CN101687925B

CN101687925B - 抗IL-23p19的工程抗体

Info

Publication number: CN101687925B
Application number: CN2008800131689A
Authority: CN
Inventors: L·G·普雷斯塔; B·M·拜尔; R·N·因格拉姆; P·奥尔特; Y-H·刘
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme BV
Priority date: 2007-02-23
Filing date: 2008-02-21
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2028-02-21
Also published as: US20100272731A1; HRP20182174T1; ES2708988T3; LUC00092I1; HUE042172T2; CN101687925A; NL300959I2; EP2426144A1; JP6054898B2; CA2678749A1; EP2426144B1; CY2019004I1; MX2009009079A; DK2426144T3; US8293883B2; IL200560A0; PT2059534E; CY1112912T1; HRP20120611T1; ZA200906224B

Abstract

本发明提供了针对人白介素-23p19(IL-23p19)的工程抗体及其用途，例如在治疗炎性疾病、自身免疫病和增生性疾病中的用途。

Description

抗IL-23p19的工程抗体

发明领域

总的来讲，本发明涉及白介素-23p19(IL-23p19)特异性抗体及其用途。更具体地讲，本发明涉及识别人IL-23p19并调节其活性(尤其在炎性疾病、自身免疫病和增生性疾病中)的人源化抗体。

发明背景

免疫系统的功能是保护个体免遭感染性因子(例如细菌、多细胞生物和病毒)的感染并免遭癌症侵袭。该系统包括几种类型的淋巴细胞和骨髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)、嗜酸性粒细胞、T细胞、B细胞和嗜中性粒细胞。这些淋巴细胞和骨髓细胞通常产生信号转导蛋白，即细胞因子。免疫应答包括产生炎症，即免疫细胞在全身或机体的特定部位积累。为了响应感染性因子或外源物质，免疫细胞分泌细胞因子，而细胞因子反过来又能调节免疫细胞增殖、发育、分化或迁移。免疫应答可产生病理后果，例如当它参与过度炎症时，例如在自身免疫病中(参见例如Abbas等(编著)(2000)Cellular and Molecular Immunology，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，PA；Oppenheim和Feldmann(编著)(2001)Cytokine Reference，Academic Press，San Diego，CA；von Andrian和Mackay(2000)NewEngl.J.Med.343：1020-1034；Davidson和Diamond(2001)New Engl.J.Med.345：340-350)。

白介素-12(IL-12)是由p35亚基和p40亚基组成的异二聚体分子。研究表明，IL-12在初始T细胞分化成能分泌IFNγ的1型T-辅助CD4⁺淋巴细胞的过程中起到关键性作用。研究还表明，IL-12在体内对T细胞依赖性免疫应答和炎症应答至关重要。参见例如Cua等(2003)Nature 421：744-748。IL-12受体由IL-12β1亚基和IL-12β2亚基组成。

白介素-23(IL-23)是由p19和p40两种亚基组成的异二聚体细胞因子，其中p19是IL-23所独有的，而p40是与IL-12共有的。p19亚基与IL-6、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和IL-12的p35亚基具有结构相关性。IL-23通过与DL-23R和IL-12β1(与IL-12受体共有)所组成的异二聚体受体结合而介导信号转导。大量早期研究表明，p40遗传缺陷(p40敲除小鼠；p40KO小鼠)的后果比p35KO小鼠的后果更为严重。IL-23的发现以及p40KO不仅阻止IL-12表达，而且阻止IL-23表达的发现，最终解释了这些结果中的某些方面(参见例如Oppmann等(2000)Immunity 13：715-725；Wiekowski等(2001)J.Immunol.166：7563-7570；Parham等(2002)J.Immunol.168：5699-708；Frucht(2002)Sci STKE 2002，E1-E3；Elkins等(2002)Infection Immunity70：1936-1948)。

通过使用p40KO小鼠的近期研究表明，对IL-23和IL-12的阻断能有效治疗各种炎性疾病和自身免疫病。然而，通过p40对IL-12的阻断看来具有不同的全身性后果，例如对微生物机会性感染的敏感性增加。Bowman等(2006)Curr.Opin.Infect.Dis.19：245。

治疗性抗体可用于阻断细胞因子的活性。将抗体用于体内治疗药的最主要限制是抗体的免疫原性。因为大多数单克隆抗体都来自啮齿类，所以在人体中重复使用将会导致产生针对治疗性抗体的免疫应答。这样的免疫应答轻则会导致治疗功效的丧失，重则导致潜在的致命性过敏反应。降低啮齿类抗体免疫原性的初期工作包括制备小鼠可变区与人恒定区融合在一起的嵌合抗体。Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-43。然而，注射了人可变区与小鼠恒定区杂合体的小鼠产生直接针对人可变区的强烈的抗-抗体应答，表明在这样的嵌合抗体中保留完整的啮齿类Fv区仍会在患者中产生不良的免疫原性。

通常认为，可变区的互补决定区(CDR)环包含抗体分子的结合位点。因此，试图将啮齿类CDR环移植到人构架上(即人源化)，以进一步减少啮齿类序列。Jones等(1986)Nature 321：522；Verhoeyen等(1988)Science 239：1534。然而，CDR环的交换仍不能一致产生与原抗体具有相同结合特性的抗体。还需要改变人源化抗体中CDR环支架所包含的构架残基(FR)，以保留抗原结合亲和性。Kabat等(1991)J.Immunol.147：1709。尽管已报道在大量人源化抗体构建体中都采用CDR移植和构架残基保留，但很难预测特定序列是否会产生具有所需结合特性和生物学特性(在某些时候)的抗体。参见例如Queen等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 86：10029，Gorman等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88：4181和Hodgson(1991)Biotechnology(NY)9：421-5。此外，先前大多数研究都将不同的人序列用于动物的轻链可变区序列和重链可变区序列，使得这些研究的预测特性不可靠。已知抗体的序列已被使用，尤其是具有已知X射线结构的抗体，即抗体NEW和KOL的那些序列。参见例如Jones等人，出处同上；Verhoeyen等人，出处同上；和Gorman等人，出处同上。对于某些人源化构建体，已经报道了确切的序列信息。以下文献中已公开了示例性的针对IL-23p19的工程抗体：共同转让的美国临时专利申请号60/891,409和60/891,413(均在2007年2月23日提交)、美国专利申请公布号2007/0009526和2007/0048315、以及国际专利公布说明书WO 2007/076524、WO2007/024846和WO 2007/147019。

需要抗huIL-23p19抗体，用于例如治疗炎性疾病、自身免疫病和增生性疾病。优选对这些抗体进行工程化改造来引入人种系序列(例如在构架区中)，以降低在人类治疗对象体内的免疫原性。优选这些抗体将会对huIL-23p19具有高亲和性并以高特异性结合huIL-23p19。

发明概述

本发明提供与人IL-23p19结合的结合化合物，例如抗体或其片段，包括人源化抗体或嵌合重组抗体，所述结合化合物包含具有至少1个、2个或3个选自SEQ ID NO：32-46的CDR的抗体轻链可变区或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明的结合化合物包含轻链可变区，该区包含至少一个选自SEQ ID NO：32-36的CDRL1；至少一个选自SEQ ID NO：37-41的CDRL2；和至少一个选自SEQ ID NO：42-46的CDRL3。

在一个实施方案中，结合化合物包含具有至少1个、2个或3个选自SEQ ID NO：15-31的CDR的抗体重链可变区，或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明的结合化合物包含重链可变区，该区包含至少一个选自SEQ ID NO：15-19的CDRH1；至少一个选自SEQ ID NO：20-26的CDRH2；和至少一个选自SEQ ID NO：27-31的CDRH3。

在其它实施方案中，本发明的结合化合物包含前两段所描述的轻链可变区和重链可变区，或其抗原结合片段。

在某些实施方案中，结合化合物包含构架区，其中架构区的氨基酸序列全都是或基本上都是人免疫球蛋白氨基酸序列。

在某些实施方案中，轻链可变区和/或重链可变区包含一个或多个CDR的变异体。在不同的实施方案中，变异体结构域包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个与相应SEQ ID NO序列相关的保守修饰的氨基酸残基。保守氨基酸取代见下表1。

在某些实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO：14的残基1-108或其变异体。在某些实施方案中，重链可变区包含选自SEQID NO：6-8(例如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8)的残基1-116的序列。在不同的实施方案中，变异体可变区包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50个或更多个与相应SEQ ID NO序列相关的保守修饰的氨基酸残基。在又一个实施方案中，结合化合物包含本段所描述的轻链可变区和重链可变区，或其抗原结合片段。

在一个实施方案中，结合化合物包含SEQ ID NO：14的轻链序列和/或选自SEQ ID NO：6-8的重链序列。

在其它实施方案中，本发明的结合化合物包含基本上由SEQ ID NO：14的残基1-108组成的轻链可变区，或其抗原结合片段；和/或基本上由选自SEQ ID NO：6-8(例如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8)的残基1-116的序列组成的重链可变区，或其抗原结合片段。

在其它实施方案中，本发明的结合化合物包含与SEQ IDNO：14的残基1-108具有至少50％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同源性的轻链可变区，或其抗原结合片段；和/或与选自SEQ ID NO：6-8(例如SEQ ID NO：6、SEQ EO NO：7或SEQ ID NO：8)的残基1-116的序列具有至少50％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同源性的重链可变区，或其抗原结合片段。

在一个实施方案中，本发明的结合化合物与人IL-23p19(SEQ ID NO：47)在表位上结合，所述表位包含残基20-30或残基82-110或这两者。在另一实施方案中，IL-23p19结合化合物与表位结合，所述表位包含以下残基的某些或全部：残基K20、T23、W26、S27、P30、E82、S95、L96、L97、P98、D99、P101、G103、Q104、H106、A107和L110，以及任选残基L24、L85、T91、S100和V102。在不同的实施方案中，通过获取抗体：抗原复合体的X射线晶体结构并测定IL-23p19上哪些残基在目标抗体上的残基的指定距离内，来测定目标抗体的表位，其中指定距离是例如4

或5在某些实施方案中，表位定义为沿IL-23p19序列延伸的11个或更多个邻接的氨基酸残基，其中至少30％、40％、45％、50％或54％的残基在抗体的指定距离内。

在一个实施方案中，本发明涉及在交叉阻断测定(cross-blocking assay)中能阻断本发明结合化合物与人IL-23结合的抗体。在另一个实施方案中，本发明涉及能阻断IL-23介导活性的结合化合物，所述活性包括但不限于与其受体结合并促进T_H17细胞的增殖或存活。

在某些实施方案中，本发明的结合化合物还包含重链恒定区，其中重链恒定区包含γ1、γ2、γ3或γ4人重链恒定区或其变异体。在不同的实施方案中，轻链恒定区包含λ或κ人轻链恒定区。

在不同的实施方案中，本发明的结合化合物是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或完整人抗体或其片段。本发明还考虑的是抗原结合片段是选自例如以下的抗体片段：Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)₂和双抗体(diabody)。

本发明包括在人类治疗对象体内抑制免疫应答的方法，所述方法包括将IL-23特异性抗体(或其抗原结合片段)以有效阻断IL-23生物活性的量给予有需要的治疗对象。在某些实施方案中，对IL-23具有特异性的抗体是人源化抗体或嵌合抗体。在另一些实施方案中，免疫应答是包括关节炎、银屑病和炎性肠病在内的炎性应答。在其它实施方案中，免疫应答是自身免疫应答，包括多发性硬化、葡萄膜炎、系统性红斑狼疮和糖尿病。在另一个实施方案中，所述治疗对象患有癌症，免疫应答是Th17应答。

本发明还考虑给予另外的免疫抑制药或抗炎药。本发明的结合化合物可包含在药物组合物中，所述组合物含有所述结合化合物或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体或稀释剂。在另一个实施方案中，药物组合物还包含免疫抑制药或抗炎药。

本发明包括分离的核酸，所述核酸编码本发明结合化合物的抗体实施方案的多肽序列。核酸在表达载体中可与被该载体所转染的宿主细胞所识别的调节序列操作性连接。本发明还包括含有所述载体的宿主细胞和产生多肽的方法，所述方法包括在表达核酸序列的条件下培养宿主细胞，从而产生多肽，然后自宿主细胞或培养基中回收该多肽。

在不同的实施方案中，本发明涉及本发明结合化合物在制备用于治疗以下疾病的药物中的用途，所述疾病包括但不限于炎性疾病、自身免疫病、癌症、感染性疾病(例如细菌性、分枝杆菌性、病毒性或真菌性感染，包括慢性感染)、关节炎、银屑病、炎性肠病、多发性硬化、葡萄膜炎、系统性红斑狼疮和糖尿病。

在其它实施方案中，本发明涉及用于治疗以下疾病的含本发明结合化合物的药物组合物，所述疾病包括但不限于炎性疾病、自身免疫病、癌症、感染性疾病(例如细菌性、分枝杆菌性、病毒性或真菌性感染，包括慢性感染)、关节炎、银屑病、炎性肠病、多发性硬化、葡萄膜炎、系统性红斑狼疮和糖尿病。

在某些实施方案中，本发明的结合化合物或药物组合物导致治疗对象疾病症状的长期缓解，使得给药间隔期可延长至比结合化合物在治疗对象体内的半衰期长得多，例如在治疗复发缓解型疾病中。在不同的实施方案中，一次给药与另一次给药之间的间隔期为6周、8周、10周、12周、16周、20周、24周、30周或更长时间。在其它实施方案中，一次给药足以永久性防止复发。

附图简述

图1显示小鼠抗人IL-23p19抗体克隆重链可变区序列的比较。提供了克隆m1A11、m11C1、m5F5、m21D1、m13B8、h13B8a、h13B8b和h13B8c的序列。标出了CDR。在两幅图中，“m”前缀是指鼠抗体，而“h”是指人源化抗体。后缀“a”、“b”和“c”是指人源化13B8重链可变区的序列变异体，这在下文有更详细讨论。

图2显示小鼠抗人IL-23p19抗体克隆轻链可变区序列的比较。提供了克隆m1A11、m11C1、m5F5、m21D1、m13B8、h13B8的序列。标出了CDR。

发明详述

包括所附权利要求书在内的本文中所用名词的单数形式例如“一个”、“一种”以及“所述”包括它们相应的复数形式，除非上下文另有明确说明。下表7提供用于本申请的序列编号的列表。本文所引用的所有参考资料都通过引用结合到本文中，其程度就象每份出版物、专利申请或专利各自通过具体引用分别结合到本文中一样。本文对参考文献的引用不应视为对任何前述技术就是相关现有技术的承认，也不应视为其构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。I.定义

“增殖活性”包括促进以下过程、为以下过程所必需或与以下过程明确相关的活性：例如正常细胞分裂、以及癌症、肿瘤、发育异常、细胞转化、转移和血管生成。

当用于动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物流体时，“给药”和“治疗”是指使外源药物、治疗药、诊断试剂或组合物与动物、人、对象、细胞、组织、器官或生物流体接触。“给药”和“治疗”可指例如治疗方法、药代动力学方法、诊断方法、研究方法和实验方法。细胞治疗包括使试剂与细胞接触，以及使试剂与流体接触，其中流体与细胞接触。“给药”和“治疗”也指例如通过试剂、诊断性组合物、结合组合物对细胞进行体外和离体治疗，或通过另一细胞对细胞进行体外和离体治疗。当用于人、兽医或研究对象时，“治疗”是指治疗性治疗、预防或防止性措施、研究性和诊断性施用。当用于人、兽医或研究对象或者细胞、组织或器官时，“治疗”包括使试剂与动物治疗对象、细胞、组织、生理区室或生理流体接触。“对细胞的治疗”也包括使试剂接触IL-23受体(IL-23R/IL-12Rβ1异二聚体)的情况，例如在流体相或胶体相中，但也包括激动剂或拮抗剂不与细胞或受体接触的情况。

本文所用的术语“抗体”是指表现出所需生物活性的抗体的任何形式。因此，其用于最广泛意义上并且具体覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、完整人抗体等，只要它们能表现出所需生物活性。

本文所用的术语“IL-23p19结合片段”、“其结合片段”或“其抗原结合片段”包括仍基本保留其抑制IL-23p19活性的生物活性的抗体片段或衍生物。因此，术语“抗体片段”或IL-23p19结合片段是指全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线式抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。通常，结合片段或衍生物保留其对IL-23p19抑制活性的至少10％。尽管具有足够亲和性以发挥所需生物效应的任何结合片段都可使用，但是优选结合片段或衍生物保留其对IL-23p19抑制活性的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更高)。这也意味着IL-23p19结合片段可包括具有保守氨基酸取代且基本上不改变其生物活性的变异体。

本文所用的术语“单克隆抗体”是指得自基本上是同种抗体群体的抗体，即除了可能含少量天然发生的突变之外，群体所含的每个抗体都是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相比之下，常规的(多克隆)抗体制备物通常包含针对不同表位(或对不同表位具有特异性)的多种抗体。修饰词“单克隆”是指抗体的特点是其得自基本上同种的抗体群体，而不应视为需要通过任何特定方法制备抗体。例如，本发明所用的单克隆抗体可通过杂交瘤方法来制备，该方法首次由下文描述：Kohler等(1975)Nature 256：495；或可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可从噬菌体抗体文库中分离，采用例如以下文献描述的技术：Clackson等(1991)Nature 352：624-628和Marks等(199I)J.Mol.Biol.222：581-597。

只要它们表现出所需生物活性，单克隆抗体在本文中具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)以及这类抗体的片段，其中重链和/或轻链部分与来源于特定物种的抗体的相应序列相同或同源，或者属于特定抗体种类或亚类，而链的其余部分与来源于另一物种的抗体的相应序列相同或同源，或者属于另一抗体种类或亚类。美国专利号4,816,567；Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855。

“域抗体(domain antibody)”是免疫功能性免疫球蛋白片段，其仅含重链可变区或轻链可变区。在某些情况下，两个或更多个V_H区与肽接头共价连接，产生二价域抗体。二价域抗体的两个V_H区可靶向相同或不同抗原。

“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在某些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体也可以是双特异性的(参见下文)。

本文所用的术语“单链Fv”或“scFv”抗体是指包含抗体V_H和V_L区的抗体片段，其中这些区可呈单条多肽链形式。通常，Fv多肽还包含在V_H区与V_L区之间的多肽接头，这使sFv形成抗原结合所需的结构。有关sFv的综述，参见Pluckthun(1994)THEPHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES，第113卷，Rosenburg和Moore编著.Springer-Verlag，New York，第269-315页。

本文的单克隆抗体还包括骆驼化单域抗体。参见例如Muyldermans等(2001)Trends Biochem.Sci.26：230；Reichmann等(1999)J.Immunol.Methods 231：25；WO 94/04678；WO 94/25591；美国专利号6,005,079)。在一个实施方案中，本发明提供单域抗体，其包含两个带修饰的V_H区，使得能形成单域抗体。

本文所用的术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其片段包含在同一多肽链中的与轻链可变区(V_L)连接的重链可变区(V_H)(V_H-V_L或V_L-V_H)。通过使用接头(其太短以致于同一条链上的两个区之间不能配对)，使这些区被迫与另一条链上的互补区配对，而产生两个抗原结合位点。有关双抗体的更全面描述可参见例如EP 404,097；WO 93/11161；和Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448。有关工程抗体变异体的一般性综述可参见Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136。

本文所用的术语“人源化抗体”是指含有来自非人类(例如鼠)抗体的序列以及人抗体的序列的抗体形式。这样的抗体含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列。一般而言，人源化抗体包含至少一个、通常两个可变区的基本上所有的部分，其中所有或基本上所有超变环对应于非人类免疫球蛋白的那些超变环，并且所有或基本上所有FR区都是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。当需要区分人源化抗体(例如hum13B8)和亲代啮齿类抗体(例如小鼠13B8或m13B8)时，会将前缀“hum”、“hu”或“h”加在抗体克隆名称前。啮齿类抗体的人源化形式通常包含亲代啮齿类抗体的相同CDR序列，尽管其含有某些氨基酸取代以增加亲和性，增加人源化抗体的稳定性或为了其它原因。

本发明的抗体还包括具有修饰(或封闭)Fc区以提供改变的效应子功能的抗体。参见例如美国专利号5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702；Presta(2006)Adv.Drug Delivery Rev.58：640-656。这样的修饰可用于增加或抑制免疫系统的各种反应，这在诊断和治疗上可能具有有利效果。Fc区的改变包括氨基酸改变(取代、缺失和插入)、糖基化或去糖基化以及添加多个Fc。Fc的改变也可在治疗性抗体中改变抗体的半衰期，而更长的半衰期可导致更少的给药次数，同时更加便利并减少对材料的使用。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731于734-35。

术语“完全人抗体(fully human antibody)”是指仅含人免疫球蛋白的蛋白质序列的抗体。如果在小鼠、小鼠细胞或来自小鼠细胞的杂交瘤中产生的话，完全人抗体可含有鼠源糖链。同样，“小鼠抗体”是指仅含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。可通过噬菌体展示或其它分子生物学方法，在人体内、在具有人免疫球蛋白种系序列的转基因动物中产生完全人抗体。

本文所用的术语“超变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区包含来自“互补决定区”即“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变区的残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)，以及重链可变区的残基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)(Kabat等(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutesof Health，Bethesda，Md.)和/或来自“超变环”的那些残基(即轻链可变区的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3))，以及重链可变区的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。本文所用的术语“构架”即“FR”残基是指在除了本文定义为CDR残基的超变区残基之外的可变区残基。以上的残基编号涉及Kabat编号系统，不一定具体对应于所附序列表的序列编号。

“结合化合物”是指能与靶标结合的分子、小分子、大分子、多肽、抗体或其片段或类似物、或可溶性受体。“结合化合物”也可指分子复合体(例如非共价复合体)、离子化分子、共价或非共价修饰分子(例如通过磷酸化、酰化、交联、环化或限制性切割来修饰的分子)。当用于抗体时，术语“结合化合物”是指抗体和其抗原结合片段。“结合”是指结合组合物与靶标的缔合，在结合组合物可溶解或悬浮于溶液的情况下，这种缔合导致结合组合物的正常布朗运动减少。“结合组合物”是指与例如稳定剂、赋形剂、盐、缓冲剂、溶剂或添加剂组合在一起的能与靶标结合的分子(例如结合化合物)。

“保守修饰的变异体”或“保守取代”是指本领域技术人员已知的氨基酸取代，这通常可在不改变所得分子的生物活性的前提下进行，甚至可在多肽的必需区中进行。这样的示例性取代优选按照下表1所示来进行：表1示例性的保守氨基酸取代

原始残基	保守取代
		Ala(A)	Gly；Ser
Arg(R)	Lys；His
		Asn(N)	Gln；His
Asp(D)	Glu；Asn
		Cys(C)	Ser；Ala
Gln(Q)	Asn
		Glu(E)	Asp；Gln
Gly(G)	Ala
		His(H)	Asn；Gln
Ile(I)	Leu；Val
		Leu(L)	Ile；Val
Lys(K)	Arg；His
		Met(M)	Leu；Ile；Tyr
Phe(F)	Try；Met；Leu
		Pro(P)	Ala
Ser(S)	Thr
		Thr(T)	Ser
Trp(W)	Try；Phe
		Tyr(Y)	Trp；Phe
Val(V)	Ile；Leu

另外，本领域技术人员知道，一般而言，在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性。参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(第4版)。

本说明书全文和权利要求书所用的术语“基本上由...组成”或其变型例如“基本由...组成”是指包括任何所述元素或元素组，并任选包括与所述元素特性相似或不同的其它元素，其在本质上并不改变所指定的给药方案、方法或组合物的基础或者新性质。作为非限制性实例，基本上由所述氨基酸序列组成的结合化合物还可包含一个或多个氨基酸，包括一个或多个氨基酸残基的取代，其本质上并不影响结合化合物的性质。

“有效量”包括足以改善或预防医学病症的症状或病征的量。有效量也指足以允许或促进诊断的量。对于特定患者或兽医学对象而言的有效量因以下各因素而异：例如所治疗病征、患者的总体健康状况、给药的方法途径和剂量以及副作用的严重程度。参见例如美国专利号5,888,530。有效量可以是最大剂量或者可以是避免明显副作用或毒性效应的给药方案。所述效果将会导致诊断测定值或参数改善至少5％，通常至少10％，更通常为至少20％，最通常为至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，最优选至少60％，理想的是至少70％，更理想的是至少80％，最理想的是至少90％，其中100％定义为正常治疗对象所显示的诊断参数。参见例如Maynard等(1996)AHandbook of SOPs for Good Clinical Practice，Interpharm Press，BocaRaton，FL；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice，Urch Publ.，London，UK。

“免疫疾病”或“免疫障碍”包括例如病理炎症、炎性疾病和自身免疫病。“免疫疾病”也指感染、持续感染和增生性疾病，例如癌症、肿瘤和血管生成，包括抵抗免疫系统根除的感染、肿瘤和癌症。“癌性病症”包括例如癌症、癌细胞、肿瘤、血管生成和癌前期病症，例如发育异常。

“炎性疾病”是指这样的障碍或病理症状：其中病理是因免疫系统细胞整体或部分变化所致，例如数量改变、迁移率的改变或活化的改变。免疫系统细胞包括例如T细胞、B细胞、单核细胞或巨噬细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突细胞、小胶质细胞、NK细胞、NKT细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞或与免疫学明确相关的任何其它细胞，例如产生细胞因子的内皮细胞或上皮细胞。

“产生IL-17的细胞”是指并非经典TH1型T细胞或经典TH2型T细胞的T细胞，称为T_H17细胞。T_H17细胞的更详细讨论可参见Cua和Kastelein(2006)Nat.Immunol.7：557-559；Tato和O′Shea(2006)Nature 441：166-168；Iwakura和Ishigame(2006)J.Clin.Invest.116：1218-1222。“产生IL-17的细胞”也指表达以下产物的T细胞：美国专利申请公布号2004/0219150的表10B的基因或多肽(例如促分裂原反应性P-蛋白；趋化因子配体2；白介素-17(IL-17)；相关的转录因子RAR；和/或细胞因子信号转导3的抑制剂)，其中用IL-23激动剂处理的表达大于用IL-12激动剂处理的表达，其中“大于”定义如下。用IL-23激动剂的表达通常比用IL-12处理的表达大至少5倍，通常至少10倍，更通常至少15倍，最通常至少20倍，优选至少25倍，最优选至少30倍。可对表达进行测定，例如用基本纯化的产生IL-17的细胞群体处理来进行测定。Th17应答是一种免疫应答，其中Th17细胞的活性和/或增殖得以增强，尤其是与受抑制的Th1应答相偶联。

此外，“产生IL-17的细胞”包括在细胞发育或细胞分化途径中定向分化为如上定义的产生IL-17的细胞的祖细胞或前体细胞。产生IL-17的细胞的祖细胞或前体细胞可在引流淋巴结(draininglymph node，DLN)中找到。另外，“产生IL-17的细胞”包括如上定义的产生IL-17的细胞，其可以是例如被佛波酯、离子运载体和/或致癌剂活化；进一步分化；贮存；冷冻；干燥；灭活；通过例如细胞凋亡、蛋白水解或脂质氧化部分降解；或例如经重组技术修饰的产生IL-17的细胞。

本文所用的术语“分离的核酸分子”是指从至少一种污染核酸分子中鉴定并分离出的核酸分子，在抗体核酸的天然来源中所述核酸分子通常与所述污染核酸分子缔合。分离的核酸分子并非以天然存在的形式或设置存在。因此，分离的核酸分子与天然细胞中的核酸分子不同。然而，分离的核酸分子包括通常表达抗体的细胞中所含的核酸分子，其中例如该核酸分子位于与天然细胞的核酸分子不同的染色体位置上。

表达“调节序列”是指在特定宿主生物中操作性连接的编码序列表达所需的DNA序列。适用于原核生物的调节序列包括例如启动子、任选操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞能利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

当核酸位于另一核酸序列的功能性相关位置时，该核酸就是“操作性连接”的。例如，如果前序列即分泌性前导序列的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白的话，则该DNA就与多肽的DNA操作性连接；如果启动子或增强子影响序列的转录的话，则该启动子或增强子就与编码序列操作性连接；或者，如果核糖体结合位点的位置能促进翻译的话，则该位点就与编码序列操作性连接。通常，“操作性连接”是指所连接的DNA序列是邻接的，而且在分泌性前导序列的情况下是邻接的且在读框内。然而，增强子不必是邻接的。通过在方便的限制性位点上的连接作用来进行连接。如果这样的位点不存在，可按照常规实践，使用合成寡核苷酸衔接头或接头。

本文所用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，所有这些名称都包括后代。因此，术语“转化子”和“转化细胞”包括原代治疗对象细胞和源自它的培养物，而不考虑转移次数。也应该理解的是，所有后代在DNA含量上并非正好相同，因为有故意或无意突变。所筛选的与原始转化细胞具有同样功能或生物活性的突变后代也包括在内。尽管用不同名称，但从上下文看是显而易见的。

本文所用的“聚合酶链式反应”即“PCR”是指按照例如美国专利号4,683,195所述，对微量核酸、RNA和/或DNA的特定片段进行扩增的方法或技术。通常，需要有效的来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物可以与待扩增模板的相反链的序列相同或类似。两个引物的5’端核苷酸可与扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和从总细胞RNA转录而来的cDNA、噬菌体序列或质粒序列等。一般性参见Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263；Erlich编著(1989)PCR TECHNOLOGY(StocktonPress，N.Y.)。认为本文所用的PCR就是一个、但并非唯一一个用于扩增核酸试验样品的核酸聚合酶反应方法的实例，该方法包括使用已知核酸作为引物并使用核酸聚合酶来扩增或产生特定核酸片段。

本文所用的术语“种系序列”是指未重排免疫球蛋白DNA序列的序列，包括啮齿类(例如小鼠)种系序列和人种系序列。未重排免疫球蛋白DNA的任何合适来源都可使用。人种系序列可得自例如美国国立卫生研究院国立关节炎和肌骨和皮肤病研究所(NationalInstitute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the UnitedStates National Institutes of Health)网站上的种系数据库。小鼠种系序列可得自例如Giudicelli等(2005)Nucleic Acids Res.33：D256-D261。

为了检测例如对IL-23活性的抑制程度，将包含给定例如蛋白质、基因、细胞或生物体的样品或测定用潜在活化剂或抑制剂处理，并与无试剂的对照样品相比。对照样品，即未用试剂处理的样品的相对活性值定为100％。当相对于对照而言活性值为约90％以下，通常在85％以下，更通常在80％以下，最通常在75％以下，一般在70％以下，更一般在65％以下，最通常在60％以下，典型的在55％以下，经常在50％以下，更经常在45％以下，最经常在40％以下，优选在35％以下，更优选在30％以下，还更优选25％以下，最优选小于25％时，就达到抑制。当相对于对照而言活性值为约110％，一般为至少120％，更一般为至少140％，更一般为至少160％，经常为至少180％，更经常为至少2倍，最经常为至少2.5倍，通常至少5倍，更通常至少10倍，优选至少20倍，更优选至少40倍，最优选超过40倍以上时，就达到活化。

活化或抑制的终点可监测如下。可通过终点监测对例如细胞、生理流体、组织、器官和动物或人类对象的活化、抑制和治疗反应。终点可包括例如炎症指数、致癌性或细胞脱粒或分泌(例如释放细胞因子、毒性氧或蛋白酶)的预定量或百分率。终点可包括例如以下过程的预定量：离子流动或转运；细胞迁移；细胞粘附；细胞增殖；转移潜力；细胞分化；和表型(phenotype)变化，例如炎症、细胞凋亡、转化、细胞周期或转移等相关基因表达的变化(参见例如Knight(2000)Ann.Clin.Lab.Sci 30：145-158；Hood和Cheresh(2002)Nature Rev.Cancer 2：91-100；Timme等(2003)Curr.Drug Targets 4：251-261；Robbins和Itzkowitz(2002)Med.Clin.North Am.86：1467-1495；Grady和Markowitz(2002)Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.3：101-128；Bauer等(2001)Glia 36：235-243；Stanimirovic和Satoh(2000)BrainPathol.10：113-126)。

抑制终点通常为对照的75％以下，优选为对照的50％以下，更优选为对照的25％以下，最优选为对照的10％以下。通常，活化的终点是对照的至少150％，优选是对照的至少2倍，更优选是对照的至少4倍，最优选是对照的至少10倍。

“小分子”定义为分子量小于10kDa、通常小于2kDa、优选小于1kDa的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机成分的有机分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗药，比起大分子来说，小分子更容易渗透进细胞内，对降解的敏感性更小，不容易引起免疫应答。小分子，例如抗体肽模拟物和细胞因子以及小分子毒素，可参见例如Casset等(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.307：198-205；Muyldermans(200I)J.Biotechnol.74：277-302；Li(2000)Nat.Biotechnol.18：1251-1256；Apostolopoulos等(2002)Curr.Med.Chem.9：411-420；Monfardini等(2002)Curr.Pharm.Des.8：2185-2199；Domingues等(1999)Nat.Struct.Biol.6：652-656；Sato和Sone(2003)Biochem.J.371：603-608；美国专利号6,326,482。

当涉及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”或“选择性”结合是指在蛋白质和其它生物制品的非均质群体中测定蛋白质存在的结合反应。因此，在指定条件下，特异性配体与特定受体结合，并且不与样品中存在的其它蛋白质以显著的量结合。如果与含有IL-23p19序列的多肽结合而不与缺少IL-23p19序列的蛋白结合的话，就认为本文所用的抗体与包含给定序列(在这种情况下是IL-23p19)的多肽特异性结合。例如，与含有IL-23p19序列的多肽特异性结合的抗体可与IL-23p19的

标记形式结合而不与其它

标记的蛋白结合。

所提出方法的抗体或来自抗体的抗原结合位点的结合组合物与其抗原结合的亲和性比与无关抗原结合的亲和性大至少2倍，优选大至少10倍，更优选大至少20倍，最优选的至少100倍。在一个优选的实施方案中，按照例如Scatchard分析测定，抗体亲和性大于约10⁹升/mol。Munsen等(1980)Analyt.Biochem.107：220-239。

本文所用的术语“免疫调节剂”是指抑制或调节免疫应答的天然或合成剂。免疫应答可以是体液应答也可以是细胞应答。免疫调节剂包括免疫抑制剂或抗炎药。

本文所用的“免疫抑制药”、“免疫抑制药物”或“免疫抑制剂”是用于免疫抑制疗法的治疗药，用于抑制或阻止免疫系统的活性。从临床上看，它们可用于防止移植的器官和组织(例如骨髓、心、肾、肝)的排斥，和/或用于治疗最可能是自身免疫来源的自身免疫病(例如类风湿性关节炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、多发性硬化)。免疫抑制药可分为4类：糖皮质激素类细胞抑制药；抗体(包括生物反应调节剂或DMARD)；作用于抑免蛋白的药物；其它药物，包括已知用于治疗增生性疾病的化疗药。具体地讲，对于多发性硬化而言，可将本发明抗体与一类新型髓磷脂结合蛋白样治疗药(称为copaxone)联合给予。

“抗炎剂”即“抗炎药”用于代表甾体类和非甾体类治疗药。甾体类(也叫皮质类固醇)是非常类似于皮质醇(由肾上腺天然产生的一种激素)的药物。甾体类作为主要治疗用于某些炎性病症，例如：全身性脉管炎(血管炎症)；和肌炎(肌肉炎症)。甾体类也可选择性用于治疗炎性病症，例如：类风湿性关节炎(发生于身体两侧关节的慢性炎性关节炎)；系统性红斑狼疮(由异常免疫系统功能引起的全身性疾病)；斯耶格伦综合征(Sjogren’s syndrome)(引起眼干和口干的慢性障碍)。

非甾体抗炎药，通常缩写为NSAID，是具有镇痛、退热和抗炎效果的药物-它们减轻疼痛、发热和炎症。术语“非甾体”用于将这些药物与甾体类区分开来，其(在广泛的其它效果中)具有类似于类二十烷酸类抑制、抗炎作用。在下列病症的症状缓解上通常需要NSAID：类风湿性关节炎；骨关节炎；炎性关节病(例如强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、赖特综合征(Reiter′s syndrome))；急性痛风；通经；转移性骨疼痛；头痛和偏头痛；手术后疼痛；因炎症和组织损伤所致轻度至中度疼痛；发热；和肾绞痛。NSAID包括水杨酸盐类、芳基烷酸类、2-芳基丙酸类(普鲁芬(profen))、N-芳基邻氨基苯甲酸类(芬那酸类(fenamic acids))、昔康类(oxicams)、考昔类(coxibs)和磺酰替苯胺(sulphonanilide)。II.概述

本发明提供抗IL-23的工程抗体及其在治疗炎性疾病、自身免疫病和增生性疾病中的用途。

各种细胞因子在神经障碍的病理或修复上起作用。IL-6、IL-17、干扰素-γ(IFN-γ)和粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)已知与多发性硬化有关。Matusevicius等(1999)Multiple Sclerosis 5：101-104；Lock等(2002)Nature Med.8：500-508。IL-1α、IL-1β和转化生长因子-β1(TGF-β1)在ALS、帕金森病(Parkinson’s disease)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)中起作用。Hoozemans等(2001)Exp.Gerontol.36：559-570；Griffin和Mrak(2002)J.Leukocyte Biol.72：233-238；Ilzecka等(2002)Cytokine 20：239-243。TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、干扰素-γ和IL-17似乎调节对脑缺血的反应。参见例如Kostulas等(1999)Stroke30：2174-2179；Li等(2001)J.Neuroimmunol.116：5-14。血管内皮细胞生长因子(VEGF)与ALS有关。Cleveland和Rothstein(2001)Nature2：806-819。

炎性肠病，例如克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎、乳糜泻和过敏性肠综合征，由免疫系统细胞和细胞因子介导。例如，克罗恩病与IL-12和IFN-γ增加有关，而溃疡性结肠炎与IL-5、IL-13和转化生长因子-β(TGFβ)增加有关。IL-17表达在克罗恩病和溃疡性结肠炎中也会增加。参见例如Podolsky(2002)New Engl.J.Med.347：417-429；Bouma和Strober(2003)Nat.Rev.Immunol.3：521-533；Bhan等(1999)Immunol.Rev.169：195-207；Hanauer(1996)New Engl.J.Med.334：841-848；Green(2003)The Lancet 362：383-391；McManus(2003)New Engl.J.Med.348：2573-2574；Horwitz和Fisher(2001)NewEngl.J.Med.344：1846-1850；Andoh等(2002)Int.J.Mol.Med.10：631-634；Nielsen等(2003)Scand.J.Gastroenterol.38：180-185；Fujino等(2003)Gut 52：65-70。

IL-23受体是IL-23R亚基和IL-12Rβ1亚基的异二聚体复合体。参见Parham等(2000)J.Immunol.168：5699。IL-12受体是IL-12Rβ1亚基和IL-12Rβ2亚基的复合体。参见Presky等(1996)Proc.Nat ′I Acad.Sci USA 93：14002。已经认为IL-23R是炎性肠病、克罗恩病和溃疡性结肠炎中的关键性遗传因子。Duerr等(2006)Sciencexpress2006年10月26日：1。基因组范围的相关研究发现，IL-23R的基因与克罗恩病密切相关，有一种不常见的编码变异体(Arg381Gln)赋予针对该病的强烈性保护。这种遗传相关性证实了先前的生物学发现(Yen等(2006)J.Clin.Investigation 116：1218)，表明IL-23及其受体是治疗IBD的新型疗法的有前景的靶标。

皮肤、关节、CNS的炎性疾病、以及增生性疾病引发类似免疫应答，因此对IL-23的阻断应能提供对这些免疫介导的炎性疾病的抑制，而不包括宿主对抗系统性感染的能力。对IL-23的拮抗应能缓解炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎和特应性皮炎的相关炎症。使用IL-23抑制剂也能提供对增生性疾病的抑制，所述疾病例如癌症和自身免疫病，例如多发性硬化、I型糖尿病和SLE。对于这些不同疾病中IL-23的描述，可参见以下已公布的PCT申请：WO 04/081190；WO 04/071517；WO 00/53631；和WO 01/18051。还发现IL-23抑制剂可用于治疗感染，包括慢性感染，例如细菌性、分枝杆菌性、病毒性和真菌性感染。

IL-23的p19亚基是造血细胞因子“长链”家族的成员(Oppmann等人(2000)，出处同上)并且包含4个压缩的α-螺旋(称为A、B、C和D)，其拓扑学为上-上-下-下。这4个螺旋由3个多肽环连接。A-B环和C-D环的相对长度类似，因为它们连接平行螺旋。短B-C环连接反平行的B螺旋和C螺旋。IL-23的p19亚基是螺旋细胞因子IL-6家族的成员。该细胞因子家族通过3个保守表位(位点I、II和III；Bravo和Heath(2000)EMBO J.19：2399-2411)与其同族受体(cognate receptor)结合。p19亚基与3个细胞因子受体亚基相互作用，形成感受态(competent)信号转导复合体。当在细胞中表达时，p19亚基先与p40亚基形成复合体，p40亚基为其与IL-12所共享。如上所述，从细胞中分泌出的p19p40复合体呈异二聚体蛋白形式，称为IL-23。参见例如Oppmann等人，出处同上。IL-23信号转导所需的细胞受体复合体由细胞因子IL-6/IL-12家族的tall信号转导受体亚基的两个成员组成，即IL-23-特异性IL-23R(参见例如Parham等人，出处同上)和IL-12Rb1，其与IL-12共享。

对“长链”细胞因子/受体识别结构基础的了解表明，尽管在形成细胞因子-受体复合体时，大面积的蛋白质表面被掩埋，但相互作用的亲和性是受常紧密成簇的少数氨基酸残基控制的，这些氨基酸残基在结合界面中心形成能量“热点”。控制蛋白质之间大界面的结合能的残基本身被称为“功能性表位”。因此，相互作用的亲和性(以及由此而来的生物特异性)定义为配体和受体的功能性表位的结构互补性。详细的诱变研究表明，构成细胞因子和受体的功能性表位的最重要残基是疏水性接触，包括非极性侧链(例如色氨酸)或者非极性侧链或多肽主链的脂族成分的接触。非极性“核心”由对结合能而言重要性较小的极性残基圈(halo)所包围。动力学研究表明，功能性表位的基本作用是通过降低复合体的解离速率而使蛋白质之间的相互作用稳定。已经提出，细胞因子与受体间的最初接触受到随机扩散或者导致许多不稳定接触的蛋白质表面的“滚动”控制。当受体和配体的功能性表位结合时，复合体则稳定。参见例如Bravo和Heath，出处同上。III.IL-23特异性抗体的产生

产生单克隆抗体的任何合适方法都可使用。例如，可用IL-23异二聚体或其片段的连接或未连接(例如天然发生的)形式，来免疫受体。任何合适的免疫方法都可使用。这些方法可包括佐剂、其它免疫刺激剂、重复加强免疫和使用一种或多种免疫途径。

IL-23的任何合适来源都可用作免疫原，用于产生本文所公开的组合物和方法中的对p19亚基具有特异性的非人类抗体。这样的形式包括但不限于完整蛋白(包括连接的和天然存在的异二聚体)肽和表位，其可以通过本领域已知的重组方法、合成方法、化学或酶促降解方法来产生。

任何形式的抗原都可用于产生足以产生生物活性抗体。因此，诱导用抗原可以是单一表位、多个表位或单独的完整蛋白质或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂联用。诱导用抗原可以是分离的全长蛋白质、细胞表面蛋白(例如用至少部分抗原转染的细胞来免疫)或可溶性蛋白(例如仅用蛋白质的胞外结构域部分来免疫)。抗原可在遗传修饰细胞中产生。编码抗原的DNA可以是基因组或非基因组DNA(例如cDNA)并编码至少部分胞外结构域。本文所用的术语“部分”是指适宜构成目标抗原的免疫原性表位的最小数量的氨基酸或核酸。适于转化目标细胞的任何遗传载体都可使用，包括但不限于腺病毒载体、质粒和非病毒载体，例如阳离子脂质。

任何合适方法都可用于诱导具有抑制IL-23的所需生物特性的抗体。最好是从不同哺乳动物宿主(例如小鼠、啮齿类、灵长类、人类等)制备单克隆抗体(mAb)。这类单克隆抗体制备技术的描述可参见例如Stites等(编著)BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(第4版)Lange Medical Publications，Los Altos，CA以及其中引用的参考文献；Harlow和Lane(1988)ANTIBODIES：A LABORATORY MANUALCSH Press；Goding(1986)MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE(第2版)Academic Press，New York，NY。因此，可通过本领域研究人员熟知的多种方法获取单克隆抗体。通常，来自用所需抗原免疫的动物的脾细胞通常通过与骨髓瘤细胞融合而成为无限增殖细胞。参见Kohler和Milstein(1976)Eur.J.Immunol.6：511-519。无限增殖的替代方法包括用Epstein Barr病毒、癌基因或逆转录病毒来转化或用本领域已知的其它方法。参见例如Doyle等(编著，1994和定期增刊)CELL AND TISSUE CULTURE：LABORATORY PROCEDURES，John Wiley and Sons，New York，NY。根据对抗原具有所需特异性和亲和性的抗体的产生情况，对来自单个无限增殖细胞的集落进行筛选，并且可通过包括向脊椎动物宿主腹膜腔注射在内的各种技术而提高这类细胞所产生的单克隆抗体的产量。或者，可按照例如以下文献所概述的一般性方案，通过筛选来自人B细胞的DNA文库，来分离编码单克隆抗体或其抗原结合片段的DNA序列：Huse等(1989)Science 246：1275-1281。

其它合适技术包括在噬菌体或类似载体中选择抗体文库。参见例如Huse等，出处同上；和Ward等(1989)Nature 341：544-546。可采用修饰或未修饰的本发明多肽和抗体，包括嵌合抗体或人源化抗体。通常，多肽和抗体可通过与提供可检测信号的物质共价或非共价连接而得以标记。各种各样的标记和缀合是已知的，在科技文献和专利文献中已有大量报道。合适的标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁性颗粒等。教导这些标记的使用的专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。另外，可产生重组免疫球蛋白，参见Cabilly美国专利号4,816,567；和Queen等(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：10029-10033；或在转基因小鼠中制备重组免疫球蛋白，参见Mendez等(1997)Nature Genetics 15：146-156。另见Abgenix and Medarex technologies。

可通过用多肽、片段、肽或表位与载体蛋白的缀合物来免疫动物，产生针对IL-23预定片段的抗体或结合组合物。单克隆抗体可从分泌所需抗体的细胞中制备。可根据与正常或缺陷IL-23的结合性对这些抗体进行筛选。通常通过ELISA测定，这些单克隆抗体通常以至少约1μM，更通常至少约300nM、30nM、10nM、3nM、1nM、300pM、100pM、30pM或更好的K_d结合。也可用以下实施例5和实施例6所述的生物学测定，鉴定合适的非人类抗体。

依据布达佩斯条约，将表达抗体13B8的杂交瘤于2006年8月17日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC-Manassas，Virginia，USA)，保藏号为PTA-7803。IV.IL-23特异性抗体的人源化

任何合适的非人类抗体均可用作超变区的来源。非人类抗体来源包括但不限于鼠、兔类(包括兔)、牛和灵长类。对于大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者超变区残基被来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类)(供体抗体)的具有所需特异性、亲和性和能力的超变区残基取代。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应非人类残基取代。此外，人源化抗体可包含受者抗体或供体抗体中不存在的残基。可进行这些修饰，以进一步改进抗体的所需生物活性的特性。有关细节可参见Jones等(1986)Nature 321：522-525；Reichmann等(1988)Nature 332：323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。

重组工程抗体的方法描述于例如Boss等(美国专利号4,816,397)、Cabilly等(美国专利号4,816,567)、Law等(欧洲专利申请公布号EP438310A1)和Winter(欧洲专利号EP239400B1)。

可通过将合适核苷酸改变引入人源化抗IL-23抗体DNA，或通过肽合成，来制备人源化抗IL-23抗体的氨基酸序列变异体。这类变异体包括例如在人源化抗IL-23抗体所示的氨基酸序列内缺失和/或插入和/或取代的残基。进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终构建体，前提是最终构建体具有所需特性。氨基酸改变也可改变人源化抗IL-23抗体的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数量或位置。

鉴定人源化抗IL-23p19抗体多肽的某些残基或区域(优选诱变位置)的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变(alanine scanningmutagenesis)”，可参见Cunningham和Wells(1989)Science 244：1081-1085。在此，鉴定靶残基中的一个或一组残基(例如带电荷的残基例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)取代，从而影响氨基酸与IL-23抗原的相互作用。表现出对取代具有功能敏感性的氨基酸残基再通过在取代位点处引入更多或其它变异体(或用于取代位点)，而得以改进。因此，尽管引入氨基酸序列改变的位点是预定的，但是突变本身的特性不需要预定。例如，为了分析给定位点的突变的特性，在靶密码子或区域进行Ala扫描或随机诱变，然后根据所需活性来筛选所表达人源化抗IL-23p19抗体变异体。

氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端融合，其长度范围为1个残基至含有上百个甚至更多残基的多肽，以及序列内插入一个或多个氨基酸残基。末端插入的实例包括具有N-端甲硫氨酰残基的人源化抗IL-23抗体或与表位标记融合的抗体。人源化抗IL-23抗体分子的其它插入变异体包括将酶或多肽与人源化抗IL-23抗体N-端或C-端融合，这可延长抗体的血清半衰期。

另一类型的变异体是氨基酸取代变异体。这些变异体在人源化抗IL-23p19抗体分子中有至少一个氨基酸残基被除去并在该位置内插入不同残基。取代诱变的最有兴趣的位点包括超变环，但也包括FR的改变。

抗体的氨基酸变异体的另一类型是改变抗体的原有糖基化模式。改变是指在抗体中发现缺失一个或多个碳水化合物部分，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。抗体糖基化通常可以是N-联或O-联。N-联是指碳水化合物部分连接在天冬酰胺残基侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，多肽中存在这些三肽序列中的一种，就可产生潜在糖基化位点。O-联糖基化是指糖类N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸连接，所述羟基氨基酸最常见是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

将糖基化位点添加到抗体上，这可通过改变氨基酸序列使其含有一个或多个上述三肽序列(用于N-联糖基化位点)，而方便地完成。也可通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基加入或取代到原抗体序列中而使其改变(用于O-联糖基化位点)。

氨基酸变异体的再一类型是取代残基，使最终人源化抗体具有更大的化学稳定性。例如，可改变天冬酰胺(N)残基，以降低在啮齿类CDR的任何NG序列内形成异天冬氨酸的潜力。在DG序列中也有类似问题。Reissner和Aswad(2003)Cell.Mol.Life Sci 60：1281。异天冬氨酸的形成可以削弱或完全阻止抗体与其靶抗原的结合。Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731于734。在一个实施方案中，将天冬酰胺变为谷氨酰胺(Q)。另外，可改变啮齿类CDR中的甲硫氨酸残基，以降低甲硫氨酸的硫氧化的可能性，而所述硫氧化可降低抗原结合亲和性并在最终抗体制备中造成分子异质性。同上。在一个实施方案中，将甲硫氨酸变为丙氨酸(A)。然后筛选具有这类取代的抗体，以确保取代不至于将与IL-23p19的结合亲和性降低至不可接受水平。

可通过本领域已知的各种方法制备人源化IL-23特异性抗体氨基酸序列变异体的编码核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源分离(就天然存在的氨基酸序列变异体而言)或通过以下方法制备：寡核苷酸-介导(或定点)诱变、PCR诱变和早期制备变异体或非变异体形式的人源化抗IL-23p19抗体的盒式诱变。

通常，人源化抗IL-23抗体的氨基酸序列变异体的氨基酸序列与重链或轻链的原始人源化抗体氨基酸序列的氨基酸序列同一性为至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％、98％或99％。有关该序列的同一性或同源性在本文中定义为，在序列比对并在必要时引入空位以达到最大％序列同一性后，候选序列中与人源化抗IL-23残基相同的氨基酸残基的百分率，而不考虑任何保守取代作为序列同一性组成部分。抗体序列的N-端、C-端或内部延伸、缺失或插入都不应视为对序列同一性或同源性有影响。

人源化抗体可选自免疫球蛋白的任何类型，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE。优选抗体为IgG抗体。任何IgG同种型都可使用，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。IgG同种型变异体也考虑在内。人源化抗体可包含来自不止一种类型或一种同种型的序列。可通过在下述生物测定中筛选抗体，而容易地对必需恒定区序列进行优化，以产生所需生物活性。

同样，任一类型的轻链都可用于本文的组合物和方法。具体地讲，κ、λ或其变异体可用于本发明的组合物和方法。

来自非人类抗体的CDR序列的任何合适部分都可使用。可通过取代、插入或缺失至少一个残基而使CDR序列发生突变，使CDR序列与所用的人类和非人类抗体序列不同。考虑到的是，这样的突变将会是最小的。通常，至少75％的人源化抗体残基将会对应于非人类CDR残基，更通常是90％，最优选大于95％。

来自人抗体的FR序列的任何合适部分都可使用。可通过取代、插入或缺失至少一个残基而使FR序列发生突变，使FR序列与所用的人类和非人类抗体序列不同。考虑到的是，这样的突变将会是最小的。通常，至少75％人源化抗体残基将会对应于人FR残基，更通常是90％，最优选大于95％、98％或99％。

按照Kabat的标准序列定义来确定CDR和FR残基。Kabat等(1987)Sequences of Proteins of Immunological Interest，NationalInstitutes of Health，Bethesda Md。SEQ ID NO：1-5表示不同小鼠抗人IL-23p19抗体的重链可变区序列，而SEQ ID NO：9-13表示轻链可变区序列。图1和图2提供本发明各种抗体的重链可变区和轻链可变区的序列调整。图中标明CDR，单个CDR序列各自给出唯一的序列编号(Sequence Identifier)，如下表7所示。[0100]提供了抗体13B8的人源化形式。人源化轻链13B8序列(带有κ恒定区)如SEQ ID NO：14所示，轻链可变区包含这些序列的残基1-108。人源化重链13B8序列(带有γ1恒定区)的三种形式如SEQ IDNO：6-8所示，重链可变区包含这些序列的残基1-116。13B8重链变异体如下表2所示，与亲代序列的不同之处用黑体标出。将Met(M)修饰为Lys(K)，以避免残基氧化和抗体失活的可能性。用AQKLQ取代NEMFE是用来自人构架(其选择用于使抗体人源化)的人种系序列取代鼠CDR序列。表2抗体13B8CDRH2变异体

抗体	CDRH2序列	SEQ ID NO：
			m13B8，h13B8-a	QIFPASGSADYNEMFEG	24
h13B8-b	QIFPASGSADYNEKFEG	25
			h13B8-c	QIFPASGSADYAQKLQG	26

通过简单地将亲代啮齿类抗体CDR取代到SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：6所示的人源化13B8的轻链序列和重链序列中，就可产生本文所公开的其他抗体的人源化形式。该方法很可能成功用于抗体链，所述抗体链的CDR与抗体13B8的CDR具有高度同源性，例如重链上的克隆11C1和轻链上的克隆11C1和21D1。或者，可用本文所概述的方法，例如在实施例2中概述的方法，单独使鼠抗体人源化。

在一个实施方案中，CDR包括本文所公开的任何单个序列CDR的变异体(SEQ ID NO：15-46)，其中用表1数据进行测定，相对于所公开序列而言，变异体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个保守氨基酸取代。

还将嵌合抗体考虑在内。如上所述，典型的嵌合抗体包括这样的重链和/或轻链部分：其与来源于特定物种的抗体或者属于特定抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，；而链的其余部分与来自另一物种的抗体或者属于另一抗体种类或亚类的抗体及这些抗体的片段的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需生物活性。参见美国专利号4,816,567；和Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855。

双特异性抗体也可用于本发明的方法和组合物。本文所用的术语“双特异性抗体”是指与至少2个不同抗原性表位都具有结合特异性的抗体，通常是单克隆抗体，例如IL-23p19和IL-17。在一个实施方案中，所述表位来自同一抗原。在另一个实施方案中，所述表位来自两个不同抗原。双特异性抗体的制备方法是本领域已知的。例如，用2个免疫球蛋白重链/轻链对共表达，而重组产生双特异性抗体。参见例如Milstein等(1983)Nature 305：537-39。或者，用化学连接来制备双特异性抗体。参见例如Brennan等(1985)Science 229：81。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。参见例如Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48，Gruber等(1994)J.Immunol.152：5368。

在再一些实施方案中，不同恒定区可附加在本文所提供的人源化V_L区和V_H区上。例如，如果需要本发明抗体(或片段)的特定用途用于改变效应子功能的话，可使用重链恒定区而不是IgG1。尽管IgG1抗体具有长半衰期和效应子功能，例如补体激活和抗体依赖性细胞毒性，但是这样的活性对抗体的所有用途而言可能是不需要的。在这种情况下，例如可使用IgG4恒定区。V.人源化抗IL-23的生物活性

对于人源化抗IL-23抗体中具有经本文鉴定所需特性的抗体，可对其进行体外抑制性生物活性或合适的结合亲和性的筛选。为了筛选出能与目标抗体所结合的人IL-23上的表位(即p19亚基)相结合的抗体(例如阻断细胞因子与其受体结合的那些)，可以进行常规交叉阻断测定(routine cross-blocking assay)，例如参见ANTIBODIES，ALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlowand David Lane(1988)。在这类测定中，与同一表位结合的抗体可能发生交叉阻断，但并非所有交叉阻断抗体都必定刚好结合在同一表位上，因为交叉阻断可起因于抗体结合的空间位阻，即通过抗体在重叠表位上或者甚至在邻近的非重叠表位上结合。

或者，可以进行表位作图，例如参见Champe等(1995)J.Biol.Chem.270：1388-1394，以确定抗体是否与目标表位结合。“丙氨酸扫描诱变”(参见Cunningham和Wells(1989)Science 244：1081-1085)或在人IL-23中的氨基酸残基的某些其它形式的点诱变也可用于确定本发明的抗IL-23抗体的功能性表位。然而，诱变研究也可揭示对IL-23总体三维结构至关重要、但并非直接参与抗体-抗原接触的氨基酸残基，因此还必须用其它方法来证实用此方法确定的功能性表位。

也可通过评价抗体与包含人IL-23p19(SEQ ID NO：47)片段的肽的结合，来确定特异性抗体所结合的表位。IL-12和IL-23的p40亚基的序列可参见GenBank检索号P29460。可合成一系列包含IL-23p19序列的重叠肽并根据其结合情况进行筛选，例如在直接ELISA(一种竞争性ELISA(其中评价肽阻断抗体与连接在微量滴定板孔上的IL-23p19结合的能力)中或在芯片上进行。这样的肽筛选方法也许不能检测某些不连续的功能性表位，即包含在IL-23p19多肽链的基本序列中为不连续的氨基酸残基的功能性表位。

也可通过结构性方法例如X射线晶体结构测定(例如WO2005/044853)、分子建模和核磁共振(NMR)光谱(包括当其游离或与目标抗体结合在复合体中时，对IL-23中不稳定酰胺氢的H-D交换率的NMR测定)，来确定本发明抗体所结合的表位(Zinn-Justin等(1992)Biochemistry 31：11335-11347；Zinn-Justin等(1993)Biochemistry32：6884-6891)。

对于X射线晶体学而言，可用本领域任何已知方法(例如Giege等(1994)Acta Crystallogr.D50：339-350；McPherson(1990)Eur.J.Biochem.189：1-23))进行结晶，所述方法包括microbatch(例如Chayen(1997)Structure 5：1269-1274)、悬滴蒸汽扩散(例如McPherson(1976)J.Biol.Chem.251：6300-6303)、加晶种和透析。最好使用浓度为至少约1mg/mL、优选约10mg/mL至约20mg/mL的蛋白质制备物。最好在含聚乙二醇1000-20,000(PEG；平均分子量范围约1000至约20,000Da)、优选约5000至约7000Da、更优选约6000Da的沉淀剂溶液中，浓度范围为约10％至约30％(w/v)，进行结晶。最好还包含蛋白质稳定剂，例如浓度范围为约0.5％至约20％的甘油。合适的盐，例如氯化钠、氯化锂或柠檬酸钠最好也包含在沉淀剂溶液中，优选浓度范围为约1mM至约1000mM。沉淀剂优选缓冲至pH约4.0至约10.0，通常约7.0至8.5，例如pH 8.0。用于沉淀剂溶液的具体缓冲剂可以不同，是本领域众所周知的。Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，第3版(1994)Springer-Verlag，New York。有用缓冲剂的实例包括但不限于HEPES、Tris、MES和乙酸盐。晶体可在宽范围温度下生长，包括2℃、4℃、8℃和26℃。

抗体：抗原晶体可采用众所周知的X射线衍射技术来研究并使用计算机软件来改进，所述软件例如X-PLOR(Yale University，1992，distributed by Molecular Simulations，Inc.；参见例如Blundell &Johnson(1985)Meth.Enzymol.114 & 115，H.W.Wyckoff等(编著)，Academic Press；美国专利申请公布号2004/0014194)和BUSTER(Bricogne(1993)Acta Cryst.D49：37-60；Bricogne(1997)Meth.Enzymol.276A：361-423，Carter & Sweet编著.；Roversi等(2000)Acta Cryst.D56：1313-1323)。

通过根据与表位的结合情况筛选出针对IL-23而产生的抗体，或者通过用包含具有表位序列的人IL-23片段的肽来免疫动物，可以得到与本发明抗体所结合的表位的另外的抗体。与同一功能性表位结合的抗体有望表现出类似生物活性，例如阻断受体结合，而且这样的活性可通过抗体的功能性测定得以证实。

可用标准分析来测定抗体亲和力(例如对于人IL-23的亲和力)。优选的人源化抗体就是与人IL-23p19结合的K_d值不超过约1x10^-7M；优选不超过约1x10^-8M；更优选不超过约1x10^-9M；和最优选不超过约1x10^-10M或甚至1x10^-11M的那些抗体。

本发明的组合物和方法所用的抗体及其片段是具有生物活性的抗体和片段。本文所用的术语“生物活性”是指能结合所需抗原性表位并直接或间接发挥生物学效应的抗体或抗体片段。通常，这些效应是因为IL-23不能与其受体结合所致。本文所用的术语“特异性”是指抗体与目标抗原表位的选择性结合。可测定抗体的结合特异性，即在给定的一组条件下，通过比较与IL-23的结合和与不相关抗原或抗原混合物的结合情况来测定。如果抗体与IL-23结合比与不相关抗原或抗原混合物结合大至少10倍、优选50倍，则认为就是特异性的。与IL-12结合的抗体不是IL-23特异性抗体。与IL-23p19“特异性结合”的抗体并不与不含IL-23p19来源序列的蛋白质结合，即本文所用的“特异性”涉及IL-23p19特异性，并且不与目标的蛋白质中存在的任何其它序列结合。例如，本文所用的与IL-23p19“特异性结合”的抗体通常可结合

-hIL-23p19(一种含IL-23p19和

肽标记的融合蛋白)，但不与单独的肽标记或融合了非IL-23p19的蛋白质的肽标记结合。

本发明的IL-23特异性结合化合物，例如抑制性IL-23p19特异性抗体，可以任何方式抑制其生物活性，包括但不限于由腹膜巨噬细胞产生IL-1β和TNF和由T_H17T细胞产生IL-17。参见Langrish等(2004)Immunol.Rev.202：96-105。抗IL-23p19抗体也能抑制以下的基因表达：IL-17A、IL-17F、CCL7、CCL17、CCL20、CCL22、CCR1和GM-CSF。参见Langrish等(2005)J.Exp.Med.201：233-240。本发明的IL-23特异性结合化合物，例如抗IL-23p19抗体，也可阻断IL-23增强T_H17细胞增殖和存活的能力。Cua和Kastelein(2006)Nat.Immunol.7：557-559。抗IL-23p19的工程抗体的抑制活性将可用于治疗炎性疾病、自身免疫病和增生性疾病。这类疾病的实例参见PCT专利申请公布说明书WO 04/081190；WO 04/071517；WO 00/53631；和WO 01/18051。VI.药物组合物

为了制备含IL-23p 19抗体的药物组合物或无菌组合物，将细胞因子类似物或突变蛋白、其抗体或其核酸与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences andU.S.Pharmacopeia：National Formulary，Mack Publishing Company，Easton，PA(1984)。

可通过与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合成例如冻干粉剂、浆剂(slurry)、水性溶液剂或混悬剂的形式，制备治疗药和诊断试剂的制剂。参见例如Hardman等(2001)Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill，New York，NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams和Wilkins，New York，NY；Avis等(编著)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY；Lieberman等(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，Marcel Dekker，NY；Lieberman等(编著)(1990)Pharmaceutical DosageForms：Disperse Systems，Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY。

抗体组合物，当单独给予或与免疫抑制剂联用时，其毒性和疗效可通过标准药学方法，在细胞培养物或实验动物中进行测定，例如测定LD₅₀(50％群体致死剂量)和ED₅₀(50％群体治疗有效剂量)。毒性和疗效间的剂量比率就是治疗指数，可表示为LD₅₀与ED₅₀的比率。优选具有高治疗指数的抗体。得自细胞培养测定和动物研究的数据可用于配制人用剂量范围。这类化合物的剂量优选在循环浓度(circulating concentration)范围内，其包含没有或几乎没有毒性的ED₅₀。在该范围内，剂量因所用剂型和所用给药途径不同而异。

给药模式并不特别重要。合适的给药途径可包括例如口服、直肠、经粘膜、肠道给药；胃肠外给药，包括肌内、皮内、皮下、髓内注射、以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。用于药物组合物或实践本发明方法的抗体给药可以各种常规方式进行，例如口服摄入、吸入、局部用药或皮肤、皮下、腹膜内、胃肠外、动脉内或静脉内注射。

另一方面，可用局部、而非全身方式给予抗体，例如通过将抗体直接注射到患关节炎的关节或以免疫病理为特征的病原体诱导的病灶，通常呈长效制剂或持续释放制剂的形式。此外，可用靶向的药物递送系统给予抗体，例如在包被组织特异性抗体(靶向例如患关节炎的关节或以免疫病理为特征的病原体诱导的病灶)的脂质体中。脂质体可靶向患病组织并由患病组织选择性摄入。

对治疗药给药方案的选择取决于各种因素，包括实体的血清或组织更新率、症状水平、实体的免疫原性和生物基质中靶细胞的可及性。优选给药方案使给予患者的治疗药量达到最大化，同时又具有可接受的副作用水平。因此，所给予生物制品的量部分取决于特定实体和所治疗疾病的严重程度。可以使用选择合适剂量的抗体、细胞因子和小分子的指南。参见例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy，Bios Scientific Pub.Ltd，Oxfordshire，UK；Kresina(编著)(1991)Monoclonal Antibodies，Cytokines and Arthritis，Marcel Dekker，NewYork，NY；Bach(编著)(1993)Monoclonal Antibodies and PeptideTherapy in Autoimmune Diseases，Marcel Dekker，New York，NY；Baert等(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602。

由临床医生使用例如本领域已知或怀疑会影响治疗或预测会影响治疗的参数或因素，对合适剂量作出判定。通常，剂量开始的用量略小于最佳剂量，然后少量递增，直到达到相对于任何副作用而言的所需或最佳效果。重要的诊断性测定包括对症状例如炎症的测定或对所产生的炎性细胞因子水平的测定。优选所用生物制品与治疗所靶向的动物基本上来自是同一物种(例如人源化抗体用于治疗人类治疗对象)，从而使针对该试剂的任何免疫应答达到最小化。

可通过连续输注或间隔给药来给予抗体、抗体片段和细胞因子，所述间隔例如1天、每周1-7次、1周、2周、每月、每两个月等。可通过静脉内、皮下、局部、口服、鼻腔、直肠、肌内、脑内、脊柱内，或通过吸入，给予剂量。一个优选的剂量方案包括避免严重不良副作用的最大剂量或给药频率。总周剂量通常为至少0.05μg/kg、0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.2mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg体重或更高。参见例如Yang等(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等(2002)New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu等(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji等(20003)Cancer Immunol.Immunother.52：133-144。小分子治疗药(例如肽模拟物、天然产物或有机化学物)的所需剂量与抗体或多肽的大致相同，基于摩尔/kg计算。

本文所用的“抑制”或“处理”或“治疗”包括延迟自身免疫病或病原体诱导的免疫病理相关症状的发展和/或降低将要发展或预期发展的所述症状的严重程度。这些术语还包括改善现有未受控或不合乎需要的自身免疫相关或病原体诱导的免疫病理症状，预防额外症状，以及改善或预防这类症状的潜在原因。因此，这些术语表示已将有益结果赋予罹患自身免疫或病原体诱导免疫病理疾病或症状、或者具有发展所述疾病或症状可能性的脊椎动物治疗对象可以得到有益结果。

本文所用的术语“治疗有效量”或“有效量”是指当单独或与另外的治疗药一起给予细胞、组织或治疗对象时，能有效预防或改善自身免疫病或病原体诱导的免疫病理相关疾病或病症或所述疾病进程的IL-23p19特异性结合化合物例如抗体的量。治疗有效量还指足以导致症状改善的化合物的量，所述改善例如治疗、治愈、预防或缓和相关医学病症，或者提高所述病症的治疗、治愈、预防或缓和的比率。当将活性成分单独给予个体时，治疗有效量是指单一成分。当联合给药时，无论是联用、序贯给予还是同时给予，治疗有效量均指达到疗效的活性成分的联合用量。治疗药的有效量通常可使症状减少至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％，最优选至少50％。

与第二治疗药(例如细胞因子、抗体、甾体、化疗药、抗生素或辐射)联用或治疗的方法是本领域众所周知的，参见例如Hardman等(编著)(2001)Goodman and Gilman′s The PharmacologicalBasis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill，New York，NY；Poole和Peterson(编著)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：APractical Approach，Lippincott，Williams & Wilkins，Phila.，PA；Chabner和Longo(编著)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy，Lippincott，Williams & Wilkins，Phila.，PA。本发明的药物组合物也可含其它免疫抑制药或免疫调节剂。任何合适的免疫抑制药都可使用，包括但不限于抗炎药、皮质类固醇、环孢素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)(即FK-506)、西罗莫司(sirolimus)、干扰素、可溶性细胞因子受体(例如sTNRF和sIL-1R)、中和细胞因子活性的试剂(例如英利昔单抗(inflixmab)、依那西普(etanercept))、麦考酚酸酯(mycophenolatemofetil)、15-脱氧精胍菌素、沙利度胺(thalidomide)、格拉默(glatiramer)、硫唑嘌呤(azathioprine)、来氟米特(leflunomide)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氨蝶呤(methotrexate)等。药物组合物也可与其它治疗形式(例如光疗和辐射)一起使用。

通常，兽医学对象、实验或研究对象包括猴、狗、猫、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、马和人。VII.抗体的产生

在一个实施方案中，为重组产生本发明抗体，将两条链的编码核酸分离出来并插入到一个或多个可复制载体中，进行进一步克隆(DNA扩增)或表达。使用常规方法(例如通过使用能特异性结合抗体重链和轻链的编码基因的寡核苷酸)，容易分离出单克隆抗体的编码DNA并进行测序。许多载体都可使用。载体的构成通常包括但不限于以下中的一个或多个：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。在一个实施方案中，本发明人源化抗IL-23p19抗体的轻链和重链都从同一载体(例如质粒或腺病毒载体)表达。

可通过本领域已知的任何方法产生本发明抗体。在一个实施方案中，抗体在培养的哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达，所述细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)293细胞、小鼠骨髓瘤NSO细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、草地夜蛾卵巢(Spodoptera frugiperdaovarian，Sf9)细胞。在一个实施方案中，将CHO细胞分泌的抗体回收并通过以下标准色谱方法纯化：例如蛋白A、阳离子交换、阴离子交换、疏水性相互作用和羟磷灰石色谱。将所得抗体浓缩并贮藏于20mM乙酸钠，pH 5.5中。

在另一个实施方案中，按照WO2005/040395所述方法，在酵母中产生本发明的抗体。简而言之，将分别编码目标抗体的轻链或重链的载体引入不同酵母单倍体细胞(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)的不同接合型)中，这样的酵母单倍体细胞任选是互补的营养缺陷型。然后使转化的单倍体酵母细胞接合或融合，得到能同时产生重链和轻链两者的二倍体酵母细胞。二倍体菌株就能分泌出完整装配并具有生物活性的抗体。可通过例如使用具有不同拷贝数的载体，使用不同强度的转录启动子，或来自诱导型启动子的诱导型表达，来驱动编码一条或两条链的基因的转录，从而优化两条链的相对表达水平。

在一个实施方案中，将多种不同的抗IL-23p19抗体(“原始”抗体)各自的重链和轻链引入酵母单倍体细胞中，产生表达多种轻链的一种接合型的单倍体酵母菌株文库，和表达多种重链的另一种不同接合型的单倍体酵母菌株文库。这些单倍体菌株文库可以接合(或融合成原生质球)，产生表达包含轻链和重链各种可能排列的抗体的组合文库的一系列二倍体酵母细胞。然后筛选抗体的组合文库，测定是否有任何抗体具有比原始抗体更加优良的性质(例如对IL-23具有更高亲和性)。参见例如WO2005/040395。

在另一个实施方案中，本发明的抗体是人域抗体，其中抗体可变区的部分于分子量约为13kDa的多肽连接。参见例如美国专利公布号2004/0110941。这样的单域，低分子量试剂对于合成的便利性、稳定性和给药途径方面都具有众多优势。VIII.用途

本发明提供抗IL-23的工程抗体及其片段在例如以下炎性疾病的治疗和诊断中的使用方法：中枢神经系统疾病、周围神经系统疾病和胃肠道疾病、以及自身免疫病和增生性疾病。

提供治疗方法，用于治疗例如多发性硬化(MS)，包括复发缓解型MS和原发进展型MS、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化(a.k.a.ALS；Lou Gehrig氏病)、缺血性脑损伤、朊病毒病和HIV相关痴呆。也提供治疗方法，用于治疗神经性疼痛、外伤后神经病、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)、周围多神经病和神经再生。

提供治疗或改善多发性硬化或其它炎性疾病或神经系统疾病的一种或多种以下特征、症状、方面、表现或病征的方法：脑损伤、髓磷脂损伤、脱髓鞘、脱髓鞘斑(demyelinated plaque)、视觉障碍、丧失平衡或协调性、痉挛状态、感觉障碍、失禁、疼痛、虚弱、疲劳、麻痹、认知减退、智力迟钝、复视、视神经炎、感觉异常、步态共济失调、疲劳、马托夫综合征(Uhtoffs symptom)、神经痛、失语症、失用症、抽搐、视野丧失、痴呆、锥体束外现象、抑郁症、感觉良好或其它情感症状、慢性进展型脊髓病，以及由磁共振造影(MRI)检测到的症状，包括钆增强的损伤(gadolinium-enhancing lesion)、诱发电位记录或脑脊液检查。参见例如Kenealy等(2003)J.Neuroimmunol.143：7-12；Noseworthy等(2000)New Engl.J.Med.343：938-952；Miller等(2003)New Engl.J.Med.348：15-23；Chang等(2002)New Engl.J.Med.346：165-173；Bruck和Stadelmann(2003)Neurol.Sd.24增刊.5：S265-S267。

此外，本发明提供治疗和诊断炎性肠病的方法，所述肠病例如克罗恩病、溃疡性结肠炎、乳糜泻和过敏性肠综合征。提供治疗或改善炎性肠病的一种或多种以下症状、方面、表现或病征的方法：食物吸收不良、改变的肠动力、感染、发热、腹痛、腹泻、直肠出血、体重减轻、营养不良病征、肛周疾病、腹部包块和生长障碍、以及肠并发症(例如缩窄、瘘、中毒性巨结肠症、穿孔和癌症)，并且包括内窥镜发现，例如脆性、阿弗他溃疡和线状溃疡、鹅卵石样表现、假息肉和直肠受累，以及抗酵母抗体。参见例如Podolsky，出处同上；Hanauer，出处同上；Horwitz和Fisher，出处同上。

还包括炎性疾病、自身免疫病和增生性疾病的治疗，所述炎性疾病例如银屑病、特应性皮炎、关节炎，包括类风湿性关节炎、骨关节炎和银屑病性关节炎；所述自身免疫病例如系统性红斑狼疮和I型糖尿病；所述增生性疾病例如癌症。参见例如PCT专利申请公布说明书WO 04/081190；WO 04/071517；WO 00/53631；和WO01/18051。

本发明的IL-23p19结合化合物也可与其它细胞因子(例如抗体)的一种或多种拮抗剂联用，所述细胞因子包括但不限于IL-17A、IL-17F、IL-1β、IL-6和TGF-β。参见例如Veldhoen(2006)Immunity 24：179-189；Dong(2006)Nat.Rev.Immunol.6(4)：329-333。在不同的实施方案中，本发明的IL-23p19结合化合物在给予另一种或另一些拮抗剂(例如抗IL-17A抗体)之前、同时或之后给予。在一个实施方案中，IL-17A结合化合物单独或与本发明IL-23拮抗剂抗体联合用于治疗不良免疫应答(例如MS、克罗恩病)的急性早期。在后一种情况下，可逐渐减少IL-17A结合化合物并持续单用IL-23拮抗剂进行治疗，以保持对不良应答的抑制。或者，可在给予本发明IL-23p19结合化合物的同时、之前或之后给予IL-1β、IL-6和/或TGF-β的拮抗剂。参见Cua和Kastelein(2006)Nat.Immunol.7：557-559；Tato和O′Shea(2006)Nature441：166-168；Iwakura和Ishigame(2006)J.Clin.Invest.116：1218-1222。

参考以下实施例，能够很好地理解本发明的宽范围；其不得视为将本发明限制在具体实施方案内。仅以实例的方式给出本文所述的具体实施方案，本发明受到由所附权利要求书的术语的限制，并限制在这些权利要求书所给出的等同实施方案的全部范围内。实施例实施例1.通用方法

描述了分子生物学标准方法。Maniatis等(1982)MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Wu(1993)Recombinant DNA，第217卷，Academic Press，San Diego，CA。标准方法也可参见Ausbel等(2001)Current Protocols in MolecularBiology，第1-4卷，John Wiley and Sons，Inc.New York，NY，该书介绍了在细菌细胞中克隆和DNA诱变(第1卷)，在哺乳动物细胞和酵母中克隆(第2卷)，糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。

描述了蛋白质纯化方法，包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶。Coligan等(2000)Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化。参见例如Coligan等(2000)Current Protocols in Protein Science，第2卷，John Wiley andSons，Inc.，New York；Ausubel等(2001)Current Protocols in MolecularBiology，第3卷，John Wiley and Sons，Inc.，NY，NY，第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich，Co.(2001)Products for Life Science Research，St.Louis，MO；第45-89页；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory，Piscataway，N.J.，第384-391页。描述了多克隆抗体和单克隆抗体的产生、纯化和断裂(fragmentation)。Coligan等(2001)CurrentProtcols in Immunology，第1卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York；Harlow和Lane(1999)Using Antibodies，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY；Harlow和Lane，出处同上。可使用表征配体/受体相互作用的标准技术。参见例如Coligan等(2001)CurrentProtcols in Immunology，第4卷，John Wiley，Inc.，New York。

可使用流式细胞术，包括荧光激活细胞分选检测系统

的方法。参见例如Owens等(1994)Flow Cytometry Principlesfor Clinical Laboratory Practice，John Wiley and Sons，Hoboken，NJ；Givan(2001)Flow Cytometry，第2版.；Wiley-Liss，Hoboken，NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry，John Wiley and Sons，Hoboken，NJ。可使用适于修饰核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体的荧光试剂，作为例如诊断试剂。Molecular Probes(2003)Catalogue，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue，St.Louis，MO。

描述了免疫系统组织学的标准方法。参见例如Muller-Harmelink(编著)(1986)Human Thymus：Histopathology andPathology，Springer Verlag，New York，NY；Hiatt等(2000)Color Atlas ofHistology，Lippincott，Williams，and Wilkins，Phila，PA；Louis等(2002)Basic Histology.Text and Atlas，McGraw-Hill，New York，NY。

可使用测定例如抗原性片段、前导序列、蛋白质折叠、功能性结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库。参见例如GenBank，Vector

Suite(Informax，Inc，Bethesda，MD)；GCGWisconsin Package(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)；(TimeLogic Corp.，Crystal Bay，Nevada)；Menne等(2000)Bioinformatics16：741-742；Menne等(2000)Bioinformatics Applications Note16：741-742；Wren等(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68：177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133：17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14：4683-4690。实施例2抗人IL-23p19抗体的产生和人源化

通过用嵌合IL-23(人p19：小鼠p40)免疫IL-23p19敲除小鼠，产生抗人IL-23p19抗体。通过标准方法制备单克隆抗体。

基本上按照PCT专利申请公布说明书WO 2005/047324和WO 2005/047326所述，进行鼠抗体13B8可变区(小鼠IgG1/κ)的人源化。

简而言之，将抗体13B8的非人类VH区的氨基酸序列与一组5种人VH种系氨基酸序列进行比较；其中一种代表来自亚组IGHV1和IGHV4，三种代表来自亚组IGHV3。VH亚组在以下文献中列举：M.-P.Lefranc(2001)″Nomenclature of the HumanImmunoglobulin Heavy (IGH)Genes″，Experimental and ClinicalImmunogenetics 18：100-116。在亚组VH1中，抗体13B8对于人重链种系DP-14得分最高。

抗体13B8的VL序列是VL的κ亚类。将非人类VL区的氨基酸序列与一组4种人VLκ种系氨基酸序列进行比较。这4种一组包括一种代表来自以下文献中列举的4种已建立的人VL亚组中的每一种：V.Barbie & M.-P.Lefranc(1998)″The Human ImmunoglobulinKappa Variable(IGKV)Genes and Joining(IGKJ)Segments″，Experimental and Clinical Immunogenetics 15：171-183和M.-P.Lefranc(2001)″Nomenclature of the Human Immunoglobulin Kappa(IGK)Genes″，Experimental and Clinical Immunogenetics 18：161-174。这4亚组也对应于以下文献中列举的4亚组：Kabat等(1991-第5版.)″Sequences of Proteins of Immunological Interest″，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH Pub.91-3242，第103-130页。在亚组VLkI中，抗体13B8对于人轻链种系Z-012得分最高。

如上文所述，在CDRH2中进行了另外的氨基酸取代并公开于SEQ ID NO：24-26中。将人源化13B8重链可变区和轻链可变区分别克隆到编码人γ1(IgG1)重链恒定区和κ轻链恒定区的载体中。所得人源化13B8抗体(IgG1/κ)与人IL-23和猕猴IL-23结合，但不与人IL-12、人p40或小鼠IL-23结合。

一旦确定重链可变区和轻链可变区的目标氨基酸序列，就可产生编码全长人源化抗体的质粒。可用Kunkel诱变(Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 82：488-492)来改变质粒序列，从而使DNA序列变为目标人源化抗体序列。同样，可进行密码子优化，以提供潜在优化表达。

可构建本文所公开的其它抗体的人源化形式，即通过用所公开的人构架取代人源化13B8抗体，或者用本实施例所公开的方法，通过重复选择最佳人构架的步骤。对于具有类似于13B8的CDR序列的抗体而言，将本文所公开的人构架取代为人源化抗体13B8的组成部分是最适合的。实施例3.用KinExA技术测定人源化抗人IL-23的平衡离解常数(K_d)

用KinExA 3000仪器(Sapidyne Instruments Inc.，BoiseIdaho，USA)测定抗人IL-23抗体的平衡离解常数(K_d)。KinExA采用动力学排阻测定(Kinetic Exclusion Assay)方法原理，其基于对抗体、抗原和抗体-抗原复合体的混合物中的未复合抗体浓度的测定。通过将混合物在非常短时间内暴露给固相固定化抗原，来测定游离抗体浓度。在实践中，这通过使溶液相抗原-抗体混合物流过流动室(flow cell)中截流的包被抗原的颗粒来完成。采用用户软件分析由仪器产生的数据。用数学理论，根据以下假设来求出平衡常数：

1.结合遵循可逆结合平衡方程：K_结合[Ab][Ag]＝K_离解[AbAg]2.抗体和抗原按1∶1结合，总抗体等于抗原-抗体复合体加上游离抗体。3.仪器信号与游离抗体浓度线性相关。

按照Sapidyne″Protocol for coating PMMA particles withbiotinylated ligands having short or nonexistent linker arms″，用生物素化IL-23包被98微米PMMA颗粒(Sapidyne，目录号440198)。在该实验中，生物素化IL-23包含小鼠IL-12p40和人IL-23p19的复合体。按照制造商的建议(Pierce bulletin 0874)，用EZ-联TFP PEO-生物素(Pierce，目录号21219)来制备生物素化IL-23。按照KinExA 3000手册进行所有实验步骤。

在竞争性结合测定中评价抗IL-23p19抗体的结合情况，其中在一系列浓度下，将抗体与含有两条二硫键连接链(即人p19(SEQID NO：47)和人p40(GenBank检索号P29460))的非连接的(天然)人IL-23一起预孵育。然后让所得样品(包含未结合抗体和IL-23-结合抗体的混合物)流过上一段所描述的rhIL-23(″elastikine″)PMMA颗粒。再用荧光标记的第二抗体来测定PMMA颗粒所捕获的抗体量。

表3显示KinExA分析结果，包括对每种抗体的重复测定。表3通过KinExA测定K_d值抗体 K _d (pM)m13B8 15，52hum13B8-a 64±40，110，365，447hum13B8-b 47，470，520hum13B8-c 47，52，470实施例4.用BIAcore技术测定人源化抗人IL-23p19抗体的平衡离解常数(K_d)

基本上按照共同转让的美国专利申请公布号2007/0048315的实施例4所述进行BIAcore测定。简而言之，用标准胺偶联方法，将配体(抗IL-23mAb)固定在BIAcore CM5传感器芯片上。将IL-23在PBS中稀释，得到不同浓度。用BIA评价软件3.1来确定不同相互作用的动力学常数。用所求得的离解常数和缔合速率常数来确定K_d。

表4提供用BIAcore测定的K_d值，包括重复测定。表4.用BIAcore测定K_d值抗体 K _d (pM)m13B8 173，228hum13B8-a 72-104，68-100，81-129hum13B8-b 77-129，69-116hum13B8-c 92-153实施例5.评价抗IL-23中和抗体的增殖生物测定

通过使用表达重组IL-23受体的细胞的短期增殖生物测定，评价单克隆抗体对IL-23的生物中和能力。IL-23R转染子细胞系(Ba/F3-2.21o-hIL-23R)同时表达hIL-23R和hIL-12Rβ1，并响应人IL-23和猕猴IL-23。转染子Ba/F3-2.21o细胞在响应人IL-23时增殖，这样的响应可被抗IL-23中和抗体抑制。针对剂量-反应曲线的线性区内、靠近平台区和超过EC50而选择的IL-23浓度，来滴定抗体。通过用Alamar Blue(一种根据代谢活性测定的生长指示性染料)的比色测定，来测定增殖或其缺失。根据抗体IC50值或导致IL-23增殖半最大抑制的抗体浓度，来评价抗体对IL-23的中和能力。

将Ba/F3转染子维持在RPMI-1640培养基、10％胎牛血清、50μM 2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、50μg/mL青霉素-链霉素和10ng/mL小鼠IL-3中。在RPMI-1640培养基、10％胎牛血清、50μM 2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺和50μg/mL青霉素-链霉素中，进行Ba/F3增殖生物测定。方法

在96孔平底板(Falcon 3072或类似板)中，每孔150μL，进行测定。抗IL-23抗体与IL-23一起预孵育30-60分钟，再加入细胞并孵育40-48小时。加入Alamar Blue(Biosource目录号DAL1100)并让其显色5-12小时。然后在570nm和600nm处读取吸光度(VERSAmax Microplate Reader，Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)，得到OD_570-600。

使用健康生长状态的细胞，通常密度为3-8x10⁵/ml。对细胞进行计数，沉淀，用生物测定培养基洗涤2次并以合适密度悬浮，用于接种。用IL-23的系列1∶3稀释度(25∶50μL/生物测定培养基)进行IL-23剂量反应。选择3ng/ml(50pM)的IL-23浓度，用于抗体测定。也用系列1∶3稀释度(25∶50μL/生物测定培养基)，进行中和抗体剂量反应。

用GraphPad

3.0软件(Graphpad Software Inc.，SanDiego，California，USA)进行IC50值的测定，其中吸光度对细胞因子或抗体浓度作图，用S形剂量-反应的非线性回归(曲线拟合)确定IC50值。

表5显示抗IL-23p19抗体阻断Ba/F3细胞增殖的IC50值。包括对一些抗体的多次测定值。表5.抗IL-23抗体阻断Ba/F3细胞增殖的IC50值

抗体

IC50(pM)

m13B8	700
		hum13B8-a	1100，1100
hum13B8-b	1200，1100
		hum13B8-c	1100，2200

实施例6基于IL-17产生的IL-23的小鼠脾细胞测定

基本上按照以下文献所述，用脾细胞测定来评价本发明抗IL-23p19抗体的生物活性：Aggarwal等(2003)J.Biol.Chem.278：1910和Stumhofer等(2006)Nature Immunol.7：937。小鼠脾细胞测定根据鼠脾细胞产生IL-17的水平来检测样品中IL-23活性。通过测定在给定样品中使IL-23活性降低50％所需的抗体浓度(IC50)，来评价抗IL-23p19抗体的抑制活性。用该测定所测得的IC50大于等于平衡离解结合常数(K_d)，即K_d可小于等于IC50。通常，IC50和K_d值更低表示活性和亲和力更高。

简而言之，自8-12周龄雌性C57BL/6J小鼠(JacksonLaboratories，Bar Harbor，Maine，USA)取出脾脏。将脾脏绞碎，沉淀两次并通过细胞滤器(70μm尼龙)过滤。在96孔板(4x10⁵细胞/孔)中，在人IL-23(10ng/ml，约170pM)和小鼠-抗CD3e抗体(1μg/ml)(BDPharmingen，Franklin Lakes，New Jersey，USA)存在下，有或没有待测抗IL-23p19抗体时，培养回收的细胞。加入10μg/ml和系列3倍稀释度的抗IL-23p19抗体。将细胞培养72小时，沉淀，通过夹心ELISA测定上清液中IL-17的含量。

IL-17ELISA进行如下。在4℃下，用捕获抗IL-17抗体(100ng/孔)对各板包被过夜，洗涤并封闭。加入样品和标准品并在室温下孵育2小时，同时振荡。洗涤各板，加入生物素化抗IL-17检测抗体(100ng/孔)并在室温下孵育1小时，同时振荡。捕获抗体和检测抗体是不同抗体，它们都能结合小鼠IL-17，但不会交叉阻断。洗涤各板，再用链霉抗生物素-HRP(辣根过氧化物酶)和TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)检测结合的检测抗体。然后在450-650nm处读板，通过与标准品比较而求出样品中IL-17的浓度。

表6中提供脾细胞测定的IC50值，包括一些重复测定值。表6.脾细胞测定IC50

抗体	IC50(pM)
		m13B8	28，54，64
hum13B8-a	71-108
		hum13B8-b	110，221
hum13B8-c	515

实施例7.抗IL-23p19抗体13B8-b制备物的表征

用含13B8-b重链和轻链的编码DNA序列(分别为SEQ IDNO：49和SEQ ID NO：50)的载体，从哺乳动物细胞制备人源化抗IL-23p19抗体13B8-b。

基本上按照实施例4(参见上文)所述，当用BIAcore分析测定时，Hum 13B8-b对于人IL-23的K_d为297pM。

除340pM IL-23(而不是50pM)用于刺激增殖之外，基本上按照实施例5(参见上文)所述，用Ba/F3增殖测定来评价hum13B8-b的生物活性。通过测定在给定样品中使IL-23活性降低50％所需的抗体浓度，评价抗IL-23p19抗体的抑制活性(IC50)。通常，IC50更低表示活性更高。在Ba/F3增殖测定中，Hum13B8-b的IC50为187pM。

除脾细胞得自人脾而不是小鼠脾脏、不使用抗CD3e抗体、读出IFN-γ而不是IL-17之外，基本上按照实施例6(参见上文)所述，使用人脾细胞测定，再次评价hum13B8-b的生物活性。该测定检测样品中IL-23的活性，即通过检测由人原代脾细胞产生的IFN-γ水平。在不同浓度的抗IL-23p19抗体hum13B8-b存在下，或者在抗体不存在下，使人脾细胞接触人IL-23(170pM)。用夹心ELISA检测IFN-γ。在人脾细胞测定中，Hum13B8-b的IC50为59-144pM。

基本上按照Parham等(2002)J.Immunol.168：5699所述，用KIT225STAT-3磷酸化测定，进一步评价hum13B8-b的生物活性。在不同浓度的抗IL-23p19抗体hum13B8-b存在下，或者在抗体不存在下，用138pM人IL-23刺激人KIT225细胞(一种白血病T细胞系)。通过检测STAT3磷酸化水平来测定IL-23活性。在KIT225测定中，Hum13B8-b的IC50为130pM。实施例8人源化抗IL-23p19抗体13B8-b的表位

通过X射线结晶学测定人源化抗体13B8-b与人IL-23p19(SEQ ID NO：47)结合的表位。测定人源化抗IL-23p19抗体13B8-b的Fab片段与非连接的人IL-23(其包含p19亚基和p40亚基)复合体的配价(coordinate)。用于测定晶体结构的IL-23的p40亚基具有N222Q取代，其中Asn222被Gln置换。人IL-23p19的序列见SEQ ID NO：47，人IL-12/IL-23p40成熟形式的序列见GenBank检索号P29460残基23-328。人源化抗IL-23p19抗体13B8-b包含人源化13B8-b重链(SEQID NO：7)和人源化13B8-b轻链(SEQ ID NO：14)。结晶条件为15％聚乙二醇4000、60mM乙酸钠、100mM TRIS-HCl(pH 8)。用其它缓冲剂(pH 8或pH 8附近)也可得到晶体。

在抗体13B8-b残基4.0

内的IL-23氨基酸残基包括K20、T23、W26、S27、P30、E82、S95、L96、L97、P98、D99、P101、G103、Q104、H106、A107和L110。另外的残基L24、L85、T91、S100和V102都在5.0

内。如果IL-23p19氨基酸残基的任何原子配价在抗体任何原子配价的指定距离内，则认为该残基在抗体指定距离(例如4.0

或5.0

)内。

大多数这些接触的残基都落入沿着IL-23p19一级结构的两个主簇(main cluster)内，其中第一簇包括残基20-30(其中11个残基中有6个在抗体的5.0

内，11个中有5个在4.0

内)，第二簇包括残基82-110(其中29个残基中有16个在抗体的5.0

内，29个中有12个在4.0

内)。这些簇限定表位，其包含多段IL-23p19的11个或更多邻接的氨基酸残基，其中30％、40％、45％、50％或54％或更多残基在抗体的4.0

或5.0内。

与这两个簇中的一个或两者结合的抗体将有望阻断抗体13B8-b的结合，并将有望表现出类似生物活性。

表7提供序列表中的序列的简短描述。表7序列编号

SEQ ID NO：	描述
		1	m1A11V_H
2	m11C1V_H
		3	m5F5V_H
4	m21D1V_H
		5	m13B8V_H

6	hum13B8HC-a
		7	hum13B8HC-b
8	hum13B8HC-c
		9	m1A11V_L
10	m11C1V_L
		11	m5F5V_L
12	m21D1V_L
		13	m13B8V_L
14	hum13B8LC
		15	m1A11CDRH1
16	m11C1CDRH1
		17	m5F5CDRH1
18	m21D1CDRH1
		19	m13B8CDRH1
20	m1A11CDRH2
		21	m11C1CDRH2
22	m5F5CDRH2
		23	m21D1CDRH2
24	m13B8CDRH2-a
		25	h13B8CDRH2-b
26	h13B8CDRH2-c
		27	m1A11CDRH3
28	m11C1CDRH3
		29	m5F5CDRH3
30	m21D1CDRH3
		31	m13B8CDRH3
32	m1A11CDRL1
		33	m11C1CDRL1
34	m5F5CDRL1
		35	m21D1CDRL1
36	m13B8CDRL1
		37	m1A11CDRL2

38	m11C1CDRL2
		39	m5F5CDRL2
40	m21D1CDRL2
		41	m13B8CDRL2
42	m1A11CDRL3
		43	m11C1CDRL3
44	m5F5CDRL3
		45	m21D1CDRL3
46	m13B8CDRL3
		47	人IL-23p19
48	小鼠IL-23p19
		49	hum13B8-bHCDNA
50	hum13B8LCDNA

序列表

<110>先灵公司

L.G.普雷斯塔

B.M.拜尔

R.N.因格拉姆

Y-H.刘

P.奥尔特

<120>抗IL-23p19的工程抗体

<130>BP06597

<150>60/891,409

<151>2007-02-23

<160>50

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>117

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Asn Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

Tyr Ile Gln Trp Val Lys Gln Ser Arg Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210>2

<211>116

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>2

His Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Ala Tyr

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Phe Pro Val Arg Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Glu Ile Phe

50 55 60

Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210>3

<211>124

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Val Asn Ser Tyr Tyr Asn Glu Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210>4

<211>116

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Leu Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Phe Ile His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asn His Asp Val Glu Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Asp

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Asn Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210>5

<211>116

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>5

His Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Glu Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ile Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Thr Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Glu Met Phe

50 55 60

Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210>6

<211>446

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人构架、啮齿类CDR

<220>

<221>结构域

<222>(1)..(116)

<223>可变区

<400>6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ile Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gln Ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Glu Met Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210>7

<211>446

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人构架、啮齿类CDR

<220>

<221>结构域

<222>(1)..(116)

<223>可变区

<400>7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ile Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gln Ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210>8

<211>446

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人构架、啮齿类CDR

<220>

<221>结构域

<222>(1)..(116)

<223>可变区

<400>8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ile Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gln Ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

GlyThr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210>9

<211>113

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>9

Asn Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210>10

<211>108

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Trp Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>11

<211>111

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>11

Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Ile Thr

20 25 30

Ser Asn Asp Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Ser Phe Thr

35 40 45

Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly

65 70 75 80

Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser

85 90 95

Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210>12

<211>108

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Val Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Phe Gly Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Asp Leu Lys Arg

100 105

<210>13

<211>108

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Arg Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Arg Tyr Phe Cys Gln His His Tyr Gly Ile Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>14

<211>214

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人构架、啮齿类CDR

<220>

<221>结构域

<222>(1)..(108)

<223>可变区

<400>14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ile Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>15

<211>10

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>15

Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr Tyr Ile Gln

1 5 10

<210>16

<211>10

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>16

Gly Tyr Ile Phe Ser Ala Tyr Trp Met Thr

1 5 10

<210>17

<211>10

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>17

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser

1 5 10

<210>18

<211>10

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>18

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Phe Phe Ile His

1 5 10

<210>19

<211>10

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>19

Gly Tyr Ile Phe Ile Thr Tyr Trp Met Thr

1 5 10

<210>20

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>20

Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>21

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>2l

Gln Ile Phe Pro Val Arg Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Glu

1 5 10 15

Gly

<210>22

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>22

Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Val Asn Ser Tyr Tyr Asn Glu Arg Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>23

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>23

Trp Ile Phe Pro Gly Asn His Asp Val Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>24

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>24

Gln Ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Glu Met Phe Glu

1 5 10 15

Gly

<210>25

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有一个氨基酸取代的啮齿类CDR

<400>25

Gln Ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Glu

1 5 10 15

Gly

<210>26

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有4个氨基酸取代的啮齿类CDR

<400>26

Gln Ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Gln Lys Leu Gln

1 5 10 15

Gly

<210>27

<211>8

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>27

Gln Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5

<210>28

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>28

Gly Gly Gly Gly Phe Ala Tyr

1 5

<210>29

<211>15

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>29

Gly Gly Asn Tyr Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210>30

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>30

Gly Gly Gly Asn Leu Pro Tyr

1 5

<210>31

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>31

Gly Gly Gly Gly Phe Ala Tyr

1 5

<210>32

<211>16

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>32

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210>33

<211>11

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>33

Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210>34

<211>14

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>34

Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Ile Thr Ser Asn Asp Ala Asn

1 5 10

<210>35

<211>11

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>35

Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210>36

<211>11

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>36

Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210>37

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>37

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser

1 5

<210>38

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>38

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu

1 5

<210>39

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>39

Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro

1 5

<210>40

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>40

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu

1 5

<210>41

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>41

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu

1 5

<210>42

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>42

Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr

1 5

<210>43

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>43

Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe Thr

1 5

<210>44

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>44

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val

1 5

<210>45

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>45

Gln His His Tyr Gly Ile Pro Phe Thr

1 5

<210>46

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>46

Gln His His Tyr Gly Ile Pro Phe Thr

1 5

<210>47

<211>170

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>47

Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln Cys Gln Gln

1 5 10 15

Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His Pro Leu Val

20 25 30

Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr Thr Asn Asp

35 40 45

Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln Gly Leu Arg

50 55 60

Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly Leu Ile Phe

65 70 75 80

Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu

85 90 95

Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu

100 105 110

Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln Gln Ile

115 120 125

Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu Leu Arg Phe

130 135 140

Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala Ala Arg Val

145 150 155 160

Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro

165 170

<210>48

<211>175

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>48

Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln Cys Gln Gln Leu Ser

1 5 10 15

Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His Ala Pro Ala Gly His

20 25 30

Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu Glu Asp Glu Glu Thr Lys Asn Asn Val

35 40 45

Pro Arg Ile Gln Cys Glu Asp Gly Cys Asp Pro Gln Gly Leu Lys Asp

50 55 60

Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile Arg Gln Gly Leu Ala Phe Tyr

65 70 75 80

Lys His Leu Leu Asp Ser Asp Ile Phe Lys Gly Glu Pro Ala Leu Leu

85 90 95

Pro Asp Ser Pro Met Glu Gln Leu His Thr Ser Leu Leu Gly Leu Ser

100 105 110

Gln Leu Leu Gln Pro Glu Asp His Pro Arg Glu Thr Gln Gln Met Pro

115 120 125

Ser Leu Ser Ser Ser Gln Gln Trp Gln Arg Pro Leu Leu Arg Ser Lys

130 135 140

Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Leu Ala Ile Ala Ala Arg Val Phe

145 150 155 160

Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu Val Pro Thr Ala

165 170 175

<210>49

<211>1398

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人恒定区和构架区、啮齿类CDR

<400>49

atggctgtgc tggggctgct gttctgcctg gtgacattcc caagctgtgt gctgtcccag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgctgaggtg aagaagcctg gcgcctccgt gaaggtctcc 120

tgcaaggctt ctggctacat cttcatcacc tactggatga cctgggtgcg gcaggcccct 180

ggccaggggc tggagtggat gggccagatc ttccctgcca gcggctctgc agactacaac 240

gagaagttcg aaggcagagt caccatgacc acagacacat ccaccagcac agcctacatg 300

gagctgagga gcctgagatc tgacgacacc gccgtgtatt actgtgccag aggcggtggc 360

ggattcgctt actggggcca gggcaccctg gtcaccgtct ccagcgctag caccaagggc 420

ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480

ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540

ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600

agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660

aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 720

actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780

ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 840

gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020

gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080

ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140

gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200

agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260

tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320

ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380

ctgtctccgg gtaaatga 1398

<210>50

<211>702

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人恒定区和构架区、啮齿类CDR

<400>50

atggctccag tgcagctgct ggggctgctg gtgctgttcc tgccagccat gagatgtgat 60

atccagatga cccagtctcc atcctccctg tctgcctctg tgggcgacag agtgaccatc 120

acctgcagga ccagcgagaa catctacagc tacctggcct ggtatcagca gaagccaggg 180

aaggccccta agctgctgat ctataacgcc aagaccctgg ctgaaggggt gccatccagg 240

ttcagcggca gcggctctgg gacagacttc accctgacca tcagcagcct gcagcctgag 300

gacttcgcca cctactactg tcagcaccac tacggaattc cattcacctt cggccagggc 360

accaaggtgg agatcaagcg tacggtggct gcaccatctg tgttcatctt ccctccatct 420

gatgagcagc tgaagtctgg aactgcctcc gtggtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480

agagaggcca aggtgcagtg gaaggtggat aacgccctcc agagcggcaa ctcccaggag 540

agcgtgacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 600

agcaaagcag actacgagaa acacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca tcagggcctg 660

agcagccccg tgacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt aa 702

Claims

1.一种与人IL-23结合的抗体或其抗原结合片段，其包含：

a)包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区或其抗原结合片段，其中：

CDRL1包含SEQ ID NO：36的序列；

CDRL2包含SEQ ID NO：41的序列；并且

CDRL3包含SEQ ID NO：46的序列；和

b)包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区或其抗原结合片段，其中：

CDRH1包含SEQ ID NO：19的序列；

CDRH2包含SEQ ID NO：25的序列；并且

CDRH3包含SEQ ID NO：31的序列。

2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：14的残基1-108。

3.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：7的残基1-116的序列。

4.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含：

权利要求2定义的抗体轻链可变区；和

权利要求3定义的抗体重链可变区。

5.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链和重链，其中：

所述轻链包含SEQ ID NO：14的序列；并且

所述重链包含SEQ ID NO：7的序列。

6.一种分离的核酸，所述核酸编码权利要求1的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和重链可变区。

7.一种包含权利要求6的核酸的表达载体，所述核酸与调控序列可操作性连接，所述调控序列在宿主细胞被所述载体转染时被所述宿主细胞识别。

8.一种宿主细胞，所述细胞包含权利要求7的表达载体。

9.一种制备抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：

在表达核酸序列的条件下、在培养基中培养权利要求8的宿主细胞，从而产生包含抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和重链可变区的多肽；和

自所述宿主细胞或培养基中回收所述抗体或其抗原结合片段。

10.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是选自以下的抗体片段：Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)₂和双抗体。

11.权利要求1的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途。

12.权利要求1的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗选自关节炎、银屑病和炎性肠病的疾病的药物中的用途。

13.权利要求1的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗选自多发性硬化、系统性红斑狼疮和糖尿病的疾病的药物中的用途。

14.权利要求1的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

15.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体或稀释剂组合。

16.权利要求15的药物组合物，所述组合物还包含免疫抑制药或抗炎药。

17.一种宿主细胞，其包含：

a)包含编码权利要求1的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸序列的表达载体；和

b)包含编码权利要求1的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸序列的表达载体。

18.一种制备抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：

在表达核酸序列的条件下、在培养基中培养权利要求17的宿主细胞，从而产生包含抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和重链可变区的多肽；和