JP2016514676A

JP2016514676A - 四価二重特異性抗体

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Publication number: JP2016514676A
Application number: JP2016502882A
Authority: JP
Inventors: ミンロキン; エー．イー．ジズルスパーガーノラ
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2016-05-23
Also published as: EP2970485A1; KR20150130349A; US20160009824A1; HK1217958A1; CA2903056A1; WO2014144357A1; BR112015021921A2; AU2014227638A1; MX2015012059A; RU2015144098A; CN105189557A

Abstract

本発明は、四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）、該抗体を作製する方法、並びに該抗体をがん又は免疫疾患の診断及び治療に使用する方法に関する。ＴｅｔＢｉＡｂは、抗体のＣ末端に結合された第二の抗原特異性をもつＦａｂ断片の第二の対を特徴とし、したがって２つの抗原特異性の各々について二価である分子を提供する。該四価抗体は、抗体重鎖をそれと同種の共発現されたＦａｂ重鎖と結合するＦａｂ軽鎖に共有結合的に連結することによって遺伝子工学的な方法によって作製される。【選択図】図１Ｂ

Description

関連出願の参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９３，１５３号に基づく優先権の利益を主張するものであり、該仮出願の完全な開示は参照により本明細書に援用される。

本発明は、四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）、該抗体を作製する方法、並びに該抗体をがん又は免疫疾患の治療及び診断に使用する方法に関する。

規制上の理由や商業的な理由から、抗体工学における近年の技術の進歩が二重特異性アプローチを用いて重点的に取り組んできたのは、（１）腫瘍細胞のリダイレクト溶解にエフェクター細胞を関与させること、（２）結合アビディティー及び標的の特異性を増加させること、又は（３）２つの薬物候補を１つに合わせることである。第一の方法では、リダイレクト溶解のための、ＣＤ３（Baeuerle et al, Cancer Res. 69:4941, 2009）、ＣＤ１６（Weiner et al, Cancer Immunol. Immunother. 45:190, 1997）、又はＣＤ６４（Graziano et al, Cancer Immunol. Immunother. 45:124, 1997）の結合を通した、疾患を引き起こす細胞とエフェクター細胞との架橋として二重特異性抗体は作用する。第二の方法では、普通の結合親和性をもつ２つの抗体を合わせて、二重パラト−プ（同じ標的抗原の２つの別個のエピトープに結合する）又は二重特異性（同じ標的細胞の２つの異なる抗原に結合する）抗体にすることによってそれぞれ標的又は標的細胞の選択性を大幅に増加できる。第三の方法は、２つの可溶性サイトカインの同時結合（Mabry et al, Protein Eng. Des. & Sel. 23:115, 2010; Wu et al, Nature Biotech. 25:1290, 2007）によって例示され、適切な疾患状態での二重標的の潜在的な相乗効果を利用する。ＩｇＧは可変領域を通して優れた結合特異性をもたらすのにくわえて、エフェクター機能や非常に長い血中半減期を有するため、二重特異性抗体の設計に好ましい骨格であることが多い。

Ｆａｂフォーマットでは、遊離軽鎖とその同種重鎖のみとの特異的な対形成を導くことができる既存技術がないために異なる抗原特異性の遊離軽鎖は重鎖とランダムに対形成する。そのため現在の二重特異性抗体技術は大抵、各ＶＨ（重鎖の可変領域）がその同種ＶＬ（軽鎖の可変領域）に共有結合するｓｃＦｖ（可変領域の単鎖断片）フォーマット（Coloma and Morrison, Nature Biotechnol. 15:159, 1997; Lu et al, J. Biol. Chem. 280:19665, 2005）に依存する。しかし、結合親和力が失われる可能性や、タンパク質の凝集、安定性に乏しいこと、産生レベルが低いことに起因して、単鎖抗体の発現は技術的に簡単ではない場合が多い（Demarest et al, Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11:675, 2008; Michaelson et al, mAbs 1:2, 128-141, 2009）。とりわけ、出発抗体が、（ファージディスプレイライブラリー由来の単鎖抗体とは対照的に）単鎖抗体に作り変える必要のあるハイブリドーマ由来である場合に当てはまる。他方では、ファージから単離されたｓｃＦｖ’ｓは、哺乳類細胞での発現が悪いことが多い。

数種の革新的な技術により、ほぼ排他的なＦｃヘテロ二量体の構築が可能になり、二重特異性を設計する骨格が提供されている。例えば、ノブ・イントゥー・ホール（knob-in-hole）（Ridgway et al, Protein Eng. 9:617, 1996）、静電ステアリング（electrostatic steering）（Gunasekaran et al, J. Biol. Chem. 285:19637, 2010）や、ストランド−エクスチェンジエンジニアリングドメイン（strand-exchange engineering domain）（ＳＥＥＤ）（Davis, Protein Eng. Des. & Sel. 23:195, 2010）がある。しかし、天然の重鎖−軽鎖Ｆａｂフォーマットに依存する二重特異性抗体の改変を可能にすると思われる、遊離軽鎖がその同種重鎖とのみ特異的に対形成することを導くことができる既存の技術は未だない。ｓｃＦｖフォーマットには前述の問題があるので、２つの異なるＦａｂ’ｓに共通の軽鎖をスクリーニングしたり（Merchant et al, Nature Biotechnol. 16:677, 1998）、単一の可変領域を使用して完全に軽鎖に使用を避ける（Shen et al, J. Immunol. Methods 318:65, 2007）技術が幾つか存在する。

二重可変領域（Dual Variable Domains）（ＤＶＤ）−Ｉｇ方法では、第二の抗体のＶＬ及びＶＨが、柔軟なリンカーを介して第一の抗体軽鎖及び重鎖それぞれのＮ末端に融合され、外（outer）ＶＤ及び内（inner）ＶＤ（Wu et al、前掲論文）と呼ばれる縦一列の２つの可変領域（ＶＤ）を創る。外ＶＤが内ＶＤリガンド結合部位に近接することで生ずる立体障害に起因して、利用可能な多くのモノクローナル抗体からのＶＤの選択、ＶＤの配位、及びリンカー設計に係わる、そのほとんどが経験的に決定しなければならない膨大な最適化が、内ＶＤの結合親和力を保持するのに必要とされる（DiGiammarino et al, Methods Mol. Biol. 899:145, 2012）。

別の方法は、ラット／マウスクアドローマでの選択的種限定重鎖及び軽鎖対形成（preferential species-restricted heavy and light chain pairing）（Lindhofer et al, J. Immunol. 155:219, 1995）を利用する。しかし、生成された二重特異性抗体はラット／マウス抗体であり、治療薬として免疫原性にかかわる問題があるのは明らかである。

Ｃｒｏｓｓｍａｂ法は、ノブ・イントゥー・ホール（knob-in-hole）ヘテロ二量体化重鎖に基づき、くわえて二重特異性ＩｇＧ抗体を作製する一般的方法として免疫グロブリン領域交差（mmunoglobulin domain crossover）を用いる（Schaefer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:1 1 187, 2011）。それでもなお、Ｈ鎖ヘテロ二量体と同種Ｆｖ’ｓの正しい対形成は排他的ではなく、不要な副産物を精製中に取り除く必要がある。

Ｃｒｏｓｓｍａｂ法の拡張が使用されて、ＦａｂとＣｒｏｓｓｍａｂＦａｂ断片の追加セットをＣｒｏｓｓｍａｂのＣ末端につけることによって四価二重特異性抗体を生成された（Regula et al、米国特許出願公開第２０１０／０３２２，９３４号明細書）。依然としてＨ鎖ヘテロ二量体と同種Ｆｖ’ｓの排他的に正しい対形成を得るという課題は残る。

二重特異性に対する方法は、２つの異なる抗原を標的とする単一結合部位を使用することであり、「ツー・イン・ワン（two-in-one）」抗体で実際に示された。そのような「ツー・イン・ワン（two-in-one）」抗体の１つは抗体ハーセプチンの異型であり、Ｈｅｒ２とＶＥＧＦの両方に相互作用する（Bostrom et al, Science 323:1610, 2009）。この方法は同一のフォーマットを正常ＩｇＧとして有する二重特異性抗体を提供するので臨床への適用にとっては魅力的である。しかし、そのような異型のスクリーニングは非常に多くの労力を要し、目的の両抗原に結合できる単一結合部位が得られる保証はない。

Ｆａｂ断片に単一セットに基づく１つの特異性のみをもつ安定した多価抗体は、米国特許出願公開第２０１１／００７６７２２号明細書に記載された。別の技術はドック・アンド・ロック（Dock-and-Lock）領域を使用し、予め成形された異なる特異性のＦａｂ断片を抗体に連結して六価二重特異性抗体を形成する（Rossi et al, Cancer Res. 68:8384, 2008）。

圧倒的多数の抗体（すなわち、起源が通常のマウス、ラット、及びウサギ、又はトランスジェニックの（ヒト化された）マウス若しくはラット、又は患者かどうかにかかわらず、ハイブリドーマ、Ｆａｂライブラリー、及びＢ細胞クローニングから生成されたもの）は、その同種重鎖と対形成された遊離軽鎖を有するので、ランダム軽鎖対形成の問題を回避する、二重特異性抗体のためのＦａｂをベースとする技術が緊急に必要とされる。そのような技術は、２つの既存の抗体から簡単、効率的に二重特異性抗体を作製することを促進すると思われ、第一に、汎用性のあるツール分子として使用されて二重標的の相乗効果の可能性を探ることができ、第二に、治療薬として使用されて治療の対象となる疾患状態において完全抗体という状況で二重標的を有効に生かすことができる。

本発明は四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）を特徴とする。本発明の一般的な実施形態では、抗体はそのＣ末端でＦａｂ軽鎖によってＦａｂに連結された抗体Ｆｃ領域を含む。ＴｅｔＢｉＡｂの１つの実施形態では、抗体はそのＣ末端でＦａｂ軽鎖によって第二の結合特異性をもつＦａｂ第二の対と共有結合され、連結されたＦａｂ軽鎖は遊離同種Ｆａｂ重鎖と対形成する。逆に、Ｆａｂ重鎖は、抗体のＮ末端で、従来通り同種遊離軽鎖と対形成する。結果として得られる抗体はその結合特異性各々について二価である。ＴｅｔＢｉＡｂ中のポリペプチド鎖の配置は図１Ｂに模式的に示される。

ＴｅｔＢｉＡｂの代替的な実施形態では、抗体Ｆｃ領域はそのＮ末端でＦａｂ軽鎖によって第一の特異性をもつＦａｂに連結され、連結されたＦａｂ軽鎖は遊離同種Ｆａｂ重鎖と対形成し、それにくわえて、抗体Ｆｃ領域はそのＣ末端でＦａｂ重鎖によって第二の特異性をもつＦａｂに連結される。連結されたＦａｂ重鎖は、抗体のＮ末端で、従来通り同種遊離軽鎖と対形成する。やはり、結果として得られる抗体はその結合特異性各々について二価である。代替ＴｅｔＢｉＡｂ中のポリペプチド鎖の配置は図１Ｄに模式的に示される。

よって本発明の１つの実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂは、（ｉ）第一の抗体の抗体重鎖を含む第一のポリペプチド（ここで、該重鎖は第一の抗体の可変領域及び定常領域（ＶＨ（１）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含み、該重鎖はそのＣ末端において直接的又は間接的にペプチド結合によって第二の抗体の抗体軽鎖のＮ末端に連結され、該軽鎖は第二の抗体の可変及び定常領域（ＶＬ（２）−ＣＬ）を含む）；（ｉｉ）第一の抗体の抗体軽鎖を含む第二のポリペプチド（ここで第一の抗体の該軽鎖は可変及び定常領域（ＶＬ（１）−ＣＬ）を含む）；並びに（ｉｉｉ）ＣＨ２及びＣＨ３定常領域を欠く第二の抗体のＦａｂ重鎖（ＶＨ（２）−ＣＨ１）を含む第三のポリペプチドを含み、
第一及び第二の抗体が異なる結合特異性を有する、すなわち、抗体が別個のエピトープに特異的に結合することが理解される。これらのポリペプチドは完全四価二重特異性抗体を構築する。

本発明のさらなる実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂの第一のポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｌ）−ＶＬ（２）−ＣＬ）は、重鎖定常領域のＣ末端を軽鎖可変領域のＮ末端の機能的に連結するリンカーを更に含む。１つの実施形態では、リンカーはアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_n（配列番号６）を有し、ｎは１〜１０の整数である。いっそうさらなる実施形態では、リンカーはｎが４の（ＧＧＧＧＳ）_nである。

本発明のさらなる実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂの前記第一のポリペプチドの重鎖定常領域はＩｇＧ定常領域である。

本発明のさらなる実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂの前記第一のポリペプチドはＣＨ２領域を欠く。

本発明のさらなる実施形態では、第三のポリペプチド、（ＶＨ（２）−ＣＨ１）はそのＣ末端に配列ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）を有する上部ヒンジ領域を含む。

本発明の別の態様では、ＴｅｔＢｉＡｂを形成するポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ分子が提供される。１つの実施形態では、第一のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子が提供され、該ＤＮＡ配列は随意のリンカーを介して第二の抗体（ＶＬ（２）−ＣＬ）の軽鎖に遺伝子組換えで融合された第一の抗体（ＶＨ（１）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）の重鎖をコードし、ＶＨ（１）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−（随意のリンカー）−ＶＬ（２）−ＣＬをコードする配列を提供する。さらなる実施形態では、第一のＤＮＡ配列に第二のＤＮＡ配列がさらに提供され、第二の配列は第一の抗体（ＶＬ（１）−ＣＬ）の軽鎖をコードする。さらなる実施形態では、第三のＤＮＡ配列がさらに提供され、第三の配列は第二の抗体（ＶＨ（２）−ＣＨ１）のＦａｂ重鎖をコードし、随意にアミノ酸配列ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）を有するヒンジ領域をコードするさらなる配列に連結される。さらなる実施形態では、第一、第二、又は第三のＤＮＡ配列の少なくとも１つは別のＤＮＡ分子に含まれる。

本発明の別の実施形態では、第一、第二、及び第三遺伝子構築物を含むＤＮＡ分子が提供され、該第一構築物は随意のリンカーを介して第二の抗体の軽鎖（ＶＬ（２）−ＣＬ）に遺伝子組換えで融合される第一の抗体の重鎖（ＶＨ（１）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）をコードしてＶＨ（１）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−随意のリンカー−ＶＬ（２）−ＣＬをコードする配列を生じ；第二の構築物は第一の抗体の軽鎖（ＶＬ（１）−ＣＬ）をコードし；第三の構築物はヒンジ領域（アミノ酸配列ＥＰＫＳＣ、配列番号１０；図１Ａを参照されたい）をコードするさらなる配列に機能的に連結される第二の抗体のＦａｂ重鎖（ＶＨ（２）−ＣＨ１）をコードする。

さらに本発明は、本発明のＤＮＡ分子を保有する宿主細菌を提供する。

さらに本発明は、本発明のＴｅｔＢｉＡｂを作製する方法を提供する。

本発明の別の態様では、本発明のＴｅｔＢｉＡｂに適切な標的結合特異性を選択する方法が提供される。

また、具体的なＴｅｔＢｉＡｂも提供される。１つの実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂはＣＤ２０及びＣＤ１６を標的とする。別の実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂはＥＧＦＲ及びＣＤ１６を標的とする。さらなる実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂはＣＤ２０及びＣＤ４７を標的とする。いっそうさらなる実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂはＣＤ２０及びＣＤ５２を標的とする。いっそうさらなる実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂはＥｐＣａｍ及びＣＤ４７を標的とする。

本発明の１つの態様は、がん又は免疫関連病態をもつ個人を本発明のＴｅｔＢｉＡｂを用いて治療する方法を提供し、その方法は治療上有効な量のＴｅｔＢｉＡｂ、例えば、上記に列挙された実施形態のＴｅｔＢｉＡｂを投与してその病態を治療することを含む。

図１は四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）を模式的に図示する。図１Ａでは、ＴｅｔＢｉＡｂの発現用のＤＮＡ構築物が示される。ＤＮＡ構築物１（上段）は、随意のリンカー（Ｌ）を介して第二の抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ（２））、それに続く軽鎖定常領域（ＣＬ）に遺伝子組換えで融合された第一の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ（１））、それに続く重鎖定常領域（ＣＨ１、ヒンジ（Ｈ）−ＣＨ２−ＣＨ３）をコードする。ＤＮＡ構築物２（中段）は、第一の抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ（１））、それに続く軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする。ＤＮＡ構築物３（下段）は、第二の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ（２））、それに続く重鎖定常領域１（ＣＨ１）、及び随意に上部ヒンジ領域（Ｈ^*）をコードする。図１Ｂでは、ＴｅｔＢｉＡｂの模式図は図１Ａに示されるＤＮＡ構築物によってコードされる３つのポリペプチド構成要素を含む六量体構造を示す。鎖間ジスルフィド結合は、２つのポリペプチド鎖間の短いバーとして示されている。図１Ｃでは、ＴｅｔＢｉＡｂの発現用の代替ＤＮＡ構築物が示される。ＤＮＡ構築物１（上段）は、随意のリンカー（Ｌ）を介して第二の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ（２））、それに続く重鎖定常領域１（ＣＨ１）に遺伝子組換えで融合された第一の抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ（１））、それに続く軽鎖定常領域（ＣＬ）、それに続く重鎖定常領域（ヒンジ（Ｈ）−ＣＨ２−ＣＨ３）、及び随意に上部ヒンジ領域（Ｈ^*）をコードする。ＤＮＡ構築物２（中段）は、第二の抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ（２））、それに続く軽鎖定常領域（ＣＬ）コードする。ＤＮＡ構築物３（下段）は、第一の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ（１））、それに続く定常領域１（ＣＨ１）、及び随意に上部ヒンジ領域（Ｈ^*）をコードする。図１Ｄでは、ＴｅｔＢｉＡｂの模式図は、図１Ｃに示されるＤＮＡ構築物によってコードされる３つのポリペプチド構成要素を含む六量体構造を示す。鎖間ジスルフィド結合は、２つのポリペプチド鎖間の短いバーとして示されている。図１は四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）を模式的に図示する。図１Ｃでは、ＴｅｔＢｉＡｂの発現用の代替ＤＮＡ構築物が示される。ＤＮＡ構築物１（上段）は、随意のリンカー（Ｌ）を介して第二の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ（２））、それに続く重鎖定常領域１（ＣＨ１）に遺伝子組換えで融合された第一の抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ（１））、それに続く軽鎖定常領域（ＣＬ）、それに続く重鎖定常領域（ヒンジ（Ｈ）−ＣＨ２−ＣＨ３）、及び随意に上部ヒンジ領域（Ｈ^*）をコードする。ＤＮＡ構築物２（中段）は、第二の抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ（２））、それに続く軽鎖定常領域（ＣＬ）コードする。ＤＮＡ構築物３（下段）は、第一の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ（１））、それに続く定常領域１（ＣＨ１）、及び随意に上部ヒンジ領域（Ｈ^*）をコードする。図１Ｄでは、ＴｅｔＢｉＡｂの模式図は、図１Ｃに示されるＤＮＡ構築物によってコードされる３つのポリペプチド構成要素を含む六量体構造を示す。鎖間ジスルフィド結合は、２つのポリペプチド鎖間の短いバーとして示されている。図２は、ＥＧＦとの競合結合アッセイによる、抗ＥＧＦＲ（黒丸、実線）、Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＶＨＣＨ１）（白四角形、点線）、及びＦｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＬＣ）（黒四角形、破線）の、ＥＧＦＲを発現するヒトＡ４３１類表皮がん細胞への結合を示す（実施例１）。図３は、ＳＰＲ分析による、さまざまな濃度でのＥＧＦＲの、固定化Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＶＨＣＨ１）、Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＬＣ）、及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＥＧＦＲ（ＬＣ）への結合を示す。図４は、抗ＣＤ２０（黒丸、実線）、Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＣＤ２０（ＶＨＣＨ１）（白三角形、点線）、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ２０（ＶＨＣＨ１）（白四角形、短破線）、Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＣＤ２０（ＬＣ）（黒三角形、実線）、及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ２０（ＬＣ）（黒四角形、長破線）の、Ｄａｕｄｉ細胞に発現させたＣＤ２０への結合（実施例２）を示す。図５は、抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲ（レーン２）及び抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６（レーン３）の３つのポリペプチドの発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析（図５Ａ）、並びに抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲ（上パネル）及び抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６の完全六量体分子の構築（下パネル）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析を示す（図５Ｂ；実施例３））。図６は、ＥＧＦとの競合結合アッセイによる、抗ＥＧＦＲ（黒丸、実線）、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６（白丸、点線）、及び抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲ（白四角形、破線）のＥＧＦＲを発現するヒトＡ４３１類表皮がん細胞への結合を示す（実施例３）。図７は、静止期ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター（エフェクターと標的細胞の比１００：１）として用いた、抗ＥＧＦＲ（黒丸、実線）、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６（白丸、点線）、及び抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲ（白四角形、破線）の、ヒトＡ４３１類表皮がん細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示す（実施例４）。図８は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６の３つのポリペプチドの発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析（図８Ａ）、及び完全六量体分子の構築のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析（図８Ｂ）を示す。図９は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６（白丸、点線）及び抗ＣＤ２０（黒丸、実線）のＣＤ２０を発現するＤａｕｄｉ細胞への結合を示す。図１０は、精製したヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をエフェクター（エフェクターと標的細胞の比１０：１）として用いた、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６（白丸、点線）及び抗ＣＤ２０（黒丸、実線）のヒトＲａｍｏｓバーキットリンパ腫細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示す。２つのグラフは、提供者が異なるエフェクター細胞の結果を表わす。図１１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７の３つのポリペプチドの発現の分析（図１１Ａ）、及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による完全六量体分子の構築の分析（図１１Ｂ；実施例５）を示す。図１２は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７（白丸、点線）、抗ＣＤ２０（黒丸、実線）及び抗ＣＤ４７（黒四角形、実線）のＣＤ２０（ＣＤ２０をトランスフェクションしたＮＳ０細胞；図１２Ａ）若しくはＣＤ４７（Ｕ９３７細胞；図１２Ｂ）のいずれか、又は両方（ＳＵ−ＤＨＬ４細胞；図１２Ｃ）を発現する細胞への結合を示す。図１２は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７（白丸、点線）、抗ＣＤ２０（黒丸、実線）及び抗ＣＤ４７（黒四角形、実線）のＣＤ２０（ＣＤ２０をトランスフェクションしたＮＳ０細胞；図１２Ａ）若しくはＣＤ４７（Ｕ９３７細胞；図１２Ｂ）のいずれか、又は両方（ＳＵ−ＤＨＬ４細胞；図１２Ｃ）を発現する細胞への結合を示す。図１３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２（レーン２）及び抗ＣＤ５２／抗ＣＤ２０（レーン３）の３つのポリペプチドの発現の分析（図１３Ａ）、並びにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２（上パネル）及び抗ＣＤ５２／抗ＣＤ２０（下パネル）の完全六量体分子の構築の分析（図１３Ｂ；実施例６））を示す。図１４は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２（白丸、点線）、抗ＣＤ５２／抗ＣＤ２０（白三角形、破線）、抗ＣＤ２０（黒丸、実線）、及び抗ＣＤ５２（黒三角形、実線）の、ＣＤ２０（Ｄａｕｄｉ細胞；図１４Ａ）又はＣＤ５２（Ｋａｓｕｍｉ−３細胞、図１４Ｂ）のいずれかを発現する細胞への結合を示す。図１５は、ＥＬＩＳＡによる、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ４７（ＶＨＣＨ１）（白三角形、点線）、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ４７（ＬＣ）（黒三角形、破線）、及び抗ＣＤ４７のさまざまな抗体濃度における、固定化したＣＤ４７への結合を示す（実施例７）。図１６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７（レーン２）及び抗ＣＤ４７／抗ＥＧＦＲ（レーン３）の３つのポリペプチドの発現の分析（図１８Ａ）、並びにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７（上パネル）及び抗ＣＤ４７／抗ＥＧＦＲ（下パネル）の完全六量体分子の構築の分析（図１６Ｂ；実施例８））を示す。図１７は、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７（白丸、点線）、抗ＣＤ４７／抗ＥＧＦＲ（白四角形、破線）、抗ＥＧＦＲ（黒丸、実線）、及び抗ＣＤ４７（黒四角形、実線）の、固定化したＣＤ４７（図１７Ａ）又は固定化したＥＧＦＲ（図１７Ｂ）への、ＥＬＩＳＡによる結合を示す。Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲを高レベルで発現し、ＣＤ４７を低レベルで発現する）への、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７（白丸、点線）、抗ＥＧＦＲ（黒丸、実線）、及び抗ＣＤ４７（黒四角形、実線）結合が図１７Ｃに示される。図１７は、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７（白丸、点線）、抗ＣＤ４７／抗ＥＧＦＲ（白四角形、破線）、抗ＥＧＦＲ（黒丸、実線）、及び抗ＣＤ４７（黒四角形、実線）の、固定化したＣＤ４７（図１７Ａ）又は固定化したＥＧＦＲ（図１７Ｂ）への、ＥＬＩＳＡによる結合を示す。Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲを高レベルで発現し、ＣＤ４７を低レベルで発現する）への、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７（白丸、点線）、抗ＥＧＦＲ（黒丸、実線）、及び抗ＣＤ４７（黒四角形、実線）結合が図１７Ｃに示される。図１８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ４７抗体（レーン３）及び抗ＣＤ４７／抗ＨＥＲ２抗体（レーン３）の３つのポリペプチドの発現の分析（図１８Ａ）、並びにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ４７抗体（上パネル）及び抗ＣＤ４７／抗ＨＥＲ２抗体（下パネル）の完全六量体分子の構築の分析（図１８Ｂ；実施例９）を示す。図１９は、抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ４７抗体（白三角形、点線）、抗ＣＤ４７／抗ＨＥＲ２抗体（白四角形、破線）、抗ＨＥＲ２（黒三角形、実線）、及び抗ＣＤ４７（黒四角形、実線）の、ＥＬＩＳＡによる、固定化したＣＤ４７（図１９Ａ）、又はＨＥＲ２を発現するがＣＤ４７を発現しないＳＫ−ＢＲ３細胞（図１９Ｂ）のいずれかへの結合を示す。

本発明は、異なる結合特異性をもつ２つのＦａｂ断片を含む二重特異性抗体細胞発現、構築、及び精製における抜本的な問題、すなわち２つの種の遊離軽鎖がＦａｂ重鎖とランダムに対形成し結果として多数の異常な抗体種を産生するということを克服する。これら異常な抗体は、所望の生成物から精製することが困難で、生成物収率に影響することがある。本発明の技術においては、１つ種の遊離軽鎖のみが存在し、所望の二重特異性抗体生成物が容易に得られる。

本発明の全体的な実施形態では、抗体は抗体Ｆｃ領域を含み、該Ｆｃ重鎖はそのＣ末端においてＦａｂ軽鎖によってＦａｂに連結される。

より具体的に、本発明は四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）を提供し、該四価二重特異性抗体では、第二の結合特異性をもつ第二のＦａｂ断片が抗体のＣ端末にＦａｂ軽鎖によって連結される。次いで、これらの連結されたＦａｂ軽鎖は遊離同種Ｆａｂ重鎖と対形成できる。逆に、抗体のＮ末端に通常存在するＦａｂ重鎖領域はその遊離軽鎖と対形成できる。結果として得られる抗体はその結合特異性各々について二価である。ＴｅｔＢｉＡｂ中のポリペプチド鎖の配置は図１Ｂに模式的に示される。

ＴｅｔＢｉＡｂの変形はＴｅｔＢｉＡｂの逆の配置となる：軽鎖がＮ末端Ｆｃポリペプチド鎖に連結され、第二の結合特異性をもつＦａｂ第二のセットがＦｃ領域のＣ端末にＦａｂ重鎖によって連結される。ＴｅｔＢｉＡｂ中のポリペプチド鎖のこの配置は図１Ｄに模式的に示される。

「Ｆａｂ断片」又は単に「Ｆａｂ」という用語は互換可能に使用され、本明細書において本質的にＩｇＧ抗体のパパイン分解によって得られる抗体の抗原結合部分を述べるのに使用される。Ｆａｂ断片はヘテロ二量体であり、２つのポリペプチド、可変（ＶＬ）及び定常（ＣＬ）領域を有する軽鎖並びに可変（ＶＨ）及び第一の定常領域（ＣＨ１）を有する重鎖からなり、特にＦａｂがＩｇＧ１サブクラスの場合、上部ヒンジ領域も含みうる。ポリペプチド鎖は互いにペプチド結合によって連結せず、互いに非共有結合性の相互作用によって結合し、重鎖の上部ヒンジ領域がある場合はジスルフィド結合によって結合する。

本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ重鎖」という用語は、ＶＨ領域及びＣＨ１領域からなるが、ＣＨ２領域もＣＨ３領域も含まないポリペプチドを意味する。特にＦａｂがＩｇＧ１サブクラスの場合、ポリペプチドはさらに抗体ヒンジの上部ヒンジ領域を含みうる。

本明細書で使用される場合、「軽鎖」（ＬＣ）又は「Ｆａｂ軽鎖」という用語は、ＶＬ領域及びＣＬ領域からなるポリペプチドを意味する。抗体軽鎖はカッパ若しくはラムダ軽鎖、又はカッパに分類される。

本明細書で使用される場合、「遊離軽鎖」又は「遊離Ｆａｂ重鎖」という用語は、ペプチド結合によってＦｃポリペプチド鎖に連結されない本発明の抗体のポリペプチド構成要素を表わす。

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、Ｆｃ受容体及びある種の補体タンパク質に結合し、伝統的にはパパイン分解によって得られるが、上部ヒンジ領域を含む断片に本質的に相当する抗体の部分を表わす。Ｆｃ領域は典型的にはホモ二量体であり、抗体重鎖由の来の２つ同一のポリペプチド鎖からなり、典型的には、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含むがＣＨ１領域を含まない（「Ｆｃ重鎖」；ＩｇＧ１ポリペプチドでは、Ｆｃ重鎖ヒンジは、ＥＵ番号付与体系（EU numbering system）によってされるように、残基２１６にて始まり、アミノ酸グルタミン酸にあたる）。ある実施形態では、ＣＨ２領域が欠けていることがある。その他の実施形態では、Ｆｃ領域は、例えばエフェクター機能関与又は抗体半減期に影響する変異を含みうる。ポリペプチド鎖は互いに、ＣＨ３領域の非共有結合性の相互作用及びヒンジ領域のジスルフィド結合によって結合する。

本明細書で使用される場合、「領域」という用語は、例えばタンパク質又はポリペプチド鎖の構造的又は機能的に規定される要素又は構成部分を表わす。Ｆｃ重鎖定常領域の例は、ＣＨ２領域又はＣＨ３領域である。Ｆａｂ領域の例は、軽鎖可変領域（ＶＬ）又はＦａｂ重鎖定常領域（ＣＨ１）である。

本明細書で使用される場合、「一価」、「二価」、「四価」という用語は、タンパク質中の抗原結合要素の数（それぞれ１、２、又は４）を指す。

本明細書で使用される場合、特異的ＴｅｔＢｉＡｂは「抗標的（１）／抗標的（２）」と表わされ、呼称中の標的の順序はＦｃ領域に対するＦａｂ断片の順序を反映する。抗標的（１）／抗標的（２）は、Ｆａｂ（抗標的（１））−Ｆｃ−Ｆａｂ（抗標的（２））順である。

本発明の一般的な実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂは、（ｉ）第一の抗体の抗体重鎖を含む第一のポリペプチド（ここで、該重鎖は第一の抗体の可変領域及び定常領域（ＶＨ（１）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含み、該重鎖はそのＣ末端において直接的又は間接的にペプチド結合によって第二の抗体の抗体軽鎖のＮ末端に連結され、該軽鎖は第二の抗体の可変及び定常領域（ＶＬ（２）−ＣＬ）を含む）；
（ｉｉ）第一の抗体の抗体軽鎖を含む第二のポリペプチド（ここで第一の抗体の該軽鎖は可変及び定常領域（ＶＬ（１）−ＣＬ）を含む）；並びに
（ｉｉｉ）ＣＨ２及びＣＨ３定常領域を欠く第二の抗体のＦａｂ重鎖（ＶＨ（２）−ＣＨ１）を含む第三のポリペプチドを含み、
第一及び第二の抗体が異なる結合特異性を有する、すなわち、抗体が別個のエピトープに特異的に結合することが理解される。これらのポリペプチドは完全四価二重特異性抗体を構築する。

さらなる実施形態では、第一のポリペプチドは重鎖定常領域のＣ末端と軽鎖可変領域のＮ末端の間にリンカーを含んでもよい。１つの実施形態では、該リンカーはＧ４Ｓ（アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ、配列番号６）である。該リンカーは連鎖状の複数のＧ４Ｓ要素、（Ｇ４Ｓ）_nを含んでもよく、ｎは２〜１０の整数である。さらなる実施形態では、ｎは２〜６の整数である。いっそうさらなる実施形態では、ｎは４である。

さらなる実施形態では、上記のＴｅｔＢｉＡｂの遊離Ｆａｂ重鎖ポリペプチド、ＶＨ（２）−ＣＨ１は、そのＣ末端においてアミノ酸配列ＥＰＫＳＣ（配列番号１０；「上部ヒンジ領域」）のＦｃヒンジ領域をさらに含み、それにより重鎖ポリペプチドはその同種軽鎖とジスルフィド結合を形成できる。

本発明の別の態様では、ＴｅｔＢｉＡｂを形成する３つのポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ構築物が提供される。第一の構築物は、第二の抗体の軽鎖（ＶＬ（２）−ＣＬ）に随意のリンカー介して遺伝子組換えで融合された第一の抗体の重鎖（ＶＨ（１）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）をコードして、ＶＨ（１）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−随意のリンカー−ＶＬ（２）−ＣＬをコードするＤＮＡ配列を生じ；第二の構築物は、第一の抗体の軽鎖（ＶＬ（１）−ＣＬ）をコードし；第三の構築物は、第二の抗体のＦａｂ重鎖（ＶＨ（２）−ＣＨ１）を、随意にヒンジ領域（アミノ酸配列ＥＰＫＳＣ、配列番号１０；図１Ａを参照されたい）をコードする配列をさらに伴ってコードする。

別の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、それに続く随意のリンカー及び第二の抗体のＦａｂ重鎖（ＶＨ（２）−ＣＨ１）に遺伝子組換えで融合された第一の抗体（ＶＬ（１）−ＣＬ１）の軽鎖を含む融合ポリペプチドをコードして、配列ＶＬ（１）−ＣＬ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−随意のリンカー−ＶＨ（２）−ＣＨ１を与える（図１Ｃ）。

本発明のさらなる態様では、本発明のＴｅｔＢｉＡｂを作製する方法が提供される。宿主細菌での分泌のためのシグナルペプチドを含む適切な発現ベクターの３つのＤＮＡ構築物を共発現すると、２つの異なる結合特異性をもつ所望のＴｅｔＢｉＡｂ（図１Ｂ）は、形成されて培養培地中に分泌され、プロテインＡクロマトグラフィーなどの標準的な抗体精製手順によって精製される。一過性発現に好適な宿主細菌の例はヒト胚腎細胞２９３Ｅである。安定発現に好適な宿主細菌の例はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

発現された３つのポリペプチド鎖が互いにペプチド結合によって連結されないことは当業者にとって明らかである。本発明は１つの遊離軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）が存在することを利用し、その結果ランダムな軽鎖対形成の問題が克服される。

本発明の別の利点は、ｓｃＦｖと比較してＦａｂ断片が非所に安定であることであり、その重鎖のＣ末端に融合された追加のＦａｂ断片をもつ抗体は概して非常に安定であり、且つ高レベルで発現すると予想される。重要なことには、本発明は抗体重鎖融合ポリペプチド鎖の１つの単一種の発現に基づき、一端において１つの同種遊離軽鎖ポリペプチド、及び融合ポリペプチドのもう一端において１つの同種遊離Ｆａｂ重鎖ポリペプチドと特異的に対形成する。故に、ヘテロ二量体Ｆｃ骨格は二重特異性抗体を構築する手段を提供する必要がない。したがって、重鎖の誤った対形成がない。

第一及び第二の抗体の可変領域に関して事実上モジュール式（modular）であるＤＮＡを提供することが本発明の目的であり、その結果として第一及び第二の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡが、例えば安定化変異や二重特異性抗体の発現の膨大な最適化を導入する必要なく容易に構築できる。二重特異性抗体の作製を容易にするそのような強力な技術は、ある種の疾患状態において相乗効果を生むことができる標的の組み合わせの発見に非常に有利である。

本発明の別の目的は、生物由来の二重特異性結合を達成するＦａｂ断片、及び所望のエフェクター機能及び半減期プロファイルを達成する、随意に改変されたＦｃ領域を特徴とする生物学的治療薬（biotherapeutic）として開発するのに適した、安定した抗体ベースの融合タンパク質を提供することである。エフェクター機能及び半減期に影響するＦｃ変異体は当該技術分野で充分に解明されている（例えば、国際公開第２０００／０４２０７２号パンフレットを参照されたい）。Ｆａｂ断片が本来単鎖Ｆｖ’ｓより安定である（Rothlisberger et al、J. Mol. Biol. 347:773、2005）こと、抗体の結合アーム（binding arm）として天然に生じ、さらなる操作なしにそのまま使用できる（Schoonjans et al, J. Immunol. 165:7050, 2000）ことは当該技術分野でよく理解されている。

１つの実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域及びカッパ定常領域はＴｅｔＢｉＡｂの構築に使用される。今日まで、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）アイソタイプは主要な血清免疫グロブリンであり、生物由来の生物学的治療薬として容易に製造可能であるので、認可されている治療用抗体はすべてＩｇＧである。さらに、ＩｇＧは免疫細胞上のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合して多様なエフェクター機能を導き出し、ヒトでの典型的なＩｇＧに長い血清半減期を付与する防御的な胎児性Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに結合する唯一のアイソタイプである。ＩｇＧアイソタイプには、４つのサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４がある。抗体のＩｇＧサブクラスは、そのエフェクター機能を決定し、その治療への適用に合うように注意深く選ばれる。それゆえに、ＩｇＧ１サブクラスはエフェクター機能が望ましい場合に選ばれ、ＩｇＧ２はＦｃγＲ結合を欠いて抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を最小限にすることから選ばれ、ＩｇＧ４はＡＤＣＣ活性が低く、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を完全に欠くことから選ばれる。また、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭなどの他の免疫グロブリンアイソタイプの定常領域も、ＴｅｔＢｉＡｂを構築するのに使用できる。天然のアイソタイプ及びＩｇＧサブクラスの重鎖定常領域配列の他に、組換えハイブリッドアイソタイプも本発明に使用できる（例えば、Gillies, S.D., and Lo, K.-M. Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety. 米国特許第７１４８３２１号明細書）。くわえて、Ｃ末端Ｆａｂに使用されるＣＨ１はＮ末端Ｆａｂに使用されるＣＨ１と異なるアイソタイプであることができる。さらに、ＩｇＧ１のＣＨ１がＣ末端Ｆａｂに使用される場合、通常軽鎖とジスルフィド結合を形成するシステイン残基を提供するために、ＣＨ１はそのＣ末端がＩｇＧ１上部ヒンジ領域のさらなる５つの残基ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）によって伸長されてもよい（Rothlisberger et al, J Mol Biol. 347:773, 2005）。軽鎖定常領域に関して、カッパ鎖定常領域又はラムダ鎖定常領域は、Ｎ末端Ｆａｂ若しくはＣ末端Ｆａｂのいずれか、又は両方に使用される。

本発明の別の目的は、検出がより特異的で、解離半減時間が長く、ルミネックス及び他の多重アッセイなどのアッセイでの感度が向上した診断用薬剤としてＴｅｔＢｉＡｂを提供すること、並びに蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析での標的細胞の特異的結合を高めることである。

別の態様では、本発明は治療に適用するためのＴｅｔＢｉＡｂを作製する方法を提供する。該方法は次の工程を含む：（ａ）そのような四価二重特異性抗体をコードするトランスフェクションされたＤＮＡ分子を含む哺乳類細胞を提供すること；（ｂ）哺乳類細胞を培養して該四価二重特異性抗体を産生すること；（ｃ）当該技術分野で周知の従来技術を用いて該四価二重特異性抗体を精製すること；及び（４）治療に適用するＴｅｔＢｉＡｂを製剤化すること。天然の抗体のように、ＴｅｔＢｉＡｂは１つの標的につき二価の結合を保持するが、それにくわえて、同一細胞上の２つの疾患関連標的に結合することを通して、疾患を引き起こす細胞に結合するアビディティーが高まり、結果として標的をより特異的にし、副作用をより少なくすることになる。さらに、そのようなアビディティーの増加は受容体の広範な多価の架橋をもたらすことができ、それは多く場合、増殖停止、アポトーシス、並びに受容体のインターナリゼーション及び分解などの生体活性を高める。全体として、ＴｅｔＢｉＡｂの多価結合及び高いアビディティーは、治療への適用において治療投薬量を減らし、有効性を高めることにつながる可能性をもつ特徴である。

四価二重特異性抗体の具体的な非限定的実施形態としては、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６（実施例３）、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６（実施例４）、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７（実施例５）、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２（実施例６）、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７（実施例８）、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ４７（実施例９）が挙げられ、それらでは第一の抗体の特異性はＮ末端Ｆａｂに備わり、第二の抗体の特異性はＣ末端Ｆａｂに備わる（図１を参照されたい）。２つの抗体の位置は逆にすることができ、例えば抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲに代わって抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６にすることができる。

当業者は四価二重特異性抗体の両形態を発現でき、次いで発現レベル、Ｎ末端及びＣ末端Ｆａｂの結合親和性、並びに他の生体活性アッセイに基づいてどちらが好ましい形態かを決定できる。１つの方法では、ＤＮＡの構築及び融合タンパク質の分析を単純にするのに、当業者は比較用のＦａｂ−Ｆｃ（通常の抗体）及びＦｃ−Ｆａｂを発現し、どちらの抗体Ｆａｂ領域をＣ末端Ｆａｂとして発現すべきか決定する。

また、当業者はどのＦａｂをＣ末端に連結するＦａｂとして使用するかの選択を導くにあたって標的抗原の性質も考慮してもよい。原則として、標的抗原への接触可能性（accessibility）は、Ｃ末端Ｆａｂの結合部位においてのほうが制約を大きく受ける。したがって、可溶性因子又は大きな露出細胞外ドメインをもつ受容体はＣ末端Ｆａｂによる標的になりやすい傾向がある。逆に、小さな露出細胞外ループ領域のみをもつ複数回膜貫通膜タンパク質の標的抗原、又は細胞膜に近い抗原表面は、Ｃ末端Ｆａｂによる標的になる可能性が低いことがある。

理論に束縛されるものではないが、Ｆｃ領域がＣ末端Ｆａｂの結合部位に近いことは立体障害を引き起こす可能性がある。Ｃ末端Ｆａｂの標的、とりわけ、細胞受容体への結合に関して、柔軟なリンカーを組み込むことは立体障害を軽くすることによる結合親和力の保持に役立ちことがある。１つの実施形態では、柔軟なリンカーはアミノ酸配列ＧＧＧＧＳを有する。当業者はＧＧＧＧＳ配列（配列番号６）の複数のコピーを組み込むことによって、柔軟なリンカーの最適長を容易に調べることができる。概して、最大で１０コピーが使用され、１つの実施形態では４コピーが使用される。

したがって、１つの実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂは２つの異なる細胞タイプ上の２つの別個の標的に結合する。好ましい実施形態は、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６又は抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６であり、ＴｅｔＢｉＡｂは標的腫瘍細胞上のＥＧＦＲ又はＣＤ２０と、ナチュラルキラー細胞上のＣＤ１６の間を架橋してナチュラルキラー細胞を腫瘍に向ける。別の実施形態では、四価二重特異性抗体は、好ましい実施形態である抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７又は抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２などの同一細胞上の２つの別個の標的を結合する。本発明のさらに別の実施形態では、四価二重特異性抗体は同一の分子標的上の２つの異なるエピトープ（すなわち、二重パラト−プ）に結合する。また、ＴｅｔＢｉＡｂの標的の一方又は両方が可溶性でも、細胞表面に発現していることもできることは当業者に明らかである。

１つの好ましい実施形態では、本発明は、抗ＣＤ２０重鎖−抗ＣＤ４７軽鎖融合ポリペプチド、抗ＣＤ２０軽鎖、及び抗ＣＤ４７Ｆａｂ重鎖を含む抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７ＴｅｔＢｉＡｂを提供し：
（ａ）抗ＣＤ２０のＶＨ及びＶＬ配列はそれぞれ配列番号２４及び配列番号２２と同一であり、
（ｂ）抗ＣＤ４７のＶＨ及びＶＬ配列はそれぞれ配列番号５６及び配列番号５４と同一であり、
（ｃ）定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭからなる群から選択される。

さらなる実施形態では、本発明は、抗ＣＤ２０重鎖−抗ＣＤ４７軽鎖融合ポリペプチド、抗ＣＤ２０軽鎖、及び抗ＣＤ４７Ｆａｂ重鎖を含む抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７四価二重特異性抗体を提供し：
（ａ）抗ＣＤ２０のＶＨ及びＶＬ配列はそれぞれ配列番号２４及び配列番号２２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有し、
（ｂ）抗ＣＤ４７のＶＨ及びＶＬ配列はそれぞれ配列番号５６及び配列番号５４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有し、
（ｃ）定常領域は、Ｆｃ領域のエフェクター機能を抑止する変異を含む、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭからなる群から選択される。

別の好ましい実施形態では、本発明は、抗ＣＤ２０重鎖−抗ＣＤ４７軽鎖融合ポリペプチド、抗ＣＤ２０軽鎖、及び抗ＣＤ４７Ｆａｂ重鎖を含む抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７四価二重特異性抗体を提供し：
（ａ）抗ＣＤ２０のＶＨ及びＶＬ配列はそれぞれ配列番号２４及び配列番号２２の相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びにコンセンサスヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、
（ｂ）抗ＣＤ４７のＶＨ及びＶＬ配列はそれぞれ配列番号５６及び配列番号５４の相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びにコンセンサスヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、
（ｃ）定常領域は、Ｆｃ領域のエフェクター機能を抑止する変異を含む、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭからなる群、か、又はＦｃ領域のエフェクター機能を抑止する変異を含む、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭからなる群から選択される。

本発明の別の実施形態によれば、ＴｅｔＢｉＡｂは、好ましくは疾患を引き起こす標的細胞上に発現し、健康な組織では発現しないか低レベルで発現する抗原に結合する。そのような標的抗原の非限定的な例としては、癌胎児性抗原、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ−１Ｃ、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＭＡ、並びにガングリオシドＧＤ２及びＧＤ３が挙げられ、その多くは腫瘍特異抗原である。ＴｅｔＢｉＡｂでは、これらの腫瘍特異抗原のいずれか１つに結合するＦａｂは、Ｔ細胞のＣＤ３、ＮＫ細胞のＣＤ１６、又は単球のＣＤ６４抗原などのエフェクター細胞の抗原を標的とするＦａｂと対形成されて腫瘍細胞の溶解を促進するＴｅｔＢｉＡｂを生成できる。そのようなＴｅｔＢｉＡｂはこれらの腫瘍抗原の発現を特徴とするがんの治療に使用できる。

本発明の代替的な実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂは、例えば、正常及び悪性Ｂ細胞に発現する抗原ＣＤ１９及びＣＤ２０をもつ症例などの、疾患を引き起こす細胞に発現し、正常細胞の類にも発現しうる抗原に結合する。そのようなＴｅｔＢｉＡｂでは、ＣＤ１９又はＣＤ２０に結合するＦａｂは、ＮＫ細胞のＣＤ１６などのエフェクター細胞を標的とするＦａｂと対形成できる。例えば、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６ＴｅｔＢｉＡｂは血液学的悪性疾患の治療に使用できる。

さらに別の実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂは２つの抗体のＦａｂを含み、各抗体はもしそうでなければ普通の、同じ所望の標的細胞に対する選択性を有し、それによって所望の標的に対する選択性を個々の抗体各々に比較して著しく増加させる。同一標的細胞上の第二の疾患特異的抗原に結合する別のＦａｂと対形成した、疾患特異的抗原のいずれかと結合するＦａｂを含むＴｅｔＢｉＡｂの好ましい実施形態は、例えば、抗Ｈｅｒ２／抗Ｈｅｒ３及び抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒである。

代替的に、ＴｅｔＢｉＡｂは、疾患特異的抗原のいずれかに対し、且つ正常細胞の類に発現する抗原に対して向けられる。１つの好ましい実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂは抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ４７である。いっそうさらなる好ましい実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂは抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７又は抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２などの、正常細胞の類に発現する２つの異なる抗原を標的にする。いっそうさらなる実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂはＦａｂを含み、その一方又は両方のＦａｂはいずれの成長因子、例えば、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、及びＣＳＦ−１、又はサイトカイン、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、及びＴＮＦαなどの可溶性因子に結合する。

本発明の別の態様では、本発明は、ＴｅｔＢｉＡｂをがん、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び感染症などの疾患の治療のために対象、好ましくはヒトに投与する方法を提供する。

本発明の四価二重特異性抗体を調製し、対象に投与する方法は当業者に周知であるか、当業者によって容易に決定される。四価二重特異性抗体投与経路は、経口、非経口、局所であってよく、又は吸入によってもよい。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、腹膜内、筋肉内、皮下、経直腸、又は経膣投与が挙げられる。好ましい投与の形態は、例えば、注射用溶液、特に静脈内若しくは動脈内注射又は点滴用溶液である。通常、好適な注射用医薬組成物は薬理学的に許容される担体をさらに含みうる。薬理学的に許容される担体としては、例えば、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールなどが挙げられる。随意に、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤などの従来の添加剤を組成物に加えてもよい。

患者を治療するための四価二重特異性抗体の有効投与量は、投与経路、患者の健康状態、疾患の重症度、患者の体重、年齢、及び性別などを含む多くのさまざまな要因に依る。概して、該四価二重特異性抗体は、単回投与、毎日投与、毎週投与、毎週投与、隔週投与、毎月投与などとして投与されうる。投与量は四価二重特異性抗体の０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。

好ましい実施形態では、ＴｅｔＢｉＡｂ抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７の有効投与量は１〜１０ｍｇ／ｋｇの典型的な範囲で、Ｂ細胞性疾患、例えば、非ホジキンリンパ腫、関節リウマチ、又は全身エリテマトーデスを罹患する患者に経静脈で与えられる。

別の好ましい実施形態では、四価二重特異性抗体抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６の有効投与量は１〜１０ｍｇ／ｋｇの典型的な範囲で、結腸直腸がん又は肺がんなどのＥＧＦＲを過剰発現する固形腫瘍の患者に経静脈で与えられる。

がん治療では、患者の腫瘍性の細胞の増殖を除去、軽減、又は制御するいずれの化学療法剤又はレジメンと共に又は組み合せて四価二重特異性抗体を使用してもよい。例示的な化学療法剤としては、アルキル化剤、ビンカアルカロイド、タキサン、代謝拮抗物質、ニトロソウレア剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ−糖タンパク質阻害剤、白金錯体誘導体、ホルモン拮抗剤、細胞毒性抗生物質などが挙げられる。四価二重特異性抗体と併用される化学療法剤の量は、対象並びに疾患の種類及び重症度によって変動でき、当該技術分野において公知であることに従って投与できる。例えば、Chabner et al., Antineoplastic Agents, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287 (Joel G. Hardman et al., eds., 9^th ed. 1996)を参照されたい。

本発明の他の利点及び特長は、以下の例、図面、及び請求項から明らかになるであろう。

以下の例は、本発明のある特定の好ましい実施例及び態様を例示する役割を果たし、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。

特に断りのない限り、ＩｇＧ重鎖のアミノ酸残基の番号付与は、Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed., Public Health Service, NIH, Bethesda, Md （1991）にあるＥＵインデックス（EU index）のものである。

表１は本明細書に記載の配列を提供する。分泌分子のポリペプチド配列はすべてシグナル配列を含まずに示されている。可変領域は下線が施されている。

実施例１
Ｆｃ−抗ＥＧＦＲ前駆体分子
１Ａ）Ｆｃ−Ｆａｂ前駆体の構築及び発現
完全ＴｅｔＢｉＡｂ分子を創るために、多くのＦｃ−Ｆａｂ前駆体を生成し、ＦａｂがＦｃのＣ末端に移された場合に依然としてＦａｂの抗原結合が起こりうるかどうかを調べた。Ｆｃ−抗ＥＧＦＲの生成は、抗ＥＧＦＲＣ２２５（セツキシマブ）モノクローナル抗体に基づく（Kawamoto, PNAS 80:1337, 1983）。Ｃ２２５のＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号１及び配列番号２に提供される。Ｃ２２５のＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号３及び配列番号４に提供される。３つの異なるＦｃ−ＥＧＦＲ分子を生成した：(i) Fc-G4S-anti-EGFR(VHCH1)、ここでFc領域重鎖のC末端は、G4Sリンカー（GGGGS）を介して、抗-EGFR Fab重鎖のN末端に結合し、重鎖は、G4Sリンカーを介して抗EGFR Fab軽鎖のN末端に結合される；及び（ｉｉｉ）リンカーの４回繰り返しを含むことを除いて（ｉｉ）と同じ分子であるＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＥＧＦＲ（ＬＣ）。

Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＶＨＣＨ１）の発現のために、以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｇ４Ｓ−ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号１１）：システイン（天然に軽鎖とジスルフィド結合を形成する）をセリンに変異させたヒト重鎖ヒンジ領域（ＥＰＫＳＳ、配列番号８）、それに続く定常領域２及び３、それに続くＧ４Ｓリンカー、並びに抗ＥＧＦＲ重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域（ＥＰＫＳＣ、配列番号１０、抗ＥＧＦＲ軽鎖とのジスルフィド架橋を可能にするため）；並びに２）次の要素をコードする構築物ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＬ（配列番号１２）：抗ＥＧＦＲ軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域。これら２つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される。

Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＬＣ）の発現のために、以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｇ４Ｓ−ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＬ（配列番号１５）：ヒト重鎖ヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号８）、それに続く定常領域２及び３、それに続くＧ４Ｓリンカー、並びに抗ＥＧＦＲ軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域；並びに２）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号１６）：抗ＥＧＦＲ重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら２つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号１７及び配列番号１８に示される。

Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＥＧＦＲ（ＬＣ）の発現のために、以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）₄−ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＬ（配列番号１９）：ヒト重鎖ヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号８）、それに続く定常領域２及び３、それに続く（Ｇ４Ｓ）₄リンカー、並びに抗ＥＧＦＲ軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域；並びに２）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号１６）：抗ＥＧＦＲ重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら２つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号２０及び配列番号１８に示される。

Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＶＨＣＨ１）、Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＬＣ）、及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＥＧＦＲ（ＬＣ）の発現のために、２つのベクターのセット各々を、Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅ（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルベニア州ウォリントン）を用いてＨＥＫ２９３−６Ｅに一過的に共トランスフェクションした。タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって一段階で精製した。２つのポリペプチドの発現及び完全六量体分子の構築を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で確認した。

さらに、標準モノクローナル抗体フォーマットの対照抗ＥＧＦＲ（抗ＥＧＦＲＩｇＧ１）を生成して異なるＦｃ−Ｆａｂフォーマットと比較した。

１Ｂ）Ｆｃ−Ｆａｂ前駆体の抗原への結合
１Ｂｉ）ｃ−ＥＧＦＲのＡ４３１膜のＥＧＦに対する競合結合
Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＶＨＣＨ１）及びＦｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＬＣ）のＥＧＦＲに対する結合を保持する能力を競合放射性リガンド結合アッセイによって示す。ＥＧＦＲを過剰発現するヒトＡ４３１類表皮がん細胞から調製した２ｍｇの膜を加える前に、競合する抗体を¹²⁵Ｉ−ＥＧＦ（パーキンエルマー社、マサチューセッツ州ウォルサム）と混ぜた。Ａ４３１細胞膜は窒素キャビテーションによって調製した。細胞を９００プサイのＮ₂ガスで３０分間粉砕し、その後溶解物を１０００ｇで４℃にて１０分間遠心分離した。上澄みを集め、１００，０００ｇで４℃にて１時間遠心分離した。結果として得られたペレットをダウンス型ホモジナイザーで懸濁した。試料のタンパク質濃度を、バイオ・ラッドタンパク質アッセイ試薬を用いて決定し、将来使用するために試料を−８０℃で冷凍保存した。非特異的結合は、ＥＧＦＲ結合部位を飽和する大過剰の非標識ＥＧＦ（１００ｎＭ）の存在下で決定した。反応を振とうしながら３７℃で９０分間インキュベーションし、グラスファイバーフィルター（ＥＭＤミリポア社、マサチューセッツ州ビレリカ）を通して濾過することによって終わらせた。フィルターを洗浄し、ガンマカウンターで計測してＡ４３１細胞膜に結合した¹²⁵Ｉ−ＥＧＦの量を決定した。

結果は、Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＶＨＣＨ１）は抗ＥＧＦＲと同様の¹²⁵Ｉ−ＥＧＦのＡ４３１細胞膜のＥＧＦＲへの結合を阻害する能力を有することを示す（図２）。また、Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＬＣ）は僅かに高い阻害定数（Ｋｉ）であるがＥＧＦＲに結合した（図２）。これらの結果は、ＦｃのＣ末端にＶＨ又はＶＬのいずれかのＮ末端を介して融合された抗ＥＧＦＲＦａｂはＥＧＦＲへの結合を保持したことを示す。

１Ｂｉｉ）ＳＰＲ分析
Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＶＨＣＨ１）、Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＬＣ）、及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＥＧＦＲ（ＬＣ）の、ＥＧＦＲに対する結合を保持する能力を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。精製したヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ビアコア４０００装置（ＧＥヘルスケア）を用いてアミンカップリング化学でＣＭ５チップ上に固定化した。ビアコアＣＭ−５チップ、エタノールアミン、ＮＨＳ／ＥＤＣＮＨＳ／ＥＤＣカップリング試薬、及びバッファーをビアコア（ＧＥヘルスケア）から入手した。固定化工程を、ＨＥＰＥＳバッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、３．４ｍＭＥＤＴＡ、及び０．００５％Ｐ２０界面活性剤）で流速３０μｌ／分にて行なった。センサー表面をＮＨＳ（０．０５Ｍ）及びＥＤＣ（０．２Ｍ）の混合物で７分間活性化した。ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃを１０ｍＭ酢酸ナトリウム中〜３０μｇ／ｍｌの濃度、ｐＨ５．０で７分間注入した。エタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）を７分間注入して、残りの活性基をいずれもブロックした。平均１２，０００応答ユニット（ＲＵ）の捕捉抗体を各フローセルに固定化した。動態結合実験（Kinetic binding experiment）を、同じＨＥＰＥＳバッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、３．４ｍＭＥＤＴＡ、及び０．００５％Ｐ２０界面活性剤）を用いて行ない、２５℃で平衡化した。動態データ（Kinetic data）を注入試験によって集め、対照抗体は０．５及び１μｇ／ｍｌ、２分間、流速３０μｌ／分、その後バッファー洗浄を３０秒間同じ流速で行った。ヒトＥＧＦＲ−１（Ｒ＆Ｄシステム組換えヒトＥＧＦ受容体（１０９５−ＥＲ））４０、２０、１０、５、２．５、及び０ｎＭで３分間結合させた後、１０分間、流速３０μｌ／分の解離工程を行った。データをＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア結合モデルでフィットさせた。動態速度定数（Kinetic rate constant）を結合及び解離フェーズの適合度から決定し、これら定数の比からＫ_Dを導いて得た。

結果は、Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＶＨＣＨ１）は抗ＥＧＦＲより僅かに高いＫ_D、（〜１ｎＭに対して〜２ｎＭ）でＥＧＦＲに結合したことを示す（図３）。またＦｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＥＧＦＲ（ＬＣ）もＥＧＦＲに結合したが、ＫＤは〜６ｎＭであった（図３）。リンカーを（Ｇ４Ｓ）₄に伸ばした場合、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＥＧＦＲ（ＬＣ）のＫ_Dは〜２ｎＭに下がった（図３）。これらの結果はパート１Ｂｉの競合結合アッセイと異なる。考えられうる説明のひとつは、Ｆｃ−抗ＥＧＦＲがビアコアチップに抗Ｆｃを介して捕捉された場合、抗ＥＧＦＲＦａｂへの接近可能性を欠くことである。この仮説は、リンカーを長くした場合に親和性が増加することによってサポートされる。その親和性の増加は抗ＥＧＦＲＦａｂのＥＧＦＲへの結合ための接近可能性が増すことによる可能性がある。

実施例２
Ｆｃ−抗ＣＤ２０前駆体分子
２Ａ）Ｆｃ−Ｆａｂ前駆体の構築及び発現
Ｆｃ−抗ＣＤ２０の生成は、抗ＣＤ２０２Ｂ８（リツキシマブ）モノクローナル抗体（Reff et ai, Blood 83:435, 1994）に基づく。２Ｂ８のＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号２１及び配列番号２２に提供される。２Ｂ８のＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号２３及び配列番号２４に提供される。４つの異なるＦｃ−ＣＤ２０分子を生成した：（ｉ）Ｆｃ領域重鎖のＣ末端がＧ４Ｓリンカー（ＧＧＧＧＳ、配列番号６）を介して抗ＣＤ２０Ｆａｂ重鎖のＮ末端に連結されるＦｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＣＤ２０（ＶＨＣＨ１）；（ｉｉ）リンカーの４回繰り返しを含むこと以外（ｉ）と同じ分子であるＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ２０（ＶＨＣＨ１）；（ｉｉｉ）Ｆｃ領域重鎖のＣ末端がＧ４Ｓリンカーを介して抗ＣＤ２０Ｆａｂ重鎖のＮ末端に連結されるＦｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＣＤ２０（ＬＣ）；及び（ｉｖ）リンカーの４回繰り返しを含むこと以外（ｉｉｉ）と同じ分子であるＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ２０（ＬＣ）。

Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＣＤ２０（ＶＨＣＨ１）の発現のために、以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｇ４Ｓ−ＶＨ（抗ＣＤ２０）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号２５）：ヒト重鎖ヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号８）、それに続く定常領域２及び３、それに続くＧ４Ｓリンカー、及び抗ＣＤ２０重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）；並びに２）次の要素をコードする構築物ＶＬ（抗−ＣＤ２Ｑ）−ＣＬ（配列番号２６）：抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域：）。これら２つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号２７及び配列番号２８に示される。

Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ２０（ＶＨＣＨ１）の発現のために、以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）₄−ＶＨ（抗ＣＤ２０）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号２９）：ヒト重鎖ヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号８）、それに続く定常領域２及び３、それに続く（Ｇ４Ｓ）₄リンカー、及び抗ＣＤ２０重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）；並びに２）次の要素をコードする構築物ＶＬ（抗ＣＤ２０）−ＣＬ（配列番号２８）：抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域）。これら２つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号３０及び配列番号２８に示される。

Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＣＤ２０（ＬＣ）の発現のために、以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｇ４Ｓ−ＶＬ（抗ＣＤ２０）−ＣＬ（配列番号３１）：ヒト重鎖ヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号８）、それに続く定常領域２及び３、それに続くＧ４Ｓリンカー、及び抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域；並びに２）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ２０）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号３２）：抗ＣＤ２０重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら２つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号３３及び配列番号３４に示される。

Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ２０（ＬＣ）の発現のために、以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）₄−ＶＬ（抗ＣＤ２０）−ＣＬ（配列番号３５）：ヒト重鎖ヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号８）、それに続く定常領域２及び３、それに続く（Ｇ４Ｓ）₄リンカー、並びに抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域；並びに２）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ２０）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号３２）：抗ＣＤ２０重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら２つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号３６及び配列番号３４に示される。

Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＣＤ２０（ＶＨＣＨ１）、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ２０（ＶＨＣＨ１）、Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＣＤ２０（ＬＣ）、及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ２０（ＬＣ）の発現のために、２つのベクターのセット各々を、Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅ（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルベニア州ウォリントン）を用いてＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に一過的に共トランスフェクションした。タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって一段階で精製した。２つのポリペプチドの発現及び完全四量体分子の構築を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で確認した。

くわえて、標準モノクローナル抗体フォーマットの対照抗ＣＤ２０（抗ＣＤ２０ＩｇＧ１）を生成して、異なるＦｃ−Ｆａｂフォーマットと比較した。

２Ｂ）Ｆｃ−Ｆａｂ前駆体の抗原への結合
Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＣＤ２０（ＶＨＣＨ１）、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ２０（ＶＨＣＨ１）、Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＣＤ２０（ＬＣ）、及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ２０（ＬＣ）の、細胞表面のＣＤ２０に結合する能力を、ＣＤ２０を発現するヒトＤａｕｄｉバーキットリンパ腫細胞で測定した。９６ウェルプレート中で、１つのウェルにつき１×１０⁵個のＤａｕｄｉ細胞を、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで希釈したさまざまな濃度の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ２０と、氷上で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで洗浄した後、細胞をＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１：２００に希釈したＴＲＩＴＣＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルベニア州ウェストグローブ）と氷上で３０分間インキュベーションした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ、ＥＭＤミリポア社、マサチューセッツ州ビレリカ）によって分析した。

結果は、抗ＣＤ２０ＩｇＧ１ほどではないが、Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＣＤ２０（ＶＨＣＨ１）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ２０（ＶＨＣＨ１）はＣＤ２０への結合を保持することを示す（図４）。リンカーを長くすることは結合を強めるようであるが、抗ＥＧＦＲと同じ程度までではない（図３）。Ｆｃ−Ｇ４Ｓ−抗ＣＤ２０（ＬＣ）もＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ２０（ＬＣ）もＣＤ２０への結合を保持しない（図４）。ＦｃのＣ末端における結合、とりわけＶＬによる結合の際、抗ＣＤ２０Ｆａｂの細胞膜に発現したＣＤ２０への結合は悪い。ＣＤ２０は膜貫通型タンパク質であり、抗ＣＤ２０は細胞外ループにのみ結合する。恐らくＦｃは、小さなループに結合するＣ末端Ｆａｂへの接近可能性に支障を来たす。抗ＥＧＦＲなどのより大きな細胞外ドメインに対する抗体のほうがより良い四価二重特異性抗体の候補である。

実施例３
抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲ
３Ａ）ＴｅｔＢｉＡｂの構築及び発現
ＥＧＦＲ及びＣＤ１６に対するＴｅｔＢｉＡｂの生成は、抗ＥＧＦＲＣ２２５（セツキシマブ）モノクローナル抗体（Kawamoto, PNAS 80:1337, 1983）及び抗ＣＤ１６３Ｇ８モノクローナル抗体（Fleit et al, PNAS 79:3275, 1982）に基づく。Ｃ２２５のＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号１及び配列番号２に提供される。Ｃ２２５のＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号３及び配列番号４に提供される。３Ｇ８のＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号３７及び配列番号３８に提供される。３Ｇ８のＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号３９及び配列番号４０に提供される。ＥＧＦＲ及びＣＤ１６分子に対する２つの異なるＴｅｔＢｉＡｂを生成した：（ｉ）抗ＥＧＦＲ重鎖ポリペプチドのＣ末端がＧ４Ｓリンカーを介して抗ＣＤ１６Ｆａｂ軽鎖のＮ末端に連結する抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６、及び（ｉｉ）抗ＣＤ１６重鎖ポリペプチドのＣ末端がＧ４Ｓリンカーを介して抗ＥＧＦＲＦａｂ軽鎖のＮ末端に連結する抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲ。

抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６ＴｅｔＢｉＡｂの発現のために、図１にあるように、以下の３つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ（抗ＣＤ１６）−ＣＬ（配列番号４１）：抗ＥＧＦＲ重鎖可変領域、それに続くエフェクターサイレントＩｇＧ１．４（Armour et al, Eur J. Immunol. 29:2813, 1999に記載の変異を含む）由来のヒト重鎖定常領域１〜３、それに続くＧ４Ｓリンカー、及び抗ＣＤ１６軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、２）次の要素をコードする構築物ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＬ（配列番号１２）：抗ＥＧＦＲ軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、３）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ１６）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号：４２）：抗ＣＤ１６重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら３つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号４３、配列番号１４、及び配列番号４４に示される。

抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲＴｅｔＢｉＡｂの発現のために、図１にあるように、以下の３つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ１６）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＬ（配列番号４５）：抗ＣＤ１６重鎖可変領域、それに続くエフェクターサイレントＩｇＧ１．４由来のヒト重鎖定常領域１〜３、それに続くＧ４Ｓリンカー、及び抗ＥＧＦＲ軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、２）次の要素をコードする構築物ＶＬ（抗ＣＤ１６）−ＣＬ（配列番号４８）：抗ＣＤ１６軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、３）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号１６）：抗ＥＧＦＲ重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら３つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号１８に示される。

抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲの発現のために、３つのベクターのセット各々を、Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅ（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルベニア州ウォリントン）を用いてＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に一過的に共トランスフェクションした。２つのＴｅｔＢｉＡｂをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって一段階で精製した。３つのポリペプチドの発現及び完全六量体分子の構築を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに関して、精製したＴｅｔＢｉＡｂ試料をＤＴＴで還元し、ＮｕＰＡＧＥＭＥＳ４〜１２％ゲルに２００Ｖで３５分間流した後、クマシー染色した。

ゲルの３つの主なバンドは、予想された分子量（ＭＷ）及び正しい化学量論比を有し、純度が＞９５％であった（図５Ａ）。図５Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲの３つのポリペプチドの予想ＭＷ（７３．６、２３．８、２３．８ｋＤａ）及び正しい化学量論比（１：１：１）を示し、レーン３は抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６の３つのポリペプチドの予想ＭＷ（７３．３、２３．６、２３．３ｋＤａ）及び正しい化学量論比（１：１：１）を示す。ＳＥＣに関して、精製したＴｅｔＢｉＡｂ試料を５０ｍＭリン酸ナトリウム、４００ｍＭ過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１、及び３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ²で平衡化したＴＳＫ−ＧＥＬスーパーＳＷ３０００ＳＥＣカラム４．６×３００ｍｍ（東ソー・バイオサイエンス、東京、日本）で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体の抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲともに、予想ＭＷである約２５０ｋＤａにピークを示した（図５Ｂ）。

くわえて、多くの対照を生成してＴｅｔＢｉＡｂフォーマットと比較、又はＴｅｔＢｉＡｂフォーマットを最適化した。それらには、標準モノクローナル抗体フォーマットの抗ＥＧＦＲ（抗ＥＧＦＲＩｇＧ１）及びエフェクターサイレントフォーマットの抗ＥＧＦＲ（抗ＥＧＦＲＩｇＧ１．４）が含まれる。

３Ｂ）ＴｅｔＢｉＡｂの抗原への結合
抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲのＥＧＦＲに対する結合を保持する能力を競合放射性リガンド結合アッセイによって示す。ＥＧＦＲを過剰発現するヒトＡ４３１類表皮がん細胞から調製した２ｍｇの膜を加える前に、競合する抗体を¹²⁵Ｉ−ＥＧＦ（パーキンエルマー社、マサチューセッツ州ウォルサム）と混ぜた。Ａ４３１細胞膜は窒素キャビテーションによって調製した。細胞を９００プサイのＮ₂ガスで３０分間粉砕し、その後溶解物を１０００ｇで４℃にて１０分間遠心分離した。上澄みを集め、１００，０００ｇで４℃にて１時間遠心分離した。結果として得られたペレットをダウンス型ホモジナイザーで懸濁した。試料のタンパク質濃度を、バイオ・ラッドタンパク質アッセイ試薬を用いて決定し、将来使用するために試料を−８０℃で冷凍保存した。非特異的結合は、ＥＧＦＲ結合部位を飽和する大過剰の非標識ＥＧＦ（１００ｎＭ）の存在下で決定した。反応を振とうしながら３７℃で９０分間インキュベーションし、グラスファイバーフィルター（ＥＭＤミリポア社、マサチューセッツ州ビレリカ）を通して濾過することによって終わらせた。フィルターを洗浄し、ガンマカウンターで計測してＡ４３１細胞膜に結合した¹²⁵Ｉ−ＥＧＦの量を決定した。

結果は、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６は抗ＥＧＦＲと同様の¹²⁵Ｉ−ＥＧＦのＡ４３１細胞膜のＥＧＦＲへの結合を阻害する能力を有することを示す。また、抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲは僅かに高い阻害定数（Ｋｉ）であるがＥＧＦＲに結合し（図６）、別の抗体のＣ末端に融合された抗ＥＧＦＲＦａｂはＥＧＦＲへの結合を保持したことを示す。

３Ｃ）ＴｅｔＢｉＡｂの生体活性
さらに、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲの機能及び効用を、Mueller et al（J. Immunol. 144:1382, 1990）に記載の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイで示した。３×１０⁶個のヒトＡ４３１類表皮がん細胞を３００μＣｉのＮａ⁵¹Ｃｒ（パーキンエルマー社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて３７℃で４５分間標識した。細胞を洗浄した後、５００個の細胞を、０．２５〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度に連続希釈した組み換え抗体とともに９６ウェルプレートの各ウェルに移した。エフェクター細胞と４時間インキュベーションした後に、特異的溶解を測定した。エフェクター細胞は静止期ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（エフェクター細胞と標的細胞の比１００：１）又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（エフェクター細胞と標的細胞の比１０：１）のいずれかであった。ＮＫ細胞をＭＡＣＳＮＫ細胞単離キット（ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）を用いてＰＢＭＣから単離した。標的細胞をトリトン１００界面活性剤を用いて溶解することによって、総放出可能放射能（最大溶解）を測定した。バックグラウンドの自然発生放射能放出を標的細胞のみを含むウェルで測定した。特異的溶解の割合は、実験値からバックグラウンドの溶解を引いて、最大溶解で割って、１００を掛けることによって算出した。

エフェクターサイレントＩｇＧ１．４のＦｃはＮＫ細胞のＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合できないので、このアッセイではＡＤＣＣが起こるのに２つの異なる細胞タイプの抗原に対するＴｅｔＢｉＡｂの同時結合が要求される。特に抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲは、Ａ４３１細胞の死滅及びＡ４３１細胞からのＣｒ放出が起こるためには標的Ａ４３１細胞のＥＧＦＲとエフェクターＮＫ細胞のＣＤ１６の両方に結合しなければならない。

結果は、エフェクターサイレントＦｃを含む抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ１６／抗ＥＧＦＲはともに、陽性対照抗ＥＧＦＲＩｇＧ１と比較して、低い抗体濃度でより強力なＡＤＣＣを誘発したことを示す（図７）。ＴｅｔＢｉＡｂの両方のエフェクターサイレントＦｃは観察されたＡＤＣＣに寄与することができなかったので、その結果は抗ＣＤ１６によるＦｃγＲＩＩＩの効果的な結合を示唆する。
実際に、同様に同じエフェクターサイレントＦｃを含む陰性対照抗ＥＧＦＲＩｇＧ１．４はＡＤＣＣを誘発できなかった（図７）。今日まで、診療所での多くの治療用ＩｇＧ１抗体の投与は、注入関連反応の「初回投与効果」を引き起こす可能性があるので、特異的かつ選択的にＦｃγＲＩＩＩのみに結合する能力をもつ治療用ＴｅｔＢｉＡｂは有益である。これらの反応は、架橋結合及び全身活性化を導くＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＩＡなどの他の活性化受容体へのＦｃの同時結合に起因すると考えられる（McCall et al, J Immunol. 166:61 12, 2001）。

実施例４
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６
４Ａ）ＴｅｔＢｉＡｂの構築及び発現
ＣＤ２０及びＣＤ１６に対するＴｅｔＢｉＡｂの生成は、抗ＣＤ２０２Ｂ８（リツキシマブ）モノクローナル抗体（Reff et al, Blood 83:435, 1994）及び抗ＣＤ１６３Ｇ８モノクローナル抗体（Fleii et al, PNAS 79:3275, 1982）に基づく。２Ｂ８のＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号２１及び配列番号２２に提供される。２Ｂ８のＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号２３及び配列番号２４に提供される。３Ｇ８のＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号３７及び配列番号３８に提供される。３Ｇ８のＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号３９及び配列番号４０に提供される。１つのＣＤ２０及びＣＤ１６分子に対するＴｅｔＢｉＡｂを生成した：抗ＣＤ２０重鎖ポリペプチドのＣ末端がＧ４Ｓリンカーを介して抗ＣＤ１６Ｆａｂ軽鎖のＮ末端に連結される抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６。

抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６ＴｅｔＢｉＡｂの発現のために、図１にあるように、以下の３つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ２０）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ（抗ＣＤ１６）−ＣＬ（配列番号４９）：抗ＣＤ２０重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１〜３アイソタイプＩｇＧ１、それに続くＧ４Ｓリンカー、及び抗ＣＤ１６軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、２）次の要素をコードする構築物ＶＬ（抗ＣＤ２０）−ＣＬ（配列番号２６）：抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、３）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ１６）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号５０）：抗ＣＤ１６重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら３つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号５１、配列番号２８、及び配列番号５２に示される。

抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６の発現のために、３つのベクターを、Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅ（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルベニア州ウォリントン）を用いてＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に一過的に共トランスフェクションした。２つのＴｅｔＢｉＡｂをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって一段階で精製した。３つのポリペプチドの発現及び完全六量体分子の構築を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣで確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに関して、精製したＴｅｔＢｉＡｂ試料をＤＴＴで還元し、ＮｕＰＡＧＥＭＥＳ４〜１２％ゲルに２００Ｖで３５分間流した後、クマシー染色した。ゲルの３つの主なバンドは予想されたＭＷ及び正しい化学量論比を有し、純度が＞９５％であった（図８Ａ）。図８Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６の３つのポリペプチドの予想ＭＷ（７３．２、２３．１、２２．９ｋＤａ）及び正しい化学量論比（１：１：１）を示す。ＳＥＣに関して、精製したＴｅｔＢｉＡｂ試料を５０ｍＭリン酸ナトリウム、４００ｍＭ過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１、及び３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ²で平衡化したＴＳＫ−ＧＥＬスーパーＳＷ３０００ＳＥＣカラム４．６×３００ｍｍ（東ソー・バイオサイエンス、東京、日本）で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６の予想ＭＷである約２５０ｋＤａにピークを示した（図８Ｂ）。

くわえて、標準モノクローナル抗体フォーマットの抗ＣＤ２０（抗ＣＤ２０ＩｇＧ１）を対照として生成して、Ｆｃ−Ｆａｂフォーマットと比較した。

４Ｂ）ＴｅｔＢｉＡｂの抗原への結合
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６の、細胞表面のＣＤ２０への結合を保持する能力を、ＣＤ２０を発現するがＣＤ１６を発現しないヒトＲａｍｏｓバーキットリンパ腫細胞で測定した。９６ウェルプレート中で、１つのウェルにつき１×１０⁵個のＲａｍｏｓ細胞を、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで希釈したさまざまな濃度の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ２０と、氷上で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで洗浄した後、細胞をＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１：２００に希釈したＴＲＩＴＣＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルベニア州ウェストグローブ）と氷上で３０分間インキュベーションした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ、ＥＭＤミリポア社、マサチューセッツ州ビレリカ）によって分析した。

結果は、陽性対照抗ＣＤ２０ほどではないが、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６はＤａｕｄｉ細胞に発現するＣＤ２０への結合することを示す（図９）。Ｃ末端での抗ＣＤ１６がＮ末端での抗ＣＤ２０のＤａｕｄｉ細胞への結合に影響する可能性は理論的に考えられうるが、より可能性の高い説明は、Ｃ末端での抗ＣＤ１６ＦａｂがＦｃの接近可能性に影響してＴＲＩＴＣＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγを検出したという技術的なものである。

４Ｃ）ＴｅｔＢｉＡｂの生体活性
さらに、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６の機能及び効用を、ヒトＲａｍｏｓバーキットリンパ腫細胞を用いた抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイによって示した。２０００個の細胞を、０．０５〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度に連続希釈した組み換え抗体とともに９６ウェルプレートの各ウェルに移した。ナチュラルキラー（ＮＫ）エフェクター細胞（エフェクター細胞と標的細胞の比１０：１）と４時間インキュベーションした後に、乳酸脱水素酵素を介して特異的溶解を測定した。ＮＫ細胞をＭＡＣＳＮＫ細胞単離キット（ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）を用いて静止期ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。標的細胞をトリトン１００界面活性剤を用いて溶解することによって、総放出可能ＬＤＨ（最大溶解）を測定した。バックグラウンドの自然発生ＬＤＨ放出を標的細胞のみを含むウェルで測定した。特異的溶解の割合は、実験値からバックグラウンドの溶解を引いて、最大溶解で割って、１００を掛けることによって算出した。

ＡＤＣＣ結果の２つのグラフは、異なる提供者のエフェクター細胞の用いたことを除いて同様に行なわれた別々の実験からのデータを示す。抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ１６と違って、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６はそのＩｇＧ１フォーマットに起因して、抗ＣＤ１６がエフェクター細胞のＣＤ１６と結合することなしに誘発できた。しかし、７名中４名の提供者からのエフェクター細胞に関して、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６とインキュベーションしたＲａｍｏｓ細胞のＡＤＣＣは、抗ＣＤ２０と比較して１０倍の増大が観察された（図１０、上パネル）。他の３名の提供者については、抗ＣＤ２０と比較した抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６のＡＤＣＣ増大はわずかであった（図１０、下パネル）。理論に束縛されるものではないが、これは恐らくＦｃＲＩＩＩＡの多形性に起因すると考えられる（Cartron et al, 2002 Blood）。図１０、下パネルに見られるように、Ｆｃの結合親和力を増加するＦｃＲＩＩＩＡの１５８番目のバリンの同型である提供者に関して、その提供者らのＦｃＲＩＩＩＡ保有ＮＫ細胞はＡＤＣＣアッセイにおける抗ＣＤ１６結合の効果が少ない可能性があると思われる。

実施例５
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７
５Ａ）ＴｅｔＢｉＡｂの構築及び発現
ＣＤ２０及びＣＤ４７に対するＴｅｔＢｉＡｂの生成は、抗ＣＤ２０２Ｂ８（リツキシマブ）モノクローナル抗体（Reff et al, Blood 83:435, 1994）及び抗ＣＤ４７Ｂ６Ｈ１２モノクローナル抗体（Lindberg et al, JBC 269: 1567, 1994）に基づく。２Ｂ８のＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号２１及び配列番号２２に提供される。２Ｂ８のＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号２３及び配列番号２４に提供される。Ｂ６Ｈ１２のＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号５３及び配列番号５４に提供される。Ｂ６Ｈ１２のＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号５５及び配列番号５６に提供される。１つのＣＤ２０及びＣＤ４７分子に対するＴｅｔＢｉＡｂを生成した：抗ＣＤ２０重鎖ポリペプチドのＣ末端がＧ４Ｓリンカーを介して抗ＣＤ４７Ｆａｂ軽鎖のＮ末端に連結される抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７。

抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７ＴｅｔＢｉＡｂの発現のために、図１にあるように、以下の３つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ２０）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ（抗ＣＤ４７）−ＣＬ（配列番号５７）：抗ＣＤ２０重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１〜３アイソタイプＩｇＧ１、それに続くＧ４Ｓリンカー、及び抗ＣＤ４７軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、２）次の要素をコードする構築物ＶＬ（抗ＣＤ２０）−ＣＬ（配列番号２６）：抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、３）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ４７）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号５８）：抗ＣＤ４７重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら３つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号５９、配列番号２８、及び配列番号６０に示される。

抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７の発現のために、３つのベクターを、Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅ（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルベニア州ウォリントン）を用いてＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に一過的に共トランスフェクションした。ＴｅｔＢｉＡｂをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって一段階で精製した。３つのポリペプチドの発現及び完全六量体分子の構築を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣで確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに関して、精製したＴｅｔＢｉＡｂ試料をＤＴＴで還元し、ＮｕＰＡＧＥＭＥＳ４〜１２％ゲルに２００Ｖで３５分間流した後、クマシー染色した。ゲルの３つの主なバンドは予想されたＭＷ及び正しい化学量論比を有し、純度が＞９５％であった（図１１Ａ）。図１１Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７の３つのポリペプチドの予想ＭＷ（７３．８、２３．４、２３．０ｋＤａ）及び正しい化学量論比（１：１：１）を示す。ＳＥＣに関して、精製したＴｅｔＢｉＡｂ試料を５０ｍＭリン酸ナトリウム、４００ｍＭ過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１、及び３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ²で平衡化したＴＳＫ−ＧＥＬスーパーＳＷ３０００ＳＥＣカラム４．６×３００ｍｍ（東ソー・バイオサイエンス、東京、日本）で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７の予想ＭＷである約２５０ｋＤａにピークを示した（図１１Ｂ）。

くわえて、標準モノクローナル抗体フォーマットの抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ４７（抗ＣＤ２０ＩｇＧ１及び抗ＣＤ４７ＩｇＧ１）を対照として生成して、ＴｅｔＢｉＡｂフォーマットと比較した。

５Ｂ）ＴｅｔＢｉＡｂの結合
（ｉ）ＴｅｔＢｉＡｂの抗原への結合
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７の、細胞表面に発現する両抗原に結合する能力を測定し、２つの対照分子抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ４７と比較した。９６ウェルプレート中で、１つのウェルにつき１×１０⁵個のＣＤ２０をトランスフェクションしたマウスＮＳ０骨髄腫細胞又はヒトＵ９３７組織球性リンパ腫細胞を、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで希釈したさまざまな濃度の抗体と、氷上で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで洗浄した後、細胞をＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１：２００に希釈したＴＲＩＴＣＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルベニア州ウェストグローブ）と氷上で３０分間インキュベーションした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ、ＥＭＤミリポア社、マサチューセッツ州ビレリカ）によって分析した。

結果は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７及び抗ＣＤ２０はＣＤ２０をトランスフェクションしたＮＳ０細胞の発現させたＣＤ２０に結合するが、抗ＣＤ４７は、ＣＤ４７が発現していないのでＮＳ０／ＣＤ２０細胞に結合しないことを示す（図１２Ａ）。
実施例４ＢでのＣＤ２０への抗ＣＤ２０／抗ＣＤ１６の結合が明らかに減少した先の観察例の場合と同様に、Ｃ末端での抗ＣＤ４７がＮ末端での抗ＣＤ２０のＣＤ２０への結合に影響した可能性は低い（図１２Ａ）。よりふさわしい説明としてはＣ末端での抗ＣＤ４７ＦａｂがＴＲＩＴＣＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ検出に対するＦｃの接近可能性に影響し、それによって結果として図１２Ａの観察された明らかに減少した結合が観察された。抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７及び抗ＣＤ４７はＵ９３７細胞に結合し、抗ＣＤ２０はＣＤ４７を発現するがＣＤ２０を発現しないＵ９３７細胞に結合しない（図１２Ｂ）。抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７のＵ９３７細胞への結合は、軽鎖によってＦｃのＣ末端に結合されたＣ末端Ｆａｂとしての抗ＣＤ４７は、それでもやはりその抗原を認識できることを示す（図１２Ｂ）。観察された結合の僅かな減少は、ＦｃのＣ末端に結合された場合に抗ＥＧＦＲＦａｂで観察された減少と同様である（図２及び図３）。

（ｉｉ）抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７ＴｅｔＢｉＡｂの両抗原を発現する細胞に対する結合アビディティー
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７の細胞表面のＣＤ２０及びＣＤ４７への結合を、ＣＤ２０を過剰発現し、ＣＤ４７を低レベルで発現するヒトＳＵ−ＤＨＬ４Ｂ細胞リンパ腫細胞で測定した。抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７、抗ＣＤ２０、及び抗ＣＤ４７を、アレクサフルオル（登録商標）４８８カルボン酸，ＴＦＰエステル，ビス（トリエチルアンモニウム塩）（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）と結合した。９６ウェルプレート中で、１つのウェルにつき１×１０⁵個のＳＵ−ＤＨＬ４細胞を、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで希釈したさまざまな濃度のアレクサ４８８標識抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７、抗ＣＤ２０、及び抗ＣＤ４７と、氷上で６０分間インキュベーションした。ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで洗浄した後、細胞をＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をフローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ、ミルテニーバイオテク社、ケルン、ドイツ）によって分析した。

結果は、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞への抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７結合が、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞への抗ＣＤ２０又は抗ＣＤ４７の単独での結合又は組み合せての結合と比較して増大したことを示し（図１２Ｃ）、親和性について強力な証拠を提供する。抗ＣＤ４７の結合を得た低い中央蛍光値からも明らかなようにＳＵ−ＤＨＬ４細胞のＣＤ４７発現のレベルは低いので、それはとりわけ特筆すべきである。同一細胞の２つの腫瘍標的に結合することによって腫瘍細胞に結合するアビディティーを付するＴｅｔＢｉＡｂの能力は、結果として生体内において標的をより特異的にし、副作用をより少なくしうる。

５Ｃ）ＴｅｔＢｉＡｂの生体活性
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７の効用を生体内実験によって示す。播種性リンパ腫モデルでは、ＳＣＩＤマウスに５×１０⁶個のＣＤ２０＋ヒトＲａｊｉリンパ腫細胞を静注した後、２００ｍｇ／マウスの抗体アイソタイプ対照（群１）、２００ｍｇ／マウスの抗ＣＤ２０（群２）、２００ｍｇ／マウスの抗ＣＤ４７（群３）、２００ｍｇ／マウスの抗ＣＤ２０と２００ｍｇ／マウスの抗ＣＤ４７の組み合わせ（群４）、又は等モル量の四価二重特異性抗体である３３３ｍｇ／マウスの抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７（群５）を静注する。すべての群（ｎ＝１０）は毎週注射を受け、結果はマウスの全身の健康状態、例えば１０〜１４日で死に至るまひ症、及び生存として報告される。抗ＣＤ２０／抗ＣＤ４７四価二重特異性抗体での治療（群５）は、併用治療（群４）と少なくとも同じくらい効果があり、２つの単剤治療（群２及び群３）より優れることがわかった。

実施例６
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２及び抗ＣＤ５２／抗ＣＤ２０
６Ａ）ＴｅｔＢｉＡｂの構築及び発現
ＣＤ２０及びＣＤ５２に対するＴｅｔＢｉＡｂの生成は、抗ＣＤ２０２Ｂ８（リツキシマブ）モノクローナル抗体（Reff et al, Blood 83:435, 1994）及び抗ＣＤ５２Ｃａｍｐａｔｈモノクローナル抗体（James et al, JMB 289:293, 1999）に基づく。２Ｂ８のＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号２１及び配列番号２２に提供される。２Ｂ８のＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号２３及び配列番号２４に提供される。ＣａｍｐａｔｈのＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号６１及び配列番号６２に提供される。ＣａｍｐａｔｈのＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号６３及び配列番号６４に提供される。ＣＤ２０及びＣＤ５２分子に対する２つの異なるＴｅｔＢｉＡｂを生成した：（ｉ）抗ＣＤ２０重鎖ポリペプチドのＣ末端がＧ４Ｓリンカーを介して抗ＣＤ５２Ｆａｂ軽鎖のＮ末端に連結される抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２、（ｉｉ）抗ＣＤ５２重鎖ポリペプチドのＣ末端がＧ４Ｓリンカーを介して抗ＣＤ２０Ｆａｂ軽鎖のＮ末端に連結される抗ＣＤ５２／抗ＣＤ２０。

抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２ＴｅｔＢｉＡｂの発現のために、図１にあるように、以下の３つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ２０）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ（抗ＣＤ５２）−ＣＬ（配列番号８５）：抗ＣＤ２０重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１〜３アイソタイプＩｇＧ１、それに続くＧ４Ｓリンカー、及び抗ＣＤ５２軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、２）次の要素をコードする構築物ＶＬ（抗ＣＤ２０）−ＣＬ（配列番号２６）：抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、３）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ５２）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号８６）：抗ＣＤ５２重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら３つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号６７、配列番号２８、及び配列番号６８に示される。

抗ＣＤ５２／抗ＣＤ２０ＴｅｔＢｉＡｂの発現のために、図１にあるように、以下の３つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ５２）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ（抗ＣＤ２０）−ＣＬ（配列番号６９）：抗ＣＤ５２重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１〜３アイソタイプＩｇＧ１、それに続くＧ４Ｓリンカー、及び抗ＣＤ２０軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、２）次の要素をコードする構築物ＶＬ（抗ＣＤ５２）−ＣＬ（配列番号７０）：抗ＣＤ５２軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、３）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ２０）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号３２）：抗ＣＤ２０重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら３つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号７１、配列番号７２、及び配列番号３４に示される。

抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２及び抗ＣＤ５２／抗ＣＤ２０の発現のために、３つのベクターのセット各々を、Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅ（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルベニア州ウォリントン）を用いてＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に一過的に共トランスフェクションした。２つのＴｅｔＢｉＡｂをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって一段階で精製した。３つのポリペプチドの発現及び完全六量体分子の構築を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに関して、精製したＴｅｔＢｉＡｂ試料をＤＴＴで還元し、ＮｕＰＡＧＥＭＥＳ４〜１２％ゲルに２００Ｖで３５分間流した後、クマシー染色した。ゲルの３つの主なバンドは予想された分子量（ＭＷ）及び正しい化学量論比を有し、純度が＞９５％であった（図１３Ａ）。図１３Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２の３つのポリペプチドの予想ＭＷ（７３．０、２３．４、２３．１ｋＤａ）及び正しい化学量論比（１：１：１）を示し、レーン３は抗ＣＤ５２／抗ＣＤ２０の３つのポリペプチドの予想ＭＷ（７２．７、２３．５、２３．２ｋＤａ）及び正しい化学量論比（１：１：１）を示す。ＳＥＣに関して、精製したＴｅｔＢｉＡｂ試料を５０ｍＭリン酸ナトリウム、４００ｍＭ過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１、及び３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ²で平衡化したＴＳＫ−ＧＥＬスーパーＳＷ３０００ＳＥＣカラム４．６×３００ｍｍ（東ソー・バイオサイエンス、東京、日本）で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２及び抗ＣＤ５２／抗ＣＤ２０ともに、予想ＭＷである約２５０ｋＤａにピークを示した（図１３Ｂ）。

くわえて、多くの対照を生成してＴｅｔＢｉＡｂフォーマットと比較、又はＴｅｔＢｉＡｂフォーマットを最適化した。それらには、標準モノクローナル抗体フォーマットの抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ５２（抗ＣＤ２０ＩｇＧ１及び抗ＣＤ５２ＩｇＧ１）が含まれる。

６Ｂ）ＴｅｔＢｉＡｂの抗原への結合
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２及び抗ＣＤ５２／抗ＣＤ２０の細胞表面に発現するＣＤ２０及びＣＤ５２への結合を測定し、２つの対照分子抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ５２と比較した。９６ウェルプレート中で、１つのウェルにつき１×１０⁵個のヒトＤａｕｄｉバーキットリンパ腫細胞又はヒトＫａｓｕｍｉ−３急性骨髄芽球白血病細胞を、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで希釈したさまざまな濃度の抗体と、氷上で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで洗浄した後、細胞をＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１：２００に希釈したＴＲＩＴＣＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルベニア州ウェストグローブ）と氷上で３０分間インキュベーションした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ、ＥＭＤミリポア社、マサチューセッツ州ビレリカ）によって分析した。

結果は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２及び抗ＣＤ２０結合はＤａｕｄｉ細胞に結合し、抗ＣＤ５２／抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ５２は、ＣＤ２０を発現するがＣＤ５２を発現しないＤａｕｄｉ細胞に結合しないことを示す（図１４Ａ）。そのうえ、抗ＣＤ５２／抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ５２はＫａｓｕｍｉ−３細胞に結合し、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ５２及び抗ＣＤ２０はＣＤ５２を発現するがＣＤ２０を発現しないＫａｓｕｍｉ−３細胞に結合しない（図１４Ｂ）。

これらの結果は、抗ＣＤ２０ＦａｂはＦｃ領域のＣ末端においてＦａｂ軽鎖を介して結合したとき細胞膜に発現されたＣＤ２０に結合しないことを示す図４の結果と一致する。ＣＤ５２及びＣＤ２０はともに小さい細胞外領域を含む膜貫通型タンパク質であり、抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ５２は細胞外ループにのみ結合する。恐らくＦｃ領域はその小さなループに結合するＣ末端Ｆａｂの接近可能性に支障を来たすと考えられる。例として、標的のこの組み合わせは図１Ｃ及び図１Ｄに図示される代替的なコンフォメーションでのＴｅｔＢｉＡｂの良い候補でありうる。
実施例２では、抗ＣＤ２０ＦａｂはＦｃ領域のＣ末端にＦａｂ重鎖を介して結合した場合には結合を保持するが、軽鎖を介して結合した場合には結合を保持しないことが示された。よって、抗ＣＤ２０ＦａｂはＦｃ領域のＣ末端にＦａｂ重鎖を介して結合し、抗ＣＤ５２ＦａｂはＦｃ領域のＮ末端に（標準モノクローナル抗体フォーマットにあるようにＣＨ１を介するよりむしろ）軽鎖を介して結合する。結果として得られた抗ＣＤ５２／抗ＣＤ２０の両抗原への結合を次に調べた。Ｆｃ領域のＮ末端に軽鎖を介して結合された抗ＣＤ２０Ｆａｂ（Schaefer et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 108:1 1 187, 2011）や、Ｆｃ領域のＣ末端にＦａｂ重鎖を介して結合された抗ＣＤ５２を含むさらなる変形も設計されて調べられる。

実施例７
Ｆｃ−抗ＣＤ４７前駆体分子
７Ａ）Ｆｃ−Ｆａｂ前駆体の構築及び発現
Ｆｃ−抗ＣＤ４７の生成は、抗ＣＤ４７Ｂ６Ｈ１２モノクローナル抗体（Lindberg et al, JBC 269: 1567, 1994）に基づく。Ｂ６Ｈ１２のＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号５３及び配列番号５４に提供される。Ｂ６Ｈ１２のＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号５５及び配列番号５６に提供される。２つの異なるＦｃ−ＣＤ４７分子を生成した：（ｉ）Ｆｃ重鎖のＣ末端が（Ｇ４Ｓ）₄リンカーを介して抗ＣＤ４７Ｆａｂ重鎖のＮ末端に連結されるＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ４７（ＶＨＣＨ１）、及び（ｉｉ）Ｆｃ領域重鎖のＣ末端が（Ｇ４Ｓ）₄リンカーを介して抗ＣＤ４７Ｆａｂ軽鎖のＮ末端に連結されるＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ４７（ＬＣ）。

Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ４７（ＶＨＣＨ１）の発現のために、以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）₄−ＶＨ（抗ＣＤ４７）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号７３）：システイン（天然に元々から軽鎖とジスルフィド結合を形成する）をセリンに変異させたヒト重鎖ヒンジ領域（ＥＰＫＳＳ、配列番号８）、それに続く定常領域２及び３、それに続く（Ｇ４Ｓ）₄リンカー、及び抗ＣＤ４７重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域（ＥＰＫＳＣ、配列番号１０、抗ＣＤ４７軽鎖とのジスルフィド架橋を可能にするため；並びに２）次の要素をコードする構築物ＶＬ（抗ＣＤ４７）−ＣＬ（配列番号７４）：抗ＣＤ４７軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域。これら２つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号７５及び配列番号７６に示される。

Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ４７（ＬＣ）の発現のために、以下の２つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）₄−ＶＬ（抗ＣＤ４７）−ＣＬ（配列番号７７）：ヒト重鎖ヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号８）、それに続く定常領域２及び３、それに続く（Ｇ４Ｓ）₄リンカー、及び抗ＣＤ４７軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域；並びに２）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ４７）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号５８）：抗ＣＤ４７重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら２つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号７８及び配列番号６０に示される。

Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ４７（ＶＨＣＨ１）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ４７（ＬＣ）の発現のために、２つのベクターのセット各々を、Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅ（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルベニア州ウォリントン）を用いてＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に一過的に共トランスフェクションした。タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって一段階で精製した。２つのポリペプチドの発現及び完全四量体分子の構築を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で確認した。

くわえて、対照標準モノクローナル抗体フォーマットの抗ＣＤ４７（抗ＣＤ４７ＩｇＧ１）を対照として生成して、異なるＦｃ−Ｆａｂフォーマットと比較した。

７Ｂ）Ｆｃ−Ｆａｂ前駆体の抗原への結合
Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ４７（ＶＨＣＨ１）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ４７（ＬＣ）のＣＤ４７に結合する能力をＥＬＩＳＡによって測定し、対照分子抗ＣＤ４７と比較した。ヒトＣＤ４７を９６ウェルプレートに４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ウェルをＰＢＳＴ＋２％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロックした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＴ＋２％ＢＳＡに希釈したさまざまな濃度の抗体をウェルに加えて室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＴ＋２％ＢＳＡで１：１００００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルベニア州ウェストグローブ）をウェルに加えて室温で１時間インキュベーションした。ＨＲＰ基質、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて、結合した抗体を可視化した。プレートを４５０ｎｍでの吸光度について測定した。結果は、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ４７（ＶＨＣＨ１）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）₄−抗ＣＤ４７（ＬＣ）は、抗ＣＤ４７ＩｇＧ１ほどではないが、ＣＤ４７への結合を保持することを示す（図１５）。

実施例８
抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７及び抗ＣＤ４７／抗ＥＧＦＲ
８Ａ）ＴｅｔＢｉＡｂの構築及び発現
ＥＧＦＲ及びＣＤ４７に対するＴｅｔＢｉＡｂの生成は、抗ＥＧＦＲＣ２２５（セツキシマブ）モノクローナル抗体（Kawamoto, PNAS 80:1337, 1983）及び抗ＣＤ４７Ｂ６Ｈ１２モノクローナル抗体（Lindberg et al, JBC 269: 1567, 1994）に基づく。Ｃ２２５のＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号１及び配列番号２に提供される。Ｃ２２５のＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号３及び配列番号４に提供される。Ｂ６Ｈ１２のＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号５３及び配列番号５４に提供される。Ｂ６Ｈ１２のＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号５５及び配列番号５６に提供される。ＥＧＦＲ及びＣＤ４７分子に対する２つの異なるＴｅｔＢｉＡｂを生成した：（ｉ）抗ＥＧＦＲ重鎖ポリペプチドのＣ末端が（Ｇ４Ｓ）₄リンカーを介して抗ＣＤ４７Ｆａｂ軽鎖のＮ末端に連結された抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７、及び（ｉｉ）抗ＣＤ４７重鎖ポリペプチドのＣ末端が（Ｇ４Ｓ）₄リンカーを介して抗ＥＧＦＲＦａｂ軽鎖のＮ末端に連結された抗ＣＤ４７／抗ＥＧＦＲ。

抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７ＴｅｔＢｉＡｂの発現のために、図１にあるように、以下の３つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）₄−ＶＬ（抗ＣＤ４７）−ＣＬ（配列番号７９）：抗ＥＧＦＲ重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１〜３、それに続く（Ｇ４Ｓ）₄リンカー、及び抗ＣＤ４７軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、２）次の要素をコードする構築物ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＬ（配列番号１２）：抗ＥＧＦＲ軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、３）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ４７）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号５８）：抗ＣＤ４７重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら３つの構築物に対応するアミノ酸配列番号はそれぞれ、配列番号８０、配列番号１４、及び配列番号６０に示される。

抗ＣＤ４７／抗ＥＧＦＲＴｅｔＢｉＡｂの発現のために、図１にあるように、以下の３つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ４７）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）₄−ＶＬ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＬ（配列番号８１）：抗ＣＤ４７重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１〜３、それに続く（Ｇ４Ｓ）₄リンカー、及び抗ＥＧＦＲ軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、２）次の要素をコードする構築物ＶＬ（抗ＣＤ４７）−ＣＬ（配列番号７４）：抗ＣＤ４７軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、３）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号１６）：抗ＥＧＦＲ重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら３つの構築物に対応するアミノ酸配列番号はそれぞれ、配列番号８２、配列番号７６、及び配列番号１８に示される。

抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７及び抗ＣＤ４７／抗ＥＧＦＲの発現のために、３つのベクターのセット各々を、Ｅｘｐｉ２９３ｆｅｃｔｉｎ（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を用いてＥｘｐｉ２９３細胞に一過的に共トランスフェクションした。２つのＴｅｔＢｉＡｂをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって一段階で精製した。３つのポリペプチドの発現及び完全六量体分子の構築を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに関して、精製したＴｅｔＢｉＡｂ試料をＤＴＴで還元し、ＮｕＰＡＧＥＭＥＳ４〜１２％ゲルに２００Ｖで３５分間流した後、クマシー染色した。ゲルの３つの主なバンドは予想された分子量（ＭＷ）及び正しい化学量論比を有し、純度が＞９５％であった（図１６Ａ）。図１６Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は抗ＣＤ４７／抗ＥＧＦＲの３つのポリペプチドの予想ＭＷ（７４、２４、２３ｋＤａ）及び正しい化学量論比（１：１：１）を示し、レーン３は抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７の３つのポリペプチドの予想ＭＷ（７４、２３、２３ｋＤａ）及び正しい化学量論比（１：１：１）を示す。ＳＥＣに関して、精製したＴｅｔＢｉＡｂ試料を５０ｍＭリン酸ナトリウム、４００ｍＭ過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１、及び３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ²で平衡化したＴＳＫ−ＧＥＬスーパーＳＷ３０００ＳＥＣカラム４．６＿３００ｍｍ（東ソー・バイオサイエンス、東京、日本）で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体の抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７及び抗ＣＤ４７／抗ＥＧＦＲともに、予想ＭＷである約２５０ｋＤａにピークを示した（図１６Ｂ）。

くわえて、多くの対照を生成してＴｅｔＢｉＡｂフォーマットと比較、又はＴｅｔＢｉＡｂフォーマットを最適化した。それらには、標準モノクローナル抗体フォーマットの抗ＥＧＦＲ（抗ＥＧＦＲＩｇＧ１）及び標準モノクローナル抗体フォーマットの抗ＣＤ４７（抗ＣＤ４７ＩｇＧ１）が含まれる。

８Ｂ）ＴｅｔＢｉＡｂの結合
（ｉ）ＴｅｔＢｉＡｂの抗原への結合
抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７及び抗ＣＤ４７／抗ＥＧＦＲのＣＤ４７への結合を保持する能力をＥＬＩＳＡによって測定した。ヒトＣＤ４７を９６ウェルプレートに４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ウェルをＰＢＳＴ＋２％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロックした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＴ＋２％ＢＳＡに希釈したさまざまな濃度の抗体をウェルに加えて室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＴ＋２％ＢＳＡで１：１００００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルベニア州ウェストグローブ）をウェルに加えて室温で１時間インキュベーションした。ＨＲＰ基質、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて、結合した抗体を可視化した。プレートを４５０ｎｍでの吸光度について測定した。

結果は、抗ＣＤ４７と同様に、抗ＣＤ４７／抗ＥＧＦＲはＣＤ４７への結合を保持することを示す。また抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７もＣＤ４７への結合を保持するが、抗ＣＤ４７ほど結合しない（図１７Ａ）。

抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７及び抗ＣＤ４７／抗ＥＧＦＲのＥＧＦＲへの結合を保持する能力をＥＬＩＳＡによって測定した。ヒトＥＧＦＲを９６ウェルプレートに４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ウェルをＰＢＳＴ＋２％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロックした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＴ＋２％ＢＳＡに希釈したさまざまな濃度の抗体をウェルに加えて室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＴ＋２％ＢＳＡで１：１００００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルベニア州ウェストグローブ）をウェルに加えて室温で１時間インキュベーションした。ＨＲＰ基質、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて、結合した抗体を可視化した。プレートを４５０ｎｍでの吸光度について測定した。

結果は、抗ＥＧＦＲと同様に、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７はＥＧＦＲへの結合を保持することを示す。また抗ＣＤ４７／抗ＥＧＦＲもＥＧＦＲへの結合を保持するが、抗ＥＧＦＲほど結合しない（図１７Ｂ）。

（ｉｉ）抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７ＴｅｔＢｉＡｂの両抗原を発現する細胞に対する結合アビディティー
抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７が細胞表面のＥＧＦＲ及びＣＤ４７にアビディティーで結合する能力を、ＥＧＦＲを過剰発現し、ＣＤ４７を発現するヒトＡ４３１類表皮がん細胞で測定した。抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７、抗ＥＧＦＲ、及び抗ＣＤ４７を、アレクサフルオル（登録商標）４８８カルボン酸，ＴＦＰエステル，ビス（トリエチルアンモニウム塩）（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）と結合させた。９６ウェルプレート中で、１つのウェルにつき１×１０⁵個のＡ４３１細胞を、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで希釈したさまざまな濃度のアレクサ４８８標識抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７、抗ＥＧＦＲ、及び抗ＣＤ４７と、氷上で６０分間インキュベーションした。ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで洗浄した後、細胞をＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をフローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ、ミルテニーバイオテク社、ケルン、ドイツ）によって分析した。

結果は、Ａ４３１細胞への抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ４７結合は、Ａ４３１細胞への抗ＥＧＦＲ若しくは抗ＣＤ４７個々又はそれらを合わせた結合と比較して増強されることを示し（図１７Ｃ）、アビディティーに関する強力な証拠を提供している。同一細胞の２つの腫瘍標的に結合することによって腫瘍細胞に結合するアビディティーを付するＴｅｔＢｉＡｂの能力は、結果として生体内において標的をより特異的にし、副作用をより少なくすることになりうる。

実施例９
抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ４７及び抗ＣＤ４７／抗ＨＥＲ２
９Ａ）ＴｅｔＢｉＡｂの構築及び発現
ＨＥＲ２及びＣＤ４７に対するＴｅｔＢｉＡｂの生成は、抗ＨＥＲ２４Ｄ５（トラスツズマブ）モノクローナル抗体（Carter et al, PNAS 89: 4285, 1992）及び抗ＣＤ４７Ｂ６Ｈ１２モノクローナル抗体（Lindberg et al, JBC 269: 1567, 1994）に基づく。４Ｄ５のＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号８３及び配列番号８４に提供される。４Ｄ５のＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号８５及び配列番号８６に提供される。Ｂ６Ｈ１２のＦａｂ軽鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号５３及び配列番号５４に提供される。Ｂ６Ｈ１２のＦａｂ重鎖のＤＮＡ配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号５５及び配列番号５６に提供される。ＨＥＲ２及びＣＤ４７分子に対する２つの異なるＴｅｔＢｉＡｂを生成した：（ｉ）抗ＨＥＲ２重鎖ポリペプチドのＣ末端が抗ＣＤ４７Ｆａｂ軽鎖のＮ末端に（Ｇ４Ｓ）₄リンカーを介して連結される抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ４７抗体、（ｉｉ）抗ＣＤ４７重鎖ポリペプチドのＣ末端が抗ＨＥＲ２Ｆａｂ軽鎖のＮ末端に（Ｇ４Ｓ）₄リンカーを介して連結される抗ＣＤ４７／抗ＨＥＲ２抗体。

抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ４７ＴｅｔＢｉＡｂの発現のために、図１にあるように、以下の３つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（分泌のためのマウス軽鎖シグナルペプチド配列を含む）にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＨＥＲ２）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）₄−ＶＬ（抗ＣＤ４７）−ＣＬ（配列番号８７）：抗ＨＥＲ２重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１〜３、それに続く（Ｇ４Ｓ）₄リンカー、及び抗ＣＤ４７軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、２）次の要素をコードする構築物ＶＬ（抗ＨＥＲ２）−ＣＬ（配列番号８８）：抗ＨＥＲ２軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、３）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ４７）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号５８）：抗ＣＤ４７重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら３つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号８９、配列番号９０、及び配列番号６０に示される。

抗ＣＤ４７／抗ＨＥＲ２抗体ＴｅｔＢｉＡｂのために、図１にあるように、以下の３つの遺伝子構築物を標準的な組み換えＤＮＡ技術で構築し、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５にクローニングした：１）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＣＤ４７）−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ）₄−ＶＬ（抗ＨＥＲ２）−ＣＬ（配列番号９１）：抗ＣＤ４７重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１〜３、それに続く（Ｇ４Ｓ）₄リンカー、及び抗ＨＥＲ２軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、２）次の要素をコードする構築物ＶＬ（抗ＣＤ４７）−ＣＬ（配列番号７４）：抗ＣＤ４７軽鎖可変領域、それに続くヒトカッパ軽鎖定常領域、３）次の要素をコードする構築物ＶＨ（抗ＨＥＲ２）−ＣＨ１−Ｈ（配列番号９２）：抗ＨＥＲ２重鎖可変領域、それに続くヒト重鎖定常領域１、それに続くヒンジ領域ＥＰＫＳＣ（配列番号１０）。これら３つの構築物の対応アミノ酸配列はそれぞれ配列番号９３、配列番号７６、及び配列番号９４に示される。

抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ４７抗体及び抗ＣＤ４７／抗ＨＥＲ２抗体の発現のために、３つのベクターのセット各々を、Ｅｘｐｉ２９３ｆｅｃｔｉｎ（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を用いてＥｘｐｉ２９３細胞に一過的に共トランスフェクションした。２つのＴｅｔＢｉＡｂをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって一段階で精製した。３つのポリペプチドの発現及び完全六量体分子の構築を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに関して、精製したＴｅｔＢｉＡｂ試料をＤＴＴで還元し、ＮｕＰＡＧＥＭＥＳ４〜１２％ゲルに２００Ｖで３５分間流した後、クマシー染色した。ゲルの３つの主なバンドは予想された分子量（ＭＷ）及び正しい化学量論比を有し、純度が＞９５％であった（図１８Ａ）。図１８Ａにおいて、レーン１は分子量（ＭＷ）マーカーを示し、レーン２は抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ４７抗体の３つのポリペプチドの予想ＭＷ（７４、２３、２３ｋＤａ）及び正しい化学量論比（１：１：１）を示し、レーン３は抗ＣＤ４７／抗ＨＥＲ２抗体の３つのポリペプチドの予想ＭＷ（７４、２４、２３ｋＤａ）及び正しい化学量論比（１：１：１）を示す。ＳＥＣに関して、精製したＴｅｔＢｉＡｂ試料を５０ｍＭリン酸ナトリウム、４００ｍＭ過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．３＋０．１、及び３８＋２．０ｍＳ／ｃｍ²で平衡化したＴＳＫ−ＧＥＬスーパーＳＷ３０００ＳＥＣカラム４．６×３００ｍｍ（東ソー・バイオサイエンス、東京、日本）で分析した。サイズ排除クロマトグラフィーは、単量体の抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ４７抗体及び抗ＣＤ４７／抗ＨＥＲ２抗体ともに、予想ＭＷである約２５０ｋＤａにピークを示した（図１８Ｂ）。

くわえて、多くの対照を生成してＴｅｔＢｉＡｂフォーマットと比較、又はＴｅｔＢｉＡｂフォーマットを最適化した。それらには、標準モノクローナル抗体フォーマットの抗ＨＥＲ２（抗ＨＥＲ２ＩｇＧ１）及び標準モノクローナル抗体フォーマットの抗ＣＤ４７（抗ＣＤ４７ＩｇＧ１）が含まれる。

９Ｂ）ＴｅｔＢｉＡｂの抗原への結合
抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ４７抗体及び抗ＣＤ４７／抗ＨＥＲ２抗体のＣＤ４７への結合を保持する能力をＥＬＩＳＡによって測定した。ヒトＣＤ４７を９６ウェルプレートに４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ウェルをＰＢＳＴ＋２％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロックした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＴ＋２％ＢＳＡに希釈したさまざまな濃度の抗体をウェルに加えて室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＴ＋２％ＢＳＡで１：１００００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルベニア州ウェストグローブ）をウェルに加えて室温で１時間インキュベーションした。ＨＲＰ基質、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて、結合した抗体を可視化した。プレートを４５０ｎｍでの吸光度について測定した。

結果は、抗ＣＤ４７と同様に、抗ＣＤ４７／抗ＨＥＲ２抗体はＣＤ４７への結合を保持することを示す。また抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ４７もＣＤ４７への結合を保持するが、抗ＣＤ４７ほど結合しない（図１９Ａ）。

抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ４７抗体及び抗ＣＤ４７／抗ＨＥＲ２抗体の細胞表面おＨＥＲ２への結合を保持する能力を、ＨＥＲ２を過剰発現するヒトＳＫ−ＢＲ−３乳腺／乳癌細胞で測定した。９６ウェルプレート中で、１つのウェルにつき１×１０⁵個のＳＫ−ＢＲ−３細胞を、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで希釈したさまざまな濃度の抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＤ４７／抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ２、及び抗ＣＤ４７と、氷上で６０分間インキュベーションした。ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで洗浄した後、細胞をＰＢＳ＋１％ＦＢＳで１：２００に希釈したＴＲＩＴＣＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルベニア州ウェストグローブ）と氷上で６０分間インキュベーションした。再度洗浄した後、細胞をＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をフローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ、ミルテニーバイオテク社、ケルン、ドイツ）によって分析した。

結果は、抗ＨＥＲ２と同様に、抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ４７抗体はＨｅｒ２を発現するＳＫ−ＢＲ−３細胞への結合を保持することを示す。また抗ＣＤ４７／抗ＨＥＲ２もＨＥＲ２への結合を保持するが、抗ＨＥＲ２ほど結合しない。ＣＤ４７はＳＫ−ＢＲ−３細胞に発現していないので、抗ＣＤ４７はＳＫ−ＢＲ−３細胞に結合しない（図１９Ｂ）。

均等論
本発明はその趣旨又は本質的な特徴から逸脱することなく他の具体的な形で具現化されうる。そのため、前述の実施形態はあらゆる点で例示であって、本明細書に記載の発明を限定すると解釈してはならない。本発明の範囲は、前述の明細書本文よってではなく添付の請求の範囲によって示されるものであって、請求項の意味する及び均等範囲内の変更はすべて、本発明の範囲内のものであることが意図される。

Claims

Ｆｃ領域ポリペプチド鎖を含むポリペプチドであって、前記鎖がヒンジ及びＦｃ重鎖定常領域を含有し、前記鎖が直接的又は間接的に前記鎖のＣ末端においてペプチド結合によってＦａｂ軽鎖に共有結合するポリペプチド。
四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）であって、
（ｉ）第一の抗体の抗体重鎖を含む第一のポリペプチド（前記重鎖が前記第一の抗体の可変領域及び定常領域を含み、前記重鎖が直接的又は間接的に前記重鎖のＣ末端で第二の抗体の抗体軽鎖のＮ末端に連結し、前記軽鎖が前記第二の抗体の可変及び定常領域を含む）、
（ｉｉ）前記第一の抗体の抗体軽鎖を含む第二のポリペプチド（前記第一の抗体の前記軽鎖が可変及び定常領域を含む）、
（ｉｉｉ）前記第二の抗体のＦａｂ重鎖を含む第三のポリペプチド（前記第三のポリペプチドが重鎖定常領域ＣＨ２及びＣＨ３を欠く）
を含み、
前記第一及び第二の抗体が異なる結合特異性を有し、
前記第二のポリペプチド及び前記第一のポリペプチドの同種Ｆａｂ重鎖領域がヘテロ二量体を形成して、前記第一の抗体の結合特異性をもたらし、
前記第三のポリペプチド及び前記第一のポリペプチドの同種軽鎖領域がヘテロ二量体を形成して、前記第二の抗体の結合特異性をもたらす四価二重特異性抗体。
前記第一の抗体の定常領域がＩｇＧ定常領域である請求項２の四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）。
前記第一のポリペプチドが、重鎖定常領域のＣ末端を軽鎖可変領域のＮ末端に連結するリンカーを更に含む請求項２の四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）。
前記リンカーがアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_nを有し、ｎが１〜１０の整数である請求項４の四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）。
前記整数が４である請求項５の四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）。
前記第一のポリペプチドがＣＨ２領域を欠く請求項２の四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）。
前記第三のポリペプチドが配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒンジ領域を更に含む請求項２の四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）。
前記ＴｅｔＢｉＡｂの結合特異性が２つの異なる標的抗原に対し、前記第一及び第二の抗原が異なる細胞型に存在する請求項２の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂの結合特異性が２つの異なる標的抗原に対し、前記第一及び第二の抗原が同じ細胞型に存在する請求項２の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂの結合特異性が同じ標的分子の２つの異なるエピトープに対する請求項２の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂの結合特異性が２つの異なる標的抗原に対し、前記第一の抗原が細胞の表面に存在し、前記第二の抗原が可溶性因子にある請求項２の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂの結合特異性が２つの異なる標的抗原に対し、前記第一及び第二の抗原が２つの異なる可溶性因子にある請求項２の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂの結合特異性が腫瘍細胞の第一の標的抗原及び免疫細胞の第二の標的抗原に対する請求項９の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂの結合特異性が標的抗原対に対し、前記対がＥＧＦＲ／ＣＤ１６及びＣＤ２０／ＣＤ１６から選択される群からなる請求項９の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂの結合特異性が２つの異なる標的抗原に対し、前記第一及び第二の抗原が腫瘍細胞に存在する請求項１０の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂの結合特異性が標的抗原ペアに対し、前記ペアがＣＤ２０／ＣＤ４７及びＣＤ２０／ＣＤ５２からなる群から選択される請求項９の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂがＥＧＦＲ及びＣＤ１６に結合する請求項１５の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂが、配列番号４３、配列番号１４、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含む請求項１８の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂが、配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含む請求項１８の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂが配列番号４３、配列番号１４、及び配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含む請求項１９の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂが配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含む請求項２０の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂがＣＤ２０及びＣＤ１６に結合する請求項１５の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂが、配列番号５１、配列番号２８、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含む請求項２３の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂがＣＤ２０及びＣＤ４７に結合する請求項１７の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂが配列番号５９、配列番号２８、及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含む請求項２５の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂが配列番号５９、配列番号２８、及び配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含む請求項２６の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂがＣＤ２０及びＣＤ５２に結合する請求項１７の四価二重特異性抗体。
前記ＴｅｔＢｉＡｂが配列番号６７、配列番号２８、及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含む請求項２８の四価二重特異性抗体。
四価二重特異性抗体であって、
（ｉ）第一の抗体の抗体軽鎖を含む第一のポリペプチド（前記軽鎖が前記第一の抗体の可変及び定常領域を含み、前記軽鎖が前記軽鎖のＣ末端においてＦｃ領域のＮ末端に連結され、前記Ｆｃ領域が少なくとも直接的又は間接的に第二の抗体の抗体重鎖のＮ末端に連結されたヒンジ及びＣＨ３領域を含み、前記重鎖が前記第二の抗体の可変及びＣＨ１領域を含む）、
（ｉｉ）前記第一の抗体のＦａｂ重鎖を含む第二のポリペプチド（前記第二のポリペプチドが重鎖定常領域ＣＨ２及びＣＨ３を欠く）、
（ｉｉｉ）前記第二の抗体の抗体軽鎖を含む第三のポリペプチド（前記第二の抗体の前記軽鎖が可変及び定常領域を含む）
を含み、
前記第一及び第二の抗体が異なる結合特異性、前記第二のポリペプチド及び前記第一のポリペプチドの同種軽鎖領域がヘテロ二量体を形成して、前記第一の抗体の結合特異性をもたらし、
前記第三のポリペプチド及び前記第一のポリペプチドの同種Ｆａｂ重鎖領域がヘテロ二量体を形成して、前記第二の抗体の結合特異性をもたらす四価二重特異性抗体。
前記第一のポリペプチドが前記ＣＨ３領域のＣ末端を前記重鎖可変領域のＮ末端に連結するリンカーをさらに含む請求項３０の四価二重特異性抗体。
前記リンカーが前記アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_nを有し、ｎが１〜１０の整数である請求項３０の四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）。
前記整数が４である請求項３１の四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）。
前記第一のポリペプチドがＣＨ２領域を欠く請求項３０の四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）。
前記第一のポリペプチドがヒンジ領域Ｃ末端を配列番号１０のアミノ酸配列を含む前記重鎖ＣＨ１領域にさらに含む請求項３０の四価二重特異性抗体（ＴｅｔＢｉＡｂ）。
随意のリンカーを介して第二の抗体の軽鎖（ＶＬ（２）−ＣＬ）に遺伝子組換えで融合された第一の抗体の重鎖（ＶＨ（１）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたＤＮＡ分子。
（ｉ）前記第一の抗体（ＶＬ（１）−ＣＬ）の軽鎖をコードする配列、及び（ｉｉ）前記第二の抗体（ＶＨ（２）−ＣＨ１）のＦａｂ重鎖をコードする配列から選択されるＤＮＡ配列をさらに含む請求項３６の単離されたＤＮＡ分子。
請求項２の前記四価抗体の前記第一、前記第二、及び前記第三のポリペプチドを含む四価二重特異性抗体をコードする核酸。
請求項３０の前記四価抗体の前記第一、前記第二、及び前記第三のポリペプチドを含む四価二重特異性抗体をコードする核酸。
請求項３６、請求項３８、又は請求項３９の前記核酸を含む宿主細菌。
請求項３９の前記宿主細菌を前記四価二重特異性抗体の発現に適した条件下で培養すること、及び前記四価二重特異性抗体を回収することを含む四価二重特異性抗体を作製する方法。
請求項２３の四価二重特異性抗体及び薬理学的に許容される担体を含む医薬製剤。
個人に請求項２３の前記四価二重特異性抗体の有効量を投与することを含むがんを患う個人を治療する方法。