PT2059534E

PT2059534E - Anticorpos anti-il-23p19 fabricados por engenharia genética

Info

Publication number: PT2059534E
Application number: PT08714211T
Authority: PT
Inventors: Leonard G Presta; Brian M Beyer; Richard N Ingram; Peter Orth; Yan-Hui Liu
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 2007-02-23
Filing date: 2008-02-21
Publication date: 2012-07-17
Also published as: US8293883B2; CA2678749A1; JP2010518856A; CY1121327T1; ES2388837T3; CY1112912T1; DK2059534T3; US20100272731A1; HRP20182174T1; PL2059534T3; CN101687925A; US9809648B2; CY2019004I1; AU2008218968B2; PT2426144T; IL200560A0; NZ579158A; RS58098B1; LT2426144T; CA2678749C

Description

1

DESCRIÇÃO

"ANTICORPOS ANTI-IL-23P19 FABRICADOS POR ENGENHARIA GENÉTICA" A presente revelação refere-se geralmente a anticorpos específicos da pl9 da interleucina-23 (IL-23pl9) e utilizações dos mesmos. Mais especificamente, a revelação refere-se a anticorpos humanizados que reconhecem a IL-23pl9 humana e modulam a sua atividade, particularmente em distúrbios inflamatórios, autoimunes, e proliferativos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 sistema imune funciona para proteger os indivíduos dos agentes infeciosos, por exemplo, bactérias, organismos multicelulares, e vírus, bem como de cancros. Este sistema inclui vários tipos de células linfóides e mielóides tais como monócitos, macrófagos, células dendríticas (DC), eosinófilos, células T, células B, e neutrófilos. Estas células linfóides e mielóides frequentemente produzem proteínas sinalizadoras conhecidas como citocinas. A resposta imune inclui inflamação, isto é, a acumulação de células imunes sistematicamente ou num local particular do corpo. Em resposta a um agente infecioso ou substância estranha, as células imunes secretam citocinas que, por sua vez, modulam a proliferação, desenvolvimento, diferenciação, ou migração das células imunes. A resposta imune pode produzir consequências patológicas, por exemplo, quando envolve inflamação excessiva, como nas doenças autoimunes (ver, por exemplo, Abbas et al. (editores) (2000) Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders 2

Co., Philadelphia, PA; Oppenheim e Feldmann (editores) (2001) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA; von Andrian e Mackay (2000) New Engl. J. Med. 343:1020-1034; Davidson e Diamond (2001) New Engl. J. Med. 345:340-350) . A interleucina-12 (IL-12) é uma molécula heterodimérica composta pelas subunidades p35 e p40. Estudos têm indicado que a IL-12 desempenha um papel crítico na diferenciação de células T naive em linfócitos T auxiliares CD4+ tipo 1 que segregam IFNy. Também foi demonstrado que a IL-12 é essencial para as respostas imune e inflamatória in vivo dependentes das células T. Ver, por exemplo, Cua et al. (2003) Nature 421:744-748. O recetor da IL-12 é composto pelas subunidades IL-12P1 e IL-1232. A interleucina-23 (IL-23) é uma citocina heterodimérica que compreende duas subunidades, pl9 que é unicamente da IL-23, e p40, que é partilhada com a IL-12. A subunidade pl9 está estruturalmente relacionada com a IL-6, com o fator de estimulação da colónia de granulócitos (G-CSF) , e com a subunidade p35 da IL-12. A IL-23 medeia a sinalização ligando-se a um recetor heterodimérico, compreendido de IL23R e IL-12pi, que é partilhado pelo recetor da IL-12. Um número de estudos iniciais demonstrou que as consequências de uma deficiência genética em p40 (p40 de ratinho knockout; p40 de ratinho KO) eram mais severas do que aquelas encontradas na p35 de ratinho KO. Alguns destes resultados foram eventualmente explicados pela descoberta da IL-23, e da observação de que a p40KO previne a expressão não só da IL-12, mas também da IL-23 (ver, por exemplo, Oppmann et al. (2000) Immunity 13:715-725; Wiekowski et al. (2001) J. Immunol. 166:7563-7570; 3

Parham et al. (2002) J. Immunol. 168:5699-708; Frucht (2002) Sei STKE 2002, E1-E3; Elkins et al. (2002) Infection Immunity 70:1936-1948).

Estudos recentes, através da utilização de p40 de ratinho KO, mostraram que o bloqueio tanto da IL-23 como da IL-12 constitui um tratamento eficaz para vários distúrbios inflamatórios e autoimunes. Contudo, o bloqueio da IL-12 através da p40 parece ter várias consequências sistemáticas tais como suscetibilidade aumentada a infeções microbianas oportunistas. Bowman et al. (2006) Curr. Opin. Infect. Dis. 19:245.

Podem ser utilizados anticorpos terapêuticos para bloquear a atividade das citocinas. A limitação mais significativa na utilização de anticorpos como um agente terapêutico in vivo é a imunogenicidade dos anticorpos. Como a maioria dos anticorpos monoclonais são derivados de roedores, a utilização repetida em humanos resulta na geração de uma resposta imune contra o anticorpo terapêutico. Tal resposta imune resulta, num mínimo, numa perda de eficácia terapêutica e, num máximo, numa resposta anafilática fatal potencial. Esforços iniciais para reduzir a imunogenicidade dos anticorpos dos roedores envolveram a produção de anticorpos quiméricos, nos quais as regiões variáveis de ratinho foram fundidas com regiões constantes humanas. Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3439-43. Contudo, ratinhos injetados com híbridos de regiões variáveis humanas e regiões constantes de ratinho desenvolvem uma forte resposta anti-anticorpo dirigida contra a região variável humana, o que sugere que a retenção da região Fv inteira de roedor em tais anticorpos quiméricos poderia ainda resultar numa imunogenicidade 4 indesejada em pacientes. É geralmente aceite que os loops da região determinante de complementaridade (CDR) dos dominios variáveis compreendem o local de ligação das moléculas do anticorpo. Assim, tentou-se o transplante dos loops da CDR de roedor em sistemas humanos (isto é, humanização) para minimizar ainda mais as sequências de roedor. Jones et al. (1986) Nature 321:522; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534. Contudo, as trocas de loop da CDR ainda não resultam uniformemente num anticorpo com as mesmas propriedades de ligação que o anticorpo de origem. As alterações nos resíduos estruturais (FR), resíduos envolvidos no suporte do loop da CDR, em anticorpos humanizados também sao necessárias para preservar a afinidade de ligação ao antígeno. Kabat et al. (1991) J. Immunol. 147 :1709. Ainda que tenha sido reportada a utilização do transplante da CDR e a preservação do resíduo estrutural num número de construções de anticorpo humanizado, é difícil prever se uma sequência particular resultará no anticorpo com a ligação, e por vezes propriedades biológicas, desejadas. Ver, por exemplo, Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029, Gorman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:4181, e Hodgson (1991) Biotechnology (NY) 9:421-5. Além disso, a maioria dos estudos prévios utilizaram sequências humanas diferentes para as sequências animais variáveis pesada e leve, tornando a natureza preditiva de tais estudos questionável. Foram utilizadas sequências de anticorpos conhecidas ou, mais tipicamente, aquelas de anticorpos que têm estruturas de raio X conhecidas, anticorpos NEW e KOL. Ver, por exemplo, Jones et al., supra; Verhoeyen et al., 5 supra; e Gorman et al., supra. A informação exata da sequência foi reportada para umas poucas construções humanizadas. São revelados anticorpos exemplares contra IL-23pl9 fabricados por engenharia genética nos pedidos de Patente U.S. provisórios cedidos ao mesmo cessionário N.°s 60/891 409 e 60/891 413 (ambos preenchidos em 23 de Fevereiro de 2007), na Publicação do pedido de Patente U.S. N.°s 2007/0009526 e 2007/0048315, e na Publicação de Patente Internacional N.°s WO 2007/076524, WO 2007/024846 e WO 2007/147019.

Existe uma necessidade de anticorpos anti-huIL-23pl9 para utilização, por exemplo, no tratamento de distúrbios inflamatórios, autoimunes, e proliferativos. Preferencialmente, tais anticorpos são fabricados por engenharia genética para introduzir sequências germinativas humanas para reduzir a imunogenicidade em sujeitos humanos, por exemplo nas regiões estruturais. Preferencialmente, tais anticorpos terão uma elevada afinidade para huIL-23pl9 e ligar-se-ão com elevada especifidade a huIL-23pl9.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é como definida nas reivindicaçãos. A presente revelação providencia compostos de ligação, tais como anticorpos ou fragmentos dos mesmos, incluindo anticorpos recombinantes humanizados ou quiméricos, que ligam a IL23pl9 humana, que compreendem um domínio variável da cadeia leve do anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tendo pelo menos uma, duas ou três CDR selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 32-46. Numa modalidade, o composto de ligação da presente revelação compreende um 6 domínio variável da cadeia leve que compreende pelo menos uma CDRL1 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 32-36; pelo menos uma CDRL2 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 37-41; e pelo menos uma CDRL3 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 42-46.

Numa modalidade, o composto de ligação compreende um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tendo pelo menos uma, duas ou três CDR selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 15-31. Numa modalidade, o composto de ligação da presente revelação compreende um domínio variável da cadeia pesada que compreende pelo menos uma CDRH1 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 15-19; pelo menos uma CDRH2 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 20-26; e pelo menos uma CDRH3 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 27-31.

Noutras modalidades o composto de ligação da presente revelação compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio variável da cadeia pesada, ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos nos dois parágrafos anteriores.

Em algumas modalidades, o composto de ligação compreende uma região estrutural, em que a sequência do aminoácido da região estrutural é toda, ou substancialmente toda, a da sequência de aminoácido de uma imunoglobulina humana.

Em algumas modalidades os domínios variáveis da cadeia leve e/ou cadeia pesada compreendem uma variante de uma ou mais das CDR. Em várias modalidades o domínio variante 7 compreende até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos de aminoácido conservadoramente modificados relativos à sequência das SEQ. ID N.°s respetivas. São providenciadas no Quadro 1 substitutições conservadoras de aminoácidos.

Em algumas modalidades o domínio variável da cadeia leve compreende resíduos 1-108 da SEQ. ID N.° 14 ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nos resíduos 1-116 das SEQ. ID N.°s 6-8, tais como SEQ. ID N.° 6, SEQ. ID N.° 7 ou SEQ. ID N.° 8. Em várias modalidades o domínio variável da variante compreende até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50 ou mais resíduos de aminoácido conservadoramente modificados relativos à sequência das SEQ. ID N.°s respectivas. Ainda numa outra modalidade, o composto de ligação compreende um domínio variável da cadeia leve e um domínio variável da cadeia pesada, ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos neste parágrafo.

Numa modalidade o composto de ligação compreende uma sequência da cadeia leve da SEQ. ID N.° 14 e/ou uma sequência da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 6-8.

Noutras modalidades o composto de ligação da presente revelação compreende um domínio variável da cadeia leve, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, consistindo essencialmente nos resíduos 1-108 da SEQ. ID N.° 14, e/ou num domínio variável da cadeia pesada, ou num fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, consistindo essencialmente numa sequência selecionada a partir do grupo que consiste 8 nos resíduos 1-116 das SEQ. ID N.°s 6-8, tais como SEQ. ID N.° 6, SEQ. ID N.° 7 ou SEQ. ID N.° 8.

Noutras modalidades o composto de ligação da presente revelação compreende um domínio variável da cadeia leve, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tendo pelo menos 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de homologia da sequência com os resíduos 1-108 da SEQ. ID N.° 14, e/ou um domínio variável da cadeia pesada, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tendo pelo menos 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de homologia da sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nos resíduos 1-116 das SEQ. ID N.°s 6-8, tais como SEQ. ID N.° 6, SEQ. ID N.° 7 ou SEQ. ID N.° 8.

Numa modalidade, o composto de ligação da presente revelação liga-se à IL-23pl9 humana (SEQ. ID N.° 47) num epítopo que compreende os resíduos 20-30, ou os resíduos 82-110, ou ambos. Numa outra modalidade o composto de ligação da IL-23pl9 liga-se a um epítopo que compreende alguns ou todos os resíduos K20, T23, W26, S27, P30, E82, S95, L96, L97, P98, D99, P101, G103, Q104, H106, A107 e L110, e opcionalmente os resíduos L24, L85, T91, S100 e V102. Em várias modalidades o epítopo para um anticorpo de interesse é determinado obtendo uma estrutura de cristal por raios X de um complexo anticorpo:antígeno e determinando que resíduos na IL-23pl9 estão dentro de uma distância especificada de resíduos no anticorpo de interesse, em que a distância especificada é, por exemplo, 4À ou 5Ã. Em algumas modalidades, o epítopo é definido como um alongamento de 11 ou mais resíduos de aminoácido contíguos ao longo da sequência da IL-23pl9 na qual pelo menos 30%, 40%, 45%, 50% ou 54% dos resíduos estão dentro 9 da distância especificada do anticorpo.

Numa modalidade, a revelação refere-se aos anticorpos que são capazes de bloquear a ligação de um composto de ligação da presente revelação à IL-23 humana num ensaio de bloqueio cruzado. Numa outra modalidade, a revelação refere-se a compostos de ligação que são capazes de bloquear a atividade mediada pela IL-23, incluindo tais atividades, mas não limitadas a, a ligação ao seu recetor e a promoção da proliferação ou sobreviência das células Th17.

Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada compreende uma região constante da cadeia pesada humana γΐ, γ2, γ3, ou γ4 ou uma variante da mesma. Em várias modalidades a região constante da cadeia leve compreende uma região constante da cadeia leve humana lambda ou kappa.

Em várias modalidades o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da presente invenção são anticorpos policlonais, monoclonais, quiméricos, humanizados ou totalmente humanos ou fragmentos dos mesmos. A presente invenção também contempla que o fragmento de ligação ao antigeno seja um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em, por exemplo, Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab') 2 , e um diacorpo. A presente revelação abrange um método de suprimir uma resposta imune num sujeito humano que compreende administrar a um sujeito em necessidade do mesmo um anticorpo (ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo) especifico para IL23 numa quantidade eficaz para bloquear a atividade biológica da IL-23. Em algumas modalidades, o anticorpo específico para IL-23 é o anticorpo humanizado ou 10 quimérico. Em modalidades adicionais, a resposta imune é uma resposta inflamatória incluindo artrite, psoríase, e doença inflamatória do intestino. Noutras modalidades, a resposta imune é uma resposta autoimune, incluindo esclerose múltipla, uveite, lúpus eritematoso sistémico e diabetes. Numa outra modalidade, o sujeito tem cancro e a resposta imune é uma resposta Thl7. A presente revelação também contempla administrar um agente imunossupressor ou anti-inflamatório adicional. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da presente invenção pode estar numa composição farmacêutica que compreende o composto de ligação, ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, em combinação com um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Numa modalidade adicional, a composição farmacêutica compreende ainda um agente imunossupressor ou anti-inflamatório. A presente invenção abrange um ácido nucleico isolado que codifica a sequência polipeptidica de uma modalidade do anticorpo do composto de ligação da presente invenção. O ácido nucleico pode estar num vetor de expressão operativamente ligado às sequências controlo reconhecidas por uma célula hospedeira transfetada com o vetor. É também abrangida uma célula hospedeira que compreende o vetor, e um método de produzir um polipeptídeo que compreende cultivar a célula hospedeira em condições em que a sequência do ácido nucleico é expressa, produzindo assim o polipeptídeo, e recuperando o polipeptídeo da célula ou meio hospedeiro. Em várias modalidades, a invenção refere-se à utilização de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da presente invenção no fabrico de 11 medicamentos para o tratamento de distúrbios incluindo, ms não limitados a, doença inflamatória, doença autoimune, cancro, doença infeciosa (por exemplo infeção bacteriana, micobacteriana, virai ou fúngica, incluindo infeções crónicas), artrite, psoríase, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, uveite, lúpus eritematoso sistémico e diabetes.

Noutras modalidades a invenção refere-se a composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da presente invenção para tratar distúrbios incluindo, mas não limitados a, doença inflamatória, doença autoimune, cancro, doença infeciosa (por exemplo infeção bacteriana, micobacteriana, virai ou fúngica, incluindo infeções crónicas), artrite, psoríase, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, uveite, lúpus eritematoso sistémico e diabetes.

Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo ou composição farmacêutica da presente invenção induz um período prolongado de remissão dos sintomas da doença num sujeito, de tal maneira que o intervalo de dosagem pode ser estendido para muito mais do que a meia-vida do composto de ligação no sujeito, por exemplo no tratamento de uma doença reincidente-remitente. Em várias modalidades, o intervalo entre uma administração e outra é de 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 30 semanas ou mais

longo. Noutras modalidades uma única administração é suficiente para prevenir as reincidências permanentemente. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra comparações de sequências do domínio variável da cadeia pesada clone do anticorpo de ratinho anti-IL-23pl9 humana. As sequências são providencidas para 12 os clones mlAll, mllCl, m5F5, m21Dl, ml3B8, hl3B8a, hl3B8b e hl3B8c. As CDR são indicadas. Em ambas as figuras, um prefixo "m" indica um anticorpo murino e um "h" indica um anticorpo humanizado. Os sufixos "a", "b" e "c" referem-se a sequências variantes do domínio variável da cadeia pesada 13B8 humanizado, como discutido em grande detalhe a seguir. A Figura 2 mostra comparações de sequências do domínio variável da cadeia leve clone do anticorpo de ratinho anti-IL-23pl9 humana. As sequências são providenciadas para os clones mlAll, mllCl, m5F5, m2lDl, ml3B8, hl3B8. As CDR são indicadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Como usado aqui, incluindo nas reivindicações em anexo, as formas singular de palavras tais como "um," "uma," e "o, " incluem as suas referências plurais correspondentes a menos que o contexto claramente dite o contrário. 0 Quadro 7 em baixo providencia uma lista de identificadores de sequência utilizados neste pedido. A citação das referências aqui não é pretendida como uma admissão de que qualquer das precedentes é pertinente anterior à arte, nem constitui qualquer admissão quanto aos conteúdos ou data destas publicações ou documentos. I. Definições "Atividade proliferativa" abrange uma atividade que promove, que é necessária para, ou que está especificamente associada com, por exemplo, divisão celular normal, bem como cancro, tumores, displasia, transformação celular, metástases, e angiogénese. "Administração" e "tratamento," como se aplica a um animal, humano, sujeito experimental, célula, tecido, orgão, ou fluído biológico, referem-se ao contacto de um 13 agente ou composição diagnóstico, terapêutico, farmacêutico exógeno com o animal, humano, sujeito, célula, tecido, orgão, ou fluido biológico. "Administração" e "tratamento" podem referir-se, por exemplo, a métodos terapêuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, de investigação, e experimentais. 0 tratamento de uma célula abrange contacto de um reagente com a célula, bem como contacto de um reagente com um fluído, onde o fluído está em contacto com a célula. "Administração" e "tratamento" também significam tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, de uma célula, por um reagente, composição de diagnóstico, de ligação, ou por outra célula. "Tratamento," como se aplica a um humano, veterinário, ou sujeito de investigação, refere-se a tratamento terapêutico, medidas profiláticas ou preventativas, para aplicações de investigação e diagnósticas. "Tratamento" como se aplica a um humano, veterinário, ou sujeito de investigação, ou célula, tecido, ou orgão, abrange o contacto de um agente com um sujeito animal, uma célula, tecido, compartimento fisiológico, ou fluido fisiológico. "Tratamento de uma célula" também abrange situações onde o agente contacta o recetor da IL-23 (heterodimero IL-23R/IL-12Rbetal), por exemplo, na fase fluida ou fase coloidal, mas também situações onde o agonista ou antagonista não contactam a célula ou o recetor.

Como usado aqui, o termo "anticorpo" refere-se a qualquer forma do anticorpo que exibe a atividade biológica desejada. Assim, é usado no sentido mais amplo e especificamente cobre anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento inteiro), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecificos (por exemplo, 14 anticorpos biespecíficos) , anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos inteiramente humanos, etc. desde que eles exibam a atividade biológica desejada.

Como usado aqui, os termos "fraqmento de ligação da IL-23pl9," "fragmento de ligação do mesmo" ou "fragmento de ligação ao antigeno do mesmo" abrangem um fragmento ou um derivado de um anticorpo que ainda retém substancialmente a sua atividade biológica de inibir a atividade da IL-23pl9. Assim, o termo "fragmento de anticorpo" ou fragmento de ligação da IL-23pl9 refere-se a uma porção de um anticorpo de comprimento inteiro, geralmente a ligação do antigeno ou região variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab') 2 , e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples, por exemplo, sc-Fv; e anticorpos multiespecificos formados dos fragmentos de anticorpo. Tipicamente, um fragmento de ligação ou derivado retém pelo menos 10% da sua atividade inibitória da IL-23pl9. Preferencialmente, um fragmento de ligação ou derivado retém pelo menos 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% (ou mais) da sua atividade inibitória da IL-23pl9, apesar de qualquer fragmento de ligação com afinidade suficiente para exercer o efeito biológico desejado será útil. Também se pretende que um fragmento de ligação da IL-23pl9 possa incluir variantes que têm substituições de aminoácidos conservadoras que não alteram substancialmente a sua atividade biológica. O termo "anticorpo monoclonal", como usado aqui, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são 15 idênticos com exceção das possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em menores quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único epítopo de antigénio. Em contraste, as preparações de anticorpo (policlonal) convencionais tipicamente incluem uma multitude de anticorpos dirigidos contra (ou específicos para) epítopos diferentes. 0 modificador "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como tendo sido obtido de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não será construído como produção requerente do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados em concordância com a presente invenção podem ser fabricados pelo método do hibridoma inicialmente descrito por Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, ou podem ter sido fabricados por métodos recombinantes de ADN (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 4 816 567) . Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fago utilizando as técnicas descritas em Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 e Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597, por exemplo.

Os anticorpos monoclonais aqui especificamente incluem anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica com, ou homóloga a, sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da cadeia (s) é idêntico com, ou homóloga a, sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse 16 de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada. Patente U.S. N.° 4 816 567; Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855.

Um "anticorpo domínio" é um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional contendo apenas a região variável de uma cadeia pesada ou a região variável de uma cadeia leve. Em algumas ocasiões, duas ou mais regiões VH estão unidas covalentemente com um ligante peptídico para criar um anticorpo domínio bivalente. As duas regiões VH de um anticorpo domínio bivalente podem estar dirigidas ao mesmo ou a antígenos diferentes.

Um "anticorpo bivalente" compreende dois locais de ligação ao antígeno. Em algumas ocasiões, os dois locais de ligação têm as mesmas especificidades do antígeno. Contudo, anticorpos bivalentes podem ser biespecíficos (ver a seguir) .

Como usado aqui, o termo anticorpo "Fv de cadeia simples" ou "scFv" refere-se a fragmentos do anticorpo que compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presente numa única cadeia do polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o sFv forme a estrutura desejada para a ligação do antígeno. Para uma revisão sobre sFv, ver Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, volume 113, Rosenburg e Moore editores Springer-Verlag, Nova Iorque, páginas 269-315.

Os anticorpos monoclonais aqui também incluem anticorpos de domínio simples camelizados. Ver, por exemplo, Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sei. 17 26:230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; documento WO 94/04678; documento WO 94/25591; Patente U.S. N.° 6 005 079). Numa modalidade, a presente invenção providencia anticorpos de domínio simples que compreendem dois domínios VH com modificações de tal maneira que os anticorpos de domínio único são formados.

Como usado aqui, o termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) ligados a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL ou VL-VH) . Ao utilizar um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antígeno. Os diacorpos são descritos com mais detalhe em, por exemplo, documento EP 404, 097; documento WO 93/11161; e Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448. Para uma revisão sobre variantes de anticorpo fabricadas por engenharia genética ver geralmente Holliger e Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.

Como usado aqui, o termo "anticorpo humanizado" refere-se a formas de anticorpos que contêm sequências de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) bem como anticorpos humanos. Tais anticorpos contêm a sequência mínima derivada da imunoglobulina não humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos, ou substancialmente todos, os loops hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina 18 não humana e todas, ou substancialmente todas, as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante da imunoglobulina (Fc) , tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. 0 prefixo "hum", "hu" ou "h" é adicionado às designações do clone do anticorpo quando necessário para distinguir anticorpos humanizados (por exemplo huml3B8) dos anticorpos parentais de roedor (por exemplo 13B8 de ratinho, ou ml3B8). As formas humanizadas de anticorpos de roedor compreenderão geralmente as mesmas sequências CDR dos anticorpos parentais de roedor, apesar de poderem ser incluídas certas substituições de aminoácidos para aumentar a afinidade, aumentar a estabilidade do anticorpo humanizado, ou por otras razões.

Os anticorpos da presente invenção também incluem anticorpos com regiões Fc modificadas (ou bloqueadas) para providenciar funções efetoras alteradas. Ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 5 624 821; documento W02003/086310; documento W02005/120571; documento W02006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656. Tal modificação pode ser utilizada para aumentar ou suprimir várias reações do sistema imune, com possíveis efeitos benéficos no diagnóstico e terapêutica. As alterações da região Fc incluem alterações de aminoácidos (substituições, eliminações e inserções), glicosilação ou desglicosilação, e adição de múltiplas Fc. Alterações às Fc também podem alterar a meia-vida dos anticorpos em anticorpos terapêuticos, e uma meia-vida mais longa resultaria numa dosagem menos frequente, com o aumento concomitante da conveniência e utilização diminuída do material. Ver Presta 19 (2005) J. Allergy Clin. Immunol.116:731 páginas 734-35. O termo "anticorpo inteiramente humano" refere-se a um anticorpo gue compreende apenas seguências proteicas da imunoglobulina humana. Um anticorpo inteiramente humano pode conter cadeias de carboidratos murinos, se produzidas num ratinho, numa célula de ratinho, ou num hibridoma derivado de uma célula de ratinho. Da mesma forma, "anticorpo de ratinho" refere-se a um anticorpo gue compreende apenas sequências de imunoglobulina de ratinho. Um anticorpo inteiramente humano pode ser gerado num ser humano, num animal transgénico que tem sequências germinativas da imunoglobulina humana, por exposição a fago ou por outros métodos biológicos moleculares.

Como usado aqui, o termo "região hipervariável" refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma "região determinante de complementariedade" ou "CDR" (por exemplo resíduos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) e 89-97 (CDRL3) no domínio variável da cadeia leve e resíduos 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) e 95-102 (CDRH3) no domínio variável da cadeia pesada (Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, 5a Edição. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) e/ou aqueles resíduos de um "loop hipervariável" (isto é resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada (Chothia e Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196 : 901-917). Como usado aqui, o termo resíduos "estruturais" ou "FR" referem-se àqueles resíduos do domínio variável que não são os resíduos da 20 região hipervariável definidos aqui como resíduos CDR. A numeração do resíduo anterior refere-se ao sistema de numeração Kabat e não corresponde necessariamente em detalhe à numeração da sequência da Listagem de Sequências em anexo. "Composto de ligação" refere-se a uma molécula, molécula pequena, macromolécula, polipeptídeo, anticorpo ou fragmento ou análogo do mesmo, ou recetor solúvel, capaz de se ligar a um alvo. "Composto de ligação" também se pode referir a um complexo de moléculas, por exemplo, um complexo não covalente, a uma molécula ionizada, e a uma molécula modificada covalentemente ou não covalentemente, por exemplo, modificada por fosforilação, acilação, reticulação, ciclização, ou clivagem limitada, que é capaz de se ligar a um alvo. Quando utilizada com referência a anticorpos, o termo "composto de ligação" refere-se a ambos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. "Ligação" refere-se a uma associação da composição de ligação a um alvo onde a associação resulta na redução no movimento Browniano normal da composição de ligação, em casos onde a composição de ligação pode ser dissolvida ou suspensa na solução. "Composição de ligação" refere-se a uma molécula, por exemplo um composto de ligação, em combinação com um estabilizador, excipiente, sal, tampão, solvente, ou aditivo, capaz de se ligar a um alvo. "Variantes modificadas conservadoramente" ou "substituição conservadora" refere-se a substituições de aminoácidos qu são conhecidas daqueles com habilitação nesta arte e que podem ser feitas geralmente sem alterar a atividade biológica da molécula resultante, mesmo em regiões essenciais do polipeptídeo. Tais substituições 21 exemplares sao preferencialmente feitas em concordância com aquelas estabelecidas adiante no Quadro 1 como se segue:

Quadro 1

Substituições de aminoácidos conservadoras exemplares Original Resíduo da substituição conservadora Resíduo original Substituição conservadora Ala (A) Gly; Ser Arg (R) Lys, His Asn (N) Gin; His Asp (D) Glu; Asn Cys (C) Ser; Ala Gin (Q) Asn Glu (E) Asp; Gin Gly (G) Ala His (H) Asn; Gin He (I) Leu; Vai Leu (L) Ile; Vai Lys (K) Arg; His Met (M) Leu; Ile; Tyr Phe (F) Tyr; Met; Leu Pro (P) Ala Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr (Y) Trp; Phe Vai (V) Ile; Leu

Adicionalmente, aqueles habilitados nesta arte reconhecem que, em geral, substituições de aminoácidos simples em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica. Ver, por 22 exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., página 224 (4a Edição). A frase "consiste essencialmente em, " ou variações tais como "consistem essencialmente em" ou "consistindo essencialmente em," como utilizada ao longo da especificação e reivindicações, indica a inclusão de quaisquer elementos ou grupo de elementos recitados, e a inclusão opcional de outros elementos, de natureza semelhante ou diferente do que os elementos recitados, que não mudam materialmente as propriedades básicas ou novas do regime de dosagem especificado, método, ou composição. Como um exemplo não limitante, um composto de ligação que consiste essencialmente numa sequência de aminoácido recitada pode também incluir um ou mais aminoácidos, incluindo substituições de um ou mais residuos de aminoácido, que não afetam materialmente as propriedades do composto de ligação. "Quantidade eficaz" abrange uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um sintoma ou sinal da condição médica. Quantidade eficaz também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. Uma quantidade eficaz para um paciente particular ou sujeito veterinário pode variar dependendo de fatores tais como a condição patológica a ser tratada, o estado de saúde global do paciente, a via do método e dose de administração e a severidade dos efeitos secundários. Ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 5 888 530. Uma quantidade eficaz pode ser a dose máxima ou o protocolo de dosagem que evita efeitos secundários significativos ou efeitos tóxicos. O efeito resultará numa melhoria de uma medida ou parâmetro do 23 diagnóstico em pelo menos 5%, normalmente em pelo menos 10%, mais normalmente pelo menos 20%, o mais normal pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 40%, mais preferencialmente pelo menos 50%, o mais preferencial pelo menos 60%, idealmente pelo menos 70%, mais idealmente pelo menos 80%, e o mais ideal pelo menos 90%, onde 100% é definido como o parâmetro diagnóstico exibido por um sujeito normal. Ver, por exemplo, Maynard et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinicai Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinicai Practice, Urch Publ., London, UK. "Condição imune" ou "distúrbio imune" abrange, por exemplo, uma inflamação patológica, um distúrbio inflamatório, e um distúrbio ou doença autoimune. "Condição imune" também se refere a infeções, infeções persistentes, e condições proliferativas, tais como cancro, tumores, e angiogénese, incluindo infeções, tumores, e cancros que resistem a erradicação pelo sistema imune. "Condição cancerosa" inclui, por exemplo, cancro, células cancerosas, tumores, angiogénese, e condições patológicas pré-cancerosas tais como displasia. "Distúrbio inflamatório" significa um distúrbio ou condição patológica onde a patologia resulta, no todo ou em parte, em, por exemplo, uma alteração no número, alteração na taxa de migração, ou alteração na ativação, de células do sistema imune. As células do sistema imune incluem, por exemplo, células T, células B, monócitos ou macrófagos, células apresentadoras de antigeno (APC), células dendriticas, microglia, células NK, células NKT, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos, ou qualquer outra célula especificamente associada com a imunologia, por 24 exemplo, células epiteliais ou endoteliais produtoras de citocina.

Uma "célula produtora de IL-17" significa uma célula T que não é uma célula T tipo TH1 clássica ou uma célula T tipo TH2 clássica, referidas como células TH17. As células Th17 são discutidas com grande detalhe em Cua e Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559; Tato e 0'Shea (2006) Nature 441:166-168; Iwakura e Ishigame (2006) J. Clin. Invest. 116:1218-1222. "Célula produtora de IL-17" também significa uma célula T que expressa um gene ou polipeptídeo do Quadro 10B da publicação do pedido de Patente U.S. N.° 2004/0219150 (por exemplo, proteína P recetiva ao mitogénio; ligando 2 da quemoquina; interleucina-17 (IL-17); fator de transcrição RAR relacionado; e/ou supressor da sinalização da citocina 3), onde a expressão com tratamento por um agonista da IL-23 é maior do que a por tratamento com um agonista da IL-12, onde "maior do que" é definido como se segue. A expressão com um agonista da IL-23 é normalmente pelo menos 5 vezes maior, tipicamente pelo menos 10 vezes maior, mais tipicamente pelo menos 15 vezes maior, o mais típico pelo menos 20 vezes maior, preferencialmente pelo menos 25 vezes maior, e o mais preferencial pelo menos 30 vezes maior, do que com o tratamento com IL-12. A expressão pode ser medida, por exemplo, com tratamento de uma população de células produtoras da IL-17 substancialmente puras. Uma resposta Thl7 é uma resposta imune na qual a atividade e/ou proliferação das células Thl7 são aumentadas, tipicamente unidas com uma resposta Thl reprimida.

Além disso, "célula produtora de IL-17" inclui uma célula progenitora ou precursora que é dedicada, por via de 25 desenvolvimento celular ou de diferenciação celular, a diferenciar-se numa célula produtora de IL-17, como definido anteriormente. Uma célula progenitora ou precursora da célula produtora de IL-17 pode ser encontrada num nódulo linfático de drenagem (DLN). Além disso, "célula produtora de IL-17" abrange uma célula produtora de IL-17, como definido anteriormente, que foi, por exemplo, ativada, por exemplo, por um éster de forbol, ionóforo, e/ou carcinogénio, adicionalmente diferenciados, armazenados, congelados, dissecados, desativados, parcialmente degradados, por exemplo, por apóptose, proteólise, ou oxidação lipidica, ou modificados, por exemplo, por tecnologia recombinante.

Como usado aqui, o termo "molécula de ácido nucleico isolada" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está normalmente associada na fonte natural do ácido nucleico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucleico isolada encontra-se noutra forma ou cenário que não são aqueles em que é encontrada na natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas são distinguidas, assim, da molécula de ácido nucleico tal como existe nas células naturais. Contudo, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente expressam o anticorpo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização no cromossoma diferente daquela das células naturais. A expressão "sequências controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência codificante ligada operativamente num organismo 26 hospedeiro particular. As sequências controlo que são adequadas para procariontes, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um local de ligação ao ribossoma. As células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação, e potenciadores.

Um ácido nucleico é "ligado operativamente" quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou líder secretor está ligado operativamente ao ADN para um polipeptídeo se é expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou potenciador é ligado operativamente a uma sequência codificante se afeta a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma é ligado operativamente a uma sequência codificante se é posicionado de maneira a facilitar a tradução. Geralmente, "ligado operativamente" significa que as sequências de ADN a ser ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretor, contíguas e na mesma grelha de leitura. Contudo, os potenciadores não têm que ser contíguos. A ligação é conseguida por ligação em locais de restrição convenientes. Se tais locais não existem, os adaptadores ou ligantes oligonucleotídeos sintéticos são utilizados de acordo com a prática convencional.

Como usado aqui, as expressões "célula," "linha de células," e "cultura de células" são utilizadas alternadamente e todas tais designações incluem progénia. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem uma célula sujeito primário e culturas derivadas dela sem consideração pelo número de 27 transferências. Também é entendido que toda a progénia pode não ser exatamente idêntica no conteúdo de ADN, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. A progénie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como classificado na célula originalmente transformada são incluídas. Onde designações distintas são pretendidas, tornar-se-á claro pelo contexto.

Como usado aqui, "reação em cadeia da polimerase" ou "PCR" refere-se a um procedimento ou técnica na qual quantidades minuto de uma peça específica de ácido nucleico, ARN e/ou ADN, são amplificadas como descrito em, por exemplo, Patente U.S. N.° 4 683 195. Geralmente, é necessário que a informação da sequência das extremidades da região de interesse, ou para lá delas, esteja disponível, de tal maneira que podem ser desenhados iniciadores de oligonucleotídeo; estes iniciadores serão idênticos ou semelhantes na sequência às cadeias opostas do molde a ser amplificado. Os nucleotídeos do terminal 5' dos dois iniciadores podem coincidir com as extremidades do material amplificado. A PCR pode ser utilizada para amplificar sequências de ARN específicas, sequências de ADN específicas do ADN genómico total, e ADNc transcrito do ARN celular total, sequências de bacteriofago ou plasmídeo, etc. Ver geralmente Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.) Como utilizado aqui, a PCR é considerada como um, mas não o único, exemplo de um método de reação da polimerase de ácido nucleico para amplificar uma amostra teste de ácido nucleico que compreende a uilização de um ácido nucleico conhecido como um iniciador e uma polimerase de ácido nucleico para 28 amplificar ou gerar uma peça específica do ácido nucleico.

Como usado aqui, o termo "sequência germinativa" refere-se a uma sequência de sequências de ADN de imunoglobulina desarranjadas, incluindo sequências germinativas de roedor (por exemplo ratinho) e humanas. Pode ser utilizada qualquer fonte adequada de ADN de imunoglobulina desarranjada. Sequências germinativas humanas podem ser obtidas, por exemplo, das bases de dados germinativas JOINSOLVER ® na página de internet do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e da Pele dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos. Podem ser obtidas sequências germinativas de ratinho, por exemplo, como descrito em Giudicelli et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33:D256-D261.

Para examinar a extensão da inibição da atividade da IL-23, por exemplo, amostras ou ensaios que compreendem um dado, por exemplo, proteína, gene, célula, ou organismo, são tratados com um agente inibidor ou ativador potencial e são comparados com amostras controlo sem o agente. É atribuído às amostras controlo, isto é, não tratadas com o agente, um valor de atividade relativa de 100%. A inibição é conseguida quando o valor de atividade relativa em relação ao controlo é cerca de 90% ou inferior, tipicamente 85% ou inferior, mais tipicamente 80% ou inferior, o mais típico 75% ou inferior, geralmente 70% ou inferior, mais geralmente 65% ou inferior, o mais geral 60% ou inferior, tipicamente 55% ou inferior, normalmente 50% ou inferior, mais normalmente 45% ou inferior, o mais normal 40% ou inferior, preferencialmente 35% ou inferior, mais preferencialmente 30% ou inferior, ainda mais preferencialmente 25% ou inferior, e o mais preferencial 29 inferior a 25%. A ativação é conseguida quando o valor de atividade relativa em relação ao controlo é cerca de 110%, geralmente pelo menos 120%, mais geralmente pelo menos 140%, mais geralmente pelo menos 160%, frequentemente pelo menos 180%, mais frequentemente pelo menos 2 vezes, o mais frequente pelo menos 2,5 vezes, normalmente pelo menos 5 vezes, mais normalmente pelo menos 10 vezes, preferencialmente pelo menos 20 vezes, mais preferencialmente pelo menos 40 vezes, e o mais preferencial mais de 40 vezes superior.

Os pontos finais na ativação ou inibição podem ser monitorizados como se segue. A ativação, inibição, e resposta ao tratamento, por exemplo, de uma célula, fluido fisiológico, tecido, orgão, e sujeito animal ou humano, podem ser monitorizados por um ponto final. O ponto final pode compreender uma quantidade ou percentagem pré-determinada de, por exemplo, indícios de inflamação, oncogenicidade, ou desgranulação ou secreção da célula, tal como a libertação de uma citocina, oxigénio tóxico, ou uma protease. O ponto final pode compreender, por exemplo, uma quantidade pré-determinada de fluxo ou transporte iónico; migração celular; adesão celular; proliferação celular; potencial para metástase; diferenciação celular; e alteração no fenótipo, por exemplo, alteração na expressão do gene relacionado com a inflamação, apóptose, transformação, ciclo celular, ou metástase (ver, por exemplo, Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sei. 30:145-158; Hood e Cheresh (2002) Nature Rev. Câncer 2:91-100; Timme et al. (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261; Robbins e Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am. 86:1467-1495; Grady e Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; 30

Bauer, et al. (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic e Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126).

Um ponto final de inibição é geralmente 75% do controlo ou inferior, preferencialmente 50% do controlo ou inferior, mais preferencialmente 25% do controlo ou inferior, e o mais preferencial 10% do controlo ou inferior. Geralmente, um ponto final de ativação é pelo menos 150% o controlo, preferencialmente pelo menos duas vezes o controlo, mais preferencialmente pelo menos quatro vezes o controlo, e o mais preferencial pelo menos 10 vezes o controlo. "Molécula pequena" é definida como uma molécula com um peso molecular que é inferior a 10 kDa, tipicamente inferior a 2 kDa, e preferencialmente inferior a 1 kDa. Moléculas pequenas incluem, mas não se limitam a, moléculas inorgânicas, moléculas orgânicas, moléculas orgânicas contendo um componente inorgânico, moléculas que compreendem um átomo radioativo, moléculas sintéticas, péptidos miméticos, e anticorpos miméticos. Como um terapêutico, uma molécula pequena pode ser mais permeável às células, menos suscetível à degradação, e menos apta a despoletar uma resposta imune do que as moléculas grandes. São descritas moléculas pequenas, tais como péptidos miméticos de anticorpos e citocinas, bem como toxinas de moléculas pequenas. Ver, por exemplo, Casset et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205; Muyldermans (2001) J. Biotechnol. 74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol. 18:1251-1256; Apostolopoulos et al. (2002) Curr. Med. Chem. 9:411-420; Monfardini et al. (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Domingues et al. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:652-656; Sato e Sone (2003) Biochem. J. 31 371: 603-608; Patente U.S. N.° 6 326 482.

Ligado "especificamente" ou "seletivamente", quando se refere a um ligando/recetor, anticorpo/antigeno, ou outro par de ligação, indica uma reação de ligação que é determinante da presença da proteína numa população heterogénea de proteínas e outros biológicos. Assim, em condições designadas, um ligando específico liga-se a um recetor particular e não se liga numa quantidade significativa a outras proteínas presentes na amostra. Como usado aqui, diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um polipeptídeo que compreende uma dada sequência (neste caso IL-23pl9) e se liga a polipeptídeos que compreendem a sequência da IL-23pl9 mas não se liga a proteínas que não têm a sequência da IL-23pl9. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo que compreende IL-23pl9 pode ligar-se a uma forma rotulada FLAG ® da IL-23pl9 mas não se ligará a outras proteínas rotuladas FLAG ®. O anticorpo, ou composição de ligação derivada do local de ligação ao antígeno de um anticorpo, do método contemplado liga-se ao seu antígeno com uma afinidade que é pelo menos duas vezes superior, preferencialmente pelo menos dez vezes superior, mais preferencialmente pelo menos 20 vezes superior, e o mais preferencial pelo menos 100 vezes superior à afinidade com antígenos não relacionados. Numa modalidade preferida, o anticorpo terá uma afinidade que é superior a cerca de 109 litros/mol, como determinado, por exemplo, por análise Scatchard. Munsen et al. (1980)

Analyt. Biochem. 107:220-239.

Como usado aqui, o termo "agente imunomodulador" refere-se a agentes naturais ou sintéticos que suprimem ou 32 modulam uma resposta imune. A resposta imune pode ser uma resposta humoral ou celular. Os agentes imunomoduladores abrangem agentes imunossupressores ou anti-inflamatórios. "Agentes imunossupressores," "fármacos imunossupressores, " ou "imunossupressores" como usado aqui são terapêuticos que são utilizados em terapêuticas imunossupressoras para inibir ou prevenir a atividade do sistema imune. Clinicamente são utilizados para prevenir a rejeição de orgãos e tecidos transplantados (por exemplo medula óssea, coração, rim, fígado), e/ou no tratamento de doença autoimunes ou doenças que são muito provavelmente de origem autoimune (por exemplo artrite reumatóide, miastenia grave, lúpus eritematoso sistémico, colite ulcerosa, esclerose múltipla). Os fármacos imunossupressores podem ser classificados em quatro grupos: glicocorticóides citostáticos; anticorpos (incluindo Modificadores de Resposta Biológica ou DMARD); fármacos que atuam em imunofilinas; outros fármacos, incluindo agentes quemoterapêuticos conhecidos utilizados no tratamento de distúrbios proliferativos. Para a esclerose múltipla, em particular, os anticorpos da presente invenção podem ser administrados em conjunto com uma nova classe de terapêuticos tipo proteína de ligação da mielina, conhecidos como copaxonas. "Agentes anti-inflamatórios" ou "fármacos anti-inf lamatórios", é utilizado para representar ambos terapêuticos esteroidais e não esteroidais. Os esteróides, também conhecidos como corticosteróides, são fármacos que se assemelham intimamente ao cortisol, uma hormona produzida naturalmente pelas glândulas adrenais. Os esteróides são utilizados como o tratamento principal para 33 certas condições patológicas inflamatórias, tais como: vasculite sistémica (inflamação dos vasos sanguíneos); e miosite (inflamação do músculo). Os esteróides também podem ser utilizados seletivamente para tratar condições patológicas inflamatórias tais como: artrite reumatóide (artrite inflamatória crónica que ocorre nas articulações em ambos os lados do corpo); lúpus eritematoso sistémico (uma doença generalizada causada por uma função anormal do sistema imune); síndrome de Sjõgren (distúrbio crónico que causa olhos secos e boca seca). Fármacos anti-inflamatórios não esteroidais, normalmente abreviados para NSAID, são fármacos com efeitos analgésicos, antipiréticos e anti-inflamatórios - reduzem a dor, febre e inflamação. 0 termo "não esteroidal" é utilizado para distinguir estes fármacos dos esteróides, que (entre uma ampla gama de outros efeitos) têm uma ação depressora dos eicosanóides, anti-inflamatória semelhante. NSAID são geralmente indicados para o alívio sintomático das seguintes condições patológicas: artrite reumatóide; osteoartrite; artropatias inflamatórias (por exemplo espondilite anquilosante, artrite psoriática, Síndrome de Reiter); gota aguda; dismenorreia; dor óssea metastática; dor de cabeça e enxaqueca; dor pós-operatória; dor leve a moderada devido a inflamação e lesão de tecido; pirexia; e cólica renal. Os NSAID incluem salicilatos, ácidos arilalcanóicos, ácidos 2-arilpropiónicos (profenos), ácidos N-arilantranílicos (ácidos fenâmicos), oxicamos, coxibis, e sulfonanilidas. II. Geral A presente invenção providencia anticorpos anti-IL-23 fabricados por engenharia genética e utilizações dos mesmos 34 para tratar distúrbios inflamatórios, autoimunes, e proliferativos .

Um número de citocinas tem um papel na patologia ou reparação de distúrbios neurológicos. A IL-6, IL-17, interferão gamma (IFNgamma, IFN-γ), e fator de estimulação de colónia de granulócito (GM-CSF) têm sido associados com a esclerose múltipla. Matusevicius et al. (1999) Multiple sclerosis 5:101-104; Lock et al. (2002) Nature Med. 8:500-508. A IL-lalfa, IL-lbeta, e o fator de crescimento transformador beta 1 (TGF-betal) desempenham um papel nas ALS, doença de Parkinson, e doença de Alzheimer. Hoozemans et al. (2001) Exp. Gerontol. 36:559-570; Griffin e Mrak (2002) J. Leukocyte Biol. 72:233-238; Ilzecka et al. (2002) Cytokine 20:239-243. A TNF-alfa, IL-lbeta, IL-6, IL-8, interferão-gamma, e IL-17 parecem modular a resposta à isquemia cerebral. Ver, por exemplo, Kostulas et al. (1999) Stroke 3 0:2174-2179; Li et al. (2001) J. Neuroimmunol. 116:5-14. 0 fator de crescimento da célula endotelial vascular (VEGF) está associado com ALS. Cleveland e Rothstein (2001) Nature 2:806-819.

Distúrbios inflamatórios do intestino, por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerosa, doença celíaca, e síndrome do intestino irritável, são mediados por células do sistema imune e por citocinas. Por exemplo, a doença de Crohn está associada com IL-12 e IFNy aumentados, enquanto a colite ulcerosa está associada com IL-5, IL-13, e fator de crescimento transformador beta (TGFbeta) aumentados. A expressão da IL-17 pode também aumentar na doença de Crohn e na colite ulcerosa. Ver, por exemplo, Podolsky (2002) New Engl. J. Med. 347:417-429; Bouma e Strober (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:521-533; Bhan et al. (1999) Immunol. Rev. 35 169:195-207; Hanauer (1996) New Engl. J. Med. 334:841-848; Green (2003) The Lancet 362:383-391; McManus (2003) New Engl. J. Med. 348:2573-2574; Horwitz e Fisher (2001) New Engl. J. Med. 344:1846-1850; Andoh et al. (2002) Int. J. Mol. Med. 10:631-634; Nielsen et al. (2003) Scand. J. Gastroenterol. 38:180-185; Fujino et al. (2003) Gut 52:65-70. O recetor da IL-23 é um complexo heterodimérico das subunidades IL-23R e IL-12í^l. Ver Parham et al. (2000) J. Immunol. 168:5699. O recetor da IL-12 é um complexo das subunidades IL-12RP1 e IL-12Rβ2. Ver Presky et al. (1996) Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 93:14002. A IL-23R foi implicada como um fator genético critico nos distúrbios inflamatórios do intestino, doença de Crohn e colite ulcerosa. Duerr et al. (2006) Sciencexpress 26 de Outubro de 2006:1. Um estudo de associação amplo de genoma verificou que o gene para a IL-23R estava altamente associado com a doença de Crohn, com uma variante codificante pouco comum (Arg381 Gin) conferindo forte proteção contra a doença. Esta associação genética confirma observações biológicas prévias (Yen et al. (2006) J. Clin. Investigation 116:1218) que sugerem que a IL-23 e o seu recetor são alvos promissores para novas abordagens terapêuticas para tratar IBD.

Doenças inflamatórias da pele, articulações, CNS, bem como distúrbios proliferativos despoletam respostas imunes semelhantes, assim o bloqueio da IL-23 deveria providenciar a inibição destes distúrbios inflamatórios mediados pelo sistema imune, sem compreender a capacidade do hospedeiro para lutar contra infeções sistémicas. Antagonizar a IL-23 deveria aliviar a inflamação associada com a doença inflamatória do intestino, a doença de Crohn, a colite 36 ulcerosa, a artrite reumatóide, a artrite psoriática, a psoriase, a espondilite anquilosante, e a dermatite atópica. A utilização de inibidores da IL-23 também providenciará a inibição de distúrbios proliferativos, por exemplo, cancro e distúrbios autoimunes, por exemplo, esclerose múltipla, diabetes de tipo I, e SLE. Descrições de IL-23 nestes vários distúrbios podem ser encontradas nos seguintes pedidos de PCT publicados: documento WO 04/081190; documento WO 04/071517; documento WO 00/53631; e documento WO 01/18051. Os inibidores da IL-23 também podem encontrar uso no tratamento de infeções, incluindo infeções crónicas, tais como infeções bacterianas, micobacterianas, virais e fúngicas. A subunidade pl9 da IL-23 é um membro da família 'cadeia longa' das citocinas hematopoiéticas (Oppmann et al. (2000) supra) e compreende quatro hélices α acumuladas designadas A, B, C e D, com uma topologia cima-cima-baixo-baixo. As 4 hélices estão ligadas por 3 loops de polipeptídeo. Os loops A-B e C-D são modelados para serem relativamente longos uma vez que ligam hélices paralelas. O loop curto B-C liga as hélices ant i-paralelas B e C. A subunidade pl9 da IL-23 é um membro da família da IL-6 de citocinas helicoidais. Esta família de citocinas liga-se aos seus recetores cognatos através de três epítopos conservados (local I, II e III; Bravo e Heath (2000) EMBO J. 19:2399-2411). A subunidade pl9 interage com três subunidades do recetor da citocina para formar o complexo sinalizador competente. Quando expressa numa célula, a subunidade pl9 primeiro forma um complexo com a subunidade p40, que partilha com a IL-12. Como notado anteriormente, o complexo pl9p40 é secretado da célula como uma proteína 37 heterodimérica e é designado IL-23. Ver, por exemplo, Oppmann et al., supra. 0 complexo do recetor celular requerido para transduzir o sinal da IL-23 consiste em dois membros das altas subunidades do recetor sinalizador da família de citocinas IL-6/IL-12, a IL-23R específica da IL-23 (ver, por exemplo, Parham et al., supra) e a IL-12Rbl, que é partilhada com IL-12. 0 entendimento da base estrutural do reconhecimento citocina 'cadeia longa'/recetor mostraram que apesar das grandes áreas da superfície da proteína estarem enterradas na formação de complexos citocina-recetor, a afinidade da interação é dominada por uns poucos resíduos de aminoácido, frequentemente agrupados firmemente, que formam um 'ponto quente' energético no centro da interface de ligação. A identidade dos resíduos que dominam a energia de ligação de uma grande interface proteína-proteína tem sido designada 'epítopo funcional.' A afinidade da interação (e, portanto, especificidade biológica) é consequentemente definida pela complementariedade estrutural dos epítopos funcionais de ligando e recetor. Estudos mutagénicos detalhados mostraram que os resíduos mais significativos que constituem os epítopos funcionais das citocinas e recetores são contactos hidrofóbicos que envolvem tanto cadeias laterais não polares tais como triptofano, os componentes alifáticos das cadeias laterais não polares ou a estrutura do polipeptídeo. 0 'núcleo' não polar é rodeado por um halo de resíduos polares de menor importância para a energia de ligação. Estudos cinéticos indicam que o papel primário dos epítopos funcionais é estabilizar a interação proteína-proteína diminuindo a taxa de dissociação do complexo. Tem sido sugerido que o contacto incial entre citocina e 38 recetor é dominado por difusão aleatória ou 'rolamento' das superfícies da proteína produzindo muitos contactos instáveis. 0 complexo é depois estabilizado quando os epítopos funcionais do recetor e ligando engatam. Ver, por exemplo, Bravo e Heath, supra. III. Geração de anticorpos específicos da IL-23

Pode ser utilizado qualquer método adequado para gerar anticorpos monoclonais. Por exemplo, um recetor pode ser imunizado com uma forma ligada ou não ligada (por exemplo que ocorre naturalmente) do heterodímero da IL-23, ou um fragmento do mesmo. Pode ser utilizado qualquer método adequado de imunização. Tais métodos podem incluir adjuvantes, outros imunoestimulantes, imunizações de reforço repetidas, e o uso de uma ou mais vias de imunização.

Pode ser utilizada qualquer fonte adequada de IL-23, como o imunogene, para a geração de anticorpo não humano, específico para a subunidade pl9, das composições e métodos revelados aqui. Tais formas incluem, mas não se limitam a toda a proteína, incluindo heterodímeros ligados e que ocorrem naturalmente, péptido(s), e epítopos, gerados através de meios de degradação recombinante, sintética, química ou enzimática conhecidos na arte.

Qualquer forma do antígeno pode ser utilizada para gerar o anticorpo que é suficiente para gerar um anticorpo biologicamente ativo. Assim, o antígeno obtido pode ser um único epítopo, epítopos múltiplos, ou a proteína inteira isolada ou em combinação com um ou mais agentes potenciadores de imunogenicidade conhecidos na arte. 0 antígeno obtido pode ser uma proteína de comprimento inteiro isolada, uma proteína de superfície celular (por 39 exemplo, imunizando com células transfetadas com pelo menos uma porção do antigeno), ou uma proteína solúvel (por exemplo, imunizando com apenas a porção do domínio extracelular da proteína). 0 antigeno pode ser produzido numa célula modificada geneticamente. 0 ADN que codifica o antigeno pode ser genómico ou não genómico (por exemplo, ADNc) e codifica pelo menos uma porção do domínio extracelular. Como usado aqui, o termo "porção" refere-se ao número mínimo de aminoácidos ou ácidos nucleicos, como apropriado, para constituir um epítopo imunogénico do antigeno de interesse. Quaisquer vetores genéticos adequados para a transformação das células de interesse podem ser empregues, incluindo, mas não limitados a, vetores adenovirais, plasmídeos, e vetores não virais, tais como lípidos catiónicos.

Qualquer método adequado pode ser utilizado para obter um anticorpo com as propriedades biológicas desejadas para inibir a IL-23. É desejável preparar anticorpos monoclonais (Acm) de vários hospedeiros mamíferos, tais como ratinhos, roedores, primatas, humanos, etc. A descrição de técnicas para preparar tais anticorpos monoclonais pode ser encontrada em, por exemplo, Stites et al. (editores) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4a Edição) Lange Medicai Publications, Los Altos, CA, e referências nele citadas; Harlow e Lane (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, Nova Iorque, NY. Assim, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos a partir de uma variedade de técnicas familiares aos investigadores habilitados na arte. Tipicamente, células do baço de um animal imunizado com um antigeno desejado são 40 imortalizadas, normalmente por fusão com uma célula de mieloma. Ver Kohler e Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519. Métodos alternativos de imortalização incluem transformação com virus de Epstein Barr, oncogenes, ou retrovirus, ou outros métodos conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Doyle et al. (editores; 1994 e suplementos periódicos) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley e Filhos, Nova Iorque, NY. As colónias que surgem de células imortalizadas únicas são classificadas para a produção de anticorpos da especificidade e afinidade pelo antigeno desejadas, e a produção dos anticorpos monoclonais produzidos por tais células pode ser aumentada por várias técnicas, incluindo injeção na cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebrado. Em alternativa, alguém pode isolar sequências de ADN que codificam um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo através da classificação de uma biblioteca de ADN de células B humanas de acordo, por exemplo, com o protocolo geral definido por Huse et al. (1989) Science 246 :1275-1281.

Outras técnicas adequadas envolvem a seleção de bibliotecas de anticorpos em fago ou vetores semelhantes. Ver, por exemplo, Huse et al. supra; e Ward et al. (1989) Nature 341:544-546. Os polipeptideos e anticorpos da presente invenção podem ser utilizados com ou sem modificação, incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados. Frequentemente, os polipeptideos e anticorpos serão rotulados unindo, seja covalentemente ou não covalentemente, uma substância que providencia um sinal detetável. Uma grande variedade de rótulos e técnicas de conjugação são conhecidas e são reportadas extensivamente 41 em ambas literatura científica e de patentes. Rótulos adequados incluem radioisótopos, enzimas, substratos, co-fatores, inibidores, frações fluorescentes, frações quemiluminescentes, partículas maqnéticas, e afins. Patentes que ensinam o uso de tais rótulos incluem Patente U.S. N.°s 3 817 837; 3 850 752; 3 939 350; 3 996 345; 4 277 437; 4 275 149; e 4 366 241. Também podem ser produzidas imunoqlobulinas recombinantes, ver Cabilly Patente U.S. N.° 4 816 567; e Queen et al. (1989) Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 86:10029-10033; ou feitas em ratinhos transqénicos, ver Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156. Ver também tecnoloqias Abgenix e Medarex.

Anticorpos de composições de ligação contra fragmentos de IL-23 pré-determinados podem ser criados por imunização de animais com conjugados do polipeptídeo, fragmentos, péptidos, ou epítopos com proteínas de transporte. Anticorpos monoclonais são preparados a partir de células que secretam o anticorpo desejado. Estes anticorpos podem ser classificados para ligação a IL-23 normal ou defeituosa. Estes anticorpos monoclonais ligar-se-ão normalmente com pelo menos um Kd de cerca de 1 μΜ, mais normalmente pelo menos cerca de 300 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM ou melhor, normalmente determinado por ELISA. Anticorpos não humanos adequados podem também ser identificados utilizando os ensaios biológicos descritos nos Exemplos 5 e 6, a seguir.

Um hibridoma que expressa o anticorpo 13B8 foi depositado de acordo com o Tratado de Budapeste, com a Coleção de Culturas Tipo Americana (ATCC - Manassas, Virgínia, EUA) em 17 de Agosto de 2006 sob a acessão número PTA-7803. 42 IV. Humanização dos anticorpos específicos da IL-23

Qualquer anticorpo não humano adequado pode ser utilizado como uma fonte para a reqião hipervariável. Fontes para anticorpos não humanos incluem, mas não se limitam a, murinos, lagomorfos (incluindo coelhos), bovinos, e primatas. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo do recetor) nos quais os resíduos da região hipervariável do recetor são substituídos pelos resíduos da região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo do dador) tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas. Em algumas ocasiões, os resíduos Fv da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo do recetor ou no anticorpo do dador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo na atividade biológica desejada. Para mais detalhes, ver Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Reichmann et al. (1988) Nature 332:323-329; e Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.

Foram descritos métodos para fabricar anticorpos por engenharia genética recombinante, por exemplo, por Boss et al. (Patente U.S. N.° 4 816 397), Cabilly et al. (Patente U.S. N.° 4 816 567), Law et al. (Publicação do pedido de Patente Europeia N.° EP438310A1) e Winter (Patente Europeia N.0 EP239400B1) .

Variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo anti-IL-23 humanizado são preparadas introduzindo alterações nucleotídicas apropriadas no ADN do anticorpo 43 anti-IL-23 humanizado, ou por síntese peptídica. Tais variantes incluem, por exemplo, eliminações de, e/ou inserções em, e/ou substituições de, resíduos dentro das sequências de aminoácidos mostradas para o anticorpo anti-IL-23 humanizado. Qualquer combinação de eliminação, inserção, e substituição é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As alterações dos aminoácidos também podem alterar os processos pós-translacionais do anticorpo anti-IL-23 humanizado, tais como alterar o número ou posição dos locais de glicosilação.

Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do polipeptídeo do anticorpo anti-IL-23pl9 humanizado que são locais preferidos para a mutagénese é designado "mutagénese de digitalização da alanina," como descrito por Cunningham e Wells (1989) Science 244: 1081-1085. Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvo são identificados (por exemplo, resíduos carregados tais como Arg, Asp, His, Lys, e Glu) e substituídos por um aminoácido carregado negativamente ou neutro (o mais preferencial alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno IL-23. Os resíduos de aminoácido que demonstram sensibilidade funcional às substituições são depois refinados introduzindo outras variantes, ou variantes adicionais nos, ou para, os locais de substituição. Assim, enquanto o local para introduzir uma variação da sequência do aminoácido é pré-determinado, a natureza da mutação per se não precisa de ser pré-determinada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação num dado local, a mutagénese aleatória ou de digitalização de Ala é conduzida no codão ou região alvo e 44 as variantes do anticorpo anti-IL-23pl9 humanizado expressas são classificadas de acordo com a atividade desejada.

As inserções da sequência de aminoácido incluem fusões de terminal amino e/ou carboxilo que oscilam em comprimento de um resíduo a polipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, bem como inserções intra-sequência de resíduos de aminoácido único ou múltiplo. Exemplos de inserções de terminal incluem o anticorpo anti-IL-23 humanizado com um resíduo metionilo no terminal N ou o anticorpo fundido a uma etiqueta de epítopo. Outras variantes insercionais da molécula do anticorpo anti-IL-23 humanizado incluem a fusão aos terminais N ou C do anticorpo anti-IL-23 humanizado de uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida do soro do anticorpo.

Outro tipo de variante é uma variante de substituição do aminoácido. Estas variantes têm, pelo menos um resíduo do aminoácido na molécula do anticorpo anti-IL-23pl9 humanizado removida e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os locais de maior interesse para a mutagénese de substituição incluem os loops hipervariáveis, mas as alterações de FR também são contempladas. tripeptídicas

Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o padrão original de glicosilação do anticorpo. Por alterar quer-se dizer eliminar uma ou mais frações do carboidrato encontradas no anticorpo, e/ou adicionar um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação dos anticorpos está tipicamente ligada quer a N ou ligada a 0. Ligada a N refere-se à anexação da fração de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências 45 asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a anexação enzimática da fração de carboidrato à cadeia lateral da asparagina. Assim, a presença de qualquer uma destas sequências tripeptidicas num polipeptídeo cria um local de glicosilação potencial. A glicosilação ligada a 0 refere-se à anexação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um ácido hidroxiamino, sendo o mais comum serina ou treonina, apesar de também poderem ser utilizados 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina. A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é convenientemente conseguida alterando a sequência do aminoácido de tal maneira que contém uma ou mais das sequências tripeptídicas descritas anteriormente (para locais de glicosilação ligados a N) . A alteração pode também ser feita adicionando, ou substituindo por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para locais de glicosilação ligados a 0) .

Ainda outro tipo de variante de aminoácido é a substituição de resíduos para providenciar uma maior estabilidade química do anticorpo humanizado final. Por exemplo, um resíduo de asparagina (N) pode ser alterado para reduzir o potencial de formação de isoaspartato em quaisquer sequências NG dentro de uma CDR de um roedor. Um problema semelhante pode ocorrer numa sequência DG. Reissner e Aswad (2003) Cell. Mol. Life Sei. 60:1281. A formação de isoaspartato pode debilitar ou abolir completamente a ligação de um anticorpo ao seu antígeno alvo Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 na 46 página 734. Numa modalidade, a asparagina é alterada para glutamina (Q). Além disso, resíduos de metionina na CDR de roedor podem ser modificados para reduzir a possibilidade de que o enxofre da metionina oxide, o que reduziria a afinidade de ligação ao antígeno e também contribuiria para a heterogeneidade molecular na preparação do anticorpo final. Id. Numa modalidade, a metionina é alterada para alanina (A). Os anticorpos com tais substituições são subsequentemente classificados para assegurar que as substituições não diminuíram a afinidade de ligação da IL23pl9 para níveis inaceitáveis.

As moléculas de ácido nucleico que codificam as variantes da sequência do aminoácido do anticorpo humanizado específico da IL-23 são preparadas através de uma variedade de métodos conhecidos na arte. Estes métodos incluem, mas não se limitam a, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes da sequência do aminoácido que ocorrem naturalmente) ou preparação por mutagénese mediada por oligonucleotídeo (ou dirigida a local), mutagénese por PCR, e mutagénese por cassete de uma variante preparada previamente ou uma versão não variante do anticorpo anti-IL-23pl9 humanizado.

Normalmente, as variantes da sequência do aminoácido do anticorpo anti-IL-23 humanizado terão uma sequência do aminoácido que tem, pelo menos 75% de identididade com a sequência do aminoácido com as sequências do aminoácido do anticorpo humanizado original de tanto a cadeia leve ou pesada, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, e o mais preferencial pelo menos 95, 98, ou 99%. A identidade ou homologia no que se refere a esta 47 sequência é definida aqui como a percentaqem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos com os resíduos anti-IL-23 humanizados, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para atingir a identidade percentual da sequência máxima, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade da sequência. Nenhuma das extensões, eliminações, ou inserções internas, do terminal N ou do terminal C, na sequência do anticorpo serão construídas afetando a identidade ou homologia da sequência. 0 anticorpo humanizado pode ser selecionado a partir de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA, e IgE. Preferencialmente, o anticorpo é um anticorpo IgG. Qualquer isotipo de IgG pode ser utilizado, incluindo IgGi, IgG2, IgG3, e IgG4. Também são contempladas variantes dos isotipos IgG. 0 anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais do que uma classe ou isotipo. A otimização das sequências do domínio constante necessária para gerar a atividade biologica desejada é prontamente conseguida classificando os anticorpos nos ensaios biológicos descritos anteriormente.

Da mesma maneira, qualquer classe de cadeia leve pode ser utilizada nas composições e métodos aqui. Especificamente, kappa, lambda, ou variantes das mesmas são úteis nas presentes composições e métodos.

Qualquer porção adequada das sequências da CDR do anticorpo não humano pode ser utilizada. As sequências da CDR podem ser mutagenizadas por substituição, inserção ou eliminação de pelo menos um resíduo de tal maneira que a sequência da CDR é diferente da sequência do anticorpo humano e não humano empregue. Está contemplado que tais 48 mutações seriam mínimas. Tipicamente, pelo menos 75% dos resíduos do anticorpo humanizado corresponderão àqueles dos resíduos CDR não humanos, mais frequentemente 90%, e o mais preferencial superior a 95%.

Qualquer porção adequada das sequências FR do anticorpo humano pode ser utilizada. As sequências FR podem ser mutagenizadas por substituição, inserção ou eliminação de, pelo menos um resíduo de tal maneira que a sequência FR é diferente da sequência do anticorpo humano e não humano empregue. Está contemplado que tais mutações seriam mínimas. Tipicamente, pelo menos 75% dos resíduos do anticorpo humanizado corresponderão aos resíduos FR humanos, mais frequentemente 90%, e o mais preferencial superior a 95, 98, ou 99%.

Os resíduos CDR e FR são determinados de acordo com a definição padrão de sequência de Kabat. Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda Md. As SEQ. ID N.°s 1-5 mostram as sequências do domínio variável da cadeia pesada de vários anticorpos IL-23pl9 anti-humanos de ratinho, e as SEQ. ID N.°s 9-13 representam as sequências do domínio variável da cadeia leve. As Figuras 1 e 2 providenciam alinhamentos de sequência dos domínios variáveis da cadeia leve e pesada dos vários anticorpos da presente invenção. As CDR estão indicadas nas figuras, e as sequências CDR individuais são cada apresentadas com Identificadores de Sequência únicos como indicado no Quadro 7. São providenciadas formas humanizadas do anticorpo 13B8. A sequência 13B8 da cadeia leve humanizada (com região constante kappa) é providenciada na SEQ. ID N.° 14, e o domínio variável da cadeia leve compreende os resíduos 49 1-108 dessa sequência. Três versões da sequência 13B8 da cadeia pesada humanizada (com reqiões constantes γΐ) são providenciadas nas SEQ. ID N.°s 6-8, e o dominio variável da cadeia pesada compreende os resíduos 1-116 dessas sequências. As variantes 13B8 das cadeias pesadas são ilustradas no Quadro 2, com as diferenças da sequência parental indicadas a negrito. A Met (M) foi modificda para Lys (K) para evitar o potencial para oxidação do resíduo e desativação do anticorpo. A substituição de AQKLQ por NEMFE é uma substituição da sequência CDR de murino com a sequência germinativa humana da estrutura humana selecionada para humanizar o anticorpo. 50

Quadro 2

Variantes 13B8 CDRH2 do anticorpo Anticorpo Sequência CDRH2 SEQ. ID N.0 ml3B8, hl3B8-a QIFPASGSADYNEMFEG 24 hl3B8-b QIFPASGSADYNEKFEG 25 hl3B8-c QIFPASGSADYAQKLQG 26

Formas humanizadas dos outros anticorpos revelados aqui podem ser criadas substituindo simplesmente as CDR do anticorpo parental de roedor nas sequências da cadeia leve e pesada para 13B8 humanizado providenciado nas SEQ. ID N.°s 14 e 6. Esta abordagem será mais provavelmente bem-sucedida para as cadeias do anticorpo com CDR tendo elevada homologia com a CDR do anticorpo 13B8, por exemplo clone 11C1 na cadeia pesada e clones 11C1 e 21D1 na cadeia leve. Em alternativa, os anticorpos murinos podem ser independentemente humanizados utilizando as abordagens definidas aqui, por exemplo no Exemplo 2.

Numa modalidade, as CDR incluem variantes de qualquer sequência CDR única revelada aqui (SEQ. ID N.°s 15-46), nas quais a variante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições conservadoras de aminoácidos em relação à sequência revelada, como determinado utilizando os dados do Quadro 1.

Também contemplados são os anticorpos quiméricos. Como indicado anteriormente, os anticorpos quiméricos típicos compreendem uma porção da cadeia leve e/ou pesada idêntica a, ou homóloga a, sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse particular de anticorpo, enquanto o restante da cadeia(s) é idêntico a, ou homólogo a, 51 sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada. Ver Patente U.S. N.° 4 816 567; e Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855.

Anticorpos biespecíficos são também úteis nos métodos e composições presentes. Como usado aqui, o termo "anticorpo biespecífico" refere-se a um anticorpo, tipicamente um anticorpo monoclonal, que tem especificidades de ligação por, pelo menos dois epítopos antigénicos diferentes, por exemplo, IL-23pl9 e IL-17. Numa modalidade, os epítopos são do mesmo antígeno. Numa outra modalidade, os epítopos são de dois antígenos diferentes. Métodos para fabricar anticorpos biespecíficos são conhecidos na arte. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser produzidos recombinantemente utilizando a co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve da imunoglobulina. Ver, por exemplo, Milstein et al. (1983) Nature 305: 537-39. Em alternativa, os anticorpos biespecíficos podem ser preparados utilizando a ligação química. Ver, por exemplo, Brennan et al. (1985) Science 229:81. Os anticorpos biespecíficos incluem fragmentos de anticorpo biespecífico. Ver, por exemplo, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90:6444-48, Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152:5368.

Ainda noutras modalidades, os domínios constantes diferentes podem ser anexados às regiões VL e VH humanizadas providenciadas aqui. Por exemplo, se um uso particular pretendido de um anticorpo (ou fragmento) da presente invenção requeresse funções efetoras alteradas, 52 poderia ser utilizado um domínio constante de cadeia pesada que não o IgGl. Apesar dos anticorpos IgGl providenciarem uma meia-vida longa e funções efetoras, tais como ativação do complemento e citotoxicidade celular dependente do anticorpo, tais atividades podem não ser desejáveis para todos os usos do anticorpo. Em tais ocasiões, pode ser utilizado, por exemplo, um domínio constante IgG4. V. Atividade biológica do anti-IL-23 humanizado

Os anticorpos com as características identificadas aqui como sendo desejáveis num anticorpo anti-IL-23 humanizado podem ser classificados em função da atividade biológica inibitória in vitro ou afinidade de ligação adequada. Para classificar os anticorpos que se ligam ao epítopo numa IL-23 humana (isto é, a subunidade pl9) ligada por um anticorpo de interesse (por exemplo, aqueles que bloqueiam a ligação da citocina ao seu recetor), pode ser realizado um ensaio de rotina de bloqueio cruzado tal como aquele descrito em ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988). Os anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo provavelmente bloquearão de forma cruzada em tais ensaios, mas não todos os anticorpos bloqueadores cruzados ligar-se-ão necessariamente ao mesmo epítopo exatamente, uma vez que o bloqueio cruzado pode resultar de obstáculos estéricos à ligação do anticorpo por ligação de anticorpos nos epítopos sobrepostos, ou mesmo nos epítopos próximos não sobrepostos.

Em alternativa, pode ser realizado o mapeamento de epítopo, por exemplo, como descrito em Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394, para determinar se o anticorpo se liga a um epítopo de interesse. "Mutagénese de 53 digitalização de alanina," como descrita por Cunningham e Wells (1989) Science 244: 1081-1085, ou uma outra forma de mutagénese pontual de residuos de aminoácido na IL-23 humana pode também ser utilizada para determinar o epítopo funcional para um anticorpo anti-IL-23 da presente invenção. Estudos mutagénicos, contudo, também podem revelar residuos de aminoácido que são cruciais para a estrutura tri-dimensional global da IL-23 mas que não estão diretamente envolvidos em contactos anticorpo-antigeno, e assim outros métodos podem ser necessários para confirmar um epítopo funcional determinado utilizando este método. A ligação do epítopo por um anticorpo específico também pode ser determinada avaliando a ligação do anticorpo a péptidos que compreendem fragmentos da IL-23pl9 humana (SEQ. ID N.° 47) . A sequência da subunidade p40 da IL-12 e IL23 encontra-se na acessão do GenBank N.° P29460. Uma série de péptidos sobrepostos abrangendo a sequência da IL23pl9 pode ser sintetizada e classificada para ligação, por exemplo num ELISA direto, num ELISA competitivo (onde o péptido é avaliado pela sua capacidade de prevenir a ligação de um anticorpo a IL-23pl9 ligado a um poço de uma placa de titulação), ou um chip. Tais métodos de classificação do péptido podem não ser capazes de detetar alguns epítopos funcionais descontínuos, isto é, epítopos funcionais que envolvem resíduos de aminoácido que não são contíguos ao longo da sequência primária da cadeia polipeptídica da IL-23pl9. A ligação do epítopo por anticorpos da presente invenção também pode ser determinada por métodos estruturais, tais como determinação da estrutura de cristal por raios X (por exemplo, documento WO2005/044853), 54 modelação molecular e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), incluindo determinação por NMR das taxas de intercâmbio H-D de hidrogénios de amida lábeis na IL-23 quando livres e quando ligados num complexo com um anticorpo de interesse (Zinn-Justin et al.(1992) Biochemistry 31:11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32:6884-6891).

Em relação à cristalografia por raios X, a cristalização pode ser conseguida utilizando qualquer dos métodos conhecidos na arte (por exemplo Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23), incluindo micro-batelada (por exemplo Chayen (1997) Structure 5:1269-1274), difusão a vapor de gota suspensa (por exemplo McPherson (1976) J Biol. Chem. 251:6300-6303), verding e diálise. É desejável usar uma preparação de proteína com uma concentração de, pelo menos cerca de 1 mg/mL, e preferencialmente cerca de 10 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. A cristalização pode ser melhor conseguida numa solução precipitante que contém poletileno glicol 1000-20,000 (PEG; peso molecular médio que oscila de cerca de 1000 a cerca de 20, 000 Da), preferencialmente cerca de 5000 a cerca de 7000 Da, mais preferencialmente cerca a 6000 Da, com concentrações que oscilam de cerca de 10% a cerca de 30% (p/v). Também pode ser desejável incluir um agente estabilizador de proteína, por exemplo glicerol a uma concentração que oscila de cerca de 0,5% a cerca de 20%. Um sal adequado, tal como cloreto de sódio, cloreto de lítio ou citrato de sódio também pode ser desejável na solução precipitante, preferencialmente a uma concentração que oscila de cerca de 1 mM a cerca de 1000 mM. O precipitante é preferencialmente tamponado a um pH de cerca 55 de 4,0 a cerca de 10,0, frequentemente de cerca de 7,0 a 8,5, por exemplo pH 8,0. Tampões úteis específicos na solução precipitante podem variar e são bem conhecidos na arte. Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, 3a Edição, (1994) Springer-Verlag, Nova Iorque. Exemplos de tampões úteis incluem, mas não se limitam a, HEPES, Tris, MES e acetato. Os cristais podem ser crescidos numa ampla gama de temperaturas, incluindo 2°C, 4°C, 8°C e 26 °C.

Cristais de anticorpo:antígeno podem ser estudados utilizando técnicas de difração por raios X bem conhecidas e podem ser refinados utilizando programas informáticos tais como X-PLOR (Universidade de Yale, 1992, distribuído por Molecular Simulations, Inc.; ver por exemplo Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al. editores, Academic Press; Publicação do Pedido de Patente U.S. N.° 2004/0014194), e BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Cárter & Sweet, editores; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323).

Podem ser obtidos anticorpos adicionais que se ligam ao mesmo epítopo como um anticorpo da presente invenção, por exemplo, classificando os anticorpos criados contra a IL-23 para ligação ao epítopo, ou por imunização de um animal com um péptido que compreende um fragmento da IL-23 humana que compreende a sequência do epítopo. Pode-se esperar que os anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo funcional exibam atividades biológicas semelelhantes, tais como bloqueio da ligação ao recetor, e tais atividades podem ser confirmadas por ensaios funcionais dos anticorpos. 56

As afinidades do anticorpo (por exemplo pela IL-23 humana) podem ser determinadas utilizando análises padrão. Os anticorpos humanizados preferidos são aqueles que ligam a IL-23pl9 humana com um valor de Kd não superior a cerca de lxlCT7; preferencialmente não superior a cerca de lxlCT8; mais preferencialmente não superior a cerca de lxlCT9; e o mais preferencial não superior a cerca de lxlO“10 ou mesmo lxlCT11 M.

Os anticorpos e fragmentos dos mesmos úteis nas composições e métodos presentes são anticorpos e fragmentos biologicamente ativos. Como usado aqui, o termo "biologicamente ativo" refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que é capaz de ligar o epítopo antigénico desejado e direta ou indiretamente exercer um efeito biológico. Tipicamente, estes efeitos resultam do fracasso da IL-23 em se ligar ao seu recetor. Como usado aqui, o termo "especifico" refere-se à ligação seletiva do anticorpo ao epítopo do antígeno alvo. Os anticorpos podem ser testados para especificidade de ligação comparando a ligação à IL-23 com a ligação a um antígeno ou mistura de antígeno irrelevante sob um conjunto determinado de condições. Se o anticorpo se liga à IL-23 pelo menos 10, e preferencialmente 50 vezes mais do que a um antígeno ou mistura de antígeno irrelevante então é considerado específico. Um anticorpo que se liga à IL-12 não é um anticorpo específico da IL-23. Um anticorpo que "se liga especificamente" a IL23pl9 não se liga a proteínas que não compreendem as sequências derivadas da IL-23pl9, isto é "especificidade" como usado aqui refere-se à especificidade a IL-23pl9, e não a quaisquer outras sequências que podem estar presentes na proteína em questão. Por exemplo, como 57 usado aqui, um anticorpo que "se liga especificamente" a IL-23pl9 ligar-se-á tipicamente a FLAG ®-hIL-23pl9, que é uma proteína de fusão que compreende IL-23pl9 e um rótulo peptídico FLAG ®, mas não se liga ao rótulo peptídico FLAG® sozinha ou quando é fundida com outras proteínas que não a IL-23pl9. 0 anticorpo específico da IL-23 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção, tais como anticorpos específicos da IL-23pl9 inibitórios, pode inibir a sua atividade biológica de qualquer maneira, incluindo, mas não limitado a, a produção de IL-Ιβ e TNF por macrófagos peritoneais e IL-17 por células T TH17. Ver Langrish et al. (2004) Immunol. Rev. 202:96-105. Os anticorpos anti-IL-23pl9 também serão capazes de inibir a expressão dos genes da IL-17A, IL-17F, CCL7, CCL17, CCL20, CCL22, CCR1, e GM-CSF. Ver Langrish et al. (2005) J. Exp. Med. 201:233-240. O anticorpo específico de IL-23 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção, tais como anticorpos anti-IL-23pl9, também bloquearão a capacidade da IL-23 de aumentar a proliferação ou sobrevivência das células TH17. Cua e Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559. A atividade inibitória do anti-IL-23pl9 fabricado por engenharia genética será útil no tratamento de distúrbios inflamatórios, autoimunes, e proliferativos. Exemplos de tais distúrbios estão descritos nas publicações dos pedidos de Patente PCT WO 04/081190; WO 04/071517; WO 00/53631; e WO 01/18051. VI. Composições farmacêuticas

Para preparar composições farmacêuticas ou estéreis incluindo o anticorpo IL-23pl9, o análogo ou mutante da citocina, anticorpo desse, ou ácido nucleico do mesmo, é 58 misturado com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences e U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).

Formulações de agentes terapêuticos e de diagnóstico podem ser preparadas misturando com veículos fisiologicamente aceitáveis, excipientes, ou estabilizadores sob a forma de, por exemplo, pós liofilizados, pastas fluídas, soluções ou suspensões aquosas. Ver, por exemplo, Hardman et al. (2001) Goodman e Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nova Iorque, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, e Wilkins, Nova Iorque, NY; Avis et al. (editores) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Mareei Dekker, NY; Lieberman, et al. (editores) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Mareei Dekker, NY; Lieberman et al. (editores) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Mareei Dekker, NY; Weiner e Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, NY. A toxicidade e eficácia terapêutica das composições do anticorpo, administradas isoladas ou em combinação com um agente imunossupressor, podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão da dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos constitui o índice terapêutico e pode ser expresso como a razão da LD50 para a ED50. Os anticorpos que exibem índices terapêuticos 59 elevados são preferidos. Os dados obtidos a partir destes ensaios de cultura de células e estudos animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagens para uso em humanos. A dosagem de tais compostos reside preferencialmente num intervalo de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro deste intervalo dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. 0 modo de administração não é particularmente importante. Vias de administração adequadas podem, por exemplo, incluir administração oral, retal, transmucosal, ou intestinal; entrega parentérica, incluindo injeções intramusculares, intradérmicas, subcutâneas, intramedulares, bem como injeções intratecais, intraventriculares diretas, intravenosas, intraperitoneais, intranasais, ou intraoculares. A administração do anticorpo utilizado na composição farmacêutica ou para praticar o método da presente revelação pode ser realizada numa variedade de formas convencionais, tais como ingestão oral, inalação, aplicação tópica ou cutânea, injeção subcutânea, intraperitoneal, parentérica, intra-arterial ou intravenosa.

Em alternativa, alguém pode administrar o anticorpo de uma maneira local em vez de sistémica, por exemplo, via injeção do anticorpo diretamente numa articulação artrítica ou lesão induzida por um patógeno caracterizada por imunopatologia, frequentemente numa formulação depot ou de libertação prolongada. Além disso, alguém pode administrar o anticorpo num sistema de entrega do fármaco dirigido, por exemplo, num lipossoma revestido com um anticorpo 60 específico de tecido, dirigido a, por exemplo, articulação artrítica ou lesão induzida por patógeno caracterizada por imunopatologia. Os lipossomas serão dirigidos para e preparados seletivamente por um tecido gravemente atingido.

Selecionar um regime de administração para um terapêutico depende de vários fatores, incluindo a taxa de rendimento do tecido ou soro da entidade, o nível dos sintomas, a imunogenicidade da entidade, e a accessibilidade das células T alvo na matriz biológica. Preferencialmente, um regime de administração maximiza a quantidade de terapêutico entregue ao paciente consistente com um nível aceitável de efeitos secundários. Em conformidade, a quantidade de biológico entregue depende em parte da entidade particular e da severidade da condição patológica a ser tratada. Orientação na seleção das doses apropriadas de anticorpos, citocinas, e moléculas pequenas está disponível. Ver, por exemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (editora) (1991) Monoclonal antibodies, cytokines and arthritis, Mareei Dekker, Nova Iorque, NY; Bach (editora) (1993) Monoclonal antibodies and petide Therapy in autoimmune diseases, Mareei Dekker, Nova Iorque, NY; Baert et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med 341:1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602. A determinação da dose apropriada é feita pelo clínico, por exemplo, utilizando parâmetros ou fatores conhecidos ou suspeitos na arte de afetar o tratamento ou 61 que se prevê que afetem o tratamento. Geralmente, a dose começa com uma quantidade um tanto inferior à dose ótima e é aumentada em pequenos incrementos a partir dai até o efeito desejado ou ótimo ser conseguido em relação a quaisquer efeitos secundários negativos. Medidas importantes de diagnóstico incluem aquelas de sintomas de, por exemplo, a inflamação ou nível de citocinas inflamatórias produzidas. Preferencialmente, um biológico que será utilizado é substancialmente derivado das mesmas espécies que o animal selecionado para tratamento (por exemplo um anticorpo humanizado para tratamento de sujeitos humanos), minimizando assim qualquer resposta imune ao reagente.

Anticorpos, fragmentos de anticorpo, e citocinas podem ser providenciados por infusão contínua, ou por doses em intervalos de, por exemplo, um dia, 1-7 vezes por semana, uma semana, duas semanas, mensalmente, bimestralmente, etc. As doses podem ser providenciadas por via intravenosa, subcutânea, tópica, oral, nasal, retal, intramuscular, intracerebral, intra-espinal, ou por inalação. Um protocolo de dosagem preferido é um que envolve a dose máxima ou frequência de doses que evita efeitos secundários indesejados significativos. Uma dose total semanal é geralmente pelo menos 0,05 pg/kg, 0,2 pg/kg, 0,5 pg/kg, 1 pg/kg, 10 pg/kg, 100 pg/kg, 0,2 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg do peso corporal ou mais. Ver, por exemplo, Yang et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold et al. (2002) New Engl. J Med. 346:1692-1698; Liu et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67: 451-456; Portielji et al. (20003) Câncer Immunol. Immunother. 52:133-144. A dose desejada de uma 62 molécula pequena terapêutica, por exemplo, um péptido mimético, produto natural, ou químico orgânico, é próxima da mesma que para um anticorpo ou polipeptídeo, numa base de moles/kg.

Como usado aqui, "inibe" ou "trata" ou "tratamento" inclui um adiamento do desenvolvimento dos sintomas associados com a doença autoimune ou imunopatologia induzida por um patógeno e/ou uma redução na severidade de tais sintomas que desenvolverão ou que se espera que se desenvolvam. Os termos incluem ainda a melhoria de sintomas existentes não controlados ou indesejados da imunopatologia induzida por um patógeno ou relacionada com autoimune, prevenindo sintomas adicionais, e a melhoria ou prevenção das causas subjacentes a tais sintomas. Assim, os termos denotam que um resultado benéfico foi conferido num sujeito vertebrado com uma doença ou sintoma de imunopatologia induzida por um patógeno ou autoimune, ou com o potencial de desenvolver tal doença ou sintoma.

Como usado aqui, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de um composto de ligação especifico da IL23pl9, por exemplo e anticorpo, que quando administrada isolada ou em combinação com um agente terapêutico adicional a uma célula, tecido, ou sujeito é eficaz para prevenir ou melhorar a doença autoimune ou imunopatologia induzida por um patógeno associada a doença ou condição patológica ou a progressão da doença. A dose terapeuticamente eficaz refere-se ainda àquela quantidade do composto suficiente para resultar na melhoria dos sintomas, por exemplo, tratamento, cura, prevenção ou melhoria da condição médica relevante, ou um aumento na taxa do tratamento, cura, 63 prevenção ou melhoria de tais condições patológicas. Quando aplicado a um ingrediente ativo individual administrado sozinho, a dose terapeuticamente eficaz refere-se àquele ingrediente sozinho. Quando aplicado a uma combinação, a dose terapeuticamente eficaz refere-se às quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, seja administrado em combinação, em série ou simultâneamente. Uma quantidade eficaz do terapêutico diminuirá os sintomas tipicamente em, pelo menos 10%; normalmente em pelo menos 20%; preferencialmente pelo menos cerca de 30%; mais preferencialmente pelo menos 40%, e o mais preferencial em pelo menos 50%. Métodos para a co-administração ou tratamento com um segundo agente terapêutico, por exemplo, uma citocina, anticorpo, esteróide, agente quemoterapêutico, antibiótico, ou radiação, são bem conhecidos na arte, ver, por exemplo, Hardman et al. (editores) (2001) Goodman e Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a Edição, McGraw-Hill, Nova Iorque, NY; Poole e Peterson (editores) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner e Longo (editores) (2001) Câncer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA. A composição farmacêutica da invenção pode também conter outros agentes imunossupressores ou imunomoduladores. Qualquer agente imunossupressor adequado pode ser empregue, incluindo, mas não limitado a, agentes anti-inflamatórios, corticoesteróides, ciclosporina, tacrolimus (isto é, FK-506), sirolimus, interferões, recetores de citocina solúveis (por exemplo, sTNRF e sIL-lR), agentes que neutralizam a atividade da citocina (por exemplo, 64 inflixmab, etanercept), mofetil micofenolato, 15-deoxispergualina, talidomida, glatirâmero, azatioprina, leflunomida, ciclofosfamida, metotrexato, e afins. A composição farmacêutica também pode ser empregue com outras modalidades terapêuticas tais como fototerapêutica e radiação.

Sujeitos veterinários, experimentais, ou de investigação típicos incluem macacos, cães, gatos, ratos, ratinhos, coelhos, cobaias, cavalos, e humanos. VII. Produção de anticorpo

Numa modalidade, para produção recombinante dos anticorpos da presente invenção, os ácidos nucleicos que codificam as duas cadeias são isolados e inseridos em um ou mais vetores replicáveis para clonagem adicional (amplificação do ADN) ou para expressão. 0 ADN que codifica o anticorpo monoclonal é prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não se limitam a, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem da replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor, e uma sequência de terminação da transcrição. Numa modalidade, ambas as cadeias leve e pesada do anticorpo anti-IL-23pl9 humanizado da presente invenção são expressas a partir do mesmo vetor, por exemplo um plasmídeo ou um vetor adenoviral.

Anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido na arte. Numa modalidade, os anticorpos são expressos em células de mamíferos ou de 65 insecto em cultura, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), células 293 embrionárias do rim humano (HEK), células NSO de mieloma de ratinho, células de rim de hamster bebé (BHK), células de ovário de Spodoptera frugiperda (Sf9). Numa modalidade, os anticorpos secretados das células CHO são recuperados e purificados por métodos cromatográficos padrão, tai como proteína A, troca de catiões, troca de aniões, interação hidrofóbica, e cromatografia com hidroxiapatita. Os anticorpos resultantes são concentrados e armazenados em acetato de sódio a 20 mM, pH 5,5.

Numa outra modalidade, os anticorpos da presente invenção são produzidos em leveduras de acordo com os métodos descritos no documento W02005/040395. Resumidamente, os vetores que codificam as cadeias pesada e leve individuais de um anticorpo de interesse são introduzidos em células haplóides de levedura diferentes, por exemplo tipos de cruzamento diferentes da levedura Pichia pastoris, cujas células haplóides de levedura são opcionalmente auxotróficos complementares. As células haplóides de levedura transformadas podem depois ser cruzadas ou fundidas para proporcionar uma célula diplóide de levedura capaz de produzir ambas cadeias leve e pesada. A estirpe diplóide é depois capaz de secretar o anticorpo completamente montado e biologicamente ativo. Os níveis de expressão relativos das duas cadeias podem ser otimizados, por exemplo, utilizando vetores com número de cópias diferente, utilizando promotores transcricionais de forças diferentes, ou induzindo a expressão de promotores induzíveis dirigindo a transcrição dos genes que codificam uma ou ambas as cadeias. 66

Numa modalidade, as cadeias leve e pesada respetivas de uma pluralidade de anticorpos anti-IL-23pl9 diferentes (os anticorpos "originais") são introduzidos em células haplóides de levedura para criar uma biblioteca de estirpes haplóides de levedura de um tipo de cruzamento que expressa uma pluralidade de cadeias leves, e uma biblioteca de estirpes haplóides de levedura de um tipo de cruzamento diferente que expressa uma pluralidade de cadeias pesadas. Estas bibliotecas de estirpes haplóides podem ser cruzadas (ou fundidas como esferoplastos) para produzir uma série de células diplóides de levedura que expressam uma biblioteca combinatória de anticorpos compreendidos pelas várias permutações possíveis das cadeias leve e pesada. A biblioteca combinatória de anticorpos pode depois ser classificada para determinar se quaisquer dos anticorpos têm propriedades que são superiores (por exemplo afinidade superior por EL-23) àquelas dos anticorpos originais. Ver, por exemplo, o documento W02005/040395.

Numa outra modalidade, os anticorpos da presente invenção são anticorpos do domínio humano no qual as porções de um domínio variável de anticorpo estão ligadas num polipeptídeo de peso molecular de aproximadamente 13 kDa. Ver, por exemplo, Publicação da Patente U.S. N.° 2004/0110941. Tal domínio único, agentes com baixo peso molecular providenciam numerosas vantagens em termos de facilidade de síntese, estabilidade e via de administração. VIII. Utilizações A presente revelação providencia métodos para utilizar anticorpos anti-IL-23 e fragmentos dos mesmos fabricados por engenharia genética para o tratamento e diagnóstico de distúrbios e condições patológicas inflamatórias, por 67 exemplo, do sistema nervoso central, sistema nervoso periférico, e trato gastrointestinal, bem como distúrbios autoimunes e proliferativos. Métodos são providenciados para o tratamento de, por exemplo, esclerose múltipla (MS), incluindo MS reincidente-remitente e MS primária progressiva, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica (a.k.a. ALS; doença de Lou Gehrig), lesão isquémica cerebral, doenças priónicas, e demência associada ao VIH. Também são providenciados métodos para tratar a dor neuropática, neuropatias pós-traumáticas, sindrome de Guillain-Barre (GBS), polineuropatia periférica, e regeneração nervosa. São providenciados métodos para tratar ou melhorar uma ou mais das seguintes características, sintomas, aspetos, manifestações, ou sinais de esclerose múltipla, ou outro distúrbio inflamatório ou condição patológica do sistema nervoso: lesões cerebrais, lesões da mielina, desmielinação, placas desmielinizadas, perturbação visual, perda de equilíbrio ou coordenação, espasticidade, perturbações sensoriais, incontinência, dor, fraqueza, fadiga, paralisia, enfraquecimento cognitivo, bradifrenia, diplopia, neurite ótica, parestesia, ataxia da marcha, fadiga, sintoma de Uhtoff, neuralgia, afasia, apraxia, ataques apopléticos, perda de campo visual, demência, fenómenos extrapiramidais, depressão, sentido de bem-estar, ou outros sintomas emocionais, mielopatia progressiva crónica, e um sintoma detetado por ressonância magnética (MRI), incluindo lesões potenciadores de gadolínio, gravação do potencial evocado, ou exame do fluído cerebrospinal. Ver, por exemplo, Kenealy et al. (2003) J. Neuroimmunol. 143:7-12; Noseworthy et al. (2000) New Engl. 68 J. Med 343:938-952; Miller et al. (2003) New Engl. J. Med 348:15-23; Chang et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:165-173; Bruck e Stadelmann (2003) Neurol. Sei. 24 Suppl. 5:S265-S26 7.

Além disso, a presente revelação providencia métodos paa tratar e diagnosticar distúrbios inflamatórios do intestino, por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerosa, doença celíaca, e síndrome do intestino irritável. São providenciados métodos para tratar ou melhorar um ou mais dos seguintes sintomas, aspetos, manifestações, ou sinais de um distúrbio inflamatório do intestino: má absorção da comida, motilidade alterada do intestino, infeção, febre, dor abdominal, diarreia, hemorragia retal, perda de peso, sinais de malnutrição, doença perianal, massa abdominal, e falha no crescimento, bem como complicações intestinais tais como estenose, fístulas, megacólon tóxico, perforação, e cancro, e incluindo observações endoscópicas, tais como, friabilidade, úlceras aftosas e lineares, aparecimento de pedras, pseudopólipos, e envolvimento retal e, além disso, anticorpos anti-levedura. Ver, por exemplo, Podolsky, supra; Hanauer, supra; Horwitz e Fisher, supra.

Também está contemplado o tratamento de distúrbios inflamatórios tais como psoríase, dermatite atópica, artrite, incluindo artrite reumatóide, osteoartrite, e artrite psoriática, distúrbios autoimunes, tais como lúpus eritematoso sistémico e diabetes de tipo I, e distúrbios proliferativos tais como cancro. Ver, por exemplo, Publicações de pedido de Patente PCT WO 04/081190; documento WO 04/071517; documento WO 00/53631; e documento WO 01/18051. O anticorpo IL-23pl9 ou fragmento de ligação ao 69 antígeno do mesmo da presente invenção também pode ser utilizado em combinação com um ou mais antagonistas de outras citocinas (por exemplo anticorpos), incluindo, mas não limitado a, IL-17A, IL-17F, IL-Ιβ, IL-6 e TGF-β. Ver, por exemplo, Veldhoen (2006) Immunity 24:179-189; Dong (2006) Nat. Rev. Immunol. 6(4):329-333. Em várias modalidades, um anticorpo IL-23pl9 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção é administrado antes, concorrentemente com, ou após administração do outro antagonista ou antagonistas, tais como um anticorpo anti-IL-17A. Numa modalidade, um composto de ligação IL-17A é utilizado no tratamento da fase inicial aguda de uma resposta imune adversa (por exemplo MS, doença de Crohn) sozinho ou em combinação com um anticorpo IL-23 antagonista da presente invenção. Neste último caso, o composto de ligação IT-17A pode ser gradualmente diminuído e o tratamento com o antagonista de IL23 sozinho é continuado para manter a supressão da resposta adversa. Em alternativa, os antagonistas do II-Ιβ, IL-6 e/ou TGF-β podem ser administrados concorrentemente, antes ou depois de um anticorpo IL-23pl9 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção. Ver Cua e Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559; Tato e 0'Shea (2006) Nature 441: 166-168; Iwakura e Ishigame (2006) J. Clin. Invest. 116:1218-1222. O amplo âmbito desta invenção é melhor compreendido com referência aos seguintes exemplos, que não se pretende que sejam limitantes das invenções às modalidades específicas. As modalidades específicas descritas aqui são oferecidas a título de exemplo apenas, e a invenção é para ser limitada pelos termos das reivindicações em anexo, 70 juntamente com o âmbito completo dos equivalentes aos quais tais reivindicações estão autorizadas. EXEMPLOS Exemplo 1 Métodos Gerais São descritos métodos padrão em biologia molecular. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning, 3a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Volume 217, Academic Press, San Diego, CA. Os métodos padrão também aparecem em Ausbel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Volumes 1-4, John Wiley e Filhos, Inc. Nova Iorque, NY, que descreve a clonagem em células bacterianas e mutagénese do ADN (Volume 1), clonagem em células de mamíferos e levedura (Volume 2), glicoconjugados e expressão de proteínas (Volume 3), e bioinformática (Volume 4) . São descritos métodos para puruficação de proteínas incluindo imunoprecipitação, cromatografia, eletroforese, centrifugação, e cristalização. Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Volume 1, John Wiley e Filhos, Inc., Noa Iorque. Análise química, modificação química, modificação pós-translacional, produção de proteínas de fusão, glicosilação de proteínas são descritas. Ver, por exemplo, Coligan et al. (2000) Current

Protocols in Protein Science, Volume 2, John Wiley e Filhos, Inc., Nova Iorque; Ausubel et al. (2001) Current

Sigma-

Protocols in Molecular Biology, Volume 3, John Wiley e Filhos, Inc., NY, NY, páginas 16.0.5-16.22.17; 71

Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; páginas 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., páginas 384-391. São descritas a produção, purificação, e fragmentação de anticorpos monoclonais e policlonais. Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Volume 1, John Wiley e Filhos, Inc., Nova Iorque; Harlow e Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow e Lane, supra. Estão disponíveis técnicas padrão para caracterizar as interações ligando/recetor. Ver, por exemplo, Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Volume 4, John Wiley, Inc., Nova Iorque.

Estão disponíveis métodos para citometria de fluxo, incluindo sistemas de deteção de classificação células ativadas por fluorescência (FACS ®) . Ver, por exemplo, Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principies for Clinicai Laboratory Practice, John Wiley e Filhos, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2a Edição; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley e Filhos, Hoboken, NJ. Reagentes fluorescentes adequados para modificar ácidos nucleicos, incluindo ácidos nucleicos iniciadores e sondas, polipeptídeos, e anticorpos, para utilização, por exemplo, como reagentes de diagnóstico, estão disponíveis. Molecular Probes (2003) Catálogo, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catálogo, St. Louis, MO. São descritos métodos padrão de histologia do sistema imune. Ver, por exemplo, Muller-Harmelink (editora) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, Nova Iorque, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas 72 of Histology, Lippincott, Williams, e Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Nova Iorque, NY.

Pacotes de programas informáticos e bases de dados para determinar, por exemplo, fragmentos antigénicos, sequências líder, dobragem de proteínas, domínios funcionais, locais de glicosilação, e alinhamentos de sequências, estão disponíveis. Ver, por exemplo, GenBank, Vector NTI ® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher ® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690.

Exemplo 2

Geração e humanização de anticorpos anti-IL-23pl9 humanos

Os anticorpos anti-IL-23pl9 humanos foram gerados imunizando ratinhos knockout IL-23pl9 com IL-23 quimérica (pl9 de humano: p40 de ratinho). Os anticorpos monoclonais foram preparados por métodos padrão. A humanização dos domínios variáveis do anticorpo 13B8 murino (IgGl/kappa de ratinho) foi realizada essencialmente como descrito nas publicações do pedido de Patente PCT WO 2005/047324 e WO 2005/047326.

Resumidamente, a sequência de aminoácido do domínio VH não humano do anticorpo 13B8 foi comparada a um grupo de cinco sequências de aminoácido germinativas humanas VH; uma representativa dos subgrupos IGHV1 e IGHV4 e três representativas do subgrupo IGHV3. Os subgrupos VH estão 73 listados em M.-P. Lefranc (2001) "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Heavy (IGH) Genes", Experimental and Clinicai Immunogenetics 18:100-116. O anticorpo 13B8 foi o que se classificou mais alto contra a cadeia pesada humana germinativa DP-14 no subgrupo VH1. A sequência VL do anticorpo 13B8 é da subclasse kappa da VL. A sequência de aminoácido do domínio VL não humano foi comparada com um grupo de quatro sequências de aminoácido germinativas kappa da VL humana. O grupo das quatro é compreendido por uma representativa de cada dos quatro subgrupos da VL humana estabelecidos listados em V. Barbie & M.-P. Lefranc (1998) "The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segments", Experimental and Clinicai Immunogenetics 15:171-183 e M.-P. Lefranc (2001) "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes", Experimental and Clinicai Immunogenetics 18:161-174. Os quatro subgrupos também correspondem aos quatro subgrupos listados em Kabat et al. (1991 - 5th Ed.) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos U.S., NIH Pub. 91-3242, páginas 103-130. O anticorpo 13B8 foi o que se classificou mais alto contra a cadeia leve germinativa Z-012 humana no subgrupo VLkl.

Substituições adicionais de aminoácidos foram feitas em CDRH2, como discutido supra e revelado nas SEQ. ID N.°s 24-26. Os domínios variáveis da cadeia leve e pesada 13B8 humanizada foram clonados em vetores que codificam um domínio constante da cadeia pesada humana γΐ (IgGl) e um domínio constante da cadeia leve kappa, respetivamente. O anticorpo 13B8 humanizado (IgGl/kappa) resultante liga-se a uma IL-23 humana e de macaco cinomolgos mas não a uma IL-12 74 humana, p40 humana ou IL-23 de ratinho.

Uma vez que as sequências de aminoácido alvo das cadeias variáveis pesada e leve são determinadas, os plasmideos qe codificam o anticorpo humanizado de comprimento inteiro podem ser geradas. As sequências de plasmideo podem ser alteradas utilizando mutagénese de Kunkel (Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 82:488-492) para alterar a sequência de ADN para as sequências de anticorpo humanizado alvo. Simultâneamente, a otimização do codão pode ser realizada para providenciar uma expressão potencialmente ótima.

Formas humanizadas de outros anticorpos reveladas aqui podem ser construídas substituindo as estruturas humanas reveladas para o anticorpo 13B8 humanizado, ou repetindo o procedimento para seleção das melhores estruturas humanas pelos métodos revelados neste Exemplo. A substituição das estruturas humanas revelados aqui como parte do anticorpo 13B8 humanizado é mais apropriada para anticorpos com sequências CDR semelhantes a 13B8.

Exemplo 3

Determinar a constante de dissociação de equilíbrio (Kd) para IL-23 anti-humano humanizado utilizando tecnologia KinExA A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) para anticorpos IL-23 anti-humanos é determinada utilizando o instrumento KinExA 3000. Sapidyne Instruments Inc., Boise Idaho, USA. KinExA utiliza o princípio do método de ensaio de exclusão cinético baseado na medição da concentração de anticorpo não complexado numa mistura de anticorpo, antígeno e complexo anticorpo-antigeno. A concentração do anticorpo livre é medida expondo a mistura a um antígeno 75 imobilizado em fase sólida durante um periodo muito curto de tempo. Na prática, isto é conseguido fluindo a mistura do antigeno-anticorpo em fase de solução através de partículas revestidas de antigeno presas numa célula de fluxo. Os dados gerados pelo instrumento são analisados utilizando programas informáticos personalizados. As constantes de equilíbrio são calculadas utilizando uma teoria matemática baseada nas seguintes assumpções: 1. A ligação segue a equação de ligação reversível para o equilíbrio: ^ligado [ AC ] [Ag] = kdesligado [AcAg] 2. 0 anticorpo (Ac) e antigeno (Ag) ligam 1:1 e o anticorpo total é igual ao complexo antígeno-anticorpo mais o anticorpo livre. 3. 0 sinal do instrumento está relacionado linearmente com a concentração do anticorpo livre.

Partículas PMMA com 98 micrón (Sapidyne, Cat N.° 440198) são revestidas com IL-23 biotinilada de acordo com "Protocolo para revestir partículas PMMA com ligandos biotinilados com braços ligantes curtos ou inexistentes " da Sapidyne. Nesta experiência, a IL-23 biotinilada compreende um complexo de IL-12p40 de ratinho e IL-23pl9 humana. Ligação EZ TFP PEO-biotina (Pierce, Cat. N.° 21219) é utilizada para fazer IL-23 biotinilada de acordo com as recomendações do fabricante (boletim Pierce 0874) . Todos os procedimentos experimentais são realizados de acordo com o manual do KinExA 3000. A ligação dos anticorpos anti-IL-23pl9 é avaliada num ensaio de competição de ligação, no qual os anticorpos são pré-incubados com IL-23 humana não ligada (nativa) que compreende duas cadeias com ligação dissulfida, pl9 humana 76 (SEQ. ID N.° 47) e p40 humana (acessão do GenBank N.° P29460), numa série de concentrações. As amostras resultantes, que compreendem uma mistura de anticorpos não ligados e anticorpos ligados a IL-23, são depois fluidos sobre partículas PMMA rhIL-23 ("elasticina") descritas no parágrafo anterior. A quantidade de anticorpo capturado pelas partículas PMMA é depois detetada utilizando um anticorpo secundário com marcação fluorescente. 0 Quadro 3 mostra os resultados da análise com o KinExA, incluindo determinações replicadas para cada anticorpo.

Quadro 3

Valores de K determinados por KinExA Anticorpo Kd_(pM) ml3B8 huml3B8-a huml3B8-b huml3B8-c 15,52 64±40, 110, 365, 447 47,470,520 47,52,470

Exemplo 4

Determinar a constante de dissociação de equilíbrio (Kd) para anticorpos IL-23pl9 anti-humana humanizados utilizando tecnologia BIAcore

As determinações por BIAcore são realizadas essencialmente como descrito no Exemplo 4 da Publicação do pedido de Patente U.S. cedida ao mesmo cessionário N.° 2007/0048315. Resumidamente, os ligandos (Acm anti-IL-23) são imobilizados num chip sensor BIAcore CM5 utilizando o procedimento padrão de acoplamento com amina. A IL-23 é diluída em PBS para produzir várias concentrações. As constantes cinéticas para as várias interações são 77 determinadas utilizando o programa BIAevaluation 3.1. A Kd é determinada utilizando as contantes da taxa de dissociação e associação calculadas. 0 Quadro 4 providencia os valores Kd como determinados por BIAcore, incluindo determinações replicadas.

Quadro 4

Determinação da Kd por BIAcore Anticorpo Kd (pM) ml3B8 173,228 huml3B8-a 72-104, 68-100, 81-129 huml3B8-b 77-129, 69-116 huml3B8-c 92-153

Exemplo 5

Bioensaios de proliferação para a avaliação de anticorpos anti-IL-23 neutralizadores A capacidade de um anticorpo monoclonal para neutralizar biologicamente a IL-23 foi avaliada pela aplicação de bioensaios de proliferação a curto-prazo que empregam células que expressam recetores recombinantes da IL-23. A linha de células transfetantes IL-23R (Ba/F3-2.210-hIL-23R) expressa ambas hIL-23R e hIL-12Rpi, e é recetiva a ambas IL-23 humana e IL-23 de macaco cinomolgos. As células transfetantes Ba/F3-2.21o proliferam em resposta à IL-23 humana e a resposta pode ser inibida por um anticorpo anti-IL-23 neutralizador. Um anticorpo é titulado contra uma concentração de IL-23 escolhida dentro da região linear da curva de dose-resposta, próximo da estabilização e acima da EC50. A proliferação, ou ausência da mesma, é medida por meios colorimétricos utilizando Azul de Alamar, 78 um corante indicador de crescimento baseado na deteção de atividade metabólica. A capacidade de um anticorpo para neutralizar a IL-23 é avaliada pelo ser valor de IC50, ou a concentração do anticorpo que induz a inibição de metade da máxima da proliferação da IL-23.

As Ba/F3 transfetantes são mantidas em meio RPMI-1640, 10% de soro fetal de bezerro, 50 μΜ de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L-Glutamina, 50 pg/mL de penicilina-estreptomicina, e 10 ng/mL de IL-3 de ratinho. Os ensaios de proliferação de Ba/F3 são realizados em meio RPMI-1640, 10% de soro fetal de bezerro, 50 μΜ de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L-Glutamina, e 50 pg/mL de penicilina-estreptomicina.

Procedimento

Os ensaios são realizados em placas de fundo raso com 96 poços (Falcon 3072 ou semelhante) em 150 pL por poço. Os anticorpos anti-IL-23 são pré-incubados com IL-23 durante 30-60 minutos, seguido de adição de células e incubação durante 40-48 horas. O azul de Alamar (Biosource Cat #DAL1100) é adicionado e permitido que desenvolva durante 5-12 horas. A absorvância é depois lida a 570 nm e 600 nm (Leitor de microplaca VERSAmax, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), e um OD 570-600 é obtido.

As células são utilizadas num estado de crescimento saudável, geralmente em densidades de 3-8 x 105/mL. As células são contadas, convertidas em bolas, lavadas duas vezes em meio de bioensaio, e suspensas à densidade apropriada para colocar na placa. Uma dose-resposta da IL-23 é realizada utilizando diluições em série de 1:3 (25:50 pL em meio de bioensaio) da IL-23. Uma concentração da IL-23 de 3 ng/ml (50 pM) é selecionada para utilização nos ensaios de anticorpo. Uma dose-resposta de anticorpo 79 neutralizador também é realizada utilizando diluições em série de 1:3 (25:50 pL em meio de bioensaio).

Os valores de IC50 são determinados utilizando o programa informático GraphPad Prism ® 3.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, Califórnia, USA), no qual a absorvância é desenhada num gráfico contra a concentração de citocina ou do anticorpo e os valores de IC5o são determinados utilizando uma regressão não linear (ajuste da curva) da dose-resposta sigmoidal. 0 Quadro 5 mostra os valores de IC50 para bloquear a proliferação da célula Ba/F3 por anticorpos anti-IL-23pl9. Os valores para determinações múltiplas são incluídos para alguns anticorpos.

Quadro 5

Valores de IC5o para bloquear a proliferação da célula Ba/F3 por anticorpos anti-IL-23 Anticorpo IC50 (PM) ml3B8 700 huml3B8-a 1100, 1100 huml3B8-b 1200, 1100 huml3B8-c 1100, 2200

Exemplo 6

Ensaio de esplenócito de ratinho para a IL-23 baseado na produção de IL-17 A atividade biológica dos anticorpos anti-IL-23pl9 da presente invenção é avaliada utilizando o ensaio de esplenócito essencialmente como descrito em Aggarwal et al. (2003) J. Biol. Chem. 278 : 1910 e Stumhofer et al. (2006) Nature Immunol. 7:937. O ensaio de esplenócito de ratinho mede a atividade da IL-23 numa amostra como o nível de 80 produção da IL-17 por esplenócitos murinos. A atividade inibitória dos anticorpos anti-IL-23pl9 é depois avaliada determinando a concentração do anticorpo necessária para reduzir a atividade da IL-23 numa dada amostra em 50% (a IC50) . A IC50 como medida por este ensaio é superior a, ou igual à constante de ligação de dissociação de equilíbrio (Kd) , isto é, a Kd pode ser igual a ou inferior a IC50. Como sempre, valores de IC50 e de Kd inferiores refletem atividades e afinidades superiores.

Resumidamente, os baços são obtidos de fêmeas de ratinhos C57BL/6J com 8-12 semanas de vida (Laboratórios Jackson, Bar Harbor, Maine, USA) . Os baços são prostrados, convertidos em bolas duas vezes, e filtrados através de um filtro de células (70 pm náilon). As células recuperadas são cultivadas em placas com 96 poços (4 X 105células/poço) na presença de IL-23 humana (10 ng/ml, ~170 pM) e anticorpos anti-CD3e de ratinho (1 pg/ml) (BD Pharmingen, Franklin Lakes, New Jersey, USA), com ou sem o anticorpo anti-IL-23pl9 a ser ensaiado. Os anticorpos anti-IL-23pl9 são adicionados a 10 pg/ml e numa série de 3 diluições. S células são cultivadas durante 72 horas, convertidas em bolas, e o sobrenadante é ensaiado para níveis de IL-17 por sandwich ELISA. A ELISA da IL-17 é realizada como se segue. As placas são revestidas com um anticorpo anti-IL-17 de captura (100 ng/poço) durante a noite a 4°C, lavadas e bloqueadas. As amostras e padrões são adicionados e incubados durante duas horas à temperatura ambiente com agitação. As placas são lavadas, e um anticorpo de deteção anti-IL-17 biotinilado (100 ng/poço) é adicionado e incubado durante uma hora à temperatura ambiente com agitação. Os anticorpos de captura 81 e deteção são anticorpos diferentes que se ligam ambos à IL-17 de ratinho mas não bloqueiam de forma cruzada. As placas são lavadas, e o anticorpo de deteção ligado é detetado utilizando estreptavidina-HRP (peroxidase de raiz-forte) e TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina). A placa é depois lida a 450-650 nm e a concentração da IL-17 em amostras é calculada por comparação com os padrões.

Os valores IC50 do ensaio de esplenócito são providenciados no Quadro 6, incluindo algumas determinações replicadas.

Quadro 6 IC5o do ensaio de esplenócito Clone do anticorpo IC50 (pM) ml3B8 28,54,64 huml3B8-a 71-108 huml3B8-b 110, 221 huml3B8-c 515

Exemplo 7

Caracterização de uma preparação de anticorpo 13B8-b anti-IL-23pl9 O anticorpo 13B8-b anti-IL-23pl9 humanizado é preparado a partir de células de mamíferos utilizando um vetor que alberga sequências de ADN que codificam as cadeias pesada e leve do 13B8-b, como providenciado nas SEQ. ID N.°s 49 e 50, respetivamente. O Hum 13B8-b tem um Kd de 297 pM para IL-23 humana quando ensaiado por análise BIAcore, essencialmente como descrito no Exemplo 4 (supra). A atividade biológica do huml3B8-b é avaliada 82 utilizando o ensaio de proliferação da Ba/F3, essencialmente como descrito no Exemplo 5 (supra), exceto que 340 pM da IL-23 é utilizado para estimular a proliferação, em vez de 50 pM. A atividade inibitória de anticorpos anti-IL-23pl9 (a IC50) é avaliada determinando a concentração do anticorpo necessária para reduzir a atividade da IL-23 numa dada amostra em 50%. Como sempre, valores de IC50 inferiores refletem actividades superiores. O Huml3B8-b exibe um IC50 de 187 pM no ensaio de proliferação da Ba/F3. A atividade biológica do huml3B8-b é também avaliada utilizando um ensaio de esplenócitos humanos, essencialmente como descrito no Exemplo 6 (supra) com a exceção de que os esplenócitos são obtidos a partir de baços humanos em vez de de ratinho, que não é utilizado nenhum anticorpo anti-CD3e, e que a IFN-γ é o produto de leitura em vez de IL-17. O ensaio mede a atividade da IL-23 numa amostra determinando o nivel de produção do IFN-γ por esplenócitos primários humanos. Os esplenócitos humanos são expostos a IL-23 humana (170 pM) na presença de várias concentrações de anticorpo huml3B8-b anti-IL-23pl9, ou a ausência do anticorpo. IFN-γ é detetado por sandwich ELISA. Huml3B8-b exibe um IC50 de 59-144 pM no ensaio de esplenócitos humanos.

A atividade biológica do huml3B8-b é ainda avaliada utilizando um ensaio de fosforilação KIT225 STAT-3, essencialmente como descrito em Parham et al. (2002) J. Immunol. 168:5699. As células KIT225 humanas, uma linha de células T leucémicas, são estimuladas com 138 pM de IL-23 humana na presença de várias concentrações do anticorpo huml3B8-b anti-IL-23pl9, ou na ausência do anticorpo. A 83 atividade da IL-23 é medida detetando o nível de fosforilação STAT3. Huml3B8-b exibe uma IC50 de 130 pM no ensaio KIT225.

Exemplo 8

Epítopo para anticorpo 13B8-b anti-IL-23pl9 humanizado 0 epítopo para a ligação do anticorpo 13B8-b humanizado à IL-23pl9 humana (SEQ. ID N.° 47) foi

determinado por cristalografia de raios X. As coordenadas foram determinadas para um complexo de um fragmento Fab do anticorpo 13B8-b anti-IL-23pl9 humanizado e da IL-23 humana não ligada, que compreende as subunidades pl9 e p40. A subunidade p40 na IL-23 utilizada para determinar a estrutura do cristal tem uma substituição N222Q na qual Asn222 é substituído por Gin. A sequência da IL-23pl9 humana é encontrada na SEQ. ID N.° 47 e a sequência da forma madura da IL-12/IL-23 p40 humana é encontrada nos resíduos 23-328 da acessão do GenBank N.° P29460. O anticorpo 13B8-b anti-IL-23pl9 humanizado compreende a cadeia pesada 13B8-b humanizada (SEQ. ID N.° 7) cadeia leve 13B8-b humanizada (SEQ. ID N.° 14). As condições de cristalização são 15% de polietileno glicol 4000, 60 mM de acetato de sódio, 100 mM de TRIS-HC1 (pH 8). Os cristais também podem ser obtidos com outros tampões a, ou à volta de, pH 8.

Os resíduos de aminoácido da IL-23 dentro de 4,0Â de resíduos no anticorpo 13B8-b incluem K20, T23, W26, S27, P30, E82, S95, L96, L97, P98, D99, P101, G103, Q104, H106, A107 e L110. Resíduos adicionais L24, L85, T91, S100 e V102 estavam dentro de 5,0Â. Um resíduo de aminoácido em IL-23pl9 é considerado dentro de uma dada distância do anticorpo (por exemplo 4,0Â ou 5,0Ã) se as coordenadas de 84 qualquer átomo do resíduo estão dentro da dada distância das coordenadas de qualquer átomo do anticorpo. A maioria destes resíduos contactados cai dentro de dois grupos principais ao longo da estrutura primária da IL-23pl9, com o primeiro grupo que compreende resíduos 20-30 (nos quais 6 de 11 resíduos estão dentro de 5,0Ã do anticorpo e 5 de 11 estão dentro de 4,0Â) e o segundo grupo que compreende resíduos 82-110 (nos quais 16 de 29 resíduos estão dentro de 5,0Ã do anticorpo e 12 de 29 estão dentro de 4,0Ã). Estes grupos definem epítopos que compreendem alongamentos de 11 ou mais resíduos de aminoácidos contíguos da IL-23pl9 nos quais 30%, 40%, 45%, 50% ou 54% ou mais dos resíduos estão dentro de 4, 0Â ou 5,0Â do anticorpo.

Esperar-se-ia que os anticorpos que se ligam a um dos ou a ambos destes grupos bloqueassem a ligação do anticorpo 13B8-b, e que exibissem atividades biológicas semelhantes. 0 Quadro 7 providencia uma breve descrição das sequências na listagem de sequências.

Quadro 7

Identificadores de sequência SEQ. ID N.0 Descrição 1 mlAll VH 2 mllCl VH 3 m5F5 VH 4 m21Dl VH 5 ml3B8 VH 6 huml3B8 HC-a 7 huml3B8 HC-b 85

Identificadores de sequência SEQ. ID N.0 Descrição 8 huml3B8 HC-c 9 mlAll VL 10 mllCl VL 11 m5F5 VL 12 m21D1 VL 13 ml3B8 VL 14 huml3B8 LC 15 mlAll CDRH1 16 mllCl CDRH1 17 m5F5 CDRH1 18 m21D1 CDRH1 19 ml3B8 CDRH1 20 mlAll CDRH2 21 mllCl CDRH2 22 m5F5 CDRH2 23 m21D1 CDRH2 24 ml3B8 CDRH2-a 25 hl3B8 CDRH2-b 26 hl3B8 CDRH2-C 27 mlAll CDRH3 28 mllCl CDRH3 29 m5F5 CDRH3 30 m21D1 CDRH3 31 ml3B8 CDRH3 32 mlAll CDRL1 33 mllCl CDRL1 34 m5F5 CDRL1 35 m21D1 CDRL1 86

Identificadores de sequência SEQ. ID N.0 Descrição 36 ml3B8 CDRL1 37 mlAll CDRL2 38 mllCl CDRL2 39 m5F5 CDRL2 40 m21D1 CDRL2 41 ml3B8 CDRL2 42 mlAll CDRL3 43 mllCl CDRL3 44 m5F5 CDRL3 45 m21D1 CDRL3 46 ml3B8 CDRL3 47 IL-23pl9 humana 48 IL-23pl9 de ratinho 49 huml3B8-b HC DNA 50 hum!3B8 LC DNA 87

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Schering Corporation <120> ANTICORPOS ANTI-IL-23P19 FABRICADOS POR ENGENHARIA

GENÉTICA <13 0> P3 2 0 9 4EP-PCT <140> PCT/US2008/002333 <141> 20-02-2008 <150> 60/891.409 <151> 23-02-2007 <160> 50 <1 7 0> Patentln versão 3.4 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 88

Glu val Gl n Leu Gl n Gl n Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Al a 1 5 10 15 Ser val Asn Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 20 25 50 Tyr ile Gl n Trp val Lys Gin Ser Arg Gly Lys Ser Leu Glu Trp ile 55 40 45 Gly Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Arg Tyr Asn Gl n Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Al a Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gin Phe Ser ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Al a Arg Gin Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr ser 100 105 110 Vai Thr val Ser Ser 115

<210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <4Ο0> 2

Hi s 1 val Gl n Leu Gin 5 Gin Ser Gly Pro Glu 10 Val Val Arg Pro Gly Ala 15 Ser val Lys Leu 20 Ser Cys Lys Al a Ser 25 Gly Tyr Ile Phe Ser 50 Ala Tyr

Trp Met Thr Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp ile 89 35 40 45

Gly Gl n Ile Phe Pro val Arg Gly Ser Al a Asp Tyr Asn Glu ile Phe 50 55 60 Glu Gl y Lys Ala Thr Leu Thr val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ile Gl n Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gl u Asp Ser Al a Val Tyr Tyr cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Al a Tyr T rp Gly Gl n Gl y Thr Leu val 100 105 110 Thr val Ser Al a 115

<210> 3 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 90

Gin Vai Gin Leu Gin Gin ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 15 10 15

Ser vai Lys Leu Ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 50

Gly Ile Ser Trp Vai Lys Gin Arg Thr Gly Gin Asp Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Vai Asn Ser Tyr Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp 100 105 110

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 91

Gin Vai Gin Leu Gin Gl n Ser Gly Leu Glu Leu vai Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Leu Lys ile Ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr ser Phe Thr ser Phe 20 25 30 phe ile Hl S Trp Leu Lys Gl n Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu τ rp lie 35 40 45 Gly T rp lie Phe Pro Gly Asn Hi S Asp Vai Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Al a Thr Leu Thr Al a Asp Thr Ser Ser ser Thr Ala Asp 65 70 75 80 Met Hi s Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gl y Gly Asn Leu Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Vai Ser Al a 115

<210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 92 Hi S val Gin Leu Gin Gin ser Gly Pro Glu Leu val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Glu Leu Ser cys Lys Al a Ser Gly Tyr ile Phe ile Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Met Lys Gin Arg Pro Gly Gl n Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gl n Ile Phe Pro Al a Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Glu Met Phe 50 55 60 Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Al a Tyr 65 70 75 80 Met Gl n Leu ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Al a Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr val Ser Al a 115 <210> 6 <211> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Regiões flanqueadoras humanas, CDR de roedor <220> <221> DOMÍNIO <222> (1)..(116) <223> Domínio variável <400> 6 93

Gin Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser vai Lys vai Ser Cys Lys Al a Ser Gly Tyr ile Phe Ile Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Thr T rp val Arg Gin Al a Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 55 40 45 Gly Gin lie Phe Pro Ala Ser Gly ser Ala Asp Tyr Asn Glu Met Phe 50 55 60 Glu Gly Arg vai Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu val 100 105 110 Thr Vai Ser Ser Ala ser Thr Lys Gly Pro Ser val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser ser Lys ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 150 155 140 vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu pro val Thr val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly val H1S Thr Phe Pro Ala val Leu Gin Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr ser Leu ser Ser val val Thr Val Pro ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gin Thr Tyr ile cys Asn val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys vai ASP Lys Lys val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Hi s Thr 210 215 220 Cys Pro pro cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro ser Val Phe 225 250 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 94

Glu vai Thr cys 260 Vai Val Val Asp Val 265 ser His Glu Asp Pro 270 Glu val Lys Phe Asn 275 τ rp Tyr Val Asp Gly 280 Val Glu Val His Asn 285 Ala Lys Thr tys Pro 290 Arg Glu Glu Gin Tyr 295 Asn Ser Thr Tyr Arg 300 Val Val Ser val Leu 305 Thr vai Leu Hi S Gin 310 Asp Trp Leu Asn Gly 315 Lys Glu Tyr Lys cys 320 Lys vai ser Asn Lys 325 Ala Leu Pro Ala pro 330 lie Glu Lys Thr ile 335 Ser Lys Ala Lys Gly 340 Gin Pro Arg Glu Pro 345 Gin val Tyr Thr Leu 350 Pro Pro Ser Arg ASp 355 Glu Leu Thr Lys Asn 360 Gin Val Ser Leu Thr 365 Cys Leu Val Lys Gly 370 Phe Tyr Pro Ser Asp 375 lie Ala Val Glu Trp 380 Glu Ser Asn Gly Gin 385 Pro Glu Asn Asn Tyr 390 Lys Thr Thr Pro Pro 395 Val Leu Asp Ser Asp 400 Gly Ser Phe Phe Leu 405 Tyr ser Lys Leu Thr 410 val Asp Lys Ser Arg Trp 415 Gin Gin Gly Asn 420 val Phe ser cys Ser 425 Val Met His Glu Ala 430 Leu Hi s Asn His Tyr 435 Thr Gin Lys ser Leu 440 Ser Leu Ser Pro Gly 445 Lys

<210> 7 <211> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 95 <223> Regiões flanqueadoras humanas, CDR de roedor <220> <221> DOMÍNIO <222> (1)..(116) <223> Domínio variável <400> 7

Gin val Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser val Lys Val Ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe lie Thr Tyr 20 25 30 96

Trp Met Thr 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Gl n Gly Leu 45 Glu Trp Met Gly Gin 50 lie Phe Pro Ala ser 55 Gly Ser Ala Asp Tyr 60 Asn Glu Lys Phe Glu 65 Gly Arg val Thr Met 70 Thr Thr Asp Thr Ser 75 Thr ser Thr Ala Tyr 80 Met Glu Leu Arg Ser 85 Leu Arg Ser Asp Asp 90 Thr Ala val Tyr Tyr 95 cys Ala Arg Gly Gly 100 Gly Gly phe Ala Tyr 105 Trp Gly Gin Gly Thr 110 Leu Val Thr vai Ser 115 Ser Ala ser Thr Lys 120 Gly Pro Ser val Phe 125 Pro Leu Ala Pro Ser 130 ser Lys Ser Thr ser 135 Gly Gly Thr Ala Ala 140 Leu Gly cys Leu vai 145 Lys Asp Tyr Phe pro 150 GlU Pro val Thr Val 155 Ser Trp Asn ser Gly 160 Ala Leu Thr Ser Gly 165 Val Hi S Thr Phe Pro 170 Ala Val Leu Gl n Ser 175 Ser Gly Leu Tyr Ser 180 Leu ser ser val val 185 Thr val Pro Ser Ser 190 ser Leu Gly Thr Gin 195 Thr Tyr lie cys Asn 200 Val Asn Hi s Lys Pro 205 Ser Asn Thr Lys Val 210 Asp Lys Lys val Glu 215 Pro Lys Ser cys ASP 220 Lys Thr His Thr cys 225 Pro Pro Cys Pro Al a 230 Pro Glu Leu Leu Gly 235 Gly Pro Ser val Phe 240 Leu Phe Pro Pro Lys 245 Pro Lys Asp Thr Leu 250 Met Ile Ser Arg Thr 255 Pro Glu Val Thr cys 260 Val val Val Asp val 265 Ser His Glu Asp Pro 270 Glu Val Lys Phe Asn 275 Trp Tyr Val Asp Gly 280 val Glu val His Asn 285 Ala Lys Thr Lys Pro 290 Arg Glu Glu Gin Tyr 295 Asn Ser Thr Tyr Arg 300 Val val Ser val Leu 305 Thr Val Leu His Gin 310 Asp Trp Leu Asn Gly 315 Lys Glu Tyr Lys cys 320 Lys val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile ser 97 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Al a val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gl n Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met Hi s Glu Al a Leu Hi s 420 425 430 Asn Hi s Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 8 <211> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Regiões flanqueadoras humanas, CDR de roedor <220> <221> DOMÍNIO <222> (1)..(116) <223> Domínio variável <400> 98 Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly 1 5

Ser Vai Lys vai ser Cys Lys Ala 20

Trp Met Thr Trp vai Arg Gin Ala 35 40

Gly Gin ile Phe Pro Ala Ser Gly 50 55

Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Thr 65 70

Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 10 15 Ser Gly Tyr ile Phe lie Thr Tyr 25 30 Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 45 Ser Ala Asp Tyr Ala Gin Lys Leu 60 Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai 100 105 110 99

Thr val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 Val Lys Asp Tyr Phe pro Glu Pro 145 150 Ala Leu Thr Ser Gly val Hi s Thr 165 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn 195 200 Lys Val ASP Lys Lys Val Glu Pro 210 215 Cys Pro Pro Cys Pro Al a Pro Glu 225 2 30 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys ASP 245 Glu val Thr cys Val val val ASP 260 Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly 275 280 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 290 295 Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 305 310 Lys val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 340 ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 355 360 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser ASP lie 370 375

Gly Pro Ser val Phe pro Leu Ala 125 Gly Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu 140 val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 Phe Pro Ala Val Leu Gl n Ser Ser 170 175 val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 185 190 Val Asn Hl S Lys Pro Ser Asn Thr 205 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 220 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 235 240 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 250 255 Val Ser Hi S Glu Asp Pro Glu Val 265 270 val Glu val His Asn Ala Lys Thr 285 Ser Thr Tyr Arg val Val ser val 300 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys. Cys 315 320 Ala Pro ile Glu Lys Thr ile Ser 330 335 Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro 345 350 Gin val Ser Leu Thr Cys Leu val 365 Al a val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 380

Gin pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp ser Asp B85 390 395 400 100

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415

Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His 420 425 430

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

<210> 9 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9

Asn Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser val Thr lie Gly 1 5 10 15 Gl n Pro Al a Ser lie Ser Cys Lys ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp ser 20 25 30 ASP Gly Lys 35 Thr Tyr Leu Asn Trp 40 Leu Leu Gin Arg pro 45 Gly Gl n ser Pro Lys 50 Arg Leu lie Tyr Leu 55 Val Ser Lys Leu Asp 60 Ser Gly val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 75 Phe Thr Leu Lys Ile 80 65 70 Val Gl u Ala Glu Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys Trp Gl n Gly Ser Arg /w K 90 95 85 Thr Thr phe Gly ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Hi S Phe Pro phe Γ 1 w 105 110

Arg 100 101 <210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10

Asp ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Al a Ser Leu Ser Al a Ser Val Gly 1 5 10 15 Gl u Thr vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Al a Trp Tyr Gin Glu Lys Trp Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Al a Glu Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gl n Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gl n Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin Hi s His Tyr Gly Thr Pro i Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105

<210> 11 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <40 0> 11 102

Ser Gin Al a vai Vai Thr Gin Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Vai Thr Leu Thr cys Arg Ser ser Thr Gly Al a vai Ile Thr 20 25 30 Ser Asn Asp Al a Asn T rp vai Gin Glu Lys Pro Asp His Ser Phe Thr 35 40 45 Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Vai Pro Al a Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Leu ile Gly Asp Lys Ala Al a Leu Thr ile Thr Gly 65 70 75 80 Al a Gl n Thr Glu Asp Glu Ala ile Tyr Phe cys Ala Leu Trp Tyr Ser 85 90 95 Asn Hi s T rp vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr vai Leu Gly 100 105 110

<210> 12 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 103

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro vai Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Glu Thr val Thr ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn vai Tyr ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu val 35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Asn ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His His Phe Gly Thr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Asp Leu Lys Arg 100 105

<210> 13 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <40 0> 13 104

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Al a Ser Leu Ser Al a Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr vai Thr ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Al a T rp Tyr Gin Gin Lys Gl n Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu val 35 40 45 Tyr Asn Al a Lys Thr Leu Al a Glu Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys Ile Asn Arg Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Arg Tyr Phe Cys Gin Hl S Hl S Tyr Gly Ile Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105

<210> 14 <211> 214 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Regiões flanqueadoras humanas, CDR de roedor <22 0> <221> DOMÍNIO <222> (1)..(108) <223> Domínio variável <40 0> 14 105 105 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro 1 5 ASp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg 20 Leu Ala T rp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 Tyr Asn Al a Lys Thr Leu Al a Glu 50 55 ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 Glu Asp Phe Al a Thr Tyr Tyr cys 85 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val 100 Pro Ser vai phe ile Phe Pro Pro 115 120 Thr Al a Ser vai vai Cys Leu Leu 130 135 Lys Vai Gin Trp Lys val Asp Asn 145 150 Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser 165 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Al a 180 Ai a cys Glu Vai Thr Hi s Gin Gly 195 200 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 15 <211> 10

Ser ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 10 15

Thr ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 25 50

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 45

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60 Leu Thr ile Ser Ser Leu Gl n Pro 75 80 Gin Hi s Hi S Tyr Gly ile Pro Phe 90 95 Glu ile Lys Arg Thr val Al a Al a 105 110 Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 125 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Gl u Al a 140 Al a Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gl n 155 160 Lys ASP Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175 Asp Tyr Glu Lys Hi s Lys Val Tyr 185 190 Leu Ser Ser Pro val Thr Lys Ser 205 106 <212> <213> <400> PRT Mus musculus 15

Gly Tyr Ser Phe Thr Ala 1 5

Tyr Tyr lie Gin 10 <210> <211> <212> <213> <40 0> 16 10 PRT Mus musculus 16 <210> <211> <212> <213> <40 0>

Gly Tyr lie Phe Ser Ala Tyr Trp Met Thr 1 5 io 17 10 PRT Mus musculus 17 <210> <211> < 212 > <213>

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly ile Ser 1 5 10 18 10 PRT Mus musculus <400> 18 107

Gly Tyr ser Phe Thr ser Phe Phe lie His 1 5 10

<210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19

Gly Tyr ile Phe lie Thr Tyr Trp Met Thr 1 5 10

<210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20

Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Arg Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21

Gin Ile Phe Pro vai Arg Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Glu ile Phe Glu 15 1U 15

Gly 108

<210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22

Glu Arg Phe Lys 15

Glu lie Tyr Pro Arg ser vai Asn ser Tyr Tyr Asn 15 10

Gly

<210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23

Glu Lys Phe Lys 15

Trp Ile Phe Pro Gly Asn His Asp Vai Glu Tyr Asn 1 5 10

Gly

<210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24

Glu Met Phe Glu 15

Gin ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Asn 15 10

Gly

<210> 25 <211> 17 <212> PRT 109 <213> Sequência artificial <220> <223> CDR de roedor com uma substituição de aminoácido <400> 25 Gin Ile Phe Pro Ala Ser Gly ser Ala Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Glu 15 10 15

Gly <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> CDR de roedor com quatro substituições de aminoácidos <40 0> 26

Gin Ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Ala Gin Lys Leu Gin 15 10 15

Gly <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 110

Gin Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5

<210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28

Gly Gly Gly Gly Phe Ala Tyr

<210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29

Gly Gly Asn Tyr Tyr Gly Ar9 Asn τνΓ Gly Asp Tyr phe Asp Tyr 15 15

<210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30

Gly Gly Gly Asn 5eu Pro Tyr 1

<210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus 111 <400> 31 <210> 32 ( <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Lys Ser ser Gin 1 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <40 0> 33 Arg Ala 1 <210> 34 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Arg 1 Ser Ser Tl <210> 35

Gly Gly Gly Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 15 10 10 11 112 11 112 <211> <212> <213> <400> <210> <211> <212> <213> <400> <210> <211> <212> <213> <40 0> <210> <211> <212> <213>

PRT

Mus musculus 35

Arg Thr Ser Glu Asn He Tyr ser Tyr Leu Ala 15 10 36 11

PRT

Mus musculus 36

Arg Thr ser Glu Asn lie Tyr ser Tyr Leu Ala 1 5 io 37 7

PRT

Mus musculus 37

Leu vai ser Lys Leu Asp ser 1 5 38 7

PRT

Mus musculus <400> 38 113

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu 1 5

<210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39

Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro 1 5

<210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu 1 5

<210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu 1 5

<210> 42 <211> 9 <212> PRT 114 <213> Mus musculus <400> 42 Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 43 <211> 9

<212> PRT <213> Mus musculus

<400> 43 Gin His His Tyr Gly Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <40 0> 44 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Vai 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 115

Gin His His Tyr Gly lie Pro Phe Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> <400> <210> <211> <212> <213> 46 9

PRT

Mus musculus 46

Gin His His Tyr Gly lie Pro Phe Thr 1 5

47 170 PRT

Homo sapiens <400> 47 116

Arg Ai a val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala T rp Thr Gl n Cys Gin Gin 1 5 10 15 Leu Ser Gin Lys Leu cys Thr Leu Al a Trp Ser Al a Hi s Pro Leu val 20 25 30 Gly Hi s Met ASP Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr Thr Asn Asp 35 40 45 vai Pro His ile Gin Cys Gly ASP Gly cys Asp Pro Gin Gly Leu Arg 50 55 60 Asp Asn Ser Gl n Phe Cys Leu Gin Arg Ile His Gin Gly Leu Ile Phe 65 70 75 80 Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu 85 90 95 Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gin Leu Hi S Al a Ser Leu Leu Gl y Leu 100 105 110 Ser Gin Leu Leu Gin Pro Glu Gly Hi S Hi S T rp Glu Thr Gin Gin Ile 115 120 12 5 Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gin Pro T rp Gin Arg Leu Leu Leu Arg Phe 130 135 140 Lys ile Leu Arg Ser Leu Gin Ala Phe Val Al a Val Al a Ala Arg Val 145 150 155 160 Phe Ai a Hi s Gly Ala Al a Thr Leu Ser Pro 165 170 <210: > 48 <211: > 175 <212: > PRT <213: > Mu s museu lus <400> 48 117

Vai Pro Arg Ser Ser ser Pro Asp Trp Ala Gin cys Gin Gin Leu Ser 15 10 15

Arg Asn Leu cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His Ala Pro Ala Gly His 20 25 30

Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu Glu Asp Glu Glu Thr Lys Asn Asn Vai 35 40 45

Pro Ara ile Gin Cys Glu Asp Gly Cys Asp Pro Gin Gly Leu Lys Asp 50 55 60

Asn ser Gin Phe Cys Leu Gin Arg lie Arg Gin Gly Leu Ala Phe Tyr 65 70 75 80

Lys Hi s Leu Leu Asp Ser Asp ile Phe Lys Gly Glu Pro Ala Leu L 85 90 95 Pro Asp Ser pro Met Glu Gl n Leu His Thr Ser Leu Leu Gly Leu Ser 100 105 110 Gin Leu Leu Gin Pro Glu Asp His Pro Arg Glu Thr Gin Gin Met pro 115 120 125 Ser Leu Ser Ser Ser Gin Gl n Trp Gin Arg Pro Leu Leu Arg Ser Lys 130 135 140 Ile Leu Arg Ser Leu Gin Al a Phe Leu Al a ile Al a Al a Arg val Phe 145 150 155 160 Ala Hi S Gly Al a Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu val Pro Thr Al a 165 170 175 <210> 49

<211> 1398 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Regiões constante e flanqueadoras humanas, CDR de roedor <400> 49 118 atggctgtgc tggggctgct gttctgcctg gtgacattcc caagctgtgt gctgtcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg cgctgaggtg aagaagcctg gcgcctccgt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggctacat cttcatcacc tactggatga cctgggtgcg gcaggcccct 180 ggccaggggc tggagtggat gggccagatc ttccctgcca gcggctctgc agactacaac 240 gagaagttcg aaggcagagt caccatgacc acagacacat ccaccagcac agcctacatg 300 gagctgagga gcctgagatc tgacgacacc gccgtgtatt actgtgccag aggcggtggc 360 ggattcgctt actggggcca gggcaccctg gtcaccgtct ccagcgctag caccaagggc 420 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 720 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatga 1398

<210> 50 <211> 702 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Regiões constante e flanqueadoras humanas, CDR de roedor 119 <400> 50 atggctccag tgcagctgct ggggctgctg gtgctgttcc tgccagccat gagatgtgat 60 atccagatga cccagtctcc atcctccctg tctgcctctg tgggcgacag agtgaccatc 120 acctgcagga ccagcgagaa catctacagc tacctggcct ggtatcagca gaagccaggg 180 aaggccccta agctgctgat ctataacgcc aagaccctgg ctgaaggggt gccatccagg 240 ttcagcggca gcggctctgg gacagacttc accctgacca tcagcagcct gcagcctgag 300 gacttcgcca cctactactg tcagcaccac tacggaattc cattcacctt cggccagggc 360 accaaggtgg agatcaagcg tacggtggct gcaccatctg tgttcatctt ccctccatct 420 gatgagcagc tgaagtctgg aactgcctcc gtggtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 agagaggcca aggtgcagtg gaaggtggat aacgccctcc agagcggcaa ctcccaggag 540 agcgtgacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca tcagggcctg 660 agcagccccg tgacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt aa 702 120

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 891409 P [0007] • US 60891413 P [0007] • US 20070009526 A [0007] • US 20070048315 A [0007] [0158] • WO 2007076524 A [0007] • WO 2007024846 A [0007] • WO 2007147019 A [0007] • US 4816567 A [0035] [0036] [0082] [0086] [0104] • WO 9404678 A [0040] • WO 9425591 A [0040] • US 6005079 A [0040] • EP 404097 A [0041] • WO 9311161 A [0041] • US 5624821 A [0043] • WO 2003086310 A [0043] • WO 2005120571 A [0043] • WO 20060057702 A [0043] • US 5888530 A [0050] • US 20040219150 A [0053] • US 4683195 A [0059] • US 6326482 B [0064] • WO 04081190 A [0075] [0116] [0138] 121 WO 0407151 7 A [0075] [0116] [0138] WO 0053631 A [0075] [0116] [0138] WO 0118051 A [0075] [0116] [0138] US 3817837 A [0082] US 3850752 A [0082] US 3939350 A [0082] US 3996345 A [0082] US 4277437 A [0082] US 4275149 A [0082] US 4366241 A [0082] US 4816397 A, Boss [0086] EP 438310 . AI [0086] EP 239400 BI [0086] WO 2005044853 A [0110] • US 20040014194 A [0112] • WO 2005040395 A [0131] [0132] • US 20040110941 A [0133] • WO 2005047324 A [0147] • WO 2005047326 A [0147] • US 2008002333 W [0180] • US 60891409 B [0180]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co, 2000 [0002] • Cytokine Reference. Academic Press, 2001 [0002] • von Andrian ; Mackay. New Engl. J. Med., 2 000, vol. 343, 1020-1034 [0002] • Davidson ; Diamond. New Engl. J. Med., 2001, vol. 345, 340-350 [0002] 122 • Cua et al. Nature, 2003, vol. 421, 744-748 [0003] • Oppmann et al. Immunity, 2000, vol. 13, 715-725 [0004] • Wlekowskl et al. J. Immunol., 2001, vol. 166, 7563- 7570 [0004] • Parham et al. J. Immunol., 2002, vol. 168, 5699-708 [0004] • Frucht. Sei STKE, 2002, E1-E3 [0004] • Elkins et al. Infection Immunity, 2002, vol. 70, 1936- 1948 [0004] • Bowman et al. Curr. Opin. Infect. Dis., 2006, vol. 19, 245 [0005] • Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 198 7, vol. 84, 3439-43 [0006] • Jones et al. Nature, 1986, vol. 321, 522 [0007] • Verhoeyen et al. Science, 1988, vol. 239, 1534 [0007] • Kabat et al. J. Immunol., 1991, vol. 147, 1709 [0007] • Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989, vol. 86, 10029 [0007] • Gorman et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1991, vol. 88, 4181 [0007] • Hodgson. Biotechnology (NY), 1991, vol. 9, 421-5 [0007] • Kohler et al. Nature, 1975, vol. 256, 495 [0035] • Clackson et al. Nature, 1991, vol. 352, 624-628 [0035] • Marks et al. J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581-597 [0035] • Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1984, vol. 81, 6851-6855 [0036] [0104] • pluckthun. THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES. Springer-Verlag, 1994, vol. 113, 269-315 [0039] • Muyldermans et al. Trends Biochem. Sei., 2001, vol. 26, 230 [0040] 123 • Reichmann et al. J. Immunol. Methods, 1999, vol. 231, 25 [0040] • Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, vol. 90, 6444-6448 [0041] • Holliger ; Hudson. Nat. Biotechnol., 2005, vol. 23, 1126-1136 [0041] • Presta. Adv. Drug Delivery Rev., 2006, vol. 58, 640-656 [0043] • Presta. J. Allergy Clin. Immunol., 2005, vol. 116 (731), 734-35 [0043] • Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. National Institutes of Health, 1991 [0045] • Chothia ; Lesk. J. Mol. Biol., 1987, vol. 196, 901-917 [0045] • Watson et al. Molecular Biology of the Gene. The Benjamin/Cuinmings Pub. Co, 1987, 224 [0048] • Maynard et al. Handbook of SOPs for Good Clinicai Practice. Interpharm Press, 1996 [0050] • Dent. Good Laboratory and Good Clinicai Practice. Urch Publ, 2001 [0050] • Cua ; Kastelein. Nat. Immunol., 2 0 06, vol. 7, 557-559 [0053] [0116] [0139] • Tato ; 0'Shea. Nature, 2006, vol. 441, 166-168 [0053] [0139] • Iwakura ; Ishigame. J. Clin. Invest., 2006, vol. 116, 1218-1222 [0053] [0139] • Mullis et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1987, vol. 51, 263 [0059] • PCR TECHNOLOGY. Stockton Press, 1989 [0059] • Giudicelli et al. Nucleic Acids Res., 2005, vol. 33, D256-D261 [0060] 124 • Knight. Ann. Clin. Lab. Sei., 2000, vol. 30, 145-158 [0062] • Hood ; Cheresh. Nature Rev. Câncer, 2002, vol. 2, 91- 100 [0062] • Timme et al. Curr. Drug Targets, 2003, vol. 4, 251-261 [0062] • Robbins ; Itzkowitz. Med. Clin. North Am., 2002, vol. 86, 1467-1495 [0062] • Grady ; Markowitz. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 2002, vol. 3, 101-128 [0062] • Bauer et al. Glia, 2001, vol. 36, 235-243 [0062] • Stanimirovic ; Satoh. Brain Pathol., 2000, vol. 10, 113-126 [0062] • Casset et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, vol. 307, 198-205 [0064] • Muyldermans. J. Biotechnol., 2001, vol. 74, 277-302 [0064] • Li. Nat. Biotechnol., 2000, vol. 18, 1251-1256 [0064] • Apostolopoulos et al. Curr. Med. Chem., 2 002, vol. 9, 411-420 [0064] • Monfardini et al. Curr. Pharm. Des., 2 0 02, vol. 8, 2185-2199 [0064] • Domingues et al. Nat. Struct. Biol., 1999, vol. 6, 652-656 [0064] • Sato ; Sone. Biochem. J., 2003, vol. 371, 603-608 [0064] • Munsen et al. Analyt. Biochem., 1980, vol. 107, 220-239 [0066] • Matusevicius et al. Multiple Sclerosis, 1999, vol. 5, 101-104 [0072] • Lock et al. Nature Med., 2002, vol. 8, 500-508 [0072] 125

Hoozemans et al. Exp. Gerontol., 2001, vol. 36, 559-570 [0072]

Griffin ; Mrak. J. Leukocyte Biol., 2002, vol. 72, 233-238 [0072]

Ilzecka et al. Cytokine, 2002, vol. 20, 239-243 [0072] Kostulas et al. Stroke, 1999, vol. 30, 2174-2179 [0072] Li et al. J. Neuroimmunol., 2001, vol. 11 6, 5-14 [0072] Cleveland ; Rothstein. Nature, 2001, vol. 2, 806-819 [0072]

Podolsky. New Engl. J. Med., 2002, vol. 347, 417-429 [0073]

Bouma ; Strober. Nat. Rev. Immunol., 2003, vol. 3, 521-533 [0073]

Bhan et al. Immunol. Rev., [0073] Hanauer. New Engl. J. Med., [0073] Green. lhe Lancet, 2003, vol. McManus. New Engl. J. Med., [0073] Horwitz ; Fisher. New Engl. 1846-1850 [0073] 1999, vol. 169, 195-207 1996, vol. 334, 841-848 362, 383-391 [0073] 2003, vol. 348, 2573-2574 J. Med., 2001, vol. 344,

Andoh et al. Int. J. Mol. Med., 2002, vol. 10, 631-634 [0073]

Nielsen et al. Scand. J. Gastroenterol., 2003, vol. 38, 180-185 [0073]

Fujino et al. Gut, 2003, vol. 52, 65-70 [0073]

Parham et al. J. Immunol., 2000, vol. 168, 5699 [0074] Presky et al. Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA, 19 96, vol. 93, 14002 [0074]

Duerr et al. Sciencexpress, 26 October 2006, 1 [0074] 126

Yen et al. J. Clin. Investigation, 2006, vol. 116, 1218 [0074]

Bravo ; Heath. EMBO J., 2000, vol. 19, 2399-2411 [0076] BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY. Lange Medicai Publications [0081]

Harlow ; Lane. ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL. CSH Press, 1988 [0081]

Goding. MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE. Academic Press, 1986 [0081]

Kohler ; Milstein. Eur. J. Immunol., 1976, vol. 6, 511-519 [0081] CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES.

John Wiley and Sons, 1994 [0081]

Huse et al. Science, 1989, vol. 246, 1275-1281 [0081] Ward et al. Nature, 1989, vol. 341, 544-546 [0082]

Queen et al. Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA, 1989, vol. 86, 10029-10033 [0082]

Mendez et al. Nature Genetics, 1997, vol. 15, 146-156 [0082]

Jones et al. Nature, 1986, vol. 321, 522-525 [0085] Reichmann et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-329 [0085] Presta. Curr. Op. Struct. Biol., 1992, vol. 2, 593-596 [0085]

Wells. Science, 1989, vol. 244, 1081-1085 [0088] Reissner ; Aswad. Cell. Mol. Life Sei., 2003, vol. 60, 1281 [0093]

Presta. J. Allergy Clin. Immunol., 2005, vol. 116, 731-734 [0093]

Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. National Institutes of Health, 1987 [0100] Milstein et al. Nature, 1983, vol. 305, 537-39 [0105] 127 • Brennan et al. Science, 1985, vol. 229, 81 [0105] • Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1993, vol. 90, 6444-48 [0105] • Gruber et al. J. Immunol., 1994, vol. 152, 5368 [0105] • ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL. Cold Spring Harbor

Laboratory, 1 988 [0107] • Champe et al. J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, 1388-1394 [0108] • Cunningham ; Wells. Science, 1989, vol. 244, 1081-1085 [0108] • Zinn-Justin et al. Biochemistry, 1992, vol. 31, 11335- 11347 [0110] • Zinn-Justin et al. Biochemistry, 1993, vol. 32, 6884- 6891 [0110] • Giege et al. Acta Crystallogr., 1994, vol. D50, 339-350 [0111] • McPherson. Eur. J. Biochem., 1990, vol. 189, 1-23 [0111] • Chayen. Structure, 1997, vol. 5, 1269-1274 [0111] • McPherson. J Biol. Chem., 1976, vol. 251, 6300-6303 [0111] • Scopes. Protein Purification: Principies and Practice. Springer-Verlag, 1994 [0111] • Blundell ; Johnson et al. Meth. Enzymol. Academic Press, 1985, 114, 115 [0112] • Bricogne. Acta Cryst., 1993, vol. D49, 37-60 [0112] • Bricogne. Meth. Enzymol. 1997, vol. 276A, 361-423 [0112] • Roversi et al. Acta Cryst., 2000, vol. D56, 1313-1323 [0112] • Langrish et al. Immunol. Rev., 2004, vol. 202, 96-105 [0116] 128 • Langrish et al. J. Exp. Med., 2005, vol. 201, 233-240 [0116] • Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S.

Pharmacopeia: National Formulary. Mack Publishing

Company, 1984 [0117] • Hardman et al. Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. McGraw-Hill, 2001 [0118] • Gennaro. Remington: The Science and Practice of

Pharmacy. Lippincott, Williams, and Wilkins, 2000 [0118] • Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications. Mareei Dekker, 1993 [0118] • Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets. Mareei Dekker, 1990 [0118] • Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems. Mareei Dekker, 1990 [0118] • Weiner ; Kotkoskie. Excipient Toxicity and Safety. Mareei Dekker, Inc, 2000 [0118] • Wawrzynczak. Antibody Therapy. Bios Scientific Pub. Ltd, 1996 [0122] • Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis. Mareei Dekker, 1991 [0122] • Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases. Mareei Dekker, 1993 [0122] • Baert et al. New Engl. J. Med., 2003, vol. 348, 601-608 [0122] • Milgrom et al. New Engl. J. Med, 1999, vol. 341, 1966- 1973 [0122] • Slamon et al. New Engl. J. Med, 2001, vol. 344, 783-792 [0122] 129 • Beniaminovitz et al. New Engl. J. Med., 2000, vol. 342, 613-619 [0122] • Ghosh et al. New Engl. J. Med, 2003, vol. 348, 24-32 [0122] • Lipsky et al. New Engl. J. Med., 2000, vol. 343, 159 4- 1602 [0122] • Yang et al. New Engl. J. Med., 2003, vol. 349, 427-434 [0124] • Herold et al. New Engl. J Med., 2002, vol. 346, 1692- 1698 [0124] • Liu et al. J. Neurol. Neurosurg. Psych., 1999, vol. 67, 451-456 [0124] • Portielji et al. Câncer Immunol. Immunother., 2003, vol. 52, 133-144 [0124] • Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of

Therapeutics. McGraw-Hill, 2001 [0127] • Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach. Lippincott, Williams & Wilkins, 2001 [0127] • Câncer Chemotherapy and Biotherapy. Lippincott, Williams & Wilkins, 2001 [0127] • Kenealy et al. J. Neuroimmunol., 2003, vol. 143, 7-12 [0136] • Noseworthy et al. New Engl. J. Med, 2000, vol. 343, 938-952 [0136] • Miller et al. New Engl. J. Med, 2003, vol. 348, 15-23 [0136] • Chang et al. New Engl. J. Med., 2002, vol. 346, 165-173 [0136] • Bruck ; Stadelmann. Neurol. Sei., 2003, vol. 24 (5), S265-S26 7 [0136] • Veldhoen. Immunity, 2006, vol. 24, 179-189 [0139] 130 • Dong. Nat. Rev. Immunol., 2006, vol. 6 (4), 329-333 [0139] • Maniatis et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982 [0141] • Sambrook ; Russell. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 [0141] • Wu. Recombinant DNA. Academic Press, 1993, vol. 217 [0141] • Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc, 2001, vol. 1-4 [0141] • DNA mutagenesis. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY. vol. 1 [0141] • cloning in mammalian cells and yeast. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY. vol. 2 [0141] • glycoconjugates and protein expression. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY. vol. 3 [0141] • bioinformatics. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY. vol. 4 [0141] • Coligan et al. Current Protocols in Protein Science. John Wiley and Sons, Inc, 2000, vol. 1 [0142] • Coligan et al. Current Protocols in Protein Science. John Wiley and Sons, Inc, 2000, vol. 2 [0142] • Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc, 2001, vol. 3, 16.0.5-16.22.17 [0142] • Products for Life Science Research. Sigma-Aldrich, Co, 2001, 45-89 [0142] • BioDirectory. Amersham Pharmacia Biotech, 2001, 384-391 [0142] • Coligan et al. Current Protcols in Immunology. John Wiley and Sons, Inc, 2001, vol. 1 [0142] 131 • Harlow ; Lane. Using Antibodies. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 [0142] • Coligan et al. Current Protcols in Immunology. John Wiley, Inc, 2001, vol. 4 [0142] • Owens et al. Flow Cytometry Principies for Clinicai

Laboratory Practice. John Wiley and Sons, 1994 [0143] • Givan. Flow Cytometry. Wiley-Liss, 2001 [0143] • Shapiro. Practical Flow Cytometry. John Wiley and Sons, 2003 [0143] • Molecular Probes. Catalogue. Molecular Probes, Inc, 2003 [0143] • Human Thymus: Histopathology and Pathology. Springer

Verlag, 1986 [0144] • Hiatt et al. Color Atlas of Histology. Lippincott, Williams, and Wilk ins, 2000 [0144] • Louis et al. Basic Histology: Text and Atlas. McGraw-Hill, 2002 [0144] • Menne et al. Bioinformatics, 2000, vol. 16, 741-742 [0145] • Menne et al. Bioinformatics Applications Note, 2000, vol. 16, 741-742 [0145] • Wren et al. Comput. Methods Programs Biomed., 2002, vol. 68, 177-181 [0145] • Heijne. Eur. J. Biochem., 1983, vol. 133, 17-21 [0145] • Heijne. Nucleic Acids Res., 1986, vol. 14, 4683-4690 [0145] • M.-P. Lefranc. Nomenclature of the Human Immu-noglobulin Heavy (IGH) Genes. Experimental and Clinicai Immunogenetics, 2001, vol. 18, 100-116 [0148] • V. Barbie ; M.-P. Lefranc. The Human Immunoglob-ulin

Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) 132

Segments. Experimental and Clinicai Immunogenet-ics, 1998, vol. 15, 171-183 [0149] • M.-P. Lefranc. Nomenclature of the Human Immu-noglobulin Kappa (IGK) Genes. Experimental and Clinicai Immunogenetics, 2001, vol. 18, 161-174 [0149] • Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. U. S. Department of Health and Human Services, 1991, 103-130 [0149] • Kunkel. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 1985, vol. 82, 488-492 [0151] • Aggarwal et al. J. Biol. Chem., 2003, vol. 278, 1910 [0166] • Stumhofer et al. Nature Immunol., 2006, vol. 7, 937 [0166] • Parham et al. J. Immunol., 2002, vol. 168, 5699 [0174]

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo que se liga à IL-23 humana, que compreende: a) um domínio variável da cadeia leve, ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, que compreende CDRL1, CDRL2 e CDRL3, em que: CDRL1 compreende a sequência da SEQ. ID N.° 36; CDRL2 compreende a sequência da SEQ. ID N.° 41; e CDRL3 compreende a sequência da SEQ. ID N.° 46; e b) um domínio variável da cadeia pesada, ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, que compreende CDRH1, CDRH2 e CDRH3, em que: CDRH1 compreende a sequência da SEQ. ID N.° 19; CDRH2 compreende a sequência da SEQ. ID N.° 25; e CDRH3 compreende a sequência da SEQ. ID N.° 31.

2. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 1 em que o domínio variável da cadeia leve compreende os resíduos 1-108 da SEQ. ID N.° 14.

3. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 1 em que o domínio variável da cadeia pesada compreende os resíduos 1-116 da SEQ. ID N.° 7.

4. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 1 que compreende: um domínio variável da cadeia leve do anticorpo como definido na reivindicação 2; e um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo como 2 definido na reivindicação 3.

5. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 4 que compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que: a cadeia leve compreende a sequência da SEQ. ID N.° 14; e a cadeia pesada compreende a sequência da SEQ. ID N.° 7.

6. Um ácido nucleico isolado que codifica o domínio variável da cadeia leve e domínio variável da cadeia pesada do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 1.

7. Um vetor de expressão que compreende o ácido nucleico da reivindicação 6 ligado operativamente às sequências controlo que são reconhecidas por uma célula hospedeira quando a célula hospedeira é transfetada com o vetor.

8. Uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão da reivindicação 7.

9. Um método para produzir um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo que compreende: cultivar a célula hospedeira da reivindicação 8 num meio de cultura em condições em que a sequência do ácido nucleico é expressa, produzindo assim polipeptídeos que compreendem os domínios variáveis da cadeia leve e pesada do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo; e recuperar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da célula hospedeira ou meio de cultura. 3

10. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 1, que compreende ainda uma região constante da cadeia pesada que compreende uma região constante da cadeia pesada γΐ humana ou uma variante da mesma, em que a variante da região constante compreende até 20 substituições de aminoácido conservadoramente modificadas.

11. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 1, que compreende ainda uma região constante da cadeia pesada que compreende uma região constante da cadeia pesada γ4 humana ou uma variante da mesma, em que a variante da região constante compreende até 20 substituições de aminoácido conservadoramente modificadas.

12. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo é um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab'>2 r e um diacorpo.

13. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 1 para utilização como um medicamento.

14. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo da reivindicação 1 para utilização no tratamento de um distúrbio selecionado a partir do grupo que consiste em artrite, psoriase e doença inflamatória do intestino.

15. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do 4 mesmo da reivindicação 1 para utilização no tratamento de um distúrbio selecionado a partir do grupo que consiste em esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico e diabetes.

16. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 1 para utilização no tratamento de cancro.

17. Uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 1 em combinação com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

18. A composição farmacêutica da reivindicação 17, que compreende ainda um agente imunossupressor ou anti-inflamatório.

19. Uma célula hospedeira que compreende: a) um vetor de expressão que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 1; e b) um vetor de expressão que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da reivindicação 1.

20. Um método para produzir um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende: cultivar a célula hospedeira da reivindicação 19 num meio de cultura em condições em que as sequências de ácido 5 nucleico são expressas, produzindo assim polipeptideos que compreendem os domínios variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e recuperar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da célula hospedeira ou meio de cultura.