는 특정 예는 Shields 등, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)에서 설명된 것을 포함하며, 이는 그 전체로서 본 발명에 포함된다.
본 발명에 따라서, 상기 이중특이성 작제물은 구체적으로 Tc 세포에 의해 IL23R-발현 타겟 세포를 살해하는 것이 고도로 효율적인 방식으로 설계된다. 그러한 효율적인 살해는 일반적으로 IL23R-발현 타겟 세포들을 용해하도록 세포들을 재지향하게 만드는 이중특이성 작제물의 능력과 연계된다. 용어 "효율적인"은, 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 이중특이성 작제물이 전형적으로 시험관 상에서 10 내지 500 ng/ml 범위의 EC50을 나타내고 및 1:1 내지 50:1, 구체적으로 1:1 내지 15:1, 더 구체적으로 2:1 내지 10:1의 Tc 세포 대 타겟 세포의 비율에서, Tc 세포를 통하여 타겟 세포들의 약 50 %를 재지향으로 용해 유도할 수 있다는 것을 의미한다. 상기 및 하기 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은 제시된 값이나 범위의 ±10%를 지칭한다.
또한, 본 발명의 이중특이성 작제물은 구체적으로 자극된 또는 (그렇지 않으면) 자극되지 않은 Tc 세포 및 타겟 세포를 상기 타겟 세포가 용해되는 방식으로 가교시킬 수 있다. 이것은 타겟-특이성 T 세포 클론들의 생성 또는 수지상 세포에 의한 공통적인 항원 제시가 상기 이중특이성 작제물이 그의 소정의 활성을 발휘하는 데 필요하지 않다는 장점을 제공한다. 사실, 본 발명의 이중특이성 작제물은 구체적으로 다른 활성화 신호의 부재시 타겟 세포들을 용해하도록 Tc 세포들을 재지향할 수 있다. 더 구체적으로, 이중특이성 작제물의 제1 결합 분체가 CD3, 구체적으로 CD3ε에 특이적으로 결합한다면, Tc 세포들을 재지향하게 하여 타겟 세포들을 용해하는 것에 CD28 및/또는 IL-2을 통한 신호전달이 요구되지 않는다. 비타겟 특이성 및/또는 비자극된 Tc 세포들을 활성화시키는 높은 잠재성은 본 발명의 이중특이성 작제물의 중요한 특성으로 간주되고 및 타겟 세포들을 효율적으로 살해하는 것에 기여하는 것으로 여겨진다.
본 발명은 또한 제1 및 제2 결합 분체들을 상호 상대적으로 배치하여 상기 이중특이성 작제물이 Tc 세포에 존재하는 제1 항원에 선호적으로 결합하고 및 동시에 타겟 세포에 존재하는 제2 항원 (예, IL23R)에 동시적으로 결합하나, 기본적으로는 상기 제1 항원 및 IL23R를 둘 다 동시 발현하는 단일 세포 (예, IL-17 발현 세포독성적 (Tc17)) 세포에 동시적으로 결합할 수 없는 식으로 되는 것에 관한 것이다.
두 개 세포에 동시에 결합하는 상기 이중특이성 작제물의 선호도를 측정하는 방법은 당해분야의 숙련자의 통상적인 능력에 속한다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이성 작제물은 CD3+/IL23R- 세포들 및 CD3+/IL23R+ 세포의 혼합물 또는 CD3+/IL23R- 세포들 및 CD3-/IL23R+ 세포들의 혼합물과 접촉될 수 있다. 다음, 이중특이성 작제물-양성 단일 세포들의 수 및 이중특이성 작제물에 의해 가교된 세포의 수를 현미경 또는 당해 분야에 공지된 바와 같이, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)로 평가할 수 있다. 양 쪽 설정에서 관측된 이중특이성 가교 세포가 대략 동일한 수라면, 이는 본 발명의 이중특이성 작제물은 그 표면 상에서 CD3 및 IL23R 항원을 둘 다 나타내는 단일 타겟 세포에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 대안적으로, 현시적인 결합 활성 어비더티(avidity)는 결정될 수 있다. 단일 타겟 세포에 대한 동시적 결합이 가능하지 않거나 본질적으로 가능하지 않다면, 일 면 상의 IL23R+/CD3- 또는 IL23R-/CD3+ 세포 및 다른 이면 상의 IL23R+/CD3+ 세포에 대한 이중특이성 작제물의 현시적 결합 활성은 대략 동일할 것이다. 그러나, 단일 타겟 세포에 동시적 결합이 가능하다면, 이중특이성 작제물의 IL23R+/CD3+ 세포들에 대한 현시적 결합 활성이, 어비더티 효과로 인하여, IL23R+/CD3- 또는 IL23R-/CD3+ 세포들에 대한 것보다 더 높을 것이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 이중특이성 작제물은 상기 제1 항원을 인식하는 상기 제1 결합 분체의 부분 및 상기 제2 항원을 인식하는 제2 결합 분체의 부분이, 상기 이중특이성 작제물의 중앙부에 비하여, 본질적으로 반대 방향으로 돌출되는 방식으로 상기 제1 및 제2 결합 분체들이 상대에 대하여 배열되는 구조를 가진다. 용어 "중앙부"는 구체적으로 기하적 중심부 (COG)에 관한 것이다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, 본 발명의 이중특이성 작제물의 이러한 구조는 상기 개괄한 바와 같이, 단일 타겟 세포로의 원치않는 이중 결합을 회피하는 것으로 여겨진다. 용어 "본질적으로"는 본 맥락에서 사용되는 바와 같이, 제1 결합 분체의 상기 부분 및 제2 분체의 상기 부분이, 이중특이성 작제물의 중앙부에 비하여, 135° 이상 180°까지의 각도로 배열되어 있는 것을 의미한다.
상기 이중특이성 작제물의 구조는 구체적으로 상기 전체 이중특이성 작제물의 기하적 중심 (COG)으로부터 제1 결합 분체의 제1 파라토프의 COG까지의 제1 벡터 v1 및 상기 전체 이중특이성 작제물의 COG로부터 상기 제2 결합 분체의 제2 파라토프의 COG까지의 제2 벡터 v2 사이의 각도 α가 대략 135° < α < 180°의 범위 내, 더욱 구체적으로 150° < α < 180°의 범위 내, 및 가장 구체적으로 160° < α < 180°의 범위 내에 있다는 것을 특징으로 한다. 용어 "파라토프"는, 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 제1 및 제2 항원들 각각에 직접적으로 상호작용하는 제1 및 제2 결합 분체들의 부분들을 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, 상기 제1 결합 분체 및/또는 상기 제2 결합 분체는 항체-기반 결합 분체, 구체적으로 중쇄 가변 도메인 (VH) 또는 이의 결합 단편물을 포함하는 항체-기반 결합 분체, 더욱 구체적으로 중쇄 가변 도메인 (VH) 또는 이의 결합 단편물 및 경쇄 가변 도메인 (VL) 또는 이의 결합 단편물을 포함하는 항체-기반 결합 분체이다. 용어 "결합 분체"는, 본 발명에서 사용되는 바와 같이, (단독으로 또는 다른 도메인, 부위 또는 부분과 조합하여) 여전히 기능적인, 예 상기 이중특이성 작제물에 의해 인식되는 제1 또는 제2 항원에 결합할 수 있는, 주어진 도메인, 부위 또는 부분의 일부를 지칭한다.
일반적으로, 본 발명의 의미 내의 결합 분체는, 본 발명의 이중특이성 작제물로 포함될 때, 그의 천연적 항원 결합 활성 (예, 단일특이성 작제물로서의 항원 결합 활성)의 적어도 10 %를 보유한다. 구체적으로, 결합 분체는 그 천연적 항원 결합 활성의적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 를 보유하거나, 또는 원하는 생물학적 효과 (예, Tc 세포에 의한 타겟 세포의 용해/살해)를 발휘하도록 충분한 친화도를 가진 임의의 결합 분체가 유용할지라도, 전체 천연 항원 결합 활성을 유지하거나 심지어 능가한다. 본 발명의 의미 내의 "결합 분체"는 상기 정의한 정도로 그 결합 활성을 보유하고 및 구체적으로, 결합 또는 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환을 가지는 변이체를 포함하는 것으로 의도한다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, 상기 이중특이성 작제물은 bsAb (경쇄의 C-말단에 연결된 scFv), Bs1Ab (경쇄의 N-말단에 연결된 scFv), Bs2Ab (중쇄의 N-말단에 연결된 scFv), Bs3Ab (중쇄의 C-말단에 연결된 scFv), Ts1Ab (중쇄 및 경쇄 둘 다의 N-말단에 연결된 scFv), Ts2Ab (중쇄의 C-말단에 연결된 dsscFv), 및 노브-인투-홀 (KiHs) (KiH 기술로 제조된 이중특이성 IgG들) 및 듀오바디 (Duobody 기술에 의해 제조된 IgG들)와 같은 단일 사슬 다이아바디 (scDb), 탠덤 scDb (Tandab), 선형 이량성 scDb (LD-scDb), 환형 이량성 scDb (CD-scDb), 이중특이성 T-세포 인게이저 (BiTE; 탠덤 di-scFv), 탠덤 tri-scFv, 트리(아)바디, 이중특이성 Fab2, di-미니항체, 테트라바디, scFv-Fc-scFv 융합체, di-다이아바디, DVD-Ig, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, IgG-scFv 융합체, 로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체 형식이다. 단일 사슬 다이아바디 (scDb), 특히 이중특이성 단량체성 scDb가 본 발명에 사용하기 특히 적합하다.
상기 이중특이성 scDb, 특히 상기 이중특이성 단량체성 scDb는, 구체적으로 두 개의 가변 중쇄 도메인들 (VH) 또는 이의 단편물들 및 두 개 가변 경쇄 도메인 (VL) 또는 이의 단편물들이 링커 L1, L2 및 L3에 의해 VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA, VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA, VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA, VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA, VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB, VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB, VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB 또는 VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB의 순서로 연결된 것을 포함하며 여기서 상기 VLA 및 VHA 도메인들은 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 함께 형성하고, 및 VLB 및 VHB는 IL23R대한 항원 결합 부위를 함께 형성한다.
링커 L1은 구체적으로 2-10 개 아미노산들, 더욱 구체적으로 3-7 개 아미노산들, 및 가장 구체적으로 5 개 아미노산들의 펩타이드이고, 및 링커 L3은 구체적으로 1-10개 아미노산들, 더욱 구체적으로 2-7개 아미노산들, 및 가장 구체적으로 5개 아미노산들의 펩타이드이다. 상기 중간 링커 L2는 구체적으로 10-40개 아미노산들, 더욱 구체적으로 15-30 개 아미노산들, 및 가장 구체적으로 20-25개 아미노산들의 펩타이드이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 이중특이성 작제물의 제1 및 제2 항체-기반 결합 분체의 VH 도메인은 인간 중쇄 골력 (FW) 부위에 접합된 토끼 중쇄 상보성 결정 영역들 (CDRs)을 포함하고, 및 상기 이중특이성 작제물의 상기 제1 및 제2 항체-기반 결합 분체들의 VL 도메인은 인간 경쇄 FW 부위에 결합된 토끼 경쇄 CDR들을 포함한다.
상기 제1 항체-기반 결합 분체의 중쇄 및 경쇄 CDR들은 토끼를 인간 CD3의 전장 입실론 사슬, 전장 CD28 또는 전장 C1q으로 면역화함으로써 얻은 토끼 항체로부터 유도된다. CD3ε, CD28 또는 C1q의 전장 사슬로 면역화하는 것은 토끼를 인간 CD3ε, CD28 또는 C1q의 전장 사슬을 암호화하는 플라즈미드를 사용하여 DNA 면역화 또는 대안적으로 CD3의 입실론 사슬의 정제된 세포외 도메인을 사용하여, 또는 CD28의 정제된 세포외 사슬을 사용하여, 또는 정제된 C1q을 사용하여 면역화함으로써 적절하게 수행된다. 또한, 제2 항체-기반 결합 분체의 상기 중쇄 및 경쇄 CDR들은 토끼를 IL23R 의 정제된 세포외 도메인을 사용하여 또는 전장 IL23R을 발현하는 플라즈미드를 사용하여 면역화함으로써 수득한 토끼 항체로부터 유도된다.
본 발명의 상기 이중특이성 작제물은 당해 분야에 공지된 임의의 편리한 항체 제조 방법을 사용하여 생산될 수 있다 (참조, 예, 이중특이성 작제물의 제조에 대하여 Fischer, N. & Leger, O., Pathobiology 74:3-14 (2007); 이중특이성 다이아바디 및 탠덤 scFv들에 대하여Hornig, N. & Farber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907:713-727, 2012, and WO 99/57150 A2). 또한, 예증적인 항-IL23R 및 항-CD3ε 항체 서열은 EP 2 395 025 및 EP 1 348 715 각각 개시되어 있다. 본 발명의 이중특이성 작제물의 제조에 적합한 방법의 특정 예는 특히 젠맙 (참조 Labrijn 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:5145-5150 (2013)) 및 Merus (참조 de Kruif 등, Biotechnol. Bioeng. 106:741-750 (2010)) 기술을 포함한다. 기능적 항체 Fc 부분을 포함하는 이중특이성 항체들을 생성하는 방법 또한 당해 분야에 공지되어 있다 (참조, 예, Zhu 등, Cancer Lett. 86:127-134 (1994)); and Suresh 등, Methods Enzymol. 121:210-228 (1986)).
이러한 방법들은 일반적으로, 원하는 항원으로 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 세포와 골수종 세포들을 하이브리도마 기술을 사용하여 융합시키는 수단으로써, 단일클론성 항체들을 생성하는 것 (참조, 예, Yokoyama 등, Curr. Protoc. Immunol. Chapter 2, Unit 2.5, 2006) 또는 공지된 분자 클로닝 기술을 사용하여 재조합 항체 조작 (레파토리 클로닝 또는 파지 디스플레이/효모 디스플레이) (참조, 예, Chames & Baty, FEMS Microbiol. Letters 189:1-8 (2000)), 및 두 가지 상이한 단일클론성 항체들의 항원-결합 도메인들 또는 이의 단편물이나 부분체들을 조합하여 이중특이성 작제물을 생성하는 것을 포함한다.
본 발명의 이중특이성 작제물들은, 면역원성을 감소시키고 및/또는 안정성을 향상시키기 위해, 인간화된다. 항체들의 인간화 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 하나의 기술은 인간 수용체 골격의 가변 경쇄 VL 및 가변 중쇄 VH 상에 이종발생적 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)들을 접합하는 것에 기반한다 (참조, 예, Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); and Verhoeyen 등, Science 239:1534-1536 (1988)). 다른 기술에서, 이종발생 항체의 골격은 인간 골격으로 변이시킨다. 양 쪽의 경우에서, 상기 항원-결합 부분의 기능성의 유지는 필수적이다 (Kabat 등, J. Immunol. 147:1709-1719 (1991)).
본 발명의 이중특이성 작제물들은 대안적으로 비-항체 기반 결합 도메인들에 기반한 하나 이상의 결합 분체들을 포함할 수 있다. 본 발명의 이중특이성 작제물의 제조에 적합한 방법들의 특정 예는, 특히 DARPin 기술 (Molecular partners AG), 아드넥신 (adnexin) 기술 (Adnexus), 안티칼린 (anticalin) 기술 (Pieris), 및 파이노머 기술(Fynomer) 기술 (Covagen AG)을 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 이중특이성 작제물은 PRO165 (서열번호 7), 또는 PRO165의 기능적 활성 변이이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "PRO165의 기능적 활성 변이"는 PRO165의 VL 및 VH 부위에 기반한 이중특이성 작제물을 지칭하는 것으로, 여기서 (i) 상기 이중특이성 작제물은 PRO165의 기능적 활성을 유지하며, 예, 제1 VH/VL 쌍은 특이적으로 CD3ε에 결합하고, 및 제2 VH/VL 쌍은 상기 IL-23 수용체 특이성 서브유닛 (IL23R)에 특이적으로 결합하며, 및 (ii) 상기 VL 및 VH 부위들은 PRO165의 VL 및 VH 부위에 비해 적어도 하나의 서열 변이를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 기증적 활성 변이체의 CDR 서열은 PRO165의 VL 및 VH 부위의 CDR 서열에 적어도 70%, 구체적으로 적어도 80%, 더욱 구체적으로 적어도 90% 상동적이다. 가장 구체적으로, 상기 기능적 활성 변이체의 CDR 서열들은 PRO165의 VL 및 VH 부위들의 CDR 서열에 적어도 90% 동일하고 및 적어도 95% 상동적이다. 그러한 특정 구체예에서, 상기 기능적 변이체의 VH 부위의 적어도 CDR3 부위들은 PRO165의 상응하는CDR3 부위와 동일하다. 다른 특정 구체예에서, 상기 기능적 변이체의 모든 CDR 부위들은 PRO165의 상응하는CDR 부위들과 동일하다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 작제물을 암호화하는 핵산 또는 다중 (하나 이상) 핵산에 관한 것이다. 상기 이중특이성 작제물은 단일 사슬 작제물, 예, 폴리펩타이드 또는 단백질, 상기 이중특이성 작제물을 암호화하는 단일 핵산이다. 하지만, 상기 이중특이성 작제물이 두 개 이상의 폴리펩타이드들을 가지면, 본 발명의 이중특이성 작제물은 두 개 이상의 개별 핵산들에 의해 또한 암호화될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 분자(들)는 임의의 핵산 분자, 구체적으로 DNA 또는 RNA 분자, 예를 들어 cDNA 또는 mRNA일 수 있다. 이것들은 자연 발생 분자일 수 있거나, 유전자 조작 또는 화학 합성에 의해 생성될 수 있다. 이것들은 코딩 또는 비코딩 본쇄를 포함하는 단일 사슬 분자, 또는 이중 사슬 분자일 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 핵산 또는 핵산들은 이중특이성 작제물 PRO165 (서열번호 7), 또는 이의 기능적 활성 변이체를 암호화한다.
본 발명의 핵산(들)은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 적절한 방법으로 생성될 수 있다. 본 발명의 핵산은, 예를 들어, 포스포아미다이트 방법 등에 의해 합성될 수 있거나 특정 프라이머를 사용하는 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)으로 생성될 수 있다. 또한, 소정의 변이를 특정 뉴클레오타이드 서열로 도입하는 방법, 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 기술은 당해 분야에 공지되어 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 핵산(들)을 포함하는 벡터 또는 다중 벡터들에 관한 것이다. 벡터, 특히, 플라즈미드에 포함될 때, 상기 핵산(들)은 구체적으로 DNA이다. 본 발명에 사용된 벡터의 유형은 특정하게 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 벡터는 플라즈미드와 같이 자율적으로 복제하는 벡터일 수 있거나, 또는 숙주 세포로 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합되어 그 염색체에 따라 복제되는 벡터일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 사용되는 벡터는 발현 벡터, 특히 발현 플라즈미드이다. 발현 벡터에서, 프로모터와 같이 전사에 필요한 요소들은 본 발명의 DNA 핵산(들)에 작동적으로 연결되어 있다.
세균 세포에서 작동적인 프로모터들의 예는 람파 파지의 PR 또는 PL 프로모터, 대장균의 lac, trp 또는 tac 프로모터 등을 포함한다. 포유동물 프로모터의 예는 SV40 프로모터, MT-1 (메탈로티오네인 유전자) 프로모터, 아데노바이러스 2 주요 후기 프로모터 등을 포함한다. 또한, 곤충 세포에 사용하는 예증적 프로모터들은 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터, 바큘로바이러스 전초기 (immediate early) 유전자 1 프로모터 등을 포함한다. 또한, 효모 숙주 세포에 적절한 프로모터들은 효모 해당작용 시스템 유전자로부터 유도된 프로모터, TPI1 프로모터 등을 포함한다. 상이한 발현 시스템에 적합한 다른 프로모터들은 당해 분야에 공지되어 있다.
또한, 필요시, 본 발명의 DNA는 인간 성장 호르몬 종결체 또는 TPI1 ADH3 진균 숙주 종결체와 같은 적절한 종결체에 작동적으로 연결될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 또한 폴리아데닐화 신호 (예, SV40으로부터 유도된), 전사 인핸서 서열 (예, SV40 인핸서), 또는 번역 인핸서 서열 (예, 암호화 아데노바이러스 VA RNA)와 같은 인자를 가질 수 있다.
*본 발명의 재조합 벡터는 또한 상기 백터를 숙주 세포 내에서 복제할 수 있게 하는 DNA 서열이 통상적으로 제공되며 및 포유동물 세포에 대한 이의 예는 SV40 복제 기점이다. 더욱이, 본 발명의 재조합 벡터는 또한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택성 마커의 예는, 특히, 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 네오마이신, 및 하이그로마이신과 같은 약물 내성 유전자를 포함한다. 본 발명의 핵산(들)을 프로모터, 및 필요한 바, 종결자 및/또는 분비 신호 서열을 연결하고, 이들을 적절한 벡터에 삽입하는 방법들은 당해 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 벡터 또는 벡터들은 이중특이성 작제물 PRO165 (서열번호 7), 또는 이의 기능적 활성 변이체를 암호화하는 핵산이나 핵산들을 포함한다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 벡터(들)을 포함하는 숙주 세포 또는 동일하지 않은 복수 개의 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 벡터가 도입된 숙주 세포(들)는 특정하게 제한되지 않고 본 발명의 벡터를 발현할 수 있는 임의의 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 적절한 숙주 세포들의 예는 세균 (예, 바실러스 종, 스트렙토마이세스 종, 및 에스체리키아 콜리), 포유동물 세포 (예, HEK293, HeLa, COS, BHK, CHL, 및 CHO 세포), 곤충세포 (예, 바큘로바이러스 발현 시스템), 효모 세포 (사카로마이세스 종. 또는 스키조사카로마이세스 종, 특히 사카로마이세스 세레비지아 및 사카로마이세스 클루이베리), 및 다른 진균 세포 (예, 아스퍼질러스, 뉴로스포라)를 포함한다. 구체적으로, 상기 세포들은 세균 세포, 특히 에스체리키아 콜리 세포이다.
다중 폴리펩타이드 사슬 이중특이성 작제물을 단일 숙주 세포 발현 시스템에서 만들 수 있고 여기서 상기 숙주 세포는 이중특이성 작제물의 각 사슬을 생성하고 및 상기 폴리펩타이드 사슬들을 다량체 구조로 조립하여 상기 이중특이성 작제물을 형성한 후, 상기 숙주세포로부터 상기 이중특이성 작제물을 회수한다. 대안적으로, 상기 원하는 이중특이성 작제물의 개별 폴리펩타이드 사슬들은 당해 분야에 알려진 바와 같이, 개별 발현 숙주 세포들에서 만들고, 각각의 숙주세포로부터 분리적으로 회수하고, 다음 다중-서브유닛을 이중특이성 작제물의 형성을 허용하는 조건에서 시험관 내에서 혼합될 수 있다.
본 발명의 벡터를 적절한 숙주 세포로 도입하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 및 원형질체 방법, 수용성 (competent) 세포 방법 (세균성 숙주 세포에 대해), 전기천공, 칼슘 인산염 방법, 리포펙틴 (포유동물 세포 또는 곤충세포/바큘로바이러스 시스템에 대하여), 전기천공, 스페로플라스트 방법, 및 리튬 아세트산염 방법 (효모 및 다른 진균 세포에 대하여)을 포함한다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포 또는 숙주 세포들을 제공하는 단계, 상기 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포들을 배양하는 단계, 및 상기 세포 배양물로부터 이중특이성 작제물을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 이중특이성 작제물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 배양 단계에서, 본 발명의 숙주 세포(들)는 본 발명의 이중특이성 작제물의 발현을 허용하는 조건 하에서 적절한 배양 배지에서 배양된다. 상기 세포를 배양하는 데 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유하는 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포를 성장시키기 적절한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 작제물을 제조하는 방법으로서, 본 발명에 따른 핵산 또는 핵산들, 또는 본 발명에 따른 벡터 또는 벡터들을 제공하고, 상기 핵산이나 핵산들, 또는 상기 벡터나 벡터들을, 구체적으로 시험관 내 전사/번역 시스템 (참조, 예를 들어, Yin 등, Mabs 2012 Mar 1;4(2) 217-25)에서 발현시키고, 및 상기 이중특이성 작제물을 상기 발현 시스템으로부터 수집하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
상기 이중특이성 작제물을 상기 세포 배양물로부터 수집하는 단계에서, 상기 생성된 이중특이성 작제물은, 상기 숙주 세포를 원심분리나 여과에 의해 상기 배지로부터 분리하고, 그 상등액 또는 여과물의 단백질성 성분을 염, 예를 들어, 암모늄 설페이트의 수단으로써 침전시키고, 및 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 다양한 크로마토그래프 방식으로 여과하는 것을 포함하는, 단백질 분리 및 정제 방법에 의해 회수된다. 상기 이중특이성 복합체가 불용성 봉입체를 형성하는 경우, 예를 들어 E. coli 를 숙주 세포로 사용할 때, 상기 봉입체는 변성제에 먼저 용해될 수 있고, 이후 당해 분야에 공지된 방식에 따라 리폴딩 단계를 취한다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 작제물 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적 허용"은, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 및 다른 문제가 있는 합병증 없이, 포유동물, 특히 인간의 조직에 접축하기 적합한 그러한 화합물 또는 물질을 지칭한다. 용어 "담체"는, 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 활성 성분이 투여될 수 있는 희석제, 보조제, 부형제 또는 운반체에 관한 것이다. 본 발명에서 사용되는 약학적 허용 담체는, 예를 들어, 멸균 액체 또는 분산액일 수 있다. 특정 담체들은 정맥 내, 피하 또는 국소 투여에 적합한 것으로서, 비경구 투여용의 멸균 수성 및 비수성 용액, 또는 현탁액을 포함하며, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (2000)에 논의되어 있다.
상기 약학 조성물은 일반적으로 본 발명의 이중특이성 작제물의 유효량을 포함한다. 본 발명 내에서, 용어 "유효량"은 이로운 또는 원하는 치료적 결과를 내기에 충분한 화합물의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 하나 이상의 투약, 적용 또는 복용으로 투여될 수 있고, 특정 제형이나 투여 경로에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 또한, 상기 약학 조성물은 본 발명의 이중특이성 작제물과 공동 투여되는 하나 이상의 활성 물질을 포함할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 추가의 약학적 허용 물질, 예를 들어 가용화제, 표면활성제, 긴장성 변형제 등과 같은 약학적 허용 부형제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물의 투약 형태는 특별히 제한되지 않지만, 주사 또는 주입용 수성 또는 비수성 용액이나 현탁액, 또는 국소 투여에 적합한 제형이다. 다른 특정 투여 형태는 제어되거나 지속되거나 또는 지연된 방출 매트릭스에 배합된 본 발명의 이중특이성 작제물을 포함하는 제형이다. 또한 상기 약학 조성물은 상기 이중특이성 작제물을 시간에 따라서 방출하는 이식성 장체에 포함되어 있을 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 염증성 및/또는 자가면역 질환의 치료에 본 발명의 이중특이성 작제물을 사용하는 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대상체, 구체적으로 인간 환자에, 본 발명의 이중특이성 작제물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 염증성 및/또는 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 용어 "유효량"의 의미는 상기 정의한 바와 같다. 전형적으로, 본 발명의 이중특이성 작제물의 유효량은 전술한 약학 조성물의 형태로 투여된다. 적절한 투여 경로는, 국소 및 비경구 투여, 특히 흡입, 피하 주사, 정맥내 주사 및 뇌척수액으로의 주사를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여 양태는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 격주, 매월, 격달에 한번, 세달, 여섯달 또는 아홉달에 한번, 및 일년에 한번이나, 단일 적용 투여 계획을 포함한다.
상기 염증성 및/또는 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선성 관절염, 궤양성 대장염, 크론병, 전신 홍반성 루프스, 연소자형 당뇨병, 자가면역 포도막염, 및 다발성 경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 허혈-재관류 손상일 수 있다
실시예
실시예 1: 이중특이성 항체 작제물의 클로닝
A 이중특이성 작제물 VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA (여기서 VLA 및 VHA 도메인들은 연합하여 CD3ε에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, 및 VLB 및 VHB은 연합하여 IL23R에 대한 항원 결합 부위를 형성한다)는 항체 bscCD19xCD3에 포함된 인간화된 항- CD3ε 항체 도메인으로부터 VLA 및 VHA을 (참조 EP 1 348 715 A2, 도 8, 뉴클레오타이드 1258-1575, 및 뉴클레오타이드 847-1203, 각각) 및 인간화된 항-IL23R 항체 20D7로부터 VLB 및 VHB (참조 EP 2 395 025 A1, 서열번호: 9 및 4, 각각)을 클로닝하고, 각각이 아미노산 서열 GGGGS (G4S)로 구성되는 링커 L1 및 L3 및 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (G4S)4 로 구성되는 중간 링커 L2와 함께, 상기 이중특이성 작제물을 E. coli 숙주 세포 T의 주변세포질로 분비하기 위한 N-말단 신호 서열을 포함하는, E. coli에서 발현하기 적합한 발현 벡터로, 다음과 같은 문헌에서 설명된 방법을 이용하여 도입함으로써 조립될 수 있다: Holliger 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448 (1993), Kipriyanov 등, J. Mol. Biol. 293:41-56 (1999) und Brusselbach 등, Tumor Targeting 4:115-123 (1999).
실시예 2: 암세포주에서의 IL23R의 발현 농도
공공의 도메인에서 이용가능한 데이터는 IL23R이 특정 종양에서 상향조절될 수 있다는 것을 제시한다. 그러나, 상기 이용가능한 정보는, 어떠한 절대적인 발현 수준도 및 발현의 특수성과 상이한 종양 샘플들에 걸쳐서 IL23R 상향 조절의 일관성도 알려진 바가 없기 때문에, IL23R이 이중특이성 항-IL23RxCD3ε 항체 포맷에 의한 암세포를 타겟하는 적절한 마커로서의 자격을 갖춘 것을 유효화하는 데 부족하다. 종양 세포의 타겟된 용해에 대한 표지로서 IL23R의 적절함을 더 연구하기 위해, 본 발명자들은 일차적인 암 조직 집단은 물론 다양한 종양 세포주 상에서 IL23R의 발현 수준을 평가하였다. 놀랍게도, IL23R mRNA 발현 수준은 대장암의 대부분 일차 조직 샘플에서 증가되었다. 유사하게, 증가된 IL23R mRNA 발현이 연구된 모든 129 CRC 세포주에서 발견되었다. 이러한 발견과 일치하여, IL23R은 연구된 여섯 개 대장암 세포주 모두는 물론 A549 폐선종 세포주상에서 매우 상향조절되었고, 단백질 수준도 유세포 분석상에서 그러하였다 (도 2 및 도 3). 세포당 IL23R 개수를 정량하여 CRC 세포 당 약 10'000 - 88'000 개의 발현수준이 밝혀졌다 (표 1). 뚜렷하게, 본 발명자들은 확인된 종양 마커 CEA 및 EGFR에 대해 음성으로 공표된 세포주에서도 또한 IL23R 단백질의 강력한 발현을 발견하였고, 이 둘의 타겟에 대하여는 이중특이성 T 세포 재지향 항체 요법이 현재 개발 중에 있다 (Osada, T. 등2010. British Journal of Cancer;101:124-133; Lutterbuese, R. 등2010.PNAS;107:12605-12610). 본 발명자들의 데이터는 IL23R이 대부분 대장암에서 특이적으로 상향조절되어 있는 종양 마커라는 것과 및 CRC 세포의 타겟된 용해에 대한 이중특이성 항-IL23RxCD3ε 항체는 항-CEA 또는 항-EGFR 요법에 내성인 환자에서도 효능을 가진다는 것을 제시한다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 다양한 백혈병 및 임파종 세포주에서도 또한 유사한 IL23R mRNA 발현 수준들을 발견하였고 및 시험된 모든 세포주에서 증가된 IL23R 단백질 발현을 확인하였다 (도 4).
암세포주들의 표면 상에 발현된 IL23R 분자. ΔMFI, 평균 형광 강도에서의 차이, 및 S/N, 항-IL23R 항체 및 이소타입 대조군 사이의 신호 대 배경 비율. ABC, 항원 결합능으로서, 참조 표준 비드로의 회귀에 의해 결정됨.
샘플 ΔMFI * S/N * ABC *
COLO 678 17476 172.33 88'302
DLD-1 13874 134.40 68'763
HCT 116 1539 9.79 10'553
HT-29 15540 65.21 74'865
LS-174T 8866 51.38 47'011
SW 480 18985 138.57 77'428
A549 1604 15.32 11'864
TF-1 12410 74.43 67'904
697 468 10.64 5'734
KIT225 1694 17.13 15'094
DB 563 3.51 5'677
SU-DHL-4 113 3.4 1'441
실시예 3: 인간 인터루킨 (IL)-23 수용체에 결합하는 단일클론성 토끼 항체들의 확인
인터루킨-23 수용체에 특이적으로 결합하는 항체들을 생성하는 총 475개단일클론성 B-세포들을 면역화된 토끼로부터 유세포 분석법에 기반한 단일 세포 분류법을 사용하여 분리하였고, 이 방법의 원리는 숙련자에게 공지되어 있고 및 예를 들어 Lalor 등 Eur J Immunol.1992;22.3001-2011에 설명되어 있다. 먼저 단일클론성 B 세포 배양 상등액을 인간 IL23R ECD로의 결합에 대하여 ELISA 스크리닝하였다. 다음 단계에서, 마우스 및 사이노몰거스 원숭이로부터 IL23R에 대한 교차 반응성을 평가하였다. 또한, 인간 및 사이노몰거스 IL23R에 대한 친화도를 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술을 사용하여 평가하였다 (표 2). 그러한 475개 단일클론성 항체들의 인간 IL23R에 대한 중간 평형 해리 상수 (KD)는 6.3E-11M이었다. 이러한 항체들의 오 퍼센트가 4.3E-13M 미만의 KD로 평가되었다. 사이노몰거스 및/또는 마우스에 높은 친화도 또는 교차 반응성으로 선택된 총 92개 클론들을 PCR 증폭시키고 이들의 가면적 도메인에 대하여 서열분석하였다.
수득한 토끼 IgG 클론들을 서열분석 한 결과, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들 (VL 및 VH)의 68개의 완전한 세트들을 얻었다. 토끼 가변 도메인들의 이러한 세트들을 서열 정렬로 분석하여 독특한 클론들을 동정하고 서열 유사성에 기반하여 서열들을 클러스터로 묶었다. VL 및 VH 도메인들의 이러한 정렬은 양 쪽 도메인의 접합 아미노산 서열에 기반하여 수행되었다. 상기 분석으로 58 개 독특한 클론들을 동정하였다. 상기 가변성 도메인의 정렬 외에, 각 토끼 IgG 클론의 6 개 상보성 결정 영역들 (CDRs)의 서열 세트를 상이한 클론들 간에 비교하여 CDR들의 독특한 세트들을 동정하였다. 58 개 독립적 클론들에 상응하는, 토끼 CDR들의 총 58개의 독특한 세트들이 동정되었다. 이러한 58개 CDR 세트들을 다중 정렬 도구 COBALT을 사용하여 정렬하고 Neighbor Joining 알고리즘을 사용하여 도 5에 나타난 바와 같이 계통수를 만들었다. 고도의 서열 다양성으로 진행할 목적으로 재조합 생성 및 추가 특성화를 위해, 상이한 클러스터들로부터 나온 23개 클론들을 인간, 인간, 사이노몰거스 및 마우스 IL23R에 대한 친화도를 기반으로, 선택하였다.
실시예 4: 단일클론성 토끼 항체들의 이형적 생성
상기 클론들을 선택한 후 (전술한 대로), 추가 특성화를 위해 토끼 항체들을 발현하고 정제하였다. 상응하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들을 클로닝하여 상기 DNA 단편물들을 적절한 포유동물 발현 벡터 내로 시험관 내 결찰시켰다. 이러한 발현 벡터들은 공동 발현시 완전 기능적 토끼 단일클론성 IgG들의 조립과 분비를 하게하는 토끼 IgG 경쇄 및 중쇄들의 불변 도메인의 공통 (consensus) 서열 들을 포함하였다. 상기 벡터 작제 후에, 결과된 작제물의 서열을 다시 확인하였고, 및 포유 동물 세포 형질감염을 위해 상기 플라즈미드 DNA를 증폭하고 정제하였다. 상기 토끼 항체 중쇄 및 경쇄용 발현 벡터들을 지질 기반 형질감영 제제를 사용하여 포유동물 현탁 세포주에 형질감염시켜 일과성 이형 발현하였다. 중쇄 대 경쇄 벡터의 비율과 같은 조건들을 최적화하여 분비된 단일클론성 IgG의 견고한 발현 수준을 확립하였다. 상기 발현 배양물을 7 일간 진탕 배양기에서 배양하였다. 이형 발현 기간 말에, 상기 세포 배양 상등액을 원심분리 및 디캔팅으로 수집하였다. 다음, 분비된 토끼 IgG들을 단백질 A 비드를 사용하여 친화 정제하였다. IgG가 적재된 비드들을 세척하고 정제된 항체들을 pH를 변화시켜 용출하였다. 용출 분획물을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE), 280 nm에서의 UV 흡수, 및 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)로 분석하여 정체, 내용물 및 순도를 밝혔다.
실시예 5: 정제된 단일클론성 토끼 항- IL23R 항체들의 특성화
인간, 사이노몰거스 원숭이 및 마우스 유래의 IL23R에 대한 상기 23개 정제된 토끼 단일클론성 항체들의 친화도를 SPR 측정으로 결정하였다. 각 결과가 하기 표 2에 제시되어 있다:
인간 IL23R Cyno IL23R 마우스 IL23R
클론 ID
IgG		 ka
[M-1s-1]		 kd
[s-1]		 KD
[M]		 ka
[M-1s-1]		 kd
[s-1]		 KD
[M]		 ka
[M-1s-1]		 kd
[s-1]		 KD
[M]
12-01-A08 NB NB NB ND ND ND NB NB NB
12-01-F09 1.80E+05 9.12E-05 5.07E-10 1.23E+05 5.37E-03 4.38E-08 NB NB NB
12-02-E05 2.15E+05 < 1.0E-06 < 4.66E-12 1.03E+05 1.93E-04 1.89E-09 NB NB NB
12-04-H09 1.74E+05 7.59E-05 4.37E-10 4.63E+05 7.71E-03 1.66E-08 NB NB NB
12-06-A05 1.53E+05 1.10E-05 7.17E-11 1.88E+04 8.23E-05 4.39E-09 5.48E+04 4.23E-05 7.72E-10
12-06-E01 1.18E+05 5.66E-05 4.82E-10 7.99E+04 1.14E-03 1.43E-08 1.80E+05 3.64E-03 2.02E-08
12-06-E03 6.58E+04 2.32E-05 3.53E-10 9.57E+04 7.31E-05 7.64E-10 8.91E+04 1.20E-03 1.35E-08
12-06-F06 2.83E+05 1.61E-05 5.70E-11 1.98E+05 5.98E-03 3.02E-08 2.67E+05 2.48E-03 9.31E-09
12-08-E06 9.72E+04 5.44E-05 5.60E-10 6.00E+04 2.49E-05 4.15E-10 NB NB NB
12-09-F05 1.33E+05 4.00E-06 3.00E-11 1.30E+05 4.54E-05 3.49E-10 8.46E+04 1.42E-03 1.68E-08
12-10-A06 NB NB NB ND ND ND NB NB NB
12-19-F08 2.29E+05 2.50E-05 1.10E-10 2.22E+05 1.33E-04 6.00E-10 2.45E+05 3.34E-04 1.36E-09
13-05-H06 NB NB NB NB NB NB NB NB NB
13-10-A03 NB NB NB NB NB NB NB NB NB
14-03-B01 2.79E+05 < 1E-06 < 3.58E-12 3.31E+05 4.82E-05 1.46E-10 NB NB NB
14-05-A11 2.26E+05 < 1E-06 < 4.43E-12 2.52E+05 8.46E-05 3.36E-10 NB NB NB
14-06-H08 3.34E+05 9.92E-06 2.97E-11 4.58E+05 3.17E-06 6.92E-12 NB NB NB
14-07-H07 2.50E+05 1.59E-05 6.33E-11 2.70E+05 3.00E-05 1.11E-10 NB NB NB
14-08-E05 2.17E+05 5.98E-05 2.76E-10 2.45E+05 3.79E-05 1.55E-10 NB NB NB
14-11-D07 4.14E+05 1.98E-07 4.78E-13 4.48E+05 < 1E-06 < 2.23E-12 2.23E+05 3.34E-04 1.50E-09
14-13-D08 2.06E+05 < 1E-06 < 4.85E-12 3.07E+05 2.77E-05 9.02E-11 NB NB NB
14-14-E08 5.19E+05 < 1E-06 < 1.93E-12 5.12E+05 1.58E-05 3.08E-11 NB NB NB
14-17-B09 6.77E+05 7.49E-05 1.11E-10 3.53E+05 1.16E-04 3.30E-10 8.08E+04 < 1E-06 <1.24E-11
실시예 6: 인간화된 단일 사슬 Fv 단편물의 조작처리 및 특성화
토끼 항체 클론 14-11-D07의 인간화는 상기 토끼 CDR들을 Vk1/VH3 유형의 누맙의 전매적 scFv 수용체 골격으로 전달하는 것을 포함한다. 이 과정에서, 6 개 CDR 부위의 아미노산 서열을 상기 토끼 항체 제공자 서열 상에, 공개된 바와 같이 (Borras, L. 등 2010. JBC;285:9054-9066), 동정하였고, 및 상기 누맙 수용체 골격 서열로 접합시켰다. 두 개 변이체가 생성되었는데, 여기서 변이체 sc01는 상보성 결정 영역 (CDR)들을 인간 수용체 가변성 도메인 골격상으로 독점적으로 접합하여 얻었고, 변이체 sc02는 인간 골격 서열에 추가의 변이를 포함하고 있다. 상기 두 개 결과된 인간화 scFv들을 인간, 사이노몰거스 및 마우스 유래의 IL23R에 대하여 결합 친화도에 대하여 특성화하였다 (참조 표 3). 상기 두 개 가변체에 대하여 유의한 친화도 차이가 검출되지 않음에 따라, 14-11-D07-sc01를 선택하여 상기 scDb 포맷에서 조작하였는데, 이는 이 변이체에서, 토끼 공여자 골격 서열로부터 인간 수용체 서열까지 어떠한 토끼 아미노산이 접합되지 않았고, 따라서 적용 후 인간에 있어서 항-약물 면역 반응을 야기할 위험을 최소화시키기 때문이다.
　 인간 IL23R 사이노 IL23R 마우스 IL23R
클론 ID
scFv		 ka
[M-1s-1]		 kd
[s-1]		 KD
[M]		 ka
[M-1s-1]		 kd
[s-1]		 KD
[M]		 ka
[M-1s-1]		 kd
[s-1]		 KD
[M]
14-11-D07-sc01 2.24E+06 2.59E-04 1.16E-10 2.92E+06 3.61E-04 1.24E-10 1.89E+06 4.18E-03 2.21E-09
14-11-D07-sc02 1.17E+06 1.13E-04 9.60E-11 1.55E+06 2.05E-04 1.33E-10 8.30E+05 1.39E-03 1.68E-09
실시예 7: 이중특이성 단일 사슬 다이아바디 ( scDb )의 조작처리 및 특성화
8] CD3ε+ T 세포를 재지향하게 하여 IL23R 발현 타겟 세포를 용해하기 위한 목적으로, 소위 단일 사슬 다이아바디 (scDb)의 이중특이성 항체 단편물을 조작처리하였다. PRO165로 명명된 이러한 작제물은 항-IL23R scFv 14-11-D07-sc01의 VH와 VL은 물론, 인간화된 토끼 항-CD3ε 항체 (클론 6)의 VH와 VL을 포함한다. 상기 항-CD3ε 결합 도메인은 a) 인간 CD3ε에 대하여 높은 친화도, b) 사이노몰거스 유래의 CD3ε에 대한 우수한 교차 반응성, c) 뛰어난 안정성과 응집에 대한 내성으로 인하여 및, d) 이러한 CD3ε 결합체가 가교결합시 T 세포를 독점적으로 활성화시키고 - 이는 예를 들어 타겟 세포에 결합 후 발생할 수 있는 - 이럼으로써 T 세포의 비특이적 활성화로 인한 잠재적 부작용에 대한 위험을 최소화시키기 때문에, 선택되었다.
인간, 사이노 및 마우스 IL23R, 및 인간과 마우스 CD3ε에 대한 항-IL23R and 항-CD3ε 결합 분체들 각각의 친화도를 SPR로 측정하였다 (표 4).
　 인간 IL23R 인간 CD3ε
scDb ID kd
[s-1]		 KD
[M]		 KD
[M]		 ka
[M-1s-1]		 kd
[s-1]		 KD
[M]
PRO165 1.26E-03 1.16E-08 1.82E-10 1.09E+05 1.26E-03 1.16E-08
시험된 작제물들의 열적 언폴딩에 대한 전이의 중간점은 차등 스캐닝 형광측정법 (DSF)을, 기본적으로는 Niesen (Niesen 등, Nat Protoc. 2 (2007) 2212-21)에 의해 설명된 바와 같이 사용하여 결정되었다. 상기 DSF 분석법은 qPCR 기기 (예 MX3005p, Agilent Technologies)에서 수행된다. 5x SYPRO 오렌지의 최종 농도를 25 μL의 총 부피에서 포함하는 완충액 (시트릭산염-포스페이트 pH 6.4, 0.25 M NaCl)에 샘플을 희석시켰다. 샘플을 이중으로 측정하였고 온도 증가는 25-96℃로 프로그램화하였다. 형광 신호를 획득하고 원 데이터를 GraphPad Prism (GraphPad Software Inc.; 결과 표 5 참조)으로 분석하였다.
열적 언폴딩에 대한 전이의 중간점을 모든 작제물에 대하여 차등 스캐닝 형광법으로 결정하였다
　 열적 언폴딩
scDb ID 항- IL23R 항-CD3 Tm
PRO165 14-11-D07-sc01 clone 6 65.3
실시예 8: IL23R 발현 세포들의 타겟된 용해
타겟 세포의 특이적 용해를 유도하는 scDb들의 능력을 연구하기 위해, IL23R 발현 세포들을 증가되는 농도의 각각의 scDb 존재 하에서 인간 CD8+ T 세포들과 공배양하였다. scDb 농도에 의존한 세포 용해를 DNA에 삽입된 celltox-green의 형광 강도를 측정함으로써 평가하였다. 각 세포주에 대한 PRO165의 EC50이 표 6에 나타나 있다.
IL23R 결합 분체 특이적 타겟 세포 용해의 EC 50 [nM]
ID 포맷 DLD -1 SW-480 TF -1 CHO
PRO165 scDb 14-11-D07-sc01 45.4 71.7 39.8 무용해
방법:
1. 세포주 상에서의 IL23R 발현 수준의 평가
세포막 상에서의 IL23R 검출을 위해, 살아있는 세포를 5 μg/mL의 비오틴화된 다중클론성 염소 항-IL23R 항체 (R&D Systems, Cat. No.BAF1400)로 염색하였다. 배경 대조군으로서, 다중클론성 염소 IgG 이소타입을 사용하였다 (R&D Systems, Cat. No.BAF108). 다음, 세포에 대한 염소 다중클론성 항체들의 결합은 피코에트린-(PE)-표지 스트렙타비딘 (Southern Biotech, Cat. No. 7100-09S)에 의해 검출되었다. 염색된 세포의 PE 형광 강도는 유세포 측정법으로 측정되었다 (FACS aria III, Becton Dickinson). 세포 당 IL23R 분자들을 정량화하기 위해, 인간 IL-23R Fc 키메라 (R&D Systems, Cat. No.1400-IR-050)가 적재된 항-인간 IgG Quantum™ Simply Cellular® (QSC) 미세구 (Bangs Laboratories, Cat. No. 816)를 참조 표준물로서 사용하였다. 기하 평균에서의 신호 강도를 반영하는, 평균 형광 강도 (MFI)를 염소 IgG 이소타입 대조군은 물론 염소 항-IL23 R 항체 둘 다에 대하여 측정하였다. 상기 특이적 항체 및 이소타입 대조군 항체 사이의 MFI의 차이 (ΔMFI) 를 계산하였다. 정규화된 MFI는 상기 항-IL23R 항체를 사용하여 얻은 MFI를 이디오타입 대조군의 MFI로 나눔으로써 계산되었다. 상기 세포 표면 상의 IL23R 분자를 정량화하기 위해, 세포의 특이적 항체 결합능 (ABC)을 Quantum™ Simply Cellular® (QSC) 미세구를 사용하여 만든 표준 곡선에 각각의 MFI를 회귀시킴으로써 계산하였다. 계산은 롯(lot)-특이성 QuickCal® 주형에서 수행되었다. 비특이적 결합을 비교하기 위해, 음성 대조군 항체로 염색된 세포의 ABC 값을 특이적 항체로 염색된 세포의 ABC 값에서 차감하였다.
2. 배양 상등액에서의 단일클론성 항체들의 결합 역학 및 종별 교차 반응성을 결정하기 위한 SPR 분석법
종류별 상등액에 있는 단일클론성 토끼 항-IL23R 항체들의 결합 친화도를 MASS-1 SPR 장비 (Sierra Sensors)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명법 (SPR)로 측정하였다. 친화도 측정을 위해 (0.05% Tween을 가진 DPBS에서 수행), 토끼 IgGs의 Fc 부위에 특이적인 항체 (Bethyl Laboratories, Cat. No. A120-111A)를 표준 아민-커플링 방식을 사용하여 센서 칩 (SPR-2 Affinity Sensor, Amine, Sierra Sensors)상에 고정시켰다. 고정화 후에, 배양 상등액 내의 토끼 단일클론성 항체들을 상기 항-토끼 IgG 항체로 포획하는 동안 제2 고정된 채널을 대조군으로 사용하여 여기서 상기 포획은 음성 상등액 (분류된 세포를 포함하지 않는 배양 배지)에 의해 대체되었다. 인간 IL23R 세포외 도메인 (ECD) (Trenzyme, Germany에 의해 요청시 생산) 을 90 nM 용량으로 3분간 양쪽 유 세포들에 주입하고 및 상기 센서 칩 상의 포획된 IgG로부터 단백질을 5분간 분리하였다. 유사 방식으로, 사이노몰거스 및 마우스 IL23R ECD (둘 다 90 nM, 요청시 Trenzyme가 생산)에 대한 친화도를 측정하였다. 겉보기 해리 상수 (kd)와 결합 상수 (ka), 및 겉보기 해리 평형 상수 (KD)를 일대일 랭뮤어 결합 모델을 사용하는 MASS-1 분석 소프트웨어 (Analyzer, Sierra Sensors)를 이용하여 계산하였다.
3. 정제된 단일클론성 항체들의 결합 역학 및 종별 교차 반응성을 결정하기 위한 SPR 분석법
정제된 단일클론성 토끼 항-IL23R 항체들의 결합 친화도를, 상기 종류별 상등액을 정제된IgG들로 대체한 것을 제외하고는, 종류별 상등액에서와 유사한 구성으로 측정하였다. 센서 칩 (SPR-2 Affinity Sensor, High Capacity Amine, Sierra Sensors)를 동일한 방식으로 고정하고, 및 0.5 μg/ml의 농도 (HEPES 실행 완충액에서 희석: 0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.05 % Tween)로 있는 정제된 단일클론성 항체들을 상기 항-토끼 IgG 항체로 포획하였다. 어떠한 포획도 고정된 대조군 채널 상에서 이뤄지지 않았다. 90에서 2.81 nM 로의 인간 IL23R 세포 외 도메인의 두 배씩 연속 희석한 액체를 유세포로 3분간 주입하고 및 상기 센서 칩 상의 포획된 IgG로부터 단백질을 5분간 해리시켰다. 각 주입 사이클마다, 10 mM 글리신-HCl pH 1.5를 1분간 단일 주사하여 표면을 재생하였다. 유사한 방식으로, 사이노몰거스 및 마우스 IL23R ECD에 대한 친화도를 측정하였다. 겉보기 해리 상수 (kd)와 결합 상수 (ka), 및 겉보기 해리 평형 상수 (KD)를 일대일 랭뮤어 결합 모델을 사용하는 MASS-1 분석 소프트웨어 (Analyzer, Sierra Sensors)를 이용하여 계산하였다.
4. 항- IL23R scFv들의 결합 역학 및 종별 교차 반응성을 결정하기 위한 SPR 분석법
항-IL23R scFv들의 결합 친화도를 MASS-1 SPR 장비 (Sierra Sensors)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명법 (SPR)로 측정하였다. 친화도 측정을 위해 (HEPES 실행 완충액에서 수행: 0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween), 인간 IgG들의 Fc 부위에 특이적인 항체 (Bethyl Laboratories, Cat. No. A80-104A) 를 표준 아민-커플링 방식을 사용하여 센서 칩 (SPR-2 Affinity Sensor, Amine, Sierra Sensors)상에 고정시켰다. 고정화 후에, 1 ug/ml 재조합 인간 IL23R Fc 키메라 (R&D Systems, Cat. No. 1400-IR-050) 를 상기 항-인간 IgG 항체로 포획하는 동안 제2 고정된 채널을 대조군으로 사용하여 여기서 상기 포획은 완충액으로 대체되었다. 180 에서 2.81 nM로의 인간 scFv들의 두 배씩 연속 희석한 액체를 유세포로 3 분간 주입하고 및 상기 센서 칩 상의 키메라로부터 scFv들을 700초 해리시켰다. 각 주입 사이클마다, 10 mM 글리신-HCl pH 1.5를 1 분간 단일 주사하여 표면을 재생하였다. 유사한 방식으로, 사이노몰거스 및 마우스 IL23R Fc 키메라 (R&D Systems, Cat. No. 1686-MR-050)에 대한 친화도를 측정하였다. 겉보기 해리 상수 (kd)와 결합 상수 (ka), 및 겉보기 해리 평형 상수 (KD)를 일대일 랭뮤어 결합 모델을 사용하는 MASS-1 분석 소프트웨어 (Analyzer, Sierra Sensors)를 이용하여 계산하였다.
5. 항-CD3 x IL23R scDb들의 결합 역학 및 종별 교차 반응성을 결정하기 위한 SPR 분석법
항-CD3 x IL23R scDb들의 결합 친화도를 MASS-1 SPR 장비 (Sierra Sensors)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명법 (SPR)로 측정하였다. CD3에 대한 친화도 측정을 위해 (HEPES 실행 완충액에서 수행: 0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween), 인간 이종이량성 단일 사슬 CD3γδ 세포외 도메인 (자체 생성)을 표준 아민-커플링 방식을 사용하여 센서 칩 (SPR-2 Affinity Sensor High Capacity Amine, Sierra Sensors) 상에 고정시켰다. 90 에서 0.123 nM로의 scDb들의 세 배씩 연속 희석한 액체를 유세포로 3 분간 주입하고 및 상기 센서 칩 상의 고정된 CD3γδ로부터 단백질을 700초 해리시켰다. 각 주입 사이클마다, 10 mM 글리신-HCl pH 2.0를 1분간 단일 주사하여 표면을 재생하였다. 유사한 방식으로, 사이노몰거스 CD3γδ (자체 생성) 및 마우스 CD3δε (Sino Biologicals Inc., Cat. No. CT033-M2508H) 에 대한 친화도를 측정하였다.
IL23R에 대한 친화도 측정을 위해, 인간 IL23R 세포외 도메인 (요청시 Trenzyme에 의해 생성)을 표준 아민-커플링 방식을 사용하여 센서 칩 (SPR-2 Affinity Sensor High Capacity Amine, Sierra Sensors) 상에 고정시켰다. 90 에서 5.6 nM로의 scDb들의 두 배씩 연속 희석한 액체를 유세포로 3 분간 주입하고 및 상기 센서 칩 상의 고정된 IL23R 로부터 단백질을 700초 해리시켰다. 각 주입 사이클마다, 10 mM 글리신-HCl pH 2.0를 1 분간 단일 주사하여 표면을 재생하였다. 겉보기 해리 상수 (kd)와 결합 상수 (ka), 및 겉보기 해리 평형 상수 (KD)를 일대일 랭뮤어 결합 모델을 사용하는 MASS-1 분석 소프트웨어 (Analyzer, Sierra Sensors)를 이용하여 계산하였다.
6. 세포독성 T 세포에 의한 IL-23R 발현 세포의 scDb 매개 용해
타겟 세포 용해를 유도하는 이중특이성 항-CD3 x IL-23R scDb들의 능력을 평가하기 위해, 인간 IL-23R 발현 세포주를 사용하였다. 결장암종 DLD-1 또는 SW480, 및 적백혈병 TF-1를 타겟 세포주로서 사용하였다. 전술한 바와 같이 분리된 자극되지 않은 인간 CD8+ T-세포들을 주효 세포로서 사용하였다. 타겟 세포들에 cell tox green 염료 (Promega)를 제작사 방침대로 표지하였다. 세포 용해는 CellTox™ green 세포독성 분석법 (Promega)으로 모니터하였다. 상기 분석법은 세포 사멸의 결과로서 일어나는 막 온전성에서의 변화를 측정한다. 상기 분석법은 생 세포에서는 배제되나 죽은 세포 DNA를 우선적으로 염색하는 비대칭적 시아닌 염료를 사용한다. 상기 염료가 축소된 세포에서 DNA와 결합할 때, 이의 형광 특성이 실질적으로 강화된다. 살은 세포는 형광에서 감지할 수 있는 증가를 나타내지 않는다. 따라서, 죽은 세포 DNA와 결합 상호작용으로 생성된 형광 신호는 독성과 비례한다. 전술한 바와 유사하게, 표지된 IL-23R 세포 (5'000개 세포/웰)을 CD8+ 세포독성 T-세포와 같이 40:1의 주효세포:타겟 세포 비율로 3-배 연속 희석된 scDb들 (출발 농도180 nM)의 존재하에서 96 웰 마이크로적정 플레이트에서 배양하였다. 타겟을 발현하지 않는 세포의 비특이적 용해를 산정하기 위해, T-세포를 표지된 야생형 CHO 세포와 공배양하였다. 48시간 배양 후, 다중모드 마이크로플레이터 판독기 (FlexStation 3, Molecular Devices)를 사용하여 형광 강도를 분석하였다. SoftMax® Pro data analysis Software (Molecular Devices)를 사용하여 4-파라미터 로지스틱 곡선 추정으로 데이터를 분석하였고, 및 타겟 세포 용해의 최대 절반을 유도하는 데 필요한 scDb 의 몰농도(EC50) 를 투여량-반응 곡선으로부터 유도하였다.
타겟 세포의 운명을 특이적으로 추적하기 위해, 타겟 세포를 CellVue® Claret Far Red Fluorescent (Sigma-Aldrich, Cat.No.MINCLARET-1KT)으로 5nM 염료 농도에서 제조사 지침대로 염색하였다. 어팝토시스/괴사는 Annexin V Apoptosis Detection Kit FITC (eBioscience, Cat.No.88-8005-74)를 제조사 지침대로 사용하여 (염료의 농도: 100 μL/mL Annexin V and 2 μg/mL 요오드화 프로피디움) 모니터하였다. 염색된 IL-23R 세포 (5'000개 세포/웰)를 CD8+ 세포독성 T-세포와 같이, 40:1의 주효세포:타겟 세포 비율로 연속 희석된 scDb들 (출발 농도180 nM)의 존재하에서 96 웰 마이크로적정 플레이트에서 배양하였다. 타겟을 발현하지 않는 세포의 비특이적 용해를 산정하기 위해, T-세포를 표지된 CHO 세포와 공배양하였다. 48 시간 배양 후, 유세포 분석기 (FACS aria III, Becton Dickinson)를 사용하여 형광 강도를 분석하였다. 적외선 형광염료 (CellVue® Claret Far Red Fluorescent)를 사용하여 타겟을 주효세포로부터 분별하여 데이터를 분석하였다. 타겟 세포들을 Annexin V and PI 형광에 의해, 생세포 및 초기-/후기-단계 어팝토시스성, 괴사성 세포로 분류하였다. SoftMax® Pro data analysis Software (Molecular Devices)를 사용하여 4-파라미터 로지스틱 곡선 추정으로 데이터를 분석하였고, 및 타겟 세포 용해의 최대 절반을 유도하는 데 필요한 scDb 의 몰농도(EC50) 를 투여량-반응 곡선으로부터 유도하였다.
7. 작제물 설계 및 scDb 작제물들의 제조
*상기 가변성 도메인들을 VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA 구성으로 정렬함으로써 상기 단일 사슬 다이아바디 작제물들을 설계하였다. 이러한 작제물들에서, VLA 및 VHA 도메인들은 연합하여 IL23R에 대한 결합 부위를 형성하는 반면 VLB 및 VHB 도메인들은 연합하여 CD3ε에 대한 결합부위를 형성한다. 상기 가변성 도메인들을 연결하는 펩타이드 링커 L1-L3은 글리신/세린 반복물로 제조된다. 두 개의 짧은 링커 L1 및 L3은 단일 G4S 반복체로 구성되고 긴 링커 L2는 (G4S)4 서열로 구성된다. 다양한 항-IL23R x CDE3ε scDb 작제물들을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 처음부터 새로이 합성되었고 E.coli 발현에 적응된 벡터로서, pET26b(+) 근간(Novagen)에 바탕을 둔 벡터에 클론하였다
상기 발현 작제물을 E.coli 균주 BL12 (DE3) (Novagen)로 형질전환시키고 그 세포를 초기 배양물로서 2YT 배지 (Sambrook, J., 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual) 에서 배양하였다. 발현 배양물을 접종하고 플라스크에서 37℃에서 200 rpm로 진탕배양하였다. OD600 nm가 1에 달하면, IPTG를 0.5 mM의 최종 농도로 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 밤새 발현한 후, 4000 g에서 원심분리하여 세포를 수집하였다. 봉입체 제조를 위해, 세포 펠렛을 IB 재현탁 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-100)에 재현탁하였다. 세포 슬러리에 1 mM DTT, 0.1 mg/mL 라이소자임, 10 mM 류펩틴, 100 μM PMSF 및 1 μM 펩스타틴을 보충하였다. 세포를 얼음에 냉각하는 동안 3번의 초음파 균질화로 세포를 용해하였다. 다음, 0.01 mg/mL DNAse 를 첨가하고 균질화물을 실온에서 20분간 처리하였다. 봉입체를 15000 g 및 4℃에서 원심분리하여 침전시켰다. 상기 IB들을 IB 재현탁 완충액에 재현탁시키고 초음파로 균질화한 후 다시 원심분리하였다. IB 재현탁 완충액으로 총 최소 3 세척한 후, IB 세척 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA) 을 사용하여 2 번 세척하여 최종 IB들을 얻었다.
단백질 리폴딩을 위해, 상기 분리된 IB들은 가용화 완충액 (100 mM Tris/HCl pH 8.0, 6 M Gdn-HCl, 2 mM EDTA) 에 습윤 IB의 그람당 5 mL의 비율로 재현탁되었다. 상기 가용화 혼합물을, DTT 가 최종 20 mM의 농도로 첨가될 때까지 실온에서 30분간 항온처리하고, 및 추가 30분을 더 항온처리하였다. 가용화가 완수된 후, 그 용액을 21500 g 및 4℃에서 10분간 원심분리하여 맑게 하였다. 상기 가용화된 단백질을 리폴딩 완충액 (전형적으로: 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 5.0 M 우레아, 5 mM 시스테인,1 mM 시스틴)에 최종 0.3 g/L의 단백질 농도로 신속히 희석시킴으로써 리폴딩을 수행하였다. 상기 리폴딩 반응은 통상 최소 14 시간 처리하였다. 결과된 단백질 용액을 8500 g 및 4℃에서 10분간 원심분리하여 맑게 하였다. 상기 리폴딩된 단백질를 Capto L 레진 상(GE Healthcare) 에서의 친화성 크로마토그래피 한 후, Superdex 75 컬럼 상(GE Healthcare)에서 크기 배제 크로마토그래피하여 정제하였다. 상기 단백질을 천연 완충액 (50 mM 시트르산 염-포스페이트 pH 6.4, 150 mM NaCl)에서 제형하였다. 분리된 단량체 분획물을 순도에 대하여는 크기 배제 HPLC, SDS-PAGE로 및 단백질 함량에 대하여는 UV/Vis 분광분석법으로 분석하였다.
서열목록 프리텍스트 - PRO165에 대한 서열 목록: VLA -L1- VHB -L2- VLB -L3- VHA
서열번호 타입 서열
1 링커 L1 GGGGS
2 링커 L2 GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS
링커 L3 GGGGS
3 VL
항- IL23R
14-11-D07- sc01 		DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIYSFLAWYQQKPGKAPKLLIYSASKLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNRYSNPDIYNVFGQGTKLTVLG
4 VH
항- IL23R
14-11-D07- sc01 		EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDFNSNYYMCWVRQAPGKGLEWIGCIYVGSHVNTYYANWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCATSGSSVLYFKFWGQGTLVTVSS
5 VL
항-CD3
clone 6 		DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYNNKRLSWYQQKPGKAPKLLIYTASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGEFTCSNADCFTFGQGTKLTVLG
6 VH
항-CD3
클론 6 		EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPLSSYAMIWVRQAPGKGLEWIGMILRAGNIYYASWVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHYNREGYPIGIGDLWGQGTLVTVSS
7 PRO165 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIYSFLAWYQQKPGKAPKLLIYSASKLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNRYSNPDIYNVFGQGTKLTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPLSSYAMIWVRQAPGKGLEWIGMILRAGNIYYASWVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHYNREGYPIGIGDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYNNKRLSWYQQKPGKAPKLLIYTASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGEFTCSNADCFTFGQGTKLTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDFNSNYYMCWVRQAPGKGLEWIGCIYVGSHVNTYYANWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCATSGSSVLYFKFWGQGTLVTVSS
<110> Numab AG <120> Bispecific Constructs and Their Use in the Treatment of Various Diseases <130> IPP-2015-0004-EP <150> EP 13002500.0 <151> 2013-05-10 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide linker <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide linker <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL anti-IL23R 14-11-D07-sc01 <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn 85 90 95 Pro Asp Ile Tyr Asn Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 Gly <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH anti-IL23R 14-11-D07-sc01 <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Ser Asn 20 25 30 Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr Phe Lys Phe Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL anti-CD3 clone 6 <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Lys Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Thr Cys 85 90 95 Ser Asn Ala Asp Cys Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 110 Leu Gly <210> 6 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH anti-CD3 clone 6 <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Leu Arg Ala Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Arg His Tyr Asn Arg Glu Gly Tyr Pro Ile Gly Ile Gly Asp Leu 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 501 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRO165 <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn 85 90 95 Pro Asp Ile Tyr Asn Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 130 135 140 Phe Pro Leu Ser Ser Tyr Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 145 150 155 160 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile Leu Arg Ala Gly Asn Ile Tyr 165 170 175 Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 180 185 190 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 195 200 205 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Tyr Asn Arg Glu Gly Tyr Pro 210 215 220 Ile Gly Ile Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 260 265 270 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu 275 280 285 Ser Val Tyr Asn Asn Lys Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 290 295 300 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly 305 310 315 320 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 325 330 335 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 340 345 350 Gly Glu Phe Thr Cys Ser Asn Ala Asp Cys Phe Thr Phe Gly Gln Gly 355 360 365 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 370 375 380 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 385 390 395 400 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Ser Asn Tyr Tyr Met Cys 405 410 415 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile 420 425 430 Tyr Val Gly Ser His Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 435 440 445 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 450 455 460 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr 465 470 475 480 Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr Phe Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu 485 490 495 Val Thr Val Ser Ser 500

Claims (18)

  1. IL23R-발현 종양 세포을 위시한 암의 치료에 사용하는, 적어도 하나의 제1 결합 분체 및 적어도 하나의 제2 결합 분체를 포함하는 이중특이성 작제물로서, 상기 제1 결합 분체는 세포독성적 주효 T (Tc) 세포 상에 존재하는 제1 항원에 결합하고, 및 상기 제2 결합 분체는 IL-23 수용체 특이적 서브유닛 (IL23R)에 특이적으로 결합하는 이중특이성 작제물.
  2. 적어도 하나의 제1 결합 분체 및 적어도 하나의 제2 결합 분체를 포함하는 이중특이성 작제물로서, 상기 제1 결합 분체는 세포독성적 주효 T (Tc) 세포 상에 존재하는 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 및 상기 제2 결합 분체는 타겟 세포의 표면에 존재하는 IL-23 수용체 특이성 서브유닛 (IL23R)에 특이적으로 결합하는, 구체적으로는 상기 타겟 세포는 병원성 세포, 구체적으로 IL-17 생성 T 세포 (Th17 세포), γδ T 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 불변 자연 살해 (iNK) 세포 및 IL23R 발현 종양 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포, 더 구체적으로 Th17 세포 또는 γδ T 세포 또는 IL23R 발현 종양 세포인 이중특이성 작제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제1 결합 분체는 CD3 및 CD28로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이성 작제물.
  4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 결합 분체는 CD3에, 구체적으로 CD3의 입실론 사슬(CD3ε)에, 더 구체적으로 CD3ε의 작동성 (agnoistic) 에피토프에 특이적으로 결합하는 이중특이성 작제물.
  5. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 작제물은 Tc 세포에 의한 상기 타겟 세포의 효과적인 살해를 허용하고 및/또는 상기 Tc 세포는 자극되거나 비자극된 Tc 세포인 이중특이성 작제물.
  6. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 항원을 인식하는 상기 제1 결합 분체의 부분 및 상기 제2 항원을 인식하는 제2 결합 분체의 부분이, 상기 이중특이성 작제물의 중앙부에 비하여, 본질적으로 반대 방향으로 돌출되는 방식으로 상기 제1 및 제2 결합 분체들이 서로 상대에 대하여 배열되는 구조를 가지는 이중 특이성 작제물
  7. 제1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 결합 분체 및/또는 상기 제2 결합 분체는 항체-기반 결합 분체, 구체적으로 중쇄 가변 도메인 (VH) 또는 이의 결합 단편물을 포함하는 항체-기반 결합 분체, 더욱 구체적으로 중쇄 가변 도메인 (VH) 또는 이의 결합 단편물 및 경쇄 가변 도메인 (VL) 또는 이의 결합 단편물을 포함하는 항체-기반 결합 분체인, 이중특이성 작제물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 이중특이성 작제물은 bsAb, BslAb, Bs2Ab, Bs3Ab, TslAb, Ts2Ab, 및 노브-인투-홀 (KiHs) 및 듀오바디들을 위시한 단일 사슬 다이아바디 (scDb), 탠덤 scDb (Tandab), 선형 이량성 scDb (LD-scDb), 환형 이량성 scDb (CD-scDb), 이중특이성 T-세포 인게이저 (BiTE; 탠덤 di-scFv), 탠덤 tri-scFv, 트리(아)바디, 이중특이성 Fab2, di-미니항체, 테트라바디, scFv-Fc-scFv 융합체, di-다이아바디, DVD-Ig, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, IgG-scFv 융합체로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체 형식, 구체적으로 단일 사슬 다이아바디 (scDb), 및 더 구체적으로 이중특이성 단량체성 scDb 항체형식인 이중특이성 작제물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 이중특이성 scDb는 두 개의 가변 중쇄 도메인들 (VH) 또는 이의 단편물들 및 두 개 가변 경쇄 도메인 (VL) 또는 이의 단편물들이 링커 L1, L2 및 L3에 의해 VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA, VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA, VLA-L1- VLB-L2-VHB-L3-VHA, VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA, VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB, VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB, VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB 또는 VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB의 순서로 연결된 것을 포함하며, 여기서VLA 및VHA 도메인들은 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 함께 형성하고, 및 VLB 및 VHB는 IL23R대한 항원 결합 부위를 함께 형성하며, 구체적으로 링커 L1은 2-10개 아미노산들의 펩타이드이고, 링커 L3은 1-10 개 아미노산들의 펩타이드이고 및 링커 L2는 10-40 개 아미노산들의 펩타이드인, 이중특이성 작제물.
  10. 제1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이중특이성 작제물은 PRO165 (서열번호 7), 또는 PRO165의 기능적 활성 변이체인, 이중특이성 작제물.
  11. 제1항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 작제물을 암호화하는 핵산 또는 핵산들.
  12. 제11항에 따른 핵산 또는 핵산들을 포함하는 벡터 또는 벡터들.
  13. 제12항에 따른 벡터 또는 벡터들을 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포들.
  14. 제1항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 작제물을 제조하는 방법으로서,
    (i) 제11항에 따른 핵산 또는 핵산들, 또는 제12항에 따른 벡터나 벡터들을 제공하고, 상기 핵산 또는 핵산들 또는 상기 벡터나 벡터들을 발현시키고, 및 상기 이중특이성 작제물을 발현 시스템으로부터 수집하는 것, 또는 (ii) 제13항에 따른 숙주 세포나 숙주 세포들을 제공하고, 상기 숙주 세포나 숙주 세포들을 배양하고, 및 상기 이중특이성 작제물을 상기 세포 배양물로부터 수집하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 작제물 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
  16. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    염증성 및/또는 자가면역 질환의 치료에, 구체적으로 인간환자의 치료에 사용하는 것으로서, 상기 염증성 및/또는 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선성 관절염, 궤양성 대장염, 크론병, 전신 홍반성 루프스, 연소자형 당뇨병, 자가면역 포도막염, 다발성 경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 허혈-재관류 손상으로 구성되는 군으로부터 선택되는 이중특이성 작제물.
  17. 제1항에 있어서,
    인간 환자의 치료에 사용하는 것으로서, 구체적으로 상기 암은 대장암, 폐암, 비인두암, 경구암, 식도암, 췌장암, B-세포 임파종, 및 성인 T-세포 임파종 백혈병 (ATLL), 급성 골수 임파종 (AML), 미만형 B-세포 임파종 (DLBCL), 여포형 임파종 (FL), 소아성 급성 림프구성 임파종 (B-ALL), 혈관면역모세포성 T-세포 임파종 (AITL), 미분화 대-세포 임파종 (ALCL), T-/자연 살해-세포 임파종, 및 말초 T-세포 임파종 (PTCL)을 포함하는 T-세포 임파종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 이중특이성 작제물.
  18. 제17항에 있어서 상기 인간 환자는 높은 Th17 반응을 가지는 환자인 이중특이성 작제물.
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