KR101961871B1 - 신규 다중특이적 결합 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 다중특이적 결합 단백질에 관한 것으로, 종래 공지된 여러 다중특이적 결합 단백질 포맷 예를 들어, 이중특이적 항체 포맷 등이 가지는 단점을 보완한 신규 다중특이적 결합 단백질로, 항체의 불변영역 중 중쇄의 CH1과 경쇄의 CL 영역을 포함하지 않고 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역이 연속적으로 연결되어 있는 폴리펩타이드를 포함하는 다중특이적 결합 단백질에 관한 것이다.

Description

신규 다중특이적 결합 단백질 {Novel Multi-Specific Binding Proteins}
본 발명은 신규 다중특이적 결합 단백질에 관한 것으로, 종래 공지된 여러 다중특이적 결합 단백질 포맷 예를 들어, 이중특이적 항체 포맷 등이 가지는 단점을 보완한 신규 다중특이적 결합 단백질로, 항체의 불변영역 중 중쇄의 CH1과 경쇄의 CL 영역을 포함하지 않고 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역이 연속적으로 연결되어 있는 폴리펩타이드를 포함하는 다중특이적 결합 단백질에 관한 것이다.
유전자 재조합 단백질의 생산과 파지 디스플레이 기술을 이용한 인간 항체 라이브러리 스크리닝이 쉽게 가능해 짐에 따라, 항체를 이용한 치료제의 개발이 활성 되었다. 항체를 이용한 치료제는 항원 항체의 특이적 결합 특성을 이용하며 인체의 고유한 면역시스템을 기반으로 작용하기 때문에 기존의 화학치료제에 비하여 상대적으로 낮은 독성을 갖는다. 따라서 현재 개발 및 임상에서 사용하고 있는 항체 치료제는 항암제, 자가면역 및 염증성질환, 감염질환, 장기이식 등 다양한 분야에서 활발히 이용되고 있다.
최근 한 적응증에 대한 다양한 원인과 기작들이 밝혀지면서 치료제 개발에 있어 한 종류의 타겟에서 여러 종류의 타겟으로의 접근법이 대두되고 있다. 이에 항체를 이용한 치료제 개발에 있어 단일 특이적 항체의 특성을 두 종류 이상의 항원 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 다중 특이적 기적 첨가를 위하여 다양한 연구들이 수십년 동안 진행되고 있다. 최초의 이중특이적 항체의 개발은 Quadroma Technology (Milstein, C., & Cuello, A. C. (1984). Hybrid hybridomas and the production of bi-specific monoclonal antibodies. Immunology Today, 5(10), 299-304. doi:10.1016/0167-5699(84)90155-5)를 이용한 방법으로 서로 다른 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주의 세포 융합을 통하여 이중특이적 항체를 제작하는 방법으로 시작되었다. 최근 동물세포를 이용한 유전자 재조합 단백질의 생산과 구조 기반 단백질 엔지니어링 기술이 비약적으로 발전 함에 따라 다양한 종류의 이중특이적 항체 개발이 시도되고 있다. 항체의 CH3 영역에 Knobs-into-holes design을 적용시켜 효과적으로 중쇄의 이종 이합 (heterodimerization)을 유도하여 서로 다른 두 종류의 항원이 결합할 수 있는 Two-in-one bispecific antibody (Bostrom, J., Yu, S.-F., Kan, D., Appleton, B. A., Lee, C. V., Billeci, K., et al. (2009). Variants of the antibody herceptin that interact with HER2 and VEGF at the antigen binding site. Science, 323(5921), 1610-1614. doi:10.1126/science.1165480)와 중쇄의 이종 이합을 기반으로 경쇄의 VL 또는 CL 영역을 중쇄의 VH 또는 CH1 영역과 교차반응 (crossover)시켜 한 쪽의 경쇄에 선택적인 이종 이합을 유도한 CrossMab (Schaefer, W., Regula, J. T., Bㅴhner, M., Schanzer, J., Croasdale, R., Dㆌrr, H., et al. (2011). Immunoglobulin domain crossover as a generic approach for the production of bispecific IgG antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 108(27), 11187-11192. doi:10.1073/pnas.1019002108)등이 대표적인 단가 이중특이적 항체 (monovalent bispecific antibody)이다. 그러나 이러한 이종 이합을 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우 이중특이적 항체를 얻기 위한 동물세포를 이용한 재조합 단백질을 생산함에 있어 발현 배지에 동시에 존재하는 호모와 헤테로의 구별이 어려울 뿐만 아니라 기존의 모이가항체 (parental bivalent antibody)에 비하여 약한 활성이 단점으로 존재한다.
또한, 중쇄 및 경쇄의 선택적 이종 이합을 위하여 도입한 변이 (mutation)로 인한 면역원성 (immunogenicity)등의 안정성 문제도 제기될 수 있다. 최근에는 Genentech의 Two-in-one antibody와 Roche의 CrossMab이 가지는 다양한 조합의 폴리펩타이드 이슈에 따른 CMC (Chemistry, Manufacturing, Control) 문제점에서 비교적 벗어난 이중특이적 항체 DVD-Ig (Dual-variable-domain immunoglobulin, AbbVie, USA)를 기반으로 하는 이중항체 개발이 활발히 진행되고 있다. DVD-Ig 포맷을 적용한 대표적인 타겟으로는 IL-1α/IL-1β, IL-12/IL-18, VEGF/osteopontin, TNF-α/IL-17이 있으며, 타겟 단백질들을 동시에 중화하는 전략으로 치료제의 개발 및 임상을 진행중에 있다 (Wu, C., Ying, H., Grinnell, C., Bryant, S., Miller, R., Clabbers, A., et al. (2007). Simultaneous targeting of multiple disease mediators by a dual-variable-domain immunoglobulin. Nature Biotechnology, 25(11), 1290-1297. doi:10.1038/nbt1345).
DVD-Ig 포맷의 경우 다른 항원에 결합할 수 있는 항체의 가변영역이 기존 IgG 항체 가변영역의 N-말단에 연속적으로 연결되어 있는 형태를 가지고 있다. 따라서, 기능적 첨가를 위하여 링커로 연결된 가변영역의 크기만큼 증가된 약 200 kDa의 분자량을 가지고 있다. 단백질 및 항체의약품의 개발에 있어 보다 작은 분자량을 가지는 항체 혹은 단백질 의약품은 암세포 혹은 병변조직으로의 효과적인 침투를 기대할 수 있고 또한 짧은 시간에 높은 혈중 농도에 도달 할 수 있는 장점이 있어 임상실험 및 치료제로 투여 시 동일 중량 대비 더 많은 몰 (mole)의 효과를 기대할 수 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 신규 포맷의 다중특이적 다가의 결합 단백질을 개발하고자 예의 노력한 결과, 중쇄와 경쇄 불변영역의 CH1 영역과 CL 영역을 제2항원 결합에 필요한 가변영역인 VH와 VL로 각각 대체함으로서 기존의 항체와 같은 150 kDa의 분자량을 가지는 결합 단백질 (일 실시예에서 4가의 이중특이적 항체 Fv2mab)을 제작할 수 있었으며, 위 기술한 종래 단점을 보완하고 목적하는 바와 같이 두 가지 이상의 타겟에 동시에 결합하여 활성을 억제시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 자가면역질환, 신생혈관생성 및 암세포 증식 등 다양한 적응증에 원인이 되는 여러 단백질 분자 (예를 들어 사이토카인, 케모카인 등)의 신호전달 및 생물학적 활성을 효과적으로 차단, 억제할 수 있는 신규 결합 단백질 (예를 들어, 이중특이적 항체 Fv2mab) 플랫폼을 개발하는 데 있다.
본 발명의 목적은 또한, 상기 결합 단백질을 복수개 포함하는 항체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 또한, 상기 결합 단백질을 포함하는 접합체를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 VH1-[(L1)a-VH2]m-Xb의 제1폴리펩타이드 및 VL1-[(L2)c-VL2]n를 포함하는 제2폴리펩타이드를 포함하는 결합 단백질을 제공한다: 상기 제1폴리펩타이드의 VH1 또는 VH2는 각각 동일 또는 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 중쇄 가변영역이고, 상기 제2폴리펩타이드의 VL1 또는 VL2는 각각 동일 또는 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 경쇄 가변영역이며, 상기 제2폴리펩타이드는 CL을 포함하지 않고, 상기 제1폴리펩타이드의 L1은 VH1과 VH2 사이에 존재하여 연속하는 VH1 및 VH2를 연결하기 위한 링커이며, 상기 제2폴리펩타이드의 L2는 VL1과 VL2 사이에 존재하여 연속하는 VL1 및 VL2를 연결하기 위한 링커이고, 상기 제1폴리펩타이드의 X는 CH1을 제외한 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc이며, a, b 및 c는 각각 0 또는 1이고, m 및 n은 각각 1 내지 10의 정수이다.
본 발명은 또한, VH1-[(L1)a-VH2-(IDD1)b]m-Xc로 구성된 제1폴리펩타이드 및 VL1-[(L2)d-VL2-(IDD2)e]n로 구성된 제2폴리펩타이드를 포함하는 결합 단백질을 제공한다: 상기 제1폴리펩타이드의 VH1 또는 VH2는 각각 동일 또는 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 중쇄 가변영역 또는 이의 변이체이고, 상기 제2폴리펩타이드의 VL1 또는 VL2는 각각 동일 또는 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 또는 이의 변이체이며, 상기 제1폴리펩타이드의 L1은 VH1과 VH2 사이에 존재하여 연속하는 VH1 및 VH2를 연결하기 위한 링커이며, 상기 제2폴리펩타이드의 L2는 VL1과 VL2 사이에 존재하여 연속하는 VL1 및 VL2를 연결하기 위한 링커이고, 상기 제1폴리펩타이드의 IDD1은 경쇄와 이황화 가교를 생성하기 위한 쇄간 이황화 도메인 (Inter Disulfide Domain)이며, 상기 제2폴리펩타이드의 IDD2는 중쇄와 이황화 가교를 생성하기 위한 쇄간 이황화 도메인이고, 상기 제1폴리펩타이드의 X는 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc이며, a, b, c, d 및 e는 각각 0 또는 1이고, m 및 n은 각각 1 내지 10의 정수이다.
본 발명은 또한, 결합 단백질이 복수개 포함되어 있는 항체를 제공한다.
본 발명은 더욱이, 상기 결합 단백질을 포함하는 접합체를 제공한다.
본 발명에 따른 신규 포맷의 다중특이적 다가의 결합 단백질을 통해, 종래 다중특이적 다가 결합 단백질이 가지는 단점을 보완하고, 두 가지 이상의 타겟에 동시에 결합하여 목적하는 타겟의 활성을 억제시킴으로써 단일표적 항체 치료에 비하여 질병 치료와 진단에 우수한 효과를 기대할 수 있는 신규 포맷의 다중특이적 다가의 결합 단백질을 제공할 수 있다.
도 1a는 이중특이적 항체 Fv2mab의 간략한 구조를 나타낸 것이다.
도 1b는 쇄간 이황화 가교 (inter disulfide bridge)가 도입된 엔지니어링된 Fv2mab의 구조를 나타낸 것이다. 시스테인 이황화 결합을 도입할 수 있는 부분은 외부 가변영역 (outer variable domain)과 내부 가변영역 (inner variable domain)의 C-말단에 도입한 경쇄의 RGEC 아미노산과 중쇄의 EPKSC 아미노산이다.
도 2는 링커와 이황화 가교 엔지니어링을 적용한 Fv2mab의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 RGEC 엔지니어링을 위한 쇄간 이황화 도메인 (Inter Disulfide Domain: IDD)의 길이를 나타낸 것이다.
도 4는 pFE 벡터에 클로닝한 Fv2mabs의 발현 카세트를 나타낸 것이다.
도 5는 SDS-PAGE를 이용한 Fv2mab의 발현 확인과 단백질 A 풀 다운 어세이 (pull down assay) 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Fv2mab의 조립 (assembly)과 분비 (secretion)를 위한 QC는 Bip 의존적으로 조절됨을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다 (구조 선별: structure selection).
도 7은 시스테인 엔지니어링 (cysteine engineering)에 따른 Fv2mab의 쇄간 이황화 가교 (inter disulfide bridge) 효율을 확인한 것이다.
도 8은 중쇄와 경쇄 사이의 쇄간 이황화 가교가 없는 형태의 Fv2mab (pH 7.4, PBS)에 대한 형태 (conformation)를 Native PAGE를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 VH와 VL의 결합으로만 이루어진 Fv2mab의 2D SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 엔지니어링된 Fv2mab 클론들의 형태를 Agilent bioanalyzer 2100를 이용하여 확인한 결과와 H44L100 시스테인 엔지니어링된 Fv2mab의 순도 (purity) 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 SEC-HPLC를 이용한 HUMIRA, SECUKINUMAB, Fv2mab_TNF-IL17-SL, Fv2mab_eTNF-IL17-SL의 순도 (purity) 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 인간 혈청에서 Fv2mabs (엔지니어링되고, 엔지니어링되지 않은 항체)의 안정성 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 외부 Fv의 VEGFA에 대한 Fv2mabs의 결합 친화도 (binding affinity) 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 내부 Fv의 TNF-α에 대한 Fv2mabs의 결합 친화도 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 외부 Fv의 TNF-α에 대한 Fv2mabs의 결합 친화도 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 내부 Fv의 IL-17에 대한 Fv2mabs의 결합 친화도 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 SECUKINUMAB, DVD-Ig(ABT-122), Fv2mabs들의 IL-17에 대한 IC50값의 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 SPR (Surface Plasmon Resonance)을 이용한 Kd 값의 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 In vitro 세포 기반 어세이를 통해 Fv2mabs의 TNF-α 차단 효능 (blockade efficacy) 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 In vitro 세포 기반 어세이를 통해 Fv2mabs의 IL-17 차단 효능 (blockade efficacy) 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 21는 Mono/dimeric linked Fv의 결합 친화도 비교 (number of linked Fv) 결과를 나타낸 것이다.
도 22은 링커(short, long, G4S)에 따른 Fv2mab의 항원 결합 친화도 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 23는 Fv2mab의 링커에 따른 in vitro 효능 (세포 기반 어세이)을 나타낸 것이다.
도 24는 이중특이적 항체의 포맷에 따른 항원 결합 친화도의 비교 (DVD-Ig vs. Fv2mab) 결과를 나타낸 것이다.
도 25은 DVD-Ig와 Fv2mab의 TNF-α/IL-17에 대한 차단 효능 비교 (세포 기반 어세이) 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 TNF-α와 IL-17A에 의하여 동시에 유도된 신호전달의 차단 정도를 HT-29 세포를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다 (이중표적항체 및 단일표적항체의 차단 효능 비교).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, VH1-[(L1)a-VH2]m-Xb의 제1폴리펩타이드 및 VL1-[(L2)c-VL2]n를 포함하는 제2폴리펩타이드를 포함하는 결합 단백질에 관한 것이다: 상기 제1폴리펩타이드의 VH1 또는 VH2는 각각 동일 또는 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 중쇄 가변영역이고, 상기 제2폴리펩타이드의 VL1 또는 VL2는 각각 동일 또는 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 경쇄 가변영역이며, 상기 제2폴리펩타이드는 CL을 포함하지 않고, 상기 제1폴리펩타이드의 L1은 VH1과 VH2 사이에 존재하여 연속하는 VH1 및 VH2를 연결하기 위한 링커이며, 상기 제2폴리펩타이드의 L2는 VL1과 VL2 사이에 존재하여 연속하는 VL1 및 VL2를 연결하기 위한 링커이고, 상기 제1폴리펩타이드의 X는 CH1을 제외한 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc이며, a, b 및 c는 각각 0 또는 1이고, m 및 n은 각각 1 내지 10의 정수이다.
일반적으로 항체의 발현과 분비는 ER (endoplasmic reticulum)에서 일어나는 중쇄와 경쇄의 조립에 의하여 결정되며 HSP70 chaperon인 Bip (binding immunoglobulin protein)와 중쇄의 CH1 영역이 역할을 담당한다고 알려져 있다. (Feige, M. J., Groscurth, S., Marcinowski, M., Shimizu, Y., Kessler, H., Hendershot, L. M., & Buchner, J. (2009). An Unfolded CH1 Domain Controls the Assembly and Secretion of IgG Antibodies. Molecular Cell, 34(5), 569-579. doi:10.1016/j.molcel.2009.04.028). 그러나, 본 출원의 발명자에 의해 수행된 여러 실험 결과, ER에서 일어나는 BiP 의존적 항체 조립은 기존에 알려져 있는 바와 같이 항체의 CH1과 CL만이 역할을 담당하는 필수적인 영역이 아니라 항체의 VH와 VL 또한 BiP 의존적 방식으로 항체 조립에 역할을 수행하는 것으로 관찰 되었다. 이는 항체를 조립함에 있어서 CH1과 CL 영역의 유무가 항체의 조립을 결정하는 것이 아니라 중쇄의 VH와 CH1에 결합한 Bip를 효과적으로 release 시킬 수 있는 경쇄의 폴딩 파트너인 VL과 CL 영역 모두가 항체조립을 결정하는 것으로 생각된다.
즉, VH에 결합한 BiP는 VL에 의해서만 방출 (release)되고 CH1에 결합한 BiP는 CL에 의해서만 방출되는 기작으로 항체의 조립이 조절된다. 따라서 항체의 중쇄 중 CH1과 경쇄의 CL 영역은 항체를 구성하는데 필수적 요소가 아니며 이를 대신하여 2nd 항원이 결합할 수 있는 중쇄의 VH와 경쇄의 VL을 각각 연속적으로 연결하여 서로 다른 두 개 이상의 항원에 결합할 수 있는 다가 이중특이적 항체 포맷을 제작하게 되었다. CH1과 CL 영역을 대신하여 2nd 가변영역이 도입됨으로서 H2L2로 구성된 이중특이적 항체 Fv2mab는 약 150 kDa의 크기를 가지며 이는 일반적인 항체와 동일한 분자량을 가진다.
또한, CH1과 CL 영역을 포함한 약 200 kDa의 DVD-Ig 포맷에 비하여 상대적으로 작은 크기의 Fv2mab (150 kDa)은 항체 의약품 개발에 있어서 큰 장점으로 부각될 수 있다. 이중특이적 항체 Fv2mab 생산성의 경우 본 출원인에 의해 보유되는 HEK 293 일시적 발현 시스템 (transient expression system)으로 확인시 약 100 ~ 200 mg/L 수준의 생산성을 나타냄을 확인할 수 있었으며, DVD-Ig에 비하여 상대적으로 높은 수준의 생산성을 나타냄을 관찰하였다.
더욱이, E.coli와 같은 원핵세포 발현 시스템 (prokaryotic expression system)을 사용하는 Diabody (Holliger, P., Prospero, T., & Winter, G. (1993). "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments. Proceedings of the National Academy of Sciences, 90(14), 6444-6448) 및 기타 ScFv 기반의 이중특이적 항체 포맷들에 비하여 Fv2mab의 경우 포유동물 발현 시스템 (mammalian expression system)을 이용함으로서 상대적으로 높은 생산성과 퀄리티, 및 CMC(Chemistry, Manufacturing, Control) 면에서 우위를 확보할 수 있다.
"결합 단백질"은 표적에 특이적으로 결합 가능한 형태의 단백질로, 면역글로불린 분자, 항체, 이의 단편, 이의 변이체 또는 이의 변형물을 의미한다. 본 발명에 따른 결합 단백질은 VH1-(L1)a-VH2-Xb를 포함하는 제1폴리펩타이드 및 VL1-(L2)c-VL2를 포함하는 제2폴리펩타이드를 포함하며, Fab 단편 중 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1) 및 경쇄의 불변영역을 포함하지 않는다. 경우에 따라서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 VH1-[(L1)a-VH2-(IDD1)b]m-Xc로 구성된 제1폴리펩타이드 및 VL1-[(L2)d-VL2-(IDD2)e]n로 구성된 제2폴리펩타이드를 포함한다. 상기 제1폴리펩타이드의 VH1 또는 VH2는 각각 동일 또는 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 중쇄 가변영역 또는 이의 변이체이고, 상기 제2폴리펩타이드의 VL1 또는 VL2는 각각 동일 또는 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 또는 이의 변이체이며, 상기 제1폴리펩타이드의 L1은 VH1과 VH2 사이에 존재하여 연속하는 VH1 및 VH2를 연결하기 위한 링커이며, 상기 제2폴리펩타이드의 L2는 VL1과 VL2 사이에 존재하여 연속하는 VL1 및 VL2를 연결하기 위한 링커이고, 상기 제1폴리펩타이드의 IDD1은 경쇄와 이황화 가교를 생성하기 위한 쇄간 이황화 도메인 (Inter Disulfide Domain)이며, 상기 제2폴리펩타이드의 IDD2는 중쇄와 이황화 가교를 생성하기 위한 쇄간 이황화 도메인이고, 상기 제1폴리펩타이드의 X는 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc이며, a, b, c, d 및 e는 각각 0 또는 1이고, m 및 n은 각각 1 내지 10의 정수이다.
Fab 단편은 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab' 단편은 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
"폴리펩타이드"는 아미노산의 임의의 중합체 쇄를 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 폴리펩타이드란 용어와 혼용할 수 있는 것으로서, 이 역시 아미노산의 중합체 쇄을 의미한다. "폴리펩타이드"는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
항체, 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드의 상호작용과 관련하여 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 그 상호작용이 화학종 상의 특정 구조(예컨대, 항원 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 따라 이루어진다는 것을 의미한다. 예컨대, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하여 여기에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적이라면, 표지된 "A"와 항체를 포함하는 반응에서 에피토프 A(또는 유리된 미표지 A)를 포함하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
"항체"는 4개의 폴리펩타이드 쇄, 즉 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)로 구성된 임의의 면역글로불린(Ig) 분자 또는 이러한 Ig 분자의 필수적인 에피토프 결합 특징을 갖는 임의의 기능성 단편, 돌연변이체, 변형체 또는 유도체를 의미한다. 이러한 돌연변이체, 변형체 또는 유도체의 구체예에 대해서는 이하에 논의되나, 이에 국한되지는 않는다.
완전한 항체에서, 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH로 표시됨)과 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 다시 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 초가변성 영역들로 나뉠 수 있고, 여기에는 골격 영역(FR)이라는 더 보존적인 영역들이 산재되어 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 이들은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 다음과 같은 순서에 따라 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
"Fc 영역"은 온전한 항체의 파파인 분해에 의해 생성될 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. Fc 영역은 고유 서열 Fc 영역 또는 변이 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다.
결합 단백질은 항원에 대한 특이적 결합능을 갖는 하나 이상의 항체 단편인 "항원 결합부"를 포함하며, 다른 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 이에 따라 이특이적, 이중 특이 또는 다중 특이형일 수 있다. 본 발명에서, 항원 결합부는 VH1 또는 VH2의 중쇄 가변영역 및 VL1 또는 VL2의 경쇄 가변영역에 포함되어 있으며, 각각은 동일 또는 상이한 항원 결합 영역을 포함한다.
"이특이적" 또는 "이중특이적"은 2개의 상이한 타겟에 특이적으로 결합하여 타겟의 활성을 조절할 수 있는 결합 단백질의 특성으로, 예를 들어 각 타겟에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 단편의 접합에 의해 제조될 수 있으며, 2개의 구분된 항원 결합 암 (arm: 2개 타겟에 대한 특이성)을 보유하고, 이에 결합하는 각각의 항원에 대하여 1가이다.
이는 본 발명에서 m 및 n에 의해 정의될 수 있으며, m 및 n은 1 내지 10의 정수, 예를 들어 1 내지 6의 정수, 1 내지 4의 정수, 2 내지 3의 정수일 수 있다. 하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 VH1 또는 VH2가 각각 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 중쇄 가변영역이고, VL1 또는 VL2는 각각 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 경쇄 가변영역이며, m및 n이 각각 1인 4가의 이중 특이적 항체일 수 있다.
"링커"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 의미하고, 하나 이상의 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역을 연결하는데 사용된다. 본 발명에서 링커는 존재하거나, 존재하지 않을 수 있다. 존재하는 경우, L1은 VH1과 VH2 사이에 존재하여 연속하는 VH1 및 VH2를 연결하기 위한 링커이고, L2는 VL1과 VL2 사이에 존재하여 연속하는 VL1 및 VL2를 연결하기 위한 링커이다.
하나의 실시예에서, VH1-[(L1)a-VH2]m-Xb를 포함하는 제1폴리펩타이드 중 VH1과 VH2 사이에 존재하여 연속하는 VH1 및 VH2를 연결하기 위한 링커인 L1의 수와 관련하여 a는 1이고, 이 때 L1은 ASTKGP (서열번호 1), ASTKGPSVFPLAP (서열번호 2), 및 GGGGSGGGGS (서열번호 3)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 링커일 수 있다.
또 다른 실시예에서, VL1-[(L2)c-VL2]n를 포함하는 제2폴리펩타이드에서 L2는 VL1과 VL2 사이에 존재하여 연속하는 VL1 및 VL2를 연결하기 위한 링커이고 L2의 수와 관련하여 c는 1이고, 이 때 L2는 TVAAP (서열번호 4), TVAAPSVFIFPP (서열번호 5) 및 GGSGGGGSG (서열번호 6)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 링커일 수 있다.
"쇄간 이황화 도메인 (IDD)"은 중쇄 및 경쇄를 연결하기 위한 "쇄간 이황화 가교 (inter disulfide bridge)"를 포함하는 영역을 의미하며, 본 발명에서 제1폴리펩타이드에서의 IDD1 및 제2폴리펩타이드에서의 IDD2는 각각 존재하거나, 존재하지 않을 수 있다.
하나의 실시예에서, 중쇄는 경쇄와 쇄간 이황화 가교를 생성하기 위해 VH2와 Xb 사이에 쇄간 이황화 도메인 (Inter Disulfide Domain: IDD)을 포함할 수 있고, 이 때 쇄간 이황화 도메인은 IDD1으로 표시될 수 있으며, 경우에 따라서 VH1-[(L1)a-VH2-(IDD1)b]m-Xc로 구성된 제1폴리펩타이드로 표현될 수 있다. 이 때, IDD1은 예를 들어 EPKSC (서열번호 7)일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 경쇄는 중쇄와 쇄간 이황화 가교를 생성하기 위해 C-말단에 쇄간 이황화 도메인 (Inter Disulfide Domain: IDD)을 포함할 수 있고, 이 때 쇄간 이황화 도메인은 IDD2로 표시될 수 있으며, 경우에 따라서 VL1-[(L2)d-VL2-(IDD2)e]n로 구성된 제2폴리펩타이드로 표현될 수 있다. 이 때, IDD2는 예를 들어 RGEC (서열번호 8)일 수 있다.
상기 IDD (IDD1 및/또는 IDD2)는 제1폴리펩타이드 및/또는 제2폴리펩타이드 각각에서 존재하거나 존재하지 않을 수 있으므로, IDD1을 포함하는 제1폴리펩타이드가 IDD2를 포함하는 제2폴리펩타이드와 결합하거나, IDD1을 포함하는 제1폴리펩타이드가 IDD2를 포함하지 않는 제2폴리펩타이드와 결합할 수 있다. 또한, IDD1을 포함하지 않는 제1폴리펩타이드가 IDD2를 포함하는 제2폴리펩타이드와 결합하거나, IDD1을 포함하지 않는 제1폴리펩타이드가 IDD2를 포함하지 않는 제2폴리펩타이드와 결합할 수 있다.
"모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
"에피토프"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.
"인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
"인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
"가변영역"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변영역을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변영역을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변영역의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변영역은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변영역 잔기이다. 각 가변영역은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
"변이체"는 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역을 구성하는 아미노산 서열의 변이, 예를 들어 치환, 부가 및/또는 결실을 의미할 수 있으며, 항원 결합 및 효능을 저해하지 않는 한, 임의의 변이가 제한없이 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 결합 단백질에서 변이의 도입은 예를 들어 외부 가변영역 또는 내부 가변영역, 또는 외부 가변영역 및 내부 가변영역 모두에 적용될 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 상기 VH1 및/또는 VH2 중 FR2 H44, FR2 H46, FR4 H101 및 FR4 H103로 구성된 군에서 선택된 하나 이상 위치의 아미노산이 시스테인으로 치환된 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 9 중 중쇄 FR2에 해당하는 WVRQAPGKGLEWVS 중 9번째 위치한 아미노산인 글리신(G)이 H44, 11번째 위치한 글루탐산 (E)이 H46에 해당하며, 각각이 시스테인으로 치환될 수 있다. 또한, 중쇄 가변영역의 FR4 H101, FR4 H103 위치 또한 사슬간 이황화 결합의 도입 가능한 위치이며 서열번호 9 중 98번째 위치한 알라닌 (A) 또는 100번째 위치한 글리신 (G) 각각이 시스테인으로 치환될 수 있다.
또 하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 상기 VL1 및/또는 VL2 중 FR4 L100, FR4 L98, FR2 L44, FR2 L42 및 FR2 L43로 구성된 군에서 선택된 하나 이상 위치의 아미노산이 시스테인으로 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 10 중 경쇄 FR2에 해당하는 LAWYQQKPGKAPKLLIY에서 10번째 위치한 라이신 (K)이 L42, 11번째 위치한 알라닌 (A)이 L43, 12번째 위치한 프롤린 (P)이 L44에 해당하며, 각각이 시스테인으로 치환될 수 있다. L100 및 L98의 경우 서열번호 10 중 FR4에 해당하는 FGQGTKVEIK 중 첫번째 페닐알라닌(F)이 L98, 글루타민(Q)이 L100에 해당하며, 이들 각각이 시스테인으로 치환될 수 있다.
일 실시예에서, 경쇄 또는 중쇄 시스테인 치환 사이트 중 H44-L100의 조합이 두 탄소 사이의 거리가 5Å 정도로 가장 가깝게 위치하고 있기 때문에 시스테인 치환을 통한 엔지니어링에 있어 가장 적합한 사이트로 판단되었기에, H44-L100을 엔지니어링 사이트로 선별하였다. (Zhao, J.-X., Yang, L., Gu, Z.-N., Chen, H.-Q., Tian, F.-W., Chen, Y.-Q., Zhang, H., and Chen, W. (2011). Stabilization of the Single-Chain Fragment Variable by an Interdomain Disulfide Bond and Its Effect on Antibody Affinity. Ijms 12, 1-11.)
본 발명에 따른 결합 단백질은 ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; 아그레칸; AGR2; AICDA; AIF1; AIG1; AKAP1; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPT1; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; AZGP1 (아연-a-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF; BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLR1 (MDR15); BlyS; BMP1; BMP2; BMP3B (GDF10); BMP4; BMP6; BMP8; BMPR1A; BMPR1B; BMPR2; BPAG1 (플렉틴); BRCA1; C19orf10 (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2 (D6 / JAB61); CCL1 (I-309); CCL11 (에오탁신); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-1d); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP-1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21 (MIP-2); SLC; 엑소더스-2; CCL22 (MDC/STC-1); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2 /에오탁신-2); CCL25 (TECK); CCL26 (에오탁신-3); CCL27 (CTACK/ILC); CCL28; CCL3 (MIP-1a); CCL4 (MIP-1b); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1 (CKR1 / HM145); CCR2 (mcp-1RB / RA);CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5 / ChemR13); CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBI1); CCR8 (CMKBR8 / TER1 / CKR-L1); CCR9 (GPR-9-6); CCRL1 (VSHK1); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD-22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CDH1 (E-카드헤린); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A (p21Wap1/Cip1); CDKN1B (p27Kip1); CDKN1C; CDKN2A (p16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; 키티나제; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7 (클라우딘 -7); CLN3; CLU (클루스테린); CMKLR1; CMKOR1 (RDC1); CNR1; COL18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSF1 (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4; CTNNB1 (b-카테닌); CTSB (카테프신 B); CX3CL1 (SCYD1); CX3CR1 (V28); CXCL1 (GRO1); CXCL10 (IP-10); CXCL11 (I-TAC / IP-9); CXCL12 (SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78 / LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCL1; DPP4; E2F1; ECGF1; EDG1; EFNA1; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FGF; FGF1 (aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FIL1 (EPSILON); FIL1 (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRT1 (피브로넥틴); FLT1; FOS; FOSL1 (FRA-1); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNAS1; GNRH1; GPR2 (CCR10); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCC10 (C10); GRP; GSN (겔솔린); GSTP1; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HIP1; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOX1; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN감마; IFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-1; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1B; IL1F10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2;IL1RL1;IL1RL2 IL1RN; IL2; IL20; IL20RA; IL21R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (당단백질 130); IL7; IL7R; IL8; IL8RA; IL8RB; IL8RB; IL9; IL9R; ILK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAK1; IRAK2; ITGA1; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b 4 인테그린); JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLK10; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (케라틴 19); KRT2A; KRTHB6 (모발 특이적 II형 케라틴); LAMA5; LEP (렙틴); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-β); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG 또는 Omgp ; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIB1; 미드킨; MIF; MIP-2; MKI67 (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (메탈로티오넥틴 -III); MTSS1; MUC1 (뮤신); MYC; MYD88; NCK2; 뉴로칸; NFKB1; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NME1 (NM23A); NOX5; NPPB; NR0B1; NR0B2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZ1; OPRD1; P2RX7; PAP; PART1; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAM1; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDC1; PPBP (CXCL7); PPID; PR1; PRKCQ; PRKD1; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21Rac2); RARB; RGS1; RGS13; RGS3; RNF110 (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (리포필린 B); SCGB2A1 (맘마글로빈 2); SCGB2A2 (맘마글로빈 1); SCYE1 (내피 단핵구-활성화 사이토킨); SDF2; SERPINA1; SERPINA3; SERPINB5 (마스핀); SERPINE1 (PAI-1); SERPINF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPP1; SPRR1B (Spr1); ST6GAL1; STAB1; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCP10; TDGF1; TEK; TGFA; TGFB1; TGFB1I1; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBR1; TGFBR2; TGFBR3; TH1L; THBS1 (트롬보스폰딘 -1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TIMP3; 조직 인자; TLR10; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAIP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSF11A; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10 (TRAIL); TNFSF11 (TRANCE); TNFSF12 (APO3L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (OX40 리간드); TNFSF5 (CD40 리간드); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 리간드); TNFSF8 (CD30 리간드); TNFSF9 (4-1BB 리간드); TOLLIP; Toll형 수용체; TOP2A (토포이소머라제 Iia); TP53; TPM1; TPM2; TRADD; TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸; VHL C5; VLA-4; XCL1 (림포탁틴); XCL2 (SCM-1b); XCR1 (GPR5 / CCXCR1); YY1; 또는 ZFPM2의 표적에 결합할 수 있다.
생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 폴리펩타이드, 결합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 실질적인 동일성은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 70% 이상의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명에 기재된 서열은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가지는 서열도 포함할 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, VH1-[(L1)a-VH2-(IDD1)b]m-Xc로 구성된 제1폴리펩타이드 및 VL1-[(L2)d-VL2-(IDD2)e]n로 구성된 제2폴리펩타이드를 포함하는 결합 단백질에 관한 것이다: 상기 제1폴리펩타이드의 VH1 또는 VH2는 각각 동일 또는 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 중쇄 가변영역 또는 이의 변이체이고, 상기 제2폴리펩타이드의 VL1 또는 VL2는 각각 동일 또는 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 또는 이의 변이체이며, 상기 제1폴리펩타이드의 L1은 VH1과 VH2 사이에 존재하여 연속하는 VH1 및 VH2를 연결하기 위한 링커이며, 상기 제2폴리펩타이드의 L2는 VL1과 VL2 사이에 존재하여 연속하는 VL1 및 VL2를 연결하기 위한 링커이고, 상기 제1폴리펩타이드의 IDD1은 경쇄와 이황화 가교를 생성하기 위한 쇄간 이황화 도메인 (Inter Disulfide Domain)이며, 상기 제2폴리펩타이드의 IDD2는 중쇄와 이황화 가교를 생성하기 위한 쇄간 이황화 도메인이고, 상기 제1폴리펩타이드의 X는 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc이며, a, b, c, d 및 e는 각각 0 또는 1이고, m 및 n은 각각 1 내지 10의 정수이다. 앞서 기재된 각 구성에 대한 구체적인 설명 및 예시는 위 결합 단백질과 관련된 발명에도 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 결합 단백질이 복수개 포함되어 있는 항체에 관한 것이다.
상기 복수개의 결합 단백질은 예를 들어, i) JUN 도메인 및 FOS 도메인 같은 루신-지퍼와 같은 단백질 결합 또는 비공유 상호작용, 조작된 CH 도메인, 조작된 상호 결합면 등 공지의 다양한 상호작용을 포함하는 야생형 결합 단백질간 상호 작용에 의한 결합, ii) 시스테인 도입에 의한 이황화 결합, iii) coiled-coil 도메인 융합에 의한 coiled-coil 결합 등에 의해 결합될 수 있으며, 이외 공지의 결합 방법을 제한 없이 포함할 수 있다.
상기 결합 단백질을 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 포함할 수 있으며, 예를 들어, VH1-[(L1)a-VH2-(IDD1)b]m-Xc로 구성된 제1폴리펩타이드 및 VL1-[(L2)d-VL2-(IDD2)e]n로 구성된 제2폴리펩타이드를 포함하는 결합 단백질 2개가 사슬간 이황화 결합을 통해 연결된 형태일 수 있다 (도 1).
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 결합 단백질을 포함하는 접합체에 관한 것이다.
"접합체"는 화합물, 독소 등 예컨대 치료제 또는 세포독성제에 화학적으로 결합된 결합 단백질을 의미한다. 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물이 결합될 수 있고, 치료제 또는 세포독성제로 독소, 탁솔, 시토칼라신B, 그라미시딘D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스튼, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 액티노마이신D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 이의 유사체 또는 동족체가 결합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 쇄간 이황화 도메인 IDD1을 포함하는 제1폴리펩타이드가 쇄간 이황화 도메인 IDD2를 포함하거나 및/또는 포함하지 않는 제2폴리펩타이드와 결합한 H2L2형태의 다가 항체일 수 있고, 제1폴리펩타이드 중 IDD1으로 포함된 EPKSC (서열번호 7)의 자유 시스테인기에 시스테인 특이적 접합 예를 들어, 화합물, 독소 등 예컨대 치료제 또는 세포독성제가 결합되거나, 또는 PEG (PEGylation)가 결합될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 결합 단백질의 제1폴리펩타이드 및/또는 제2폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
상기 핵산을 분리하여 결합 단백질의 제1폴리펩타이드 및/또는 제2폴리펩타이드를 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명에 따른 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 DNA를 통해 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 결합 단백질의 제1폴리펩타이드 및/또는 제2폴리펩타이드 코딩 DNA를 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 결합단백질 및/또는 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 결합단백질 및/또는 폴리펩타이드를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 결합단백질 및/또는 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 상기 결합단백질 및/또는 폴리펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 결합 단백질 및/또는 폴리펩타이드의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 신규 이중특이적 항체 포맷의 구조 (Fv2mab)
이중특이적 항체인 Fv2mab은 두 종류 이상의 서로 다른 항체의 중쇄 가변영역 (variable region of heavy chain: VH)과 경쇄 가변영역 (variable region of light chain: VL)의 결합으로 이루어진 가변영역 단편 (fragment of variable domain: Fv)이 탠덤 (tandem)으로 연결되어 있는 구조이다. 서로 다른 탠덤으로 연결한 두 종류 이상의 가변영역은 각기 해당하는 다른 항원에 독립적으로 혹은 동시에 결합할 수 있는 능력을 가지고 있으며 중쇄의 CH1 domain과 kappa 혹은 lambda 경쇄의 CL 영역이 제거되어 있는 형태이다 (도 1a 참조).
탠덤으로 연결한 두 가변영역 (Fv)에 해당하는 각각의 항원에 대한 결합 친화도 (binding affinity)를 보장하기 위하여 외부 가변영역 (outer variable domain)과 내부 가변영역 (inner variable domain) 사이에 short linker (VH : ASTKGP 서열번호 1, VL : TVAAP 서열번호 4), long linker (VH : ASTKGPSVFPLAP 서열번호 2, VL : TVAAPSVFIFPP 서열번호 5), G4S linker (VH : GGGGSGGGGS 서열번호 3, VL : GGSGGGGSG 서열번호 6)를 사용하여 각 가변영역에 구조의 독립성을 보장하였다 (도 2 참조).
컨셉 입증 (proof of concept)에 사용된 모항체 (parental antibody)는 anti-VEGFA, anti-TNF-α, anti-IL17A 모노클로날 항체를 템플레이트 (template)로 사용하여 Fv2mab의 가능성 및 우수성을 증명하였다.
실시예 2. 열역동학적 안정성을 위한 Fv2mab 엔지니어링
Fv2mab 이중특이적 항체의 구조는 두 개 이상의 연속하는 Fv (VH와 VL)를 가지는 H2L2형태의 다가 테트라머 (multivalent tetramer)이다. 일반적인 항체는 구조적으로 테트라머 (H2L2)의 형태로 존재하기 위하여 중쇄의 CH 영역과 경쇄의 CL 영역 사이가 쇄간 이황화 가교 (inter disulfide bridge: covalent bond 공유결합)로 연결되어 있다. 그러나, CH1과 CL이 삭제되어 있는 Fv2mab의 경우 탠덤으로 연결되어 있는 가변영역 (Fv)의 VH와 VL간의 결합력 (소수성 결합, 이온결합, 수소결합 등)에 의하여 구조 및 안정성이 결정되며 일반적인 항체와 달리 중쇄와 경쇄간의 내부 이황화 가교 (intra disulfide bridge, covalent bond)가 존재하지 않는다. 이에 저농도에서 중쇄와 경쇄의 구조를 결정하는 결합력이 일반적인 항체에 비하여 상대적으로 낮을 것으로 예상되며 결과적으로 저조한 pK/pD의 특성을 항체 대비 예상할 수 있다.
따라서, 열역동학적 안정성 (thermodynamic stability)을 증가시키기 위하여 VH와 VL이 상호작용하는 적절한 위치에 아미노산의 치환 및 추가의 방법을 이용하여 시스테인 이황화 가교 (cysteine disulfide bridge)를 도입하여 Fv2mab의 전체적인 열역동학적 안정성을 증가시켰다.
또한, 중쇄의 상단 힌지 (upper hinge: EPKSC 서열번호 7)와 쇄간 이황화 가교를 연결하는 경쇄의 C 말단 RGEC 아미노산 (서열번호 8)을 포함하는 서열부터 4개씩 아미노산의 길이를 길게하여 도입하는 방법도 적용하였다 (도 3 참조). 치환 및 추가의 방법을 통한 시스테인 이황화 가교를 도입하는 부분은 외부 가변영역 혹은 내부 가변영역, 또는 두 가변영역 모두 적용 가능하며, 치환에 의한 쇄간 이황화 가교를 도입하는 부분은 표 1에 나타내었으며 이황화 가교를 도입한 구조는 도 1b에 나타내었다.
[표 1] 이황화 가교 엔지니어링을 위한 가능한 사이트
Figure 112017017197153-pat00001
실시예 3. Fv2mabs 구축
POC (proof of concept)을 위한 여러 조합의 이중특이적 Fv2mab 제작에 사용된 모항체는 HUMIRA (adalimumab, AbbVie), KOSENTYX (secukinumab, Novartis), anti-VEGFA (In-house antibody), ABT-122 (DVD-Ig, AbbVie)의 중쇄와 경쇄의 가변영역 서열을 템플레이트로 사용하여 제작하였다. 이중특이적 항체 Fv2mab의 재조합 단백질의 생산을 위한 동물세포 발현벡터는 본 출원인의 pFE 발현벡터를 사용하였다. 항체의 중쇄와 경쇄의 가변영역은 초가변영역 (VH)과 프레임워크(FR)로 구성되어 있다. 가변영역내 시작점인 FR1과 끝나는 점인 FR4의 경우 대부분의 항체는 유사한 아미노산 서열로 구성되어 있기 때문에 두 종류의 가변영역을 PCR과 같은 방법으로 탠덤 연결하기는 쉽지 않다. 이는 FR1과 FR4의 유사한 뉴클레오티드 서열때문에 특이적 결합 프라이머를 제작 및 사용하는 것이 어렵기 때문이다. 따라서, 모항체의 DNA 템플레이트에서 중쇄와 경쇄의 가변영역을 각각 PCR하여 VH1+VH2+pFE vector 혹은 VL1+VL2+pFE vector와 같은 조합으로 3 pieces ligation 방법을 사용하여 Fv2mab series를 제작하였다.
탠덤 연결된 VH1과 VH2, VL1과 VL2는 성격에 따라 short linker, long linker, G4S linker를 사용하여 연결할 수 있으며, 열역동학적 안정성의 향상을 위하여 시스테인 이황화 가교를 가변영역의 적절한 위치에 도입할 수도 있다 (도 4 참조). 본 발명에서 엔지니어링 (cysteine disulfide bridge)한 Fv2mab의 경우 엔지니어링을 도입한 가변영역 앞에 'e'를 첨가하여 표기하였다. (예 : eTNF-IL17의 경우 anti-TNF-α Fv에 시스테인 이황화 가교를 TNF-eIL17의 경우 anti-IL17A의 Fv에 시스테인 이황화 가교를 도입).
또한, 경쇄의 C-말단에 IDD (Inter Disulfide Domain, RGEC)를 도입한 엔지니어링의 경우 RGEC라고 표기하였다 (예 : VEGF-TNF-RGEC). 3 pieces ligation cloning에 사용된 제한효소 (restriction enzyme)는 type II 제한효소 sapI (NEB, England)이고 T4 DNA ligase (NEB, England)를 사용하여 DNA 단편을 라이게이션하였다. 본 연구를 위하여 제작한 Fv2mab series들은 표 2에 나열하였다. 이 때, 각 Fv2mab series의 서열은 표 3에 나타내었다.
[표 2] Fv2mab 클론 시리즈
Figure 112017017197153-pat00002
[표 3] Fv2mab series의 서열
Figure 112017017197153-pat00003
실시예 4. Fv2mab 발현 및 단백질 A를 통한 정제
Fv2mab 클론 시리즈 재조합 단백질의 발현 확인 및 생산은 HEK 일시적 발현 시스템 (transient expression system)을 사용하였으며 HEK-293F 세포주 (Invitrogen, USA)를 숙주세포로 사용하였다. Fv2mab의 HEK에서의 발현은 공동 형질감염 (co-transfection)의 방법을 이용하였고 Fv2mab-Hc DNA와 Fv2mab-Lc DNA는 각각 1:1 w/w 비율로 형질감염을 진행하였다. PEI(polyethylenimine)을 형질감염 제제로 사용하여 DNA:PEI =1:4의 w/w 비율로 폴리플렉스 (polyplex)를 만들어 형질감염 하였다. 형질감염 후 5일째 배치 배양 (batch culture)을 중단하고 발현 배지 (expression medium)를 harvest하여 SDS-PAGE 및 단백질 A 비드 (GE healthcare, USA)를 이용한 풀다운 어세이 (pull down assay)를 통하여 결과를 확인하였다. SDS-PAGE/coomassie blue staining을 이용하여 input (expression medium), unbinding sample (flowthrough), output (bounded Fv2mab protein)을 분획별로 발현 정도 및 형태를 확인하였다 (도 5 참조).
풀다운 어세이의 대조군 샘플로는 모 IgG 항체를 사용하였다. pFE 발현벡터에 클로닝된 Fv2mab 시리즈는 앞서 기술한 바와 같이 PEI을 이용하여 HEK 293-F 세포에 형질감염하였으며 HEK 293-F 세포의 배양 조건 및 HEK 293-F를 이용한 재조합 단백질의 생산에 관한 방법은 제조사에서 제공한 protocol을 준수하여 진행하였다. 형질감염 후 세포의 생존가능성이 약 60% ~ 70% 정도로 측정되는 6일 ~ 7일 후 배치배양 (batch culture)을 종료하고 발현배지를 원심분리 (4,800 rpm, 30 min, 4 ℃)하여 debris를 제거 후 상층액을 0.22 ㎛ TOP-filter (Millipore, USA)를 사용하여 필터링 하였다. 이후 Fv2mab이 포함된 필터링한 상층액은 단백질 A 비드 (GE healthcare, USA)를 사용한 affinity chromatography 정제과정을 거친 후 elution buffer change를 위하여 Slide-A Lyzer Dialysis Cassette (Thermo, USA)를 이용하여 pH 7.4 PBS로 dialysis 되었다. HEK293F을 사용한 Fv2mab의 발현 수준은 약 100 ~ 200 mg/L 수준으로 확인되었으며 단백질 A를 통한 풀다운 어세이에서 확인할 수 있듯이 발현배지내에서 발현된 Fv2mab의 대부분이 회수됨을 알 수 있었다.
실시예 5. 구조 선별 및 이황화 가교 엔지니어링
이중특이적 항체 Fv2mab의 조립은 Fv2mab-중쇄의 VH 영역 폴딩 (folding)에 의하여 결정되며 VH의 폴딩은 ER내에서 BiP 의존적으로 일어난다. Fv2mab의 경우 BiP에 의하여 조절 받는 영역은 중쇄의 탠덤으로 연결한 두 개의 VH에 있으며 LC와 결합하지 못한 Bip와 VH complex는 ER에서 degradation된다. Fv2mab 중쇄의 VH에 결합한 BiP는 경쇄의 VL에 의하여 경쟁적으로 VH에서 방출되고 중쇄의 VH는 경쇄의 VL과 조립되어 외부로 분비된다.
항체의 경우 BiP에 의하여 조절되는 중쇄 영역은 CH1과 VH이며 이는 경쇄의 CL과 VL에 의해서만 BiP의 방출이 일어난다. BiP에 의한 조절은 다른 폴딩 파트너 (VH와 CL 혹은 CH1과 VL)에 의한 방식으로는 발생하지 않으며 BiP에 의한 조절의 실패는 항체의 분해 경로 (degradation pathway)로 진행된다 (도 6 참조).
일반적인 항체에 존재하는 CH1과 CL의 쇄간 이황화 결합이 가지고 있는 열역동학적 안정성을 대체하기 위하여 Fv2mab의 경우 쇄간 이황화 가교를 형성할 수 있는 RGEC 영역을 포함한 변이 IDD를 경쇄 C-말단에 적용한 방법과 가변영역 (Fv)을 형성하는 VH와 VL의 key 아미노산의 시스테인 치환(H44L100)의 방법을 적용하였다. 엔지니어링이 적용된 Fv2mab 클론들의 조립, 형태, 발현 패턴 등은 HEK 293를 이용한 단백질 발현 후 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다 (도 7 참조). SDS-PAGE 결과 쇄간 이황화 가교에 의한 효과적인 H2L2 테트라머 형성은 H44L100 엔지니어링된 클론에서 확인되었으며 발현율은 약 50 ~ 100 mg/L 수준으로 예상된다.
실시예 6. Native PAGE를 통한 Fv2mab의 conformation 확인
탠덤으로 연결된 가변영역 (Fv)의 VH와 VL의 결합으로만 이루어진 Fv2mab의 conformation (H2L2, tetramer)의 확인을 위하여 Blue Native PAGE (Invitrogen, USA)를 이용하였다. Fv2mab과 항체의 경쇄의 C-말단에 쇄간 이황화 가교를 연결하는 cysteine을 deletion시켜 쇄간 이황화 가교 없이 VH와 VL의 결합으로만 이루어진 HUMIRA LC-C (-RGE)를 대조군으로 사용하여 Fv2mab의 구조를 확인하였다.
Native PAGE 결과 pH 7.4 PBS 조건에서 Fv2mab과 HUMIRA LC-C (-RGE)는 240 kDa ~ 420 kDa 분자량사이에서 H2L2 형태의 테트라머를 형성하고 있음을 확인할 수 있었다 (도 8 참조).
또한, Native PAGE gel 상에서 240 kDa ~ 420 kDa 사이에 존재하는 Fv2mab 테트라머 밴드를 PAGE gel에서 분리하여 SDS-PAGE로 2nd 분석을 해본 결과 ionic detergent (SDS)에 의하여 분리된 Fv2mab의 중쇄와 경쇄를 모두 확인할 수 있었다 (도 9 참조).
실시예 7. 단백질 A 크로마토그래피 후 Fv2mab 순도
다양한 구조와 조합의 이중특이적 항체 Fv2mab발현 정제에 따른 단백질의 순도를 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Germany)와 SEC-HPLC (ThermoFisher, USA)를 이용하여 분석하였다. 열역동학적 안정성의 증가를 위하여 시스테인 이황화 가교를 도입한 엔지니어링된 Fv2mabs과 Fv2mabs (엔지니어링되지 않음) 및 대조군으로 사용한 HUMIRA, HUMIRA LC-C, SECUKINUMAB들을 해당 제조사의 protocol을 준수하여 순도 분석을 진행하였다. 시스테인 이황화 가교 엔지니어링된 Fv2mab 클론의 경우 H44L100 클론이 RGEC 클론에 비해 상당히 높은 비율로 쇄간 이황화 가교가 형성됨을 관찰하였으며 (도 10 참조), 2100 Bioanalyzer와 SEC-HPLC 결과 HEK293 임시 발현 시스템을 이용한 Fv2mab 재조합 단백질들은 약 90 % 이상의 순도를 확인하였다 (도 11 참조).
실시예 8. 인간 혈청 내 Fv2mabs의 안정성 (in vitro)
열역동학적 안정성의 향상을 위하여 시스테인 이황화 가교를 도입한 엔지니어링된 Fv2mab의 안정성을 in vitro에서 인간 혈청을 이용하여 측정하였다. H44L100 시스테인 치환이 적용된 엔지니어링된 Fv2mab (eTNIL17), 이황화 가교가 없는 Fv2mab (TNIL17) 및 대조군 항체 HUMIRA를 각각 0%, 5%, 10%, 25%의 인간 혈청이 포함된 배지 용액에 10 nM의 농도로 37℃에서 5일간 반응 후 TNF-α에 대한 결합 친화도를 ELISA 방법으로 측정하여 Fv2mab의 안정성을 확인하였다. 안정성의 증가를 위하여 H44L100 시스테인 치환을 적용한 엔지니어링된 Fv2mab (eTNIL17)의 경우 대조군 항체인 HUMIRA와 동등한 혈청 안정성을 보였으나 엔지니어링이 적용되지 않은 탠덤 Fv로 이루어진 Fv2mab의 경우 저농도에서 상대적으로 낮은 안정성을 확인하였다 (도 12 참조).
실시예 9. 각 항원에 대한 Fv2mab의 결합 친화도 비교
HEK293 임시발현 시스템을 이용하여 여러 조합의 Fv2mabs 발현 정제 후 IgG 형태의 모항체와 해당 항원들에 대한 결합 친화도를 상대적으로 비교하였다. 결합 친화도의 측정은 ELISA 방법과 OCTET system (ForteBIO, USA)을 이용하였다.
실시예 9-1. ELISA
Anti-TNF-α와 anti-VEGFA, anti-TNF-α와 anti-IL17A의 탠덤 Fv 형태의 조합으로 이루어진 Fv2mabs의 친화도는 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. TNF-α, VEGFA, IL-17A와 같은 항원은 100 ng/well (96 well)의 농도로 pH 7.4 PBS를 coating buffer로 사용하여 4 ℃에서 overnight으로 반응시켜 immune-plate에 고정시킨다. Well당 PBST 200 ㎕ 1번 washing 후 5% skim milk로 RT에서 1 ~ 2hr 반응시켜 surface blocking을 수행하였다. Well당 PBST 200 ㎕2번 washing 후 측정하고자 하는 적당한 이중특이적 Fv2mab과 대조군 모항체를 적당한 농도부터 1/2 ~ 1/5 간격으로 serial dilution하여 RT에서 1 ~ 2hr 반응시켰다. PBST 200 ㎕ 3번 washing 하여 결합하지 않은 항체들을 제거 하고 HRP(horseradish peroxidase)가 접합 (conjugation)되어 있는 anti-human-Fc-HRP(Millipore, USA) 1:3000의 비율로 희석하여 RT에서 1hr 반응 후 PBST 200 ㎕ 3번 washing하여 결합하지 않은 detection antibody를 제거하였다. HRP의 발색은 TMB solution(GEhealthcare, USA)을 100 ㎕/well의 volume을 사용하여 유도하였으며 stop solution (2.5 M H2SO4, 100 ㎕/well)을 이용하여 반응을 종료하였다. Spectrophotometer를 사용하여 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 결합 친화도를 계산하였다. Anti-VEGFA antibody, Fv2mab_VE-TN, Fv2mab_VE-eTN (H44L100 disulfide bridge engineered clone)의 VEGFA와 TNF-α에 대한 결합 친화도의 비교 결과는 각각 도 13과 도 14에 표기하였다.
또한, HUMIRA, ABT-122 (DVD-Ig for neutralizing TNF-α and IL-17A, AbbVie, USA), Fv2mab_TNF-IL17, Fv2mab_eTNF-IL17의 TNF-α에 대한 결합 친화도의 비교 결과는 도 15에, SECUKINUMAB, ABT-122 (AbbVie, USA), Fv2mab_TNF-IL17, Fv2mab_eTNF-IL17의 IL-17A에 대한 결합 친화도의 비교 결과 및 IC 50값은 도 16와 17에 각각 나타내었다.
실시예 9-2. OCTET (Surface Plasmon Resonance)
HUMIRA와 SECUKINUMAB의 가변영역으로 구성되어 있는 Fv2mab_TNF-IL17-SL과 Fv2mab_eTNF-IL17-SL의 TNF-α와 IL-17에 대한 결합 정도 및 특징을 SPR (Surface Plasmon Resonance)을 이용하여 측정하였다. OCTET QKe system을 이용한 Label-free kinetics (protein-protein interaction)의 측정은 anti-human IgG capture (AHC) biosensor를 선택하여 사용하였으며, 인간 Fc를 포함하고 있는 Fv2mab_TNF-IL17-SL 및 Fv2mab_eTNF-IL17-SL을 biosensor 표면에 고정시킨 후 kinetic buffer에 농도별로 희석된 TNF-α와 IL-17에 대하여 순차적으로 반응시켜 시간에 따른 sensorgram 값을 수집하였다. 평행상태에서의 농도에 따른 sensorgram 값을 plotting한 kinetics 값을 표 4에 나타내었다. Fv2mab_TNF-IL17-SL과 Fv2mab_eTNF-IL17-SL의 kinetic 값을 구하기 위하여 선택한 항원의 농도는 TNF-α와 IL-17 모두 1,000 nM과 333 nM을 선택하였으며 반응시킨 항원의 순서에 따른 결합력의 차이와 두 항원 모두에 동시에 결합할 수 있는 정도 또한 OCTET 시스템을 통하여 확인하였다 (도 18 참조).
[표 4] Fv2mab의 Kinetic
Figure 112017017197153-pat00004
실시예 10. Fv2mabs 차단 효능 (In vitro 세포 기반 어세이)
실시예 10-1. TNF-α 차단 어세이
이중특이적 항체 Fv2mab의 TNF-α에 대한 차단 효능을 확인하기 위하여 HEK blue TNF-α cell (Invivogen, USA)을 이용한 SEAP assay system을 사용하였다. Invivogen에서 제공하는 HEK Blue TNF-α cell의 경우 TNF-α에 의한 signaling을 효과적으로 monitoring할 수 있는 system이며, signaling에 의하여 조절받는 NF-kB promoter 하위에 SEAP (secreted embryonic alkalinephosphatase) reporter gene이 위치하고 있는 형태로 구성되어 있다. TNF-α에 의하여 전달된 signaling은 최종적으로 SEAP의 발현을 증가시켜 culture medium에서 축적되며 이는 쉽게 양적인 측정이 가능하다. 배양 배지에 축적된 SEAP의 양은 Quanti-Blue substrate (Invivogen, USA)를 이용한 enzymatic reaction에 의한 발색 과정으로 측정이 가능하며 spectrophotometer로 흡광도를 측정함으로써 차단 효능 정도를 확인할 수 있다. TNF-α 차단 어세이 결과 Fv2mab_TNF-IL17-SL과 Fv2mab_eTNF-IL17-SL모두 HUMIRA 대비하여 비슷한 효능을 확인하였다 (도 19 참조).
실시예 10-2. IL-17A 차단 어세이
이중특이적 항체 Fv2mab의 수용성 IL-17A에 대한 차단 효능을 확인하기 위하여 HEK Blue IL17 cell(Invivogen, USA)을 사용한 SEAP assay system을 이용하였다. 10-1에서 기술한 HEK Blue TNF-α cell system과 같이 HEK Blue IL-17 cell system 또한 SEAP가 report gene으로 사용되었다. Fv2mab_TNF-IL17-SL과 Fv2mab_eTNF-IL17-SL 및 SECUKINUMAB의 IL-17 차단 효능은 Quanti-Blue substrate (Invivogen, USA)를 이용한 enzymatic reaction의하여 수치화 하였다. (도 20 참조).
실시예 11. 모노 Fv 항체 및 2개 연결된 Fv 항체의 결합 친화도 비교
한 개의 가변영역으로 이루어진 Fv1mab (VH1-Fc, VL1)과 두 개의 연속하는 가변영역으로 이루어진 Fv2mab (VH1-L-VH2-Fc, VL1-L-VL2)의 결합 친화도를 모항체와 대비하여 비교하였다. Fv1mab의 경우 HEK 293을 이용한 임시발현에서도 Fv2mab과 비슷한 정도의 발현율을 확인하였으며 결합 친화도의 비교를 위하여 본 실험에 사용된 Fv1mab은 시스테인 이황화 결합 엔지니어링 (H44L100)을 적용하였다. Fv1mab의 제작은 HUMIRA, SECUKINUMAB를 모템플레이트로 사용하였으며 각 항체의 VH와 VL 영역을 PCR하여 사용하였다. HUMIRA, Fv1mab_TNF, Fv2mab_eTNF-IL-SL는 TNF-α에 대한 결합 친화도를 ELISA 방법을 이용하여 비교하였고 SECUKINUMAB, Fv1mab_IL17, Fv2mab_TNF-IL-SL는 IL-17에 대한 결합 친화도를 ELISA 방법을 이용하여 비교하였다 (도 21 참조).
실시예 12. 링커에 따른 결합 친화도
연속하는 가변영역을 연결하는 링커가 항원 결합에 미치는 영향을 ELISA를 이용하여 측정하였다. short linker (VH : ASTKGP 서열번호 1, VL : TVAAP 서열번호 4), long linker (VH : ASTKGPSVFPLAP 서열번호 2, VL : TVAAPSVFIFPP 서열번호 5), G4S linker (VH : GGGGSGGGGS 서열번호 3, VL : GGSGGGGSG 서열번호 6)를 외부 Fv와 내부 Fv 사이에 도입하여 링커에 따른 결합 친화도의 변화를 보고자 하였으며 외부 Fv에는 HUMIRA의 가변영역 그리고 내부 Fv에는 SECUKINUMAB의 가변영역을 사용하여 상기 링커들을 포함한 Fv2mab를 제작하였다. 다른 종류의 링커로 연결된 세 종의 Fv2mab들은 모두 H44L100의 시스테인 이황화 결합 엔지니어링이 적용되었으며 TNF-α와 IL-17에 대한 결합 친화도는 ELISA를 이용하여 측정하였다. 링커에 따른 Fv2mab의 결합 친화도의 변화는 도 22에서 확인할 수 있다.
실시예 13. 링커에 따른 Fv2mab의 In vitro 효능 (세포 기반 어세이)
Fv2mab의 연속하는 가변영역을 연결하는 링커에 따른 in vitro 효능을 HEK blue TNF-α cell (Invivogen, USA)과 HEK Blue IL17 cell (Invivogen, USA)을 사용하여 확인하였다. In vitro 효능의 측정에 사용된 short, long, G4S linker가 도입된 Fv2mab들은 10 nM 과 200 nM의 농도부터 serial dilution되어 각각 TNF-α와 IL-17과 함께 반응되었다. 항원에 대한 차단 정도는 배지에 축적된 SEAP의 발현 정도에 의하여 확인하였다. 배지에 축적된 SEAP의 양적 확인을 위하여 Quanti-Blue substrate (Invivogen, USA)를 사용하였으며 반응에 따른 발색의 정도를 측정함으로서 차단 효능을 확인 하였다 (도 23 참조).
실시예 14. DVD-Ig 및 Fv2mab 사이의 결합 친화도 비교
이중특이적 항체 포맷에 따른 결합 친화도의 비교분석을 위하여 AbbVie사의 ABT-122_DVD-Ig (anti-TNF-α/IL-17 이중특이적 항체)와 anti-TNF-α/IL-17에 대한 동일한 가변영역의 아미노산 서열을 가지는 ABT-122_Fv2mab을 제작하였다. ABT-122_DVD-Ig와 ABT-122_Fv2mab은 동일한 가변영역의 아미노산 서열과 연결 링커를 가지고 있으나 CH1과 CL을 포함하고 있는 DVD-Ig의 경우 약 200 kDa의 분자량을 가지는 반면 CH1과 CL이 없는 Fv2mab의 경우 약 150 kDa의 분자량 가진다. 가변영역간의 연결은 G4S 링커를 사용하였으며 ABT-122_Fv2mab의 경우 시스테인 이황화 결합 엔지니어링이 도입되었다. 이중항체 포맷의 비교는 TNF-α와 IL-17 항원에 대한 결합 친화도를 ELISA 방법을 이용하여 측정하였고 같은 G4S 링커를 사용하고 SECUKINUMAB의 가변영역을 사용한 eTNFIL-G4S도 대조군로 사용하여 같이 비교분석 하였다. 이중특이적 항체 포맷은 다르지만 ABT-122_DVD-Ig와 동일한 가변영역의 서열을 가지는 ABT-122_Fv2mab의 경우 TNF-α와 IL-17에 대한 친화도는 두 이중항체 모두 동일하게 측정이 되었다. 또한 DVD-Ig대비 3/4 수준의 분자량을 가지는 Fv2mab의 경우 항체의약품의 개발에 있어 타사의 이중항체 포맷보다 우수한 장점으로 부각될 수 있다 (도 24 참조).
실시예 15. In vitro 효능 (Comparison of bispecific antibody format)
실시예 15-1. HEK blue cell을 이용한 TNF-α 및 IL-17A 차단 어세이
이중특이적 항체 포맷에 따른 in vitro 효능을 HEK blue TNF-α cell (Invivogen, USA)과 HEK Blue IL17 cell (Invivogen, USA)을 사용하여 확인하였다. ABT-122_DVD-Ig와 ABT-122_Fv2mab은 10 nM 의 농도부터 사용하여 TNF-α와 IL-17에 대한 신호 전달 차단 정도를 HUMIRA 및 SECUKINMAB 대비하여 확인하였다 (도 25 참조). 동일한 가변영역의 아미노산 서열을 사용한 ABT-122_Fv2mab의 경우 ABT-122_DVD-Ig와 같은 몰농도 대비 동일한 정도의 TNF-α 와 IL-17에 대한 차단 효능을 보여주었다. 또한 ABT-122_Fv2mab의 경우 IL-17에 대한 차단 효능은 모노클로날 항체인 SECUKUNUMAB 보다 좋은 결과를 확인하였다. 이는 일반적인 항체와 동일한 분자량으로 두 종류 이상의 항원에 특이적으로 결합하여 모노클로날 항체보다 월등히 높은 효과를 가지는 이중특이적 항체를 선택적으로 쉽게 제작할 수 있으며 또한 DVD-Ig대비 약 25% 적은 분자량을 가짐으로써 효과적인 조직 침투와 빠르고 높은 혈중 농도 유지가 가능하며 임상실험 및 치료제로 투여 시 DVD-Ig 중량 대비 더 많은 몰 (mole)의 효과를 기대할 수 있다.
실시예 15-2. HT-29 cell을 이용한 TNF-α와 IL-17A 차단 어세이
이중특이적 항체의 TNF-α와 IL-17A에 대한 동시 차단 효능을 확인 및 비교하기 위하여 HT-29 (ATCCㄾ HTB-38™) 세포를 이용한 차단 어세이를 실시하였다. HT-29 세포를 이용한 싸이토카인 (cytokine) 차단어세이는 TNF-α, IL-17A 그리고 IL-22에 의하여 전달되는 신호전달로 인하여 HT-29 세포에서 분비되는 CXCL1 케모카인 (chemokine)의 레벨을 측정함으로서 가능하다. HT-29 세포에서 싸이토카인으로 유도된 세포 신호전달을 저해하는 이중항체의 효과를 측정하기위하여 사용한 TNF-α, IL-17A 그리고 IL-22의 농도는 1.17 ng/ml, 2.5 ng/ml 그리고 0.1 ng/ml 이다. HT-29 세포의 배양에 사용된 배지는 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 (Hyclone, USA) medium이며, 싸이토카인 차단 에세이에 사용된 배지는 2% FBS가 포함된 RPMI 1640 medium을 사용하였다. TH-29에서 분비된 CXCL1 양의 측정은 R&D사의 duoset ELISA kit Human CXCL1/GROa kit을 사용하였으며 ELISA를 이용한 CXCL1의 측정방법은 제조사에서 제공하는 프로토콜을 준수하여 실험하였다. HT-29를 이용한 싸이토카인 차단 어세이에 사용된 이중표적항체 (ABT122_DVD-Ig, ABT122_Fv2mab)와 단일표적항체 (HUMIRA, SECUKINUMAB)는 모두 동일하게 736 pM부터 0.7 pM까지 1/4 간격으로 희석하여 사용되었다. HT-29 세포에서 1.17 ng/ml TNF-α 단독 혹은 2.5 ng/ml IL-17A 단독에 의하여 유도되는 CXCL1의 레벨은 동일 조건에서 ELISA를 이용하여 측정 시 각각 1.5와 2.5 O.D 수준이며 TNF-α와 IL-17A 모두에 의하여 유도되는 CXCL1의 레벨은 3.4 O.D 정도이다. HT-29 세포에서 TNF-α와 IL-17A에 의하여 동시에 유도된 세포 신호전달의 저해 정도는 이중표적항체의 경우 단일표적항체대비 월등히 좋은 효과를 확인할 수 있었으며, 이중표적항체의 경우 같은 몰 (mole) 농도에서 ABT122_DVD-Ig와 ABT122-Fv2mab은 동일한 싸이토카인 차단 효과를 보였다 (도 26 참조). 이러한 결과는 동일한 가변영역의 항체 서열을 가지는 이중특이적항체 포맷의 경우 Fv2mab이 DVD-Ig에 대비하여 여러 우수한 장점들을 가질 수 있음을 예상할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Y-Biologic, Inc. <120> Novel Multi-Specific Binding Proteins <130> 302 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L1 Linker <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro 1 5 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L1 Linker <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L1 Linker <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L2 Linker <400> 4 Thr Val Ala Ala Pro 1 5 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L2 Linker <400> 5 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L2 Linker <400> 6 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Inter Disulfide Domain IDD1 <400> 7 Glu Pro Lys Ser Cys 1 5 <210> 8 <211> 4 <212> 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Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 130 135 140 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe 145 150 155 160 Gly Gly Tyr Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 165 170 175 Glu Trp Met Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Gly Phe Ala Asp Tyr Ala 180 185 190 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Thr 195 200 205 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Asn Glu Phe Trp Asn Gly Tyr Tyr Ser 225 230 235 240 Thr His Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 245 250 255 Ser <210> 31 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> eABT122_Fv2mab-Fc <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 130 135 140 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe 145 150 155 160 Gly Gly Tyr Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 165 170 175 Glu Trp Met Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Gly Phe Ala Asp Tyr Ala 180 185 190 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Thr 195 200 205 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Asn Glu Phe Trp Asn Gly Tyr Tyr Ser 225 230 235 240 Thr His Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 245 250 255 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 260 265 270 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 275 280 285 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 290 295 300 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 305 310 315 320 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 325 330 335 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 340 345 350 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 355 360 365 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 370 375 380 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 385 390 395 400 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 405 410 415 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 420 425 430 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 435 440 445 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 450 455 460 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 465 470 475 480 Ser Pro Gly Lys <210> 32 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> eABT122_Fv2mab LC <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln 115 120 125 Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 130 135 140 Asp Ile Gly Ser Glu Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Pro 145 150 155 160 Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser His Ser Thr Ser Gly Val Pro 165 170 175 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 180 185 190 Asn Gly Leu Glu Ala Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys His Gln Thr 195 200 205 Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 210 215 220 Arg 225

Claims (13)

  1. VH1-[(L1)a-VH2]m-Xb의 제1폴리펩타이드 및 VL1-[(L2)c-VL2]n를 포함하는 제2폴리펩타이드를 포함하는 결합 단백질로,
    상기 제1폴리펩타이드의 VH1 또는 VH2는 각각 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 중쇄 가변영역이고,
    상기 제2폴리펩타이드의 VL1 또는 VL2는 각각 상이한 항원 결합 영역을 포함하는 경쇄 가변영역이며, 상기 제2폴리펩타이드는 CL을 포함하지 않고,
    상기 제1폴리펩타이드의 L1은 VH1과 VH2 사이에 존재하여 연속하는 VH1 및 VH2를 연결하기 위한 링커이며,
    상기 제2폴리펩타이드의 L2는 VL1과 VL2 사이에 존재하여 연속하는 VL1 및 VL2를 연결하기 위한 링커이고,
    상기 제1폴리펩타이드의 X는 CH1을 제외한 CH2 및 CH3 영역으로 이루어진 Fc이며,
    VH1-VL1 및 VH2-VL2로 구성된 군에서 선택된 하나 이상은 쇄간 이황화 가교로 연결되고,
    a 및 c는 각각 0 또는 1이고, b는 1이며,
    m 및 n은 각각 1인 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 a는 1이고, 이 때 L1은 ASTKGP (서열번호 1), ASTKGPSVFPLAP (서열번호 2), 및 GGGGSGGGGS (서열번호 3)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 링커인 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 c는 1이고, 이 때 L2는 TVAAP (서열번호 4), TVAAPSVFIFPP (서열번호 5) 및 GGSGGGGSG (서열번호 6)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 링커인 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄는 경쇄와 쇄간 이황화 가교를 생성하기 위해 VH2와 Xb 사이에 쇄간 이황화 도메인 (Inter Disulfide Domain: IDD)을 포함하는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 쇄간 이황화 도메인은 EPKSC (서열번호 7)인 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 경쇄는 중쇄와 쇄간 이황화 가교를 생성하기 위해 C-말단에 쇄간 이황화 도메인 (Inter Disulfide Domain: IDD)을 포함하는 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 쇄간 이황화 도메인은 RGEC (서열번호 8)인 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 VH1 또는 VH2에서 FR2 H44, FR2 H46, FR4 H101 및 FR4 H103로 구성된 군에서 선택된 하나 이상 위치의 아미노산이 시스테인으로 치환된 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 VL1 또는 VL2에서 FR4 L100, FR4 L98, FR2 L44, FR2 L42 및 FR2 L43로 구성된 군에서 선택된 하나 이상 위치의 아미노산이 시스테인으로 치환된 것을 특징으로 하는 결합 단백질.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질이 복수개 포함되어 있는 항체.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 포함하는 접합체 (conjugate).
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