CN114007699A - 拮抗剂抗cd7抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分化簇7(CD7)拮抗剂,如抗体和片段,以及方法、用途和组合。
Description
技术领域
本发明涉及表达分化簇7(CD7)的细胞耗竭或CD7拮抗作用,如抗体和片段,以及方法、用途和组合。
背景技术
CD7是在T和NK谱系细胞的表面上表达的I型跨膜蛋白。CD7在T-ALL细胞中高度表达。CD7已被证明是用于诊断T-ALL的有效生物标志物。另外,其在包括5-14%AML患者的所有CEBPA双突变AML病例中表达。其也在MDS(骨髓增生异常综合征)原始细胞的子集中表达。基于这些观察,期望用配体如抗体靶向CD7以杀死肿瘤细胞以治疗这些恶性疾病。
T-ALL是罕见的侵袭性白血病,由T细胞祖细胞的恶性转化引起。在目前多中心临床试验的护理标准下,复发和难治性T-ALL的发生率在儿童中为20%,并且在成人中为40%。在复发患者中,只有5%存活超过5年。对于治疗抵抗或在初始治疗后复发的那些T-ALL患者,显然有很高的医疗需求。
发明内容
在第一构型中,本发明提供了:
一种抗体或片段,其包括与CD7(分化簇7)特异性结合的结合位点,其中所述结合位点包括由源自人VH基因区段、DH基因区段和JH基因区段的重组的核苷酸序列编码的VH结构域,其中所述VH基因区段选自IGHV3-15和IGHV3-23。
在第二构型中,本发明提供了:
一种抗体或片段,其与CD7特异性结合并且包括VH结构域,所述VH结构域包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的CDRH3序列或所述包括3、2或1种氨基酸取代的序列。
在第三构型中,本发明提供了:
一种(任选地根据前述权利要求中任一项所述的)抗体或片段,其与CD7特异性结合并且包括VL结构域,所述结构域包括选自SEQ ID NO:13、16、33、36、53、56、73和76的CDRL3序列或所述包括3、2或1中氨基酸取代的所选CDRL3序列。
在第四构型中,本发明提供了:
一种抗体或片段,其包括与CD7特异性结合的结合位点,其中所述结合位点包括VL结构域,所述VL结构域包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的VL结构域的氨基酸序列;或与其至少70%相同的氨基酸。
在第五构型中,本发明提供了:
一种抗体或片段,其与CD7特异性结合并且包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的重链氨基酸序列;或与其至少70%相同的氨基酸。
在第六构型中,本发明提供了:
一种抗体或片段,其与CD7特异性结合并且包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的轻链氨基酸序列;或与其至少70%相同的氨基酸。
在第七构型中,本发明提供了:
一种抗体或片段,其与人CD7表位特异性结合,所述表位与根据前述权利要求中任一项所述的抗体结合的表位相同。
在第八构型中,本发明提供了:
一种抗体或片段,其与根据前述构型中任一项所述的抗体竞争与人CD7结合。
在第九构型中,本发明提供了:
一种一定量的本发明的抗CD7抗体或片段与一定量的化学治疗剂的组合。
在第十构型中,本发明提供了:
一种本发明的所述抗体、片段或组合的用途,其用于制造用于施用于受试者以治疗或预防CD7介导的疾病或病状,任选地癌症的药物。
在第十一构型中,本发明提供了:
一种治疗或预防受试者的CD7介导的疾病或病状(任选地癌症)的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的抗体、片段或组合,其中所述CD7介导的疾病或病状由此被治疗或预防。
在第十二构型中,本发明提供了:
一种药物组合物,其包括所述抗体、片段或组合。
在第十三构型中,本发明提供了:
一种核酸,其对本发明的抗体或片段的VH结构域和/或VL结构域进行编码。
在第十四构型中,本发明提供了:
一种核酸,其对以下进行编码:包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的VH结构域的氨基酸序列的VH结构域;或与其至少70%相同的氨基酸。
在第十五构型中,本发明提供了:
一种核酸,其对以下进行编码:包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域;或与其至少70%相同的氨基酸。
在第十六构型中,本发明提供了:
一种核酸,其包括
(a)与SEQ ID NO:10的序列至少70%相同的核苷酸序列;和/或
(b)与SEQ ID NO:20的序列至少70%相同的核苷酸序列。
在第十七构型中,本发明提供了:
一种核酸,其对本发明的抗体或片段的重链和/或轻链进行编码。
在第十八构型中,本发明提供了:
一种核酸,其对包括与SEQ ID NO:8至少70%相同的氨基酸序列的重链进行编码。
在第十九构型中,本发明提供了:
一种核酸,其对包括与SEQ ID NO:18至少70%相同的氨基酸序列的轻链进行编码。
在第二十构型中,本发明提供了:
一种核酸(例如,宿主细胞中,例如,CHO或HEK293或Cos细胞),其包括
(a)与选自G09、F05、C02和E04的抗体的所选重链序列至少70%相同的核苷酸序列;和/或
(b)与选自G09、F05、C02和E04的抗体的所选序列至少70%相同的核苷酸序列。
在第二十一构型中,本发明提供了:
一种载体,其包括所述核酸;任选地其中所述载体是CHO或HEK293载体。
在第二十二构型中,本发明提供了:
一种宿主细胞,其包括所述本发明的核酸或载体。
在第二十三构型中,本发明提供了:
如本文所描述的抗体、片段、组合、载体、宿主细胞、用途或方法。
在第二十四构型中,本发明提供了:
一种诊断受试者的CD7介导的疾病或病状(任选地癌症)的方法,所述方法包括将本发明的抗体或片段与分离的细胞样品(例如,血液或血清样品)组合以及确定由所述样品包括的细胞被所述抗体或片段特异性结合。
还提供了:
一种用于检测样品中的CD7阳性细胞的体外测定,所述测定包括将本发明的抗体或片段与分离的细胞样品(例如,血液或血清样品)组合以及确定由所述样品包括的细胞被所述抗体或片段特异性结合。
附图说明
图1:IgG1 Fc变体对抗CD7基准单克隆抗体RFT2的CDC活性的影响。CEM细胞以1,750个细胞/孔铺板在384孔板中,并且以1/16的终浓度添加人补体血清。添加每个RFT2IgG1变体的滴定液以及同种型对照,并且在37℃下温育2小时。添加并且在Envision读板仪上读取发光。基于来自无抗体和有/无细胞的孔的信号计算每种抗体的杀伤百分比。误差条表示对于每个点进行3次重复的标准偏差。RFT2 E345R诱导的有效和最大杀伤显著大于其它变体。使用GraphPad Prism v7.02分析数据,其中对数抗体浓度(M)是相对于杀伤%(平均值±标准偏差)作图的,并且对数据应用4参数逻辑曲线拟合,允许计算EC50值。抗体的统计比较示出于表6中。RFT在以下中讨论:《免疫学杂志》1989年12月1日;143(11):3589-97,“具有人恒定区和小鼠可变区的人T细胞特异性嵌合抗体(CD7)的表征(Characterization of a human T cell-specific chimeric antibody(CD7)with humanconstant and mouse variable regions)”,Heinrich G等人。
图2:抗体发现的流程图
图3:与CEM细胞和重组食蟹猴CD7 CHO细胞结合的抗体的二次筛选。收集来自杂交瘤克隆的上清液以用于使用流式细胞术检测与在CEM细胞或重组CHO细胞中表达的CD7的结合来进行筛选。结合由几何平均值表示。
图4:与人和食蟹猴CD7蛋白结合的mAb的表征。通过SPR测量结合。如所指示的,捕获的mAb与人(h)或食蟹猴(c)CD7蛋白相互作用的单一浓度传感图。
图5:在CDC测定中对mAb进行三级筛选。对于每个浓度点和在3个独立的测定中,一式两份地运行抗体。曲线下面积用于比较抗体效力。1741E04 E345R和1741G09 E345R示出了最高的CEM细胞杀伤效力,然后是RFT2 E345R、TH69 E345R、1730C02 E345R、1896A03E345R、1734F05 E345R、1738807 E345R,而同种型对照(IgG1 E345R)和1734E10 E345R在此测定中没有示出显著的功效。使用GraphPad Prism v7.02分析数据,其中对数抗体浓度(M)是相对于杀伤%(平均值±标准偏差)作图的,并且对数据应用4参数逻辑曲线拟合,允许计算EC50值。抗体的统计比较示出于表6中。TH69在以下中讨论:《英国血液学杂志(Br JHaematol.)》1996年11月;95(2):327-38,“CD7单克隆抗体TH-69对异种移植人T细胞ALL的治疗非常有效(Therapy with CD7 monoclonal antibody TH-69 is highly effectivefor xenografted human T-cell ALL)”,Baum W等人。
图6:在ADCP测定中对mAb进行三级筛选。CellTraceTM紫罗兰(CTV)标记的单核细胞衍生的巨噬细胞对用不同浓度的E345R前导抗体(1730C02、1734F05、1741G09)或基准抗CD7抗体(RFT2)在冰上预调理的CFSE标记的CEM细胞的ADCP与IgG1同种型对照比较。CTV标记的巨噬细胞与CFSE标记的CEM细胞共培养2.5小时。收集细胞,使用可固定的胺反应性近红外线评估活力,并且通过流式细胞术进行分析。通过流式细胞术检测肿瘤细胞吞噬作用并且表达为吞噬作用%(吞噬作用%=100×(CFSE+/CTV+%)/(CFSE+%))。示出的数据是来自两个独立重复的代表性实验的重复样品的平均值±SD。
图7:1741G09 E345R和1741G09 E430G的CDC活性和体内药代动力学。(A)两种抗体1741G09 E345R和1741G09 E430G以及其同种型对照在图6中描述的CDC测定中进行了测试。两种分子在耗竭CEM细胞时示出了类似的有效耗竭活性(最大杀伤和EC50)。误差条表示对于每个点进行3次重复的标准偏差。(B)两种抗体均以10mg/kg的单次静脉内剂量施用到NODSCIDγ(NSG)小鼠中。在八个时间点处采集血清样品,其中每个时间点取三只小鼠,并且每只小鼠取两个时间点。用于定量抗体浓度的方法是抗原捕获ELISA。每个实验运行由抗体校准曲线和两组QC样品组成,一式二份地运行并放置在板的正面和背面。使用SoftMax Pro7计算抗体浓度,其中标准曲线使用四参数对数和1/Y加权。使用PKSolver Excel插件计算药代动力学参数。基于未配对t检验,半衰期差异的P值等于0.0118。示出的数据是一式三份的时间点(来自三只不同的小鼠)。数据示出为带有标准偏差的平均浓度。1741 G09 430G的t1/2比1741G09 345R长大约7倍(20.9小时对136.7小时),并且G09 430G的Cmax比G09 345R高大约3倍(216811ng/mL对75001ng/mL)。
图8:1741G09 E430G对非复发性和复发性T-ALL细胞系的有效CDC活性。T-ALL细胞包含细胞系(图8A)、源自患者的非复发性细胞(图8B)和源自患者的复发性细胞(图8C)用作靶细胞和人血清作为补体来源。添加1741G09 E430G的滴定液以及同种型对照,并且在37℃下温育2小时。添加并且在Envision读板仪上读取发光。基于来自无抗体和有/无细胞的孔的信号计算每种抗体的杀伤百分比。误差条表示对于每个点进行4次重复的标准偏差。使用GraphPad Prism v7.02分析数据,其中对数抗体浓度(M)是相对于杀伤%(平均值±标准偏差)作图的,并且对数据应用4参数逻辑曲线拟合,允许计算EC50值。
图9:1741G09对复发性T-ALL细胞系的有效ADCP活性。紫罗兰(CTV)标记的单核细胞衍生的巨噬细胞对用抗CD7抗体1741G09 E430G或适当的IgG1同种型对照抗体预调理的CFSE标记的CEM或患者T-ALL细胞的吞噬作用。1741G09E430G抗CD7抗体诱导CEM和儿科患者T-ALL(PDTALL-39、-46、-47)的浓度依赖性增强,并且在较小程度上诱导成人复发性T-ALL(PDTALL-Ad2R)吞噬作用。与同种型对照相比,使用1714G09 E340G抗体的儿科患者T-ALL的细胞吞噬具有统计学意义(使用配对t检验p=0.015),并且与PDTALL-Ad2R细胞的约70%最大吞噬作用相比,实现了90-95%的最大吞噬作用。示出的数据是一式两份分析的样品的平均值±SD。
图10:细胞因子释放分布评估了1741G09 E430G抗体刺激来自五个个体供体的人PBMC的能力,如通过特定细胞因子和趋化因子的释放来测量的。对应的同种型对照(IgG1E430G)(A)用于监测PBMC培养物的非特异性活化。在组织培养板上风干固定后,超激动性抗CD28和抗CD3(克隆OKT3)抗体用作阳性对照。将人PBMC接种到预先准备好的板中的固定化测试试剂中,并且在37℃下温育48小时。温育后,来自培养物的细胞因子水平由Luminex测量。使用5点非线性回归分析从标准曲线内插每种细胞因子的诱导水平。然后将内插数据归一化为未受刺激的对照。
图11:1741G09 E430G在CDC测定中的PBMC T和NK细胞耗竭分布。分别使用泛人T或NK细胞分离试剂盒(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech))从冷冻保存的PBMC中分离来自两个健康供体的人T(A)或NK(B)细胞,并且以1,750个细胞/孔铺板。添加1741G09E430G的滴定液以及匹配的同种型对照,并且在4℃下温育30分钟以允许抗体调理。然后添加最终浓度为1/16的人补体血清,并且将板在37℃下温育2小时。温育后,将添加到所有孔,并且在Envision读板仪上读取发光输出。发光信号与每孔的活细胞数量相关,并且基于来自没有抗体(0%杀伤)和没有细胞(100%杀伤)的孔的发光信号计算每个抗体浓度的杀伤%。使用GraphPad Prism v7.02分析数据,其中对数抗体浓度(M)是相对于杀伤%(平均值±标准偏差)作图的,并且对数据应用4参数逻辑曲线拟合,允许计算EC50值。
图12:B细胞、单核细胞、NK细胞和T细胞在人全血测定中的存活率。水蛭素管中收集的来自三个健康供体(A、B、C)的全血在三个独立实验中用不同的抗体处理,并且然后在37℃下温育20小时。水蛭素用作抗凝血剂以保持补体活性。温育后,基于细胞表面标志物通过流式细胞术分析免疫表型(T:CD45+CD3+CD19-;B:CD45+CD3-CD19+;NK:CD45+CD3-CD16+CD56+;单核细胞:CD14+)。示出了具有平均值(-)的每个供体的数据集。NC′:(阴性对照);IC′:同种型对照;OFA:奥法木单抗(Ofatumumab);RTX:利妥昔单抗(Rituximab)。通过配对t检验比较平均值。*是指低于0.05的p值;**是指低于0.01的p值。
图13:健康供体血液中的CEM细胞存活率。收集在水蛭素管中的三个健康供体(D0457、D0462、D0463)的全血用紫罗兰(CTV)标记的CEM细胞掺入,并且用10μg/mL的抗体处理,如三个独立实验所指示的。水蛭素用作抗凝血剂以保持补体活性。在37℃下温育20小时后,基于细胞表面标志物通过流式细胞术分析免疫表型(T:CD45+CD3+CD19-;B:CD45+CD3-CD19+;NK;CD45+CD3-CD16+CD56+;单核细胞:CD14+)。示出了具有平均值(-)的每个供体的数据集。IC′:同种型对照;OFA:奥法木单抗。与同种型对照相比,细胞计数的变化也被确定并且绘制在右图中。每个点表示单个供体,并且每个条件下3个供体的平均值由普通线表示。50%和90%阈值由不连续的线指示。通过配对t检验比较平均值。*是指低于0.05的p值;**是指低于0.01的p值;***是指低于0.001的p值;****是指低于0.0001的p值。
图14:抗C5aAb对1741G09 E430G诱导的细胞死亡的影响(n=1)。CTV标记的CEM细胞在健康供体血液中掺入10μg/mL的E430G KY1007、E430G IgG1、WT KY1007或奥法木单抗±10μg/mL的抗C5a Ab,并且在37℃下温育20小时。在此测定中使用了与先前部分类似的方法。
图15:1741G09 E430G延长了异种移植小鼠的存活率。NSG小鼠在第0天注射了5×106个T-ALL细胞、PDTALL46,并且然后从第3天直到研究结束每周以10mg/Kg给药三次。两组(10只小鼠/组)分别用1741G09 E430G和对应的同种型对照处理。(A)卡普兰迈耶(KaplanMeier)图示出了这两组中留在研究中的动物。***:与同种型对照相比,p<0.0001 Log-Rank(Mantel-Cox)检验。(B)个体动物流式细胞术数据示出了在研究小鼠血液中存在的细胞表面表达人CD5的细胞百分比。
图16:化疗期间的补体活性(参见参考文献15)。
图17:复发性T-ALL细胞系、CEM和外周T细胞和NK细胞的CD7和CRP表达谱
图18:补体活化途径
具体实施方式
定义
除非本文另外定义,否则科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步地,除非上下文另有要求,否则单数术语应包含复数,并且复数术语应包含单数。
除非上下文另外清楚地指出,否则单数术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述(the)”包含复数指代物。类似地,除非上下文另外清楚地指示,否则词语“或/或者(or)”旨在包含“和/以及(and)”。尽管与本文所描述的方法和材料类似或等效的那些方法和材料可以用于实施或测试本公开,但在下文描述适合的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”源自于拉丁文exempli gratia,并且在本文中用以指示非限制性实例。因此,缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。
在说明书和权利要求中,术语“约”用于修饰在描述本公开的实施例中采用的例如组合物中的成分的量、浓度、体积、加工温度、加工时间、产量、流速、压力等值,以及其范围。术语“约”是指例如通过用于制备化合物、组合物、浓缩物或使用调配物的典型测量和处理程序;通过这些程序中的疏忽错误;通过用于实施方法的起始材料或成分的制造、来源或纯度的差异,以及类似的近似考虑因素可能发生的数值数量变化。术语“约”还涵盖了由于具有特定起始浓度或混合物的调配物的老化而不同的量以及由于混合或加工具有特定起始浓度或混合物的调配物而不同的量。在用术语“约”修饰时,所附权利要求书包含这些量的等同物。
如本文所用,“施用(administer)”或“施用(administration)”是指将存在于身体外部的物质(例如,本文所提供的抗hCD7抗体)注射或以其它方式物理递送到患者中的行为,如通过粘膜、皮内、静脉内、肌肉内递送和/或本文所描述的或本领域已知的任何其它物理递送方法。当在治疗疾病或其症状时,物质的施用通常发生在疾病或其症状发作之后。当预防疾病或其症状时,物质的施用通常发生在疾病或其症状发作之前。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可以可互换使用,并且意指识别并特异性结合到靶标的免疫球蛋白分子,所述靶标如通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点的蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或上述的组合。如本文所用,术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体如双特异性抗体(包含双重结合抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包括抗体的抗原决定部分的融合蛋白,以及包括抗原识别位点的任何其它经修饰的免疫球蛋白分子,只要所述抗体表现出期望的生物活性。术语“抗体”还可以指由四个多肽链制成的分子量为大约150kDa的Y形糖蛋白:两条轻(L)链和两条重(H)链。存在五种类型的哺乳动物Ig重链同种型,由希腊字母α(α)、6(δ)、ε(ε)、γ(γ)和μ(μ)表示。重链的类型定义了抗体的类别,即分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。γ和α类别基于恒定结构域序列和功能的差异进一步分为亚类,例如IgGl、hIgG2、mIgG2A、mIgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在哺乳动物中,存在两种类型的免疫球蛋白轻链,λ和κ。抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可以分别被称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体中变化最大的部分(相对于同一类别的其它抗体)并且含有抗原结合位点。抗体的实例是仅重链(即,H2)抗体,所述抗体包括重链(5′-VH-(任选铰链)-CH2-CH3-3′)的二聚体并且缺乏轻链。
本文所描述的抗体可以是寡克隆的、多克隆的、单克隆的(包含全长单克隆抗体)、骆驼化的、嵌合的、CDR移植的、多特异性的、双特异性的(包含双结合抗体)、催化的、嵌合的、人源化的、全人的、抗独特型,包含可以以可溶或结合形式标记的抗体以及其片段、变体或衍生物,单独或与通过已知技术提供的其它氨基酸序列组合。抗体可以来自任何物种。本文所描述的抗体可以是裸露其它分子的或与其它分子缀合,如毒素、放射性同位素等。
术语“抗原结合位点”、“抗原结合结构域”、“抗原结合区”、“抗原结合片段”和类似术语是指包括与抗原相互作用并赋予结合剂对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗体的所述部分(例如互补决定区(CDR))。抗原结合区可以源自任何动物物种,如啮齿动物(例如兔、大鼠或仓鼠)和人。优选地,抗原结合区将是人类来源的。
本文所描述的抗原结合片段可以包含单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段、表现出期望的生物活性的抗体片段、二硫键稳定可变区(dsFv)、二聚可变区(双抗体)、抗独特型(抗Id)抗体(包含例如针对抗体的抗Id抗体)、体内抗体、线性抗体、单链抗体分子和由上述任何中的抗体片段和表位结合片段形成的多特异性抗体。具体地,本文所描述的抗体和抗体片段可以包含免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段,即含有抗原结合位点的分子。用酶、木瓜蛋白酶消化抗体会产生两个相同的抗原结合片段(也被称为“Fab”片段)以及没有抗原结合活性但具有结晶能力的“Fc”片段。“Fab”在本文中使用时指包含重链和轻链中的每一个的一个恒定结构域和一个可变结构域的抗体的片段。本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区,包含天然序列Fc区和变体Fc区。“Fc片段”是指通过二硫键连接在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列确定,所述区域也被某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)识别。用酶、胃蛋白酶消化抗体会产生F(ab′)2片段,其中抗体分子的两个臂保持连接并且包括两个抗原结合位点。F(ab′)2片段具有交联抗原的能力。
与基因区段相关的术语“源自...的重组”对于技术人员来说将是显而易见的,所述技术人员将理解B细胞重组其可变区基因区段以产生可变结构域的编码序列。例如“源自人VH基因区段、DH基因区段和JH基因区段的重组”涉及一个人VH基因区段与一个DH基因区段和一个JH基因区段一起的重组以形成对重链抗体可变结构域进行编码的重排的VDJ序列。连接和体细胞超突变也可以是过程的特征,由此产生的重组VDJ序列包含一个或多个不包括在种系V、D和J序列中的核苷酸添加、取代或缺失(例如,p-添加和/或n-添加)。对于κ轻链可变结构域的Vκ和Jκ基因区段,以及对于λ轻链可变结构域的Vλ和Jλ,将说是等效的。旨在任何翻译后修饰可以另外地涵盖在可变结构域中。
“Fv”在本文中使用时指保持抗原识别位点和抗原结合位点的抗体的最小片段。此区域由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域紧密、非共价或共价缔合的二聚体组成。正是在此构型中,每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而,即使是单可变结构域(或仅包括对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力,尽管以比完整结合位点更低的亲和力进行。
如本文所用,术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体,即包括所述群体的单独抗体是相同的,除了可以少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如,异构化、酰胺化)之外。单克隆抗体具有高度特异性,并且针对单个抗原决定簇或表位。相比之下,多克隆抗体制剂通常包含针对不同抗原决定簇(或表位)的不同抗体。如本文所用,术语“单克隆抗体”涵盖完整单克隆抗体和全长单克隆抗体两者以及抗体片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(scFv)突变体、包括抗体部分的、融合蛋白以及包括抗原识别位点的任何其它经修饰的免疫球蛋白分子。此外,“单克隆抗体”是指以多种方式制备的此类抗体,包含但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
本文中的单克隆抗体可以包含“嵌合”抗体(免疫球蛋白),其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源,而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体以及表现出期望的生物活性的此类抗体的片段中的对应序列相同或同源。
术语“人源化抗体”是指嵌合抗体的子集,其中来自非人免疫球蛋白(供体抗体)的“高变区”替代来自人免疫球蛋白(接受者抗体)中的高变区的残基。通常,人源化抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域中的基本上所有可变结构域,其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白序列的那些环,并且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白序列的那些区,尽管框架区可以包含改善如结合亲和力、异构化、免疫原性等抗体性能的一种或多种取代。
术语“双特异性抗体”意指包括对两个靶分子具有特异性的抗体,包含但不限于如以下等形式:DVD-Ig(参见DiGiammarino等人,“用于双特异性靶向的DVD-IgTM分子的设计和生成(Design and generation of DVD-IgTM molecules for dual-specifictargeting)”,《分子生物学方法(Meth.Mo.Biol.)》,2012,889,145-156、mAb2(参见WO2008/003103,mAb2形式的描述通过引用并入本文)、FIT-Ig(参见WO2015/103072,FIT-Ig支架的描述通过引用并入本文)、mAb-dAb、对接和锁定、Fab-臂交换、SEEDbody、三功能抗体、LUZ-Y、Fcab、κλ主体、正交Fab、scDiabody-Fc、双功能抗体Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、双功能抗体-CH3、三联体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、隆凸入孔(knobs-in-holes)、具有共同轻链的隆凸入孔,具有共同轻链和电荷对的隆凸入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig和zybody。对于双特异性形式的综述,参见Spiess,C.等人,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》(2015)。在另一个实施例中,双特异性分子包括与另一种非Ig形式融合的抗体,例如T细胞受体结合结构域;免疫球蛋白超家族结构域;无颌纲动物可变淋巴细胞受体;纤连蛋白结构域(例如,AdnectinTM);抗体恒定结构域(例如CH3结构域,例如FcabTM的CH2和/或CH3,其中所述恒定结构域不是功能性CH1结构域;scFv;(scFv)2;sc-双功能抗体;scFab;中心体蛋白和源自选自CTLA-4(EvibodyTM)的支架的表位结合结构域;脂钙蛋白结构域;蛋白质A,如蛋白质A的Z结构域(例如,AffibodyTM或SpA);A结构域(例如AvimerTM或MaxibodyTM);热休克蛋白(如源自GroEI和GroES的表位结合结构域);转铁蛋白结构域(例如反式体);锚蛋白重复蛋白(例如DARPinTM);肽适体;C型凝集素结构域(例如TetranectinTM);人γ-晶状体蛋白或人泛素(亲和素);PDZ结构域;蝎毒素;以及人蛋白酶抑制剂的库尼茨型结构域。
在一个实施例中,所述双特异性抗体是mAb2。mAb2包括来自完整抗体的与经修饰的恒定区融合的VH和VL结构域,所述恒定区已被工程化为形成抗原结合位点,被称为“Fcab”。Fcab/mAb2形式背后的技术在WO2008/003103中更详细地描述,并且mAb2形式的描述通过引用并入本文。
在另一个实施例中,双特异性抗体是“双重结合抗体”。如本文所用,术语“双重结合抗体”是双特异性抗体,其中两个抗原结合结构域均由VH/VL对形成,并且包含FIT-Ig(参见WO2015/103072,所述文献通过引用并入本文)、mAb-dAb、对接和锁定、Fab-臂交换、SEEDbody、三功能抗体、LUZ-Y、Fcab、κλ主体、正交Fab、scDiabody-Fc、双功能抗体Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、双功能抗体-CH3、三联体、微型抗体、微抗体、scFv-CH3KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv、scFv-KIH,Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、隆凸入孔(knobs-in-holes)、具有共同轻链的隆凸入孔,具有共同轻链和电荷对的隆凸入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv和scFv4-Ig。
术语“高变区”、“CDR区”或“CDR”是指序列高变和/或形成结构限定环的抗体可变结构域的区域。通常,抗体的抗原结合位点包含六个高变区:VH中的三个(CDRH1、CDRH2、CDRH3)和VL中的三个(CDRL1、CDRL2、CDRL3)。抗体的重链和轻链的这些区赋予抗体抗原结合特异性。CDR可以根据Kabat系统来定义(参见Kabat,E.A.等人,1991,“具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”,第5版,NIH出版号91-3242,美国卫生和人类服务部)。其它系统可以用于定义CDR,这是由Chothia等人设计的系统(参见Chothia,C.和Lesk,A.M.,1987,“免疫球蛋白的高变区的规范结构(Canonicalstructures forthe hypervariable regions ofimmunoglobulins)”,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,196,901-917)以及IMGT系统(参见Lefranc,M.P.,1997,“用于免疫遗传学分析的独特数据库编号系统(Unique database numbering system for immunogeneticanalysis)”《今日免疫学(Immunol.Today)》,18,50)。抗体通常含有3个重链CDR和3个轻链CDR。术语一个或多个CDR在此用于表示这些区中的一个或几个区。本领域技术人员能够容易地比较不同的命名系统并确定特定序列是否可以定义为CDR。
“人抗体”是具有与由人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或已使用用于制备人抗体的技术中的任何技术制备的并且特异性地排除包括非人抗原结合残基的人源化抗体的抗体。术语“与...特异性结合”是指如在存在包含生物分子的分子的异质群体的情况下确定靶是否存在的靶与抗体之间的结合的可测量和可再现的相互作用。例如,与靶(其可以是表位)特异性结合的抗体是相比于其与其它靶结合,结合此靶时具有更大亲和力、活动性、更容易和/或持续时间更长的抗体。在一个实施例中,抗体与不相关的靶结合的程度小于例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的抗体与靶结合的程度的约10%。
与人CD7(hCD7)抗原特异性结合的抗体或其片段可以与相关抗原交叉反应。优选地,与hCD7抗原特异性结合的抗体或其片段不与其它抗原交叉反应(但可以任选地与不同物种例如恒河猴或鼠类的CD7交叉反应)。例如,可以通过免疫测定、BIAcoreTM或本领域技术人员已知的其它技术来鉴定与hCD7抗原特异性结合的抗体或其片段。如使用放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)等实验技术确定的,当抗体或其片段与hCD7抗原结合的亲和力高于与任何交叉反应性抗原结合的亲和力时,抗体或其片段与CD7抗原特异性结合。通常,特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍,并且更通常是背景的10倍以上(如15倍以上、20倍以上、50倍以上或100倍以上)。针对关于抗体特异性的讨论,参见例如,Paul编辑,1989,《基础免疫学(Fundamental Immunology)》第二版,雷文出版社(RavenPress),纽约(New York)第332-336页。
术语“脂肪族氨基酸”意指氨基酸R基团是非极性和疏水性的。疏水性随着烃链中C原子数的增加而增加。甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是脂肪族氨基酸。
术语“芳香族氨基酸”意指氨基酸R基团含有芳香族环系统。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸是芳香族氨基酸。
术语“含羟基的氨基酸”意指氨基酸R基团含有羟基并且是亲水性的。丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和蛋氨酸是含羟基的氨基酸。
术语“碱性氨基酸”意指氨基酸R基团是含氮的并且在中性pH下是碱性的。组氨酸、赖氨酸和精氨酸是碱性氨基酸。
术语“环状氨基酸”意指氨基酸R基团具有脂肪族环状结构。脯氨酸是唯一的环状脂肪族氨基酸。
术语“酸性氨基酸”意指氨基酸R基团是极性的并且在生理pH下带负电。天冬氨酸和谷氨酸是酸性氨基酸。
术语“酰胺氨基酸”意指氨基酸R基团含有酰胺基团。天冬酰胺和谷氨酰胺是酰胺氨基酸。
如本文所用,“授权编号”或“营销授权编号”是指监管机构在所述机构确定特定医疗产品和/或组合物可以在所述机构管辖的区域内营销和/或提供销售时颁发的编号。如本文所用,“监管机构”是指负责评估例如医疗产品和/或组合物的安全性和功效以及控制此类产品和/或组合物在给定区域的销售/营销的机构之一。美国的食品和药物管理局(FDA)和欧洲的欧洲药品管理局(EPA)只是此类监管机构的两个实例。其它非限制性实例可以包含SDA、MPA、MHPRA、IMA、ANMAT、香港卫生署药物办公室、CDSCO、新西兰药品管理局(Medsafe)和KFDA。
如本文所用,“缓冲剂”是指能够吸收一定量的酸或碱而不经历pH的强烈变化的化学试剂。
如本文所用,术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如,弗氏佐剂(Freund′sadjuvant)(完全和不完全))、赋形剂或媒剂。此类药物载体可以是无茵液体,如水和油,包含石油、动物、植物或合成来源的那些油,如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时,水是优选的载体。盐溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体,特别是用于可注射溶液。
术语“化学治疗剂”或“化学疗法”是指其主要目的是破坏癌细胞的治疗剂,通常通过干扰肿瘤细胞的生长或繁殖能力。存在许多不同类型的化学治疗剂,其中超过50种已获批准的化学疗法药物可用。化学治疗药物可以基于其工作方式进行分类。烷基化药物通过直接攻击基因的遗传物质DNA来杀死癌细胞。环磷酰胺是烷基化药物。抗代谢物会干扰DNA的产生并且阻止细胞生长和繁殖。抗代谢物的实例是5-氟尿嘧啶(5-FU)。抗肿瘤抗生素是由如上壤中的真菌等天然物质制成的。抗肿瘤抗生素会干扰重要的细胞功能,包含DNA和细胞蛋白质的产生。多柔比星和博来霉素属于这组化疗药物。植物生物碱阻止细胞正常分裂。长春碱和长春新碱是从长春花植物中获得的植物生物碱。类固醇激素会减缓依赖激素的一些癌症的生长。例如,它莫西芬(tamoxifen)用于治疗依赖雌激素生长的乳腺癌。DNA损伤应答(DDR)抑制剂,如PARP抑制剂,会在单链或双链断裂后阻断DNA修复机制。
化学治疗剂的实例包含阿霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、噻替派(Thiotepa)、泰素帝(Taxotere)(多西他赛(docetaxel))、白消安、细胞毒素、紫杉醇、甲氨蝶呤、顺铂(Cisplatin)、美法仑(Melphalan)、长春碱、博来霉素、依托泊苷(Etoposide)、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌(Mitoxantrone)、长春新碱、长春瑞滨(Vinorelbine)、卡铂(Carboplatin)、替尼泊苷(Teniposide)、道诺霉素(Daunomycin)、洋红霉素(Carminomycin)、氨蝶呤、放线菌素、丝裂霉素、埃斯佩拉霉素(Esperamicin)(参见美国专利第4,675,187号)、美法仑和其它相关的氮芥。合适的毒素和化学治疗剂描述于《雷明顿氏药物科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)》,第19版(马克出版公司(MackPublishingCo.)1995)中,并且《古德曼和吉尔曼治疗学的药理学基础(Goodman andGilman′s ThePharmacological Basis of Therapeutics)》,第7版(麦克米伦出版公司(MacMillan Publishing Co.)1985)中。化学治疗剂的另一个实例是抗体缀合的毒素类,包含但不限于吡咯苯二氮卓类、美登木素类、卡奇霉素等。其它合适的毒素和/或化学治疗剂是本领域技术人员已知的。
如本文所用,术语“组合物”旨在涵盖含有任选地指定量的指定成分(例如本发明的抗体)的产品,以及直接或间接由任选地指定量的指定成分的组合产生的任何产品。
如本文所用,术语“包括(comprising/comprises)”在提及抗体、片段、用途、组合物、方法以及对所述方法或组合物来说必不可少的其相应组分时使用,但对于包含未指明的要素,无论是否必要,仍然是开放的。
术语“由......组成”是指如本文所描述的抗体、片段、用途、组合物、方法以及其相应组分,其排除在所述实施例的描述中未叙述的任何要素。
如本文所用,术语“基本上由......组成”是指给定实施例所需要的那些要素。所述术语允许存在不实质影响所述实施例的基本和新颖或功能性特征的要素。
在多肽的上下文中,如本文所用,术语“衍生物”包含包括hCD7多肽的氨基酸序列、hCD7多肽的片段或与已通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变的hCD7多肽特异性结合的抗体或片段的多肽。如本文所用,术语“衍生物”还包含hCD7多肽、hCD7多肽的片段或与已例如通过任何类型的分子与多肽的共价连接而被化学修饰的hCD7多肽特异性结合的抗体。例如,但不限于,hCD7多肽、hCD7多肽的片段或hCD7抗体可以被化学修饰,例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团的衍生化,蛋白水解切割、与细胞配体或其他它白质的连接等。衍生物以不同于天然存在的或起始肽或多肽的方式修饰,无论是以连接分子的类型还是位置。衍生物进一步包含天然存在于肽或多肽上的一个或多个化学基团的缺失。hCD7多肽的衍生物、hCD7多肽的片段或hCD7抗体可以使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰进行化学修饰,所述包含但不限于特异性化学切割、乙酰化、调配、衣霉素的代谢合成等。进一步,hCD7多肽的衍生物、hCD7多肽的片段或hCD7抗体可以含有一个或多个非经典氨基酸。多肽衍生物具有与本文所描述的hCD7多肽、hCD7多肽的片段或hCD7抗体类似或相同的功能。
如本文所用,术语“效应子功能”(或“效应子使能”)是指抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性(ADCC)、补体依赖性细胞毒活性(CDC)介导的应答、Fc介导的吞噬作用、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)或抗体依赖性吞噬作用和抗体通过FcRn受体再循环中的一种或多种。
“有效量”是指以剂量计并且持续所需的时段以实现期望的效果(包含治疗或预防结果)的有效量。“治疗有效量”是指实现可测量的改善或预防特定病症所需的最小浓度。本文中的治疗有效量可以根据如患者的疾病状态、年龄、性别和重量等因素以及抗体在个体中引发期望的应答的能力而变化。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过抗体的毒性或有害作用的量。“预防有效量”是指以剂量计并且持续所需的时段以实现期望的预防结果的有效量。在一些实施例中,本发明抗体的有效量为约0.1mg/kg(每kg受试者体重的mg抗体)到约100mg/kg。在某些实施例中,其中提供的抗体的有效量为约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg,3mg/kg,5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg或约100mg/kg(或其中的范围)。在一些实施例中,如本文所用的“有效量”还指本发明的抗体达到指定结果(例如抑制细胞的hCD7生物活性)的量。
如本文所用,术语“表位”是指抗原(如hCD7多肽或hCD7多肽片段)的表面上的局部区域,所述局部区域能够与抗体的一个或多个抗原结合区结合,并且具有在动物,优选地哺乳动物,并且最优选地人类中具有能够引发免疫应答的抗原性或免疫原性活性。具有免疫原性活性的表位是在动物中引发抗体应答的多肽的一部分。具有抗原性活性的表位是抗体特异性结合的多肽的一部分,如通过本领域公知的任何方法,例如通过本文所描述的免疫测定确定的。抗原表位不一定是免疫原性的。表位通常由如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面基团组成并且具有特异性三维结构特征以及特异性电荷特性。对表位有贡献的多肽的区域可以是多肽的连续氨基酸,或者表位可以一起来自多肽的两个或更多个非连续区域。表位可以是也可以不是抗原的三维表面特征。在某些实施例中,hCD7表位是hCD7多肽的三维表面特征(例如呈hCD7多肽的三聚体形式)。在其它实施例中,hCD7表位是hCD7多肽的线性特征(例如呈hCD7多肽的三聚体形式或单体形式)。本文提供的抗体可以与hCD7的单体(变性)形式的表位、hCD7的三聚体(天然)形式的表位,或hCD7的单体(变性)形式和三聚体(天然)形式两者特异性结合。在具体实施例中,本文提供的抗体与hCD7的三聚体形式的表位特异性结合但不特异性结合hCD7的单体形式。
如本文所用,术语“赋形剂”是指通常用作药物的稀释剂、媒剂、防腐剂、结合剂或稳定剂的惰性物质,并且包含但不限于蛋白质(例如血清白蛋白等)、氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸等)、脂肪酸和磷脂(例如烷基磺酸盐、辛酸盐等)、表面活性剂(例如SDS、聚山梨醇酯、非离子表面活性剂等),糖类(例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖等)和多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇等)。也参见《雷明顿氏药物科学》(1990)马克出版公司,宾夕法尼亚州伊斯顿,所述文献特此通过引用整体并入。
在肽或多肽的上下文中,如本文所用的术语“片段”是指包括少于全长氨基酸序列的肽或多肽。此类片段可以由例如氨基末端的截短、羧基末端的截短和/或氨基酸序列的一个或多个残基的内部缺失产生。例如,片段可能由替代性RNA剪接或由体内蛋白酶活性导致。在某些实施例中,CD7片段包含包括hCD7多肽或与hCD7多肽特异性结合的抗体的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少连续100个氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。在具体实施例中,hCD7多肽或与hCD7抗原特异性结合的抗体的片段保留了所述多肽或抗体的至少1个、至少2个或至少3个功能。
术语“游离”可以指与缓冲剂组合的多肽,例如CD7或其片段和变体,其中所述多肽不与细胞表面或细胞膜缔合。因此,术语“游离”可以指能够表面表达(即包含一个或多个跨膜结构域或膜缔合结构域)但在其当前状态下不在细胞的表面表达或与在细胞的表面上表达的蛋白质结合的多肽。游离多肽也可以指游离的重组或天然或未结合的多肽。在噬菌体展示的上下文中,可以在溶液中选择游离抗原(在本文中被称为“可溶性选择”)或吸附到表面,例如吸附到96孔板的表面(在本文中被称为“生物淘选选择”)。
如本文所用,术语“融合蛋白”是指包括抗体的氨基酸序列和异源多肽或蛋白质(即通常不是抗体的一部分的多肽或蛋白质(例如非抗CD7抗原抗体)的氨基酸序列的多肽。当与CD7或抗CD7抗体相关使用时,术语“融合”是指肽或多肽或其片段、变体和/或衍生物与异源肽或多肽的连接。优选地,融合蛋白保留了CD7或抗CD7抗体的生物学活性。在某些实施例中,融合蛋白包括CD7抗体VH结构域、VL结构域、VH CDR(一个、两个或三个VH CDR)和/或VL CDR(一个、两个或三个VL CDR),其中融合蛋白与CD7表位特异性结合。
当关于抗体使用时,术语“重链”是指抗体基于重链恒定结构域的氨基酸序列的五种不同类型,被称为α(α)、δ(6)、ε(ε)、γ(γ)和μ(μ)。这些不同类型的重链是众所周知的,并且分别产生五种抗体类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,包含IgG的四个亚类,即IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。优选地,重链是人重链。在人群体中,存在每个免疫球蛋白或免疫球蛋白亚类的多个重链恒定区等位基因。这些等位基因变体的核苷酸和氨基酸序列可在公开可用的数据库如IMGT、ENSEMBL、Swiss-Prot和Uniprot上获得。等位基因变体也可以在各种基因组测序项目中鉴定。在一个实施例中,本文公开的抗体和抗体片段包括由IgG1恒定区等位基因编码的重链,所述恒定区等位基因包含但不限于人IGHG1*01、IGHGl*02、IGHGl*03、IGHG1*04和IGHG1*05。在一个实施例中,本文公开的抗体和抗体片段包括由IgG2恒定区等位基因编码的蛋白质,所述恒定区等位基因包含但不限于人IGHG2*01、IGHG2*02、IGHG2*03、IGHG2*04、IGHG2*05和IGHG2*06。在一个实施例中,本文公开的抗体或抗体片段包括由IgG3恒定区等位基因编码的蛋白质,所述恒定区等位基因包含但不限于人IGHG3*01、IGHG3*02、IGHG3*03、IGHG3*04、IGHG3*05、IGHG3*06、IGHG3*07、IGHG3*08、IGHG3*09、IGHG3*10、IGHG3*11、IGHG3*12、IGHG3*13、IGHG3*14、IGHG3*15、IGHG3*16、IGHG3*17、IGHG3*18和IGHG3*19。在一个实施例中,本文公开的抗体或抗体片段包括由IgG4恒定区等位基因编码的蛋白质,所述恒定区等位基因包含但不限于人IGHG4*01(参见例如,本文的序列表)、IGHG4*02(参见例如,本文的序列表)、IGHG4*03(参见例如,本文的序列表)和IGHG4*04(参见例如,本文的序列表)。在另一个实例中,重链是失效的IgG同种型,例如失效的IgG4。在某些实施例中,本发明的抗体包括人γ 4恒定区。在另一个实施例中,重链恒定区不结合Fc-γ受体,并且例如包括Leu235Glu突变。在另一个实施例中,重链恒定区包括Ser228Pro突变以增加稳定性。在另一个实施例中,重链恒定区是IgG4-PE(参见例如本文的序列表)。在另一个实施例中,本文公开的抗体和抗体片段包括由鼠类IgG1恒定区等位基因编码的重链恒定区,所述恒定区等位基因包含但不限于小鼠IGHGl*01或IGHG1*02。在一个实施例中,本文公开的抗体和抗体片段包括由鼠类IgG2恒定区等位基因编码的重链恒定区,所述恒定区等位基因包含但不限于小鼠IGHG2A*01、IGHG2A*02、IGHG2B*01、IGHG2B*02、IGHG2C*01、IGHG2C*02或IGHG2C*03。在一个实施例中,本文公开的抗体或抗体片段包括由鼠类IgG3恒定区等位基因编码的蛋白质,所述恒定区等位基因包含但不限于小鼠IGHG3*01。
如本文所用,术语“宿主”是指动物,优选地哺乳动物,最优选地人。
如本文所用,术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的特定受试者细胞和此类细胞的后代或潜在后代。由于在后续世代或核酸分子整合到宿主细胞基因组中可能发生的突变或环境影响,此类细胞的后代可以与用核酸分子转染的亲本细胞不同。
在施用其它疗法的上下文中,术语“组合”是指使用超过一种疗法。术语“组合”的使用不限制对患有疾病的受试者施用疗法的顺序。可以在对已患有、患有或易患CD7介导的疾病的受试者施用第二种疗法之前(例如1分钟、45分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如1分钟、45分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用第一种疗法。任何另外的疗法可以与其它另外的疗法以任何顺序施用。在某些实施例中,本发明的抗体可以与一种或多种疗法(例如,目前施用以预防、治疗、控制和/或改善CD7介导的疾病的不是本发明的抗体的疗法)组合施用。可以与本发明的抗体组合施用的疗法的非限制性实例包含镇痛剂、麻醉剂、抗生素或免疫调节剂或美国药典和/或医师案头参考中列出的任何其它药剂。
如本文所用,“注射装置”是指被设计用于进行注射的装置,注射包含将注射装置暂时流体耦接到人的组织,通常是皮下组织的步骤。注射进一步包含将一定量的液体药物施用到组织中并且将注射装置从组织中分离或移除。在一些实施例中,注射装置可以是静脉内装置或IV装置,其是当靶组织是循环系统内的血液,例如静脉中的血液时使用的一种类型的注射装置。注射装置的常见但非限制性实例是针头和注射器。
如本文所用,“说明书”是指在制品的直接容器上展示的书面、印刷或图形物质,例如展示在含有药物活性剂的小瓶上的书面材料,或关于包含在含有所关注组合物的试剂盒中的所关注产品的组成和用途的详情。说明书阐述了预期施用或执行的治疗方法。
“分离的”或“纯化的”抗体或蛋白质是已从其生产环境的组分(例如天然或重组)中鉴定、分离和/或回收的抗体或蛋白质。例如,抗体或蛋白质基本上不含来自抗体所源自的细胞或组织来源的细胞材料或其它污染蛋白质,或者在化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品。术语“基本上不含细胞材料”包含抗体的制剂,在所述制剂中,抗体与从其中分离或重组产生所述抗体的细胞的细胞组分分离。因此,基本上不含细胞材料的抗体包含具有小于约30%、20%、10%或5%(按干重计)的异源蛋白质(本文也被称为“污染蛋白质”)的抗体制剂。当重组产生抗体时,所述抗体优选地还基本上不含培养基,即,培养基占蛋白质制剂体积的小于约20%、10%或5%。当通过化学合成产生抗体时,所述抗体优选地基本上不含化学前体或其它化学品,即,所述抗体与合成蛋白质时涉及的化学前体或其它化学品分离。因此,除了所关注的抗体外,这种抗体制剂具有少于约30%、20%、10%、5%(按干重计)的化学前体或化合物。在优选的实施例中,本发明的抗体是分离或纯化的。
术语“卡巴特编号(Kabat numbering)”和类似术语是本领域公认的,并且是指对氨基酸残基进行编号的系统,所述氨基酸残基比抗体或其抗原结合部分的重链可变区中的其它氨基酸残基更具可变性(即高变的)(Kabat等人(1971)《纽约科学院年报(Ann.NYAcad.Sci.)》,190:382-391和/或Kabat等人(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列》,第五版,美国卫生和人类服务部,NIH出版号91-3242)。对于重链可变区,高变区通常在CDR1的氨基酸位置31到35、CDR2的氨基酸位置50到65和CDR3的氨基酸位置95到102的范围内。
如本文所用,“标记”或“标记的”是指向多肽添加可检测部分,例如放射性标记、荧光标记、酶促标记、化学发光标记或生物素基或金。放射性同位素或放射性核素可以包含3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、115In、125I、131I,荧光标记可以包含罗丹明、镧系元素磷或FITC,并且酶促标记可以包含辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性半乳糖苷酶。另外的标记包含,以说明而非限制的方式:酶,如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶和过氧化物酶;染料(例如花青染料,例如Cy5TM、Cy5.5TM或Cy7TM);另外的荧光标记或荧光剂包含,如荧光素和其衍生物、荧光染料、GFP(“绿色荧光蛋白”的GFP)、其它荧光蛋白(例如mCherry、mTomato)、丹酰、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺;荧光团,如镧系元素穴状化合物和螯合物,例如铕等(珀金埃尔默(Perkin Elmer)和Cisbio测定);化学发光标记物或化学发光剂,如异鲁米诺、鲁米诺和二氧杂环丁烷;感光剂;辅酶;酶底物;颗粒,如乳胶或碳颗粒;金属溶胶;微晶;脂质体;可以进一步用染料、催化剂或其它可检测基团标记的细胞等;分子,如生物素、洋地黄毒苷或5-溴脱氧尿苷;毒素部分,例如选自假单胞菌外毒素(PE或其细胞毒性片段或突变体)、白喉毒素或其细胞毒性片段或突变体、肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E或F、蓖麻毒蛋白或其细胞毒性片段,例如蓖麻毒蛋白A、相思豆蛋白或其细胞毒性片段、皂草素或其细胞毒性片段、商陆抗病毒毒素或其细胞毒性片段和异株泻根毒蛋白1或其细胞毒性片段。
当关于抗体使用时,术语“轻链”是指免疫球蛋白轻链,在哺乳动物中存在两种类型,λ(λ)和k(κ)。优选地,轻链是人轻链。优选地,轻链恒定区是人恒定区。在人群体中,存在多个轻链恒定区等位基因。这些等位基因变体的核苷酸和氨基酸序列可在公开可用的数据库如IMGT、ENSEMBL、Swiss-Prot和Uniprot上获得。在一个实施例中,本文公开的抗体或抗体片段包括由人k恒定区等位基因编码的蛋白质,所述恒定区等位基因包含但不限于IGKC*01(参见例如,本文的序列表)、IGKC*02(参见例如,本文的序列表)、IGKC*03(参见例如,本文的序列表)、IGKC*04(参见例如,本文的序列表)和IGKC*05(参见例如,本文的序列表)。在一个实施例中,本文公开的抗体或抗体片段包括由人λ恒定区等位基因编码的蛋白质,所述恒定区等位基因包含但不限于IGLC1*01(参见例如,本文的序列表)、IGLC1*02(参见例如,本文的序列表)、IGLC2*01(参见例如,本文的序列表)、IGLC2*02(参见例如,本文的序列表)、IGLC2*03(参见例如,本文的序列表)、IGLC3*01(参见例如,本文的序列表)、IGLC3*02(参见例如,本文的序列表)、IGLC3*03(参见例如,本文的序列表)、IGLC3*04(参见例如,本文的序列表)、IGLC6*01(参见例如,本文的序列表)、IGLC7*01(参见例如本文的序列表)、IGLC7*02(参见例如,本文的序列表)、IGLC7*03(参见例如,本文的序列表)。在另一个实施例中,本文公开的抗体和抗体片段包括由小鼠k恒定区等位基因编码的轻链恒定区,所述恒定区等位基因包含但不限于IGKC*01、IGKC*03或IGKC*03。在另一个实施例中,本文公开的抗体和抗体片段包括由小鼠λ恒定区等位基因编码的轻链恒定区,所述恒定区等位基因包含但不限于IGLC1*01、IGLC2*01或IGLC3*01。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”和“同源性”被定义为,在比对序列并引入缺口(如果必要的话)以实现最大序列同一性百分比之后并且在不将任何保守取代视为序列同一性的一部分的情况下,候选序列中的与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可以用本领域技术中的多种方式来实现出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的进行的比对,例如使用可公开获得的计算机软件,如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEG ALIGNTM(DNASTAR)软件。在一个实施例中,同源性%为约70%。在一个实施例中,同源性%为约75%。在一个实施例中,同源性%为约80%。在一个实施例中,同源性%为约85%。在一个实施例中,同源性%为约90%。在一个实施例中,同源性%为约92%。在一个实施例中,同源性%为约95%。在一个实施例中,同源性%为约97%。在一个实施例中,同源性%为约98%。在一个实施例中,同源性%为约99%。在一个实施例中,同源性%为100%。
当与如核酸分子、多肽、宿主细胞等生物材料结合使用时,术语“天然存在的”或“天然的”是指在自然界发现并且未被人类操控的那些材料。
如本文所用,“包装”是指如何将组分组织和/或限制为适合分配和/或使用的单元。包装可以包含例如盒、袋、注射器、安瓿、小瓶、管、蛤壳式包装、屏障和/或容器以保持无菌、贴标签等。
如本文所用,术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典、欧洲药典或其它普遍认可的药典中列出的可用于动物,并且更具体地可用于人类。
如本文所用,术语“多核苷酸”、“核苷酸”、核酸“核酸分子”和其它类似术语可互换使用,并且包含DNA、RNA、mRNA等。
如本文所用,术语“预防(prevent、preventing和prevention)”是指对hCD7介导的疾病和/或与其相关的症状的发展、复发、发作或扩散的全部或部分抑制,由施用本文提供的疗法或疗法的组合引起(例如预防剂或治疗剂的组合,如本发明的抗体)。
术语“可溶性”是指缺乏天然或膜相关形式中发现的一个或多个跨膜或细胞质结构域的多肽,如CD7和其变体或片段。在一个实施例中,“可溶性”形式的CD7缺乏跨膜结构域和细胞质结构域。
术语“受试者”或“患者”是指任何动物,包含但不限于哺乳动物。如本文所用,术语“哺乳动物”是指哺乳其幼崽并且生下活幼崽(真哺乳亚纲或胎盘哺乳动物)或产卵(后兽亚纲或非胎盘哺乳动物)的任何脊椎动物。哺乳动物物种的实例包含但不限于人类和其它灵长类动物,包含非人灵长类动物,如黑猩猩和其它猿类和猴类;家畜,如牛、绵羊、猪、山羊和马;家养哺乳动物,如狗和猫;实验动物,包含啮齿动物,如小鼠、大鼠(包含棉鼠)和豚鼠;鸟类,包含家禽、野生鸟类和野禽,如鸡、火鸡和其它鸡类鸟类、鸭、鹅等。
如本文所用,“基本上全部”是指至少约60%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或约100%。
如本文所用,术语“治疗剂”是指可以用于治疗、管理或改善CD7介导的疾病和/或与其相关的症状的任何药剂。在某些实施例中,术语“治疗剂”是指本发明的抗体。在某些其它实施例中,术语“治疗剂”是指除本发明的抗体之外的药剂。优选地,治疗剂是已知可用于或已用于或当前用于治疗、管理或改善CD7介导的疾病或与其相关的一种或多种症状的药剂。在具体实施例中,治疗剂是完全人抗CD7抗体,如完全人抗CD7单克隆抗体。
如本文所用,术语“疗法”是指可以用于预防、管理、治疗和/或改善CD7介导的疾病(例如癌症)的任何方案、方法和/或药剂。在某些实施例中,术语“疗法(therapies和therapy)”是指可用于预防、管理、治疗和/或改善本领域技术人员如医务人员已知的CD7介导的疾病的生物疗法、支持性疗法和/或其它疗法。
术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指由施用一种或多种疗法(包含但不限于施用一种或多种预防或治疗剂,如本发明的抗体)引起的hCD7介导的疾病(例如癌症)的进展、严重性和/或持续时间的减少或改善。
术语“可变区”或“可变结构域”是指轻链和重链的一部分,通常在重链中为氨基端约120到130个氨基酸,并且在轻链中为约100到110个氨基酸,其在抗体之间在序列上差异很大并且用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的可变性集中在被称为互补决定区(CDR)的那些区域中,而可变结构域中保守性更高的区域被称为框架区(FR)。CD7和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。本文使用的氨基酸位置的编号是根据EU索引的,如Kabat等人(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列》(美国卫生与公共服务部,华盛顿特区)第5版(“Kabat等人”)中。在优选的实施例中,可变区是人可变区。
细胞生物学和分子生物学中的常用术语定义可以在以下文献中找到:“默克诊断和治疗指南(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy)”,第19版,默克研究实验室(Merck Research Laboratories)出版,2006(ISBN 0-911910-19-0);Robert S.Porter等人(编辑),《分子生物学百科全书(The Encyclopedia of Molecular Biology)》,布莱克威尔科学有限责任公司(Blackwell Science Ltd.)出版,1994(ISBN 0-632-02182-9);Benjamin Lewin,《基因X(Genes X)》,琼斯和巴特利特出版社(Jones&BartlettPublishing)出版,2009(ISBN-10:0763766321);Kendrew等人,(编辑),《分子生物学与生物技术:全面案头参考资料(Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference)》,VCH出版公司(VCH Publishers,Inc.)出版,1995(ISBN1-56081-569-8)和《现代蛋白质科学指南(Current Protocols in Protein Sciences)2009,《威利跨学科(Wiley Intersciences)》,Coligan等人编辑。
除非另外说明,否则本发明是使用如例如在以下文献中所述的标准程序进行的:Sambrook等人,《分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第4版)》,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,美国(2012);Davis等人,《分子生物学的基本方法(Methods in Molecular Biology)》,美国纽约爱思唯尔科学出版公司(ElsevierScience Publishing,Inc.,New York,USA)(1995);或《酶学方法:分子克隆技术指南(Methods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning Techniques)》第152卷,编辑:S.L.Berger和A.R.Kimmel,学术出版社公司(AcademicPress Inc.),圣地亚哥,美国(1987);《现代蛋白质科学指南(CPPS)》(编辑:John E.Coligan等人,约翰威利父子出版公司(John Wiley and Sons,Inc.))、《现代细胞生物学指南(Current Protocols in CellBiology)(CPCB)》(编辑:Juan S.Bonifacino等人,约翰威利父子出版公司)以及《动物细胞培养:基本技术指南(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique)》作者:R.Ian Freshney,出版商:威利-里斯公司(Wiley-Liss);第5版(2005)、《动物细胞培养方法(Animal Cell Culture Methods)》(《细胞生物学方法(Methods in Cell Biology)》,第57卷,编辑:Jennie P.Mather和David Barnes,学术出版社,第1版,1998),所述文献均通过引用整体并入本文。
本文在本发明的各个方面的描述内定义了其它术语。
目标原理
CD7是Ig超家族的40kDa跨膜糖蛋白(1)。在T细胞个体发育早期期间,其在外周血T细胞、NK细胞、胸腺细胞和骨髓CD34+CD38-细胞的表面上表达(2)。除了晚期记忆T细胞和效应CD8+T细胞外,CD7在大多数T细胞上表达。在早期T细胞发育期间报告了CD7表达。然而,CD7不在造血谱系干细胞(HSC)中表达(2,3),表明HSC不会被抗CD7抗体影响。尽管大多数外周T细胞通常是CD7阳性的,但据报道,一小部分循环CD4+记忆细胞(CD4+CD45RA-CD45R0+)中没有CD7(4)。
CD7的天然配体尚未鉴定。CD7已被证明是充当共刺激分子,并且据报道抗CD7单克隆抗体(mAb)是促有丝分裂的,增加钙通量并且增加IL-2的产生(5)。CD7通过基于细胞质酪氨酸的YEDM基序与磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶)结合并与II型PI 4-激酶缔合(6)。然而,确切的信号传导机制仍然未知。尽管一些实验室报告了相对较小的免疫系统缺陷,如抗原特异性T细胞触发减少、抗原特异性细胞毒性T细胞生成缺陷和脂多糖诱导休克综合征的保护,但在CD7缺陷小鼠中未鉴定出主要表型异常(7,8)。
CD7可以在抗体结合后迅速内化,如在人T-ALL细胞系、CEM细胞上所证明的,其中在与抗体连接后,超过50%的细胞表面CD7在30分钟内被内化(9)。在用鼠-人嵌合抗体RFT2的临床研究中,据报道所述抗体在人中的半衰期约为12小时(10)。内化后,内化CD7的细胞内途径没有很好地描述,因为其可以再循环到细胞膜或直接发送到溶酶体进行降解。这种快速内化可能会影响治疗后患者中的单克隆抗体的药代动力学和药效学特征。
T-ALL和AML中的CD7
CD7在恶性未成熟T细胞上高度表达,并且在恶性成熟T细胞上通常不存在,如CD4+塞扎里白血病和HTLV-1+成人T细胞白血病细胞(11)。在来自从患有T-ALL的患者获得的诊断性骨髓样品的白血病细胞中,CD7表达的中位数百分比>99%(12)在从患有复发性T-ALL的患者收集的样品中也观察到高CD7表达水平。诊断或复发时白血病细胞中的CD7表达水平始终超过相同样品中的残留正常T细胞中测量的水平,并且标准护理(SoC)化疗不影响白血病细胞中的CD7表达。在化疗期间收集的含有微小残留病(MRD)的骨髓样品中,>99%的残留白血病细胞为CD7+。由于CD7表达水平在疗法期间保持高水平(12),CD7是用于诊断T-ALL的出色流式细胞术生物标志物(表5)。
除T-ALL外,CD7在15%的急性髓性白血病(AML)病例的白血病细胞上表达(13)。由于表观遗传机制的突变或沉默,此AML病例子集中的CD7表达与野生型CCAAT/增强子结合蛋白α(CEBPA)基因的丢失相关(14)。AML中的这种突变或表观遗传筛选具有潜在的临床重要性,允许对AML的子集进行分层以进行CD7靶向疗法。
总之,使用抗CD7单克隆抗体的细胞耗竭策略有望解决成人T-ALL和CD7+AML病状以及其它CD7+癌症中未满足的医疗需求。
正常T细胞发育是严格调节的过程,其中T祖细胞从骨髓迁移到胸腺并且分化为成熟和功能性T细胞。在此分化过程期间,癌基因和肿瘤抑制基因的失调可以驱动未成熟的胸腺细胞进入不受控制的克隆扩张并导致T-ALL(22)。T-ALL占所有ALL病例的约20%,并且在成人中比在儿童中更常见,但发病率随着年龄的增长而减少。患者通常呈现为高白血细胞计数,并且也可能呈现为器官肿大,尤其是纵隔肿大。尽管对T-ALL疾病生物学的了解改善,但护理标准(SoC)在过去十年内很大程度上保持不变,并且仍然由可能随后进行自体造血干细胞移植的强化多药化学疗法。在此SoC的情况下,接受治疗的儿童和成人分别有20%和40%的复发率(23,24)。复发性和难治性环境中的长期生存率非常低,其中不到5%的患者随后达到再次应答。许多患有难治性或复发性B细胞淋巴细胞白血病的患者在接受新一代靶向疗法后,均实现了完全缓解并延长了生存率(25)然而,用于T-ALL治疗的新药开发活动很少,可能是由于其患者群体大小相对较小。
T-ALL恶性肿瘤表示一组血液系统癌症,其中在不存在有效靶向疗法的患者中具有高复发率和死亡率。在改善患有复发性和难治性T-ALL的患者的临床结果方面仍有很大的未满足医疗需求。
因此,在一个方面,本发明可用于治疗T-ALL,如难治性T-ALL。
因此,本发明提供了各种抗CD7抗体和片段(如Fab或scFv片段)、用途和方法。实例在以下编号的条款中列出。
1.一种抗体或片段,其包括与CD7(分化簇7)特异性结合的结合位点,其中所述结合位点包括由源自人VH基因区段、DH基因区段和JH基因区段的重组的核苷酸序列编码的VH结构域,其中所述VH基因区段选自IGHV3-15和IGHV3-23。
在实例中,所述VH基因区段是IGHV3-15*01或IGHV3-23*04。例如,所述DH基因区段和JH基因区段是人基因区段。
在实例中,如下文进一步描述的,在KD、Koff和/或Kon下进行特异性结合。在实例中,在KD为1pM到5nM下进行特异性结合。
技术人员熟悉人类和其它物种的抗体基因区段的数据库和其它来源。例如,IMGT数据库(www.IMGT.org)是合适的来源,例如2018年9月1日的版本。
参考实例,示出了基于IGHV3-15或IGHV3-23的抗体。令人惊奇的是,这些人VH基因区段产生具有期望的抗CD7性质的抗CD7抗体,如实例中描述的那些。
2.根据条款1所述的抗体或片段,其中所述DH基因区段是选自IGHD3-9、IGHD3-10和IGH6-19的人基因区段。
在实例中,所述DH基因区段是选自IGHD3-9*01、IGHD3-10*01和IGH6-19*01的人基因区段。
3.根据条款1或2所述的抗体或片段,其中所述JH基因区段是选自IGHJ6、IGHJ4和IGHJ5的人基因区段。
在实例中,所述JH基因区段是选自IGHJ6*02、IGHJ4*02和IGHJ5*02的人基因区段。
4.根据前述条款中任一项所述的抗体或片段,其中所述结合位点包括选自SEQ IDNO:3、6、23、26、43、46、63和66的CDRH3序列。
5.根据前述条款中任一项所述的抗体或片段,其中所述结合位点包括(i)SEQ IDNO:7的与包括SEQ ID NO:17的VL结构域配对的VH结构;(ii)包括SEQ ID NO:27的与包括SEQ ID NO:37的VL结构域配对的VH结构;(iii)包括SEQ ID NO:47的与包括SEQ ID NO:57的VL结构域配对的VH结构;或(iv)包括SEQ ID NO:67的与包括SEQ ID NO:77的VL结构域配对的VH结构域。
6.根据前述条款中任一项所述的抗体或片段,其中所述结合位点包括包含SEQ IDNO:7的VH结构域。
7.根据前述条款中任一项所述的抗体或片段,其中所述结合位点包括SEQ ID NO:7的与包括SEQ ID NO:17的VL结构域配对的VH结构。
8.一种抗体或片段,其与CD7特异性结合并且包括根据前述条款中任一项所述的抗CD7抗体的CDRH3序列,或所述包括3、2或1种氨基酸取代的CDRH3序列。
9.一种(任选地根据前述条款中任一项所述的)抗体或片段,其与CD7特异性结合并且包括VH结构域,所述VH结构域包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的CDRH3序列或所述包括3、2或1种氨基酸取代的序列。
10.根据条款9所述的抗体或片段,其中所述VH结构域包括(i)选自G09、F05、C02和E04的抗体的CDRH3序列;或所述包括3、2或1种氨基酸取代的CDRH3序列;以及(ii)所述所选抗体的CDRH1序列;或所述包括3、2或1种氨基酸取代的CDRH1序列。
11.根据条款9或10所述的抗体或片段,其中所述VH结构域包括(iii)选自G09、F05、C02和E04的抗体的CDRH3序列;或所述包括3、2或1种氨基酸取代的CDRH3序列;以及(iv)所述所选抗体的CDRH2序列;或所述包括3、2或1种氨基酸取代的CDRH2序列。
12.一种(任选地根据前述条款中任一项所述的)抗体或片段,其包括与CD7特异性结合的结合位点,其中所述结合位点包括VH结构域,所述VH结构域包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的VH结构域的氨基酸序列;或与其至少70%相同的氨基酸。
例如,所述同一性为至少85%。例如,所述同一性为至少90%。例如,所述同一性为至少95%。
13.根据条款9、10、11或12所述的抗体或片段,其中所述所选抗体为G09。
14.根据前述条款中任一项所述的抗体或片段,其包括所述VH结构域的第一拷贝和第二拷贝。
在实例中,所述抗体或片段包括结合位点,所述结合位点包括与本发明的VL结构域配对的本发明的VH结构域,其中所述结合位点能够与CD7(例如,成熟的CD7,例如人和/或食蟹猴CD7)特异性结合。例如,所述抗体或片段包括此类结合位点中的两个结合位点。
15一种(任选地根据前述条款中任一项所述的)抗体或片段,其包括与CD7特异性结合的结合位点,其中所述结合位点包括由源自人VL基因区段和JL基因区段的重组的核苷酸序列编码的VL结构域,其中所述VL基因区段选自IGKV1D-39、IGKV1-39、IGKV3-11、IGKV1-16和IGKV1-5。
在实例中,所述VL基因区段选自IGKV1D-39*01、IGKV1-39*01、IGKV3-11*01、IGKV1-16*02和IGKV1-5*03;或选自IGKV1D-39*01、IGKV3-11*01、IGKV1-16*02和IGKV1-5*03。
16根据条款15所述的抗体或片段,其中VL是Vκ并且所述JL基因区段是选自IGKJ1和IGKJ4的人基因区段。
在实例中,VI是Vκ并且所述JL基因区段是选自IGKJ1*01和IGKJ4*01的人基因区段。
17.一种抗体或片段,其与CD7特异性结合并且包括根据前述条款中任一项所述的抗CD7抗体的CDRL3序列,或所述包括3、2或1种氨基酸取代的CDRL3序列。
18一种(任选地根据前述条款中任一项所述的)抗体或片段,其与CD7特异性结合并且包括VL结构域,所述结构域包括选自SEQ ID NO:13、16、33、36、53、56、73和76的CDRL3序列或所述包括3、2或1中氨基酸取代的所选CDRL3序列。
19.一种(任选地根据前述条款中任一项所述的)抗体或片段,其与分化簇7(CD7)特异性结合并且包括VL结构域,所述结构域包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的CDRL3(以及任选地CDRH3)序列;或所述各自包括3、2或1种氨基酸取代的序列。
20.根据条款19所述的抗体或片段,其中所述VL结构域包括(i)选自G09、F05、C02和E04的抗体的CDRL3序列(以及任选地CDRH3);或所述各自包括3、2或1种氨基酸取代的CDR3序列;以及(ii)所述所选抗体的CDRL1(以及任选地CDRH1)序列;或所述各自包括3、2或1种氨基酸取代的CDR1序列。
优选地,本文中的所选抗体是G09或包括G09的可变结构域。
21.根据条款19或20所述的抗体或片段,其中所述VL结构域包括(iii)选自G09、F05、C02和E04的抗体的CDRL3(以及任选地CDRH3)序列;或所述各自包括3、2或1种氨基酸取代的CDR3序列;以及(iv)所述所选抗体的CDRL2(以及任选地CDRH2)序列;或所述各自包括3、2或1种氨基酸取代的CDR2序列。
22.一种(任选地根据前述条款中任一项所述的)抗体或片段,其包括与CD7特异性结合的结合位点,其中所述结合位点包括VL结构域,所述VL结构域包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的VL结构域的氨基酸序列;或与其至少70%相同的氨基酸。
任选地,提供了一种(任选地根据前述条款中任一项所述的)抗体或片段,其包括与分化簇7(CD7)特异性结合的结合位点,其中所述结合位点包括VL结构域,所述VL结构域包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的VL结构域的氨基酸序列;或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99%相同的氨基酸。
例如,所述同一性为至少85%。例如,所述同一性为至少90%。例如,所述同一性为至少95%。
任选地,所述抗体或片段包括所述VL结构域的第一拷贝和第二拷贝。
在实例中,所述抗体或片段包括结合位点,所述结合位点包括与VH结构域配对的本发明的VL结构域,其中所述结合位点能够与CD7(例如,成熟的CD7,例如人和/或食蟹猴CD7)特异性结合。例如,所述抗体或片段包括此类结合位点中的两个结合位点。
23.一种(任选地根据前述条款中任一项所述的)抗体或片段,其与分化簇7(CD7)特异性结合并且包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的重链氨基酸序列;或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99%相同的氨基酸。
例如,所述同一性为至少85%。例如,所述同一性为至少90%。例如,所述同一性为至少95%。
24.一种(任选地根据前述条款中任一项所述的)抗体或片段,其与分化簇7(CD7)特异性结合并且包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的轻链氨基酸序列;或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99%相同的氨基酸。
例如,所述同一性为至少85%。例如,所述同一性为至少90%。例如,所述同一性为至少95%。
25.根据条款23所述的抗体或片段,其包括所述所选抗体的轻链氨基酸序列;或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99%相同的氨基酸。
例如,所述同一性为至少85%。例如,所述同一性为至少90%。例如,所述同一性为至少95%。
26.一种(任选地根据前述条款中任一项所述的)抗体或片段,其与人CD7表位特异性结合,所述表位与根据前述条款中任一项所述的抗体结合的表位相同。
27.根据条款26所述的抗体或片段,其中所述表位通过无关氨基酸扫描或通过X-射线晶体学鉴定。
涉及抗体和抗原相互作用的接触氨基酸残基可以通过本领域技术人员已知的各种方法确定。
在一个实施例中,顺序替代抗原序列的氨基酸(使用标准分子生物学技术来使抗原的编码序列的DNA突变),在这种情况下用丙氨酸(又名丙氨酸扫描)或另一种无关的氨基酸替代CD7,可能会提供残基,所述残基的突变会降低或消除抗体识别相关抗原的能力。可以使用标准技术评估结合,例如但不限于SPR、HTRF、ELISA(其在本文别处描述)。可以进行其它取代以增强结合的破坏,如改变抗原序列氨基酸的侧链上的电荷(例如赖氨酸变为谷氨酸)、转换极性和非极性残基(例如丝氨酸变为亮氨酸)。丙氨酸扫描或其它氨基取代方法可以用重组可溶性抗原进行,或者在靶标是细胞膜靶标的情况下,使用突变版本的瞬时或稳定表达直接在细胞上进行。
在一个实施例中,蛋白质晶体学可以用于确定抗体与抗原之间的接触残基(即确定抗体结合的表位),晶体学允许涉及抗体-抗原相互作用的接触残基的直接可视化。除了标准的X射线晶体学,冷冻电子显微镜已被用于确定抗体与HIV衣壳蛋白之间的接触残基(参见Lee、Jeong Hyun等人“针对gp41构象表位的抗体通过破坏Env尖峰来中和HIV-l(Antibodies to a conformational epitope on gp41 neutralize HIV-1 bydestabilizing the Env spike.)”,《自然通讯(Nature communications)》,6,(2015))。
在一个实施例中,如果抗体识别线性表位,则可以产生基于抗原序列的短肽并且可以使用标准技术如但不限于SPR、HTRF、ELISA(其在本文别处描述)来评估抗体与这些肽的结合。通过对任何显示结合的肽进行丙氨酸扫描,可以提供对表位的进一步研究。作为线性肽的替代方案,可以使用肽扫描(Pepscan)技术(http://www.pepscan.com/)使用肽到支架上的化学键进行构象扫描,所述技术已用于确定CD20靶向抗体上的不连续表位(Niederfellner、Gerhard等人“GA101的表位表征和晶体结构为CD20抗体I/II型区分的分子基础提供了见解(Epitope characterization and crystal structure of GA101provide insights into the molecular basisfortype I/II distinction ofCD20antibodies.)”,《血液(Blood)》,118.2,(2011),358-367)。
在一个实施例中,可以使用有限的蛋白水解消化和质谱法来鉴定结合表位。抗体-抗原复合物被蛋白酶(如但不限于胰蛋白酶)消化。将消化的复合肽与单独的抗体和单独的抗原消化质谱进行比较,以确定特定表位是否受复合保护。然后可以采用涉及氮基酸取代、竞争结合的进一步工作来缩小涉及相互作用的单独的氨基酸残基(参见例如,Suckau,Detlev等人“通过固定化抗原-抗体复合物的有限蛋白水解和质谱肽图进行分子表位鉴定(Molecular epitope identification by limited proteolysis of an immobilizedantigen-antibody complex and mass spectrometric peptide mapping.)”,《美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academyof Sciences)》,87.24,(1990),9848-9852)。
因此,在一个实施例中,表位的接触残基用无关氨基酸扫描(例如丙氨酸扫描)鉴定。在另一个实施例中,使用选自SPR、HTRF、ELISA、X-射线晶体学、冷冻电子显微镜和有限蛋白水解消化和质谱法的组合的技术进行无关氨基酸扫描(例如丙氨酸扫描)。在一个实施例中,无关氨基酸扫描(例如丙氨酸扫描)使用HTRF进行。在一个实施例中,无关氨基酸扫描(例如丙氨酸扫描)使用ELISA进行。
当用ELISA或HTRF进行丙氨酸扫描时,如果信号减少至少25%,则氨基酸残基被鉴定为对表位有贡献。在一个实施例中,信号降低至少30%。在一个实施例中,信号降低至少35%。在一个实施例中,信号降低至少40%。在一个实施例中,信号降低至少45%。在一个实施例中,信号降低至少50%。在一个实施例中,信号降低至少55%。在一个实施例中,信号降低至少60%。在一个实施例中,信号降低至少70%。在一个实施例中,信号降低至少75%。在一个实施例中,信号降低至少80%。在一个实施例中,信号降低至少85%。在一个实施例中,信号降低至少90%。
当用SPR进行丙氨酸扫描时,如果亲和力降低至少10倍,则氨基酸残基被鉴定为对表位有贡献。在一个实施例中,亲和力降低至少15倍。在一个实施例中,亲和力降低至少20倍。在一个实施例中,亲和力降低至少30倍。在一个实施例中,亲和力降低至少40倍。在一个实施例中,亲和力降低至少50倍。在一个实施例中,亲和力降低至少100倍。
在一个实施例中,表位的接触残基通过X射线晶体学鉴定。在一个实施例中,表位的接触残基通过冷冻电子显微镜鉴定。在一个实施例中,表位的接触残基通过有限蛋白水解消化和质谱法的组合来鉴定。
28.根据条款27所述的抗体或片段,其中所述表位的接触残基通过在无关氨基酸扫描例如通过SPR确定的丙氨酸扫描中亲和力降低至少10倍来定义。
在一个实施例中,亲和力降低至少15倍。在一个实施例中,亲和力降低至少20倍。在一个实施例中,亲和力降低至少30倍。在一个实施例中,亲和力降低至少40倍。在一个实施例中,亲和力降低至少50倍。在一个实施例中,亲和力降低至少100倍。SPR可以如本文所描述进行。
29.一种(任选地根据前述条款中任一项所述的)抗体或片段,其与根据前述条款中任一项所述的抗体竞争与人CD7结合。
任选地,通过表面等离子体共振(SPR)或ELISA确定竞争。例如,技术人员将熟悉这些技术和标准条件。
在一个实施例中,所述抗体或片段与hCD7(或其融合蛋白)竞争(例如以剂量依赖性方式)结合细胞表面表达的hCD7。在一个实施例中,所述抗体或片段与hCD7(或其融合蛋白)竞争(例如以剂量依赖性方式)结合可溶性hCD7。
任选地,使用SPR进行与hCD7结合的竞争。SPR可以如本文所描述进行。
30.根据前述条款中任一项所述的抗体或片段,其与以下特异性结合:包括SEQ IDNO:82的人CD7;和/或包括SEQ ID NO:85的食蟹猴CD7;和/或包括SEQ ID NO:86的大鼠CD7。
在一个实例中,本文中的CD7是人、小鼠或食蟹猴CD7。
在一个实施例中,所述抗体或片段以小于1nM(例如1nM到0.01pM、或1nM到0.1pM或1nM到1pM)的亲和力与食蟹猴CD7结合。在一个实施例中,所述抗体或片段以小于10nM(例如10nM到0.01pM、或10nM到0.1pM或10nM到1pM)的亲和力与食蟹猴CD7结合。在一个实施例中,所述抗体或片段以小于0.1nM(例如0.1nM到0.01pM、或0.1nM到0.1pM或0.1nM到1pM)的亲和力与食蟹猴CD7结合。在一个实施例中,所述抗体或片段以小于0.01nM(例如0.011nM到0.01pM或0.01nM到0.1pM)的亲和力与食蟹猴CD7结合。
在一个实施例中,所述抗体或片段以与hCD7的亲和力的2倍以内的亲和力与食蟹猴CD7结合。在一个实施例中,所述抗体或片段以与hCD7的亲和力的4倍以内的亲和力与食蟹猴CD7结合。在一个实施例中,所述抗体或片段以与hCD7的亲和力的5倍以内的亲和力与食蟹猴CD7结合。在一个实施例中,所述抗体或片段以与hCD7的亲和力的6倍以内的亲和力与食蟹猴CD7结合。在一个实施例中,所述抗体或片段以与hCD7的亲和力的8倍以内的亲和力与食蟹猴CD7结合。在一个实施例中,所述抗体或片段以与hCD7的亲和力的10倍以内的亲和力与食蟹猴CD7结合。
本文中的“hCD7”是人CD7,例如本文公开的人CD7。
在一个实施例中,所述抗体或片段不与食蟹猴CD7可检测地结合。在一个实施例中,所述抗体或片段不与鼠类(例如,小鼠和/或大鼠)CD7可检测地结合。
在一个实施例中,所述抗体或片段以小于1nM(例如1nM到0.01pM、或1nM到0.1pM或1nM到1pM)的亲和力与鼠类(例如,小鼠和/或大鼠)CD7结合。在一个实施例中,所述抗体或片段以小于10nM(例如10nM到0.01pM、或10nM到0.1pM或10nM到1pM)的亲和力与鼠类CD7结合。在一个实施例中,所述抗体或片段以小于0.1nM(例如0.1nM到0.01pM、或0.1nM到0.1pM或0.1nM到1pM)的亲和力与鼠类CD7结合。在一个实施例中,所述抗体或片段以小于0.01nM(例如0.011nM到0.01pM或0.01nM到0.1pM)的亲和力与鼠类CD7结合。
任选地,所述抗体或片段包括效应子使能的恒定区,如人恒定区,例如IgG1恒定区。任选地,所述抗体或片段包括含鼠类(例如,小鼠和/或大鼠)恒定区。任选地,所述抗体或片段包括本文所描述的任何重链恒定区序列。
31.根据前述条款中任一项所述的抗体或片段,其中所述抗体或片段包括人恒定区,例如IgG1恒定区。
任选地,所述恒定区是IgG1恒定区,任选地所述恒定区包括本文公开的任何IgG1恒定区氨基酸序列。任选地,所述恒定区是IgG2恒定区,任选地所述恒定区包括本文公开的任何IgG1恒定区氨基酸序列。任选地,所述恒定区是IgG1恒定区,任选地所述恒定区包括本文公开的任何IgG3恒定区氨基酸序列。任选地,所述恒定区是IgG1恒定区,任选地所述恒定区包括本文公开的任何IgG4恒定区氨基酸序列。
在实例中(任选地除了根据紧接上述段落的重链区之外),所述恒定区包括轻链恒定区,所述轻链恒定区包括本文公开的任何轻链恒定区氨基酸序列。
32.根据条款31所述的抗体或片段,其中所述恒定区是IgGl恒定区,任选地所述恒定区包括SEQ ID NO:88、90、92、94或96(例如,SEQ ID NO:88)的氨基酸序列。
在其它实施例中,所述抗体或片段是如本文所定义的同种型或恒定区中的任何同种型或恒定区。在一个实施例中,所述恒定区是野生型人IgGl。例如,所述恒定区是效应子使能的IgG1恒定区,任选地具有ADCC和/或CDC活性。在一个实施例中,所述恒定区被工程化用于增强的ADCC和/或CDC和/或ADCP。在另一个实施例中,所述恒定区被工程化用于增强效应子功能。
Fc介导的作用的效力可以通过本领域技术人员显而易见的技术中的任何技术工程化Fc结构域来增强。在另一个实施例中,本文公开的抗体和片段可以包括增强与FcRn结合的三重突变(M252Y/S254T/T256E)。
33.根据前述条款中任一项所述的抗体或片段(例如,双特异性抗体),其进一步包括特异性结合另一个靶抗原(任选地人CD5、CD14或CD1g,例如用于治疗白血病,如AML)的抗原结合位点。
例如,所述另一个靶抗原是人CD5。
在实例中,所述另外的结合位点是所述另一个抗原的激动剂结合位点。在实例中,所述另外的结合位点是所述另一个抗原的拮抗剂结合位点。
在实例中,所述另外的结合位点是包括VH和VL的抗体结合位点;由抗体的恒定结构域(例如,Fcab结合位点)包括的结合位点或非免疫球蛋白结合位点(例如,纤连蛋白结构域)。任选地,所述抗原结合位点是本文公开的任何抗原结合位点。
例如,所述抗体或片段是双特异性抗体或片段。例如,所述抗体或片段是双重结合抗体或片段,或包括根据前述条款中任一项所述的抗体或其片段的融合蛋白。双重结合抗体具有如上所述的含义。
在实例中,所述抗体、片段或融合蛋白包括双特异性形式,所述双特异性形式选自DVD-Ig、mAb2、FIT-Ig、mAb-dAb、对接和锁定、SEEDbody、scDiabody-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、Diabody-CH3、微抗体、隆凸入孔、具有共同轻链的隆凸入孔,具有共同轻链和电荷对的隆凸入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对,具体是mAb2、隆凸入孔、具有共同轻链的隆凸入孔、具有共同轻链和电荷对的隆凸入孔以及FIT-Ig,例如mAb2和FIT-Ig。
在一个实施例中,所述双特异性形式选自DVD-Ig、mAb2、FIT-Ig、mAb-dAb、对接和锁定、Fab-臂交换、SEEDbody、三功能抗体、LUZ-Y、Fcab、kλ主体、正交Fab、scDiabody-Fc、双功能抗体Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、双功能抗体-CH3、三联体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、隆凸入孔、具有共同轻链的隆凸入孔,具有共同轻链和电荷对的隆凸入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig和zybody。
在一个实施例中,所述双特异性抗体选自DVD-Ig、FIT-Ig、mAb-dAb、对接和锁定、Fab-臂交换、SEEDbody、三功能抗体、LUZ-Y、Fcab、κλ主体、正交Fab、scDiabody-Fc、双功能抗体Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、双功能抗体-CH3、三联体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、隆凸入孔、具有共同轻链的隆凸入孔,具有共同轻链和电荷对的隆凸入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig和zybody,例如DVD-Ig、FIT-Ig、mAb-dAb、对接和锁定、SEEDbody、scDiabody-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、Diabody-CH3、微抗体、隆凸入孔、具有共同轻链的隆凸入孔,具有共同轻链和电荷对的隆凸入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对,具体是隆凸入孔、具有共同轻链的隆凸入孔、具有共同轻链和电荷对的隆凸入孔以及FIT-Ig,例如FIT-Ig。
在一个实施例中,所述双特异性抗体选自DVD-Ig、mAb2、mAb-dAb、对接和锁定、Fab-臂交换、SEEDbody、三功能抗体、LUZ-Y、Fcab、κλ主体、正交Fab、scDiabody-Fc、双功能抗体Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、双功能抗体-CH3、三联体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、隆凸入孔、具有共同轻链的隆凸入孔,具有共同轻链和电荷对的隆凸入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig和zybody,例如DVD-Ig、mAb2、mAb-dAb、对接和锁定、SEEDbody、scDiabody-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、Diabody-CH3、微抗体、隆凸入孔、具有共同轻链的隆凸入孔,具有共同轻链和电荷对的隆凸入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对,具体是mAb2、隆凸入孔、具有共同轻链和电荷对的隆凸入孔以及具有共同轻链的隆凸入孔,例如mAb2。
在一个实施例中,所述双特异性抗体选自DVD-Ig、mAb-dAb、对接和锁定、Fab-臂交换、SEEDbody、三功能抗体、LUZ-Y、Fcab、κλ主体、正交Fab、scDiabody-Fc、双功能抗体Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、双功能抗体-CH3、三联体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、隆凸入孔、具有共同轻链的隆凸入孔,具有共同轻链和电荷对的隆凸入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig和zybody,例如DVD-Ig、mAb-dAb、对接和锁定、SEEDbody、scDiabody-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、Diabody-CH3、微抗体、隆凸入孔、具有共同轻链的隆凸入孔,具有共同轻链和电荷对的隆凸入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对,具体是隆凸入孔、具有共同轻链和电荷对的隆凸入孔以及具有共同轻链的隆凸入孔。
34.一种如前述条款中任一项中所定义的抗CD7抗体或片段,其用于治疗或预防受试者的CD7介导的疾病或病状(任选地癌症,如白血病或淋巴瘤)。
35.根据条款34所述的抗CD7抗体或片段,其中所述疾病或病状选自白血病、淋巴瘤、血癌和骨髓增生异常综合征(MDS)。
在实例中,受试者是人。在替代方案中,受试者是非人类动物。在实例中,受试者是成年人。在实例中,受试者是小儿人。
在实例中,本文中的所述抗体或片段用于治疗或预防受试者(例如人)的疾病或病状,所述疾病或病状选自
·T细胞急性淋巴细胞白血病;
·具有CD7表达的急性髓系白血病;
·前体T细胞淋巴母细胞淋巴瘤;
·T细胞幼淋巴细胞白血病;
·T细胞大颗粒淋巴细胞白血病;
·外周T细胞淋巴瘤;
·血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤;
·结外NK/T细胞淋巴瘤,鼻型;
·肠病型肠T细胞淋巴瘤;以及
·肝脾T细胞淋巴瘤。
在实例中,所述疾病或病状处于人中。在实例中,所述疾病或病状处于动物中。
在实例中,所述本发明的抗体或片段用于治疗或预防人的CD7介导的疾病或病状,所述疾病或病状例如选自肿瘤或非肿瘤疾病、慢性病毒感染和恶性肿瘤,如黑色素瘤、默克尔细胞癌、非小细胞肺癌(鳞状和非鳞状)、肾细胞癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌、间皮瘤、病毒诱导的癌症(如宫颈癌和鼻咽癌)、软组织肉瘤、血液系统恶性肿瘤,如霍奇金氏病和非霍奇金氏病以及弥漫性大B细胞淋巴瘤。
在实例中,所述CD7介导的疾病或病状是神经退行性疾病、病症或病状,例如选自阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、原发性进行性多发性硬化症、继发性进行性多发性硬化症、皮质基底变性、雷特综合征(Rett syndrome)、选自年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性的视网膜变性病症;前部缺血性视神经病变、青光眼、葡萄膜炎、抑郁症、创伤相关压力或创伤后应激障碍、额颞叶痴呆、路易体痴呆、轻度认知障碍、后皮质萎缩、原发性进行性失语症和进行性核上性麻痹或老年性痴呆,具体地,神经变性疾病、病症或病状选自阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森氏病和亨廷顿氏病,例如阿尔茨海默病。
在实例中,所述本发明的抗体、片段、组合向所述受试者静脉内施用;或者用于向所述受试者静脉内施用。在实例中,所述本发明的抗体、片段、组合向所述受试者皮下施用;或者用于向所述受试者皮下施用。
36.根据条款33所述的抗体或片段,其中将所述抗体或片段与化学疗法、放射疗法或免疫检查点抑制剂同时或顺序地施用于所述受试者。
任选地,所述化学疗法选自奈拉滨(nelarabine);环磷酰胺;长春新碱;阿霉素;以及与甲氨蝶呤和阿糖胞苷交替的地塞米松(dexamethasone)。
37.一种一定量的抗CD7抗体或片段和一定量的化学治疗剂的组合(任选地包括多剂量的所述抗体和/或药剂),其中所述抗体或片段是根据条款1到36中任一项所述的抗体或片段。
还提供了:一种医疗试剂盒,其包括所述组合、包括所述量的抗体或片段的第一无菌容器和包括所述量的化学治疗剂的第二无菌容器,以及任选地用于使用所述组合治疗受试者的癌症的说明书。
38.根据条款1到37中任一项所述的抗体、片段或组合,其用于治疗人的白血病的方法中,其中所述抗体、片段或组合任选地与人CD5、CD14或CD19的拮抗剂一起施用于所述人。
39.根据条款38所述的抗体、片段或组合,其中所述白血病是急性髓性白血病或T-ALL,或者是复发性白血病(例如,复发性AML或T-ALL)。
40.根据条款1到37中任一项所述的抗体、片段或组合,其用于治疗人或动物受试者的由所述受试者的CD7+细胞介导的疾病或病状的方法中,其中所述方法包括向所述受试者施用所述抗体、组合的片段,其中CD7细胞被靶向和杀死,任选地通过ADCP和/或CDC。
41.一种根据前述条款中任一项所述的抗体、片段或组合的用途,其用于制造用于施用于受试者以治疗或预防CD7介导的疾病或病状,任选地癌症的药物。
42.一种治疗或预防受试者的CD7介导的疾病或病状(任选地癌症)的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据条款1到40中任一项所述的抗体、片段或组合,其中其中所述CD7介导的疾病或病状由此被治疗或预防。
43.根据条款41所述的用途或根据条款42所述的方法,其中其中所述CD7介导的疾病或病状是白血病(任选地T-ALL)。
44.根据条款34到43中任一项所述的抗体、片段、组合、用途或方法,其进一步包括向所述受试者施用另外的疗法,例如另外的治疗剂,任选地其中所述另外的治疗剂选自由以下组成的组:
a.环磷酰胺;
b.长春新碱;
c.阿霉素;
d.地塞米松;
e.甲氨蝶呤;
f.阿糖胞苷;以及
g.奈拉滨。
45.一种药物组合物,其包括根据条款1到40和44中任一项所述的抗体、片段或组合以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体,并且任选地与选自条款44中所述的药剂的另外治疗剂组合。
46.根据条款45所述的药物组合物,其用于治疗和/或预防CD7介导的病状或疾病,任选地癌症。
47.根据条款45或46所述的药物组合物,其与标签或说明书组合以用于治疗和/或预防人的所述疾病或病状;任选地,其中所述标签或说明包括营销授权编号(任选地,FDA或EMA授权编号);任选地其中所述试剂盒包括包含所述抗体或片段的IV或注射装置。
48.一种核酸,其对根据条款1到33中任一项所述的抗体或片段的VH结构域和/或VL结构域进行编码。
49.一种核酸,其对以下进行编码:包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的VH结构域的氨基酸序列的VH结构域;或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99%相同的氨基酸。
例如,所述同一性为至少85%。例如,所述同一性为至少90%。例如,所述同一性为至少95%。
50.一种核酸,其对以下进行编码:包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域;或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99%相同的氨基酸。
任选地,所述核酸还对以下进行编码:包括所选抗体的VH结构域的氨基酸序列的VH结构域;或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99%相同的氨基酸。例如,所述同一性为至少85%。例如,所述同一性为至少90%。例如,所述同一性为至少95%。
51.一种核酸,其包括
(a)与SEQ ID NO:10的序列至少70%相同的核苷酸序列;和/或
(b)与SEQ ID NO:20的序列至少70%相同的核苷酸序列。
52.一种核酸,其对根据条款1到33中任一项所述的抗体或片段的重链和/或轻链进行编码。
53.一种核酸,其对包括与SEQ ID NO:8至少70%相同的氨基酸序列的重链进行编码。
54.一种核酸,其对包括与SEQ ID NO:18至少70%相同的氨基酸序列的轻链进行编码。
55.一种核酸(例如,宿主细胞中,例如,CHO或HEK293或Cos细胞),其包括
(a)与选自G09、F05、C02和E04的抗体的所选重链序列至少70%相同的核苷酸序列;和/或
(b)与选自G09、F05、C02和E04的抗体的所选序列至少70%相同的核苷酸序列。
本文在提及同一性%的任何实例中,在示例中存在100%同一性。
56.一种核酸,其对根据条款1到32中任一项所述的抗体或片段的重链和/或轻链进行编码。
本发明的所有核酸均可在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中表达,例如用于表达本发明的抗体或片段的可变结构域或链。
57.一种载体,其包括所述核酸(例如,根据条款48到55中任一项所述的核酸);任选地其中所述载体是CHO或HEK293载体。
58.一种宿主细胞,其包括所述核酸(例如,根据条款48到55中任一项所述的核酸)或根据条款57所述的载体。
59.根据前述条款中任一项所述的抗体、片段、组合、载体、宿主细胞、组合物、用途或方法,其中所述抗体或片段包括IgG1(例如,人IgG1或IgG1*01)恒定区。
60.根据条款59所述的抗体、片段、组合、载体、宿主细胞、组合物、用途或方法,其中所述恒定区包括IgG1 CH3区中的位置430处的甘氨酸、位置356处的精氨酸和/或位置357处的精氨酸(根据EU编号)。
61.根据条款59所述的抗体、片段、组合、载体、宿主细胞、组合物、用途或方法,其中所述恒定区包括位置430处的甘氨酸。
62.如本文所描述的抗体、片段、组合、载体、宿主细胞、组合物、用途或方法。
本发明提供:
一种诊断受试者的CD7介导的疾病或病状(任选地癌症)的方法,所述方法包括将本发明的抗体或片段与分离的细胞样品(例如,血液或血清样品)组合以及确定由所述样品包括的细胞被所述抗体或片段特异性结合。
还提供了:
一种用于检测样品中的CD7阳性细胞的体外测定,所述测定包括将本发明的抗体或片段与分离的细胞样品(例如,血液或血清样品)组合以及确定由所述样品包括的细胞被所述抗体或片段特异性结合。
所述疾病或病状可以是本文公开的任何疾病或病状。检测可以通过任何常规方式,例如,使用如荧光标记、ELISA或RIA等标记。
在实例中,所述抗体或片段包括9、10、11或12个残基,例如10个,例如11个残基的HCDR3长度。在实例中,所述抗体或片段包括7、8或9个残基,例如8个,例如9个残基的LCDR3长度。在实例中,所述抗体或片段的每个VH结构域包括1-11个非种系残基,例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个非种系残基。在实例中,所述抗体或片段的每个VL结构域包括3-8个非种系残基,例如3个、4个、5个、6个、7个或8个非种系残基。
在实施例中,本文中的CDR序列是根据Kabat确定的。在替代方案中,CDR序列是根据IMGT确定的。
在实例中,所述所选抗体是G09。
在实例中,所述所选抗体包括G09、F05、C02或E04的重链。在实例中,所述所选抗体包括G09的重链。
在实例中,本发明的抗体或片段的重链是人γ-1、γ-2、γ-3、γ-4、μ、δ、ε或α同种型,优选地γ同种型(例如,IgG4同种型)。在实例中,本发明的抗体或片段的轻链包括人κ恒定区。可替代地,在实例中,本发明的抗体或片段的轻链包括人λ恒定区。
任选地,所述抗体是包括与轻链的二聚体相关的重链二聚体的4链抗体。在实例中,所述重链包括如本文公开的一个或重链CDR或CDR组合和/或所述轻链包括如本文公开的一个或重链CDR或CDR组合,如来自同一所选抗体。在实例中,所述重链包括如本文公开的VH结构域和/或所述轻链包括如本文公开的VL,如来自同一所选抗体。在实例中,所述重链和所述轻链来自同一所选抗体,例如本文序列表或本文实例中的表中公开的任何抗体。
在实例中,所选抗体包括G09、F05、C02或E04的轻链。在实例中,所选抗体包括G09的轻链。
在实例中,所选抗体包括G09、F05、C02或E04的可变结构域。在实例中,所选抗体包括G09的可变结构域。
在实例中,所选抗体包括G09、F05、C02或E04的VH结构域。在实例中,所选抗体包括G09的VH结构域。
在实例中,所选抗体包括G09、F05、C02或E04的VH结构域和VL结构域。在实例中,所选抗体包括G09的VH结构域和VL结构域。
在实例中,所述抗体或片段的所述结合位点包括与人CD7特异性结合的VH/VL对。
任选地,所述抗体或片段与G09(例如呈IgG形式的G09,例如人IgG1)竞争结合CD7,如通过SPR所确定的。
任选地,所述氨基酸取代是保守氨基酸取代,任选地其中每种保守取代来自组(1)到(6):
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氮酸(M)、缬氮酸(V);以及
6)苯丙氮酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
本文中的任何SPR是例如在37℃和pH 7.6下的表面等离子体共振(SPR)。
任选地,本文中的任何CD7是(例如,在体外测试中)人CD7,例如,包括本文公开的人CD7的氨基酸序列。
在实例中,本发明的抗体或片段以例如5×106M-1×s-1;或约5×106M-1×s-1的Ka与人CD7结合。在实例中,本发明的抗体或片段以例如4或5s-1;或约4或5s-1的Kd与人CD7结合。在实例中,本发明的抗体或片段以例如0.07或0.14nM;或约0.07或0.14nM的KD与人CD7结合。在实施例中,所述片段是Fab片段。在实施例中,所述片段是scFv。
任选地,本发明的所述抗体结合CD7的亲和力(KD)为1pM到5nM,任选地其中结合是在37℃下、在pH 7.6下、使用所述抗体的Fab、通过SPR确定的。
任选地,所述抗体结合CD7的解离速率(Koff)为1×10-5S-1到1×10-3S-1,任选地其中结合是在37℃下、在pH 7.6下、使用所述抗体的Fab、通过SPR确定的。
任选地,所述抗体结合CD7的结合速率(Kon)为1×105M-1S-1到1×107M-1S-1,任选地其中结合是在37℃下、在pH 7.6下、使用所述抗体的Fab、通过SPR确定的。
在实例中,抗体(例如,作为Fab)或片段结合CD7(例如,人CD7)的亲和力(KD)为
(a)2pM、3pM、4pM、5pM或10pM到3nM、4nM或5nM;
(b)1pM到10pM到5nM;
(c)10pM到3nM、4nM或5nM;
(d)50pM或80pM到200nM;
(e)50pM或80pM到150nM;或
(f)50pM或80pM到100nM。
在实例中,KD为(或约为)5pM到15pM(例如,10pM)。在实例中,KD为(或约为)2nM到5nM(例如,3nM)。在实例中,KD为(或约为)100pM到400pM(例如,140pM或390pM)。
在实例中,抗体(例如,作为Fab)或片段结合CD7(例如,人CD7)的解离速率(Koff)为
(a)1×10-5S-1到5×10-4S-1;
(b)1×10-5S-1到6×10-4S-1;
(c)1×10-5S-1到7×10-4S-1;
(d)1×10-5S-1到8×10-4S-1;
(e)2×10-5S-1到1×10-3S-1;
(f)2×10-5S-1到5×10-4S-1;
(g)2×10-5S-1到6×10-4S-1;
(h)2×10-5S-1到7×10-4S-1;或者
(i)2×10-5S-1到8×10-4S-1。
在实例中,Koff为(或约为)5×10-4S-1(例如,当KD为(或约为)2nM到400pM时;当KD为(或约为)2nM到5nM(例如,3nM)时;或当KD为(或约为)100pM到400pM(例如,140pM或390pM)时)。在实例中,Koff为(或约为)3×10-5S-1(例如,当KD为(或约为)5pM到15pM(例如,10pM)时)。
在实例中,所述抗体(例如,作为Fab)或片段结合CD7(例如,人CD7)的结合速率(Kon)为
(a)1×105M-1S-1到1×106M-1S-1;
(b)1×105M-1S-1到2×106M-1S-1;
(c)1×105M-1S-1到3×106M-1S-1;
(d)1×105M-1S-1到4×106M-1S-1;
(e)1×105M-1S-1到5×106M-1S-1;
(f)2×105M-1S-1到5×106M-1S-1;
(g)3×105M-1S-1到5×106M-1S-1;
(h)4×105M-1S-1到5×106M-1S-1;
(i)5×105M-1S-1到5×106M-1S-1;或者
(i)6×105M-1S-1到5×106M-1S-1。
在实例中,Kon为(或约为)1×10-5M-1S-1或2×10-5M-1S-1(例如,当KD为2nM到5nM(例如,3nM)时)。在实例中,Kon为(或约为)1×10-6M-1S-1到4×10-6M-1S-1、1×10-6M-1S-1、2×10-6M-1S-1、3×10-6M-1S-1或4×10-6M-1S-1(例如,当KD为(或约为)5pM到400pM(例如,140pM或390pM)或5pM到15pM(例如,10pM)时)。
如本文的条款或其它方面所提供的,抗CD7抗体或片段可以以小于50nM、小于40nM、小于30nM的KD与CD7例如人CD7结合,如通过表面等离子体共振所确定的。另一个实施例,抗CD7抗体或片段可以以小于20nM、小于15nM、小于10nM的KD与CD7例如人CD7结合,如通过表面等离子体共振所确定的。抗CD7抗体或片段可以以小于8nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于2nM或小于1nM的KD与CD7例如人CD7结合,如通过表面等离子体共振所确定的。KD可以为0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小、0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小或0.1nM或更小。
在另一个实施例中,KD在0.01到1nM的范围内,或0.05到2nM的范围内,或0.05到1nM的范围内。KD可以与hCD7、食蟹猴(即“食蟹猴”)CD7和/或小鼠CD7有关。
在另一个实施例中,本文所描述的抗CD7抗体具有大约0.5到10μM,例如大约1到8μM或大约1到7μM的KON速率(例如,如通过SPR,例如在25℃下或在37℃下所测量的)。在另一个实施例中,KON速率为大约1到5μM,例如大约1μM、大约1.5μM、大约2μM、大约2.5μM或大约3μM。在另一个实施例中,KON速率为大约3.5μM、大约4μM、大约4.5μM、大约5μM或大约5.5μM。
在另一个实施例中,本文所描述的抗CD7抗体具有大约0.01到100mM,例如大约0.1到50mM或大约0.5到50mM的KOFF速率(例如,如通过SPR,例如在25℃下或在37℃下所测量的)。在另一个实施例中,KOFF速率为大约0.5到10mM或大约0.5到10mM,例如大约1mM、大约2mM、大约3mM、大约4mM或大约5mM。在另一个实施例中,KOFF速率为大约0.6mM、大约0.7mM、大约0.8mM或大约0.9mM。
在实例中,本发明的抗体或片段包括G09、F05、C02和E04的VH结构域和VL结构域。
在实例中,本发明的抗体或片段包括G09的VH结构域和VL结构域。在实例中,本发明的抗体或片段包括F05的VH结构域和VL结构域。在实例中,本发明的抗体或片段包括G09的VH结构域和VL结构域。在实例中,本发明的抗体或片段包括C02的VH结构域和VL结构域。在实例中,本发明的抗体或片段包括E04的VH结构域和VL结构域。
在实例中,所述所选抗体是G09。
在实例中,所述所选抗体包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的可变结构域。
在实例中,所述所选抗体包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的VH结构域。在实例中,所选抗体包括G09的VH结构域。
在实例中,所述所选抗体包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的VH结构域和VL结构域。在实例中,所选抗体包括G09的VH结构域和VL结构域。
任选地,本发明的抗体或片段包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的HCDR3。任选地,本发明的抗体或片段包括所述所述抗体的HCDR1和/或HCDR2。
任选地,本发明的抗体或片段包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的HCDR1。任选地,本发明的抗体或片段包括所述所选抗体的HCDR2和/或HCDR3。
任选地,本发明的抗体或片段包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的HCDR2。任选地,本发明的抗体或片段包括所述所述抗体的HCDR1和/或HCDR3。
任选地,本发明的抗体或片段包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的VH。任选地,本发明的抗体或片段包括所述所选抗体的VL。
任选地,本发明的抗体或片段包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的VL。任选地,本发明的抗体或片段包括所述所选抗体的VH。
任选地,本发明的抗体或片段包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的重链。任选地,本发明的抗体或片段包括所述所选抗体的轻链。
任选地,本发明的抗体或片段包括选自G09、F05、C02和E04的抗体的轻链。任选地,本发明的抗体或片段包括所述所选抗体的重链。在实例中,所述所选抗体是G09。
任选地,本发明的抗体包括人IgGl*01恒定区。任选地,本发明的抗体包括人IgG1E430G恒定区,例如IgG1*01 E430G恒定区。任选地,本发明的抗体包括人IgG1 E345R恒定区,例如IgG1*01 E345R恒定区。
优选地,与hCD7特异性结合的抗体或其片段不与其它抗原交叉反应(但可以任选地与不同的CD7物种例如恒河猴、食蟹猴或鼠类交叉反应)。例如,可以通过免疫测定、BIAcoreTM或本领域技术人员已知的其它技术来鉴定与CD7抗原特异性结合的抗体或其片段。如使用放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)等实验技术确定的,当抗体或其片段与hCD7抗原结合的亲和力高于与任何交叉反应性抗原结合的亲和力时,抗体或其片段与hCD7抗原特异性结合。通常,特定或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍,并且更通常是背景的10倍以上。针对关于抗体特异性的讨论,参见例如,Paul编辑,1989,《基础免疫学》第二版,雷文出版社,纽约第332-336页。
涉及抗体和抗原如CD7相互作用的接触氨基酸残基可以通过本领域技术人员已知的各种方法确定。
在一个实施例中,如果抗体识别线性表位,则可以产生基于抗原序列的短肽并且可以使用标准技术来评估抗体与这些肽的结合。
在一个实施例中,可以使用有限的蛋白水解消化和质谱法来鉴定结合表位。
在一个实施例中,表位的接触残基通过X射线晶体学鉴定。在一个实施例中,表位的接触残基通过冷冻电子显微镜鉴定。在一个实施例中,表位的接触残基通过有限蛋白水解消化和质谱法的组合来鉴定。
在另一个实施例中,本文中描述的抗CD7抗体(和片段)提供比其它抗CD7抗体和片段改善的瞬时表达水平。因此,在一个实施例中,抗CD7抗体(或片段)在HEK293细胞例如HEK293T细胞中以大约100μg/mL或在大约100到350μg/mL的范围内的表达水平表达。在另一个实施例中,表达水平高于大约350μg/mL。
在另一个实施例中,抗CD7抗体(或片段)在CHO细胞例如Expi-CHO细胞中以大约100μg/mL或在大约100到350μg/mL的范围内的表达水平表达。在另一个实施例中,表达水平高于大约350μg/mL。
在另一个实施例中,抗CD7抗体(或片段)在CHO细胞例如Expi-CHO细胞或CHO-E7EBNA细胞中以大约100μg/mL或在大约100到350μg/mL的范围内的表达水平表达。在另一个实施例中,表达水平高于大约350μg/mL。例如,抗体包括G09中任一者的VH结构域和VL结构域,格式为人IgG1或人IgG4(例如,IgG4-PE)。
在这些表达系统中的任何表达系统中,表达在大约0.5mL与3mL之间例如在大约0.5mL与2的mL之间的范围内进行。在这些表达系统中的任何表达系统中,抗CD7抗体(或片段)可以从pTT5载体表达。在这些表达系统中的任何表达系统中,抗CD7抗体(或片段)可以与脂质转染试剂结合表达,并且可以任选地在CHO细胞例如Expi-CHO细胞中表达。在这些表达系统中的任何表达系统中,抗CD7抗体(或片段)可以与PEI转染试剂结合表达,并且可以任选地在CHO细胞例如CHO-E7 EBNA细胞中表达。在这些表达系统中的任何表达系统中,抗CD7抗体(或片段)可以与辅助质粒(例如AKT辅助质粒)结合表达,并且可以任选地在CHO细胞例如CHO-E7 EBNA细胞中表达。
在这些表达系统中的任何表达系统中,表达水平介于大约100μg/mL与大约1500μg/mL之间,例如介于大约100μg/mL与大约1000μg/mL之间,或介于大约200μg/mL与大约1000μg/mL之间,或介于大约350μg/mL与大约1000μg/mL之间。在这些表达系统中的任何表达系统中,表达下限可以是大约100μg/mL、大约200μg/mL、大约300μg/mL或大约400μg/mL。在另一个实施例中,表达下限可以是大约500μg/mL、大约600μg/mL、大约700μg/mL或大约800μg/mL。在这些表达系统中的任何表达系统中,表达上限可以是大约2000μg/mL、大约1800μg/mL、大约1600μg/mL或大约1500μg/mL。在另一个实施例中,表达上限可以是大约1250μg/mL、大约1000μg/mL、大约900μg/mL或大约800μg/mL。
在另一个实施例中,表达系统是龙沙(Lonza)表达系统,例如系统。在龙沙表达系统中,可以以大约30mL到2L,例如50mL到1L或1L到2L的范围进行表达。在龙沙表达系统中,抗CD7抗体(或片段)可以与电穿孔结合表达,并且任选地没有任何辅助质粒。在龙沙表达系统中,抗CD7抗体(或片段)可以以大约1g/L、或大约900mg/L、或大约800mg/L或大约700mg/L的水平表达。在另一个实施例中,在龙沙表达系统抗CD7抗体(或片段)可以以大约600mg/L、或大约500mg/L或大约400mg/L的水平表达。在龙沙表达系统中,抗CD7抗体(或片段)可以以介于大约400mg/L与大约2g/L之间,例如介于大约500mg/L与大约1.5g/L之间或介于大约500mg/L与大约1g/L之间的水平表达。在另一个实施例中,表达水平高于1g/L。在另一个实施例中,抗CD7抗体提供相比于其它抗CD7抗体改善的半衰期。
在一个实施例中,所述抗体或片段是人抗体或片段。在一个实施例中,所述抗体或片段是完全人抗体或片段。在一个实施例中,所述抗体或片段是完全人单克隆抗体或片段。
在一个实施例中,所述抗体或片段是人源化抗体或片段。在一个实施例中,所述抗体或片段是人源化单克隆抗体或片段。
参涉及抗体和抗原相互作用的接触氨基酸残基可以通过本领域技术人员已知的各种方法,如丙氨酸扫描、蛋白质晶体学、质谱法或任何其它技术人员显而易见的技术确定。
在一个实施例中,所述CDR包括一种氨基酸取代,所述氨基酸取代可以是保守氨基酸取代。在一个实施例中,所述CDR包括两种氨基酸取代,所述氨基酸取代可以是保守氨基酸取代。在一个实施例中,所述CDR包括三种氨基酸取代,所述氨基酸取代可以是保守氨基酸取代。在一个实施例中,所述CDR包括四种氨基酸取代,所述氨基酸取代可以是保守氨基酸取代。在一个实施例中,所述CDR包括五种氨基酸取代,所述氨基酸取代可以是保守氨基酸取代。在一个实施例中,所述CDR包括六种氨基酸取代,所述氨基酸取代可以是保守氨基酸取代。
氨基酸取代包含其中用不同的天然存在的氨基酸残基替代氨基酸的改变。此类取代可以分类为“保守的”,在所述情况下,含有在多肽中的氨基酸残基用在极性、侧链功能或大小方面具有类似特性的另一种天然存在的氨基酸替换。此类保守取代是本领域众所周知的。本发明涵盖的取代也可以是“非保守的”,其中存在于肽中的氨基酸残基用具有不同性质的氨基酸如来自不同组的天然存在的氨基酸(例如取代带电或疏水性氨基酸;用丙氨酸取代酸)取代,或可替代地,其中天然存在的氨基酸用非常规氨基酸取代。
在一个实施例中,保守氨基酸取代如本文所描述。例如,用F取代Y、用S或K取代T、用A取代P、用D或Q取代E、用D或G取代N、用K取代R、用N或A取代G、用S或K取代T、用N或E取代D、用L或V取代I、用Y取代F、用T或A取代S、用K取代R、用N或A取代G、用R取代K、用S、K或P取代A。在另一个实施例中,保守氨基酸取代可以是其中用F取代Y、用A或S取代T、用L或V取代I、用Y取代W、用L取代M、用D取代N、用A取代G、用A或S取代T、用N取代D、用L或V取代I、用Y或L取代F、用A或T取代S、并且用S、G、T或V取代A。
方面
以下方面中的任何方面可以与本文公开的特征中的任何特征(例如,与本文要求保护的实施例中的任何实施例或本文中的条款中的任何条款)组合。例如,这些方面中的任何方面中的配体可以是本发明的抗体或片段。
1.一种抗CD7配体,其向人患者施用以用于通过所述患者中的CD7+细胞(例如,癌细胞)的补体依赖性细胞毒性(CDC)治疗癌症,所述配体包括抗体Fc区和用于与人CD7特异性结合的结合位点。
在实例中,所述CD7是人CD7并且所述患者是人。
在任何方面的替代方案中,代替癌症,本文的配体用于治疗由CD7+细胞例如CD7+T细胞或NK细胞介导的疾病或病状。例如,所述疾病或病状是自身免疫疾病或病状。例如,所述疾病是移植物抗宿主病(GvHD)。例如,所述疾病或病状是炎性疾病或病状。
任选地,在任何方面的替代方案中,将所述配体预防性地施用于所述受试者以降低患癌症或疾病或病状的风险。
任选地,在任何方面,所述细胞是患者免疫系统的细胞。任选地,在任何方面,所述细胞是T细胞和/或NK细胞。任选地,在任何方面,所述细胞是人包括的组织、细胞或器官移植物的细胞。
2.一种抗CD7配体,其向人患者施用以用于通过所述患者中的CD7+细胞(例如,癌细胞)的配体依赖性吞噬作用治疗癌症,所述配体包括抗体Fc区和用于与人CD7特异性结合的结合位点。
3.其中所述吞噬作用为抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP),其中所述抗体为所述配体。
在体内,ADCP可以由单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞通过FcγRIIa、FcγRI和FcγRIIIa介导。尽管所有三种受体都可以参与ADCP,但FcγRIIa被认为是参与此过程的主要Fc7受体。在实例中,ADCP包括所述患者所包括的巨噬细胞和/或单核细胞对CD7+癌细胞的吞噬作用。
4.一种抗CD7配体,其向人患者施用以用于通过所述患者中的CD7+癌细胞的配体依赖性细胞介导的细胞毒性治疗癌症,所述配体包括抗体Fc区和用于与人CD7特异性结合的结合位点。
在ADCC中,细胞毒性可以由自然杀伤(NK)细胞介导;但巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也可以介导所述细胞毒性。在本发明的实施例中,ADCC可以包括所述患者的CD16+免疫细胞的ADCC。在本发明的实施例中,ADCC可以包括选自自然杀伤(NK)细胞的细胞;但巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的ADCC。
5.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述细胞毒性是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),其中所述抗体是所述配体。
6.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述配体包括抗CD7抗体、抗体片段或陷阱。
在实例中,所述配体包括配对的VH/VL抗CD7结合位点,其中VH和VL是人抗体可变结构域。另外地或可替代地,所述抗体或片段包括人Fc。
在实例中,所述配体是人配体,例如人抗体或片段。
在实例中,所述配体能够被CD7+细胞内化。在实例中,所述配体能够被癌细胞内化。在实例中,所述配体能够在体外被CEM细胞内化。
7.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述患者先前已经接受过癌症化疗剂。
在实例中,所述患者先前已经接受过免疫检查点抑制剂,例如针对免疫检查点抑制剂的抗体。在实例中,所述抑制剂是伊匹单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)或曲美木单抗(tremelimumab)。
在实例中,所述患者先前已经接受过抗癌放射治疗。
8.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述患者先前已经接受过GCSF。
化学疗法会导致骨髓抑制和白血细胞水平过低(中性粒细胞减少症),使患者易于感染和败血症。GCSF刺激粒细胞(白血细胞类型)的产生。在肿瘤学和血液学中,重组形式的GCSF用于某些癌症患者,以加速化学疗法后中性粒细胞减少症的恢复,允许更高强度的治疗方案。其可以通过皮下或静脉内途径施用于肿瘤患者。在本发明的上下文中,同时或顺序地(例如,在)向患者施用抗CD7配体之前施用GCSF可能有益于上调涉及本发明的CDC、ADCC和ADCP介导的CD7+细胞杀伤的细胞类型。
9.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述患者先前已经经历化学疗法并且其中紧接在向所述患者施用所述配体之前,所述患者已经接受了用于增强补体(例如,C1q)活性的治疗。
10.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述患者已接受一种或多种补体组分(例如,包括C1q的组合物)的施用。
例如,所述组分包括在施用于患者的血液或血浆中。
11.包括在施用所述配体之前确定患者的补体(例如,C1q)的水平或活性。
例如,C1q水平是患者的血清浓度在70到160微克/毫升的范围内,例如,如通过定量ELISA,例如夹心ELISA确定的。用于确定的合适技术的实例在以下中列出:《生物技术杂志(Biotechnol J.)》2009年8月;4(8):1210-4.doi:10.1002/biot.200800273,“系统性红斑狼疮和C1q:用于确定血清中Clq水平的定量ELISA(Systemic lupus erythematosus andC1q:A quantitative ELISA for determining C1q levels in serum)”,Dillon SP等人。在实施例中,所述范围为100到160微克/毫升。
正常健康人的补体水平范围:
1.总补体水平:41-90个溶血单位
2.C1水平:16-33mg/dL
3.C3水平:男性为88-252mg/dL;女性为88-206mg/dL
4.C4水平:男性为12-72mg/dL;女性为13-75mg/dL
在实例中,本发明包括在患者中施用抗CD7配体与抗CD46、抗CD55或抗CD59疗法以中和补体调节蛋白(CRP)功能。
12.包括向所述患者施用所述配体,从而杀死所述CD7+癌细胞,并且然后对所述患者进行化学疗法。
13.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述癌细胞是所述患者的免疫细胞。
14.根据前述方面中任一项所述发的配体,其中所述癌细胞是T细胞、NK细胞、胸腺细胞或骨髓CD34+CD38-细胞。
所述癌细胞是例如CD7+CD34+CD2 T细胞。所述癌细胞是例如CD34+CD38-免疫细胞(例如,T细胞)。所述癌细胞是例如CD34+CD38+免疫细胞(例如,T细胞)。
15.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述T细胞是未成熟T细胞。
任选地,未成熟T细胞包括以下类型中的一种、两种或更多种:DN1、DN2、DN3、DN4和DP。DN1细胞对以下标志物呈阳性:CD34、CD44、CD儿7、TdT、HLA-DR。DN2细胞对以下标志物呈阳性:CD2、CD5、CD7、CD25、CD38、CD44、CD117、CD127、TdT、HLA-DR。DN3细胞对以下标志物呈阳性:CD2、CD5、CD7、CD25、CD38、CD44、CD71、CD117、TdT。DN4细胞对以下标志物呈阳性:CD1、CD2、CD5、CD7、CD38、TdT。DP细胞对以下标志物呈阳性:CD2、CD3、CD4或CD8、CD7。
在实施例中,所述癌细胞包括早期胸腺前体(ETP)细胞。此类细胞的存在与高白血病风险和对奈拉滨的低应答或无应答相关。因此,在实施例中,所述患者是耐拉滨难治的,例如,其中所述癌细胞包括ETP细胞。
在实例中,所述癌细胞是CD52+。
任选地,所述未成熟T细胞是CD2+、CD5+、CD7+。
16根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述T细胞是CD7+CD34+CD38-T细胞。
任选地,所述细胞是例如CD7+CD34+CD38-Lin-T细胞,如其中所述癌症是AML。
任选地,所述T细胞是CD8+T细胞。其中所述T细胞是CD4+T细胞。
任选地,所述细胞包括多个细胞,所述多个细胞中的每个细胞包括至少100、500或1000个拷贝的细胞表面CD7(参见例如,图1a,Aandahl,EM等人《免疫学杂志(JImmunol.)》2003.170:2349-2355,有关此类确定的指导)。
17.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述细胞是白血病起始细胞(LIC)。
18根据前述方面中任一项的配体,其中所述细胞是白血病细胞,例如AML或T-ALL细胞。
19.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述癌细胞是T细胞并且NK细胞在所述患者中免于杀伤。
20.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述配体在标准体外细胞杀伤试验中杀死不超过70%(例如,不超过80、90或95%)的NK细胞。
21.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述Fc区是人Fc。
22.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述Fc区是野生型Fc。
23.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述Fc区是人IGHG1*01或IGHG1*02核苷酸序列。
24.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述癌症是急性髓性白血病(AML)、T-ALL(例如,患者来源的T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)或T细胞幼淋巴细胞白血病(TPLL)。
任选地,AML为M1/M2 AML。任选地,所述癌症是混合谱系白血病(MLL)-重排的人类急性淋巴细胞白血病。
任选地,所述癌症是由CD7+免疫细胞(例如,T细胞)介导的癌症。
任选地,所述癌症是淋巴细胞白血病(LL)(例如ALL或急性淋巴细胞白血病)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)或黑色素瘤。任选地,所述癌症是复发性T-ALL或AML。
任选地,所述癌症是肝癌。任选地,所述癌症选自黑色素瘤、默克尔细胞癌、非小细胞肺癌(鳞状和非鳞状)、肾细胞癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌、间皮瘤、病毒诱导的癌症(如宫颈癌和鼻咽癌)、软组织肉瘤、血液系统恶性肿瘤,如霍奇金氏病和非霍奇金氏病以及弥漫性大B细胞淋巴瘤。
25.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述AML是CCAAT/增强子结合蛋白α(CEBPA)突变的AML。
任选地,所述患者是CEBPA突变的纯合子。
26.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述患者具有HLA-DR+CD7+CD13+CD14-CD15+CD33+CD34+的免疫表型,例如,其中所述癌症是AML,例如CEBPAAML。
27.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述人是成人。
例如,所述成人至少为18、20、30、40、50、60、70、80或90岁。
28.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述人是婴儿。
例如,所述人是儿童,例如18岁以下的人,例如小于17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1岁。
29.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述患者在先前例如用化疗剂治疗后,遭受所述癌症的第1次或第2次复发。
在实例中,所述药剂包括免疫检查点抑制剂,如本文所描述的抑制剂。
30.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述患者先前已经接受过奈拉滨。
31.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述配体和奈拉滨同时或顺序地施用于所述患者。
例如,本发明可以能够施用比奈拉滨的护理标准更低的剂量。
32.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述配体与造血干细胞移植同时或顺序地施用于所述患者。
在实例中,所述移植是同种异体移植。
在实例中,所述配体的施用频率不超过每2或4周一次。在实例中,每两周、每月或每周施用所述配体。
33.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述治疗减少所述患者的癌症进展。
34.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述治疗提高人患者的癌症存活率。
35.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述治疗导致所述患者的癌症缓解。
36.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述配体在标准ADCP测试中介导ADCP。
37.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述配体在体外CEM细胞杀伤测定中介导CEM细胞的CDC杀伤,其中EC50范围为10到500pM(例如,10到500或100pM)。
CEM细胞是众所周知的人T-ALL细胞系。在实例中,测定中的CEM细胞在人补体存在下(例如,CEM细胞与包括补体蛋白的人血清混合)。在实例中,当针对使用非癌性人类细胞(“正常细胞”)而不是CEM细胞的对照进行评估时,所述配体比正常细胞优先介导杀死所述癌细胞。所述正常细胞可以是癌症患者细胞。
任选地,在所述测定中,配体介导具有所述EC50的CEM细胞杀伤和90-100%的CEM细胞的杀伤。
38.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述配体在体外CEM细胞杀伤测定中介导CEM细胞的ADCP杀伤,其中EC50范围为10到500pM(例如,10到500或100pM)。
CEM细胞是众所周知的人T-ALL细胞系。在实例中,测定中的CEM细胞在人补体存在下(例如,CEM细胞与包括补体蛋白的人血清混合)。在实例中,当针对使用非癌性人类细胞(“正常细胞”)而不是CEM细胞的对照进行评估时,所述配体比正常细胞优先介导杀死所述癌细胞。所述正常细胞可以是癌症患者细胞。
任选地,在所述测定中,配体介导具有所述EC50的CEM细胞杀伤和90-100%的CEM细胞的杀伤。
在实施例中,所述配体在体外CEM细胞杀伤测定中介导CEM细胞的ADCC杀伤,其中EC50范围为10到500pM(例如,10到500或100pM)。
CEM细胞是众所周知的人T-ALL细胞系。在实例中,测定中的CEM细胞在人补体存在下(例如,CEM细胞与包括补体蛋白的人血清混合)。在实例中,当针对使用非癌性人类细胞(“正常细胞”)而不是CEM细胞的对照进行评估时,所述配体比正常细胞优先介导杀死所述癌细胞。所述正常细胞可以是癌症患者细胞。
任选地,在所述测定中,配体介导具有所述EC50的CEM细胞杀伤和90--100%的CEM细胞的杀伤。
在实施例中,CEM所述配体在体外CEM细胞杀伤测定中介导CEM细胞的胞啃作用杀伤,其中EC50范围为10到500pM(例如,10到500或100pM)。
CEM细胞是众所周知的人T-ALL细胞系。在实例中,测定中的CEM细胞在人补体存在下(例如,CEM细胞与包括补体蛋白的人血清混合)。在实例中,当针对使用非癌性人类细胞(“正常细胞”)而不是CEM细胞的对照进行评估时,所述配体比正常细胞优先介导杀死所述癌细胞。所述正常细胞可以是癌症患者细胞。
任选地,在所述测定中,配体介导具有所述EC50的CEM细胞杀伤和90-100%的CEM细胞的杀伤。
39.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述配体与人CD7和食蟹猴CD7特异性结合。
40.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述治疗不在所述患者中产生细胞因子风暴综合征。
41.根据前述方面中任一项所述的配体,其中所述癌细胞是CD7高细胞。
42.一种用于治疗或预防人患者的癌症的方案,其中所述方案包括进行前述方面中任一项中所述的治疗,其中所述配体是抗体并且向所述患者施用所述抗体的第一、第二和第三剂量,其中所述剂量相隔介于1与7天之间施用,并且其中所述剂量的总和为所述抗体的0.1到100mg/Kg。
本发明还提供了一种治疗或预防人患者的癌症的方法,所述方法包括向所述患者施用根据方面中任一项所述的配体。
本发明还提供了一种检测细胞样品中(例如血液或血清样品中)的CD7+细胞的方法,其中所述方法包括将所述样品与本发明的配体混合,由此所述配体与所述细胞样品中的CD7+细胞结合,并且检测或定量所述配体结合的细胞。
代替“标准测试”或作为“标准测试”的实例,测试可以是本文的实例中使用的方法。
实例
鉴定有用地靶向人CD7并且可用于治疗癌症如T-ALL的抗体。
特别期望的抗体G09,当被格式化为包括E430G突变(也被称为“G09 E430G”)的IgG1时,显示出人/食蟹猴CD7交叉反应性并且提供高效的补体依赖性细胞毒性(CDC)依赖性杀伤和有效的巨噬细胞体外依赖性吞噬活性,以及全血测定中强大的肿瘤细胞耗竭。此数据集展示了包括G09可变结构域的抗体:
·对体外测试的大多数非复发性或复发性T-ALL细胞示出了有效的CDC活性(EC50=50-500pM;约100%杀伤)
·在体外对复发性T-ALL细胞示出了有效的ADCP活性
·在人全血测定中杀死T-ALL细胞(约100%)
·在最严重的免疫功能低下的小鼠(NSG)中杀死肿瘤
·在离体测定中降低杀死人外周T细胞(50-75%)和NK细胞(70-90%)的效力。
实例1
CD7在T细胞谱系的整个发育过程中都表达,并且因此预期会在所有T-ALL原始细胞上表达。意识到,基于CDC、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP),免疫活性CD7-IgGl mAb的结合预期会导致这些细胞的耗竭。考虑到杀死原始细胞的重要性,希望具有强大的耗竭作用。意识到,复杂的因素是CD7不仅在T细胞上表达,也在NK细胞上表达,因此有可能耗竭ADCC应答的效应细胞。另外,接受强化化疗的T-ALL恶性肿瘤患者可能会导致介导细胞毒性的效应细胞水平降低。因此,意识到在抗CD7治疗期间仅通过ADCC不能实现T-ALL细胞的有效耗竭。尽管化疗后补体活性的降低本质上是暂时的,但补体活性在疗法期间的某些时期似乎对ALL患者有效(15)(图16)。
假设通过利用增加CDC活性的策略增强CD7靶向细胞毒性的效力,可以增强CD7靶向疗法在患有T-ALL恶性肿瘤的患者中的疗效。
CDC的经典途径依赖于C1q与细胞表面抗原结合抗体的结合。人抗体诱导CDC的能力是同种型依赖性的,其中效力顺序为IgM>>IgG3≥IgG1>>IgG2=IgG4。IgM和IgG3难以制造,使得IgG1成为通过CDC进行治疗性抗体介导作用的首选Fc同种型。最近,IgG1 CH3结构域中的几个点突变、E345R、E430G和其它变体已被鉴定,当与抗原结合时,会导致免疫球蛋白形成六聚体结构(16)。这些六聚体结构可以将CDC活性增强2到3个数量级,在与天然IgM相当的水平下诱导CDC。
为了评估这些IgG1变体,将突变引入到CD7特异性基准抗体RFT2(10,17)中并且在CDC测定中在CCRF-CEM细胞(本文被称为CEM细胞,可从ATCC作为CCL-119TM获得)(使用人血清作为补体来源表达CD7的T-ALL细胞系)上评估所述突变。发现野生型IgG1版本的RFT2抗体对CEM细胞的杀伤活性非常有限或没有,而三个测试的RFT2抗体的IgG1变体介导了对CEM细胞的有效杀伤(图1)。其中,RFT2 E345R抗体的杀伤活性最有效,其中最大杀伤几乎100%,EC50低于1nM。
CDC的经典途径预期为前导抗体的主要MOA。另外,还将评估由巨噬细胞介导的ADCP和由嗜中性粒细胞介导的吞噬作用。决定的是,抗CD7抗体应与CD7结合以启动细胞耗竭,但所述抗体不应活化细胞。还针对前导抗体评估了使用人全血的细胞因子释放。
方法与材料
a)CDC测定
CCRF-CEM细胞(被称为CEM细胞,CCL-119)或其它T-ALL细胞以8.75×104个细胞/ml悬浮在测定培养基(RPMI1640,10%hiFBS)中。根据板图以20μl/孔铺板细胞悬浮液。根据板图,以10μl/孔添加连续稀释的抗体。人补体血清(西格玛公司(Sigma),S1764)在1ml冰冷的水中重构。在培养基中将重构的血清稀释到1比3,并且将10ul的稀释的血清添加到板的每个孔。将板在37℃和5%CO2下温育2小时,平衡到室温持续15分钟,并且然后每孔添加40ul重构的(普洛麦格(Promega))。所述板用光学板密封件覆盖,在板振荡器上以300rpm搅拌2分钟以确保所有细胞都被裂解,并且然后使用384方案在Envision读板仪上读取。由混合物产生的发光信号与存在的ATP量成正比。使用以下等式从一式三份一式四份样品计算最大杀伤百分比:
b)ADCP测定
通过在补充有100ng/mL M-CSF(派普泰克公司(Peprotech))的RPMI+10%FBS中培养7-10天,将原代人巨噬细胞与以2×105个细胞/孔接种在12孔板上的单核细胞分化,以产生单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)。巨噬细胞在测定前一天用2μM CellTraceTM紫罗兰(CTV;赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))标记,并且在补充有10%超低IgGFBS(Life Technologies)和50ng/mLM-CSF的RPMI中静置过夜。CEM细胞系维持在RPMI+10%FBS中培养。对于使用患者来源的T-ALL异种移植细胞(PDTALL-39、-46、-47和-Ad2R)的实验,在测定当天从冷冻中回收原液。在测定前立即通过阴性选择(使用干细胞技术公司(StemcellTechnologies)的人T细胞分离试剂盒)从巨噬细胞供体匹配的外周血单核细胞(PBMC)中新鲜分离正常原代T细胞。靶细胞(CEM、T-ALL或正常T细胞)用2μM CellTraceTM CFSE(赛默飞世尔科技公司)标记并且重悬于PBS中。
在25μL PBS中以2倍终浓度制备抗CD7或对照抗体的系列稀释液。通过在冰上温育0.5-1小时,将25μL的CFSE标记的靶细胞以4×106个细胞/mL(即1×105个细胞)在PBS中用不同稀释度的抗CD7抗体预调理。作为对照,细胞被模拟调理(无抗体)或用适当的人IgGl同种型对照抗体的稀释液调理。然后将细胞用包括RPMI+10%超低IgGFBS(以消除未结合的抗体)的过量测定培养基洗涤一次,并且在测定培养基中重悬到5×104个细胞/mL。从CTV标记的巨噬细胞的12孔板中吸出培养基,并且将800μL的靶细胞悬液添加到双孔(以给出4×104个靶细胞/孔和效应子:5∶1的目标比率)并且在37℃5%CO2下温育2.5小时,以实现靶细胞吞噬作用。
收集非贴壁细胞并且与贴壁巨噬细胞组合,使用细胞消化液(生命科技公司(LifeTechnologies))和温和的细胞刮除将其分离。在再次用PBS洗涤并且在室温下在4%多聚甲醛(PFA;美国昂飞公司(Affymetrix))中固定20分钟之前,然后用PBS洗涤细胞并且用LIVE/DEAD可固定近红外(IR)死细胞染料染色(4℃下30分钟;赛默飞世尔科技公司)。将细胞重悬于含有2mM EDTA的PBS中进行分析。使用单标记细胞和活/死近IR标记的ArCTM胺反应性珠(分子探针公司(Molecular Probes))进行补偿。使用405、488和637激光器(赛默飞世尔科技公司)在Attune NXT流式细胞仪上进行流式细胞术采集,并且使用FlowJo v10.0.8rl(FlowJo LLC)分析数据。使用以下等式从一式两份样品计算吞噬作用百分比:
c)人全血测定
关于抗凝剂的使用,决定的是不使用标准肝素,而是使用低浓度的水蛭素,这在食蟹猴研究中产生了成功的结果。从水蛭素处理的血液中提取的血浆在体外介导CEM细胞的CDC,而来自肝素化血液的血浆则没有(数据未示出)。1741G09 E430G的最终浓度、同种型对照、利妥昔单抗和奥法木单抗在研究中使用。
在管(敏锐德(Myriad)RBM,美国)中设置并进行三个血供体的全血培养。(TC)管中填充有新鲜生产的培养基±抗体/对照。管储存在-20℃(<7天),并且在解冻和彻底混合(调整到室温)后使用。采血后60分钟内,将新鲜抽取的含有水蛭素作为抗凝剂的血液转移到管,并且在块恒温器中在37℃下温育20小时。
在培养期结束时,通过流式细胞术分析免疫细胞。为了准确计算细胞计数,将限定体积的培养全血添加到BD管(CE、IDV)。为了确定免疫状态,使用了7色免疫表型图(T细胞CD45+CD3+;NK细胞CD45+CD3-CD16+CD56+;B细胞CD45+CD3-CD19+;单核细胞(CD14+)。使用来自抗体制造商(美天旎生物公司;7色免疫表型试剂盒;#130-098-456)的应用无洗涤方案对细胞进行染色。简言之,在温育期结束时,对管进行离心,去除2ml的由培养基和血浆组成的上清液,并且彻底重悬血细胞。将50μl的重悬的免疫细胞转移到管(含有限定数量的珠)中,添加检测抗体并且在2-8℃下温育10分钟。添加溶血溶液以消除红细胞(RT下20分钟)。在通过流式细胞术分析之前将细胞储存在2-8℃下。在FACSMelodyTM流式细胞仪(BD生物科学公司(BD Bioscience))上采集样品。
数据由FlowJo(版本10.4.1;FlowJo有限责任公司)分析。已根据以下等式计算每体积的细胞:
d)用于血清1741G09定量的抗原捕获ELISA
96孔高结合板在4℃下用以2μg/ml稀释于PBS中的50μl重组可溶性人CD7蛋白(义翘神州生物技术有限公司(Sino Biologicals),11028-H08H)涂覆过夜。使用板(洗涤缓冲液)洗涤器用PBS+0.1%Tween以3×300μl/孔洗涤板,在室温下每孔用200μl PBS+1%BSA封闭至少1小时,并且然后再次洗涤。以50μl/孔将连续稀释的标准品、样品和对照添加到板。在室温下以300rpm振荡温育1小时后,用洗涤缓冲液以5×300μl/孔洗涤板。以50μl/孔添加在PBS+1%BSA中按30,000分之一稀释的HRP缀合的抗人IgG。在室温下以300rpm振荡温育1小时后,用洗涤缓冲液以5×300μl/孔洗涤板。用TMB底物以50μl/孔添加板,室温下避光温育30分钟,并且然后添加50μl/孔终止液。使用设置为450nm并且在640nm处校正的微板读数仪在5分钟内确定光密度。将数据导入Softmax Pro并且使用具有加权因子1/y的4PL曲线拟合进行回归。
e)细胞因子释放测定
高结合板用1741G09 E430G和其它系列浓度的对照抗体涂覆,并且在室温下温育过夜,其中打开盖子风干。板用PBS洗涤,通过静置30分钟用细胞培养基封闭,然后刚好在添加细胞前抽吸。
将温热培养基逐滴添加到具有冷冻保存的人PBMC的小瓶,并且然后将细胞在37℃5%CO2下以高密度(0.5-1×107个细胞/ml)预温育24小时。预温育后,将PBMC接种到具有240μl/孔的培养基的(RPMI 1640、10%FBS、1%青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺)的96孔聚丙烯板中,并且然后在37℃5%CO2下温育1小时。将PBMC细胞培养物(200μl/孔,2×105个细胞/孔)转移到预先准备的板中的固定测试试剂中,并且在37℃5%CO2下培养48小时。在收集所述细胞培养上清液并储存在-80℃下直至需要进行分析之后,将板以200g离心10分钟。
Luminex对细胞培养上清液中的细胞因子水平的评估是按照制造商的方案进行的。使用5点非线性回归分析从标准曲线内插每种细胞因子的诱导水平。然后将内插数据归一化为未受刺激的对照。
f)瞬时蛋白表达
进行瞬时蛋白表达。转染后第12天收获培养物,并且将澄清的收获物转移到纯化团队。
g)稳定的池蛋白表达
进行了稳定的池蛋白表达。
发现
a)前导生成
抗CD7项目的发现工作由免疫接种、杂交瘤生成、抗体筛选、抗体效力的生物学评估和生物物理表征组成,如图2所示。
评估药物毒理学需要对人和食蟹猴CD7抗原具有交叉反应性的抗体。人和食蟹猴CD7蛋白仅共享86%的同一性。为了确保这种交叉反应性,Kymice(26)用人和食蟹猴抗原共同免疫。通过流式细胞术分析检查滴度,其中定量多克隆血清与人和食蟹猴CD7表达CHO细胞的结合程度。当血清被稀释超过104稀释度时,结合滴度可检测到的小鼠被用于杂交瘤生成。
初次、二次和三级体外筛选的命中有四个选择标准:(i)与人CD7的高水平结合,(ii)对人和食蟹猴CD7两者的特异性,(iii)有效的T-ALL细胞耗竭和(iv)无法导致T细胞释放细胞因子。
杂交瘤上清液用于初次和二次筛选以鉴定结合剂。初次筛选由基于高通量LiCOR的细胞结合测定组成,以包含所有潜在的交叉反应性结合剂。使用流式细胞术的二次筛选用于确认交叉反应性。结果在图3中示出。人和食蟹猴CD7与CEM细胞和重组食蟹猴CD7 CHO细胞的结合使用流式细胞术通过几何平均荧光强度(几何平均值)进行定量。CEM细胞是表达内源性CD7的人T-ALL细胞系。
通过测量SPR进一步检查了示出了与人和食蟹猴CD7的强和交叉反应性结合的七个命中,以了解其与两种抗原的相对结合。确认了五个前导(1730C2、1734F05、1738B07、1741G09、1896A03)以示出与来自两种物种的CD7的类似结合,如图4和表1所示。将数据与基准RFT2 IgG1(具有小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体)进行比较。
从杂交瘤克隆中检索命中的DNA序列,并且将恒定区重新格式化为具有E345R变体的人IgG1。IgG1 CH3区中的E345R变体已被示出增强补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。如图1所示,RFT2 IgGl E345R但不是RFT2 IgG1可以在CDC测定中有效杀死CEM细胞(图1)。使用人血清作为补体来源和CEM细胞作为靶细胞,在CDC测定上表达和测试IgG1 E345R重新格式化的抗体。在图5和表2中,两个前导1741E04 E345R和1741G09 E345R示出了具有100%最大杀伤和低于200pM的效力。前者仅与人抗原结合,而后者与人抗原和食蟹猴抗原两者结合。这些前导也是用野生型IgG1产生的,并且在CDC测定中进行了测试。即使在10nM以上的浓度下也没有观察到显著的杀伤(数据未示出)。
为了评估这三个前导是否可以介导巨噬细胞的吞噬作用,在ADCP测定中进行了测试,使用源自外周血单核细胞的巨噬细胞作为吞噬细胞的来源,并且CEM细胞作为靶细胞。在CDC测定中示出最佳活性的前导1741G09 E345R,在此测定中这三个前导中也示出了最佳活性,如图6所示。
通常据信,双重染色与靶细胞内化为效应细胞(或至少位于吞噬杯内)相关。在实验中,使用Amnis Imagestream(默克密理博(Merck Millipore))在吞噬测定的终点处捕获细胞的图像,并且使用允许区分内化和细胞外结合颗粒的软件工具进行分析,以证明靶细胞的吞噬作用.出于此目的,别处已经描述了类似的技术(27)。此外,在测定终点处通过酶促分离使用细胞消化液进行细胞收获可能会破坏细胞间接触,这可能会被误解为吞噬作用(内化)事件。
在筛选过程期间,存在也被报道增强CDC活性的另一种变体IgG1 E430G(28)。在测试中,1741G09 E430G变体与1741G09 E345R变体具有类似的杀伤效力(图7.A.)。1741G09E430在NSG小鼠中的半衰期为136.7小时(图7.B.),在此类小鼠中,其处于人IgGl的正常范围内。然而,1741G09 E345R的半衰期要短得多,仅为20.9小时,这可能是因为此变体具有更高的聚集趋势。基于此观察,用1741G09 E430G替代1741G09 E345R作为前导分子,并且进一步评估了此分子的CDC和ADCP活性。
b)体外前体分布
抗体发现活动基于结合、细胞耗竭测定和分子的半衰期,鉴定了前导抗体1741G09E430G。为了评估其对不同T-ALL细胞的杀伤活性,在CDC测定中对前导的14种不同的T-ALL细胞系进行了测试,所述细胞系包含两种商业体外传代细胞系(CEM和HSB2)、六个体内传代非复发性细胞系(PDTALL8、PDTALL11、PDTALL12、PDTALL13、PDTALL16和PDTALL18)和六个体内传代复发性细胞系(PDTALL39、PDTALL46、PDTALL47、PDTALL51R、PDTALLAd2R和PDTALLAd4)(29)。这些细胞系的临床和基因谱示出于表7中。1741G09 E430G被证明可以有效杀死大多数细胞系(14个细胞系中的11个)(图8),其中效力约为50-500pM(表3)。
在进行的测定中,效力和最大杀伤与细胞表面CD7表达相关(表8和9)。可以基于细胞表面的CD7表达水平对细胞系进行排序,如表3所示。反映表达水平,具有高或中等CD7表达水平(相对于CEM细胞)的PDTALL47、HSB、PDTALLAd4、PDTALL51R、PDTALL39、PDTALL8、CEM和PDTALL16具有最高的最大杀伤,接近100%,并且EC50值为50pM到200pM;具有中等到低表达水平的PDATLLAd2R、PDATALL12和PDTALL11的最大杀伤接近90%,并且EC50低于400pM;表达水平低得多的PDTALL13和PDTALL18的最大杀伤低于70%,并且EC50低于600pM(表3)。考虑到CD7表达水平,PDTALL46的水平高于PDTALLAd2R。两种细胞系具有接近350pM的类似EC50,但PDTALL46的最大杀伤低于PDTALLAd2R(78%对93%),可能是因为前者的补体调节蛋白(CRP:CD46、CD52和CD59)的表达水平高于后者(表9)。据报道,CRP用作对抗细胞表面上的补体活性的拮抗剂。总之,这些结果表明CDC活性的抗体效力主要取决于细胞表面上的靶抗原表达,并且可以由CRP调节。
如图9所示,还在使用不同T-ALL细胞的ADCP测定中测试了前导。人外周单核细胞衍生的巨噬细胞被分化并且用于评估1741G09 E430G分子对T-ALL细胞系的ADCP活性。在测试的五个细胞系中,四个示出了接近100%的巨噬细胞吞噬作用。在CDC测定中,1741G09E430G仅耗竭了80%的复发性细胞系PDTALL46细胞。然而,其在ADCP测定中介导了几乎100%的相同细胞的吞噬作用。另一方面,在ADCP测定中,1741G09 E430G仅介导了75%的其它复发性细胞系PDTALLAd2R细胞。然而,在CDC测定中,1741G09 E430G耗竭了接近95%的相同细胞。这些数据支持多种MOA可以相互补充并且介导T-ALL细胞的有效的理论。
c)细胞因子释放分布
由于CD7在外周T和NK细胞上表达,抗体连接可能会导致这些细胞的活化。据报道,抗CD7 mAb可以具有促有丝分裂作用,增加钙通量并且增加IL-2的产生(30)。然而,在先前的肾移植治疗临床试验中,抗CD7 mAb、RFT-2并未引起细胞因子风暴的任何显著担忧(10)。为了评估1741G09 E430G抗体刺激人外周血单核细胞(PBMC)的能力,在风干固定后测试了分子对从PBMC释放的细胞因子的作用。
1741G09 E430G在来自五个个体供体的PBMC中进行评估,如通过特定细胞因子和趋化因子的释放进行测量的。对应的同种型对照用于监测PBMC培养物的非特异性活化。超激动性抗CD28和抗CD3(OKT3)抗体用作阳性对照。
在细胞因子组中,在与用最高测试浓度(60μg/ml)的IgG1处理的样品相比时,用1741G09E430G处理的样品中的六种细胞因子略有增加(IL8,2.8倍;MIP-1α,2.9倍;TNFα,4.2倍;IL1β,4.6倍;IL6,1.7倍)。IgG1 E430G同种型对照也略微增加了这些细胞因子的释放,表明所述增加可以不是CD7特异性的。阳性对照抗CD3(克隆OKT3)和超激动性抗CD28诱导所有供体的特征性细胞因子谱,证实所述测定按预期进行,具有比任何测试制品或同种型对照高得多的一般诱导(图10和表4)。
发现活动总结
七个前导选自初次和二次细胞结合筛选。通过SPR测量与可溶性CD7的结合,证实了五个与人和食蟹猴CD7蛋白的交叉反应性。这五个前导被重新格式化为人IgG1 E345RFc,并且在CEM细胞的CDC和ADCP测定中进行测试。1741G09 E345R抗体被选择作为前导分子,因为其具有最有效的CDC和ADCP活性。考虑到此变体在体内具有更好的半衰期,前导抗体被进一步重新格式化为IgG1 E430G Fc。1741G9 E430G抗体的有效CDC活性也在不同的T-ALL细胞系中被证明,其中对大多数细胞系的最大杀伤为100%,并且效力强(EC50=50-500pM)。在与超级激动剂、抗CD3或抗CD28相比时,1741G09 E430G mAb没有显著增加PBMC的细胞因子释放。
c)生物评估
对PBMC T细胞和NK细胞的体外CDC测定
由于外周T细胞和NK细胞表达CD7,其易受由前导分子介导的耗竭的影响。外周T细胞和NK细胞分别从两个不同的供体中分离出来,并且用于评估1741G09 E430G的CDC活性。尽管没有检测到显著的T细胞耗竭(图11.A.),但最大65%的NK细胞耗竭,其中EC50接近300pM(图11.B.)在EC50值的范围内,并且观察到T-ALL细胞耗竭(表2)。值得注意的是,与T细胞相比,NK细胞具有更高的CD7表达和更低的CRP表达(图17)。
离体人全血测定
为了评估1741G09是否可以在更生理的上下文中耗竭正常的外周T细胞和NK细胞,使用基于的测定来评估抗体对人类全血状态的影响。1741G09 E430G抗体的使用浓度范围为0.01到100μg/ml,并且与同种型对照(100μg/ml)进行比较。还包含两个阳性对照,利妥昔单抗和奥法木单抗(100μg/ml)。在评估细胞耗竭之前,将全血和抗体温育20小时。测定中使用了三个人供体,被称为A、B和C。每μl的样品的细胞亚群数量通过流式细胞术确定。结果示出于图12中。测定由Hotscreen进行。
在测量的四种细胞类型(B、T、NK细胞和单核细胞)中,同种型对照处理的培养物示出了与阴性对照非常类似的细胞计数。奥法木单抗和利妥昔单抗是靶向B细胞的治疗性抗体,并且包含作为特定细胞耗竭的阳性对照。事实上,在整个培养过程中几乎完全消除了B细胞。在所有三个供体中都观察到1741G09 E430G对T细胞和NK细胞的浓度依赖性耗竭。与阴性(无抗体)或同种型对照相比,T细胞和NK细胞的数量减少。1741G09 E430G抗体耗竭了至多90%的NK细胞和至多75%的T细胞。与T细胞耗竭相比,所述抗体对NK耗竭更有效。在0.1μg/ml(≈0.67nM)的1741G09 E430G浓度下,NK细胞而不是T细胞被显著耗竭。
T细胞的减少似乎对CD4+与CD8+T细胞之间的比率没有影响(数据未示出)。B细胞和单核细胞计数没有显著变化,表明1741G09 E430G对其细胞耗竭活性具有特异性。
在使用人血清和分离的NK或T细胞的CDC测定中观察到至多65%的NK细胞耗竭,但没有显著的T细胞耗竭(图11)。从人全血测定(图12)中获得的更高的最大耗竭速率(NK细胞为90%和T细胞为75%)表明在此测定中存在涉及细胞耗竭的其它效应细胞组分。
掺入T-ALL细胞的离体人全血测定
理想地,应在T-ALL的血液样品中评估肿瘤细胞耗竭。然而,由于患者很少并且原代T-ALL细胞难以培养,因此很难获得此类样品。为了规避此问题,在健康供体的血液样品中掺入了T-ALL细胞系,CEM细胞。在存在10μg/ml(≈67nM)的1741G09 IgG1 E430G、1741G09IgG1野生型、E430G IgG1同种型对照或奥法木单抗的情况下评估CEM细胞的存活率以及来自健康供体的NK细胞、T细胞和B细胞的存活率。使用高浓度抗体以确保达到最大杀伤。结果示出于图13中。
1741G09 E430G显著降低加标全血样品中的CEM细胞计数。包含1741G09wt抗体作为与CDC增强版本的比较。与1741G09 E430G抗体不同,1741G09的wtFc版本已示出在CDC测定中不会显著耗竭CEM细胞(数据未示出)。在全血测定中,1741G09的wt和E430G版本均显著降低了CEM细胞的数量,但E430G版本的功效要大得多(平均耗竭百分比96.2%对66.8%)。1741G09 wt抗体对CEM细胞的耗竭表明除CDC外的其它效应组分也涉及所述过程。如所预期的,奥法术单抗在不影响CEM、NK或T细胞计数的情况下显著降低了B细胞计数。
NK和T细胞计数也被1741G09 E430G显著降低,但不是1741G09野生型。NK细胞(75%)和T细胞(52%)的耗竭不如CEM细胞(96%)的耗竭高。此数据证实,1741G09 E430G抗体的影响与靶细胞的CD7表达水平有关(CEM细胞>NK细胞>T细胞,图21),并且其对细胞耗竭的影响大于野生型Fc版本。
抗C5a抗体对前导诱导的细胞耗竭的影响
为了更好地了解前导的作用方式,评估了抗补体5a(C5a)抗体对1741G09 E430G、1741G09野生型和奥法木单抗诱导的细胞耗竭的影响。补体途径可以分为活化途径和裂解途径(图18)(31)。C5可以通过C3切割为C5a(活化途径)和C5b(裂解途径)。C5a具有趋化性和过敏性性质,并且在先天免疫应答(平滑肌收缩、血管通透性、肥大细胞和嗜碱性粒细胞的脱颗粒、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞的定向迁移)中发挥重要作用。本发明测定中使用的抗体能够抑制C5a与C5a受体的结合,而不阻断C5的切割(32)。
1741G09的wt和E430G版本都减少了CEM细胞的计数(分别减少了49%和90%)(图14)。添加抗C5a抗体不影响任一版本诱导的CEM细胞耗竭。尽管抗C5a不会阻断CEM细胞耗竭,但这两个版本的1741G09背后的MOA预期会有很大不同。1741G09 E430G缺乏对CEM耗竭的抑制支持此抗体通过裂解途径起作用的假设。E430G驱动的耗竭不太可能归因于NK细胞介导的ADCC,因为一旦添加1741G09 E430G,NK细胞将通过CDC迅速耗竭。相比之下,wt版本不会通过CDC耗竭NK或CEM细胞(数据未示出)。因此,wt版本对CEM细胞的耗竭可能是通过NK细胞介导的ADCC、巨噬细胞介导的吞噬作用或中性粒细胞介导的吞噬作用,在此实验设置中,这些似乎都不受抗C5a抗体的抑制。
1741G09 E430G抗体减少了NK和T细胞的计数(分别减少了70%和49%)。与CEM细胞相比,添加抗C5a使1741G09 E430G诱导的T细胞减少恢复为与同种型对照类似的细胞计数(图14),表明1741G09 E430G对T细胞的耗竭不归因于经典的或裂解途径,但归因于补体耗竭的炎症途径。这与CDC测定中1741G09 E430G没有显著耗竭PBMC T细胞的结果一致。添加抗C5a也部分恢复了1741G09 E430G诱导的NK细胞减少,表明此分子通过活化途径和裂解途径两者耗竭了NK细胞。奥法木单抗的作用可能会被抗C5a部分地逆转;然而,应该指出的是,此实验仅在一个供体中进行。在裂解途径抑制剂(如依库丽单抗(eculizumab))存在的情况下,将全血与1741G09的温育将确认此途径的要求。
体内异种移植研究
抗CD7抗体先前已证明在异种移植模型中有效(33)。为了评估1741G09 E430G抗体的功效,在儿科复发性PDX T-ALL异种移植模型中测试了所述抗体。
在第0天注射5×106个PDTALL46细胞后,从第3天直到研究结束,NSG小鼠以10mg/Kg每周给药三次。在连续时间点处抽血以通过流式细胞术评估血液中的人CD5表达水平,因为未鉴定出不与1741G09竞争的抗CD7的抗体。卡普兰-迈耶图证明,与具有同种型对照的组相比,用1741G09 E345R处理的组的存活时间显著增加(图15)。由于NSG小鼠严重免疫缺陷,其缺乏T细胞、B细胞和NK细胞,并且补体活性和巨噬细胞也有缺陷。在存在1741G09E430G的情况下,中性粒细胞介导的吞噬作用(34)可能介导了此小鼠模型中观察到的耗竭。
可开发性
作为候选者1741G09 E430G的可开发性评估的一部分,已进行了三项前CMC研究:早期调配物筛选、加速/实时研究和强制降解研究。
在早期调配物筛选中,将候选者溶解在12+不同的平台调配物缓冲液中,然后进行胶体和构象稳定性评估(Tm和Tagg确定,分别通过内在荧光和SLS)。两种平台缓冲液证明合适的稳定性,并且被列入加速和实时研究的候选名单:在两种调配物缓冲液中的每一种中以1mg/ml制备候选者,或作为另外对照的PBS,并且在5℃、25℃和37℃下温育两周。对于每种条件,实验一式三份地进行。测量了以下质量属性:通过SEC-HPLC和DLS测得的聚集体,通过SDS-PAGE测得的片段,通过CDC功能测定测得的活性。在任何测试条件下温育两周后,没有观察到任何质量属性或活性的显著变化。另外地,候选者经受冷冻/解冻压力,并且在-70℃下储存至少18小时,然后在室温下解冻3小时的3个循环后,未观察到相同质量属性的变化。
最后,对PBS中1mg/ml的候选者进行强制降解研究:强制脱酰胺(在37℃下在1%碳酸氢铵中温育72小时)、强制氧化(在25℃下在0.03%、0.003%和0.0003%H2O2中温育24小时)和酸性保持(在25℃和pH 2.8下温育3小时)。CDC功能测定的活性在应激条件之前和之后一式两份地进行测试。在较低和中等水平的H2O2下强制脱酰胺、酸保持和强制氧化后未观察到显著变化,而在较高H2O2浓度下的氧化示出了活性降低87%,并且EC50增加4倍。
与计算机模拟预测一致,从可开发性的角度来看,实验数据表明风险较低:候选者可以通过具有合适产品质量的平台蛋白A工艺进行纯化(聚集体低于1%,标称浓度为10mg/ml到PBS pH 7.4中作为平台缓冲液)。早期的调配物筛选证明平台调配物缓冲液可以进一步改善胶体和构象稳定性,而两周后的加速和实时条件不会影响产品质量或活性。力退化测试总体上强调了低风险,其中没有因冻结/解冻、酸性保持、脱酰胺而产生的影响;氧化风险被视为是低/中等的,并且可以通过添加牺牲抗氧化赋形剂的调配物来控制。
总体而言,基于此处呈现的计算和实验数据集,从前CMC的角度来看,候选者呈现出低风险。
前导分子表达
CD7项目中的前导分子1741G09 HuIgG1 E430G C端赖氨酸剪切,轻链的Phe变体(1741G09 E430G),已在瞬时和稳定池表达系统两者中表达。
1741G09 E430G在瞬时系统中以三种不同的比例30ml、200ml和2L表示。与表达对照抗体的培养物相比,细胞生长或活力没有显著差异。转染后第5天,所有比例中的表达水平相同,而第12天的表达有所不同,其中30ml和2L比例下的表达水平>600mg/L。表达在200ml比例下达到稳定。这种不同比例下表达产量的差异并不少见。
1741G09 E430G在30ml和2L比例下的表达产量高于与所有分子一起表达的标准高表达对照抗体(图18)。这是一个很好的初步指标,表明1741G09 E430G可以在适当的水平下表达。然而,重要的是要注意,尽管轶事证据表明,如果分子在瞬时系统中高表达,那么所述分子可能会产生高表达的稳定细胞系,但来自瞬时系统的稳定结果的可预测性尚未完全评估。
已生成三个稳定表达1741G09 E430G的细胞池。在补料分批过度生长的第13天,这些池的平均表达为385mg/L。1741G09E430G稳定池表达是平行产生的高表达对照抗体池所观察到的表达的43%。池可能含有高表达和低表达克隆的混合物,并且因此选择适当的克隆可能会带来良好的产量。事实上,对于不相关的分子,迷你池是从表达了约50%的对照,并且实现了>5倍的表达改善的池中生成的。
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术语表
AML 急性髓性白血病
ADCC 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
ADCP 抗体依赖性细胞介导的吞噬作用
CAR-T 嵌合抗原受体T细胞
CDC 补体依赖性细胞毒性
CEBPA CCAAT/增强子结合蛋白α基因
CRP 补体调节蛋白
DC 发展候选者
HSC 造血干细胞
mAb 单克隆抗体
MOA 行动模式
MRD 微小残留病
PBMC 外周血单个核细胞
SoC 护理标准
Tagg 聚集温度
T-ALL T细胞急性淋巴细胞白血病
Tm 熔融温度
T-PLL T细胞幼淋巴细胞白血病术语表
AML 急性髓性白血病
ADCC 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
ADCP 抗体依赖性细胞介导的吞噬作用
CAR-T 嵌合抗原受体T细胞
CDC 补体依赖性细胞毒性
CEBPA CCAAT/增强子结合蛋白α基因
CRP 补体调节蛋白
DC 发展候选者
HSC 造血干细胞
mAb 单克隆抗体
MOA 行动模式
MRD 微小残留病
PBMC 外周血单个核细胞
SoC 护理标准
Tagg 聚集温度
T-ALL T细胞急性淋巴细胞白血病
Tm 熔融温度
T-PLL T细胞幼淋巴细胞白血病
表1.通过SPR测量的亲和力表征。mAb的SPR的动力学速率和平衡结合常数是通过使用1∶1交互模型对传感图进行全局拟合获得的。nbs=没有观察到结合。
表2.CDC测定中前导mAb对CEM细胞的最大杀伤和EC50值。从图5中的实验获得平均最大杀伤和EC50值。
MAb | 最大杀伤 | EC<sub>50</sub> |
1730C02 E345R | 93.2% | 0.37pM |
1734E10 E345R | 8.8% | 0.09nM |
1734F05 E345R | 100.1% | 1.16nM |
1738B07 E345R | 75.4% | 2.25nM |
1741E04 E345R | 99.8% | 0.12nM |
1741G09 E345R | 99.5% | 0.12nM |
1896A03 E345R | 69.5% | 0.60nM |
TH69 E345R | 87.1% | 0.21nM |
RFT2 E345R | 98.5% | 0.22nM |
表3.CDC测定中1741G09 E430G对14个T-ALL细胞系的最大杀伤和EC50值。这些数据是从图8的实验中获得的。其CD7相对表达水平基于来自表8和9的数据
表4.来自用1741G09 E430G和对照抗体处理的PBMC的细胞因子水平。IgG1和 IgG1E430G抗体包含作为阴性对照,并且抗CD3和抗CD28作为阳性对照。来自5个供体的PBMC在37℃下用不同的抗体以60μg/ml的浓度处理48小时。
表5:使用WHO标准对T-ALL/LBL进行免疫表型分类(37)
表6:抗体的统计比较呈现于图6中
表7:PDTALL细胞系的临床和基因谱
表8:非复发性T-ALL细胞系的CD7和CRP表达谱
表9:复发性T-ALL细胞系的CD7和CRP表达谱
表10:1741G09 E430G的生物物理汇总
表11:序列
用于本发明的序列。
表12:基因区段使用
Claims (28)
1.一种抗体或片段,其包括与CD7(分化簇7)特异性结合的结合位点,其中所述结合位点包括由源自人VH基因区段、DH基因区段和JH基因区段的重组的核苷酸序列编码的VH结构域,其中所述VH基因区段是IGHV3-15。
2.根据权利要求1所述的抗体或片段,其中所述DH基因区段是选自IGHD3-9和IGH6-19的人基因区段和/或其中所述JH基因区段是选自IGHJ6和IGHJ4的人基因区段。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或片段,其包括:
(a)VH结构域,所述VH结构域包括选自G09和E04的抗体的CDRH3序列或所述包括3、2或1种氨基酸取代的序列;并且任选地所述VH结构域包括所述所选抗体的CDRHl序列或所述包括3、2或1种氨基酸取代的CDRHl序列;或者
(b)VH结构域,所述VH结构域包括选自G09和E04的抗体的CDRH3序列或所述包括3、2或1种氨基酸取代的CDRH3序列;并且任选地包括所述所选抗体的CDRH2序列或所述包括3、2或1种氨基酸取代的CDRH2序列;或者
(c)VH结构域,所述VH结构域包括选自G09和E04的抗体的CDRH1、2和3序列或所述包括3、2或1种氨基酸取代的序列;或者
(d)选自SEQ ID NO:3、6、63和66的CDRH3序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段,其中所述结合位点包括VH结构域,所述VH结构域包括选自G09和E04的抗体的VH结构域的氨基酸序列;或与其至少70%相同的氨基酸。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段,其中所述结合位点包括
(a)包括SEQ ID NO:7的与包括SEQ ID NO:17的VL结构域配对的VH结构域;或者
(b)包括SEQ ID NO:67的与包括SEQ ID NO:77的VL结构域配对的VH结构域。
6.一种(任选地根据前述权利要求中任一项所述的)抗体或片段,其包括与CD7特异性结合的结合位点,其中所述结合位点包括由源自人VL基因区段和JL基因区段的重组的核苷酸序列编码的VL结构域,其中所述VL基因区段是IGKV1D-39。
7.根据权利要求6所述的抗体或片段,其中所述VL是Vκ,并且所述JL基因区段是人基因区段IGKJ4。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段,其包括:
(a)VL结构域,所述VL结构域包括选自SEQ ID NO:13和16的CDRL3序列或所述包括3、2或1种氨基酸取代的所选CDRL3序列;
(b)VL结构域,所述VL结构域包括选自G09 E04的抗体的CDRL3(以及任选地CDRH3)序列或所述各自包括3、2或1种氨基酸取代的序列,并且任选地所述VL结构域包括抗体G09的CDRL1序列或所述各自包括3、2或1种氨基酸取代的CDR1序列;或者
(c)VL结构域,所述VL结构域包括选自G09的抗体的CDRL3(以及任选地CDRH3)序列或所述各自包括3、2或1种氨基酸取代的CDR3序列;以及任选地抗体G09的CDRL2序列或所述各自包括3、2或1种氨基酸取代的CDR2序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段,其包括:
(a)选自G09和E04的抗体的重链氨基酸序列;或与其至少70%相同的氨基酸;和/或
(b)选自G09和E04的抗体的轻链氨基酸序列;或与其至少70%相同的氨基酸。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段,其中所述结合位点包括VL结构域,所述VL结构域包括选自G09和E04的抗体的VL结构域的氨基酸序列;或与其至少70%相同的氨基酸。
11.一种抗体或片段,其特异性结合与抗体G09或E04结合的表位相同的人CD7表位;或其与抗体G09或E04竞争与人CD7结合。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段,其与以下特异性结合:包括SEQ IDNO:82的人CD7;和/或包括SEQ ID NO:85的食蟹猴CD7;和/或包括SEQ ID NO:86的大鼠CD7。
13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段,其中所述抗体或片段包括人恒定区,所述人恒定区包括SEQ ID NO:88、90、92、94或96(例如,SEQ ID NO:88)的氨基酸序列。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段,其进一步包括特异性结合另一个靶抗原(任选地人CD5、CD14或CD19)的抗原结合位点。
15.一种如前述权利要求中任一项所定义的抗CD7抗体或片段,其用于治疗或预防受试者的CD7介导的疾病或病状(任选地癌症)。
16.根据权利要求15所述的抗CD7抗体或片段,其中所述疾病或病状选自白血病、淋巴瘤、血癌和骨髓增生异常综合征(MDS)。
17.根据权利要求15或16所述的抗体或片段,其中所述抗体或片段与化学疗法或免疫检查点抑制剂同时或顺序地施用于所述受试者。
18.一种一定量的抗CD7抗体或片段和一定量的化学治疗剂的组合(任选地包括多剂量的所述抗体和/或药剂),其中所述抗体或片段是根据权利要求1到17中任一项所述的抗体或片段。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗体、片段或组合,其用于治疗人的白血病的方法中,其中所述抗体、片段或组合任选地与人CD5、CD14或CD19的拮抗剂一起施用于所述人。
20.根据权利要求19所述的抗体、片段或组合,其中所述白血病是急性髓性白血病或T-ALL,或者是复发性白血病(例如,复发性AML或T-ALL)。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的抗体、片段或组合,其用于治疗人或动物受试者的由所述受试者的CD7+细胞介导的疾病或病状的方法中,其中所述方法包括向所述受试者施用所述抗体、组合的片段,其中CD7细胞任选地通过ADCP和/或CDC被靶向和杀死。
22.一种根据前述权利要求中任一项所述的抗体、片段或组合的用途,其用于制造用于施用于受试者以治疗或预防CD7介导的疾病或病状,任选地癌症(任选地白血病,如T-ALL)的药物。
23.一种药物组合物,其包括根据权利要求1到21中任一项所述的抗体、片段或组合以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
24.一种核酸,其
(a)对根据权利要求1到17中任一项所述的抗体或片段的VH结构域和/或VL结构域进行编码;
(b)对以下进行编码:(i)包括选自G09和E04的抗体的VH结构域的氨基酸序列的VH结构域;或与其至少70%相同的氨基酸;和/或(ii)包括选自G09和E04的抗体的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域;或与其至少70%相同的氨基酸;
(c)包括与SEQ ID NO:10的序列至少70%相同的核苷酸序列;和/或与SEQ ID NO:20的序列至少70%相同的核苷酸序列;
(d)对根据权利要求1到17中任一项所述的抗体或片段的重链和/或轻链进行编码;
(e)对以下进行编码:(i)包括与SEQ ID NO:7至少70%相同的氨基酸序列的重链和/或(ii)包括与SEQ ID NO:17至少70%相同的氨基酸序列的轻链;或者
(f)包括与选自G09和E04的抗体的所选重链序列至少70%相同的核苷酸序列;和/或与选自G09和E04的抗体的所选序列至少70%相同的核苷酸序列。
25.一种载体,其包括根据权利要求24所述的核酸;任选地其中所述载体是CHO或HEK293载体。
26.一种宿主细胞,其包括根据权利要求24所述的核酸或根据权利要求25所述的载体。
27.一种诊断受试者的CD7介导的疾病或病状(任选地癌症)的方法,所述方法包括将根据权利要求1到17中任一项所述的抗体或片段与分离的血液或血清样品组合以及确定由所述样品包括的细胞被所述抗体或片段特异性结合。
28.一种用于检测样品中的CD7阳性细胞的体外测定,所述测定包括将根据权利要求1到17中任一项所述的抗体或片段与分离的血液或血清样品组合以及确定由所述样品包括的细胞被所述抗体或片段特异性结合。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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