CN110382549A - 新颖多特异性结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本公开文本涉及一种新颖多特异性结合蛋白，具体涉及一种通过弥补各种常规披露的多特异性结合蛋白例如双特异性结合蛋白的缺点而制备的新颖多特异性结合蛋白，更具体地涉及一种包括多肽的新颖多特异性结合蛋白，其中所述多肽中不包括抗体恒定区的重链CH1结构域和CL结构域，但重链可变区和/或轻链可变区是连续连接的。

Description

新颖多特异性结合蛋白
技术领域
本公开文本涉及一种新颖多特异性结合蛋白，具体涉及一种通过弥补各种常规公开的多特异性结合蛋白例如双特异性结合蛋白的缺点而制备的新颖多特异性结合蛋白，更具体地涉及一种包括多肽的新颖多特异性结合蛋白，其中所述多肽中不包括抗体恒定区的重链CH1结构域和CL结构域，但重链可变区和/或轻链可变区是连续连接的。
背景技术
随着基因重组蛋白的生产和基于噬菌体展示技术的人类抗体文库筛选变得容易，已经启动使用抗体进行的治疗剂开发。使用抗体的治疗剂通过使用特异性抗原抗体结合而基于人体的独特免疫系统起作用，因此使用抗体的治疗剂的毒性低于常规化学治疗剂的毒性。因此，目前开发和临床使用的基于抗体的治疗剂被积极地用于各种领域，诸如抗癌剂、自身免疫疾病和炎性疾病、传染病和器官移植。
随着最近发现单一适应症的各种原因和机制，开发治疗剂的方法正从单靶标途径转变为多靶标途径。几十年来，在基于抗体的治疗剂的开发上进行了各种研究，以向单特异性抗体增加多特异性机制，以使得能够特异性结合两种或更多种抗原蛋白。通过使用Quadroma Technology开发了第一种双特异性抗体(Milstein,C.,&Cuello,A.C.(1984).Hybrid hybridomas and the production of bi-specific monoclonalantibodies.Immunology Today,5(10),299–304.doi:10.1016/0167-5699(84)90155-5)，其中通过表达不同抗体的杂交瘤细胞株系的细胞融合开发双特异性抗体。随着使用动物细胞和基于结构的蛋白质工程技术来生产基因重组蛋白已经得到大幅进展，已经开发出各种类型的双特异性抗体。单价双特异性抗体的代表性例子包括二合一双特异性抗体(Bostrom,J.,Yu,S.-F.,Kan,D.,Appleton,B.A.,Lee,C.V.,Billeci,K.等人(2009).Mutants of the antibody herceptin that interact with HER2 and VEGF at theantigen binding site.Science,323(5921),1610–1614.doi:10.1126/science.1165480)，通过将杵臼(knobs-into-holes)设计用于抗体的CH3结构域使得能够通过诱导重链的有效异二聚化与两个不同种类的抗原结合来制备；以及CrossMab(Schaefer,W.,Regula,J.T.,M.,Schanzer,J.,Croasdale,R.,Dürr,H.等人(2011).Immunoglobulin domain crossover as a generic approach for theproduction of bispecific IgG antibodies.Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America,108(27),11187–11192.doi:10.1073/pnas.1019002108)，通过轻链VL或CL结构域与重链VH或CH1结构域之间的交换在一条轻链中诱导选择性异二聚化基于重链异二聚化来制备。然而，对于这些基于异二聚化的双特异性抗体，在使用动物细胞获得双特异性抗体的重组蛋白的生产中难以区分同时存在于表达培养基中的同质型和异质型，并且与常规亲本二价抗体相比活性低。
另外，关于重链和轻链的选择性异二聚化引入的突变可能引起稳定性问题，诸如免疫原性。最近，双重抗体的开发是在双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig，AbbVie，USA)的基础上积极进行的，相对来说摆脱了Genentech二合一抗体和Roche CrossMab的各种组合的多肽问题涉及的CMC(化学、制造、控制)难题。DVD-Ig形式应用的代表性靶标包括IL-1α/IL-1β、IL-12/IL-18、VEGF/骨桥蛋白和TNF-α/IL-17，并且治疗剂的开发和临床研究是以同时中和靶标蛋白的策略进行(Wu,C.,Ying,H.,Grinnell,C.,Bryant,S.,Miller,R.,Clabbers,A.等人(2007).Simultaneous targeting of multiple disease mediators bya dual-variable-domain immunoglobulin.Nature Biotechnology,25(11),1290–1297.doi:10.1038/nbt1345)。
在DVD-Ig形式中，可以与另一种抗原组合的抗体的可变区与常规IgG抗体可变区的N末端连续连接。因此，由于分子量增加与通过接头连接以增加功能的可变区的分子量一样多，DVD-Ig的分子量为约200kDa。在蛋白质和基于抗体的医疗产品的开发中，具有较小分子量的抗体或蛋白质医疗产品可以在更短的时间内对癌细胞或病变提供更有效的渗透并在血液中达到高浓度，当在临床实验中给予或作为治疗剂给予时，在相同重量下给出更高摩尔效应。
在此技术背景中，通过用VH和VL取代重链恒定区和轻链恒定区的CH1结构域和CL结构域(其中所述VH和VL是结合二级抗原所需的可变结构域)，本申请的发明人努力开发新形式的多特异性多价结合蛋白，并制备具有与常规抗体(在一个例子中为四价双特异性Fv2mab)相同的150kDa分子量的结合蛋白，并且如本发明提出的，弥补了上述常规技术的缺点并验证了通过同时结合两个或更多个靶标对活性的抑制。
发明内容
本发明的目的是开发一种新颖结合蛋白(例如，双特异性抗体Fv2mab)平台，其可以有效地阻断和抑制各种蛋白质分子的引起各种适应症诸如自身免疫疾病、血管生成和癌细胞生长(例如，细胞因子、趋化因子等)的信号转导和生物活性。
本发明的另一个目的是提供一种包含所述结合蛋白的缀合物。
为了实现所述目的，本发明提供了一种结合蛋白，其包含包括VH1-[(L1)a-VH2]m-Xb的第一多肽和包括VL1-[(L2)c-VL2]n的第二多肽，其中所述第一多肽的VH1或VH2是分别包含相同或不同的抗原结合区的重链可变区或其变体，所述第二多肽的VL1或VL2是分别包括相同或不同的抗原结合区的轻链可变区或其变体，所述第二多肽缺乏CL，这意指所述第二多肽不包括CL，所述第一多肽的L1是存在于VH1与VH2之间的用以连续连接VH1和VH2的接头，所述第二多肽的L2是存在于VL1与VL2之间的用以连续连接VL1和VL2的接头，所述第一多肽的X是包含CH2和CH3结构域并且不包括CH1的Fc，a、b和c分别是0或1，并且m和n分别是1与10之间的整数。
本发明还提供了一种结合蛋白，其包含由VH1-[(L1)a-VH2-(IDD1)b]m-Xc组成的第一多肽和由VL1-[(L2)d-VL2-(IDD2)e]n组成的第二多肽，其中所述第一多肽的VH1或VH2是分别包括相同或不同的抗原结合区的重链可变区或其变体，所述第二多肽的VL1或VL2是分别包括相同或不同的抗原结合区的轻链可变区或其变体，所述第一多肽的L1是存在于VH1与VH2之间的用以连续连接VH1和VH2的接头，所述第二多肽的L2是存在于VL1与VL2之间的用以连续连接VL1和VL2的接头，第一多肽的IDD1是用于产生与轻链的二硫桥的链间二硫键结构域，第二多肽的IDD2是用于产生与重链的二硫桥的链间二硫键结构域，所述第一多肽的X是包括CH2和CH3结构域的Fc，a、b、c、d和e分别是0或1，并且m和n分别是1与10之间的整数。
本发明还提供了一种包含多种结合蛋白的抗体。
本发明还提供了一种包含所述结合蛋白的缀合物。
附图说明
通过以下结合附图的详细描述，将更清楚地理解本公开文本的上述和其他方面、特征和其他优点，其中：
图1a显示所述双特异性抗体Fv2mab的简要结构。
图1b显示通过引入链间二硫桥制备的工程化Fv2mab的结构。可以引入半胱氨酸二硫键的部分是轻链的RGEC氨基酸并且重链的EPKSC氨基酸被引入到外部可变结构域和内部可变结构域的C-末端。
图2显示通过应用接头和链间二硫桥工程制备的Fv2mab的二级结构。
图3显示用于RGEC工程的链间二硫键结构域(IDD)的长度。
图4显示克隆到pFE载体的Fv2mab的表达盒。
图5显示使用SDS-PAGE进行Fv2mab表达验证的结果和蛋白A下拉测定(pull downassay)的结果。
图6显示SDS-PAGE结果，验证Fv2mab的组装和分泌的QC受BiP依赖性方式(结构选择)控制。
图7显示通过半胱氨酸工程制备的Fv2mab的链间二硫桥的效率的验证结果。
图8显示非变性PAGE结果，验证重链和轻链之间没有链间二硫桥的Fv2mab(pH7.4，PBS)的构象。
图9显示仅通过VH和VL的结合制备的Fv2mab的二维SDS-PAGE结果。
图10显示通过使用Agilent bioanalyzer 2100验证的工程化Fv2mab克隆的构象及验证H44L100半胱氨酸工程化的Fv2mab的纯度的结果。
图11显示通过使用SEC-HPLC验证修美乐、苏金单抗、Fv2mab_TNF-α-IL-17-SL和Fv2mab_eTNF-α-IL-17-SL的纯度的结果。
图12显示验证人类血清中Fv2mab(工程化或未工程化抗体)的稳定性的结果。
图13显示Fv2mab对外部Fv的VEGFA的结合亲和力的比较结果。
图14显示Fv2mab对内部Fv的TNF-α的结合亲和力的比较结果。
图15显示Fv2mab对外部Fv的TNF-α的结合亲和力的比较结果。
图16显示Fv2mab对内部Fv的IL-17的结合亲和力的比较结果。
图17显示苏金单抗、DVD-Ig(ABT-122)和Fv2mab关于IL-17的IC50值的比较结果。
图18显示通过使用表面等离子体共振(SPR)的Kd值的比较结果。
图19显示通过体外基于细胞的测定测量的Fv2mab的TNF-α阻断效力的比较结果。
图20显示通过体外基于细胞的测定测量的Fv2mab的IL-17阻断效力的比较结果。
图21显示单聚体/二聚体连接的Fv(经连接的Fv的数量)的结合亲和力的比较结果。
图22显示取决于接头(短、长、G4S)的Fv2mab的抗原结合亲和力的比较结果。
图23显示取决于接头的Fv2mab的体外效力(基于细胞的测定)的比较结果。
图24显示取决于双特异性抗体形式(DVD-Ig与Fv2mab)的抗原结合亲和力的比较结果。
图25显示DVD-Ig和Fv2mab(基于细胞的测定)的TNF-α/IL-17阻断效力的比较结果。
图26显示由TNF-α和IL-17A同时诱导的信号转导的阻断程度，其中通过使用HT-29细胞测量信号转导的阻断程度(双特异性抗体与单特异性抗体之间的阻断效力的比较)。
具体实施方式
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。通常，本文使用的命名法和后面将描述的实验方法是本领域熟知且常用的那些。
本发明的一个方面提供了一种结合蛋白，其包含VH1-[(L1)a-VH2]m-Xb的第一多肽和VL1-[(L2)c-VL2]n的第二多肽，其中所述第一多肽的VH1或VH2是分别包括相同或不同的抗原结合区的重链可变区，所述第二多肽的VL1或VL2是分别包括相同或不同的抗原结合区的轻链可变区，所述第二多肽缺乏CL，所述第一多肽的L1是存在于VH1与VH2之间的用以连续连接VH1和VH2的接头，所述第二多肽的L2是存在于VL1与VL2之间的用以连续连接VL1和VL2的接头，所述第一多肽的X是包括CH2和CH3结构域并且不包括CH1的Fc，a、b和c分别是0或1，并且m和n分别是1与10之间的整数。
通常已知抗体的表达和分泌是通过内质网(ER)中重链和轻链的组装来确定的，其中结合免疫球蛋白(BiP)、HSP70伴侣和重链CH1结构域发挥作用(Feige,M.J.,Groscurth,S.,Marcinowski,M.,Shimizu,Y.,Kessler,H.,Hendershot,L.M.,&Buchner,J.(2009).AnUnfolded CH1Domain Controls the Assembly and Secretion of IgGAntibodies.Molecular Cell,34(5),569–579.doi:10.1016/j.molcel.2009.04.028)。然而，本申请的发明人进行的许多实验已经显示，在ER中发生的BiP依赖性抗体组装不是仅由抗体的CH1和CL进行，而是抗体的VH和VL也以BiP依赖性方式在抗体组装中起作用。这指示抗体组装不是通过CH1和CL结构域的存在或不存在确定的，而是通过VL结构域和CL结构域两者的存在或不存在确定的，其中所述VL结构域和CL结构域是可以有效释放与重链VH和CH1结合的BiP的轻链折叠配偶体。
换句话说，抗体组装受如下机制控制，其中所述与VH结合的BiP仅由VL释放，并且所述与CH1结合的BiP仅由CL释放。因此，抗体的重链CH1结构域和轻链CL结构域不是抗体的必需组分，相反，可与二级抗原结合的重链VH和轻链VL分别连续连接，从而制备多价双特异性抗体形式。当引入二级可变区而非CH1和CL结构域时，H2L2形式的双特异性抗体Fv2mab具有与通用抗体的分子量相似的约150kDa的大小。
另外，由于Fv2mab的大小(150kDa)与包括CH1和CL结构域的DVD-Ig形式(大约200kDa)相比相对较小，因此Fv2mab可能在开发基于抗体的医疗产品方面具有优势。如通过使用本申请人拥有的HEK 293瞬时表达系统测量的，发现所述双特异性抗体Fv2mab产量为约100至200mg/L，其中所述双特异性抗体Fv2mab产量相对高于DVD-Ig的情况。
此外，与使用诸如大肠杆菌的原核表达系统的双抗体(Holliger,P.,Prospero,T.,&Winter,G.(1993).“Diabodies”:small bivalent and bispecific antibodyfragments.Proceedings of the National Academy of Sciences,90(14),6444–6448)及其他基于ScFv的双特异性抗体形式相比，使用哺乳动物表达系统的Fv2mab在产量、质量和CMC(化学、制造、控制)方面具有优势。
本文使用的术语“结合蛋白”是指可以与靶标特异性结合的蛋白质，并且意指免疫球蛋白分子、抗体、其片段、其变体或其修饰物。根据本发明的结合蛋白包含包括VH1-(L1)a-VH2-Xb的第一多肽和包括VL1-(L2)c-VL2的第二多肽，并且不包括重链第一恒定区(CH1)和Fab片段的轻链恒定区。在一些情况下，根据本发明的结合蛋白包含由VH1-[(L1)a-VH2-(IDD1)b]m-Xc组成的第一多肽和由VL1-[(L2)d-VL2-(IDD2)e]n组成的第二多肽。所述第一多肽的VH1或VH2是分别包括相同或不同的抗原结合区的重链可变区或其变体，所述第二多肽的VL1或VL2是分别包括相同或不同的抗原结合区的轻链可变区或其变体，所述第一多肽的L1是存在于VH1与VH2之间的用以连续连接VH1和VH2的接头，所述第二多肽的L2是存在于VL1与VL2之间的用以连续连接VL1和VL2的接头，第一多肽的IDD1是用于产生与轻链的二硫桥的链间二硫键结构域，第二多肽的IDD2是用于产生与重链的二硫桥的链间二硫键结构域，并且所述第一多肽的X是包括CH2和CH3结构域的Fc，a、b、c、d和e分别是0或1，并且m和n分别是1与10之间的整数。
Fab片段具有如下的结构：具有轻链和重链的可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)，并且包括一个抗原结合位点。因为Fab'片段具有包括一个或多个半胱氨酸残基的铰链区，所以Fab'片段与Fab不同。当Fab'的铰链区中的半胱氨酸残基形成二硫键时，形成F(ab')2。Fv是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。重链可变区和轻链可变区通过双链Fv中的非共价键彼此结合。在单链Fv(scFv)中，重链可变区和轻链可变区通常通过肽接头由共价键连接或在C-末端直接连接以与双链Fv中一样形成二聚体结构。这些抗体片段可以通过使用蛋白质水解酶获得(例如，整个抗体可以通过使用木瓜蛋白酶进行限制性片段化以获得Fab或通过使用胃蛋白酶进行片段化来获得F(ab')2片段)或通过基因重组技术制备。
本文使用的术语“多肽”是指氨基酸的任意聚合物链。术语“肽”和“蛋白质”可与术语“多肽”互换使用，其中术语“肽”和“蛋白质”也指氨基酸的聚合物链。多肽包括天然或合成蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合物。
关于抗体、多肽、蛋白质或肽的相互作用，本文使用的术语“特异性结合(specificbinding或specifically binding)”意指相互作用取决于化学物质的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在。例如，抗体通常识别并结合特定的蛋白质结构，而非蛋白质。当抗体对表位“A”具有特异性时，在包括经标记的“A”和所述抗体的反应中，包括表位A的分子的存在将减少与所述抗体结合的经标记的A的量。
本文使用的术语“抗体”是指具有任意免疫球蛋白(Ig)分子和Ig分子必需的表位结合特征的任意功能片段、突变体或变体、修饰物或衍生物，其中Ig分子由四条多肽链组成，包括两条重链(H)和两条轻链(L)。突变体或变体、修饰物或衍生物的具体例子如下描述，但不限于此。
在完整抗体中，每条重链由重链可变区(表示为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域组成，其中所述三个结构域表示为CH1、CH2和CH3。轻链恒定区由一个结构域组成，其中所述结构域表示为CL。所述VH和VL区可以分为称为互补决定区(CDR)的高变结构域，其中在VH和VL区中包括称为框架区(FR)的更保守区。VH和VL各自由三个CDR和四个FR组成，其中所述CDR和FR从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。免疫球蛋白分子可以是任意类型(例如，IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
本文使用的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，其可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶降解产生。Fc区可以是原始序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区通常包括两个恒定结构域，即CH2结构域和CH3结构域，并且任意地包括CH4结构域。
结合蛋白包括一个或多个“抗原结合位点”，其中所述抗原结合位点是具有与抗原特异性结合的能力的抗体片段，并且可以与抗原特异性结合成为双特异性、双重特异性或多特异性的。在本发明中，抗原结合位点包括VH1或VH2的重链可变区和VL1或VL2的轻链可变区，其中每个可变区分别包括相同或不同的抗原结合位点。
术语“双特异性”或“双重特异性”是指结合蛋白可以特异性结合两个不同靶标以调节靶标活性的特征。例如，可以通过特异性结合每个靶标的单克隆抗体或其片段的键合来制备双特异性或双重特异性蛋白。双特异性或双重特异性蛋白具有两个可区分的抗原结合臂(对两个靶标具有特异性)，并且对于与臂结合的每个抗原来说是单价的。
在本发明中，双特异性或双重特异性可以由m和n定义，其中m和n是1与10之间的整数，例如，1与6之间的整数，1与4之间的整数，或者2与3之间的整数。在本发明的一个例子中，结合蛋白可以是四价双特异性抗体，其中VH1或VH2是分别包含不同抗原结合区的重链可变区，VL1或VL2是分别包含不同抗原结合区的轻链可变区，并且m和n分别为1。
本文使用的术语“接头”是指通过肽键连接的并且用于连接一个或多个重链可变区和/或轻链可变区的两个或更多个氨基酸残基。在本发明中，可以存在或不存在接头。如果存在接头，则L1是存在于VH1与VH2之间的用以连续连接VH1和VH2的接头，并且L2是存在于VL1与VL2之间的用以连续连接VL1和VL2的接头。
在本发明的一个例子中，关于在包括VH1-[(L1)a-VH2]m-Xb的第一多肽中存在于VH1与VH2之间的用以连续连接VH1和VH2的接头L1的数量，a可以是1，其中L1是选自ASTKGP(SEQ ID NO:1)、ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:2)和GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:3)的接头。
在本发明的另一个例子中，关于在包括VL1-[(L2)c-VL2]n的第二多肽中存在于VL1与VL2之间的用以连续连接VH1和VH2的接头L2的数量，c可以是1，其中L2是选自TVAAP(SEQ ID NO:4)、TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:5)和GGSGGGGSG(SEQ ID NO:6)的接头。
术语“链间二硫键结构域(IDD)”是指包括用以连接重链和轻链的“链间二硫桥”的区域。在本发明中，第一多肽的IDD1和第二多肽的IDD2可以分别存在或不存在。
在本发明的一个例子中，重链在VH2与Xb之间可以包括IDD以产生与轻链的链间二硫桥，其中所述IDD可以表示为IDD1，或者在一些情况下，表示为由VH1-[(L1)a-VH2-(IDD1)b]m-Xc组成的第一多肽。所述IDD1可以是例如EPKSC(SEQ ID NO:7)。
在本发明的另一个例子中，轻链可以在C-末端包括IDD以产生与重链的链间二硫桥，其中所述IDD可以表示为IDD2，或者在一些情况下，表示为由VL1-[(L2)d-VL2-(IDD2)e]n组成的第二多肽。所述IDD2可以是例如RGEC(SEQ ID NO:8)。
由于在第一多肽和/或第二多肽中所述IDD(IDD1和/或IDD2)可以分别存在或不存在，包括IDD1的第一多肽可以结合包括IDD2的第二多肽或者包括IDD1的第一多肽可以结合不包括IDD2的第二多肽。另外，不包括IDD1的第一多肽可以结合包括IDD2的第二多肽或者不包括IDD1的第一多肽可以结合不包括IDD2的第二多肽。
本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本同质的抗体组(换句话说，不包括天然产生突变的相同抗体，其中各抗体可以存在极少量的天然产生突变)获得的抗体。由于单克隆抗体具有高度特异性，并且是针对单个抗原结合位点诱导的。与包括典型地针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常见(多克隆)抗体试剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
本文使用的术语“表位”是指抗体可特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由表面分子基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，并且不仅具有特定的三维结构特征，而且具有特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于以下事实，在变性溶剂的存在下，前者与电子的结合丧失，但后者与电子的结合不会丧失。
“人源化”类型的非人类(例如鼠类)抗体是指含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其通过用具有预期特异性、亲和力和容量的非人类物种(例如，小鼠、大鼠、兔子或非人类灵长类)的(供体抗体)高变区的残基取代受体高变区的残基而制备。
本文使用的术语“人类抗体”是指源自人类免疫球蛋白的分子，其中构成抗体(诸如互补决定区和结构区)的整个氨基酸序列由人类免疫球蛋白组成。
本文使用的术语“可变区”是指抗体分子的轻链和重链部分，其包括互补决定区(CDR；如CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列。
术语“互补决定区”(CDR；诸如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的氨基酸残基，其中需要可变区用于结合抗原。每个可变区典型地具有三个CDR，标识为CDR1、CDR2和CDR3。
本文使用的术语“框架区”(FR)是指除所述CDR残基外的氨基酸残基。每个可变区典型地具有四个FR，标识为FR1、FR2、FR3和FR4。
本文使用的术语“变体”是指构成重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列的突变，例如取代、添加和/或缺失，并且除非抗原结合和效力受到抑制，其可无限制地包括任意突变。将突变引入本发明的结合蛋白可以应用于例如外部可变区或内部可变区，或外部可变区和内部可变区两者。
在本发明的一个例子中，本发明的结合蛋白可包括通过用半胱氨酸取代VH1和/或VH2中的一个或多个选自FR2H44、FR2H46、FR4H101和FR4H103的氨基酸而制备的变体。例如，在对应于SEQ ID NO:9的重链FR2的WVRQAPGKGLEWVS序列中，第九个氨基酸即甘氨酸(G)和第11个氨基酸即谷氨酸(E)分别是H44和H46，并且可以分别被半胱氨酸取代。另外，重链可变区的FR4H101和FR4H103位点是可以引入链间二硫桥的位点，并且SEQ ID NO:9中的第98位丙氨酸(A)或第100位甘氨酸(G)可以分别被半胱氨酸取代。
在本发明的另一个例子中，结合蛋白可以包括通过用半胱氨酸取代VL1和/或VL2中的一个或多个选自FR4L100、FR4L98、FR2L44、FR2L42和FR2L43的氨基酸而制备的变体。例如，在对应于SEQ ID NO:10的轻链FR2的LAWYQQKPGKAPKLLIY序列中，第十个氨基酸即赖氨酸(K)、第11个氨基酸即丙氨酸(A)和第12个氨基酸即脯氨酸(P)分别是L42、L43和L44，并且可以分别被半胱氨酸取代。在L100和L98的情况下，在对应于SEQ ID NO:10的轻链FR4的FGQGTKVEIK序列中，第一苯丙氨酸(F)和谷氨酰胺(Q)分别是L98和L100，可以分别被半胱氨酸取代。
在本发明的一个例子中，选择轻链或重链半胱氨酸取代位点中的H44-L100的组合作为工程位点，因为H44-L100位点处的两个碳之间的距离接近约并且因此被认为是最适合通过半胱氨酸取代进行工程化的位点(Zhao,J.-X.,Yang,L.,Gu,Z.-N.,Chen,H.-Q.,Tian,F.-W.,Chen,Y.-Q.,Zhang,H.,and Chen,W.(2011).Stabilization of the Single-Chain Fragment Variable by an Interdomain Disulfide Bond and Its Effect onAntibody Affinity.Ijms 12,1–11)。
本发明的结合蛋白可以与以下的靶标结合：ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；聚集蛋白聚糖；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；ANGPT1；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；AZGP1(锌-a-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLR1(MDR15)；BlyS；BMP1；BMP2；BMP3B(GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B；BMPR2；BPAG1(网蛋白)；BRCA1；C19orf10(IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2(D6/JAB61)；CCL1(I-309)；CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)；CCL13(MCP-4)；CCL15(MIP-1d)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)；CCL18(PARC)；CCL19(MIP-3b)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20(MIP-3a)；CCL21(MIP-2)；SLC；exodus-2；CCL22(MDC/STC-1)；CCL23(MPIF-1)；CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)；CCL25(TECK)；CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)；CCL27(CTACK/ILC)；CCL28；CCL3(MIP-1a)；CCL4(MIP-1b)；CCL5(RANTES)；CCL7(MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1(CKR1/HM145)；CCR2(mcp-1RB/RA)；CCR3(CKR3/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKR7/EBI1)；CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)；CCRL2(L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD-22；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A；CD79B；CD8；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1(E-钙粘蛋白)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A(p21Wap1/Cip1)；CDKN1B(p27Kip1)；CDKN1C；CDKN2A(p16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；几丁质酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(claudin-7)；CLN3；CLU(聚集素)；CMKLR1；CMKOR1(RDC1)；CNR1；COL18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；CR2；CRP；CSF1(M-CSF)；CSF2(GM-CSF)；CSF3(GCSF)；CTLA4；CTNNB1(b-连环蛋白)；CTSB(组织蛋白酶B)；CX3CL1(SCYD1)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GRO1)；CXCL10(IP-10)；CXCL11(I-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2(GRO2)；CXCL3(GRO3)；CXCL5(ENA-78/LIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3(GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCL1；DPP4；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FGF；FGF1(aFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6(HST-2)；FGF7(KGF)；FGF8；FGF9；FGFR3；FIGF(VEGFD)；FIL1(EPSILON)；FIL1(ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRT1(纤连)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-1)；FY(DARC)；GABRP(GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNAS1；GNRH1；GPR2(CCR10)；GPR31；GPR44；GPR81(FKSG80)；GRCC10(C10)；GRP；GSN(凝溶胶蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HIP1；组胺及组胺受体；HLA-A；HLA-DRA；HM74；HMOX1；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；ID2；IFN-α；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFN-γ；IFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-1；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；IL1F10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2IL1RN；IL2；IL20；IL20RA；IL21R；IL22；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST(糖蛋白130)；IL7；IL7R；IL8；IL8RA；IL8RB；IL8RB；IL9；IL9R；ILK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6(a6整合素)；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b4整合素)；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5(GC Box BP)；KLF6；KLK10；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)；KRT2A；KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)；LAMA5；LEP(瘦素)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-β)；LTB；LTB4R(GPR16)；LTB4R2；LTBR；MACMARCKS；MAG或Omgp；MAP2K7(c-Jun)；MDK；MIB1；中期因子(midkine)；MIF；MIP-2；MKI67(Ki-67)；MMP2；MMP9；MS4A1；MSMB；MT3(金属硫蛋白-III)；MTSS1；MUC1(黏液素)；MYC；MYD88；NCK2；神经蛋白聚糖；NFKB1；NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1(NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR1I2；NR1I3；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZ1；OPRD1；P2RX7；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PDGFA；PDGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF；PGR；磷酸蛋白聚糖；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG；PLXDC1；PPBP(CXCL7)；PPID；PR1；PRKCQ；PRKD1；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；RAC2(p21Rac2)；RARB；RGS1；RGS13；RGS3；RNF110(ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2(亲脂素B)；SCGB2A1(乳腺球蛋白2)；SCGB2A2(乳腺球蛋白1)；SCYE1(内皮单核细胞活化细胞因子)；SDF2；SERPINA1；SERPINA3；SERPINB5(maspin)；SERPINE1(PAI-1)；SERPINF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPP1；SPRR1B(Spr1)；ST6GAL1；STAB1；STAT6；STEAP；STEAP2；TB4R2；TBX21；TCP10；TDGF1；TEK；TGFA；TGFB1；TGFB1I1；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBR1；TGFBR2；TGFBR3；TH1L；THBS1(血小板反应蛋白-1)；THBS2；THBS4；THPO；TIE(Tie-1)；TIMP3；组织因子；TLR10；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TNF；TNF-α；TNFAIP2(B94)；TNFAIP3；TNFRSF11A；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11(TRANCE)；TNFSF12(APO3L)；TNFSF13(April)；TNFSF13B；TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF15(VEGI)；TNFSF18；TNFSF4(OX40配体)；TNFSF5(CD40配体)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27配体)；TNFSF8(CD30配体)；TNFSF9(4-1BB配体)；TOLLIP；toll型受体；TOP2A(拓扑异构酶Iia)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TRPC6；TSLP；TWEAK；VEGF；VEGFB；VEGFC；多功能蛋白聚糖(versican)；VHLC5；VLA-4；XCL1(淋巴细胞趋化因子)；XCL2(SCM-1b)；XCR1(GPR5/CCXCR1)；YY1；或ZFPM2。
如果考虑具有生物等效活性的突变，则在本研究中多肽、结合蛋白或编码其的核酸被解释为包括与SEQ ID NO中公开的序列显示实质同一性的序列。所述实质上相同的序列是指显示与本发明的序列具有优选至少61％，更优选至少70％，还更优选至少80％，最优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性的序列，如使用本领域普通技术人员已知的序列比较算法之一测量的，通过所述算法本发明的序列最大限度地与另一个任意序列对齐。用于比较的序列比对方法为本领域所熟知。NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)可从包括美国国家生物信息中心(NCBI)的若干个来源获得，并且可以与互联网上的序列分析程序诸如blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/访问BLAST。使用此程序比较序列同一性的方法的描述可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BI-AST/blast help.html获得。
本发明的序列可包括与此处公开的序列有60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的序列或整个序列。所述同源性可通过本领域熟知方法进行序列比较和/或比对来测定。例如，序列比较算法(即BLAST或BLAST 2.0)、手动比对或视觉测试可用于确定本发明的核酸或蛋白质的序列同源性百分数。
本发明的另一方面涉及一种结合蛋白，其包含由VH1-[(L1)a-VH2-(IDD1)b]m-Xc组成的第一多肽和由VL1-[(L2)d-VL2-(IDD2)e]n组成的第二多肽，其中所述第一多肽的VH1或VH2是分别包括相同或不同的抗原结合区的重链可变区或其变体，所述第二多肽的VL1或VL2是分别包括相同或不同的抗原结合区的轻链可变区或其变体，所述第一多肽的L1是存在于VH1与VH2之间的用以连续连接VH1和VH2的接头，所述第二多肽的L2是存在于VL1与VL2之间的用以连续连接VL1和VL2的接头，第一多肽的IDD1是用于产生与轻链的二硫桥的链间二硫键结构域，第二多肽的IDD2是用于产生与重链的二硫桥的链间二硫键结构域，所述第一多肽的X是包括CH2和CH3结构域的Fc，a、b、c、d和e分别是0或1，并且m和n分别是1与10之间的整数。关于上述构象的具体描述和例子可同样适用于与结合蛋白有关的发明。
本发明的另一方面涉及包含多种结合蛋白的抗体。
所述多种结合蛋白可通过以下方式结合：例如，i)基于野生型结合蛋白之间的相互作用的键合，其中所述相互作用包括本领域已知的各种相互作用，诸如蛋白质键合诸如JUN结构域和FOS结构域的亮氨酸拉链或非共价相互作用、操纵的CH结构域和操纵的相互键合表面，ii)通过引入半胱氨酸的二硫键合，和iii)通过卷曲螺旋结构域融合的卷曲螺旋键合，并且本领域已知的其他键合方法可以无限制地包括在内。
可以包括两种或更多种、三种或更多种、或者四种或更多种所述结合蛋白，并且所述多种结合蛋白可以具有例如一种类型，其中包括由VH1-[(L1)a-VH2-(IDD1)b]m-Xc组成的第一多肽和由VL1-[(L2)d-VL2-(IDD2)e]n组成的第二多肽的两种结合蛋白通过链间二硫桥连接(图1)。
本发明的另一方面涉及包含结合蛋白的缀合物。
本文使用的术语“缀合物”是指化学上结合化合物、毒素或其他物质(例如治疗剂或细胞毒性剂)的结合蛋白。结合蛋白可以与以下项结合：化合物、多种化合物的混合物、生物大分子、或由生物材料制备并且作为治疗剂或细胞毒性剂的提取物、毒素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物，但不限于此。
在本发明的一个实例中，结合蛋白可以是H2L2型多价抗体，其中包含IDD1的第一多肽与包含和/或不包括IDD2的第二多肽结合，并且与在第一多肽中作为IDD1包括的EPKSC(SEQ ID NO:7)中的游离半胱氨酸形成半胱氨酸特异性缀合，例如，化合物、毒素(例如，治疗剂或细胞毒性剂)或PEG(PEG化)可与结合蛋白结合。
本发明还涉及编码结合蛋白的第一多肽和/或第二多肽的核酸。
可以分离所述核酸以重组产生所述结合蛋白的第一多肽和/或第二多肽。分离所述核酸，并且将所述分离的核酸插入可复制的载体中以进行额外的克隆(DNA扩增)或额外的表达。基于此，本发明的另一方面涉及包含所述核酸的载体。
本文使用的术语“核酸”总体上是指DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子，并且作为核酸的基本单元的核苷酸不仅包括天然核苷酸，还包括类似物，其中所述类似物中的糖或碱基部分被修饰。本发明的核酸序列可以被修饰。所述修饰包括核苷酸的添加、缺失或者非保守取代或保守取代。
编码所述结合蛋白的第一多肽和/或第二多肽的DNA可以通过使用关于DNA的公知方法(例如，通过使用可以特异性结合DNA的寡核苷酸探针)容易地分离或合成。许多种载体是可用的。载体组分通常包括以下中一项或多项(但不限于此)：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强因子、启动子和转录终止序列。
本文使用的术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶标基因的工具，并且包括质粒载体；粘粒载体；病毒载体，诸如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒。在所述载体中，编码抗体的核酸与启动子可操作地连接。
本文使用的术语“可操作连接”意指核酸表达调节序列(例如，启动子、信号序列或转录调节因子结合位点处阵列)与另一核酸序列之间的功能性键合，其中所述调节序列是通过功能性键合来调节其他核酸序列的转录和/或翻译的。
在将原核生物用作宿主的情况下，载体通常包括可以促进转录的强启动子(例如tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子和T7启动子等)、核糖体结合位点以及转录/翻译终止。另外，例如，在将真核生物用作宿主的情况下，载体通常包括源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人类血红蛋白启动子和人类肌肉肌酸启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV tk启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、HIV LTR启动子、莫洛尼病毒启动子、EB病毒(EBV)启动子和劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子)，并且通常包括聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。
在一些情况下，载体可以与另一个序列融合，以便容易地纯化结合蛋白和/或由其表达的多肽。融合序列可以是，例如，谷胱甘肽S转移酶(Pharmacia，USA)、麦芽糖结合蛋白(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)、6x His(六聚组氨酸；Quiagen，USA)等。
所述载体包括本领域中一般用作选择性标记物的抗生素耐受基因，例如耐受氨苄西林、庆大霉素、羧苄西林、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素的基因。
本发明的另一方面涉及通过使用所述载体转化的细胞。用于产生本发明的结合蛋白和/或多肽的细胞可为原核生物、酵母或高等真核生物细胞，但不限于此。
可以使用原核生物宿主细胞，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属菌株诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、链霉菌属、假单胞菌属(例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和葡萄球菌属(例如，肉葡萄球菌(Staphylocuscarnosus))。
最受关注的是动物细胞，并且可用的宿主细胞株的例子可以是COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S或HT1080，但不限于此。
本发明的另一方面涉及制备结合蛋白和/或多肽的方法，其中所述方法包括(a)培养细胞；和(b)从所培养的细胞中回收结合蛋白和/或多肽。
可以在各种培养基中培养细胞。可商购的培养基可以无限制地用作培养基。还可以以适当浓度包括本领域技术人员已知的任何其他必需的补充物。已根据选择进行表达的宿主细胞使用培养条件(诸如温度、pH等)，并且这些培养条件对于本领域技术人员而言将显而易见。
所述结合蛋白和/或所述多肽的回收可以例如通过离心或超滤除去杂质并通过使用亲和层析纯化生成物来进行。可以使用其他另外的纯化技术，例如阴离子或阳离子交换层析、疏水相互作用层析和羟基磷灰石层析。
实施例
在下文中，将参考实施例进一步详细描述本发明。对于本领域普通技术人员将显而易见的是，这些实施例仅是说明性目的，而不应解释为限制本发明的范围。
实施例1.新的双特异性抗体形式(Fv2mab)的结构
Fv2mab是一种双特异性抗体，具有由两种或更多种不同抗体的重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)之间的键合形成的可变结构域(Fv)片段的串联结构。作为不同串联连接的两个或更多个种类的可变区分别具有独立或同时结合不同抗原的能力，并且具有去除了重链CH1结构域、κ或λ和轻链CL结构域的形式(图1a)。
为了保障对对应于两个串联连接的可变结构域(Fv)的单个抗原的结合亲和力，短接头(VH：ASTKGP SEQ；ID NO:1，VL：TVAAP；SEQ ID NO:4)、长接头(VH：ASTKGPSVFPLAP；SEQID NO:2，VL：TVAAPSVFIFPP；SEQ ID NO:5)和G4S接头(VH：GGGGSGGGGS；SEQ ID NO:3，VL：GGSGGGGSG；SEQ ID NO:6)用于外部可变结构域与内部可变结构域之间以保障各个可变结构域的结构独立性(图2)。
用作概念验证(POC)的亲本抗体通过使用抗VEGFA、抗TNF-α和抗IL17A单克隆抗体作为模板证明了Fv2mab的潜力和优越性。
实施例2.关于热力学稳定性的Fv2mab工程
Fv2mab双特异性抗体的结构是具有两个或更多个连续Fv(VH和VL)的H2L2型多价四聚体。为了以四聚体(H2L2)的结构存在，通用抗体的重链CH结构域和轻链CL结构域通过链间二硫桥(共价键)连接。然而，在缺失CH1和CL的Fv2mab的情况下，结构和稳定性由串联连接的可变结构域(Fv)的VH与VL之间的结合力(疏水键合、离子键合、氢键键合等)决定，并且与通用抗体相反，在重链与轻链之间不存在链内二硫桥(共价键)。因此，在低浓度时确定重链和轻链的结构的结合力预计低于通用抗体的结合力，因此，预期pK/pD也低于通用抗体的情况。
因此，通过在VH与VL彼此相互作用的适当位点取代氨基酸并通过使用额外的方法来引入半胱氨酸二硫桥来增加Fv2mab的总体热力学稳定性。
另外，应用另一种方法，每次用四个氨基酸延长序列长度，通过链间二硫桥引入包括与重链上铰链(EPKSC；SEQ ID NO:7)连接的轻链C末端RGEC氨基酸(SEQ ID NO:8)的序列(图3)。外部可变区或内部可变区或两个可变区可以用作通过取代和添加方法引入半胱氨酸二硫桥的位点。通过取代引入链间二硫桥的位点示于表1中，并且通过引入链间二硫桥形成的结构示于图1b中。
[表1]可以进行二硫桥工程的位点
实施例3.Fv2mab的制备
通过使用修美乐(阿达木单抗，AbbVie)、KOSENTYX(苏金单抗，Novartis)、抗VEGFA(内部抗体)和ABT-122(DVD-Ig，AbbVie)的重链可变区和轻链可变区的序列制备用于概念验证(POC)的亲本抗体，其用于制备双特异性Fv2mab的各种组合。由本申请人制备的pFE表达载体用作动物细胞表达载体，用于生产双特异性抗体Fv2mab的重组蛋白。抗体的重链可变区和轻链可变区由高变区(CDR)和框架(FR)组成。由于可变区中作为起点的FR1和作为终点的FR4在大多数抗体中由相似氨基酸序列组成，因此难以通过诸如PCR等的方法串联连接两个种类的可变区。这是因为归因于FR1和FR4的类似核苷酸序列，难以制备和使用特异性结合引物。因此，Fv2mab系列按组合使用三片连接方法制备，诸如VH1+VH2+pFE载体或VL1+VL2+pFE载体，其中PCR分别用亲本抗体的DNA模板中的重链可变区和轻链可变区进行。
串联连接的VH1和VH2以及串联连接的VL1和VL2可以通过使用短接头、长接头或G4S接头并根据其特征连接，并且可以将半胱氨酸二硫桥引入适当位点以改善热力学稳定性(图4)。在本发明中，在工程化(半胱氨酸二硫桥)Fv2mab的情况下，在引入工程的可变区前面添加‘e’用于注释(例子：在eTNF-IL17的情况下，将半胱氨酸二硫桥引入抗TNF-αFv中，并且在TNF-eIL17的情况下，将其引入抗IL17A Fv中)。
另外，通过添加“RGEC”来表示通过在轻链的C-末端引入IDD(RGEC)而进行的工程(例如：VEGF-TNF-RGEC)。II型限制酶sapI(NEB，England)用于三片连接克隆，而T4DNA连接酶(NEB，England)用于DNA片段连接。表2显示为本发明制备的Fv2mab系列。表3显示每个Fv2mab系列的序列。
[表2]Fv2mab克隆系列
[表3]Fv2mab系列的序列
实施例4.通过蛋白A的Fv2mab表达和纯化
在Fv2mab克隆系列重组蛋白的表达验证和生产中，使用瞬时表达系统，并且将HEK-293F菌株(Invitrogen，USA)用作宿主细胞。通过共转染方法进行Fv2mab的表达，其中共转染以1:1w/w比例的Fv2mab-Hc DNA与Fv2mab-Lc DNA进行。通过以DNA:PEI＝1:4(w/w)的比例制备多聚复合物，将聚乙烯亚胺(PEI)用作转染的转染剂。在转染后第五天，中断分批培养，收获表达培养基，并通过使用蛋白A珠(GE healthcare，USA)从培养基中下拉抗体。通过对输入(表达培养基)、未结合的样品(流过液)和输出(结合的Fv2mab蛋白)的每个部分使用SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色来验证表达的程度和构象(图5)。
将亲本IgG抗体用作下拉测定的对照组样品。如上所述，将一系列Fv2mab抗体克隆到所述pFE表达载体，通过使用PEI转染到HEK 293F细胞，并通过分批培养从细胞生产。转染后6至7天，当细胞存活率测量为约60％至70％时，停止分批培养，并将表达培养基离心(4,800rpm，30分钟，4℃)以除去碎片。然后，使用0.22μm TOP-过滤器(Millipore，USA)过滤上清液。随后，使用蛋白A珠(GE healthcare，USA)对包括Fv2mab的过滤上清液进行亲和层析纯化过程，随后使用Slide-A Lyzer透析盒(Thermo，USA)用pH 7.4PBS透析以更换洗脱缓冲液。发现使用HEK293F的Fv2mab表达水平为约100至200mg/L，并且使用蛋白A的下拉测定显示在培养基中表达的大多数Fv2mab被回收。
实施例5.结构筛选和二硫桥工程
通过以BiP依赖性方式折叠ER中的Fv2mab-重链VH结构域来确定双特异性抗体Fv2mab的组装。在Fv2mab中，由BiP控制的区域存在于两个串联连接的重链VH结构域中，并且未结合LC的BiP和VH复合物在ER中降解。与Fv2mab重链VH结合的BiP通过轻链VL从VH竞争性释放，并且重链VH与轻链VL组装以向外部分泌。
在抗体中，重链结构域CH1和VH与仅分别由轻链CL和VL释放的BiP结合。BiP的控制不是通过基于另一折叠配偶体(VH和CL或CH1和VL)的方法发生的，BiP的控制的失败导致抗体降解(图6)。
为了取代通用抗体中存在的CH1与CL之间的链间二硫桥的热力学稳定性，在Fv2mab的情况下应用以下：将变体IDD应用于包括RGEC区域的可形成链间二硫桥的轻链C-末端的方法和用半胱氨酸取代形成可变区(Fv)的VH和VL(H44L100)的关键氨基酸的方法。使用HEK 293在蛋白质表达后通过SDS-PAGE验证工程化的Fv2mab克隆的组装、构象和表达模式(图7)。所述SDS-PAGE结果显示H2L2四聚体在H44L100工程化克隆处通过链间二硫桥有效形成，并且预测表达水平为约50至100mg/L。
实施例6.通过非变性PAGE验证Fv2mab构象
Blue非变性PAGE(Invitrogen，USA)用于验证仅通过串联连接的可变区(Fv)的VH与VL之间的键合形成的Fv2mab的构象(H2L2，四聚体)。通过使连接Fv2Mab与轻链C-末端之间的链间二硫桥的半胱氨酸缺失，在没有链间二硫桥的情况下，用仅通过VH与VL之间的键合形成的作为对照组的修美乐LCΔC(-RGE)来验证Fv2Mab的结构。
所述非变性PAGE结果验证Fv2mab和修美乐LCΔC(-RGE)在pH 7.4PBS的条件下形成分子量为240kDa至420kDa的H2L2四聚体(图8)。
另外，通过从PAGE凝胶上分离在非变性PAGE凝胶上存在于240kDa与420kDa之间的Fv2mab四聚体带进行第二次SDS-PAGE分析，并且结果验证由离子型洗涤剂(SDS)分离的Fv2mab的重链和轻链(图9)。
实施例7.蛋白A层析后的Fv2mab纯度
通过使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，Germany)和SEC-HPLC(ThermoFisher，USA)分析各种结构和组合的双特异性抗体Fv2mab的表达和纯化后的蛋白质纯度。通过遵循制造商提供的方案，用通过引入半胱氨酸二硫桥以增加热力学稳定性而制备的工程化Fv2mab、Fv2mab(未工程化)以及修美乐、修美乐LCΔC和苏金单抗对照进行纯度分析。结果显示，与半胱氨酸二硫键工程化Fv2mab克隆的情况下的RGEC克隆相比，在H44L100克隆中以相当高的比例形成链间二硫桥(图10)。通过使用2100生物分析仪和SEC-HPLC获得的结果显示，通过使用HEK293瞬时表达系统获得的Fv2mab重组蛋白的纯度为约90％或更高(图11)。
实施例8.Fv2mab在人类血清中的稳定性(体外)
通过使用人类血清体外测量由引入半胱氨酸二硫桥以增加热力学稳定性而制备的工程化Fv2mab的稳定性。将通过应用H44L100取代、不含二硫桥(TNIL17)的Fv2mab(TNIL17)和对照抗体修美乐而工程化的Fv2mab(eTNIL17)添加到分别含有0％、5％、10％和25％人类血清的10nM培养基溶液中在37℃持续5天进行反应，然后用ELISA测量对TNF-α的结合亲和力，以验证Fv2mab的稳定性。通过应用H44L100取代以增加稳定性而工程化的Fv2mab(eTNIL17)的血清稳定性等于所述对照抗体修美乐的血清稳定性，但由串联Fv组成的所述未工程化Fv2mab在低浓度下显示相对低的稳定性(图12)。
实施例9.Fv2mab对个体抗原的结合亲和力的比较
在通过使用HEK293瞬时表达系统表达和纯化各种组合的Fv2mab后，比较对IgG型亲本抗体及其抗原的结合亲和力。通过使用ELISA方法和OCTET系统(ForteBIO，USA)测量结合亲和力。
实施例9-1.ELISA
通过使用ELISA法测量由抗TNF-α和抗VEGFA以及抗TNF-α和抗IL17A的串联Fv组合组成的Fv2mab的亲和力。将诸如TNF-α、VEGFA和IL-17A的抗原以100ng/孔(96孔)的浓度固定在免疫板上，通过使用pH 7.4PBS作为包被缓冲液，在4℃反应过夜。每孔用PBST 200μl洗涤一次，然后在室温下用5％脱脂乳进行表面封闭反应1-2小时。随后，用PBST 200μl洗涤每个孔两次后，用待测的适当双特异性Fv2mab和对照亲本抗体从合适的浓度以1/2至1/5的间隔进行连续稀释，并在室温下反应1至2小时。然后，用PBST 200μl洗涤每个孔三次以除去未结合的抗体，并用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人类Fc-HRP(Millipore，USA)以1:3000的比例进行稀释，在室温下反应1小时。然后，用PBST 200μl洗涤每个孔三次以除去未结合的检测抗体。通过使用TMB溶液(GEhealthcare，USA)以100μl/孔的体积诱导HRP的显色反应，并使用终止溶液(2.5M H2SO4,100μl/孔)终止反应。使用分光光度计测量450nm波长处的吸光度以计算结合亲和力。图13和14显示抗VEGFA抗体、Fv2mab_VE-TN和Fv2mab_VE-eTN(H44L100二硫桥工程化克隆)对VEGFA和TNF-α的结合亲和力的比较。
另外，图15显示修美乐、ABT-122(用于中和TNF-α和IL-17A的DVD-Ig，AbbVie，USA)、Fv2mab_TNF-IL17和Fv2mab_eTNF-IL17对TNF-α的结合亲和力的比较，图16和17分别显示了苏金单抗、ABT-122(AbbVie，USA)、Fv2mab_TNF-IL17和Fv2mab_eTNF-IL17对IL-17A的结合亲和力及其IC 50值的比较。
实施例9-2.OCTET(表面等离子体共振)
通过使用表面等离子体共振(SPR)来测量Fv2mab_TNF-IL17-SL和Fv2mab_eTNF-IL17-SL与TNF-α和IL-17结合的程度和特征，其中Fv2mab_TNF-IL17-SL和Fv2mab_eTNF-IL17-SL由修美乐和苏金单抗的可变区组成。使用OCTET QKe系统测量无标记动力学(蛋白质-蛋白质相互作用)是通过选择和使用抗人类IgG捕获(AHC)生物传感器进行，将包括人类Fc的Fv2mab_TNF-IL17-SL和Fv2mab_eTNF-IL17-SL固定在生物传感器表面上并依次与用不同浓度的动力学缓冲液稀释的TNF-α和IL-17反应，以收集随时间的传感图。表4显示用取决于平衡时的浓度的传感图值绘制的动力学值。所选用于获得Fv2mab_TNF-IL17-SL和Fv2mab_eTNF-IL17-SL的动力学值的抗原浓度对于TNF-α和IL-17两者为1,000nM和333nM，并且使用OCTET系统来验证取决于反应抗原顺序和同时结合两种抗原的程度的结合力的差异(图18)。
[表4]Fv2mab的动力学
实施例10.Fv2mab的阻断效力(体外基于细胞的测定)
实施例10-1.TNF-α阻断测定
使用HEK Blue TNF-α细胞(Invivogen，USA)的分泌胚胎碱性磷酸酶(SEAP)测定系统来验证双特异性抗体Fv2mab的TNF-α阻断效力。由Invivogen提供的HEK Blue TNF-α细胞是用于有效监测TNF-α信令的系统，并且在通过信令调节的NF-kB启动子的下游位置处包括SEAP报告基因。由TNF-α传递的信号最终增加SEAP的表达，其中SEAP在培养基中累积并且容易定量测量。培养基中积累的SEAP的量可以通过使用Quanti-Blue底物(Invivogen，USA)的酶促反应的着色过程来测量，并且可以通过使用分光光度计来测量吸光度以验证阻断效力。TNF-α阻断测定结果显示Fv2mab_TNF-IL17-SL和Fv2mab_eTNF-IL17-SL的效力与修美乐相似(图19)。
实施例10-2.IL-17A阻断测定
将使用HEK Blue IL17细胞(Invivogen，USA)的SEAP测定系统用于验证双特异性抗体Fv2mab的水溶性IL-17A阻断效力。与实施例10-1中描述的HEK Blue TNF-α细胞系统的情况一样，SEAP也用作HEK Blue IL-17细胞系统中的报告基因。使用Quanti-Blue底物(Invivogen，USA)通过酶促反应定量Fv2mab_TNF-IL17-SL，Fv2mab_eTNF-IL17-SL和苏金单抗的IL-17阻断效力(图20)。
实施例11.单Fv抗体和两个连接的Fv的结合亲和力
将由一个可变区(VH1-Fc，VL1)组成的Fv1mab和由两个连续可变区(VH1-L-VH2-Fc，VL1-L-VL2)组成的Fv2mab的结合亲和力与亲本抗体的情况进行比较。通过使用HEK 293进行Fv1mab的瞬时表达的结果显示表达水平类似于Fv2mab，并且将半胱氨酸二硫桥工程(H44L100)应用于本实验中使用的Fv1mab来比较结合亲和力。通过使用修美乐和苏金单抗作为亲本模板制备Fv1mab，并用每种抗体的VH和VL结构域进行PCR。通过使用ELISA比较修美乐、Fv1mab_TNF和Fv2mab_eTNF-IL-SL对TNF-α的结合亲和力，并且还通过使用ELISA比较苏金单抗、Fv1mab_IL17和Fv2mab_TNF-IL-SL对IL-17的结合亲和力(图21)。
实施例12.取决于接头的结合亲和力
通过使用ELISA测量连接连续可变区的接头对抗原结合的影响。在外部Fv与内部Fv之间引入短接头(VH：ASTKGP SEQ；ID NO:1，VL：TVAAP；SEQ ID NO:4)、长接头(VH：ASTKGPSVFPLAP；SEQ ID NO:2，VL：TVAAPSVFIFPP；SEQ ID NO:5)和G4S接头(VH：GGGGSGGGGS；SEQ ID NO:3，VL：GGSGGGGSG；SEQ ID NO:6)，以研究取决于接头的结合亲和力的变化，并且通过使用用于外部Fv的修美乐可变区和用于内部Fv的苏金单抗可变区来制备包括所述接头的Fv2mab。将H44L100的半胱氨酸二硫桥工程应用于与不同种类接头连接的所有三种类型的Fv2mab，并使用ELISA测量对TNF-α和IL-17的结合亲和力。图22显示取决于接头的Fv2mab的结合亲和力的变化。
实施例13.取决于接头的Fv2mab的体外效力(基于细胞的测定)
通过使用HEK blue TNF-α细胞(Invivogen，USA)和HEK Blue IL17细胞(Invivogen，USA)验证取决于连接连续可变区的接头的Fv2mab的体外效力。将用于测量体外效力并通过引入短接头、长接头和G4S接头制备的Fv2mab从10nM和200nM的浓度进行连续稀释，然后使每份稀释的Fv2mab与TNF-α和IL-17进行反应。Quanti-Blue底物(Invivogen，USA)用于定量验证培养基中累积的SEAP，并测量取决于反应的着色程度以验证阻断效力(图23)。
实施例14.DVD-Ig与Fv2mab之间的结合亲和力的比较
为了比较分析取决于双特异性抗体形式的结合亲和力，制备了具有ABT-122_DVD-Ig(抗TNF-α/IL-17双特异性抗体)和抗TNF-α/IL-17的相同可变区的氨基酸序列的ABT-122_Fv2mab。尽管ABT-122_DVD-Ig和ABT-122_Fv2mab具有所述相同可变区的氨基酸序列和接头，但包括CH1和CL的DVD-Ig的分子量为约200kDa，而没有CH1和CL的Fv2mab的分子量为约150kDa。所述G4S接头用于连接可变区，而半胱氨酸二硫桥工程被引入ABT-122_Fv2mab。在双特异性抗体形式之间的比较中，通过使用ELISA测量对TNF-α和IL-17抗原的结合亲和力，并且将通过使用相同的G4S接头和苏金单抗的可变区制备的eTNFIL-G4S用作对照组进行比较分析。尽管双特异性抗体形式不同，但在具有相同可变区序列的ABT-122_DVD-Ig和ABT-122_Fv2mab的两种双特异性抗体中测量的对TNF-α和IL-17的亲和力是相同的。另外，在开发基于抗体的医疗产品中，Fv2ma的分子量可被认为优于其他双特异性抗体形式，因为Fv2ma的分子量为DVD-Ig的约3/4(图24)。
实施例15.体外效力(双特异性抗体形式的比较)
实施例15-1.使用HEK蓝细胞的TNF-α和IL-17A阻断测定
通过使用HEK blue TNF-α细胞(Invivogen，USA)和HEK Blue IL17细胞(Invivogen，USA)验证取决于双特异性抗体形式的体外效力。与修美乐和苏金单抗相比较，通过使用ABT-122_DVD-Ig和ABT-122_Fv2mab从10nM浓度验证相对于TNF-α和IL-17的阻断信号传递程度(图25)。使用与ABT-122_DVD-Ig相同的可变区氨基酸序列的ABT-122_Fv2mab在相同摩尔浓度下显示相同程度的TNF-α和IL-17阻断效力。另外，ABT-122_Fv2mab的IL-17阻断效力优于单克隆抗体苏金单抗。本实施例显示，通过与两个或更多个种类的抗原结合，可以选择性地和容易地制备具有与通用抗体相同分子量和比单克隆抗体显著更高的效应的双特异性抗体。由于ABT-122_Fv2mab的分子量比DVD-Ig的分子量低约25％，因此预期本发明的双特异性抗体可以有效地渗透到组织中，迅速增加并维持血液中的浓度，并且当用于临床研究并作为治疗剂给予时，与DVD-Ig的重量相比较，具有更高的摩尔效应。
实施例15-2.使用HT-29细胞的TNF-α和IL-17A阻断测定
通过使用HT-29(HTB-38TM)细胞进行阻断测定来验证和比较双特异性抗体的TNF-α和IL-17A同时阻断效应。使用HT-29细胞的细胞因子阻断测定通过由TNF-α、IL-17A和IL-22传递的信号测量从HT-29细胞分泌的CXCL1趋化因子的水平来进行。用于测量双特异性抗体抑制HT-29细胞中细胞因子诱导的细胞信号传递的效应的TNF-α、IL-17A和IL-22的浓度分别为1.17ng/ml、2.5ng/ml和0.1ng/ml。用于HT-29细胞培养的培养基是包括10％FBS的RPMI 1640(Hyclone，USA)培养基，用于细胞因子阻断测定的培养基是包括2％FBS的RPMI 1640培养基。通过使用duoset ELISA试剂盒人类CXCL1/GROa试剂盒(R&D)测量从HT-29分泌的CXCL1的量，并且通过遵循制造商提供的方案使用ELISA进行CXCL1测量。在使用HT-29的细胞因子阻断测定中，使用双特异性抗体(ABT122_DVD-Ig，ABT122_Fv2mab)和单特异性抗体(修美乐，苏金单抗)，通过同样的方法以1/4的稀释因子间隔从736pM稀释至0.7pM。通过在相同条件下进行ELISA来测量在HT-29细胞中仅通过1.17ng/ml TNF-α或仅通过2.5ng/ml IL-17A诱导的CXCL1水平，发现分别为约1.5和2.5O.D.，且发现TNF-α和IL-17A两者诱导的CXCL1水平为约3.4O.D.。在双特异性抗体中在HT-29细胞中通过TNF-α和IL-17A两者同时诱导的细胞信号传递抑制程度显著高于单特异性抗体，并且所述双特异性抗体ABT122_DVD-Ig和ABT122-Fv2mab在相同摩尔浓度下显示出等同细胞因子阻断效应(图26)。此结果显示具有相同可变区的抗体序列的双特异性抗体形式相对于Fv2mab和DVD-Ig可具有各种优势。
工业实用性
本发明的多特异性多价结合蛋白的新形式可以弥补常规多特异性结合蛋白的缺点，并通过同时结合两个或更多个靶标来抑制靶标活性，从而与基于单特异性抗体的治疗相比较在疾病治疗和诊断中提供优异的效果。
尽管已经参考具体特征详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说清楚的是，此描述仅用于优选实施方案并且不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同物定义。
序列表自由文本
附上电子文件。
<110> Y生物股份有限公司
<120> 新颖多特异性结合蛋白
<130> PP-B1854
<150> KR 10-2017-0022270
<151> 2017-02-20
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<223> VEGF-TNF-SL no S-S Bridge LC
<400> 14
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1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
His Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Val
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Thr Val Ala Ala Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
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<223> TNF-IL17-SL
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Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
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<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-IL17-SL-Fc
<400> 16
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ala Asp
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Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
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Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
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Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
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Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe
165 170 175
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu
180 185 190
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
195 200 205
Pro Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
210 215 220
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> eTNF-IL17-SL
<400> 18
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ala Asp
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
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100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
145 150 155 160
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
165 170 175
Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Val Ala Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Gly
195 200 205
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210 215 220
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His
245 250 255
Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> eTNF-IL17-SL-Fc
<400> 19
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Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
145 150 155 160
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
165 170 175
Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Trp Val Ala Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Gly
195 200 205
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
210 215 220
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His
245 250 255
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275 280 285
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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340 345 350
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Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
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35 40 45
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195 200 205
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> eTNF-IL17-LL-Fc
<400> 22
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
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<213> 人工序列
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165 170 175
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195 200 205
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Leu Glu Ile Lys Arg
225
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<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> eTNF-IL17-G4S
<400> 24
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1 5 10 15
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> eTNF-IL17-G4S-Fc
<400> 25
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65 70 75 80
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Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
165 170 175
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys
195 200 205
Tyr Tyr Val Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
210 215 220
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp
225 230 235 240
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp
245 250 255
Tyr Tyr Ile His Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu
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Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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340 345 350
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
385 390 395 400
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435 440 445
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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<210> 26
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> eTNF-IL17-G4S LC
<400> 26
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210 215 220
Lys Arg
225
<210> 27
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-eIL17-G4S
<400> 27
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ala Asp
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<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-eIL17-G4S-Fc
<400> 28
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
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245 250 255
Tyr Tyr Ile His Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu
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275 280 285
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
305 310 315 320
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
325 330 335
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
340 345 350
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
355 360 365
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
370 375 380
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
385 390 395 400
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
405 410 415
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
420 425 430
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
435 440 445
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
450 455 460
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
465 470 475 480
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
485 490 495
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 29
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-eIL17-G4S LC
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
115 120 125
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
130 135 140
Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
145 150 155 160
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
165 170 175
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
195 200 205
Tyr Gly Ser Ser Pro Cys Thr Phe Gly Cys Gly Thr Arg Leu Glu Ile
210 215 220
Lys Arg
225
<210> 30
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> eABT122_Fv2mab
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
130 135 140
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe
145 150 155 160
Gly Gly Tyr Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Met Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Gly Phe Ala Asp Tyr Ala
180 185 190
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Thr
195 200 205
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Asn Glu Phe Trp Asn Gly Tyr Tyr Ser
225 230 235 240
Thr His Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
245 250 255
Ser
<210> 31
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> eABT122_Fv2mab-Fc
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
130 135 140
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe
145 150 155 160
Gly Gly Tyr Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Met Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Gly Phe Ala Asp Tyr Ala
180 185 190
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Thr
195 200 205
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Asn Glu Phe Trp Asn Gly Tyr Tyr Ser
225 230 235 240
Thr His Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
245 250 255
Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
260 265 270
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
275 280 285
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
290 295 300
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
305 310 315 320
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
325 330 335
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
340 345 350
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
355 360 365
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
370 375 380
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
385 390 395 400
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
405 410 415
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
420 425 430
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
435 440 445
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
450 455 460
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
465 470 475 480
Ser Pro Gly Lys
<210> 32
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> eABT122_Fv2mab LC
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln
115 120 125
Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
130 135 140
Asp Ile Gly Ser Glu Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Pro
145 150 155 160
Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser His Ser Thr Ser Gly Val Pro
165 170 175
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
180 185 190
Asn Gly Leu Glu Ala Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys His Gln Thr
195 200 205
Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
210 215 220
Arg
225

Claims (13)

1.一种包含VH1-[(L1)a-VH2]m-Xb的第一多肽和VL1-[(L2)c-VL2]n的第二多肽的结合蛋白，
其中所述第一多肽的VH1或VH2分别是包含相同或不同的抗原结合区的重链可变区或其变体，
所述第二多肽的VL1或VL2分别是包含相同或不同的抗原结合区的轻链可变区或其变体，并且所述第二多肽缺乏CL，
所述第一多肽的L1是存在于VH1与VH2之间的用以连续连接VH1和VH2的接头，
所述第二多肽的L2是存在于VL1与VL2之间的用以连续连接VL1和VL2的接头，
所述第一多肽的X是包含CH2和CH3结构域并且不包括CH1的Fc，
a、b和c分别是0或1，并且m和n分别是1与10之间的整数。
2.根据权利要求1的结合蛋白，其中a是1，并且L1是选自ASTKGP(SEQ ID NO:1)、ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:2)和GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:3)的接头。
3.根据权利要求1的结合蛋白，其中c是1，并且L2是选自TVAAP(SEQ ID NO:4)、TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:5)和GGSGGGGSG(SEQ ID NO:6)的接头。
4.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述重链在VH2与Xb之间包含链间二硫桥以产生与轻链的链间二硫桥。
5.根据权利要求4的结合蛋白，其中所述IDD包含EPKSC的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。
6.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述轻链在C-末端包含链间二硫桥以产生与重链的链间二硫桥。
7.根据权利要求6的结合蛋白，其中所述IDD包含RGEC的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。
8.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述VH1和/或VH2中的一个或多个选自FR2 H44、FR2 H46、FR4 H101和FR4 H103的氨基酸被半胱氨酸取代。
9.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述VL1和/或VL2中的一个或多个选自FR4 L100、FR4 L98、FR2 L44、FR2 L42和FR2 L43的氨基酸被半胱氨酸取代。
10.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白是四价双特异性抗体，其中VH1或VH2分别是包含不同抗原结合区的重链可变区，VL1或VL2是分别包含不同抗原结合区的轻链可变区，并且m和n分别为1。
11.一种包含由VH1-[(L1)a-VH2-(IDD1)b]m-Xc组成的第一多肽和由VL1-[(L2)d-VL2-(IDD2)e]n组成的第二多肽的结合蛋白，
其中所述第一多肽的VH1或VH2是分别包括相同或不同的抗原结合区的重链可变区或其变体，
所述第二多肽的VL1或VL2是分别包括相同或不同的抗原结合区的轻链可变区或其变体，
所述第一多肽的L1是存在于VH1与VH2之间的用以连续连接VH1和VH2的接头，
所述第二多肽的L2是存在于VL1与VL2之间的用以连续连接VL1和VL2的接头，
所述第一多肽的IDD1是用于产生与轻链的二硫桥的链间二硫键结构域，所述第二多肽的IDD2是用于产生与重链的二硫桥的链间二硫键结构域，所述第一多肽的X是包含CH2和CH3结构域的Fc，a、b、c、d和e分别是0或1，并且m和n分别是1与10之间的整数。
12.一种包含多种根据权利要求1-11中任一项的结合蛋白的抗体。
13.一种包含根据权利要求1-11中任一项的结合蛋白的缀合物。
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