JP2022535324A - Ｃｄ４７の腫瘍選択的結合のための抗体の操作 - Google Patents

Abstract

抗体が提供され、ＣＤ４７に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分と、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のＣＤ２０に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分とを含み、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分は、ＣＤ４７に対して低い親和性を示し、ＣＤ２０に結合するＦａｂ部分は、ＣＤ２０に対して高い親和性を示し、抗体は、ＣＤ４７に選択的に結合し、腫瘍細胞のＳＩＲＰαとのＣＤ４７の相互作用を遮断する一方で、正常細胞のＣＤ４７とは実質的な結合を示さない。

Description

血液腫瘍状態、血液悪性腫瘍、リンパ増殖性障害、Ｂ細胞障害、Ｂ細胞悪性腫瘍、およびＢ細胞リンパ腫を含む、異常増殖を起こす細胞によってもたらされる病理学的状態の治療のための、腫瘍選択抗体、医薬組成物、および使用方法が本明細書に提供される。

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月５日に出願された米国仮出願第６２／８３０，３３５号に対する３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を有し、その全体が参照により本明細書に援用される。

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。２０２０年３月２６日に作成されたＡＳＣＩＩ複製物は、２９８０６８－３１４＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前であり、４０７キロバイトのサイズである。

過去１０年間にわたって、抑制性免疫チェックポイントに対する遮断剤の使用は、抗がん治療における最も重要な進歩の１つである（Ｓｈａｒｐｅ ＡＨ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１７ Ｍａｒ；２７６（１）：５－８）。ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１の遮断で得られた素晴らしい結果は、抗がん治療において標的化され得るいくつかの自然免疫チェックポイント、特にマクロファージ機能を調節する経路の評価につながった。マクロファージは、ＳＩＲＰαを発現し、これは、貪食を阻害するように機能する「私を食べないで（ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ）」シグナルを媒介する普遍的に発現されるタンパク質であるＣＤ４７と相互作用する。ＣＤ４７の発現は、マクロファージによる抗体結合腫瘍細胞の貪食に対する耐性を付与する。ＳＩＲＰαへのＣＤ４７結合の不在下では、マクロファージ上のＦｃ受容体に結合することができる抗体は、これらの細胞の貪食を増強することができる。がん細胞は、その細胞表面上のＣＤ４７の発現を上方制御することによって、この相互作用をハイジャックするように進化しており、したがって、貪食促進シグナルと均衡し、自然免疫監視を回避する機会を増加させる（Ｍａｔｌｕｎｇ ＨＬ，Ｓｚｉｌａｇｙｉ Ｋ，Ｂａｒｃｌａｙ ＮＡ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ＴＫ．Ｔｈｅ ＣＤ４７－ＳＩＲＰα ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｘｉｓ ａｓ ａｎ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１７ Ｍａｒ；２７６（１）：１４５－１６４）。したがって、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用の遮断は、身体からの腫瘍細胞の貪食クリアランスを活性化するための有望な治療戦略を表す。ヒト化および完全ヒト抗ＣＤ４７抗体、抗ＳＩＲＰα抗体、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に融合された可溶性ＳＩＲＰα二量体、Ｆｃ部分を欠く高親和性単量体ＳＩＲＰα、ならびに抗ＣＤ４７抗体（ナノボディ）のラクダ由来単量体断片を含むいくつかのＳＩＲＰα－ＣＤ４７遮断剤は、様々な種類のヒト腫瘍に対するインビトロ研究および前臨床研究において有効性を示している（Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅ Ａ，Ｃｈｅｎ Ａ．，ＳＩＲＰα－ＣＤ４７ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１８，３９（３）：１７３－１８４）。ＣＣ－９０００２（抗ＣＤ４７）、Ｆｏｒｔｙ Ｓｅｖｅｎの抗ＣＤ４７（Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４）、およびＴｒｉｌｌｉｕｍのＳＩＲＰα融合Ｆｃを含むいくつかのＳＩＲＰα－ＣＤ４７遮断剤は、第Ｉ相および第ＩＩ相臨床試験でそれぞれ試験されている（Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅ Ａ，Ｔａｎｇ Ｚ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＩＲＰ）α－ＣＤ４７ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｊｏｉｎｓ ｔｈｅ Ｒａｎｋｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１９ Ｆｅｂ ２７：ＪＣＯ１９００１２）。臨床におけるこれらのアプローチは、併用療法（例えば、リツキシマブ）、高親和性結合剤によるＣＤ４７を標的とする組織シンク（すなわち、治療用抗体が結合する非腫瘍細胞が存在することによって、腫瘍細胞に対する抗体の生物学的利用能が低下する）の必要性、およびいくつかの臨床分子（貧血、好中球減少症、および／または血小板減少症）による観察された血液学的毒性によって制限される。重要なことに、タンパク質治療薬は、いくつかの疾患を治療するのに実際に探索されているが、バイオ医薬品実体（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）は、低下した有効性および／または毒性がもたらされる対象に投与された場合、抗実体（ａｎｔｉ－ｅｎｔｉｔｙ）抗体の産生を伴う免疫応答を促すことができる。

本発明は、低親和性でＣＤ４７に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分と、高親和性でＣＤ２０に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分とを含む抗体を対象とし、二重特異性抗体は、腫瘍細胞のＣＤ４７に選択的に結合し、正常細胞のＣＤ４７に実質的に結合しない。

低親和性でＣＤ４７に結合する本明細書に記載のＦａｂ部分は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＫｄ（解離定数）として測定した場合、概して、約０．１μＭ～約２５μＭの間のＣＤ４７に対する親和性を示す。低親和性でＣＤ４７に結合する本明細書に記載のＦａｂ部分は、約０．２５μＭ～約２０μＭのＣＤ４７に対する親和性を示す。特定の好ましい実施形態は、約０．４μＭ～約４．０μＭのＣＤ４７に対する親和性を示す。特定の実施形態は、約１μＭ～約３．０μＭのＣＤ４７に対する親和性を示す。一部の実施形態では、例えば、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分は、約０．１μＭ～約５．０μＭであるＣＤ４７に対する親和性を示す。一部の実施形態では、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分は、約０．１μＭ～約０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１．０μＭ、１．１μＭ、１．２μＭ、１．３μＭ、１．４μＭ、１．５μＭ、１．６μＭ、１．７μＭ、１．８μＭ、１．９μＭ、２．０μＭ、２．１μＭ、２．２μＭ、２．３μＭ、２．４μＭ、２．５μＭ、２．６μＭ、２．７μＭ、２．８μＭ、２．９μＭ、３．０μＭ、３．１μＭ、３．２μＭ、３．３μＭ、３．４μＭ、３．５μＭ、３．６μＭ、３．７μＭ、３．８μＭ、３．９μＭ、４．０μＭ、４．１μＭ、４．２μＭ、４．３μＭ、４．４μＭ、４．５μＭ、４．６μＭ、４．７μＭ、４．８μＭ、４．９μＭ、または約５．０μＭであるＣＤ４７に対する親和性を示す。

一部の実施形態では、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分は、約０．２μＭ～約４．０μＭであるＣＤ４７に対する親和性を示す。さらなる実施形態では、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分は、約０．５μＭ～約３．５μＭであるＣＤ４７に対する親和性を示す。さらなる実施形態では、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分は、約１．０μＭ～約３．０μＭであるＣＤ４７に対する親和性を示す。

本発明はさらに、ＣＤ４７に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分と、ＣＤ２０に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分とを含む抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分は、ＣＤ４７に対して低い親和性を示し、ＣＤ２０に結合するＦａｂ部分は、ＣＤ２０に対して高い親和性を示し、二重特異性抗体は、腫瘍細胞のＣＤ４７に選択的に結合し、正常細胞のＣＤ４７に実質的に結合せず、抗体は、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞の抗体依存性細胞貪食を活性化する。

本発明はさらに、ＣＤ４７に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分と、ＣＤ２０に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分とを含む抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分は、ＣＤ４７に対して低い親和性を示し、ＣＤ２０に結合するＦａｂ部分は、ＣＤ２０に対して高い親和性を示し、二重特異性抗体は、腫瘍細胞のＣＤ４７に選択的に結合し、正常細胞のＣＤ４７に実質的に結合せず、抗体は、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する。

本発明はさらに、ＣＤ４７に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分と、ＣＤ２０に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分とを含む抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分は、ＣＤ４７に対して低い親和性を示し、ＣＤ２０に結合するＦａｂ部分は、ＣＤ２０に対して高い親和性を示し、二重特異性抗体は、腫瘍細胞のＣＤ４７に選択的に結合し、正常細胞のＣＤ４７に実質的に結合せず、抗体は、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。

本発明は、本明細書に記載のＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体の単量体要素をさらに対象とし、特定の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）の定常領域を含み、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生を駆動する。一実施形態では、産生中のＬＣ不対形成を低減する抗ＣＤ４７ ＬＣ定常領域は、配列番号３４０を含む。別の実施形態では、産生中のＦｃのヘテロ二量体形成を確実にする抗ＣＤ４７ ＨＣ定常領域は、配列番号３４２を含む。別の実施形態では、産生中のＬＣ不対形成を低減する抗ＣＤ２０ ＬＣ定常領域は、配列番号３４４を含む。別の実施形態では、産生中のＦｃのヘテロ二量体形成を確実にする抗ＣＤ２０ ＨＣ定常領域は、配列番号３４６を含む。

本発明はさらに、抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、抗ＣＤ４７種ＣＣ－９０００２のＶＬ（配列番号３２５）およびＶＨ（配列番号３２６）領域に由来し、ＣＤ４７に対する結合親和性が、実質的に減弱し、免疫原性が、実質的に低減される。

本発明はさらに、二重特異性抗体を対象とし、抗ＣＤ４７ ＶＬは、配列番号３２５に由来し、配列番号３２５に対して１～７個のアミノ酸置換を示し、抗ＣＤ４７ ＶＨは、配列番号３２６に由来し、配列番号３２６に対して１～１１個のアミノ酸置換を示し、ＣＤ４７に対する結合親和性は、実質的に減弱し、免疫原性は実質的に低減される。

本発明はさらに、二重特異性抗体を対象とし、抗ＣＤ４７ ＶＬは、配列番号３２５に由来し、配列番号３２５に対して１～７個のアミノ酸置換を示し、抗ＣＤ４７ ＶＬ（配列番号３２５）における少なくとも１つ（１）のアミノ酸置換は、Ａ１０Ｓ、Ｍ１１Ｌ、Ｋ２４Ｒ、Ａ５１Ｅ、Ｎ５２Ｓ、Ｌ５４Ｆ、およびＳ５６Ｄからなる群から選択され（抗ＣＤ４７ ＶＬにおける置換は、ＶＬの最初のアミノ酸に対して番号付けられる）、抗ＣＤ４７ ＶＨは、配列番号３２６に由来し、配列番号３２６に対して１～１１個のアミノ酸置換を示し、抗ＣＤ４７ ＶＨ（配列番号３２６）における少なくとも１つ（１）のアミノ酸置換は、Ｔ１４Ｐ、Ｑ４３Ｋ、Ａ４４Ｇ、Ｅ５９Ｙ、Ｄ６６Ｇ、Ｍ７６Ｔ、Ｓ８４Ｒ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｓ１０２Ｅ、およびＴ１１５Ｌ（抗ＣＤ４７ ＶＨにおける置換は、ＶＨの最初のアミノ酸に対して番号付けられる）からなる群から選択される。

本発明はさらに、二重特異性抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分は、（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２８５、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９１、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号２９７、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０３、配列番号３０５、配列番号３０７、配列番号３０９、配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１５、配列番号３１７、配列番号３１９、および配列番号３２１からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）領域と、
（ｉｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、および配列番号３２２からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）領域と、を含む。

本発明はさらに、二重特異性抗体を対象とし、ＣＤ２０に結合するＦａｂ部分が、抗ＣＤ２０のＶＬ ＣＤＲであるＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ（ＣＤＲＬ１：配列番号３５３）、ＡＴＳＮＬＡＳ（ＣＤＲＬ２：配列番号３５４）、ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ（ＣＤＲＬ３：配列番号３５５）、およびＶＨ ＣＤＲであるＳＹＮＭＨ（ＣＤＲＨ１：配列番号３５６）、ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（ＣＤＲＨ２：配列番号３５７）、ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶ（ＣＤＲＨ３：配列番号３５８）を含む。

本発明はさらに、二重特異性抗体を対象とし、ＣＤ２０に結合するＦａｂ部分は、抗ＣＤ２０ ＬＣ（配列番号３３１）および抗ＣＤ２０ ＨＣ（配列番号３３２）を含む。

本発明はさらに、二重特異性抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＶＬ ＣＤＲであるＱＡＳＱＤＩＨＲＹＬＳ（ＣＤＲＬ１：配列番号３５９）、ＲＥＳＲＦＶＤ（ＣＤＲＬ２：配列番号３６０）、およびＬＱＹＤＥＦＰＹＴ（ＣＤＲＬ３：配列番号３６１）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）領域と、ＶＨ ＣＤＲであるＤＹＹＬＨ（ＣＤＲＨ１：配列番号３６２）、ＷＩＤＰＤＱＧＤＴＹＹＡＱＫＦＱＧ（ＣＤＲＨ２：配列番号３６３）、ＡＹＧＥＳＳＹＰＭＤＹ（ＣＤＲＨ３：配列番号３６４）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）領域と、を含む。

本発明はさらに、二重特異性抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＶＬ ＣＤＲであるＲＡＳＱＤＩＨＲＹＬＳ（ＣＤＲＬ１：配列番号３６５）、ＲＥＳＲＦＶＤ（ＣＤＲＬ２：配列番号３６６）、ＬＱＹＤＥＦＰＹＴ（ＣＤＲＬ３；配列番号３６７）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）領域と、ＶＨ ＣＤＲであるＤＹＹＬＨ（ＣＤＲＨ１：配列番号３６８）、ＷＩＤＰＤＱＧＤＴＹＹＡＱＫＦＱＧ（ＣＤＲＨ２：配列番号３６９）、ＡＹＧＥＳＳＹＰＭＤＹ（ＣＤＲＨ３：配列番号３７０）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）領域と、を含む。

本発明はさらに、二重特異性抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＶＬ ＣＤＲであるＲＡＳＱＤＩＨＲＹＬＳ（ＣＤＲＬ１：配列番号３７１）、ＲＡＮＲＬＶＳ（ＣＤＲＬ２：配列番号３７２）、ＬＱＹＤＥＦＰＹＴ（ＣＤＲＬ３：配列番号３７３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）領域と、ＶＨ ＣＤＲであるＤＹＹＬＨ（ＣＤＲＨ１：配列番号３７４）、ＷＩＤＰＤＱＧＤＴＹＹＡＱＫＦＱＧ（ＣＤＲＨ２、配列番号３７５）、ＡＹＧＥＳＳＹＰＭＤＹ（ＣＤＲＨ３、配列番号３７６）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）領域と、を含む。

本発明はさらに、二重特異性抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＶＬ（配列番号３１７）およびＶＨ（配列番号３１８）を含む。

本発明はさらに、二重特異性抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＶＬ（配列番号３１９）およびＶＨ（配列番号３２０）を含む。

本発明はさらに、二重特異性抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＶＬ（配列番号３２１）およびＶＨ（配列番号３２２）を含む。

本発明はさらに、二重特異性抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＬＣ（配列番号３３３）およびＨＣ（配列番号３３４）を含む。

本発明はさらに、二重特異性抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＬＣ（配列番号３３５）およびＨＣ（配列番号３３６）を含む。

本発明はさらに、二重特異性抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＬＣ（配列番号３３７）およびＨＣ１３６７（配列番号３３８）を含む。

加えて、本発明は、腫瘍細胞を抑制するための医薬組成物であって、それを必要とする患者に投与するための医薬組成物を対象とし、本明細書に記載の二重特異性実体を含む。

加えて、本発明は、Ｂ細胞障害またはＢ細胞悪性腫瘍を治療するための医薬組成物であって、それを必要とする患者に投与するための医薬組成物を対象とし、本明細書に記載の二重特異性実体を含む。

本発明はさらに、腫瘍細胞を抑制する方法を対象とし、有効量の本明細書に記載の二重特異性実体を、それを必要とする患者に投与することを含む。

さらに、本発明は、Ｂ細胞障害またはＢ細胞悪性腫瘍の治療方法を対象とし、有効量の本明細書に記載の二重特異性実体を、それを必要とする患者に投与することを含む。

本明細書に記載の二重特異性実体の特定の属性の概略図である。二重特異性実体は、ＣＤ４７へのアビディティなしの低親和性結合、正常細胞への最小限の結合（すなわち、組織シンクがない）、腫瘍細胞への選択的結合をもたらすＣＤ２０への高親和性選択的アビディティ結合を含む、遍在的なＣＤ４７発現の課題を克服するように操作される。ＴＡＡ：腫瘍関連抗原 二重特異性実体のアーキテクチャ、タンパク質工学的特徴、およびいくつかの生物薬理学的属性の例を示す。 本明細書に記載の例示的な種類の二重特異性実体が、ＣＤ２０＋ ＣＤ４７＋ ＯＣＩ－Ｌｙ３ ＮＨＬ細胞のマクロファージ媒介性貪食を誘導することを示す。（図３Ａ～図３Ｂ）抗体濃度を鑑みた貪食マクロファージの割合を示すグラフである。（図３Ｃ）本明細書に記載の二重特異性種のＫＤおよびＥＣ５０値を示す表である。 本明細書に記載の例示的な種類の二重特異性実体が、ＣＤ２０＋ ＣＤ４７＋ ＯＣＩ－Ｌｙ３ ＮＨＬ細胞のマクロファージ媒介性貪食を誘導することを示す。（図３Ａ～図３Ｂ）抗体濃度を鑑みた貪食マクロファージの割合を示すグラフである。（図３Ｃ）本明細書に記載の二重特異性種のＫＤおよびＥＣ５０値を示す表である。 本明細書に記載の例示的な種類の二重特異性実体が、ＣＤ２０＋ ＣＤ４７＋ ＯＣＩ－Ｌｙ３ ＮＨＬ細胞のマクロファージ媒介性貪食を誘導することを示す。（図３Ａ～図３Ｂ）抗体濃度を鑑みた貪食マクロファージの割合を示すグラフである。（図３Ｃ）本明細書に記載の二重特異性種のＫＤおよびＥＣ５０値を示す表である。 本明細書に記載の例示的な二重特異性実体を示し、ＣＤ４７×ＣＤ２０ ＩｇＧ１種が、ＣＤＣ機能を示す。（図４Ａ～図４Ｂ）抗体濃度を鑑みたＣＤＣを示すグラフである。（図４Ｃ）ＴＰＰ－１３６０、ＴＰＰ－１３６２、およびリツキシマブの平均ＥＣ５０値を示す表である。 本明細書に記載の例示的な二重特異性実体を示し、ＣＤ４７×ＣＤ２０ ＩｇＧ１種が、ＣＤＣ機能を示す。（図４Ａ～図４Ｂ）抗体濃度を鑑みたＣＤＣを示すグラフである。（図４Ｃ）ＴＰＰ－１３６０、ＴＰＰ－１３６２、およびリツキシマブの平均ＥＣ５０値を示す表である。 本明細書に記載の例示的な二重特異性実体を示し、ＣＤ４７×ＣＤ２０ ＩｇＧ１種が、ＣＤＣ機能を示す。（図４Ａ～図４Ｂ）抗体濃度を鑑みたＣＤＣを示すグラフである。（図４Ｃ）ＴＰＰ－１３６０、ＴＰＰ－１３６２、およびリツキシマブの平均ＥＣ５０値を示す表である。 本明細書に記載の例示的な二重特異性実体であるＣＤ４７×ＣＤ２０ ＩｇＧ１種が、高ＣＤ２０のＮＨＬ細胞において、強力なＡＤＣＣ機能を示す（すなわち、リツキシマブよりも有意に高い）ことを示す。（図５Ａ～図５Ｂ）抗体濃度を鑑みた細胞傷害性を示すグラフである。（図５Ｃ）ＣＤ２０／ＣＤ４７比を示す表である。 本明細書に記載の例示的な二重特異性実体であるＣＤ４７×ＣＤ２０ ＩｇＧ１種が、高ＣＤ２０のＮＨＬ細胞において、強力なＡＤＣＣ機能を示す（すなわち、リツキシマブよりも有意に高い）ことを示す。（図５Ａ～図５Ｂ）抗体濃度を鑑みた細胞傷害性を示すグラフである。（図５Ｃ）ＣＤ２０／ＣＤ４７比を示す表である。 本明細書に記載の例示的な二重特異性実体であるＣＤ４７×ＣＤ２０ ＩｇＧ１種が、高ＣＤ２０のＮＨＬ細胞において、強力なＡＤＣＣ機能を示す（すなわち、リツキシマブよりも有意に高い）ことを示す。（図５Ａ～図５Ｂ）抗体濃度を鑑みた細胞傷害性を示すグラフである。（図５Ｃ）ＣＤ２０／ＣＤ４７比を示す表である。 本明細書に記載の二重特異性実体の例示的なアーキテクチャ、ならびに特定の例の特徴を示す。 本明細書に記載の二重特異性実体種の例であるＴＰＰ－１３６０を示し、ＴＰＰ－２３（４０８＿４３７ Ｆａｂ（ＶＬ：配列番号８９９、ＶＨ：配列番号９００）ＩｇＧ１を有する）の結合と比較して、結合シグナルをＢ細胞に実質的にシフトさせ、むしろＴ細胞、単球、およびＮＫ細胞に弱くシフトさせ、血小板または赤血球に対して結合が最小限であるかもしくは結合せず、それによって、ヒト全血におけるＢ細胞への選択的結合が示される。 本明細書に記載の種類の二重特異性実体の例であるＴＰＰ－１３６０を示し、ＣＤ４７⁺／ＣＤ２０⁺Ｒａｊｉ細胞に選択的に結合するが、ＣＤ４７⁺／ＣＤ２０^-ヒト赤血球（ＲＢＣ）には結合しないことが実証される。 Ｒａｊｉ細胞およびヒトＲＢＣの共培養において、本明細書に記載の例示的な種類の二重特異性実体であるＴＰＰ－１３６０が、ＣＤ４７⁺／ＣＤ２０⁺Ｒａｊｉ細胞に対して用量依存的な結合を示したが、ヒトＲＢＣに対しては、１ｍｇ／ｍＬの高い濃度でさえも結合を示さないことを示す。 ＴＰＰ－１３６０が、例えば、ＣＤ２０⁺／ＣＤ４７⁺リンパ腫細胞株ＯＣＩ－Ｌｙ３の表面に発現されるヒトＣＤ４７に対する組換えヒトＳＩＲＰα－Ｆｃの結合を、強力かつ完全に遮断したことを示す。 ＴＰＰ－１３６０が、例えば、ＣＤ２０⁺／ＣＤ４７⁺リンパ腫細胞株Ｒａｊｉの表面で発現されるヒトＣＤ４７に対する組換えヒトＳＩＲＰα－Ｆｃ結合を、強力かつ完全に遮断したことを示す。 ＴＰＰ－１３６０による処理が、例えば、ＣＤ２０⁺悪性Ｂ細胞株Ｒａｊｉのマクロファージ媒介性貪食を誘導したことを示す。 ＴＰＰ－１３６０による処理が、例えば、ＣＤ２０⁺悪性Ｂ細胞株ＯＣＩ－Ｌｙ３のマクロファージ媒介性貪食を誘導したことを示す。 ＴＰＰ－１３６０による処置が、例えば、ＣＤ２０⁺悪性Ｂ細胞株ＲＥＣ－１のマクロファージ媒介性貪食を誘導したことを示す。 ＴＰＰ－１３６０による処理が、例えば、ＣＤ２０⁺悪性Ｂ細胞株ＲＩＶＡのマクロファージ媒介性貪食を誘導したことを示す。 例えば、ＴＰＰ－１３６０での処理が、Ｒａｊｉ細胞およびＯＣＩ－Ｌｙ３細胞において、リツキシマブよりも有意に効率的な貪食を引き起こし、ＴＰＰ－１３６０によるＳＩＲＰα－ＣＤ４７相互作用の同時遮断およびＦｃγＲなどの活性化受容体の関与に起因する可能性が高いことを示す。 例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合の、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ２０⁺／ＣＤ４７⁺）に対するリツキサンおよびＴＰＰ－１３６０などの二重特異性抗体の結合を示す。 ＥｐｉＭａｔｒｉｘ抗体免疫原性スケールを示す。 Ｒａｊｉ異種移植モデルにおけるＴＰＰ－１３６２およびリツキサンによる処置を示す。 Ｒａｊｉ異種移植モデルにおけるＴＰＰ－１３６０およびリツキサンによる処置を示す。 ＴＰＰ－１３６０およびＴＰＰ－１３６２が、例えば、ＣＤ２０⁺／ＣＤ４７⁺リンパ腫細胞株ＯＣＩ－Ｌｙ３の表面で発現されるヒトＣＤ４７に対する組換えヒトＳＩＲＰαの結合を、強力かつ完全に遮断したことを示す。リツキサンは、ＳＩＲＰαの結合に対して影響がないことが分かった。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において参照されるすべての刊行物および特許は、参照により援用される。

本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指し得る。

本明細書で使用される場合、「約」は、一般に、測定値の性質または精度を考慮して測定された量に対する許容される程度の誤差を指し得る。誤差の程度の例としては、所与の値または値の範囲の５％以内である。

１つ以上の特徴を「含む」として本明細書に記載される実施形態は、かかる特徴の「からなる」および／または「本質的にからなる」対応する実施形態の開示とみなされてもよい。

本明細書で使用される場合、「ＣＤ４７に対する低い親和性」は、ＳＰＲによってＫｄとしてインビトロで測定した場合、ＣＤ４７に対する親和性が、約２５μＭ未満（例えば、約０．０５μＭ～約２５μＭ）であることを指す。

本明細書で使用される場合、「ＣＤ２０に対する高い親和性」は、ＣＤ２０に対する親和性が、約０．４ｎＭ以上（例えば、約０．４ｎＭ～約１２ｎＭ）であることを指す。一部の実施形態では、「ＣＤ２０に対する高い親和性」は、ＣＤ２０に対する親和性が、約０．４ｎＭ～約５ｎＭであることを指す。

本明細書に記載の二重特異性実体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）は、腫瘍細胞上のＣＤ４７に選択的に結合し、正常細胞では実質的にＣＤ４７に結合しない。本明細書で使用される場合、「ＣＤ４７に実質的に結合しない」とは、概して、（ＣＤ２０－／ＣＤ４７＋）正常細胞上のＣＤ４７の５％未満の結合を指す。本明細書に記載の二重特異性実体は、（ＣＤ２０－／ＣＤ４７＋）正常細胞上のＣＤ４７の２％未満に結合する。実施例５を参照されたい。換言すれば、本明細書に記載の実体は、概して、（ＣＤ２０＋／ＣＤ４７＋）細胞への９５％以上の結合を示す。本明細書に記載される実体は、（ＣＤ２０＋／ＣＤ４７＋）細胞への９８％以上の結合を示す。

本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されているか、または動物（より具体的にはヒト）で使用するために米国薬局方、欧州薬局方、または他の一般的に認められた薬局方に記載されていることを指す。

濃度、量、体積、パーセンテージおよび他の数値は、本明細書において範囲形式で提示され得る。このような範囲形式は、単に利便性および簡潔性のために使用され、範囲の限界として明示的に列挙された数値だけでなく、各数値およびサブ範囲が明示的に列挙されているかのように、その範囲内に包含されるすべての個々の数値またはサブ範囲を含むように柔軟に解釈されるべきであることも理解されたい。

本発明の抗体のアミノ酸配列におけるわずかなバリエーションは、本明細書の任意の場所で提供される抗体またはその抗原結合断片の配列に対して、アミノ酸配列における変動が少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％もしくは９９％の配列相同性もしくは配列同一性を維持することを条件として、本発明に包含されるものとして企図される。

本発明の抗体は、保存位置または非保存位置のいずれかで、１つの種に由来するアミノ酸残基が、別の種における対応する残基に置換されたバリアントを含み得る。一実施形態では、非保存位置のアミノ酸残基は、保存的残基または非保存的残基で置換される。特に、保存的アミノ酸置換が企図される。

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものを指す。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、またはグルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、またはシステイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、またはトリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはヒスチジン）が含まれる。したがって、ポリペプチドのアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸で置き換えられている場合、アミノ酸置換は保存的であると考えられる。本発明の抗体における保存的修飾バリアントの包含は、他の形態のバリアント、例えば、多型バリアント、種間ホモログ、およびアレルを除外しない。

本明細書で使用される場合、「非保存的アミノ酸置換」は、（ｉ）電気陽性側鎖（例えば、アルギニン、ヒスチジン、またはリジン）を有する残基が、電気陰性残基（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸）に置換されているか、もしくはそれによって置換されている、（ｉｉ）親水性残基（例えば、セリンまたはスレオニン）が、疎水性残基（例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、またはバリン）に置換されているか、もしくはそれによって置換されている、（ｉｉｉ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基に置換されているか、もしくはそれによって置換されている、あるいは（ｉｖ）かさばった疎水性側鎖または芳香族側鎖（例えば、バリン、ヒスチジン、イソロイシン、またはトリプトファン）を有する残基が、より小さい側鎖（例えば、アラニン、またはセリン）を有する残基または側鎖を有しない残基（例えば、グリシン）に置換されているか、もしくはそれによって置換されているものを含む。

「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、本明細書で使用される場合、従来のアイソタイプおよび単一特異性形式ならびに多価抗体を指し、これらに限定されないが、当技術分野で既知の現在の二重特異性実体形式ならびに二重特異性抗体（本明細書に別途記載される形式を含むが、これらに限定されない）が含まれる。

典型的な抗体は、少なくとも２つの「軽鎖」（ＬＣ）および２つの「重鎖」（ＨＣ）を含む。かかる抗体の軽鎖および重鎖は、いくつかのドメインからなるポリペプチドである。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において「ＶＨ」と略記される）および重鎖定常領域（本明細書において「ＣＨ」と略記される）を含む。重鎖定常領域は、重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（抗体クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧ）、および任意選択的に、重鎖定常ドメインＣＨ４（抗体クラスＩｇＥおよびＩｇＭ）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＬ」と略記される）および軽鎖定常ドメイン（本明細書において「ＣＬ」と略記される）を含む。可変領域ＶＨおよびＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに細分化することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域とともに散在する。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の「定常ドメイン」は、抗体の標的への結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。

抗体とその標的抗原またはエピトープとの間の結合は、相補性決定領域（ＣＤＲ）によって媒介される。ＣＤＲは、配列可変性が高い領域であり、抗原結合部位を形成する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域内に位置する。ＣＤＲは、抗原特異性の主な決定因子である。典型的には、抗体の重鎖および軽鎖は、各々、非連続的に配置された３つのＣＤＲを含む。抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、したがって、本発明のさらなる態様を提供する。

したがって、本明細書で使用される「抗原結合断片」という用語は、１つ、２つ、もしくは３つの軽鎖ＣＤＲ、および／または１つ、２つ、もしくは３つの重鎖ＣＤＲを含む抗原結合ポリペプチドの任意の天然に存在する構成もしくは人工的に構築された構成を含み、ポリペプチドは、抗原に結合することが可能である。

ＣＤＲの配列は、当該技術分野で既知の任意の番号システム、例えば、カバットシステム（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））、コチアシステム（Ｃｈｏｔｈｉａ ＆，Ｌｅｓｋ，“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１－９１７（１９８７））、またはＩＭＧＴシステム（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，“ＩＭＧＴ Ｕｎｉｑｕｅ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，”Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，５５－７７（２００３））を参照することによって特定することができる。本明細書で示されるＣＤＲは、カバットによる境界（すなわち、サイズ）を用いる。本明細書において記載および言及される抗体の定常領域の位置の番号付けは、概してカバットによるものである。しかしながら、本明細書に記載の抗ＣＤ４７のＶＬ領域およびＶＨ領域（すなわち、抗体の残基位置および置換位置）の番号付けは、各可変領域（すなわち、ＶＬまたはＶＨ、それぞれ、特に配列番号３２５および配列番号３２６を参照して）のＮ末端残基から始まる。

「本明細書に記載の二重特異性実体」とは、概して、機能的に定義された抗体、二重特異性要素形式、要素配列、抗体、および本明細書に記載の抗体種を指す。

本明細書で使用される「Ｆａｂ部分」または「アーム」という用語は、抗体の抗原結合断片（すなわち、抗原に結合する抗体の領域）を指す。本明細書で使用される場合、それは、軽鎖および重鎖（ＶＬ／ＶＨ）の各々の１つの可変ドメインを含む。

「Ｆａｂ’断片」は、単一の軽鎖および単一の重鎖を含むが、「Ｆａｂ’断片」は、ＣＨ１およびＶＨに加えて、鎖間ジスルフィド結合の形成に必要とされるＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の重鎖の領域を含む。したがって、２つの「Ｆａｂ’断片」は、ジスルフィド結合の形成を介して会合して、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成し得る。

「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む。各鎖は、２つの重鎖間の鎖間ジスルフィド結合の形成に必要な定常領域の一部を含む。

「Ｆｖ断片」は、重鎖および軽鎖の可変領域のみを含む。定常領域は含まれない。

「単一ドメイン抗体」は、単一の抗体ドメイン単位（例えば、ＶＨまたはＶＬ）を含む抗体断片である。

「一本鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖ」）は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む抗体断片であり、ともに連結されて一本鎖を形成する。ポリペプチドリンカーは、一般に、ｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインを接続するために使用される。

「タンデムｓｃＦｖ」、別名ＴａｎｄＡｂ（登録商標）は、可撓性ペプチドリンカーとのタンデム方向の２つのｓｃＦｖの共有結合によって形成される一本鎖Ｆｖ分子である。

「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」（ＢｉＴＥ（登録商標））は、単一ペプチド鎖上の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる融合タンパク質である。一方のｓｃＦｖは、ＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、他方は、腫瘍細胞の抗原に結合する。

「ダイアボディ」は、二価で二重特異性の小さな抗体断片であり、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）上で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、同じ鎖上で２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるペプチドリンカーによって接続されている（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７７（１９９８），７６３－７７２）。これは、別の鎖の相補的ドメインとの対形成を強制し、２つの機能的な抗原結合部位を有する二量体分子のアセンブリを促進する。

「ＤＡＲＰｉｎ」は、二重特異性アンキリンリピート分子である。ＤＡＲＰｉｎは、天然のアンキリンタンパク質に由来し、これはヒトゲノムに見出すことができ、最も豊富な種類の結合タンパク質の１つである。ＤＡＲＰｉｎライブラリモジュールは、天然のアンキリンリピートのタンパク質配列によって定義され、初期設計に２２９個のアンキリンリピート、およびその後の精密化にさらに２２００個のアンキリンリピートを使用する。モジュールは、ＤＡＲＰｉｎライブラリのビルディングブロックとしての役割を果たす。ライブラリモジュールは、ヒトゲノム配列に類似している。ＤＡＲＰｉｎは、４～６個のモジュールで構成されている。各モジュールは約３．５ｋＤａであるため、ＤＡＲＰｉｎの平均サイズは１６～２１ｋＤａである。結合剤の選択は、リボソームディスプレイによって行われ、完全に無細胞であり、Ｈｅ Ｍ．ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ ＭＪ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．２００７，Ｎｏｖ；３５（Ｐｔ ５）：９６２－５．に記載されている。

本明細書で使用される「腫瘍」および「腫瘍細胞」という用語は、広義には、がん細胞を指し、異常増殖を起こしている細胞、血液腫瘍状態、血液悪性腫瘍、リンパ増殖性障害、Ｂ細胞障害、Ｂ細胞悪性腫瘍、およびＢ細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される、ＩｇＧ１またはＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式は、基本的には、ＩｇＧ１抗体全体を指し、（ｉ）一方は、１つの供給源（すなわち、抗ＣＤ４７）由来の１つの重鎖（ＨＣ）および１つの軽鎖（ＬＣ）からなり、他方は、別の供給源（例えば、抗ＣＤ２０）由来の１つの重鎖（ＨＣ）および１つの軽鎖（ＬＣ）からなる。例えば、図２および図６を参照されたい。

ＣＤ４７
ＣＤ４７／ＳＩＲＰα軸を標的とするがん免疫療法の価値は、十分に確立されている。例えば、Ｗｅｉｓｋｏｐｆ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１７ Ｍａｙ；７６：１００、Ｆｅｎｇ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０１９ Ｏｃｔ；１９（１０）：５６８－５８６を参照されたい。臨床における抗ＣＤ４７のアプローチは、併用療法の必要性、高親和性結合剤によるＣＤ４７を標的とする組織シンク、免疫原性、ならびに観察される一部の臨床分子による血液学的毒性（貧血、好中球減少症、および／または血小板減少症）によって制限されてきた。

ＣＤ４７は、腫瘍細胞上で上方制御されているが、比較的高いレベルで、ＮＫ細胞、ＲＢＣ、および血小板を含むすべての細胞でも遍在的に発現されている。したがって、ＣＤ４７を標的とする単一特異性剤は、貧血および血小板減少症を含む標的媒介性薬物消失（ＴＭＤＤ）および副作用により、不良な薬物動態特性を示す傾向がある。標的媒介性薬物消失（ＴＭＤＤ）とは、薬物がその薬理学的標的部位（受容体など）に高い親和性で結合することにより、その薬物動態特性に影響を及ぼす現象である。抗ＣＤ４７ ＩｇＧ４ ｍＡｂは、一般に、毒性を低減するために必要とされる。したがって、単一の抗ＣＤ４７（例えば、ＩｇＧ１）の薬剤活性が制限される傾向がある。

Ｒｕｓｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．２０１８ Ｎｏｖ；３２（６）：４８０は、特異的な、十分特徴付けられたＩｇＧ４抗ＣＤ４７抗体（ＣＣ－９０００２）を記載した。特に、ＷＯ２０１３／１１９７１４（米国特許第９０４５５４１号）を参照されたい。この抗体における様々なアミノ酸置換が記載されており、無細胞産生を増加させ、免疫原性を低下させるように設計されている。ＷＯ２０１６／１０９４１５（ＵＳ２０１７／０３６９５７２）、ＷＯ２０１８／００９４９９（ＵＳ２０１９／０２４１６５４）、およびＷＯ２０１８／１８３１８２を参照されたい。ＣＣ－９０００２は、高親和性ＩｇＧ４ Ｐ／Ｅ抗ＣＤ４７分子であり、患部組織および正常組織で発現されるＣＤ４７に結合する。

しかしながら、ＣＤ４７は、正常組織および腫瘍細胞で広く発現しているため、高親和性抗ＣＤ４７抗体は、望ましくない毒性をもたらし得る。したがって、毒性および有効性に関して、ＣＣ－９０００２を改善するＣＤ４７結合ドメインを含む二重特異性抗体が、本明細書に提供される。特に、本明細書に記載の二重特異性実体は、末梢組織におけるＣＤ４７への結合がほとんどまたは全くない腫瘍細胞を選択的かつ安全に標的とする。本発明は、ＣＤ４７に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分と、ＣＤ２０に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分とを含む抗体を対象とし、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分は、ＣＤ４７に対して低い親和性（例えば、１００ｎＭ超のＫｄ）を示し、ＣＤ２０に結合するＦａｂ部分は、ＣＤ２０に対して高い親和性（例えば、５ｎＭ未満のＫｄ）を示し、二重特異性抗体は、腫瘍細胞のＣＤ４７に選択的に結合し、正常細胞のＣＤ４７に実質的に結合しない。

ＣＣ－９０００２は、参照親配列として、および本明細書に記載の二重特異性実体のいくつかの構築のための抗ＣＤ４７要素の供給源として提供される。ＣＣ－９０００２ ＶＬ ＣＤＲは、配列番号３４７（ＣＤＲＬ１）、配列番号３４８（ＣＤＲＬ２）、および配列番号３４９（ＣＤＲＬ３）である。ＣＣ－９０００２ ＶＨ ＣＤＲは、配列番号３５０（ＣＤＲＨ１）、配列番号３５１（ＣＤＲＨ２）、および配列番号３５２（ＣＤＲＨ３）である。参考のために、ＣＣ－９０００２のＶＬ（配列番号３２５）およびＶＨ（配列番号３２６）も提供されている。参考のために、ＬＣ全体を形成するように天然のＩｇＧ１ ＬＣ定常領域に融合されたＣＣ－９０００２ ＶＬは、ＣＣ－９０００２ ＬＣ全体／ＩｇＧ１（配列番号３２７）として提供されている。参考のために、ＨＣ全体を形成するように天然のＩｇＧ１ ＨＣ定常領域に融合されたＣＣ－９０００２ ＶＨは、ＣＣ－９０００２ ＨＣ全体／ＩｇＧ１（配列番号３２８）として提供されている。

ＣＣ－９０００２のＶＨ領域およびＶＬ領域の両方は、本明細書に記載の二重特異性実体における使用のために機能性を保持しながら、免疫原性を低減するように操作された。

本明細書に記載および例示される二重特異性実体は、例えば、単剤抗ＣＤ４７ｍＡｂ療法の課題を克服するために実証される。ＣＤ４７に対する脱調整（ｄｅｔｕｎｅｄ）親和性のため、本明細書に記載および提供されるＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異性実体は、ＣＤ２０⁺腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）細胞に優先的に結合する。それによって、ＣＤ４７⁺細胞によって媒介されるシンク効果および標的外腫瘍毒性が低減される。まとめると、細胞効力、インビボ有効性、および安全性データは、本明細書に記載および例示されるＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｓ）が、例えば、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞悪性腫瘍用の単剤として、独自の選択肢を提供することを示す。

図１は、本明細書に記載の二重特異性実体の特定の属性の概略図であり、ＣＤ４７へのアビディティなしの低親和性結合、正常細胞への最小限の結合（すなわち、組織シンクがない）、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ＣＤ２０への高親和性選択的アビディティ結合、を含む遍在的なＣＤ４７発現の課題を克服するように操作され、腫瘍細胞への選択的結合をもたらす。

本明細書で提供されるＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異体は、任意の高親和性ＣＤ２０結合剤由来のＣＤ２０結合ドメインを含み得る。リツキシマブのＬＣ（配列番号３２９）およびＨＣ（配列番号３３０）は、本明細書に記載の二重特異性実体の構築のための抗ＣＤ２０要素の好ましい供給源である。特定の実施形態では、本発明で提供される二重特異性抗体は、リツキシマブのＶＬ（配列番号３２３）およびＶＨ（配列番号３２４）の一方もしくは両方を含むか、またはリツキシマブのＶＬ ＣＤＲ：配列番号３５３（ＣＤＲＬ１）、配列番号３５４（ＣＤＲＬ２）、および配列番号３５５（ＣＤＲＬ３）、ならびにリツキシマブのＶＨ ＣＤＲ：配列番号３５６（ＣＤＲＨ１）、配列番号３５７（ＣＤＲＨ２）、および配列番号３５８（ＣＤＲＨ３）をそれぞれ含む。本明細書に別途記載される抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１のＬＣおよびＨＣの定常領域は、それぞれ、リツキシマブＶＬ（配列番号３２３）およびリツキシマブＶＨ（配列番号３２４）のカルボキシ末端に融合される。抗ＣＤ２０のＬＣ（配列番号３３１）は、本発明の二重特異性実体の構築に使用するために好ましい。抗ＣＤ２０のＨＣ（配列番号３３２）は、本発明の二重特異性実体の構築に使用するために好ましい。

本明細書に記載の例示的な二重特異性実体は、末梢組織、ＲＢＣ、および血小板においてＣＤ４７に実質的に結合せず、選択的かつ安全にＣＤ２０＋腫瘍細胞を標的とし、より低い毒性を有する長時間の半減期を提供し、本抗体は、腫瘍細胞の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する。

二重特異性実体は、好ましくはＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式である。
特定の実施形態では、本明細書に提供される二重特異性抗体は、共有結合して単一の実体を形成する２つの抗原結合アームを含む。２つのＦａｂドメインを用いるＩｇＧ二重特異性抗体は、所望の生成物の適切なアセンブリを確実にするために、発現および精製の戦略に関して慎重に考慮する必要がある。所望の二重特異性抗体の発現にバイアスを与えるように遺伝子レベルで尽力され得る。例えば、Ｆｃのヘテロ二量体化を駆動するために、ＩｇＧ ＦｃのＣＨ３ドメインにおける置換が記載されている。さらに、ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ ｈｏｌｅ）戦略は、立体障害を利用して、２つの異なるＦｃ ＣＨ３ドメイン間に相補的な非対称分子面を生成する。当該技術分野で既知の他の戦略は、特異性を駆動するために静電相補性を用いる。あるいは、野生型ＩｇＧの足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を使用することができ、得られた生成物の組み合わせをタンパク質精製中に分離して、所望の生成物を単離することができる。

本発明の好ましい二重特異性抗体は、基本的に、天然のヒトＩｇＧ１抗体であり、（Ａ）１つの軽鎖（ＬＣ）全体および１つの重鎖（ＨＣ）全体を含む１つの抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１（モノマー）部分と、（Ｂ）１つの軽鎖（ＬＣ）全体および１つの重鎖（ＨＣ）全体を含む１つの抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１（モノマー）部分と、からなる。２つのモノマーは、従来の二量体ＩｇＧ１抗体を形成し、一方のアーム（Ｆａｂ₁）は、ＣＤ４７の減弱した結合を提供し、他方のアーム（Ｆａｂ₂）は、ＣＤ２０に対する親和性結合およびアビディティを提供する。図２および図６は、本明細書に記載のＣＤ４７×ＣＤ２０の例示的なアーキテクチャおよび例示的なタンパク質工学的特徴を示す。

本明細書に記載のＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体の好ましい単量体要素は、各々、ＬＣおよびＨＣの定常領域内に特定の配列を含み、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中にホモ二量体の形成を低減する。一実施形態では、産生中の適切なＬＣ／ＨＣ対形成を確実にする抗ＣＤ４７ ＬＣ定常領域は、配列番号３４０を含む。別の実施形態では、産生中にＦｃヘテロ二量体形成を確実にする抗ＣＤ４７ ＨＣ定常領域は、配列番号３４２を含む。産生中の適切なＬＣ／ＨＣ対形成を確実にするための好ましい抗ＣＤ２０ ＬＣ定常領域は、配列番号３４４を含む。産生中のＦｃヘテロ二量体形成を確実にするための好ましい抗ＣＤ２０ ＨＣ定常領域は、配列番号３４６を含むことを。産生中に適切なＬＣ／ＨＣ対形成を確実にするための例示的な抗ＣＤ４７ ＬＣ定常領域は、配列番号３３９である。産生中のＦｃヘテロ二量体形成を確実にするための例示的な抗ＣＤ４７ ＨＣ定常領域は、配列番号３４１である。産生中の適切なＬＣ／ＨＣ対形成を確実にするための例示的な抗ＣＤ２０ ＬＣ定常領域は、配列番号３４３である。産生中のＦｃヘテロ二量体形成を確実にするための例示的な抗ＣＤ２０ ＨＣ定常領域は、配列番号３４５である。

本明細書に記載の１６１種類のＦａｂを用いるための好ましいＩｇＧ１定常領域は、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式であり、ＣＤ４７の減弱された結合を提供するＦａｂは、ＬＣ定常領域が配列番号３３９およびＨＣ定常領域が配列番号３４１である。
置換Ｑ１２４Ｅ、Ｌ１３５Ｗ、Ｑ１６０Ｅ、およびＴ１８０Ｅを含む抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１ ＬＣ定常領域は、ＣＣ－９０００２と比較して、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中に適切なＬＣ／ＨＣ対形成を確実にする。

本明細書では、好ましい抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１ ＬＣ定常領域（配列番号３３９）がさらに提供される。特定の実施形態（例えば、本明細書に提供される二重特異性抗体の特定の実施形態）では、本明細書に提供される抗ＣＤ４７ ＶＬ領域は、配列番号３３９のアミノ末端に融合される。配列番号３４０は、配列番号３３９の内部にある。配列番号３３９および配列番号４４０は、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中に適切なＬＣ／ＨＣ対形成を確実にする置換Ｑ１２４Ｅ、Ｌ１３５Ｗ、Ｑ１６０Ｅ、およびＴ１８０Ｅを含む。

ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中に適切なＬＣ／ＨＣ対形成およびＦｃヘテロ二量体形成を確実にするための置換Ｑ１７９Ｋ、Ｔ３７１Ｖ、Ｔ３８９Ｌ、Ｋ４２０Ｌ、およびＴ４２２Ｗを含む抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１ ＨＣ定常領域が提供される。

本明細書では、好ましい抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１ ＨＣ定常領域（配列番号３４１）がさらに提供される。特定の実施形態（例えば、本明細書に提供される二重特異性抗体の特定の実施形態）では、本明細書に提供される抗ＣＤ４７ ＶＨ領域は、配列番号３４１のアミノ末端に融合される。配列番号３４２は、配列番号３４１の内部にある。配列番号３４１および配列番号３４２は、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中にＦｃヘテロ二量体形成を確実にするための置換Ｑ１７９Ｋ、Ｔ３７１Ｖ、Ｔ３８９Ｌ、Ｋ４２０Ｌ、およびＴ４２２Ｗを含む。

抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１ ＬＣ定常領域が提供され、リツキシマブと比較して、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中に適切なＬＣ／ＨＣ対形成を確実にする置換Ｆ１１６Ａ、Ｑ１２４Ｒ、Ｌ１３５Ｖ、Ｔ１７８Ｒを含む。

本明細書では、好ましい抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１ ＬＣ定常領域（配列番号３４３）がさらに提供される。特定の実施形態（例えば、本明細書に提供される二重特異性抗体の特定の実施形態）では、本明細書に提供される抗ＣＤ２０ ＶＬ領域は、配列番号３４３のアミノ末端に融合される。配列番号３４４は、配列番号３４３の内部にある。配列番号３４３および配列番号３４４は、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中にホモ二量体形成を低減する置換Ｆ１１６Ａ、Ｑ１２４Ｒ、Ｌ１３５Ｖ、およびＴ１７８Ｒを含む。

抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１ ＨＣ定常領域が提供され、リツキシマブと比較して、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中にＦｃヘテロ二量体形成を確実にする置換Ａ１３９Ｗ、Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ、Ｔ３７１Ｖ、Ｌ３７２Ｙ、Ｆ４３６Ａ、およびＹ４３８Ｖを含む。

本明細書では、好ましい抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１ ＨＣ定常領域（配列番号３４５）がさらに提供される。特定の実施形態（例えば、本明細書に提供される二重特異性抗体の特定の実施形態）では、本明細書に提供される抗ＣＤ２０ ＶＨ領域は、配列番号３４５のアミノ末端に融合される。配列番号３４６は、配列番号３４５の内部にある。配列番号３４５および配列番号３４６は、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中にホモ二量体形成を低減する置換Ａ１３９Ｗ、Ｌ１４３Ｅ、Ｋ１４５Ｔ、Ｑ１７９Ｅ、Ｔ３７１Ｖ、Ｌ３７２Ｙ、Ｆ４３６Ａ、およびＹ４３８Ｖを含む。

ＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異体
ＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異性プログラムを開始して、ＣＤ２０発現細胞上でのみＳＩＲＰαへのヒトＣＤ４７の結合を遮断することができる治療抗体を同定した。そのプロジェクトから得られ、本明細書に提供される実施例は、ＣＤ４７に対して脱調整された（ｄｅｔｕｎｅｄ）親和性を示す一方で、ＣＤ２０に対して高い親和性で結合する。腫瘍細胞上のＣＤ２０に結合すると、抗体は、ＩｇＧ１ Ｆｃを介して、エフェクター細胞上のＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用および共エンゲージ活性化受容体ＦｃγＲを強力に遮断し、腫瘍細胞に対するマクロファージ媒介性貪食およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性細胞傷害の活性化をもたらす。

ＣＣ－９０００２に由来する抗ＣＤ４７を含む二重特異性抗体
ＣＤ４７エピトープマッピングおよびＣＣ－９０００２
抗ＣＤ４７エピトープは、ヒトＣＤ４７細胞外ドメインとの複合体で、非脱調整親バージョンのＣＣ－９０００２（４０８＿４３７）Ｆａｂ（ＶＬ：配列番号３８７、ＶＨ：配列番号３８８）の結晶構造を、２．４Åの分解能で解析することによって決定された。３つの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ（配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９）、ならびに重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ２（配列番号３５１）およびＨＣ ＣＤＲ３（配列番号３５２）はすべて、ＣＤ４７ ＥＣＤの大きな表面積への結合に関与する。ＨＣ ＣＤＲは、ＣＤ４７のＫＧＲＤループとの複数の接触を行い、ＬＣ ＣＤＲは、ＳＩＲＰα結合部位と重複し、これは、ＣＣ－９０００２および本明細書に記載の二重特異性実体がＳＩＲＰα結合を遮断する能力を説明する。

本明細書に記載されるＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異性実体は、ＣＤ４７⁺／ＣＤ２０^-正常細胞を温存しながら、ＣＤ２０およびＣＤ４７の両方を発現するがん細胞上のＣＤ４７－ＳＩＲＰα「私を食べないで（ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ）」シグナルのＣＤ２０制限の遮断を促進するように設計されている。複数のステップのタンパク質工学により、本明細書に記載の二重特異性実体の抗ＣＤ４７ Ｆａｂがもたらされた。（１）タンパク質工学をＣＣ－９０００２のＶＨ鎖およびＶＬ鎖の両方に用いて、免疫原性を低減しながら、機能性を保持し、また（２）タンパク質工学をＣＣ－９０００２を脱調整するためにも用いた。本明細書に記載および例示される、ＣＤ４７に対する親和性が低下したＣＤ４７およびＣＤ２０を標的とするＩｇＧ１二重特異性抗体は、１）ＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用を標的とし、活性化受容体ＦｃγＲを関与させることによって、抗腫瘍機能を媒介する有効性を保持し、２）標的媒介性のシンク効果および抗ＣＤ４７治療薬で観察される毒性を最小限に抑え、３）ＣＤ４７およびＣＤ２０の関与を単一分子に組み込み、２つのモノクローナル抗体による併用療法の必要性を回避する。

タンパク質設計
エフェクター抗原であるＣＤ４７の結晶構造は、高親和性抗ＣＤ４７ Ｆａｂ（ＣＣ－９０００２（４０８＿４３７ＶＬ：配列番号８９９、４０８＿４３７ＶＨ：配列番号９００））に結合して、より低い親和性、良好な安定性、および低い免疫原性の範囲を有することが予測されるＦａｂバリアントのインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）ライブラリの構築を導いた。このライブラリからのバリアントは、高親和性抗ＣＤ２０ Ｆａｂ（リツキシマブ（ＶＬ：配列番号３２３、ＶＨ：配列番号３２４））を有するＩｇＧ１二重特異体として発現された。

得られた１４３種類の物理構築物を、ＣＤ４７結合およびＳＩＲＰα遮断のための細胞ベースのアッセイを使用して選択性および効力についてスクリーニングして、選択性抗原ＣＤ２０を共発現する標的細胞上でエフェクター抗原ＣＤ４７に効果的に結合するが、エフェクター抗原ＣＤ４７のみを発現する非標的細胞株には最小限に結合するバリアントを特定した。

ＩｇＧ１アイソタイプを含むがこれらに限定されないＣＣ－９０００２と比較して、ＣＤ４７に対する結合親和性が実質的に低減され、免疫原性が低減された抗ＣＤ４７のＬＣおよびＨＣ全体、ＬＣおよびＨＣ定常領域、ＶＬおよびＶＨ領域、ならびにＣＤＲ配列の例が本明細書に提供され、別途記載される。ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式は、以下に記載されるように、（Ａ）１つの軽鎖（ＬＣ）全体および１つの重鎖（ＨＣ）全体を含む１つの抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１（単量体）部分と、（Ｂ）１つの軽鎖（ＬＣ）全体および１つの重鎖（ＨＣ）全体を含む１つの抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１（単量体）部分と、を含むことが好ましい。

本発明の抗体は、それぞれ、ＣＣ－９０００２に由来するＶＬおよびＶＨアミノ酸配列（すなわち、配列番号３２５および配列番号３２６）を含み、ＣＤ４７に対する結合親和性が、実質的に減弱され、すなわち、ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が低親和性を示す。本明細書に記載の脱調整抗ＣＤ４７結合剤のスクリーニングからのＣＤ４７に対する様々な親和性により、非標的細胞への結合が劇的に減少したが、それでもなお、ＣＤ２０に結合した後に標的細胞の表面に動員されると、貪欲にもＣＤ４７に効果的に結合できることが見出された。初期の脱調整ＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異性リードは、この選択性を、約０．５μＭ～約２．５μＭの範囲の親和性で達成した（図３Ａ～図３Ｃ）。ＴＰＰ－１３６０は、例えば、ヒトＣＤ４７ ＥＣＤに対して、Ｋｄが１．７μＭの親和性を有することが測定され、親抗ＣＤ４７結合剤と比較して、約３５０倍の親和性の低下を反映した。ＴＰＰ－１３６２は、ヒトＣＤ４７ ＥＣＤに対して、Ｋｄが０．７９６μＭの親和性を有することが測定され、親抗ＣＤ４７結合剤と比較して、約１５０倍の親和性の低下を反映した。本明細書に記載の脱調整ＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異性実体は、約０．２μＭ～約４μＭの範囲の親和性を有する選択性を示す。

本明細書に記載の二重特異性実体は、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞上でＣＤ４７に選択的に結合し、正常細胞では実質的にＣＤ４７に結合しない。本明細書に記載の二重特異性実体についての共培養結合アッセイにおける、Ｒａｊｉ（ＣＤ４７＋ＣＤ２０＋）対ヒトＲＢＣへの結合の比率は、例えば、約６０００倍である。本明細書に記載の二重特異性実体についてのヒトＢ細胞（ＣＤ４７＋ＣＤ２０＋）対ヒトＲＢＣへの結合の比率は、例えば、約７００倍である。本明細書に記載される二重特異性実体の選択性のレベルは、腫瘍細胞および正常細胞におけるＣＤ２０およびＣＤ４７の発現レベルに応じて、約４００～約８，０００倍の範囲の選択性を示す。したがって、固定レベルのＣＤ４７発現を仮定すると、ＣＤ２０レベルが増加するにつれて、本明細書に記載の二重特異性実体は、増加した選択性および効力を示す。

本発明の例示的な抗体はまた、それぞれＣＣ－９０００２に由来するＶＬ領域およびＶＨ領域（すなわち、配列番号３２５および配列番号３２６）を含み、ＶＬ、ＶＨ、またはその両方は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、得られた抗体の免疫原性を実質的に低減する。本発明の例示的な抗体は、それぞれＣＣ－９０００２に由来するＶＬ領域およびＶＨ領域（すなわち、配列番号３２５および配列番号３２６）を含み、ＶＬ、ＶＨ、または両方の配列は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、得られた抗体のＣＤ４７に対する結合親和性を低減させ、得られた抗体の免疫原性を実質的に低減する。

したがって、本明細書に記載のＣＣ－９０００２に由来する好ましい抗体は、ＶＬ配列番号３２５に対して１～７個のアミノ酸置換を示し、ＶＨ配列番号３２６に対して１～１１個のアミノ酸置換を示す。

さらに、ＣＣ－９０００２に由来する抗体が、本明細書で企図され、別途機能的に記載され、ＶＬ配列番号３２５に対して８個のアミノ酸置換を示す。さらに、ＣＣ－９０００２に由来する抗体が、本明細書で企図され、別途機能的に記載され、ＶＬ配列番号３２５に対して９個のアミノ酸置換を示す。さらに、ＣＣ－９０００２に由来する抗体が、本明細書で企図され、別途機能的に記載され、ＶＬ配列番号３２５に対して１０個のアミノ酸置換を示す。

さらに、ＣＣ－９０００２に由来する抗体が、本明細書で企図され、別途機能的に記載され、ＶＨ配列番号３２６に対して１２個のアミノ酸置換を示す。さらに、ＣＣ－９０００２に由来する抗体が、本明細書で企図され、別途機能的に記載され、ＶＨ配列番号３２６に対して１３個のアミノ酸置換を示す。さらに、ＣＣ－９０００２に由来する抗体が、本明細書で企図され、別途機能的に記載され、ＶＨ配列番号３２６に対して１４個のアミノ酸置換を示す。

本明細書において、ＣＤ４７抗体が提供され、抗ＣＤ４７ ＶＬは、配列番号３２５に対して１～７個のアミノ酸置換を示し、当該アミノ酸置換のうちの少なくとも１個は、Ａ１０Ｓ、Ｍ１１Ｌ、Ｋ２４Ｒ、Ａ５１Ｅ、Ｎ５２Ｓ、Ｌ５４Ｆ、およびＳ５６Ｄからなる群から選択され、抗ＣＤ４７ ＶＨは、配列番号３２６に対して１～１１個のアミノ酸置換を示し、当該アミノ酸置換のうちの少なくとも１個は、Ｔ１４Ｐ、Ｑ４３Ｋ、Ａ４４Ｇ、Ｅ５９Ｙ、Ｄ６６Ｇ、Ｍ７６Ｔ、Ｓ８４Ｒ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｓ１０２Ｅ、およびＴ１１５Ｌからなる群から選択される。

また、本明細書において、ＣＤ４７抗体が提供され、抗ＣＤ４７ ＶＬは、配列番号３２５に対して少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、または少なくとも７個のアミノ酸置換を示し、アミノ酸置換は、Ａ１０Ｓ、Ｍ１１Ｌ、Ｋ２４Ｒ、Ａ５１Ｅ、Ｎ５２Ｓ、Ｌ５４Ｆ、およびＳ５６Ｄからなる群から選択される。

本発明は、本明細書に記載の抗体を対象とし、抗ＣＤ４７ ＶＬは、配列番号３２５に対して少なくとも７個のアミノ酸置換を示し、アミノ酸置換のうちの７個は、Ａ１０Ｓ、Ｍ１１Ｌ、Ｋ２４Ｒ、Ａ５１Ｅ、Ｎ５２Ｓ、Ｌ５４Ｆ、およびＳ５６Ｄである。

本発明は、本明細書に記載の抗体を対象とし、抗ＣＤ４７ ＶＨは、配列番号３２６に対して、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個のアミノ酸置換を示し、アミノ酸置換は、Ｔ１４Ｐ、Ｑ４３Ｋ、Ａ４４Ｇ、Ｅ５９Ｙ、Ｄ６６Ｇ、Ｍ７６Ｔ、Ｓ８４Ｒ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｓ１０２Ｅ、およびＴ１１５Ｌからなる群から選択される。

本発明は、本明細書に記載の抗体を対象とし、抗ＣＤ４７ ＶＨは、配列番号３２６に対して少なくとも１１個のアミノ酸置換を示し、アミノ酸置換のうちの１１個は、Ｔ１４Ｐ、Ｑ４３Ｋ、Ａ４４Ｇ、Ｅ５９Ｙ、Ｄ６６Ｇ、Ｍ７６Ｔ、Ｓ８４Ｒ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｓ１０２Ｅ、およびＴ１１５Ｌである。

抗ＣＤ４７のＬＣ（配列番号３３５）およびＨＣ（配列番号３３６）は、本明細書に記載の二重特異性実体を構築するための抗ＣＤ４７要素の好ましい供給源であり、特に、ＶＬ（配列番号３１９）およびＶＨ（配列番号３２０）は、それぞれ、ＶＬ ＣＤＲ：配列番号３６５（ＣＤＲＬ１）、配列番号３６６（ＣＤＲＬ２）、および配列番号３６７（ＣＤＲＬ３）、ならびにＶＨ ＣＤＲ：配列番号３６８（ＣＤＲＨ１）、配列番号３６９（ＣＤＲＨ２）、および配列番号３７０（ＣＤＲＨ３）を含む。置換Ａ１０Ｓ、Ｍ１１Ｌ、Ｋ２４Ｒ、Ａ５１Ｅ、Ｎ５２Ｓ、Ｌ５４Ｆ、およびＳ５６Ｄは、ＣＣ－９０００２に関して重要なＶＬ（配列番号３１９）置換であり、低ＣＤ４７結合親和性をもたらし、免疫原性を低下させる。Ｔ１４Ｐ、Ｑ４３Ｋ、Ａ４４Ｇ、Ｅ５９Ｙ、Ｄ６６Ｇ、Ｍ７６Ｔ、Ｓ８４Ｒ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｓ１０２Ｅ、およびＴ１１５Ｌは、ＣＣ－９０００２に関して重要なＶＨ（配列番号３２０）であり、低ＣＤ４７結合親和性（特に、Ｅ５９ＹおよびＳ１０２Ｅ）をもたらし、免疫原性を低下させる。本明細書に別途記載される抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１のＬＣおよびＨＣの定常領域（例えば、それぞれ、配列番号３３９および配列番号３４１）は、特定の実施形態では、ＶＬ（配列番号３１９）およびＶＨ（配列番号３２０）のカルボキシ末端に融合される。抗ＣＤ４７ ＬＣ（配列番号３３５）は、本発明の二重特異性実体の構築に用いることが好ましい。抗ＣＤ４７ ＨＣ（配列番号３３６）は、本発明の二重特異性実体の構築に用いることが好ましい。置換Ｑ１２４Ｅ、Ｌ１３５Ｗ、Ｑ１６０Ｅ、およびＴ１８０Ｅは、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中に適切なＬＣ／ＨＣ対形成を確実にするために重要な配列番号３３５の位置である。置換Ｑ１７９Ｋ、Ｔ３７１Ｖ、Ｔ３８９Ｌ、Ｋ４２０Ｌ、およびＴ４２２Ｗは、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中のホモ二量体形成の傾向を低減するために重要な配列番号３３６の位置である。

本発明はさらに、本明細書に別途記載される抗体を対象とし、抗ＣＤ４７ ＶＬは、配列番号３２５に対して１～３個のアミノ酸置換を示し、抗ＣＤ４７ ＶＬ（配列番号３２５）における少なくとも１個、少なくとも２個、または少なくとも３個のアミノ酸置換は、Ａ１０Ｓ、Ｍ１１Ｌ、およびＫ２４Ｒ（例えば、配列番号３２１）からなる群から選択され、抗ＣＤ４７ ＶＨは、配列番号３２６に対して１～１１個のアミノ酸置換を示し、抗ＣＤ４７ ＶＨ（配列番号３２６）における少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、または少なくとも１１個のアミノ酸置換は、Ｔ１４Ｐ、Ｑ４３Ｋ、Ａ４４Ｇ、Ｅ５９Ｙ、Ｄ６６Ｇ、Ｍ７６Ｔ、Ｓ８４Ｒ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｓ１０２Ｅ、およびＴ１１５Ｌ（例えば、配列番号３２２）からなる群から選択される。

本発明は、本明細書に別途記載される抗体を特に対象とし、抗ＣＤ４７ ＶＨは、配列番号３２６に対して１～１１個のアミノ酸置換を示し、抗ＣＤ４７ ＶＨ（配列番号３２６）における少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、または少なくとも１１個のアミノ酸置換は、Ｔ１４Ｐ、Ｑ４３Ｋ、Ａ４４Ｇ、Ｅ５９Ｙ、Ｄ６６Ｇ、Ｍ７６Ｔ、Ｓ８４Ｒ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｓ１０２Ｅ、およびＴ１１５Ｌ（例えば、配列番号３２２）からなる群から選択される。

抗ＣＤ４７のＬＣ（配列番号３３７）およびＨＣ（配列番号３３８）は、本明細書に記載の二重特異性実体を構築するための抗ＣＤ４７要素の好ましい供給源であり、特に、ＶＬ（配列番号３２１）およびＶＨ（配列番号３２２）は、それぞれ、ＶＬ ＣＤＲ：配列番号３７１、配列番号３７２、および配列番号３７３、ならびにＶＨ ＣＤＲ：配列番号３７４、配列番号３７５、および配列番号３７６を含む。Ａ１０Ｓ、Ｍ１１Ｌ、およびＫ２４Ｒは、低ＣＤ４７結合親和性をもたらし、免疫原性を低下させるための重要なＶＬ（配列番号３２１）位置である。置換Ｔ１４Ｐ、Ｑ４３Ｋ、Ａ４４Ｇ、Ｅ５９Ｙ、Ｄ６６Ｇ、Ｍ７６Ｔ、Ｓ８４Ｒ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｓ１０２Ｅ、およびＴ１１５Ｌは、低ＣＤ４７結合親和性（特に、Ｅ５９ＹおよびＳ１０２Ｅ）をもたらし、免疫原性を低下させる重要なＶＨ（配列番号３２２）位置である。抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１のＬＣおよびＨＣの定常領域（例えば、それぞれ、配列番号３３９および配列番号３４１）は、ＶＬ（配列番号３２１）およびＶＨ（配列番号３２２）のカルボキシ末端に融合される。抗ＣＤ４７ ＬＣ（配列番号３３７）は、本発明の二重特異性実体の構築に用いることが好ましい。抗ＣＤ４７ＨＣ（配列番号３３８）は、本発明の二重特異性実体の構築に用いることが好ましい。置換Ｑ１２４Ｅ、Ｌ１３５Ｗ、Ｑ１６０Ｅ、およびＴ１８０Ｅは、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中にホモ二量体形成の傾向を低減するための重要な配列番号３３７の位置である。置換Ｑ１７９Ｋ、Ｔ３７１Ｖ、Ｔ３８９Ｌ、Ｋ４２０Ｌ、およびＴ４２２Ｗは、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中のホモ二量体形成の傾向を低減するための重要な配列番号３３８の位置である。

本発明は、本明細書に別途記載される抗体を特に対象とし、抗ＣＤ４７ ＶＬは、配列番号３２５に対して１～１０個のアミノ酸置換を示し、抗ＣＤ４７ ＶＬ（配列番号３２５）における少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のアミノ酸置換は、Ａ１０Ｓ、Ｍ１１Ｌ、Ｋ２４Ｑ、Ｋ３９Ｄ、Ｋ４２Ｔ、Ｋ４５Ｑ、Ａ５１Ｅ、Ｎ５２Ｓ、Ｌ５４Ｆ、およびＳ５６Ｄ（例えば、配列番号３１７）からなる群から選択され、抗ＣＤ４７ ＶＨは、配列番号３２６に対して１～１１個のアミノ酸置換を示し、抗ＣＤ４７ ＶＨ（配列番号３２６）における少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、または少なくとも１１個のアミノ酸置換は、Ｔ１４Ｐ、Ａ４４Ｇ、Ｅ５９Ｙ、Ｄ６６Ｇ、Ｍ７６Ｔ、Ｓ８４Ａ、Ｒ８７Ｔ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｓ１０２Ｅ、およびＴ１１５Ｌ（例えば、配列番号３１８）からなる群から選択される。

本発明は、本明細書に別途記載される抗体を特に対象とし、抗ＣＤ４７ ＶＨは、配列番号３２６に対して１～１１個のアミノ酸置換を示し、抗ＣＤ４７ ＶＨ（配列番号３２６）における少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、または少なくとも１１個のアミノ酸置換は、Ｔ１４Ｐ、Ａ４４Ｇ、Ｅ５９Ｙ、Ｄ６６Ｇ、Ｍ７６Ｔ、Ｓ８４Ａ、Ｒ８７Ｔ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｓ１０２Ｅ、およびＴ１１５Ｌ（例えば、配列番号３１８）からなる群から選択される。

抗ＣＤ４７のＬＣ（配列番号３３３）およびＨＣ（配列番号３３４）は、本明細書に記載の二重特異性実体の構築のための抗ＣＤ４７要素の好ましい供給源であり、特に、ＶＬ（配列番号３１７）およびＶＨ（配列番号３１８）は、それぞれ、ＶＬ ＣＤＲ：配列番号３５９、配列番号３６０、および配列番号３６１、ならびにＶＨ ＣＤＲ：配列番号３６２、配列番号３６３、および配列番号３６４を含む。置換Ａ１０Ｓ、Ｍ１１Ｌ、Ｋ２４Ｑ、Ｋ３９Ｄ、Ｋ４２Ｔ、Ｋ４５Ｑ、Ａ５１Ｅ、Ｎ５２Ｓ、Ｌ５４Ｆ、およびＳ５６Ｄは、低ＣＤ４７結合親和性をもたらし、免疫原性を低下させるための重要なＶＬ位置（配列番号３１７）である。置換Ｔ１４Ｐ、Ａ４４Ｇ、Ｅ５９Ｙ、Ｄ６６Ｇ、Ｍ７６Ｔ、Ｓ８４Ａ、Ｒ８７Ｔ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｓ１０２Ｅ、およびＴ１１５Ｌは、低ＣＤ４７結合親和性（特にＥ５９ＹおよびＳ１０２Ｅ）をもたらし、免疫原性を低下させる重要なＶＨ（配列番号３１８）位置である。抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１のＬＣおよびＨＣの定常領域（例えば、それぞれ、配列番号３３９および配列番号３４１）は、ＶＬ（配列番号３１７）およびＶＨ（配列番号３１８）のカルボキシ末端に融合される。抗ＣＤ４７のＬＣ（配列番号３３３）は、本発明の二重特異性実体の構築に使用するために好ましい。抗ＣＤ４７ＨＣ（配列番号３３４）は、本発明の二重特異性実体の構築に用いることが好ましい。置換Ｑ１２４Ｅ、Ｌ１３５Ｗ、Ｑ１６０Ｅ、およびＴ１８０Ｅは、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中のホモ二量体形成の傾向を低減するために重要な配列番号３３３の位置である。置換Ｑ１７９Ｋ、Ｔ３７１Ｖ、Ｔ３８９Ｌ、Ｋ４２０Ｌ、およびＴ４２２Ｗは、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中のホモ二量体形成の傾向を低減するための重要な配列番号３３４の位置である。

本明細書に記載および企図される例示的な抗体は、抗ＣＤ２０のＶＬ ＣＤＲであるＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ（配列番号３５３）、ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号３５４）、およびＱＱＷＴＳＮＰＰＴ（配列番号３５５）、ならびにＶＨ ＣＤＲであるＳＹＮＭＨ（配列番号３５６）、ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号３５７）、およびＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶ（配列番号３５８）を含む。本明細書に別途記載される例示的な二重特異性抗体は、抗ＣＤ２０ ＶＬ（配列番号３２３）およびＶＨ（配列番号３２４）を含む。本明細書に機能的に記載される好ましい種類の二重特異性抗体の例は、抗ＣＤ２０ ＬＣ（配列番号３３１）および抗ＣＤ２０ ＨＣ（配列番号３３２）を含む。

ＣＣ－９０００２に由来する脱調整抗ＣＤ４７ ＶＬ／ＶＨ Ｆａｂの１６１例
本明細書において、親抗体ＣＣ－９０００２に由来する１６１個のＶＬおよびＶＨ Ｆａｂが、さらに提供される。１６１個のＦａｂの各々について、ＶＬアミノ酸配列は、奇数の配列番号１～３２１として提供され、ＶＨアミノ酸誘導配列は、偶数の配列番号２～３２２として提供されている。特定されたＦａｂ（ＶＬ／ＶＨ対）は、各々、隣接する配列番号の対として番号付けされる（すなわち、以下のパターンに従って本明細書に開示される）：配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４などから、配列番号３２１／配列番号３２２まで。

配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３３／配列番号３４、配列番号３５／配列番号３６、配列番号３７／配列番号３８、配列番号３９／配列番号４０、配列番号４１／配列番号４２、配列番号４３／配列番号４４、配列番号４５／配列番号４６、配列番号４７／配列番号４８、配列番号４９／配列番号５０、配列番号５１／配列番号５２、配列番号５３／配列番号５４、配列番号５５／配列番号５６、配列番号５７／配列番号５８、配列番号５９／配列番号６０、配列番号６１／配列番号６２、配列番号６３／配列番号６４、配列番号６５／配列番号６６、配列番号６７／配列番号６８、配列番号６９／配列番号７０、配列番号７１／配列番号７２、配列番号７３／配列番号７４、配列番号７５／配列番号７６、配列番号７７／配列番号７８、配列番号７９／配列番号８０、配列番号８１／配列番号８２、配列番号８３／配列番号８４、配列番号８５／配列番号８６、配列番号８７／配列番号８８、配列番号８９／配列番号９０、配列番号９１／配列番号９２、配列番号９３／配列番号９４、配列番号９５／配列番号９６、配列番号９７／配列番号９８、配列番号９９／配列番号１００、配列番号１０１／配列番号１０２、配列番号１０３／配列番号１０４、配列番号１０５／配列番号１０６、配列番号１０７／配列番号１０８、配列番号１０９／配列番号１１０、配列番号１１１／配列番号１１２、配列番号１１３／配列番号１１４、配列番号１１５／配列番号１１６、配列番号１１７／配列番号１１８、配列番号１１９／配列番号１２０、配列番号１２１／配列番号１２２、配列番号１２３／配列番号１２４、配列番号１２５／配列番号１２６、配列番号１２７／配列番号１２８、配列番号１２９／配列番号１３０、配列番号１３１／配列番号１３２、配列番号１３３／配列番号１３４、配列番号１３５／配列番号１３６、配列番号１３７／配列番号１３８、配列番号１３９／配列番号１４０、配列番号１４１／配列番号１４２、配列番号１４３／配列番号１４４、配列番号１４５／配列番号１４６、配列番号１４７／配列番号１４８、配列番号１４９／配列番号１５０、配列番号１５１／配列番号１５２、配列番号１５３／配列番号１５４、配列番号１５５／配列番号１５６、配列番号１５７／配列番号１５８、配列番号１５９／配列番号１６０、配列番号１６１／配列番号１６２、配列番号１６３／配列番号１６４、配列番号１６５／配列番号１６６、配列番号１６７／配列番号１６８、配列番号１６９／配列番号１７０、配列番号１７１／配列番号１７２、配列番号１７３／配列番号１７４、配列番号１７５／配列番号１７６、配列番号１７７／配列番号１７８、配列番号１７９／配列番号１８０、配列番号１８１／配列番号１８２、配列番号１８３／配列番号１８４、配列番号１８５／配列番号１８６、配列番号１８７／配列番号１８８、配列番号１８９／配列番号１９０、配列番号１９１／配列番号１９２、配列番号１９３／配列番号１９４、配列番号１９５／配列番号１９６、配列番号１９７／配列番号１９８、配列番号１９９／配列番号２００、配列番号２０１／配列番号２０２、配列番号２０３／配列番号２０４、配列番号２０５／配列番号２０６、配列番号２０７／配列番号２０８、配列番号２０９／配列番号２１０、配列番号２１１／配列番号２１２、配列番号２１３／配列番号２１４、配列番号２１５／配列番号２１６、配列番号２１７／配列番号２１８、配列番号２１９／配列番号２２０、配列番号２２１／配列番号２２２、配列番号２２３／配列番号２２４、配列番号２２５／配列番号２２６、配列番号２２７／配列番号２２８、配列番号２２９／配列番号２３０、配列番号２３１／配列番号２３２、配列番号２３３／配列番号２３４、配列番号２３５／配列番号２３６、配列番号２３７／配列番号２３８、配列番号２３９／配列番号２４０、配列番号２４１／配列番号２４２；配列番号２４３／配列番号２４４、配列番号２４５／配列番号２４６、配列番号２４７／配列番号２４８、配列番号２４９／配列番号２５０、配列番号２５１／配列番号２５２、配列番号２５３／配列番号２５４、配列番号２５５／配列番号２５６、配列番号２５７／配列番号２５８、配列番号２５９／配列番号２６０、配列番号２６１／配列番号２６２、配列番号２６３／配列番号２６４、配列番号２６５／配列番号２６６、配列番号２６７／配列番号２６８、配列番号２６９／配列番号２７０、配列番号２７１／配列番号２７２、配列番号２７３／配列番号２７４、配列番号２７５／配列番号２７６、配列番号２７７／配列番号２７８、配列番号２７９／配列番号２８０、配列番号２８１／配列番号２８２、配列番号２８３／配列番号２８４、配列番号２８５／配列番号２８６、配列番号２８７／配列番号２８８、配列番号２８９／配列番号２９０、配列番号２９１／配列番号２９２、配列番号２９３／配列番号２９４、配列番号２９５／配列番号２９６、配列番号２９７／配列番号２９８、配列番号２９９／配列番号３００、配列番号３０１／配列番号３０２、配列番号３０３／配列番号３０４、配列番号３０５／配列番号３０６、配列番号３０７／配列番号３０８、配列番号３０９／配列番号３１０、配列番号３１１／配列番号３１２、配列番号３１５／配列番号３１６、配列番号３１７／配列番号３１８、配列番号３１９／配列番号３２０、および配列番号３２１／配列番号３２２。

示された各対は、それ自体が好ましいものの、本開示はそれらに限定されない。本明細書に開示されるＶＬおよびＶＨの領域種の集団は、別個の対、すなわち、提供されるＶＬおよびＶＨの領域種の集団から選択される多様なＦａｂを形成するために用いることができる。

本明細書に別途機能的に記載される例示的な抗体が提供され、抗ＣＤ４７ ＶＬは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２８５、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９１、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号２９７、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０３、配列番号３０５、配列番号３０７、配列番号３０９、配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１５、配列番号３１７、配列番号３１９、および配列番号３２１からなる群から選択され、ならびに抗ＣＤ４７ ＶＨは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、および配列番号３２２からなる群から選択される。

本発明のＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異性実体の特性
エフェクター抗原ＣＤ４７の細胞外ドメインを用いたインビトロ親和性測定により、最初に、これらのバリアントに対する親和性が１００～２００倍低下したことが明らかになった。ＣＤ４７の細胞外ドメインを用いたインビトロ親和性測定により、バリアントの親和性が１００～５００倍減少することが明らかになった。これらの脱調整ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の二重特異体を用いたインビボおよびインビトロの細胞ベースの研究から、単一特異性抗体と比較して、エフェクターベースの細胞死滅および非標的細胞型への結合の減少を確認した。抗ＣＤ２０ ＶＬ：配列番号３２３、抗ＣＤ２０ ＶＨ：配列番号３２４。抗ＣＤ２０ ＬＣ定常領域は、配列番号３４３である。抗ＣＤ２０ ＨＣ定常領域は、配列番号３４５である。

本明細書に記載され、例示され、特許請求される二重特異性実体は、ＣＤ２０発現細胞への選択的結合を示し、例えば、ＣＤ４７とマクロファージチェックポイント阻害剤であるシグナル制御タンパク質α（ＳＩＲＰα）との相互作用が阻害される。単一特異性抗ＣＤ４７のアプローチよりも増加したこの選択性は、ＩｇＧ１ Ｆｃの使用を可能にし、活性化断片である結晶化可能なγ受容体（ＦｃγＲ）に関与して、マクロファージを完全に増強させて、ＣＤ２０陽性細胞を貪食させ、破壊する。例えば、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブと比較して、本明細書に記載および例示される抗ＣＤ４７／抗ＣＤ２０二重特異性抗体は、インビトロでの貪食およびＡＤＣＣの誘導においてより強力である。

インビトロの細胞ベースの研究は、本明細書に記載の脱調整ＣＤ４７二重特異性実体が、抗体依存性細胞貪食、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化することを実証する。図４Ａ～図４Ｃおよび図５Ａ～図５Ｃを参照されたい。さらに、カニクイザル（ｃｙｎｏ）の薬物動態（ＰＫ）および探索的毒性（Ｅ－ｔｏｘ）試験の実験は、脱調整ＣＤ４７二重特異体が、親の単一特異性抗ＣＤ４７抗体と比較して、Ｂ細胞を効果的に枯渇させ、カニクイザル赤血球（ＲＢＣ）への結合を低減させた。それによって、本明細書に記載および特許請求される標的細胞の選択性戦略の成功および医学的価値が、実質的に確認された。本明細書に例示される種は、非ヒト霊長類への複数回の投与後、血液学的パラメータに見られる最小限の有害な作用を伴うＣＤ２０⁺Ｂ細胞の好ましい薬物動態および枯渇を示す。

特定の実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異体は、ＴＰＰ－１３６０、ＴＰＰ－１３６１、ＴＰＰ－１３６７、およびＴＰＰ－１３６２と称され、以下のような重鎖配列および軽鎖配列を含む：ＴＰＰ－１３６０は、（ＣＤ４７ ＬＣ配列番号３３５、ＨＣ配列番号３３６）×（ＣＤ２０ ＬＣ配列番号３３１、ＨＣ配列番号３３２）を含む。ＴＰＰ－１３６１は、（ＣＤ４７ ＬＣ配列番号３３３、ＨＣ配列番号３３４）×（ＣＤ２０ ＬＣ配列番号３３１、ＨＣ配列番号３３２）を含む。ＴＰＰ－１３６７は、（ＣＤ４７ ＬＣ配列番号３３７、ＨＣ配列番号３３８）×（ＣＤ２０ ＬＣ配列番号３３１、ＨＣ配列番号３３２）を含む。ＴＰＰ－１３６２は、（ＣＤ４７ ＬＣ配列番号３８５、ＨＣ配列番号３８６）×（ＣＤ２０ ＬＣ配列番号３３１、ＨＣ配列番号３３２）を含む。

ＴＰＰ－１３６２に関して、ＣＤ４７ ＶＬは、配列番号３８３を含む。ＴＰＰ－１３６２のＣＤ４７ ＶＨは、配列番号３８４を含む。ＴＰＰ－１３６２のＣＤ４７ ＶＬ ＣＤＲは、配列番号３７７（ＣＤＲＬ１）、配列番号３７８（ＣＤＲＬ２）、および配列番号３７９（ＣＤＲＬ３）を含む。ＴＰＰ－１３６２のＣＤ４７ ＶＨ ＣＤＲは、配列番号３８０（ＣＤＲＨ１）、配列番号３８１（ＣＤＲＨ２）、および配列番号３８２（ＣＤＲＨ３）を含む。

本明細書に別途記載される属内の一連の二重特異性実体の例は、一般に、属の治療価値を示す薬理学的特徴を示すことが実証される。
これらの高く評価された種は、例えば、ＣＤ２０に対する高い親和性およびＣＤ４７に対する脱調整親和性を示し、有効なＣＤ４７遮断、カニクイザル（ｃｙｎｏ）－交差反応性、良好な物理化学的特性（溶解性、安定性、発現）、および低免疫原性予測（ＥｐｉＶａｘ）を示す。実施例１３、図１８を参照されたい。ＩｇＧ１ヘテロ二量体形式およびＦｃは、標準的なＣＨＯプロセスを使用して、十分な量および純度で信頼性の高い産生を付与し、相適切な力価、収率、製品品質および液体組成を有する。これらの高く評価された例示的な種は、ＣＣ－９０００２よりも優れたＣＤ２０⁺腫瘍細胞のインビトロ貪食能を示し、リツキシマブよりも強力なＡＤＣＣを示す。これらの高く評価された例示的な種はまた、末梢血およびリンパ組織におけるカニクイザルＢ細胞の顕著な減少を示す。これらの高く評価された例示的な種はまた、ＣＤ２０^-ＣＤ４７⁺健常な細胞（ＲＢＣおよび血小板）への結合を伴わない最小限のシンク効果を示す。これらの高く評価された例示的な種はまた、例えば、毎週の投薬を支持する許容されるＰＫパラメータを示す。

例えば、ＴＰＰ－１３６０のＲＢＣ結合能を、精製されたヒトＲＢＣにおいて、およびヒトＲＢＣの腫瘍細胞との共培養において、広範に評価された。図８に示されるように、ＴＰＰ－１３６０は、ＣＤ４７^+/ＣＤ２０⁺のＲａｊｉ細胞に選択的に結合するが、ＣＤ４７⁺／ＣＤ２０^-のヒトＲＢＣには結合しないことが実証される。さらに、Ｒａｊｉ細胞とヒトＲＢＣの共培養では、ＴＰＰ－１３６０は、ＣＤ４７⁺／ＣＤ２０⁺Ｒａｊｉ細胞に対して用量依存的な結合を示したが、ヒトＲＢＣに対しては１ｍｇ／ｍＬの高い濃度でさえも結合を示さなかった。図９を参照されたい。むしろ、ＣＤ４７野生型／ＣＤ２０二重特異性ＴＰＰ－２は、Ｒａｊｉ細胞およびヒトＲＢＣの両方に有意に結合した。さらに、ＴＰＰ－１３６０は、複数のドナーから精製されたカニクイザルＲＢＣへの結合を示さない。

本開示の例示的な種類の二重特異性実体であるＴＰＰ－１３６０は、ＣＤ４７およびＣＤ２０を共標的とするファースト・イン・クラス抗体であり、ＣＤ２０には高親和性で結合し、ＣＤ４７には最適に脱調整された親和性で結合するように設計されている。ＣＤ２０発現細胞に結合した場合、例えば、ＴＰＰ－１３６０は、マクロファージチェックポイント阻害剤のＳＩＲＰαとＣＤ４７との相互作用を遮断するだけでなく、ＦｃγＲの活性化に関与して、マクロファージを完全に増強させて、ＣＤ２０陽性細胞を貪食させ、破壊する。潜在的なインビトロ活性は、ＴＰＰ－１３６０によって、例えば、貪食、ＡＤＣＣ、およびＣＤＣを含む複数の作用様式を介してがん細胞を排除するように誘導される。本明細書に記載の二重特異性実体の例であるＴＰＰ－１３６０は、リツキシマブおよびＣＣ－９０００２を上回る増強された薬理学的活性を提供する。

本明細書に記載され、特許請求されるＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異性実体は、単剤としてのリツキシマブまたはＣＣ－９０００２と比較して、強化された貪食を示す。本明細書に記載のＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異性実体の貪食活性は、概して、それらのＣＤ４７結合親和性と相関する。本明細書に記載のＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異性実体は、貪食を誘導する際、単剤活性が、ＣＣ－９０００２とリツキシマブの組み合わせと同等である。

本明細書に記載のＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異性実体は、単剤抗ＣＤ４７活性と比較して、リツキシマブ感受性および耐性の腫瘍細胞において改善されたＡＤＣＣを示す。

本明細書に記載のＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異性実体は、Ｒａｊｉ ＮＯＤ－ＳＣＩＤモデルにおいて、インビボでリツキシマブよりも優れた有効性を示す。実施例１５を参照されたい。

ＴＰＰ－１３６０は、リツキシマブを上回る貪食およびＡＤＣＣ活性の両方を増強する。加えて、ＴＰＰ－１３６０および本明細書に記載され、例示され、および特許請求される関連する二重特異性実体は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ製のＲＥＧＮ１９７９またはＲｏｃｈｅ製のモスネツズマブ（現在、臨床使用）などのＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーとは差別化される。それは、Ｔ細胞活性化と比較して、貪食、ＡＤＣＣ、およびＣＤＣを含む異なる作用様式を有するためである。さらに、毒性プロファイルも、ＣＤ２０×ＣＤ３とは異なる（潜在的な血液毒性、対してサイトカイン放出症候群）。特に、Ｔ細胞エンゲージャーは、強力な免疫エンゲージャーであり、非常に低いレベルの標的抗原を発現する非標的細胞のアポトーシスを引き起こす可能性があり、したがって、標的抗原は、極めて特異的であるか、または二重特異性の抗標的アームは、マスキング技術を用いるか、または正常組織および疾患組織上の標的抗原の発現レベル間を区別するように調整する必要がある。さらに、二重特異性の抗ＣＤ３部分は、Ｔ細胞の全身活性化によるサイトカイン放出を防止するために正確に調整される必要がある。重要なことに、ＴＰＰ－１３６０は、本明細書の代表例として、非ヒト霊長類への複数回の投与後の血液学的パラメータに見られる最小限の有害な作用を伴う有利な除去動態を示す。本発明のＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異性抗体は、とりわけ、Ｂリンパ腫患者、例えば、難治性および／または現在の療法に耐性の患者の静脈内（ＩＶ）注射治療として開発される。

本明細書に記載の二重特異性実体は、これらに限定されないが、異常増殖を起こしている細胞、血液腫瘍状態、血液悪性腫瘍、リンパ増殖性障害、Ｂ細胞障害、Ｂ細胞悪性腫瘍、および／またはＢ細胞リンパ腫を含む腫瘍、腫瘍細胞、がんの治療方法および／または抑制方法を提供する。本発明の二重特異性実体は、抗体の最新技術に従って、治療実体として製剤化され、投与される。例えば、ＩｇＧ１抗体の製剤化および投与の標準は、当該技術分野で周知である。本明細書に記載の抗体は、例えば、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞リンパ腫の患者の静脈内（ＩＶ）注射治療として投与される。本発明は、腫瘍細胞を抑制する方法を対象とし、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に記載の二重特異性実体を投与することを含む。腫瘍細胞は、がん細胞を指し、異常増殖を起こしている細胞、血液腫瘍状態、血液悪性腫瘍、リンパ増殖性障害、Ｂ細胞障害、Ｂ細胞悪性腫瘍、およびＢ細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されない。

本明細書に記載のＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異性実体は、特に、Ｂ細胞障害またはＢ細胞悪性腫瘍の治療方法で用いられるように提供され、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に記載の二重特異性実体を投与することを含む。

アロメトリーおよびヒト薬物動態は、本明細書に記載の二重特異性実体について評価される。本発明の実体は、脱調整ＣＤ４７結合アームと、規則的なＣＤ２０（リツキシマブ）結合アームとを含む。ＣＤ４７アームの脱調整された結合親和性を考慮すると、二重特異性実体に対する標的媒介性薬物消失（ＴＭＤＤ）は、潜在的に主にＣＤ２０結合によって駆動される。したがって、特定の実施形態では、臨床用量は、現在リツキシマブに使用されている用量の範囲内である。カニクイザルにおける１０、２０、および１００ｍｇ／ｋｇの用量に基づいて、終末相半減期は約７日である。ＣＤ２０媒介性ＴＭＤＤは、リツキシマブの追加の前臨床データおよび臨床データに基づく。ファースト・イン・ヒューマン臨床試験は、非盲検多施設第１／１ｂ相試験であり、リツキシマブおよび／または他のＣＤ２０標的療法で進行した再発性または難治性のＣＤ２０＋ ＮＨＬを有する対象の安全性と耐容性を評価する。用量漸増は、１ｍｇ／ｋｇ未満で開始し、次いで、リツキシマブの現在の臨床用量である１０ｍｇ／ｋｇに漸増する。カニクイザルに、２０ｍｇ／ｋｇを２回、１日目および１５日目に投薬した。本明細書に記載の二重特異性実体は、用量に比例した曝露を伴うＮＨＰ ｅＴＯＸ試験において、単剤として良好な耐容性を示すことが見出されている。本明細書に記載の二重特異性実体の哺乳動物またはヒトの用量は、約３ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。本明細書に記載の二重特異性実体のさらなる哺乳動物またはヒトの用量は、特に、約５ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。また、本明細書に記載の二重特異性実体の哺乳動物またはヒトの用量は、約７ｍｇ／ｋｇ～約１３ｍｇ／ｋｇである。本明細書に記載の二重特異性実体の投薬レジメンは、約５日に１回、または約１週間（７日）に１回、または約１０日に１回、または約２週間に１回である。

本明細書に記載の二重特異性抗体の製造プロセスは、典型的なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）製造プラットフォームに従ってもよい。これらの二重特異性抗体の精製において観察される一般的な混入物質は、半抗体であり、除去するために特定の精製プロトコルを必要とする。チャイニーズハムスター卵巣細胞における４本鎖二重特異性の発現後、プロテインＡを、ＩｇＧベースの二重特異性を精製するための最初のステップとして使用する。この第１のステップに続いて、概して、所望の４本鎖二重特異性抗体および半抗体という２つの種類が存在する。ほとんどの場合、イオン交換クロマトグラフィーはこれら２種類を分離するのに十分であるが、他の場合は、疎水性相互作用クロマトグラフィーが必要とされ得る。ＬＣの正しいペアリングは、質量分析によって評価され、イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの追加のタンパク質精製方法によってミスアセンブリの不純物を除去する必要がある。二次精製アプローチのいずれかに従い、調製サイズの排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、４本鎖二重特異体を緩衝液交換しながら、立体構造の均一性を研磨し、確保することができる。最終的な品質管理は、二重特異体の立体構造および化学的完全性を確実にするために、分析ＳＥＣ、質量分析、および異なる抗原とのインビト結合評価を含むべきである。例えば、Ｊ．Ｂ．Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１、Ｋ．Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２０１０）１９６３７－１９６４６を参照されたい。本明細書に記載のＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体の好ましい単量体要素は、各々、上で論じた特定のＬＣおよびＨＣの定常領域配列を含み、ＩｇＧ１ １＋１ヘテロ二量体形式の産生中にホモ二量体形成の傾向を低減するために本明細書で特定される。

実施例１：ＣＣ－９０００２の脱調整
非脱調整親バージョンＣＣ－９０００２（４０８＿４３７）の抗ＣＤ４７アームの親和性を低減するための合理的な設計は、ＣＤ４７の細胞外ドメインに結合した抗ＣＤ４７ Ｆａｂの結晶構造により可能になった。ＣＣ－９０００２が結合したエピトープは、ヒトＣＤ４７に結合した元のマウス抗ＣＤ４７ ２Ａ１のエピトープと同一である。米国特許第９，０４５，５４１号を参照されたい。

２Ａ１の可変ドメインをヒト化し、ＨＣ＿２．３ＱとＬＣ＿Ｎからなる最終抗体を「ＱＮ」と命名し、最終的に、ＩｇＧ４Ｐ／Ｅ形式（ＣＣ－９０００２）として開発した。無細胞発現を改善するために、可変重ドメインに残基を導入することによって、ＱＮをさらに修飾した。このＨＣバリアントは、「ＨＣ＿Ｑ＿５＿ＭＵＴ」と命名された。ＨＣ＿Ｑ＿５＿ＭＵＴ ＨＣおよびＬＣ＿Ｎを、インシリコモデリングおよび免疫原性のインシリコ予測を使用して、それらの免疫原性を低減するためにさらに修飾した。これらは、「ＣＤ４７ ２．０」と総称される。ＣＤ４７ ２．０ ＬＣ＿１１４７＿２およびＣＤ４７ ２．０ ＨＣ＿４３４の可変重ドメインおよび可変軽ドメインにおけるさらなるバリアントを、薬物動態を改善するために設計した。これらは、「ＣＤ４７３．０」と称される。ＷＯ２０１６／１０９４１５（ＵＳ２０１７／０３６９５７２）、ＷＯ２０１８／００９４９９（ＵＳ２０１９／０２４１６５４）、およびＷＯ２０１８／１８３１８２を参照されたい（それらの各々は、参照により本明細書に援用される）。

抗ＣＤ４７エピトープは大きな表面積を覆い、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）の両方からの残基が相互作用に関与する。

ＣＤ４７に対する抗ＣＤ４７アームの親和性を低減するために、ＬＣおよびＨＣの両方からのＣＤ４７相互作用残基を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）モデリングプログラムからの「残基スキャン」モジュールを使用して、インシリコ変異誘発に供した。このプロセスで、広範囲の予測される親和性を有する数千のバリアントのライブラリが作成された。インシリコＦａｂバリアントの各々をモデル化して、安定性（ｄＳｔａｂｉｌｉｔｙ）の予測される変化またはＣＤ４７ ＥＣＤ（ｄＡｆｆｉｎｉｔｙ）に対する親和性の変化を計算した。正のｄＡｆｆｉｎｉｔｙスコア（親Ｆａｂと比較して低い親和性を有すると予測される）および負のｄＳｔａｂｉｌｉｔｙ（親Ｆａｂよりも高い安定性を有すると予測される）を有する５，０００を超えるバリアントを、免疫原性評価ソフトウェアを使用して分析し、低い免疫原性を有すると予測されるバリアントを特定した。これらのうち、１０ｎＭ～１ｍＭの範囲のＣＤ４７についての予測Ｋｄを有する１４３個の免疫原性のリスクが低いＦａｂバリアントを、細胞ベースの試験用に選択した。

標的細胞選択性の抗ＣＤ４７ Ｆａｂをスクリーニングするために、選択された抗ＣＤ４７ Ｆａｂバリアントを、ＩｇＧ１融合物として構築し、セツキシマブ由来の抗ＥＧＦＲアームと対形成させた。４本鎖二重特異体の適切なアセンブリは、本明細書に記載のＦａｂ置換およびＦｃ置換がすべての４本鎖に存在することによって可能になった。１４３個の選択されたバリアントを含む４本鎖二重特異体をＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞で一過的に発現させ、磁気プロテインＡビーズを使用して単一ステップで二重特異体を精製した。標的細胞選択性の二重特異体を特定するために、バリアントを２つの実験で試験した。第１の実験は、脱調整抗ＣＤ４７×抗ＥＧＦＲ二重特異体が、ＣＤ４７抗原を発現するがＥＧＦＲ抗原を発現しない非標的Ｒａｊｉ細胞株に結合する能力を測定した。第２の実験は、脱調整抗ＣＤ４７×抗ＥＧＦＲ二重特異体が、ＣＤ４７抗原およびＥＧＦＲ抗原を発現する標的Ｆａｄｕ細胞株へのＳＩＲＰαの結合を遮断する能力を測定した。これらの実験から、非標的ＣＤ４７＋／ＥＧＦＲ－Ｒａｊｉ細胞株に対する親和性が、非脱調整抗ＣＤ４７×抗ＥＧＦＲ親抗体と比較して１０倍～２０倍低下したが、それでもＣＤ４７＋／＋ＥＧＦＲＦａｄｕ標的細胞株へのＳＩＲＰαの結合を７５～９０％遮断することができた８個のバリアントのセットが得られた。

同様に、リツキシマブの抗ＣＤ２０アームを、ＩｇＧ１ Ｆｃを使用して、８つの脱調整抗ＣＤ４７バリアントと対形成させた。脱調整ＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異体は、非脱調整ＣＤ４７×ＣＤ２０親抗体と比較して、ＣＤ４７＋／ＣＤ２０－非標的Ｆａｄｕ細胞株への結合を低下させたが、それでもＣＤ４７およびＣＤ２０陽性である標的Ｒａｊｉ細胞株へのＳＩＲＰαの結合を７５～９０％遮断し得たことが観察された。

バリアントのさらなる開発可能性の評価は、カニクイザルにおける薬物動態試験用の、３つのＣＣ－９０００２由来のフレームワークにクローニングされた単一の抗ＣＤ４７ ＦａｂバリアントＶＨ Ｅ５９Ｙ／Ｓ１０２Ｅの選択につながった：ＴＰＰ－１３６７、ＴＰＰ－１３６０、およびＴＰＰ－１３６１。

実施例２：本明細書に記載の二重特異性実体のＳＰＲ結合の結果の概要
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を使用して、ＴＰＰ－１３６０およびＴＰＰ－１３６２のＣＤ４７に対する親和性を測定した。これらの２つの抗体を、ヒトＣＤ４７およびカニクイザルＣＤ４７への結合について試験し、マウスＣＤ４７には結合しないことが見出された。ＴＰＰ－１３６０は、Ｋｄが１．７μＭのヒトＣＤ４７ ＥＣＤに対する親和性を有することが測定され、これは、親抗ＣＤ４７結合剤と比較して、約３５０倍の親和性の低下を反映する。カニクイザルＣＤ４７ ＥＣＤに対するＴＰＰ－１３６０の親和性は、Ｋｄが４．５１μＭであることが見出された。ＴＰＰ－１３６２を測定すると、Ｋｄが０．７９６μＭのヒトＣＤ４７ ＥＣＤに対する親和性を有することが測定され、これは、親抗ＣＤ４７結合剤と比較して、約１５０倍の親和性の低下を反映する。カニクイザルＣＤ４７ ＥＣＤに対するＴＰＰ－１３６２の親和性は、Ｋｄが２．０６μＭであることを見出した。最後に、測定された親和性に加えて、サンドイッチＳＰＲアッセイにより、ＣＤ４７およびＣＤ２０の両方に同時に結合したことが実証された。

実施例３：例示的な二重特異性実体の結合およびＳＩＲＰα遮断の用量反応
様々なＣＤ２０を発現する非ホジキンリンパ腫の腫瘍細胞株に対するヒトＳＩＲＰαの結合のＴＰＰ－１３６０およびＴＰＰ－１３６２遮断に関する用量反応曲線を生成した。細胞株を、いずれかの二重特異体の濃度を増加させながらインキュベートし、次いでヒトＳＩＲＰαを飽和濃度で添加した。二重特異性に加えて、リツキシマブおよび親抗ＣＤ４７結合剤（ＩｇＧ１を有する４０８＿４３７であるＴＰＰ－２３）を参考のために含めた。細胞を洗浄し、次いで二次抗体とインキュベートして、腫瘍細胞に結合したＳＩＲＰαの量を測定した。細胞株ＯＣＩ－Ｌｙ３（ＤＬＢＣＬ細胞株）の場合、ＴＰＰ－１３６０は、ＥＣ５０＝１．３０ｎＭを有することが見出され、ＴＰＰ－１３６２は、ＥＣ５０＝０．７０ｎＭを有することが見出された。Ｒａｊｉ細胞株（Ｂリンパ球バーキットリンパ腫細胞株）の場合、ＴＰＰ－１３６０は、ＥＣ５０＝１．６４ｎＭを有することが見出され、ＴＰＰ－１３６２は、ＥＣ５０＝１．１０ｎＭを有することが見出された。図２１に示されるように、親抗ＣＤ４７、ＴＰＰ－２３は、ＯＣＩ－Ｌｙ３細胞へのヒトＳＩＲＰαの結合を遮断するのに０．１１ｎＭのＩＣ₅₀を有することが見出された。リツキシマブは、ＳＩＲＰαの結合に対して効果がなかった。

実施例４：貪食に対する用量反応
種々のＣＤ２０発現非ホジキンリンパ腫腫瘍細胞株に対する貪食のＴＰＰ－１３６０およびＴＰＰ－１３６２活性化の用量反応曲線を生成した。ヒト単球をマクロファージに分化させ、次いで、腫瘍細胞株に添加し、いずれかの二重特異体の濃度を増加させながらインキュベートした。二重特異性実体に加えて、リツキシマブおよび親抗ＣＤ４７結合剤（ＴＰＰ－２３）を参考のために含めた。マクロファージおよび腫瘍細胞の蛍光標識を使用して、画像ベースの定量法を使用して貪食事象の数を測定した。ＯＣＩ－Ｌｙ３細胞株の場合、ＴＰＰ－１３６０は、ＩＣ５０＝１．４ｎＭを有することが見出され、ＴＰＰ－１３６２は、ＩＣ５０＝０．４３ｎＭを有することが見出された。Ｒａｊｉ細胞株の場合、ＴＰＰ－１３６０は、ＩＣ５０＝１．８ｎＭを有することが見出され、ＴＰＰ－１３６２は、ＩＣ５０＝０．３７ｎＭを有することが見出された。

実施例５：ヒトおよびカニクイザルのＲＢＣとの結合試験および血球凝集
ヒトおよびカニクイザルのＲＢＣに対する特定の二重特異性実体例の結合を決定し、それらの非標的細胞に結合する可能性を評価した。ＲＢＣを全血から単離し、例示的な二重特異体の濃度を増加させながらインキュベートした。結合は、２μｇ／ｍｌの親抗ＣＤ４７結合剤（ＴＰＰ－２３）で観察される結合量のパーセンテージとして表された。２００μｇ／ｍｌでは、ＴＰＰ－１３６０およびＴＰＰ－１３６１は、親抗ＣＤ４７結合について見られた結合の１％未満で、ヒトＲＢＣに結合した。同様に、２００μｇ／ｍｌでは、ＴＰＰ－１３６０は、親抗ＣＤ４７結合について見られた結合の１％未満で、カニクイザルＲＢＣに結合した。２００μｇ／ｍｌでのカニクイザルＲＢＣに対するＴＰＰ－１３６２の結合の場合、より高度の結合が観察され、親抗ＣＤ４７結合剤の２～３％の結合が示された。最後に、両方のリードの親抗ＣＤ４７結合剤は、２００μｇ／ｍｌでは、ヒトＲＢＣの血球凝集を示さなかった。同様に、ＴＰＰ－１３６０およびＴＰＰ－１３６１の両方とも、２００μｇ／ｍｌでは、血球凝集を示さなかった。既知の血液凝集性の抗体であるＢＲＩＣ６を、陽性対照として使用した。

実施例６：ヒトＰＢＭＣおよび全血への結合試験
本明細書に記載の二重特異性実体種のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）への結合を評価した。親抗ＣＤ４７結合剤であるＴＰＰ－２３およびリツキシマブと比較して、ＴＰＰ－１３６０二重特異体は、すべての細胞型に対してより少ない結合を示したが、例外として、Ｂ細胞は、抗ＣＤ２０ Ｆａｂ部分の存在により有意な結合を示した。

実施例７：第１ラウンドのリードのカニクイザルＰＫ
本明細書に記載の二重特異性実体種の例を用いて、カニクイザルＰＫ実験を行った。カニクイザルに、２０ｍｇ／ｋｇを２回、１日目および１５日目に投薬した。Ｂ細胞の枯渇が観察された。これらの研究から、ＴＰＰ－１３６０およびＴＰＰ－１３６２を、実施例８に記載されるように、カニクイザル探索的毒性（Ｅ－ｔｏｘ）試験におけるさらなる研究のために選択した。

実施例８：第２ラウンドのリードのカニクイザルＥ－ｔｏｘ
ＴＰＰ－１３６０およびＴＰＰ－１３６２を用いて、カニクイザルＥ－ｔｏｘ実験を行った。ＴＰＰ－１３６０の場合、カニクイザルに、１００、２０、および１０ｍｇ／ｋｇで、週１回、２週間投薬し、２週間の非投薬期間がそれに続いた。第２のＴＰＰ－１３６０アームは、１０ｍｇ／ｋｇを週２回、２週間にわたって試験し、２週間の非投薬期間もそれに続いた。ＴＰＰ－１３６２の場合、カニクイザルに、６０、２０、および１０ｍｇ／ｋｇで、週１回、２週間投薬し、２週間の非投薬期間がそれに続いた。第２のＴＰＰ－１３６２アームは、１０ｍｇ／ｋｇを週２回、２週間試験し、２週間の非投薬期間、２０ｍｇ／ｋｇで１日目および１５日目に２回もそれに続いた。これらの研究で、ＴＰＰ－１３６０が良好な耐容性を示し、深いＢ細胞枯渇を示し、用量に比例した曝露を達成することが示された。したがって、シンクが回避され、標的細胞選択的であることが確認された。

実施例９：インビトロ薬理学
Ａ．ヒト全血結合
ＴＰＰ－１３６０の特異性を評価するために、その結合プロファイルを、フローサイトメトリーを使用して、最初に全血で評価した。２つのドナーにわたって、２００ｎＭのＴＰＰ－１３６０は、結合シグナルをＢ細胞へとシフトさせ、むしろＴ細胞、単球、およびＮＫ細胞には実質的に弱くシフトさせ、血小板または赤血球への結合は最小限であるかもしくは全くなかった。それによって、ヒト全血中のＢ細胞への選択的結合が示された。図７を参照されたい。

図７は、二重特異性ＴＰＰ－１３６０が、例えば、主にＢ細胞に結合し、列挙された他の細胞型には非常に少量の結合を伴うことを示す（おそらく血液細胞上で見出されるものよりも高いレベルのＣＤ４７のためか、またはＮＫ細胞および単球上で発現されるＦｃ受容体を関与させ得るＦｃの寄与のためである）。逆に、高親和性ＣＤ４７単一特異性抗体であるＴＰＰ－２３は、ＣＤ４７の遍在的な発現およびＴＰＰ－２３に見出されるＣＤ４７に対する高親和性により、これらの細胞型のすべてに結合する。

ヒト全血におけるＴＰＰ－１３６０の全体的な結合プロファイルは、リツキシマブと同様である。逆に、親ＣＤ４７ｍＡｂであるＴＰＰ－２３は、ＣＤ４７発現用の対照として使用され、ヒト血液中のすべての細胞集団に有意に結合した。

Ｂ．腫瘍細胞の結合
さらに、例えば、ＴＰＰ－１３６０のＲＢＣ結合能を、精製ヒトＲＢＣにおいて、およびヒトＲＢＣと腫瘍細胞との共培養において広範に評価した。図８に示されるように、ＴＰＰ－１３６０は、ＣＤ４７⁺／ＣＤ２０⁺Ｒａｊｉ細胞に選択的に結合したが、ＣＤ４７⁺／ＣＤ２０^-ヒトＲＢＣには結合しなかった。さらに、Ｒａｊｉ細胞とヒトＲＢＣの共培養では、ＴＰＰ－１３６０は、ＣＤ４７⁺／ＣＤ２０⁺Ｒａｊｉ細胞に対して用量依存的な結合を示したが、ヒトＲＢＣに対しては１ｍｇ／ｍＬの高い濃度でさえも結合を示さなかった。図９を参照されたい。むしろ、親ＣＤ４７型／ＣＤ２０二重特異体であるＴＰＰ－２は、Ｒａｊｉ細胞とヒトＲＢＣの両方に有意に結合した。さらに、ＴＰＰ－１３６０は、複数のドナーから精製されたカニクイザルＲＢＣへの結合を示さない。

Ｃ．ＳＩＲＰαの競合
ＣＤ２０⁺／ＣＤ４７⁺細胞への選択的結合を実証した後、インビトロ競合アッセイを使用して、細胞表面ＣＤ４７とのヒトＳＩＲＰαの相互作用を拮抗するＴＰＰ－１３６０の能力を評価した。ＴＰＰ－１３６０は、ＣＤ２０⁺／ＣＤ４７⁺リンパ腫細胞株であるＯＣＩ－Ｌｙ３およびＲａｊｉの表面で発現されるヒトＣＤ４７に対する組換えヒトＳＩＲＰα－Ｆｃの結合を強力に遮断し、平均ＥＣ５０値は、それぞれ１．３０ｎＭおよび１．６４ｎＭであった。図１０および図１１を参照されたい。図１０は、ＴＰＰ－１３６０が、例えば、ＣＤ２０⁺／ＣＤ４７⁺リンパ腫細胞株ＯＣＩ－Ｌｙ３の表面に発現されるヒトＣＤ４７に対する組換えヒトＳＩＲＰα－Ｆｃの結合を、強力かつ完全に遮断したことを示す。図１１は、ＴＰＰ－１３６０が、例えば、ＣＤ２０⁺／ＣＤ４７⁺リンパ腫細胞株Ｒａｊｉの表面で発現されるヒトＣＤ４７に対する組換えヒトＳＩＲＰα－Ｆｃ結合を、強力かつ完全に遮断したことを示す。対照的に、リツキシマブも、対照二重特異性抗体ＴＰＰ－１４８０（抗ＣＤ２０／ニワトリ卵リゾチーム）も、同じ細胞株に結合するヒトＳＩＲＰα－Ｆｃと競合することはできなかった。本明細書に提示されるデータはまた、ヒトＳＩＲＰα－ＣＤ４７相互作用を遮断するＴＰＰ－１３６０の効力が、ＴＰＰ－２３よりも低いことも実証し、ヒトＣＤ４７に対するＴＰＰ－１３６０の減弱した親和性と一致する。

実施例１０：機能活性：ヒトマクロファージ貪食
この実施例は、腫瘍貪食を誘発するＴＰＰ－１３６０の能力を実証し、標識されたマクロファージの中の「食べられた」ＣＤ２０⁺ＣＤ４７⁺腫瘍細胞を自動的にカウントすることによってインビトロで決定される。

ＣＤ２０およびＣＤ４７の発現は、最初に、フローサイトメトリーアッセイ（Ｄｅｎｎｙ ＴＮ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．１９９６ Ｄｅｃ；２６（４）：２６５－７４）を使用して、抗体結合能（ＡＢＣ）を定量することによって、各標的腫瘍細胞株（ＯＣＩ－Ｌｙ３、Ｒａｊｉ、ＲＥＣ－１、およびＲＩＶＡ）で検証された。４つの細胞株はいずれも、高レベルのＣＤ４７およびＣＤ２０を発現する。
表１：リンパ腫細胞表面のＣＤ４７およびＣＤ２０の抗原発現

ＡＢＣ＝抗体結合能。

次に、滴定した抗体を、予め分化させたマクロファージに加え、続いてＴＰＰ－１３６０でオプソニン化されたカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＳＦＥ）で標識された腫瘍細胞と共培養した。貪食活性は、標識マクロファージ内の標識された腫瘍細胞の数によって定量的に決定された。緑色強度（ＣＦＳＥ）を、ＣＤ１４アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識マクロファージの各々において測定し、閾値ゲートを使用して、ＣＦＳＥ陽性マクロファージを同定した。実験にわたって、数百ＭＦＩ（平均蛍光強度）以下の分散を有する約１０００ＭＦＩの閾値を観察した。各試料について、計算された貪食のパーセンテージは、［（ＣＦＳＥ陽性マクロファージの数）／（マクロファージの総数）］×１００として決定された。少なくとも２つのドナーにわたって、ＴＰＰ－１３６０による処理は、４つのＣＤ２０⁺悪性Ｂ細胞株のマクロファージ媒介性貪食を誘導した。１つのドナーからの代表的なデータを、図１２（Ｒａｊｉ細胞）、図１３（ＯＣＩ－Ｌｙ３細胞）、図１４（ＲＥＣ－１細胞）、および図１５（ＲＩＶＡ細胞）に示す。曲線下面積を計算し、続いて対応のあるｔ検定を行い、リツキシマブと比較したＴＰＰ－１３６０の統計的有意性を決定した。図１６を参照されたい。データは、ＴＰＰ－１３６０による処理が、ＲａｊｉおよびＯＣＩ－Ｌｙ３細胞において、リツキシマブよりも顕著に効率的な貪食を引き起こしたことを実証し、ＴＰＰ－１３６０によるＳＩＲＰα－ＣＤ４７相互作用の同時の遮断およびＦｃγＲなどの活性化受容体の関与に起因する可能性が高い。

実施例１１：薬物動態
二重特異性実体（本明細書に記載の抗体種、ＴＰＰ－１３６０、ＴＰＰ－１３６１、ＴＰＰ－１３６２、およびＴＰＰ－１３６７）の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを決定するために、マウスおよびカニクイザルにおいて非ＧＬＰ試験を行った。単回用量のマウスＰＫ試験を、ナイーブ雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを使用して実施し、１０ｍｇ／ｋｇの抗体が腹腔内（ＩＰ）注射を介して投与された。まばらなＰＫサンプリング（ｎ＝４／時点）を７２時間にわたって実施し、すべての動物は、試験期間全体を通して検出可能な抗体種濃度を示した。計算された半減期は３．４日であったが、サンプリング期間を考慮すると過小評価される可能性がある。カニクイザルにおけるＰＫプロファイルを評価するために、反復投与探索的毒性試験を行い、２０ｍｇ／ｋｇの抗体種を１日目および１５日目に３匹のナイーブ雄ザルにＩＶボーラス注射を介して投与した。抗体種の反復投与後、全身曝露が達成され、抗体種は、試験期間全体を通して３匹のサルのうち２匹の血清中で検出可能であった（１５日目の投与後３３６時間）。また、血液学的および免疫表現型評価のための反復投与試験の一部として、試料も採取した。観察されたＢリンパ球の枯渇は、インビボにおける薬物機能を実証する。全体として、抗体種の曝露は、単回投与マウスおよび反復投与サルの試験の両方で試験期間全体を通して維持され、２つの試験間で３～３．５日の範囲の類似した半減期が報告された。

実施例１２：安全性プロファイル
この一連の高く評価された種の例は、許容可能な毒性プロファイル（例えば、試験された最高用量である１００ｍｇ／ｋｇ ＱＷまで、良好な耐容性を示した。毒物動態は、カニクイザルにおける２８日間の探索的毒性試験の一部として評価された。ＴＰＰ－１３６０を、１日目、４日目、８日目、１１日目、および１５日目に１０ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＷ）の用量レベルで、または１日目、８日目、および１５日目に２０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ（ＱＷ）で、カニクイザル（４／群）にＩＶ注射を介して、ＢＩＷまたはＱＷのいずれかで投与した。捕捉用に抗リツキシマブ抗体および検出用にヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを使用して、血清濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。１０、２０、または１００ｍｇ／ｋｇの複数回のＩＶ投与の後、ＴＰＰ－１３６０の全身曝露がすべての用量レベルで達成され、試験期間全体を通してすべての動物で維持された。ＴＰＰ－１３６０は、２０ｍｇ／ｋｇ用量群および１００ｍｇ／ｋｇ用量群にわたって、Ｃ_maxおよびＡＵＣ_0-168でほぼ用量に比例した増加を有する直線状のＴＫを示した。初回の投与後、クリアランスは、１０～１００ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたって同様であり、１０ｍｇ／ｋｇの用量で標的の飽和が示唆された。Ｒ_AUC値は、１０ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＷ）および１００ｍｇ／ｋｇ（ＱＷ）用量群における５回目の投与および３回目の投与によって、ある程度のＴＰＰ－１３６０の蓄積を示す。平均計算半減期は、用量レベルおよび用量レジメンに応じて、２～４日の範囲であった。抗薬物抗体は、投与前の１５日目に試験された８匹の動物のうちの５匹において、および試験２９日目に試験された６匹の動物のうちの５匹において検出された。抗薬物抗体は、ＡＤＡ陽性動物の曝露の観察された減少によって証明されるように、ＴＰＰ－１３６０の曝露に影響を及ぼした。ＴＰＰ－１３６０は、試験された最高用量である１００ｍｇ／ｋｇ ＱＷまで、良好な耐容性を示した。末梢血中および複数のリンパ組織中のＢ細胞の減少は、１０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＷで、および２０ｍｇ／ｋｇ ＱＷ以上で見られ、頑強な薬力学的活性を示した。１０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＷの投薬は、２０ｍｇ／ｋｇ ＱＷを超える追加の恩恵をもたらさなかった。Ｂ細胞に対する効果に加えて、ＴＰＰ－１３６０はまた、すべての用量レベルでＴ細胞およびＮＫ細胞を減少させ、≧２０ｍｇ／ｋｇ ＱＷで好中球、および１００ｍｇ／ｋｇ ＱＷで赤血球を減少させた。しかし、被験試料に関連する血小板の減少は観察されなかった。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好中球、および赤血球の減少は、これらの細胞がＣＤ２０を発現しないため、ＴＰＰ－１３６０のＣＤ４７アームによって媒介されると考えられる。

実施例１３：免疫原性
ＥｐｉＶａｘによって開発されたＩｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（ＩＳＰＲＩ）ソフトウェアは、ヒトにおける潜在的な抗体免疫原性を評価するために使用されるインシリコ計算方法であり、臨床的に十分に確立されたＴ細胞依存性分析ツールであることが知られている（図１８）。ＴＰＰ－１３６０のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を推定上のＴエフェクターおよびＴ調節ホットスポットについて分析し、免疫原性のリスクが低いことが見出された。

実施例１４：Ｒａｊｉ異種移植モデル
本明細書に記載のＣＤ４７×ＣＤ２０二重特異性実体は、Ｒａｊｉ ＮＯＤ－ＳＣＩＤモデルにおいて、インビボでリツキシマブよりも優れた有効性を示す。この研究の目的は、より低いレベルのＣＤ２０およびより高いレベルのＣＤ４７を発現するＲａｊｉ異種移植モデルにおけるＴＰＰ－１３６０またはＴＰＰ－１３６２の単剤抗腫瘍活性を決定することであった。雌ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに、右脇腹にＲａｊｉ細胞を接種した。投与は、腫瘍のサイズが約２７０ｍｍ³であるときに開始した。ＴＰＰ－１３６０およびＴＰＰ－１３６２を、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇで、週１回（ＱＷ）、２週間の投与で試験した。ＣＤ２０に対して二価であるリツキシマブを、同じ投与パラダイムを有する対照薬として使用した。最終的な腫瘍体積の減少は、試験の終了時点の２５日目、アイソタイプ対照（抗ＲＳＶ ＩｇＧ１）群の平均腫瘍体積が約２０００ｍｍ³に達したときに、決定した。腫瘍体積が５２％減少したＴＰＰ－１３６０の有意な（ｐ＜０．０００１）抗腫瘍活性は、１０および３０ｍｇ／ｋｇ ＱＷの両方で観察された。また、ＴＰＰ－１３６２の有意な抗腫瘍活性も観察され、１０ｍｇ／ｋｇ ＱＷでは６２％の腫瘍減少、または３０ｍｇ／ｋｇ ＱＷでは６４％の腫瘍減少が観察された。（図１９～図２０）同じ投薬レジメンにおいて、リツキシマブはそれぞれ３０ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで３３％および３８％の腫瘍体積の減少（ＴＶＲ）を示した。３０ｍｇ／ｋｇ ＱＷでのＴＰＰ－１３６０の抗腫瘍活性は、対応する用量レベルのリツキシマブよりも有意に良好であり（ｐ＜０．０１）、ＴＰＰ－１３６０の抗腫瘍活性におけるＣＤ４７アームの寄与を示唆した。３０ｍｇ／ｋｇ ＱＷでのＴＰＰ－１３６２の抗腫瘍活性も、対応する用量レベルのリツキシマブよりも有意に良好であり（ｐ＜０．０００１）、ＴＰＰ－１３６２の抗腫瘍活性におけるＣＤ４７アームの寄与を示唆した。アイソタイプ対照、ＴＰＰ－１３６０、ＴＰＰ－１３６２、またはリツキシマブで処置された動物において、有意な体重減少はなかった。

本明細書において参照されるすべての刊行物および特許は、参照により援用される。本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、記載される対象の様々な修正および変形は、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の実施形態に関連して説明されてきたが、特許請求される本発明は、これらの実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための様々な修正は、当業者には明らかであり、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims (43)

1. ＣＤ４７に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分と、ＣＤ２０に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分と、を含む二重特異性抗体であって、前記ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＣＤ４７に対して低い親和性を示し、前記ＣＤ２０に結合するＦａｂ部分が、ＣＤ２０に対して高い親和性を示し、前記二重特異性抗体が、腫瘍細胞のＣＤ４７に選択的に結合し、正常細胞のＣＤ４７に実質的に結合しない、二重特異性抗体。
2. Ｂ細胞に選択的に結合する、請求項１に記載の二重特異性抗体。
3. アイソタイプＩｇＧ１である、請求項２に記載の二重特異性抗体。
4. 前記ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、配列番号３４０を含む軽鎖（ＬＣ）領域を含む、請求項３に記載の二重特異性抗体。
5. 前記ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、配列番号３４２を含む重鎖（ＨＣ）領域を含む、請求項４に記載の二重特異性抗体。
6. 悪性Ｂ細胞に選択的に結合する、請求項３に記載の二重特異性抗体。
7. 悪性Ｂ細胞に選択的に結合する、請求項５に記載の二重特異性抗体。
8. 前記ＣＤ２０に結合するＦａｂ部分が、配列番号３４４を含む軽鎖（ＬＣ）領域を含む、請求項７に記載の二重特異性抗体。
9. 前記ＣＤ２０に結合するＦａｂ部分が、配列番号３４６を含む重鎖（ＨＣ）領域を含む、請求項８に記載の二重特異性抗体。
10. 前記ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、軽鎖可変領域（ＶＬ）領域と、重鎖可変領域（ＶＨ）領域と、を含み、それぞれ、ＶＬ ＣＤＲ（配列番号３４７、配列番号３４８、および配列番号３４９）、ならびにＶＨ ＣＤＲ（配列番号３５０、配列番号３５１、および配列番号３５２）を含む、請求項９に記載の二重特異性抗体。
11. 前記抗ＣＤ４７ ＶＬが、配列番号３２５に由来し、配列番号３２５に対して１～７個のアミノ酸置換を示し、前記抗ＣＤ４７ ＶＨが、配列番号３２６に由来し、配列番号３２６に対して１～１１個のアミノ酸置換を示す、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
12. 前記ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、
    （ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２８５、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９１、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号２９７、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０３、配列番号３０５、配列番号３０７、配列番号３０９、配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１５、配列番号３１７、配列番号３１９、および配列番号３２１からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）領域と、
    （ｉｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、および配列番号３２２からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）領域と、を含む、請求項３に記載の二重特異性抗体。
13. 前記ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、
    （ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２８５、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９１、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号２９７、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０３、配列番号３０５、配列番号３０７、配列番号３０９、配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１５、配列番号３１７、配列番号３１９、および配列番号３２１からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）領域と、
    （ｉｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、および配列番号３２２からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）領域と、を含む、請求項９に記載の二重特異性抗体。
14. 前記ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＶＬ ＣＤＲであるＱＡＳＱＤＩＨＲＹＬＳ（配列番号３５９）、ＲＥＳＲＦＶＤ（配列番号３６０）、およびＬＱＹＤＥＦＰＹＴ（配列番号３６１）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）領域と、ＶＨ ＣＤＲであるＤＹＹＬＨ（配列番号３６２）、ＷＩＤＰＤＱＧＤＴＹＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３６３）、ＡＹＧＥＳＳＹＰＭＤＹ（配列番号３６４）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）領域と、を含む、請求項３に記載の二重特異性抗体。
15. 前記ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＶＬ ＣＤＲであるＲＡＳＱＤＩＨＲＹＬＳ（配列番号３６５）、ＲＥＳＲＦＶＤ（配列番号３６６）、ＬＱＹＤＥＦＰＹＴ（配列番号３６７）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）領域と、ＶＨ ＣＤＲであるＤＹＹＬＨ（配列番号３６８）、ＷＩＤＰＤＱＧＤＴＹＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３６９）、ＡＹＧＥＳＳＹＰＭＤＹ（配列番号３７０）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）領域と、を含む、請求項３に記載の二重特異性抗体。
16. 前記ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＶＬ ＣＤＲであるＲＡＳＱＤＩＨＲＹＬＳ（配列番号３７１）、ＲＡＮＲＬＶＳ（配列番号３７２）、ＬＱＹＤＥＦＰＹＴ（配列番号３７３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）領域と、ＶＨ ＣＤＲであるＤＹＹＬＨ（配列番号３７４）、ＷＩＤＰＤＱＧＤＴＹＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３７５）、ＡＹＧＥＳＳＹＰＭＤＹ（配列番号３７６）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）領域と、を含む、請求項３に記載の二重特異性抗体。
17. 前記ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＶＬ ＣＤＲであるＱＡＳＱＤＩＨＲＹＬＳ（配列番号３５９）、ＲＥＳＲＦＶＤ（配列番号３６０）、およびＬＱＹＤＥＦＰＹＴ（配列番号３６１）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）領域と、ＶＨ ＣＤＲであるＤＹＹＬＨ（配列番号３６２）、ＷＩＤＰＤＱＧＤＴＹＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３６３）、ＡＹＧＥＳＳＹＰＭＤＹ（配列番号３６４）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）領域と、を含む、請求項９に記載の二重特異性抗体。
18. 前記ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＶＬ ＣＤＲであるＲＡＳＱＤＩＨＲＹＬＳ（配列番号３６５）、ＲＥＳＲＦＶＤ（配列番号３６６）、ＬＱＹＤＥＦＰＹＴ（配列番号３６７）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）領域と、ＶＨ ＣＤＲであるＤＹＹＬＨ（配列番号３６８）、ＷＩＤＰＤＱＧＤＴＹＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３６９）、ＡＹＧＥＳＳＹＰＭＤＹ（配列番号３７０）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）領域と、を含む、請求項９に記載の二重特異性抗体。
19. 前記ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＶＬ ＣＤＲであるＲＡＳＱＤＩＨＲＹＬＳ（配列番号３７１）、ＲＡＮＲＬＶＳ（配列番号３７２）、ＬＱＹＤＥＦＰＹＴ（配列番号３７３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）領域と、ＶＨ ＣＤＲであるＤＹＹＬＨ（配列番号３７４）、ＷＩＤＰＤＱＧＤＴＹＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３７５）、ＡＹＧＥＳＳＹＰＭＤＹ（配列番号３７６）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）領域と、を含む、請求項９に記載の二重特異性抗体。
20. 配列番号３１７を含むＶＬ領域と、配列番号３１８を含むＶＨ領域と、を含む、請求項１４に記載の二重特異性抗体。
21. 配列番号３１９を含むＶＬ領域と、配列番号３２０を含むＶＨ領域と、を含む、請求項１５に記載の二重特異性抗体。
22. 配列番号３２１を含むＶＬ領域と、配列番号３２２を含むＶＨ領域と、を含む、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
23. 配列番号３１７を含むＶＬ領域と、配列番号３１８を含むＶＨ領域と、を含む、請求項１７に記載の二重特異性抗体。
24. 配列番号３１９を含むＶＬ領域と、配列番号３２０を含むＶＨ領域と、を含む、請求項１８に記載の二重特異性抗体。
25. 配列番号３２１を含むＶＬ領域と、配列番号３２２を含むＶＨ領域と、を含む、請求項１９に記載の二重特異性抗体。
26. Ａ１０Ｓ、Ｍ１１Ｌ、Ｋ２４Ｒ、Ａ５１Ｅ、Ｎ５２Ｓ、Ｌ５４Ｆ、およびＳ５６Ｄからなる群から選択される、抗ＣＤ４７ ＶＬ（配列番号３２５）における少なくとも１つ（１）のアミノ酸置換を含む、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
27. Ｔ１４Ｐ、Ｑ４３Ｋ、Ａ４４Ｇ、Ｅ５９Ｙ、Ｄ６６Ｇ、Ｍ７６Ｔ、Ｓ８４Ｒ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｓ１０２Ｅ、およびＴ１１５Ｌからなる群から選択される、抗ＣＤ４７ ＶＨ（配列番号３２６）における少なくとも２つ（２）のアミノ酸置換を含む、請求項２６に記載の二重特異性抗体。
28. Ｔ１４Ｐ、Ｑ４３Ｋ、Ａ４４Ｇ、Ｅ５９Ｙ、Ｄ６６Ｇ、Ｍ７６Ｔ、Ｓ８４Ｒ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ｓ１０２Ｅ、およびＴ１１５Ｌからなる群から選択される、抗ＣＤ４７ ＶＨ（配列番号３２６）における少なくとも３つ（３）のアミノ酸置換を含む、請求項２７に記載の二重特異性抗体。
29. 配列番号３１９を含む抗ＣＤ４７ ＶＬ領域と、配列番号３２０を含む抗ＣＤ４７ ＶＨ領域と、を含む、請求項２８に記載の二重特異性抗体。
30. 配列番号３３５を含む抗ＣＤ４７のＬＣ領域と、配列番号３３６を含む抗ＣＤ４７のＨＣ領域と、を含む、請求項２９に記載の二重特異性抗体。
31. 抗ＣＤ２０のＶＬ ＣＤＲであるＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ（配列番号３５３）、ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号３５４）、ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ（配列番号３５５）と、ＶＨ ＣＤＲであるＳＹＮＭＨ（配列番号３５６）、ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号３５７）、ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶ（配列番号３５８）と、を含む、請求項９に記載の二重特異性抗体。
32. 配列番号３２３を含む抗ＣＤ２０ ＶＬ領域と、配列番号３２４を含むＶＨ領域と、を含む、請求項３１に記載の二重特異性抗体。
33. （配列番号３３１）を含む抗ＣＤ２０ ＬＣ領域と、配列番号３３２を含む抗ＣＤ２０ ＨＣ領域と、を含む、請求項３２に記載の二重特異性抗体。
34. 抗ＣＤ２０のＶＬ ＣＤＲであるＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ（配列番号３５３）、ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号３５４）、ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ（配列番号３５５）と、ＶＨ ＣＤＲであるＳＹＮＭＨ（配列番号３５６）、ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号３５７）、ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶ（配列番号３５８）と、を含む、請求項１３に記載の二重特異性抗体。
35. 配列番号３２３を含む抗ＣＤ２０のＶＬ領域と、配列番号３２４を含むＶＨ領域と、を含む、請求項３４に記載の二重特異性抗体。
36. 配列番号３３１を含む抗ＣＤ２０のＬＣ領域と、配列番号３３２を含む抗ＣＤ２０のＨＣ領域と、を含む、請求項３５に記載の二重特異性抗体。
37. 配列番号３３３を含む抗ＣＤ４７のＬＣ領域と、配列番号３３４を含む抗ＣＤ４７のＨＣ領域と、を含む、請求項３６に記載の二重特異性抗体。
38. 配列番号３３５を含む抗ＣＤ４７のＬＣ領域と、配列番号３３６を含む抗ＣＤ４７のＨＣ領域と、を含む、請求項３６に記載の二重特異性抗体。
39. 配列番号３３７を含む抗ＣＤ４７のＬＣ領域と、配列番号３３８を含む抗ＣＤ４７のＨＣ領域と、を含む、請求項３６に記載の二重特異性抗体。
40. 医薬組成物を必要とする患者に投与するための医薬組成物であって、
    ｉ）ＣＤ４７に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分と、ＣＤ２０に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分と、を含む二重特異性抗体であって、前記ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＣＤ４７に対して低い親和性を示し、前記ＣＤ２０に結合するＦａｂ部分が、ＣＤ２０に対して高い親和性を示し、前記二重特異性抗体が、腫瘍細胞のＣＤ４７に選択的に結合し、正常細胞のＣＤ４７に実質的に結合しない、二重特異性抗体と、
    ｉｉ）少なくとも１つの薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
41. 患者の腫瘍細胞を抑制する方法であって、有効量の二重特異性抗体を投与することを含み、前記二重特異性抗体が、ＣＤ４７に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分と、ＣＤ２０に結合する少なくとも１つのＦａｂ部分と、を含み、前記ＣＤ４７に結合するＦａｂ部分が、ＣＤ４７に対して低い親和性を示し、前記ＣＤ２０に結合するＦａｂ部分が、ＣＤ２０に対して高い親和性を示し、前記二重特異性抗体が、腫瘍細胞のＣＤ４７に選択的に結合し、正常細胞のＣＤ４７に実質的に結合しない、方法。
42. 患者の血液悪性腫瘍またはＢ細胞障害を抑制する、請求項４０に記載の方法。
43. 患者のＢ細胞悪性腫瘍を抑制する、請求項４１に記載の方法。

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