JP6919100B2 - 新規多重特異的結合タンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、新規多重特異的結合タンパク質に関し、従来公知の様々な多重特異的結合タンパク質フォーマット、例えば二重特異的抗体フォーマットなどにおける短所を補完した新規多重特異的結合タンパク質であり、抗体の不変領域のうち、重鎖のＣＨ１と軽鎖のＣＬ領域を含まず、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域が連続して連結されているポリペプチドを含む多重特異的結合タンパク質に関する。

遺伝子組換えタンパク質の生産とファージディスプレイ技術を用いたヒト抗体ライブラリースクリーニングが容易になることにより、抗体を用いた治療剤の開発が活発になった。抗体を用いた治療剤は、抗原抗体の特異的結合特性を利用し、人体固有の免疫システムに基づいて作用することから、既存の化学治療剤に比べて低い毒性を有する。したがって、現在開発中及び臨床で使用中の抗体治療剤は抗癌剤、自己免疫及び炎症性疾患、感染疾患、臓器移植などの様々な分野で活発に使用されている。

最近、一つの適応症に対する様々な原因と機作が明らかになり、治療剤開発においても単一種類のターゲットから複数種類のターゲットへの接近法が台頭している。そこで、抗体を用いた治療剤開発において単一特異的抗体の特性を２種類以上の抗原タンパク質に特異的に結合し得る多重特異的機能追加のために様々な研究が数十年間行われている。最初の二重特異的抗体の開発は、Ｑｕａｄｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，＆Ｃｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．（１９８４）。Ｈｙｂｒｉｄ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，５（１０）、２９９−３０４．ｄｏｉ：１０．１０１６／０１６７−５６９９（８４）９０１５５−５）を用いた方法であって、異なる抗体を発現するハイブリドーマ細胞株の細胞融合によって二重特異的抗体を作製する方法で始まった。最近では動物細胞を用いた遺伝子組換えタンパク質の生産と構造基盤タンパク質エンジニアリング技術が飛躍的に発展することによって多種多様な二重特異的抗体の開発が試みられている。抗体のＣＨ３領域にＫｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓデザインを適用させて効果的に重鎖の異種二量体化（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を誘導し、異なる２種類の抗原が結合し得るＴｗｏ−ｉｎ−ｏｎｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｏｓｔｒｏｍ，Ｊ．，Ｙｕ，Ｓ．−Ｆ．，Ｋａｎ，Ｄ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｂ．Ａ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｖ．，Ｂｉｌｌｅｃｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）。Ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ＨＥＲ２ ａｎｄ ＶＥＧＦ ａｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２３（５９２１）、１６１０−１６１４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６５４８０）と、重鎖の異種二量体化に基づいて軽鎖のＶＬ又はＣＬ領域を重鎖のＶＨ又はＣＨ１領域と交差反応（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）させて一方の軽鎖に選択的な異種二量体化を誘導したＣｒｏｓｓＭａｂ（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．，Ｒｅｇｕｌａ，Ｊ．Ｔ．，Ｂａｈｎｅｒ，Ｍ．，Ｓｃｈａｎｚｅｒ，Ｊ．，Ｃｒｏａｓｄａｌｅ，Ｒ．，Ｄｕｒｒ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）。Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ａｓ ａ ｇｅｎｅｒｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０８（２７）、１１１８７−１１１９２．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１９００２１０８）などが、単価二重特異的抗体（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の代表である。しかし、このような異種二量体化に基づく二重特異的抗体の場合、二重特異的抗体を得るための動物細胞を用いた組換えタンパク質を生産するとき、発現培地に同時に存在するホモとヘテロの区別が困難であるだけでなく、既存の親二価抗体（ｐａｒｅｎｔａｌ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）に比べて活性が弱いという短所がある。

また、重鎖及び軽鎖の選択的異種二量体化のために導入した変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）による免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）などの安定性問題も提起され得る。最近ではＧｅｎｅｎｔｅｃｈのＴｗｏ−ｉｎ−ｏｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙとＲｏｃｈｅのＣｒｏｓｓＭａｂが持つ様々な組合せのポリペプチドイシューによるＣＭＣ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｃｏｎｔｒｏｌ）問題点から比較的離れた二重特異的抗体ＤＶＤ−Ｉｇ（Ｄｕａｌ−ｖａｒｉａｂｌｅ−ｄｏｍａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，ＡｂｂＶｉｅ，ＵＳＡ）に基づく二重抗体の開発が活発に行われている。ＤＶＤ−Ｉｇフォーマットを適用したターゲットの代表には、ＩＬ−１α／ＩＬ−１β、ＩＬ−１２／ＩＬ−１８、ＶＥＧＦ／ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ＴＮＦ−α／ＩＬ−１７があり、ターゲットタンパク質を同時に中和する戦略で治療剤の開発及び臨床を進行している（Ｗｕ，Ｃ．，Ｙｉｎｇ，Ｈ．，Ｇｒｉｎｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｂｒｙａｎｔ，Ｓ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．，Ｃｌａｂｂｅｒｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）。Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｂｙ ａ ｄｕａｌ−ｖａｒｉａｂｌｅ−ｄｏｍａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５（１１）、１２９０−１２９７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１３４５）。

ＤＶＤ−Ｉｇフォーマットの場合、他の抗原に結合し得る抗体の可変領域が、既存ＩｇＧ抗体可変領域のＮ−末端に連続して連結されている形態を有している。したがって、機能的添加のためにリンカーで連結された可変領域の大きさ分だけ増加した約２００ｋＤａの分子量を有している。タンパク質及び抗体医薬品の開発においてより小さい分子量を有する抗体或いはタンパク質医薬品は、癌細胞或いは病変組織への効果的な浸潤を期待でき、且つ短時間で高い血中濃度に到達できる長所があるので、臨床実験及び治療剤として投与すれば、同一重量に対してより多いモル（ｍｏｌｅ）の効果を期待することができる。

このような技術的背景の下に、本出願の発明者らは新規フォーマットの多重特異的多価の結合タンパク質を開発しようと鋭意努力した結果、重鎖と軽鎖不変領域のＣＨ１領域とＣＬ領域を、第２抗原結合に必要な可変領域であるＶＨとＶＬにそれぞれ取り替えることによって、既存の抗体のような１５０ｋＤａの分子量を有する結合タンパク質（一実施例において４価の二重特異的抗体Ｆｖ２ｍａｂ）が作製でき、上に記した従来の短所を補完し、目的の通りに２種以上のターゲットに同時に結合して活性を抑制させ得ることを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、自己免疫疾患、新生血管生成及び癌細胞増殖などの様々な適応症に原因となる様々なタンパク質分子（例えば、サイトカイン、ケモカインなど）の信号伝達及び生物学的活性を効果的に遮断、抑制できる新規結合タンパク質（例えば、二重特異的抗体Ｆｖ２ｍａｂ）プラットホームを開発することにある。
本発明の目的はまた、前記結合タンパク質を含む接合体を提供することにある。

上記の目的を達成するために、本発明は、ＶＨ１−［（Ｌ１）ａ−ＶＨ２］ｍ−Ｘｂの第１ポリペプチド及びＶＬ１−［（Ｌ２）ｃ−ＶＬ２］ｎを含む第２ポリペプチドを含む結合タンパク質を提供する：前記第１ポリペプチドのＶＨ１又はＶＨ２はそれぞれ、同一の又は異なる抗原結合領域を含む重鎖可変領域であり、前記第２ポリペプチドのＶＬ１又はＶＬ２はそれぞれ、同一の又は異なる抗原結合領域を含む軽鎖可変領域であり、前記第２ポリペプチドはＣＬを含まず、前記第１ポリペプチドのＬ１はＶＨ１とＶＨ２との間に存在し、連続するＶＨ１及びＶＨ２を連結するためのリンカーであり、前記第２ポリペプチドのＬ２はＶＬ１とＶＬ２との間に存在し、連続するＶＬ１及びＶＬ２を連結するためのリンカーであり、前記第１ポリペプチドのＸは、ＣＨ１を除くＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＦｃであり、ａ、ｂ及びｃはそれぞれ０又は１であり、ｍ及びｎはそれぞれ１〜１０の整数である。

本発明はまた、ＶＨ１−［（Ｌ１）ａ−ＶＨ２−（ＩＤＤ１）ｂ］ｍ−Ｘｃで構成された第１ポリペプチド及びＶＬ１−［（Ｌ２）ｄ−ＶＬ２−（ＩＤＤ２）ｅ］ｎで構成された第２ポリペプチドを含む結合タンパク質を提供する：前記第１ポリペプチドのＶＨ１又はＶＨ２はそれぞれ、同一の又は異なる抗原結合領域を含む重鎖可変領域又はその変異体であり、前記第２ポリペプチドのＶＬ１又はＶＬ２はそれぞれ、同一の又は異なる抗原結合領域を含む軽鎖可変領域又はその変異体であり、前記第１ポリペプチドのＬ１はＶＨ１とＶＨ２との間に存在し、連続するＶＨ１及びＶＨ２を連結するためのリンカーであり、前記第２ポリペプチドのＬ２はＶＬ１とＶＬ２との間に存在し、連続するＶＬ１及びＶＬ２を連結するためのリンカーであり、前記第１ポリペプチドのＩＤＤ１は、軽鎖とジスルフィド架橋を生成するための鎖間ジスルフィドドメイン（Ｉｎｔｅｒ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｄｏｍａｉｎ）であり、前記第２ポリペプチドのＩＤＤ２は、重鎖とジスルフィド架橋を生成するための鎖間ジスルフィドドメインであり、前記第１ポリペプチドのＸは、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＦｃであり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅはそれぞれ０又は１であり、ｍ及びｎはそれぞれ１〜１０の整数である。
本発明はまた、結合タンパク質が複数個含まれている抗体を提供する。
本発明はさらに、前記結合タンパク質を含む接合体を提供する。

図１Ａは、二重特異的抗体Ｆｖ２ｍａｂの簡略な構造を示す図である。図１Ｂは、鎖間ジスルフィド架橋（ｉｎｔｅｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｒｉｄｇｅ）が導入されたエンジニアリングされたＦｖ２ｍａｂの構造を示す図である。システインジスルフィド結合を導入できる部分は、外部可変領域（ｏｕｔｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）と内部可変領域（ｉｎｎｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）のＣ−末端に導入した軽鎖のＲＧＥＣアミノ酸と重鎖のＥＰＫＳＣアミノ酸である。 リンカーとジスルフィド架橋エンジニアリングを適用したＦｖ２ｍａｂの２次構造を示す図である。 ＲＧＥＣエンジニアリングのための鎖間ジスルフィドドメイン（Ｉｎｔｅｒ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｄｏｍａｉｎ：ＩＤＤ）の長さを示す図である。 ｐＦＥベクターにクローニングしたＦｖ２ｍａｂｓの発現カセットを示す図である。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたＦｖ２ｍａｂの発現確認とタンパク質Ａプルダウンアッセイ（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）結果を示すものである。 Ｆｖ２ｍａｂの組立て（ａｓｓｅｍｂｌｙ）と分泌（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）のためのＱＣがＢｉｐ依存的に調節されることをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である（構造選別：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）。 システインエンジニアリング（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）によるＦｖ２ｍａｂの鎖間ジスルフィド架橋（ｉｎｔｅｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｒｉｄｇｅ）効率を確認した結果である。 重鎖と軽鎖間の鎖間ジスルフィド架橋がない形態のＦｖ２ｍａｂ（ｐＨ７．４、ＰＢＳ）に対する形態（構造）をＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥを用いて確認した結果である。 ＶＨとＶＬの結合だけからなるＦｖ２ｍａｂの２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示すものである。 エンジニアリングされたＦｖ２ｍａｂクローンの形態をＡｇｉｌｅｎｔ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて確認した結果と、Ｈ４４Ｌ１００システインエンジニアリングされたＦｖ２ｍａｂの純度（ｐｕｒｉｔｙ）を確認した結果である。 ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いたＨＵＭＩＲＡ、ＳＥＣＵＫＩＮＵＭＡＢ、Ｆｖ２ｍａｂ＿ＴＮＦ−ＩＬ１７−ＳＬ、Ｆｖ２ｍａｂ＿ｅＴＮＦ−ＩＬ１７−ＳＬの純度（ｐｕｒｉｔｙ）を確認した結果である。 ヒト血清におけるＦｖ２ｍａｂｓ（エンジニアリングされた抗体、エンジニアリングされていない抗体）の安定性確認結果である。 外部ＦｖのＶＥＧＦＡに対するＦｖ２ｍａｂｓの結合親和度（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）比較結果である。 内部ＦｖのＴＮＦ−αに対するＦｖ２ｍａｂｓの結合親和度比較結果である。 外部ＦｖのＴＮＦ−αに対するＦｖ２ｍａｂｓの結合親和度比較結果である。 内部ＦｖのＩＬ−１７に対するＦｖ２ｍａｂｓの結合親和度比較結果である。 ＳＥＣＵＫＩＮＵＭＡＢ、ＤＶＤ−Ｉｇ（ＡＢＴ−１２２）、Ｆｖ２ｍａｂｓのＩＬ−１７に対するＩＣ５０値の比較結果である。 ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いたＫｄ値の比較結果である。 Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞基盤アッセイを用いたＦｖ２ｍａｂｓのＴＮＦ−α遮断効能（ｂｌｏｃｋａｄｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ）の比較結果である。 Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞基盤アッセイを用いたＦｖ２ｍａｂｓのＩＬ−１７遮断効能（ｂｌｏｃｋａｄｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ）の比較結果である。 Ｍｏｎｏ／ｄｉｍｅｒｉｃ ｌｉｎｋｅｄ Ｆｖの結合親和度比較（ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｌｉｎｋｅｄ Ｆｖ）結果である。 リンカー（ｓｈｏｒｔ、ｌｏｎｇ、Ｇ４Ｓ）によるＦｖ２ｍａｂの抗原結合親和度比較結果である。 Ｆｖ２ｍａｂのリンカーによるｉｎ ｖｉｔｒｏ効能（細胞基盤アッセイ）を示す図である。 二重特異的抗体のフォーマットによる抗原結合親和度の比較（ＤＶＤ−Ｉｇ ｖｓ．Ｆｖ２ｍａｂ）結果を示す図である。 ＤＶＤ−ＩｇとＦｖ２ｍａｂのＴＮＦ−α／ＩＬ−１７に対する遮断効能比較（細胞基盤アッセイ）結果である。 ＴＮＦ−αとＩＬ−１７Ａによって同時に誘導された信号伝達の遮断程度をＨＴ−２９細胞を用いて測定した結果を示すグラフである（二重標的抗体及び単一標的抗体の遮断効能比較）。

別に定義されない限り、本明細書で使われた全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われた命名法は当該技術分野に周知であり、通常使われるものである。

本発明は一観点において、ＶＨ１−［（Ｌ１）ａ−ＶＨ２］ｍ−Ｘｂの第１ポリペプチド及びＶＬ１−［（Ｌ２）ｃ−ＶＬ２］ｎを含む第２ポリペプチドを含む結合タンパク質に関する：前記第１ポリペプチドのＶＨ１又はＶＨ２はそれぞれ、同一の又は異なる抗原結合領域を含む重鎖可変領域であり、前記第２ポリペプチドのＶＬ１又はＶＬ２はそれぞれ、同一の又は異なる抗原結合領域を含む軽鎖可変領域であり、前記第２ポリペプチドはＣＬを含まず、前記第１ポリペプチドのＬ１はＶＨ１とＶＨ２との間に存在し、連続するＶＨ１及びＶＨ２を連結するためのリンカーであり、前記第２ポリペプチドのＬ２はＶＬ１とＶＬ２との間に存在し、連続するＶＬ１及びＶＬ２を連結するためのリンカーであり、前記第１ポリペプチドのＸは、ＣＨ１を除くＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＦｃであり、ａ、ｂ及びｃはそれぞれ０又は１であり、ｍ及びｎはそれぞれ１〜１０の整数である。

一般に、抗体の発現と分泌は、ＥＲ（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）で起きる重鎖と軽鎖の組立てによって決定され、ＨＳＰ７０ ｃｈａｐｅｒｏｎであるＢｉｐ（ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）と重鎖のＣＨ１領域が作用すると知られている（Ｆｅｉｇｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｒｏｓｃｕｒｔｈ，Ｓ．，Ｍａｒｃｉｎｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙ．，Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｈ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ，Ｌ．Ｍ．，＆Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊ．（２００９）。Ａｎ Ｕｎｆｏｌｄｅｄ ＣＨ１ Ｄｏｍａｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，３４（５）、５６９−５７９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２００９．０４．０２８）。しかし、本出願の発明者によって行われた様々な実験の結果、ＥＲで起きるＢｉＰ依存的抗体組立ては、既存に知られているように抗体のＣＨ１とＣＬだけが働く必須領域ではなく、抗体のＶＨ及びＶＬもＢｉＰ依存的方式で抗体組立てに働くことが観察された。これは抗体を組み立てる際に、ＣＨ１とＣＬ領域の有無が抗体の組立てを決定するのではなく、重鎖のＶＨとＣＨ１に結合したＢｉｐを効果的に放出（ｒｅｌｅａｓｅ）させ得る軽鎖のフォルディングパートナーであるＶＬとＣＬ領域の両方が抗体組立てを決定すると考えられる。

すなわち、ＶＨに結合したＢｉＰはＶＬのみによって放出され、ＣＨ１に結合したＢｉＰはＣＬのみによって放出される機作で抗体の組立てが調節される。したがって、抗体の重鎖中のＣＨ１と軽鎖のＣＬ領域は抗体を構成するための必須要素ではなく、それに代えて二次抗原が結合し得る重鎖のＶＨと軽鎖のＶＬをそれぞれ連続的に連結し、異なる２つ以上の抗原に結合し得る多価二重特異的抗体フォーマットを作製するようになった。ＣＨ１とＣＬ領域に代えて二次可変領域が導入されることによって、Ｈ_２Ｌ_２で構成された二重特異的抗体Ｆｖ２ｍａｂは約１５０ｋＤａのサイズを有し、これは一般の抗体と同じ分子量を有する。

また、ＣＨ１とＣＬ領域を含む約２００ｋＤａのＤＶＤ−Ｉｇフォーマットに比べて相対的に小さいサイズのＦｖ２ｍａｂ（１５０ｋＤａ）は、抗体医薬品の開発において大きなメリットとなり得る。二重特異的抗体Ｆｖ２ｍａｂ生産性の場合、本出願人に保有されるＨＥＫ２９３一時的発現システム（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）で確認したとき、約１００〜２００ｍｇ／Ｌレベルの生産性を示すことが確認でき、ＤＶＤ−Ｉｇに比べて相対的に高いレベルの生産性を示すことを観察した。

さらに、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細胞発現システム（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を使用するＤｉａｂｏｄｙ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，Ｐｒｏｓｐｅｒｏ，Ｔ．，＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９３）。“Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ”：ｓｍａｌｌ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９０（１４）、６４４４−６４４８）及びその他ＳｃＦｖベースの二重特異的抗体フォーマットに比べて、Ｆｖ２ｍａｂは、哺乳動物発現システム（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を利用することによって相対的に高い生産性とクォリティー、及びＣＭＣ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｃｏｎｔｒｏｌ）面で優位を確保することができる。

“結合タンパク質”は、標的に特異的に結合可能な形態のタンパク質であり、免疫グロブリン分子、抗体、その断片、その変異体又はその変形物を意味する。本発明に係る結合タンパク質は、ＶＨ１−（Ｌ１）ａ−ＶＨ２−Ｘｂを含む第１ポリペプチド及びＶＬ１−（Ｌ２）ｃ−ＶＬ２を含む第２ポリペプチドを含み、Ｆａｂ断片のうち重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）及び軽鎖の不変領域を含まない。場合によって、本発明に係る結合タンパク質は、ＶＨ１−［（Ｌ１）ａ−ＶＨ２−（ＩＤＤ１）ｂ］ｍ−Ｘｃで構成された第１ポリペプチド及びＶＬ１−［（Ｌ２）ｄ−ＶＬ２−（ＩＤＤ２）ｅ］ｎで構成された第２ポリペプチドを含む。前記第１ポリペプチドのＶＨ１又はＶＨ２はそれぞれ、同一の又は異なる抗原結合領域を含む重鎖可変領域又はその変異体であり、前記第２ポリペプチドのＶＬ１又はＶＬ２はそれぞれ、同一の又は異なる抗原結合領域を含む軽鎖可変領域又はその変異体であり、前記第１ポリペプチドのＬ１はＶＨ１とＶＨ２との間に存在し、連続するＶＨ１及びＶＨ２を連結するためのリンカーであり、前記第２ポリペプチドのＬ２はＶＬ１とＶＬ２との間に存在し、連続するＶＬ１及びＶＬ２を連結するためのリンカーであり、前記第１ポリペプチドのＩＤＤ１は、軽鎖とジスルフィド架橋を生成するための鎖間ジスルフィドドメイン（Ｉｎｔｅｒ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｄｏｍａｉｎ）であり、前記第２ポリペプチドのＩＤＤ２は、重鎖とジスルフィド架橋を生成するための鎖間ジスルフィドドメインであり、前記第１ポリペプチドのＸは、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＦｃであり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅはそれぞれ０又は１であり、ｍ及びｎはそれぞれ１〜１０の整数である。

Ｆａｂ断片は、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）_２は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを持つ最小の抗体断片である。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ；ｓｃＦｖ）は、一般に、ペプチドリンカーによって重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されたり、又はＣ−末端において直接に連結されており、二重鎖Ｆｖのように二量体のような構造をなし得る。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すればＦａｂが得られ、ペブシンで切断すればＦ（ａｂ’）_２断片が得られる。）、遺伝子組換え技術を用いて作製することもできる。

“ポリペプチド”は、アミノ酸の任意の重合体鎖を意味する。“ペプチド”及び“タンパク質”という用語は、ポリペプチドと同じ意味で使えるものであり、これも同様にアミノ酸の重合体鎖を意味する。“ポリペプチド”は、天然又は合成タンパク質、タンパク質断片及びタンパク質配列のポリペプチド類似体を含む。ポリペプチドは単量体又は重合体であり得る。

抗体、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドの相互作用と関連して“特異的結合”又は“特異的に結合する”とは、その相互作用が化学種上の特定構造（例えば、抗原決定因子又はエピトープ）の存在によってなされるということを意味する。例えば、抗体は一般に、タンパク質よりは特定タンパク質構造を認識してそこに結合する。抗体がエピトープ“Ａ”に特異的であれば、標識された“Ａ”と抗体を含む反応においてエピトープＡ（又は遊離した未標識Ａ）を含む分子の存在は、抗体に結合された標識されたＡの量を減少させるだろう。

“抗体”とは、４個のポリペプチド鎖、すなわち２個の重鎖（Ｈ）と２個の軽鎖（Ｌ）で構成された任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子又はこのようなＩｇ分子の必須のエピトープ結合特徴を有する任意の機能性断片、突然変異体、変形体又は誘導体を意味する。このような突然変異体、変形体又は誘導体の具体例については以下に議論するか、それに限定されない。

完全な抗体において、各重鎖は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ又はＶＨで表示される）と重鎖不変領域で構成される。重鎖不変領域は、３個のドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３で構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域と軽鎖不変領域で構成される。軽鎖不変領域は１個のドメインＣＬで構成される。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域に分けることができ、ここには骨格領域（ＦＲ）というより保存的な領域が散在している。各ＶＨ及びＶＬは３個のＣＤＲ及び４個のＦＲで構成され、それらはアミノ末端からカルボキシ末端へ次のような順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。免疫グロブリン分子は、任意の類型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであり得る。

“Ｆｃ領域”は、完全な抗体のパパイン分解によって生成され得る免疫グロブリン重鎖のＣ−末端領域を定義するために使われる。Ｆｃ領域は、固有配列Ｆｃ領域又は変異Ｆｃ領域であり得る。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に２個の不変ドメイン、すなわちＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、任意にＣＨ４ドメインを含む。

結合タンパク質は、抗原に対する特異的結合能を有する一つ以上の抗体断片である“抗原結合部”を含み、他の抗原に特異的に結合でき、これによって二特異的、二重特異又は多重特異型であり得る。本発明において、抗原結合部はＶＨ１又はＶＨ２の重鎖可変領域及びＶＬ１又はＶＬ２の軽鎖可変領域に含まれており、各々は同一の又は異なる抗原結合領域を含む。

“二特異的”又は“二重特異的”は、２個の異なるターゲットに特異的に結合してターゲットの活性を調節できる結合タンパク質の特性であり、例えば、各ターゲットに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片の接合によってなり、また、２個の区分された抗原結合アーム（ａｒｍ：２個ターゲットに対する特異性）を保有し、これに結合するそれぞれの抗原に対して１価である。

これは、本発明においてｍ及びｎと定義することができ、ｍ及びｎは、１〜１０の整数、例えば１〜６の整数、１〜４の整数、２〜３の整数であり得る。一実施例において、本発明に係る結合タンパク質は、ＶＨ１又はＶＨ２がそれぞれ、異なる抗原結合領域を含む重鎖可変領域であり、ＶＬ１又はＶＬ２はそれぞれ、異なる抗原結合領域を含む軽鎖可変領域であり、ｍ及びｎがそれぞれ１である４価の二重特異的抗体であり得る。

“リンカー”は、ペプチド結合によって連結された２個以上のアミノ酸残基を意味し、一つ以上の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を連結するために利用される。本発明においてリンカーは存在しても存在しなくてもよい。存在する場合、Ｌ１は、ＶＨ１とＶＨ２との間に存在し、連続するＶＨ１及びＶＨ２を連結するためのリンカーであり、Ｌ２は、ＶＬ１とＶＬ２との間に存在し、連続するＶＬ１及びＶＬ２を連結するためのリンカーである。

一実施例において、ＶＨ１−［（Ｌ１）ａ−ＶＨ２］ｍ−Ｘｂを含む第１ポリペプチドにおいて、ＶＨ１とＶＨ２との間に存在して連続するＶＨ１及びＶＨ２を連結するためのリンカーであるＬ１の数と関連してａは１であり、このとき、Ｌ１は、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号１）、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）から構成された群から選ばれるいずれか一つのリンカーでよい。

他の実施例において、ＶＬ１−［（Ｌ２）ｃ−ＶＬ２］ｎを含む第２ポリペプチドにおいて、Ｌ２はＶＬ１とＶＬ２との間に存在し、連続するＶＬ１及びＶＬ２を連結するためのリンカーであり、Ｌ２の数と関連してｃは１であり、このとき、Ｌ２は、ＴＶＡＡＰ（配列番号４）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号５）及びＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号６）から構成された群から選ばれるいずれか一つのリンカーでよい。

“鎖間ジスルフィドドメイン（ＩＤＤ）”は、重鎖及び軽鎖を連結するための“鎖間ジスルフィド架橋（ｉｎｔｅｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｒｉｄｇｅ）”を含む領域を意味し、本発明において第１ポリペプチドにおけるＩＤＤ１及び第２ポリペプチドにおけるＩＤＤ２はそれぞれ存在しても存在しなくてもよい。

一実施例において、重鎖は、軽鎖と鎖間ジスルフィド架橋を生成するためにＶＨ２とＸｂとの間に鎖間ジスルフィドドメイン（Ｉｎｔｅｒ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｄｏｍａｉｎ：ＩＤＤ）を含むことができ、このとき、鎖間ジスルフィドドメインはＩＤＤ１と表示でき、場合によってＶＨ１−［（Ｌ１）ａ−ＶＨ２−（ＩＤＤ１）ｂ］ｍ−Ｘｃで構成された第１ポリペプチドと表現されてもよい。このとき、ＩＤＤ１は、例えばＥＰＫＳＣ（配列番号７）であり得る。

他の実施例において、軽鎖は、重鎖と鎖間ジスルフィド架橋を生成するためにＣ−末端に鎖間ジスルフィドドメイン（Ｉｎｔｅｒ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｄｏｍａｉｎ：ＩＤＤ）を含むことができ、このとき、鎖間ジスルフィドドメインはＩＤＤ２と表示でき、場合によって、ＶＬ１−［（Ｌ２）ｄ−ＶＬ２−（ＩＤＤ２）ｅ］ｎで構成された第２ポリペプチドと表現されてもよい。このとき、ＩＤＤ２は、例えばＲＧＥＣ（配列番号８）であり得る。

前記ＩＤＤ（ＩＤＤ１及び／又はＩＤＤ２）は、第１ポリペプチド及び／又は第２ポリペプチドのそれぞれにおいて存在しても存在しなくてもよいので、ＩＤＤ１を含む第１ポリペプチドがＩＤＤ２を含む第２ポリペプチドと結合したり、ＩＤＤ１を含む第１ポリペプチドがＩＤＤ２を含まない第２ポリペプチドと結合し得る。また、ＩＤＤ１を含まない第１ポリペプチドがＩＤＤ２を含む第２ポリペプチドと結合したり、ＩＤＤ１を含まない第１ポリペプチドがＩＤＤ２を含まない第２ポリペプチドと結合してもよい。

“モノクローナル抗体”とは、実質的に同質的抗体集団から収得した抗体、すなわち集団を占めている個々の抗体が微量で存在し得る可能な天然発生的突然変異を除いては、同じものを指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であるため、単一抗原部位に対抗して誘導される。典型的に異なる決定因子（エピトープ）に対して指示された異なる抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一決定因子に対して指示される。

“エピトープ”は、抗体が特異的に結合し得るタンパク質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。エピトープは通常、化学的に活性である表面分子群、例えばアミノ酸又は糖側鎖で構成され、一般に特定の３次元の構造的特徴だけでなく特定の電荷特性を有する。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は消失されるが、後者に対しては消失されないという点で区別される。

“ヒト化”形態の非ヒト（例：ミューリン）抗体は、非ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域からの残基を目的の特異性、親和性及び能力を保有している非ヒト種（供与者抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類の超可変領域からの残基に取り替えたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。

“ヒト抗体”は、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であり、相補性決定領域、構造領域を含む抗体を構成する全てのアミノ酸配列の全体がヒトの免疫グロブリンで構成されているものを意味する。

“可変領域”は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分を指す。ＶＨは重鎖の可変領域を指す。ＶＬは軽鎖の可変領域を指す。

“相補性決定領域”（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変領域のアミノ酸残基を指す。各可変領域は典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。

“骨格領域”（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変領域残基である。各可変領域は典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された４個のＦＲを有する。

“変異体”とは、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を構成するアミノ酸配列の変異、例えば置換、付加及び／又は欠失を意味でき、抗原結合及び効能を阻害しない限り、任意の変異が制限なく含まれ得る。本発明に係る結合タンパク質において変異の導入は、例えば、外部可変領域又は内部可変領域、若しくは外部可変領域及び内部可変領域の両方に適用可能である。

一実施例において、本発明に係る結合タンパク質は、前記ＶＨ１及び／又はＶＨ２のうちＦＲ２ Ｈ４４、ＦＲ２ Ｈ４６、ＦＲ４ Ｈ１０１及びＦＲ４ Ｈ１０３で構成された群から選ばれる一つ以上の位置のアミノ酸がシステインに置換された変異体を含むことができる。例えば、配列番号９のうち重鎖ＦＲ２に該当するＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳにおいて、９番目に位置したアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がＨ４４、１１番目に位置したグルタミン酸（Ｅ）がＨ４６に該当し、それぞれがシステインに置換され得る。また、重鎖可変領域のＦＲ４ Ｈ１０１、ＦＲ４ Ｈ１０３の位置も鎖間ジスルフィド結合の導入可能な位置であり、配列番号９のうち９８番目に位置したアラニン（Ａ）又は１００番目に位置したグリシン（Ｇ）のそれぞれがシステインに置換され得る。

他の実施例において、本発明に係る結合タンパク質は、前記ＶＬ１及び／又はＶＬ２のうち、ＦＲ４ Ｌ１００、ＦＲ４ Ｌ９８、ＦＲ２ Ｌ４４、ＦＲ２ Ｌ４２及びＦＲ２ Ｌ４３で構成された群から選ばれる一つ以上の位置のアミノ酸がシステインに置換された変異体を含むことができる。例えば、配列番号１０のうち、軽鎖ＦＲ２に該当するＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹにおいて１０番目に位置したリシン（Ｋ）がＬ４２、１１番目に位置したアラニン（Ａ）がＬ４３、１２番目に位置したプロリン（Ｐ）がＬ４４に該当し、それぞれがシステインに置換され得る。Ｌ１００及びＬ９８の場合、配列番号１０のうちＦＲ４に該当するＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫにおいて最初のフェニルアラニン（Ｆ）がＬ９８、グルタミン（Ｑ）がＬ１００に該当し、これらのそれぞれがシステインに置換され得る。

一実施例において、軽鎖又は重鎖システイン置換サイトのうちＨ４４−Ｌ１００の組合せが、２つの炭素間の距離が５Å程度と最も近接していることから、システイン置換を用いたエンジニアリングにおいて最適のサイトと判断され、Ｈ４４−Ｌ１００をエンジニアリングサイトとして選別した。（Ｚｈａｏ，Ｊ．−Ｘ．，Ｙａｎｇ，Ｌ．，Ｇｕ，Ｚ．−Ｎ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．−Ｑ．，Ｔｉａｎ，Ｆ．−Ｗ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．−Ｑ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｗ．（２０１１）。Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｖａｒｉａｂｌｅ ｂｙ ａｎ Ｉｎｔｅｒｄｏｍａｉｎ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ．Ｉｊｍｓ１２，１−１１．）

本発明に係る結合タンパク質は、ＡＢＣＦ１；ＡＣＶＲ１；ＡＣＶＲ１Ｂ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬ１；ＡＤＯＲＡ２Ａ；アグリカン；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＩＦ１；ＡＩＧ１；ＡＫＡＰ１；ＡＫＡＰ２；ＡＭＨ；ＡＭＨＲ２；ＡＮＧＰＴ１；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣ１；ＡＲ；ＡＺＧＰ１（亜鉛−ａ−糖タンパク質）；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ；ＢＡＧ１；ＢＡＩ１；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲ１（ＭＤＲ１５）；ＢｌｙＳ；ＢＭＰ１；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭＰ８；ＢＭＰＲ１Ａ；ＢＭＰＲ１Ｂ；ＢＭＰＲ２；ＢＰＡＧ１（プレクチン）；ＢＲＣＡ１；Ｃ１９ｏｒｆ１０（ＩＬ２７ｗ）；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡＮＴ１；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶ１；ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）；ＣＣＬ１（Ｉ−３０９）；ＣＣＬ１１（エオタキシン）；ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）；ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−１ｄ）；ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）；ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）；ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）；ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂ）；ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）；ＣＣＬ２１（ＭＩＰ−２）；ＳＬＣ；エクソダス−２；ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−１）；ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）；ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）；ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）；ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）；ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１ａ）；ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１ｂ）；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）；ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）；ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）；ＣＣＮＡ１；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤ１；ＣＣＮＥ１；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲ１（ＣＫＲ１／ＨＭ１４５）；ＣＣＲ２（ｍｃｐ−１ＲＢ／ＲＡ）；ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）；ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）；ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩ１）；ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ−Ｌ１）；ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）；ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）；ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤ１Ｃ；ＣＤ２０；ＣＤ２００；ＣＤ−２２；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４４；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤ８；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリン）；ＣＤＨ１０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤＫ２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１Ｗａｐ１／Ｃｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７Ｋｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｃ；ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６ＩＮＫ４ａ）；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲ１；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；キチナーゼ；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７（クラウジン−７）；ＣＬＮ３；ＣＬＵ（クラステリン）；ＣＭＫＬＲ１；ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）；ＣＮＲ１；ＣＯＬ１８Ａ１；ＣＯＬ１Ａ１；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＳＦ１（Ｍ−ＣＳＦ）；ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）；ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢ１（ｂ−カイネチン）；ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）；ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤ１）；ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）；ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）；ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）；ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ／ＩＰ−９）；ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）；ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）；ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ）；ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）；ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）；ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）；ＣＹＢ５；ＣＹＣ１；ＣＹＳＬＴＲ１；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８；ＤＮＣＬ１；ＤＰＰ４；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦ１；ＥＤＧ１；ＥＦＮＡ１；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮＯ１；ＥＮＯ２；ＥＮＯ３；ＥＰＨＢ４；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ−２）；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲ１；ＥＳＲ２；Ｆ３（ＴＦ）；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲ１Ａ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦＧＦ；ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ；ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）；ＦＧＦ４（ＨＳＴ）；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）；ＦＧＦ７（ＫＧＦ）；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）；ＦＩＬ１（ＥＰＳＩＬＯＮ）；ＦＩＬ１（ＺＥＴＡ）；ＦＬＪ１２５８４；ＦＬＪ２５５３０；ＦＬＲＴ１（フィブロネクチン）；ＦＬＴ１；ＦＯＳ；ＦＯＳＬ１（ＦＲＡ−１）；ＦＹ（ＤＡＲＣ）；ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）；ＧＡＧＥＢ１；ＧＡＧＥＣ１；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ−６ＳＴ；ＧＡＴＡ３；ＧＤＦ５；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ−ＣＳＦ；ＧＮＡＳ１；ＧＮＲＨ１；ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）；ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）；ＧＲＰ；ＧＳＮ（ゲルゾリン）；ＧＳＴＰ１；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＨＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦ１Ａ；ＨＩＰ１；ヒスタミン及びヒスタミン受容体；ＨＬＡ−Ａ；ＨＬＡ−ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸ１；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；ＩＤ２；ＩＦＮ−ａ；ＩＦＮＡ１；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮガンマ；ＩＦＮＷ１；ＩＧＢＰ１；ＩＧＦ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ−１；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ−１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；ＩＬ１４；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；ＩＬ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；ＩＬ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１９；ＩＬ１Ａ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬ１Ｆ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹ１；ＩＬ１Ｒ１；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２ＩＬ１ＲＮ；ＩＬ２；ＩＬ２０；ＩＬ２０ＲＡ；ＩＬ２１Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ２２Ｒ；ＩＬ２２ＲＡ２；ＩＬ２３；ＩＬ２４；ＩＬ２５；ＩＬ２６；ＩＬ２７；ＩＬ２８Ａ；ＩＬ２８Ｂ；ＩＬ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ３；ＩＬ３０；ＩＬ３ＲＡ；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ５ＲＡ；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）；ＩＬ７；ＩＬ７Ｒ；ＩＬ８；ＩＬ８ＲＡ；ＩＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；ＩＬ９；ＩＬ９Ｒ；ＩＬＫ；ＩＮＨＡ；ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫ１；ＩＲＡＫ２；ＩＴＧＡ１；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；ＪＡＧ１；ＪＡＫ１；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩ１；ＫＤＲ；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣ Ｂｏｘ ＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬＫ１０；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＲＴＨＢ６（毛髪特異的II型ケラチン）；ＬＡＭＡ５；ＬＥＰ（レプチン）；Ｌｉｎｇｏ−ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ−Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ−β）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧ又はＯｍｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ−Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；ＭＩＢ１；ミドカイン；ＭＩＦ；ＭＩＰ−２；ＭＫＩ６７（Ｋｉ−６７）；ＭＭＰ２；ＭＭＰ９；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン−III）；ＭＴＳＳ１；ＭＵＣ１（ムチン）；ＭＹＣ；ＭＹＤ８８；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ−Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ−Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ−ｐ７５；ＮｇＲ−Ｔｒｏｙ；ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）；ＮＯＸ５；ＮＰＰＢ；ＮＲ０Ｂ１；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲ１Ｄ１；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１Ｉ２；ＮＲ１Ｉ３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰ１；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺ１；ＯＰＲＤ１；Ｐ２ＲＸ７；ＰＡＰ；ＰＡＲＴ１；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＤＧＦＡ；ＰＤＧＦＢ；ＰＥＣＡＭ１；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣ１；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲ１；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤ１；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）；ＰＴＮ；ＲＡＣ２（ｐ２１Ｒａｃ２）；ＲＡＲＢ；ＲＧＳ１；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢＯ２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥ１（内皮単球活性化サイトカイン）；ＳＤＦ２；ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰＩＮＢ５（マスピン）；ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ−１）；ＳＥＲＰＩＮＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰ１；ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒ１）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢ１；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ；ＳＴＥＡＰ２；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰ１０；ＴＤＧＦ１；ＴＥＫ；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢ１；ＴＧＦＢ１Ｉ１；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲ１；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨ１Ｌ；ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン−１）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ−１）；ＴＩＭＰ３；組織因子；ＴＬＲ１０；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＮＦ；ＴＮＦ−ａ；ＴＮＦＡＩＰ２（Ｂ９４）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様受容体；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＩｉａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭ１；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＲＡＦ１；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭ１；ＴＲＥＭ２；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬ Ｃ５；ＶＬＡ−４；ＸＣＬ１（リンホタクチン）；ＸＣＬ２（ＳＣＭ−１ｂ）；ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）；ＹＹ１；又はＺＦＰＭ２の標的に結合し得る。

生物学的均等活性を有する変異を考慮すれば、本発明においてポリペプチド、結合タンパク質又はこれをコードする核酸分子は、配列番号に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。実質的な同一性は、本発明の配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界において通常利用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最小で６１％以上の相同性、好ましくは７０％以上の相同性、より好ましくは８０％以上の相同性、最も好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は当業界では公知である。ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）は、ＮＢＣＩなどで接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して利用することができる。ＢＬＳＡＴはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認できる。

これに基づいて、本発明に記載された配列は、明細書に記載された明示された配列又は全体と比較して６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有する配列も含むことができる。このような相同性は、当業界における公知の方法による配列比較及び／又は整列によって決定され得る。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０）、手動整列、肉眼検査を用いて本発明の核酸又はタンパク質のパーセント配列相同性を決定することができる。

本発明は、他の観点において、ＶＨ１−［（Ｌ１）ａ−ＶＨ２−（ＩＤＤ１）ｂ］ｍ−Ｘｃで構成された第１ポリペプチド及びＶＬ１−［（Ｌ２）ｄ−ＶＬ２−（ＩＤＤ２）ｅ］ｎで構成された第２ポリペプチドを含む結合タンパク質に関する：前記第１ポリペプチドのＶＨ１又はＶＨ２はそれぞれ、同一の又は異なる抗原結合領域を含む重鎖可変領域又はその変異体であり、前記第２ポリペプチドのＶＬ１又はＶＬ２はそれぞれ、同一の又は異なる抗原結合領域を含む軽鎖可変領域又はその変異体であり、前記第１ポリペプチドのＬ１はＶＨ１とＶＨ２との間に存在し、連続するＶＨ１及びＶＨ２を連結するためのリンカーであり、前記第２ポリペプチドのＬ２はＶＬ１とＶＬ２との間に存在し、連続するＶＬ１及びＶＬ２を連結するためのリンカーであり、前記第１ポリペプチドのＩＤＤ１は、軽鎖とジスルフィド架橋を生成するための鎖間ジスルフィドドメイン（Ｉｎｔｅｒ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｄｏｍａｉｎ）であり、前記第２ポリペプチドのＩＤＤ２は重鎖とジスルフィド架橋を生成するための鎖間ジスルフィドドメインであり、前記第１ポリペプチドのＸはＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＦｃであり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅはそれぞれ０又は１であり、ｍ及びｎはそれぞれ１〜１０の整数である。先に記載された各構成に対する具体的な説明及び例示は、上の結合タンパク質と関連した発明にも同一に適用され得る。
本発明は、さらに他の観点において、前記複数個の結合タンパク質が含まれている抗体に関する。

前記複数個の結合タンパク質は、例えば、ｉ）ＪＵＮドメイン及びＦＯＳドメインのようなロイシンジッパーのようなタンパク質結合又は非共有相互作用、操作されたＣＨドメイン、操作された相互結合面などの公知の様々な相互作用を含む野生型結合タンパク質間相互作用による結合、ｉｉ）システイン導入によるジスルフィド結合、ｉｉｉ）ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメイン融合によるｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ結合などによって結合でき、その他公知の結合方法を制限無く用いることができる。

前記結合タンパク質を２個以上、３個以上、４個以上含むことができ、例えば、ＶＨ１−［（Ｌ１）ａ−ＶＨ２−（ＩＤＤ１）ｂ］ｍ−Ｘｃで構成された第１ポリペプチド及びＶＬ１−［（Ｌ２）ｄ−ＶＬ２−（ＩＤＤ２）ｅ］ｎで構成された第２ポリペプチドを含む結合タンパク質の２個が鎖間ジスルフィド結合によって連結された形態であり得る（図１）。
本発明は、更に他の観点において、前記結合タンパク質を含む接合体に関する。

“接合体”とは、化合物、毒素など、例えば治療剤又は細胞毒性剤に化学的に結合した結合タンパク質を意味する。化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的巨大分子又は生物学的物質から製造された抽出物が結合し得る。治療剤又は細胞毒性剤として、毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または同族体が結合し得るが、これに制限されるものではない。

一実施例において、本発明に係る結合タンパク質は、鎖間ジスルフィドドメインＩＤＤ１を含む第１ポリペプチドが、鎖間ジスルフィドドメインＩＤＤ２を含む及び／又は含まない第２ポリペプチドと結合したＨ_２Ｌ_２形態の多価抗体でよく、第１ポリペプチドにおいてＩＤＤ１として含まれたＥＰＫＳＣ（配列番号７）の自由システイン基にシステイン特異的接合、例えば、化合物、毒素などの例えば治療剤又は細胞毒性剤が結合したり、又はＰＥＧ（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）が結合し得る。
本発明はまた、前記結合タンパク質の第１ポリペプチド及び／又は第２ポリペプチドをコードする核酸に関する。

前記核酸を分離し、結合タンパク質の第１ポリペプチド及び／又は第２ポリペプチドを組み換えて生産することができる。核酸を分離して、それを複製可能なベクター内に挿入してさらにクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）、又はさらに発現させる。これに基づいて、本発明は、さらに他の観点において、前記核酸を含むベクターに関する。

“核酸”は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味であり、核酸において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明に係る核酸の配列は変形され得る。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。

前記ＤＮＡを用いて通常の過程によって（例えば、ＤＮＡと特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）結合タンパク質の第１ポリペプチド及び／又は第２ポリペプチドのコーディングＤＮＡを容易に分離又は合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には一般に、次のいずれか一つ以上が含まれるが、これに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終結配列。

本明細書で使われる用語、“ベクター”は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含む。前記ベクターにおいて抗体をコードする核酸はプロモーターと作動的に連結されている。

“作動的に連結”は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節する。

原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させ得る強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合座及び転写／解読終結配列を含むのが一般的である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーターエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウスサルコマウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）を用いることができ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。

場合によって、ベクターは、それから発現する結合タンパク質及び／又はポリペプチドの精製を容易にするために他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。

前記ベクターは、選択標識として、当業界に通常使用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン，クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。

本発明はさらに他の観点において、前記言及されたベクターに形質転換された細胞に関する。本発明の結合タンパク質及び／又はポリペプチドを生成させるために使用された細胞は、原核生物、酵母又は高等真核生物細胞であり得るが、これに制限されるものではない。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌及びバチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を用いることができる。

ただし、動物への関心が最も高く、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ−７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０が挙げられるが、これに制限されるものではない。

本発明は、さらに他の観点において、（ａ）前記細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞から結合タンパク質及び／又はポリペプチドを回収する段階を含む前記結合タンパク質及び／又はポリペプチドの製造方法に関する。

前記細胞は、各種培地で培養することができる。市販用の培地を制限なく培養培地として使用することができる。当業者に公知のその他全ての必須補充物が適度の濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨなどが発現のために選別された宿主細胞と共に既に用いられており、これは当業者には明らかであろう。

前記結合タンパク質及び／又はポリペプチドの回収は、例えば遠心分離又は限外ろ過によって不純物を除去し、その結果を、例えば親和クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。追加のその他精製技術、例えば陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどを用いることができる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

実施例１．新規二重特異的抗体フォーマットの構造（Ｆｖ２ｍａｂ）
二重特異的抗体であるＦｖ２ｍａｂは、２種類以上の異なる抗体の重鎖可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ：ＶＨ）と軽鎖可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：ＶＬ）の結合からなる可変領域断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ：Ｆｖ）がタンデム（ｔａｎｄｅｍ）に連結されている構造である。互いに異なるタンデムに連結した２種類以上の可変領域はそれぞれ該当する他の抗原に独立して或いは同時に結合し得る能力を有し、重鎖のＣＨ１ドメインとｋａｐｐａ或いはｌａｍｂｄａ軽鎖のＣＬ領域が除去されている形態である（図１Ａ参照）。

タンデムに連結した２つの可変領域（Ｆｖ）に該当するそれぞれの抗原に対する結合親和度（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を保障するために外部可変領域（ｏｕｔｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）と内部可変領域（ｉｎｎｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）との間にショート（ｓｈｏｒｔ）リンカー（ＶＨ：ＡＳＴＫＧＰ配列番号１、ＶＬ：ＴＶＡＡＰ配列番号４）、ロング（ｌｏｎｇ）リンカー（ＶＨ：ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ配列番号２、ＶＬ：ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ配列番号５）、Ｇ４Ｓリンカー（ＶＨ：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ配列番号３、ＶＬ：ＧＧＳＧＧＧＧＳＧ配列番号６）を使用して各可変領域に構造の独立性を保障した（図２参照）。

コンセプト立証（ｐｒｏｏｆ ｏｆ ｃｏｎｃｅｐｔ）に用いられた親抗体（ｐａｒｅｎｔａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、ａｎｔｉ−ＶＥＧＦＡ、ａｎｔｉ−ＴＮＦ−α、ａｎｔｉ−ＩＬ１７Ａモノクローナル抗体をテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いてＦｖ２ｍａｂの可能性及び優秀性を証明した。

実施例２．熱力学的安定性のためのＦｖ２ｍａｂエンジニアリング
Ｆｖ２ｍａｂ二重特異的抗体の構造は、２つ以上の連続するＦｖ（ＶＨとＶＬ）を有するＨ_２Ｌ_２形態の多価テトラマー（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｔｅｔｒａｍｅｒ）である。一般の抗体は、構造的にテトラマー（Ｈ_２Ｌ_２）の形態で存在するために、重鎖のＣＨ領域と軽鎖のＣＬ領域とが鎖間ジスルフィド架橋（ｉｎｔｅｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｒｉｄｇｅ：共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ））で連結されている。しかし、ＣＨ１とＣＬが削除されているＦｖ２ｍａｂの場合、タンデムに連結されている可変領域（Ｆｖ）のＶＨとＶＬ間の結合力（疎水性結合、イオン結合、水素結合など）によって構造及び安定性が決定され、一般の抗体とは違い、重鎖と軽鎖間の内部ジスルフィド架橋（ｉｎｔｒａ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｒｉｄｇｅ）（共有結合）が存在しない。このため、低濃度で重鎖と軽鎖の構造を決定する結合力が一般の抗体に比べて低いことと予想され、結果として、抗体に比べて低調なｐＫ／ｐＤの特性が予想できる。

したがって、熱力学的安定性（ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を増加させるためにＶＨとＶＬが相互作用する適切な位置に、アミノ酸の置換及び追加の方法を用いてシステインジスルフィド架橋（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｒｉｄｇｅ）を導入し、Ｆｖ２ｍａｂの全体的な熱力学的安定性を増加させた。

また、重鎖の上段ヒンジ（ｕｐｐｅｒ ｈｉｎｇｅ：ＥＰＫＳＣ配列番号７）と鎖間ジスルフィド架橋を連結する軽鎖のＣ末端ＲＧＥＣアミノ酸（配列番号８）を含む配列から始めて４個ずつアミノ酸の長さを長くして導入する方法も適用した（図３参照）。置換及び追加の方法を用いたシステインジスルフィド架橋を導入する部分は、外部可変領域或いは内部可変領域、又はこれら可変領域のいずれをも適用可能である。置換による鎖間ジスルフィド架橋を導入する部分は表１に示し、ジスルフィド架橋を導入した構造は図１Ｂに示している。

実施例３．Ｆｖ２ｍａｂｓ構築
ＰＯＣ（ｐｒｏｏｆ ｏｆ ｃｏｎｃｅｐｔ）のための様々な組合せの二重特異的Ｆｖ２ｍａｂ作製に用いられた親抗体は、ＨＵＭＩＲＡ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ，ＡｂｂＶｉｅ）、ＫＯＳＥＮＴＹＸ（ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ａｎｔｉ−ＶＥＧＦＡ（Ｉｎ−ｈｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＡＢＴ−１２２（ＤＶＤ−Ｉｇ，ＡｂｂＶｉｅ）の重鎖と軽鎖の可変領域配列をテンプレートとして用いて作製した。二重特異的抗体Ｆｖ２ｍａｂの組換えタンパク質の生産のための動物細胞発現ベクターは、本出願人のｐＦＥ発現ベクターを使用した。抗体の重鎖と軽鎖の可変領域は、超可変領域（ＶＨ）とフレームワーク（ＦＲ）で構成されている。可変領域内の始点であるＦＲ１と終点であるＦＲ４の場合、大部分の抗体は類似のアミノ酸配列で構成されているため、２種類の可変領域をＰＣＲのような方法でタンデム連結することは容易でない。これは、ＦＲ１とＦＲ４の類似なヌクレオチド配列により、特異的結合プリマーを作製及び使用することが難しいためである。したがって、親抗体のＤＮＡテンプレートで重鎖と軽鎖の可変領域をそれぞれＰＣＲし、ＶＨ１＋ＶＨ２＋ｐＦＥベクター或いはＶＬ１＋ＶＬ２＋ｐＦＥベクターのような組合せによって３片ライゲーション方法を用いてＦｖ２ｍａｂシリーズを作製した。

タンデム連結されたＶＨ１とＶＨ２、ＶＬ１とＶＬ２は性格によってショートリンカー、ロングリンカー、Ｇ４Ｓリンカーを用いて連結することができ、熱力学的安定性の向上のためにシステインジスルフィド架橋を可変領域の適切な位置に導入することができる（図４参照）。本発明においてエンジニアリング（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｒｉｄｇｅ）したＦｖ２ｍａｂの場合、エンジニアリングを導入した可変領域の前に‘ｅ’を付して表記した。（例えば、ｅＴＮＦ−ＩＬ１７の場合はａｎｔｉ−ＴＮＦ−α Ｆｖにシステインジスルフィド架橋を、ＴＮＦ−ｅＩＬ１７の場合はａｎｔｉ−ＩＬ１７ＡのＦｖにシステインジスルフィド架橋を導入）。

また、軽鎖のＣ−末端にＩＤＤ（Ｉｎｔｅｒ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｄｏｍａｉｎ；ＲＧＥＣ）を導入したエンジニアリングの場合、ＲＧＥＣと表記した（例：ＶＥＧＦ−ＴＮＦ−ＲＧＥＣ）。３片ライゲーションクローニングに用いられた制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）は、タイプＩＩ制限酵素ｓａｐＩ（ＮＥＢ，Ｅｎｇｌａｎｄ）であり、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用してＤＮＡ断片をライゲーションした。本研究のために作製したＦｖ２ｍａｂシリーズを表２に示した。このとき、各Ｆｖ２ｍａｂシリーズの配列は、表３に示した。

実施例４．Ｆｖ２ｍａｂ発現及びタンパク質Ａを用いた精製
Ｆｖ２ｍａｂクローンシリーズ組換えタンパク質の発現確認及び生産は、ＨＥＫ一時的発現システム（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を使用し、ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を宿主細胞とした。Ｆｖ２ｍａｂのＨＥＫにおける発現は、共同形質感染（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の方法を利用し、Ｆｖ２ｍａｂ−Ｈｃ ＤＮＡとＦｖ２ｍａｂ−Ｌｃ ＤＮＡはそれぞれ１：１ｗ／ｗの比率で形質感染を行った。ＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）を形質感染製剤として、ＤＮＡ：ＰＥＩ＝１：４のｗ／ｗの比率でポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）を作って形質感染した。形質感染して５日目にバッチ培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）を中断し、発現培地（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）を採取（ｈａｒｖｅｓｔ）して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質Ａビーズ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）を用いたプルダウンアッセイ（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）で結果を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブルー染色（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を用いてｉｎｐｕｔ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）、ｕｎｂｉｎｄｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）、ｏｕｔｐｕｔ（ｂｏｕｎｄｅｄ Ｆｖ２ｍａｂ ｐｒｏｔｅｉｎ）を、分画別に発現程度及び形態を確認した（図５参照）。

プルダウンアッセイの対照群サンプルとしては親ＩｇＧ抗体を使用した。ｐＦＥ発現ベクターにクローニングされたＦｖ２ｍａｂシリーズは、上述したように、ＰＥＩを用いてＨＥＫ２９３−Ｆ細胞に形質感染し、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞の培養条件及びＨＥＫ２９３−Ｆを用いた組換えタンパク質の生産に関する方法は、メーカーで提供したプロトコルを遵守して行った。形質感染してから細胞の生存可能性が約６０％〜７０％程度と測定される６日〜７日目にバッチ培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）を終了し、発現培地を遠心分離（４，８００ｒｐｍ、３０分、４℃）して破片を除去後、上層液を０．２２μｍＴＯＰ−ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を用いてフィルタリングした。その後、Ｆｖ２ｍａｂが含まれたフィルタリングした上層液は、タンパク質Ａビーズ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）を使用した親和クロマトグラフィー精製過程を経た後、溶出緩衝液の変更のためにＳｌｉｄｅ−Ａ Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳＡ）を用いてｐＨ７．４のＰＢＳで透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）された。ＨＥＫ２９３Ｆを使用したＦｖ２ｍａｂの発現レベルは、約１００〜２００ｍｇ／Ｌと確認され、タンパク質Ａを用いたプルダウンアッセイから確認できるように、発現培地内で発現されたＦｖ２ｍａｂの大部分が回収されることが分かる。

実施例５．構造選別及びジスルフィド架橋エンジニアリング
二重特異的抗体Ｆｖ２ｍａｂの組立ては、Ｆｖ２ｍａｂ−重鎖のＶＨ領域フォルディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）によって決定され、ＶＨのフォルディングはＥＲ内でＢｉＰ依存的に起きる。Ｆｖ２ｍａｂの場合、ＢｉＰによって調節される領域は重鎖のタンデムに連結した２つのＶＨにあり、ＬＣと結合しなかったＢｉｐとＶＨ複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）はＥＲで分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）される。Ｆｖ２ｍａｂ重鎖のＶＨに結合したＢｉＰは、軽鎖のＶＬによって競争的にＶＨから放出され、重鎖のＶＨは軽鎖のＶＬと組み立てられて外部に分泌される。

抗体の場合、ＢｉＰによって調節される重鎖領域はＣＨ１とＶＨであり、これは軽鎖のＣＬとＶＬのみによってＢｉＰの放出が起きる。ＢｉＰによる調節は、他のフォルディングパートナー（ＶＨとＣＬ、或いはＣＨ１とＶＬ）による方式では発生せず、ＢｉＰによる調節の失敗は抗体の分解経路（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）で進行される（図６参照）。

一般の抗体に存在するＣＨ１とＣＬの鎖間ジスルフィド結合が持つ熱力学的安定性に代えるために、Ｆｖ２ｍａｂの場合、鎖間ジスルフィド架橋を形成し得るＲＧＥＣ領域を含む変異ＩＤＤを軽鎖Ｃ−末端に適用した方法と、可変領域（Ｆｖ）を形成するＶＨとＶＬのキー（ｋｅｙ）アミノ酸のシステイン置換（Ｈ４４Ｌ１００）の方法を適用した。エンジニアリングが適用されたＦｖ２ｍａｂクローンの組立て、形態、発現パターンなどは、ＨＥＫ２９３を用いたタンパク質発現後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図７参照）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、鎖間ジスルフィド架橋による効果的なＨ_２Ｌ_２テトラマー形成は、Ｈ４４Ｌ１００エンジニアリングされたクローンから確認され、発現率は約５０〜１００ｍｇ／Ｌレベルと予想される。

実施例６．Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥを用いたＦｖ２ｍａｂの構造確認
タンデムに連結された可変領域（Ｆｖ）のＶＨとＶＬの結合のみからなるＦｖ２ｍａｂの構造（Ｈ_２Ｌ_２，、テトラマー）の確認のために、Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。Ｆｖ２ｍａｂと抗体の軽鎖のＣ−末端に鎖間ジスルフィド架橋を連結するシステインを欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）させ、鎖間ジスルフィド架橋無しにＶＨとＶＬの結合のみからなるＨＵＭＩＲＡ ＬＣΔＣ（−ＲＧＥ）を対照群として用いてＦｖ２ｍａｂの構造を確認した。

Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥの結果、ｐＨ７．４のＰＢＳ条件でＦｖ２ｍａｂとＨＵＭＩＲＡ ＬＣΔＣ（−ＲＧＥ）は、２４０ｋＤａ〜４２０ｋＤａ分子量の範囲でＨ_２Ｌ_２形態のテトラマーを形成していることが確認できた（図８参照）。

また、Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥゲル上で２４０ｋＤａ〜４２０ｋＤａの範囲に存在するＦｖ２ｍａｂテトラマーバンドをＰＡＧＥゲルから分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで二次分析をした結果、イオン性界面活性剤（ｉｏｎｉｃ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）（ＳＤＳ）によって分離されたＦｖ２ｍａｂの重鎖、軽鎖のいずれをも確認することができた（図９参照）。

実施例７．タンパク質Ａクロマトグラフィー後のＦｖ２ｍａｂ純度
様々な構造と組合せの二重特異的抗体Ｆｖ２ｍａｂ発現精製によるタンパク質の純度をＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とＳＥＣ−ＨＰＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を用いて分析した。熱力学的安定性の増加のためにシステインジスルフィド架橋を導入したエンジニアリングされたＦｖ２ｍａｂｓとＦｖ２ｍａｂｓ（エンジニアリングされていない）、及び対照群としたＨＵＭＩＲＡ、ＨＵＭＩＲＡ ＬＣΔＣ、ＳＥＣＵＫＩＮＵＭＡＢを当該メーカーのプロトコルを遵守して純度分析を行った。システインジスルフィド架橋エンジニアリングされたＦｖ２ｍａｂクローンの場合、Ｈ４４Ｌ１００クローンがＲＧＥＣクローンに比べてかなり高い比率で鎖間ジスルフィド架橋が形成されることを観察し（図１０参照）、２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒとＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果、ＨＥＫ２９３臨時発現システムを用いたＦｖ２ｍａｂ組換えタンパク質は、約９０％以上の純度を確認した（図１１参照）。

実施例８．ヒト血清内Ｆｖ２ｍａｂｓの安定性（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
熱力学的安定性の向上のためにシステインジスルフィド架橋を導入したエンジニアリングされたＦｖ２ｍａｂの安定性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト血清を用いて測定した。Ｈ４４Ｌ１００システイン置換が適用されたエンジニアリングされたＦｖ２ｍａｂ（ｅＴＮＩＬ１７）、ジスルフィド架橋がないＦｖ２ｍａｂ（ＴＮＩＬ１７）、及び対照群抗体ＨＵＭＩＲＡをそれぞれ、０％、５％、１０％、２５％のヒト血清が含まれた培地溶液に１０ｎＭの濃度で３７℃で５日間反応後、ＴＮＦ−αに対する結合親和度をＥＬＩＳＡ方法で測定し、Ｆｖ２ｍａｂの安定性を確認した。安定性の増加のためにＨ４４Ｌ１００システイン置換を適用したエンジニアリングされたＦｖ２ｍａｂ（ｅＴＮＩＬ１７）の場合、対照群抗体であるＨＵＭＩＲＡと同等の血清安定性を示したが、エンジニアリングが適用されていないタンデムＦｖからなるＦｖ２ｍａｂの場合、低濃度において相対的に低い安定性を確認した（図１２参照）。

実施例９．各抗原に対するＦｖ２ｍａｂの結合親和度の比較
ＨＥＫ２９３臨時発現システムを用いて様々な組合せのＦｖ２ｍａｂｓ発現精製後、ＩｇＧ形態の親抗体と該当の抗原に対する結合親和度を相対的に比較した。結合親和度の測定は、ＥＬＩＳＡ方法とＯＣＴＥＴシステム（ＦｏｒｔｅＢＩＯ，ＵＳＡ）を利用した。

実施例９−１．ＥＬＩＳＡ
Ａｎｔｉ−ＴＮＦ−αとａｎｔｉ−ＶＥＧＦＡ、ａｎｔｉ−ＴＮＦ−αとａｎｔｉ−ＩＬ１７ＡのタンデムＦｖ形態の組合せからなるＦｖ２ｍａｂｓの親和度は、ＥＬＩＳＡ方法を用いて測定した。ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦＡ、ＩＬ−１７Ａのような抗原は、１００ｎｇ／ウェル（９６ウェル）の濃度でｐＨ７．４のＰＢＳをコーティングバッファーとして４℃で一晩反応させ、免疫プレートに固定させた。ウェル当たり、ＰＢＳＴ ２００μｌで１回洗浄後、５％脱脂乳を用いてＲＴで１〜２時間反応させて表面ブロッキング（ｓｕｒｆａｃｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行った。ウェル当たりＰＢＳＴ２００μｌで２回洗浄後、測定しようとする適当な二重特異的Ｆｖ２ｍａｂと対照群親抗体を、適度の濃度から始めて１／２〜１／５間隔で階段希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）してＲＴで１〜２時間反応させた。ＰＢＳＴ２００μｌで３回洗浄し、結合しなかった抗体を除去し、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）されているａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ−Ｆｃ−ＨＲＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を１：３０００の比率で希釈してＲＴで１時間反応後、ＰＢＳＴ２００μｌで３回洗浄し、結合しなかった検出用抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を除去した。ＨＲＰの発色は、ＴＭＢ溶液（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）を１００μｌ／ウェルの量（ｖｏｌｕｍｅ）を用いて誘導し、停止液（ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（２．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４、１００μｌ／ウェル）を用いて反応を終了した。分光光度計を用いて４５０ｎｍの波長で吸光度を測定し、結合親和度を計算した。Ａｎｔｉ−ＶＥＧＦＡ抗体、Ｆｖ２ｍａｂ＿ＶＥ−ＴＮ、Ｆｖ２ｍａｂ＿ＶＥ−ｅＴＮ（Ｈ４４Ｌ１００ジスルフィド架橋エンジニアされたクローン）のＶＥＧＦＡとＴＮＦ−αに対する結合親和度の比較結果はそれぞれ、図１３及び図１４に表記した。

また、ＨＵＭＩＲＡ、ＡＢＴ−１２２（ＤＶＤ−Ｉｇ ｆｏｒ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ＴＮＦ−α ａｎｄ ＩＬ−１７Ａ，ＡｂｂＶｉｅ，ＵＳＡ）、Ｆｖ２ｍａｂ＿ＴＮＦ−ＩＬ１７、Ｆｖ２ｍａｂ＿ｅＴＮＦ−ＩＬ１７のＴＮＦ−αに対する結合親和度の比較結果は図１５に、ＳＥＣＵＫＩＮＵＭＡＢ、ＡＢＴ−１２２（ＡｂｂＶｉｅ，ＵＳＡ）、Ｆｖ２ｍａｂ＿ＴＮＦ−ＩＬ１７、Ｆｖ２ｍａｂ＿ｅＴＮＦ−ＩＬ１７のＩＬ−１７Ａに対する結合親和度の比較結果及びＩＣ５０値は図１６及び図１７に、それぞれ示した。

実施例９−２．ＯＣＴＥＴ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）
ＨＵＭＩＲＡとＳＥＣＵＫＩＮＵＭＡＢの可変領域で構成されているＦｖ２ｍａｂ＿ＴＮＦ−ＩＬ１７−ＳＬとＦｖ２ｍａｂ＿ｅＴＮＦ−ＩＬ１７−ＳＬのＴＮＦ−αとＩＬ−１７に対する結合程度及び特徴を、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いて測定した。ＯＣＴＥＴ ＱＫ^ｅ ｓｙｓｔｅｍを用いたラベルフリーキネティックス（Ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）（タンパク質間相互作用）の測定は、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）バイオセンサーを選択して使用し、ヒトＦｃを含んでいるＦｖ２ｍａｂ＿ＴＮＦ−ＩＬ１７−ＳＬ及びＦｖ２ｍａｂ＿ｅＴＮＦ−ＩＬ１７−ＳＬをバイオセンサー表面に固定させた後、キネティックバッファーに濃度別に希釈されたＴＮＦ−αとＩＬ−１７に対して順次に反応させ、時間によるセンサーグラム値を収集した。平行状態における濃度によるセンサーグラム値をプロットしたキネティック値を表４に示した。Ｆｖ２ｍａｂ＿ＴＮＦ−ＩＬ１７−ＳＬとＦｖ２ｍａｂ＿ｅＴＮＦ−ＩＬ１７−ＳＬのキネティック値を求めるために選択した抗原の濃度は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７両方とも１，０００ｎＭと３３３ｎＭを選択し、反応させた抗原の順序による結合力の差異と両抗原に同時に結合し得る程度もＯＣＴＥＴシステムで確認した（図１８参照）。

実施例１０．Ｆｖ２ｍａｂｓ遮断効能（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞基盤アッセイ）
実施例１０−１．ＴＮＦ−α遮断アッセイ
二重特異的抗体Ｆｖ２ｍａｂのＴＮＦ−αに対する遮断効能を確認するために、ＨＥＫ ｂｌｕｅ ＴＮＦ−α細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いたＳＥＡＰアッセイシステムを使用した。Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから提供されるＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＴＮＦ−α細胞の場合、ＴＮＦ−αによるシグナリングを効果的にモニタリングできるシステムであり、シグナリングによって調節されるＮＦ−ｋＢプロモーターの下位にＳＥＡＰ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）レポーター遺伝子が位置している形態で構成されている。ＴＮＦ−αによって伝達されたシグナリングは最終的にＳＥＡＰの発現を増加させて培養培地に蓄積され、これは容易に量的測定が可能である。培養培地に蓄積されたＳＥＡＰの量は、Ｑｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた酵素反応による発色過程によって測定可能であり、分光光度計で吸光度を測定することによって遮断効能程度を確認することができる。ＴＮＦ−α遮断アッセイの結果、Ｆｖ２ｍａｂ＿ＴＮＦ−ＩＬ１７−ＳＬとＦｖ２ｍａｂ＿ｅＴＮＦ−ＩＬ１７−ＳＬの両方とも、ＨＵＭＩＲＡと対比して類似の効能を確認した（図１９参照）。

実施例１０−２．ＩＬ−１７Ａ遮断アッセイ
二重特異的抗体Ｆｖ２ｍａｂの水溶性ＩＬ−１７Ａに対する遮断効能を確認するためにＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ１７細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用したＳＥＡＰアッセイシステムを用いた。１０−１で技術したＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＴＮＦ−α細胞システムと同様に、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ−１７ｃｅｌｌシステムも、ＳＥＡＰがレポーター遺伝子として使用された。Ｆｖ２ｍａｂ＿ＴＮＦ−ＩＬ１７−ＳＬとＦｖ２ｍａｂ＿ｅＴＮＦ−ＩＬ１７−ＳＬ及びＳＥＣＵＫＩＮＵＭＡＢのＩＬ−１７遮断効能は、Ｑｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた酵素反応によって数値化した（図２０参照）。

実施例１１．モノＦｖ抗体及び２個連結されたＦｖ抗体の結合親和度の比較
１個の可変領域からなるＦｖ１ｍａｂ（ＶＨ１−Ｆｃ，ＶＬ１）と２個の連続する可変領域からなるＦｖ２ｍａｂ（ＶＨ１−Ｌ−ＶＨ２−Ｆｃ，ＶＬ１−Ｌ−ＶＬ２）の結合親和度を、親抗体と対比して比較した。Ｆｖ１ｍａｂの場合、ＨＥＫ２９３を用いた臨時発現においてもＦｖ２ｍａｂに類似する程度の発現率を確認し、結合親和度の比較のためにこの実験に用いられたＦｖ１ｍａｂは、システインジスルフィド結合エンジニアリング（Ｈ４４Ｌ１００）を適用した。Ｆｖ１ｍａｂの作製は、ＨＵＭＩＲＡ、ＳＥＣＵＫＩＮＵＭＡＢを親テンプレートとして、各抗体のＶＨとＶＬ領域をＰＣＲして使用した。ＨＵＭＩＲＡ、Ｆｖ１ｍａｂ＿ＴＮＦ、Ｆｖ２ｍａｂ＿ｅＴＮＦ−ＩＬ−ＳＬは、ＴＮＦ−αに対する結合親和度をＥＬＩＳＡ方法で比較し、ＳＥＣＵＫＩＮＵＭＡＢ、Ｆｖ１ｍａｂ＿ＩＬ１７、Ｆｖ２ｍａｂ＿ＴＮＦ−ＩＬ−ＳＬは、ＩＬ−１７に対する結合親和度をＥＬＩＳＡ方法を用いて比較した（図２１参照）。

実施例１２．リンカーによる結合親和度
連続する可変領域を連結するリンカーが抗原結合に及ぼす影響を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。ショートリンカー（ＶＨ：ＡＳＴＫＧＰ配列番号１、ＶＬ：ＴＶＡＡＰ配列番号４）、ロングリンカー（ＶＨ：ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ配列番号２、ＶＬ：ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ配列番号５）、Ｇ４Ｓリンカー（ＶＨ：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ配列番号３、ＶＬ：ＧＧＳＧＧＧＧＳＧ配列番号６）を、外部Ｆｖと内部Ｆｖとの間に導入し、リンカーによる結合親和度の変化を観察しようとした。また、外部ＦｖにはＨＵＭＩＲＡの可変領域、そして内部ＦｖにはＳＥＣＵＫＩＮＵＭＡＢの可変領域を使用して前記リンカーを含むＦｖ２ｍａｂを作製した。異なる種類のリンカーで連結された３種のＦｖ２ｍａｂのいずれにも、Ｈ４４Ｌ１００のシステインジスルフィド結合エンジニアリングが適用された。ＴＮＦ−αとＩＬ−１７に対する結合親和度は、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。リンカーによるＦｖ２ｍａｂの結合親和度の変化は、図２２から確認できる。

実施例１３．リンカーによるＦｖ２ｍａｂのＩｎ ｖｉｔｒｏ効能（細胞基盤アッセイ）
Ｆｖ２ｍａｂの連続する可変領域を連結するリンカーによるｉｎ ｖｉｔｒｏ効能をＨＥＫ ｂｌｕｅ ＴＮＦ−α細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＵＳＡ）とＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ１７細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて確認した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ効能の測定に用いられたｓｈｏｒｔ、ｌｏｎｇ、Ｇ４Ｓリンカーが導入されたＦｖ２ｍａｂは、１０ｎＭと２００ｎＭの濃度から階段希釈され始め、それぞれＴＮＦ−αとＩＬ−１７と共に反応された。抗原に対する遮断程度は、培地に蓄積されたＳＥＡＰの発現程度によって確認した。培地に蓄積されたＳＥＡＰの量的確認のためにＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用し、反応による発色の程度を測定することによって遮断効能を確認した（図２３参照）。

実施例１４．ＤＶＤ−Ｉｇ及びＦｖ２ｍａｂ間の結合親和度の比較
二重特異的抗体フォーマットによる結合親和度の比較分析のためにＡｂｂＶｉｅ社のＡＢＴ−１２２＿ＤＶＤ−Ｉｇ（ａｎｔｉ−ＴＮＦ−α／ＩＬ−１７二重特異的抗体）とａｎｔｉ−ＴＮＦ−α／ＩＬ−１７に対する同じ可変領域のアミノ酸配列を有するＡＢＴ−１２２＿Ｆｖ２ｍａｂを作製した。ＡＢＴ−１２２＿ＤＶＤ−ＩｇとＡＢＴ−１２２＿Ｆｖ２ｍａｂは同じ可変領域のアミノ酸配列と連結リンカーを有しているが、ＣＨ１とＣＬを含んでいるＤＶＤ−Ｉｇの場合、約２００ｋＤａの分子量を有するのに対し、ＣＨ１とＣＬがないＦｖ２ｍａｂの場合は約１５０ｋＤａの分子量有する。可変領域間の連結にはＧ４Ｓリンカーを使用し、ＡＢＴ−１２２＿Ｆｖ２ｍａｂの場合、システインジスルフィド結合エンジニアリングが導入された。二重抗体フォーマットの比較は、ＴＮＦ−αとＩＬ−１７抗原に対する結合親和度をＥＬＩＳＡ方法で測定し、同じＧ４Ｓリンカーを使用し、ＳＥＣＵＫＩＮＵＭＡＢの可変領域を使用したｅＴＮＦＩＬ−Ｇ４Ｓも対照群として、共に比較分析した。二重特異的抗体フォーマットは異なるが、ＡＢＴ−１２２＿ＤＶＤ−Ｉｇと同じ可変領域の配列を有するＡＢＴ−１２２＿Ｆｖ２ｍａｂの場合、ＴＮＦ−αとＩＬ−１７に対する親和度は、両二重抗体とも同一に測定された。また、ＤＶＤ−Ｉｇに比べて３／４レベルの分子量を有するＦｖ２ｍａｂの場合、抗体医薬品の開発において他社の二重抗体フォーマットと比較して、際立つ長所となり得る（図２４参照）。

実施例１５．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ効能（二重特異的抗体フォーマットの比較）
実施例１５−１．ＨＥＫ ｂｌｕｅ ｃｅｌｌを用いたＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａ遮断アッセイ
二重特異的抗体フォーマットによるｉｎ ｖｉｔｒｏ効能をＨＥＫ ｂｌｕｅ ＴＮＦ−α細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＵＳＡ）とＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ１７細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて確認した。ＡＢＴ−１２２＿ＤＶＤ−ＩｇとＡＢＴ−１２２＿Ｆｖ２ｍａｂは、１０ｎＭの濃度から使用し始め、ＴＮＦ−αとＩＬ−１７に対する信号伝達遮断の程度をＨＵＭＩＲＡ及びＳＥＣＵＫＩＮＭＡＢと対比して確認した（図２５参照）。同じ可変領域のアミノ酸配列を使用したＡＢＴ−１２２＿Ｆｖ２ｍａｂの場合、ＡＢＴ−１２２＿ＤＶＤ−Ｉｇと同じモル濃度に対して同じ程度のＴＮＦ−αとＩＬ−１７に対する遮断効能を示した。また、ＡＢＴ−１２２＿Ｆｖ２ｍａｂの場合、ＩＬ−１７に対する遮断効能は、モノクローナル抗体であるＳＥＣＵＫＵＮＵＭＡＢに比べて良い結果を確認した。これは、一般抗体と同じ分子量で２種類以上の抗原に特異的に結合し、モノクローナル抗体よりもとびきり高い効果を有する二重特異的抗体を選択的に作製し易く、またＤＶＤ−Ｉｇに比べて約２５％少ない分子量を有することにより、効果的な組織浸潤及び速くて高い血中濃度維持が可能であり、臨床実験及び治療剤として投与時に、ＤＶＤ−Ｉｇ重量に比べてより多いモル（ｍｏｌｅ）の効果を期待することができる。

実施例１５−２．ＨＴ−２９細胞を用いたＴＮＦ−αとＩＬ−１７Ａの遮断アッセイ
二重特異的抗体のＴＮＦ−αとＩＬ−１７Ａに対する同時遮断効能を確認及び比較するために、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ(R)ＨＴＢ−３８^TM）細胞を用いた遮断アッセイを実施した。ＨＴ−２９細胞を用いたサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）遮断アッセイは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−２２によって伝達される信号伝達によってＨＴ−２９細胞で分泌されるＣＸＣＬ１ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）のレベルを測定することによって可能である。ＨＴ−２９細胞でサイトカインに誘導された細胞信号伝達を阻害する二重抗体の効果を測定するために使用したＴＮＦ−α、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−２２の濃度は、１．１７ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ及び０．１ｎｇ／ｍｌである。ＨＴ−２９細胞の培養に用いられた培地は、１０％のＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）培地であり、サイトカイン遮断アッセイに用いられた培地は、２％のＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ １６４０培地だった。ＴＨ−２９から分泌されたＣＸＣＬ１量の測定は、Ｒ＆Ｄ社のｄｕｏｓｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ Ｈｕｍａｎ ＣＸＣＬ１／ＧＲＯａキットを使用し、ＥＬＩＳＡを用いたＣＸＣＬ１の測定方法は、メーカーで提供するプロトコルを遵守して実験した。ＨＴ−２９を用いたサイトカイン遮断アッセイに用いられた二重標的抗体（ＡＢＴ１２２＿ＤＶＤ−Ｉｇ、ＡＢＴ１２２＿Ｆｖ２ｍａｂ）と単一標的抗体（ＨＵＭＩＲＡ、ＳＥＣＵＫＩＮＵＭＡＢ）はいずれも同一に、７３６ｐＭから０．７ｐＭまで１／４間隔で希釈して使用した。ＨＴ−２９細胞から１．１７ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−α単独或いは２．５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１７Ａ単独で誘導されるＣＸＣＬ１のレベルは、同一条件でＥＬＩＳＡを用いて測定時に、それぞれ１．５と２．５Ｏ．Ｄレベルであり、ＴＮＦ−αとＩＬ−１７Ａ両方によって誘導されるＣＸＣＬ１のレベルは３．４Ｏ．Ｄ程度である。ＨＴ−２９細胞でＴＮＦ−αとＩＬ−１７Ａによって同時に誘導された細胞信号伝達の阻害程度は、二重標的抗体の場合、単一標的抗体に比べてとびきり良い効果を確認することができ、二重標的抗体の場合と同じモル（ｍｏｌｅ）濃度において、ＡＢＴ１２２＿ＤＶＤ−ＩｇとＡＢＴ１２２−Ｆｖ２ｍａｂは同じサイトカイン遮断効果を示した（図２６参照）。このような結果は、同じ可変領域の抗体配列を有する二重特異的抗体フォーマットの場合、Ｆｖ２ｍａｂがＤＶＤ−Ｉｇに比べて様々な優れた長所を有し得ることが予想できる。

本発明に係る新規フォーマットの多重特異的多価の結合タンパク質により、従来の多重特異的多価結合タンパク質が持つ短所を補完し、２種類以上のターゲットに同時に結合して目的のターゲットの活性を抑制させることによって、単一標的抗体治療に比べて疾病治療及び診断に優れた効果を期待できる新規フォーマットの多重特異的多価の結合タンパク質を提供することができる。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述してきたが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は好適な実施態様に過ぎないもので、これらによって本発明の範囲が制限されるわけではない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。

Claims (11)

1. ＶＨ１−［（Ｌ１）ａ−ＶＨ２］ｍ−Ｘｂの第１ポリペプチド及びＶＬ１−［（Ｌ２）ｃ−ＶＬ２］ｎの第２ポリペプチドを含む結合タンパク質であって、
   前記第１ポリペプチドのＶＨ１又はＶＨ２はそれぞれ、異なる抗原結合領域を含む重鎖可変領域であり、
   前記第２ポリペプチドのＶＬ１又はＶＬ２はそれぞれ、異なる抗原結合領域を含む軽鎖可変領域であり、前記第２ポリペプチドはＣＬを含まず、
   前記第１ポリペプチドのＬ１はＶＨ１とＶＨ２との間に存在し、連続するＶＨ１及びＶＨ２を連結するためのリンカーであり、
   前記第２ポリペプチドのＬ２はＶＬ１とＶＬ２との間に存在し、連続するＶＬ１及びＶＬ２を連結するためのリンカーであり、
   前記第１ポリペプチドのＸは、ＣＨ１を除くＣＨ２及びＣＨ３領域のみからなるＦｃであり、
   ＶＨ１−ＶＬ１及びＶＨ２−ＶＬ２から構成された群から選ばれる一つ以上が鎖間ジスルフィド架橋で連結されており、
   ａ及びｃはそれぞれ０又は１であり、
   ｂは１であり、
   ｍ及びｎはそれぞれ１である。
2. 前記ａは１であり、このとき、Ｌ１は、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号１）、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）から構成された群から選ばれるいずれか一つのリンカーであることを特徴とする、請求項１に記載の結合タンパク質。
3. 前記ｃは１であり、このとき、Ｌ２は、ＴＶＡＡＰ（配列番号４）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号５）及びＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号６）から構成された群から選ばれるいずれか一つのリンカーであることを特徴とする、請求項１に記載の結合タンパク質。
4. 前記重鎖は、軽鎖と鎖間ジスルフィド架橋を生成するためにＶＨ２とＸｂとの間に鎖間ジスルフィドドメイン（Ｉｎｔｅｒ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｄｏｍａｉｎ：ＩＤＤ）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の結合タンパク質。
5. 前記鎖間ジスルフィドドメインは、ＥＰＫＳＣ（配列番号７）を含むことを特徴とする、請求項４に記載の結合タンパク質。
6. 前記軽鎖は、重鎖と鎖間ジスルフィド架橋を生成するためにＣ−末端に鎖間ジスルフィドドメイン（Ｉｎｔｅｒ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｄｏｍａｉｎ：ＩＤＤ）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の結合タンパク質。
7. 前記鎖間ジスルフィドドメインは、ＲＧＥＣ（配列番号８）を含むことを特徴とする、請求項６に記載の結合タンパク質。
8. 前記ＶＨ１及びＶＨ２におけるカバット位置Ｈ４４の少なくとも一つのアミノ酸がシステインに置換されたことを特徴とする、請求項１に記載の結合タンパク質。
9. 前記ＶＬ１及びＶＬ２におけるカバット位置Ｌ１００の少なくとも一つのアミノ酸がシステインに置換されたことを特徴とする、請求項１に記載の結合タンパク質。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の結合タンパク質が複数個含まれている抗体。
11. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の結合タンパク質を含む接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。
    

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