ES2347690T3

ES2347690T3 - Anticuerpos anti-il-23.

Info

Publication number: ES2347690T3
Application number: ES06802075T
Authority: ES
Inventors: Catherine Brautigam Beidler; Stuart Willis Bright; Craig Duane Dickinson; Kristine Kay Kikly; David Matthew Marquis; Alain Philippe Vasserot
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2005-08-25
Filing date: 2006-08-23
Publication date: 2010-11-03
Anticipated expiration: 2026-08-23
Also published as: MX2008002179A; DE602006015830D1; AU2006283194B9; BRPI0615018A2; IL188312A0; DK1937721T3; SI1937721T1; CA2619052A1; NO20081465L; WO2007024846A3; EP1937721B1; ATE475672T1; HK1119712A1; JP2009506041A; WO2007024846A2; PT1937721E; EA200800417A1; CY1110792T1; US7872102B2; KR20080031450A

Abstract

Un anticuerpo monoclonal anti-IL23, o la porción de unión al antígeno de este, que comprende: (i) una secuencia de LCDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO:28; (ii) una secuencia de LCDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO:37; (iii) una secuencia de LCDR3 de acuerdo con la ID NO:40; (iv) una secuencia de HCDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO:3; (v) una secuencia de HCDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO:8; y (vi) una secuencia de HCDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:19.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la medicina, en particular al campo de los anticuerpos monoclonales contra la interleuquina 23 (IL-23). Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales anti-IL-23 neutralizantes para el tratamiento de una enfermedad autoinmune. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se considera que IL-23 es una citoquina importante para la activación de una variedad de células inflamatorias que son necesarias para la inducción de la inflamación crónica. IL-23 tiene una función separada pero complementaria a IL-12, una citoquina heterodimérica de 70 KDa que consiste en subunidades de p40 y p35 unidas en forma covalente. IL-23 se compone de la misma subunidad p40 que IL-12 pero apareada covalentemente con una subunidad p19 (Langrish et. al., Immunological Reviews 202:96-105, 2004).

Además, se ha implicado a IL-23 en el cumplimiento de un papel importante en las respuestas de las células T de memoria/patogénicas al promover la secreción de la citoquina proinflamatoria IL-17 a partir de las células T activadas. Existe una evidencia creciente de que altos niveles de IL-17 se asocian con enfermedades inflamatorias, autoinmunes, que incluyen artritis reumatoide, psoriasis y esclerosis múltiple (Aggarwal et al., J. Biol. Chem 278(3):1910-1914, 2003). En consecuencia, un anticuerpo neutralizante para IL-23 inhibirá la secreción y los efectos proinflamatorios de IL-17 y, en última instancia, el efecto de IL-17 sobre las enfermedades inflamatorias.

El documento WO 2004/081190 pretende describir procedimientos para el tratamiento de tumores mediante el uso de agonistas y antagonistas de IL-23. Se dice que el documento WO 2004/071517 se basa en la observación de que un agonista o antagonista de IL-23 modula las afecciones y los trastornos inflamatorios del sistema nervioso y el aparato gastrointestinal. A partir de este momento esta solicitud tiene por objeto proporcionar un procedimiento para tratar un trastorno mediado por IL-23 que comprende administrar una cantidad efectiva de un agonista o antagonista de IL-23.

Si bien previamente se han informado anticuerpos para IL-23 humana, no se han desvelado anticuerpos neutralizantes de alta afinidad para IL-23 humana que reconocen un epitopo específico sobre la subunidad p19. Sin duda, se necesitan terapias modificadoras de la enfermedad para el tratamiento de la enfermedad autoinmune.

Por consiguiente, se necesita un anticuerpo neutralizante de alta afinidad que se una específicamente a la subunidad p19 de la IL-23 y de este modo bloquee las acciones proinflamatorias de IL-17, que se pueda utilizar como agente terapéutico. Un anticuerpo de alta afinidad que se una específicamente a la subunidad p19 de la IL-23 es también conveniente ya que puede permitir administrar el anticuerpo a un paciente por vía subcutánea en vez de por vía intravenosa. También es necesario un anticuerpo que se una específicamente a la subunidad p19 de IL-23 con un valor de IC50 bajo en un ensayo de inhibición de IL-23 a fin de generar un anticuerpo anti-IL-23 terapéutico con una dosis terapéutica efectiva mínima. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona ventajas relacionadas, lo que proporciona en consecuencia un tratamiento útil para la enfermedad autoinmune. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-IL-23 que comprende seis péptidos seleccionados del grupo que consiste en péptidos con una secuencia que se muestra en la (a) SEQ ID NO:28; (b) SEQ ID NO:37; (c) SEQ ID NO:40; (d) SEQ ID NOs:3; (e) SEQ ID NO:8 y (f) SEQ ID NOs:16 o 19 (es decir, un péptido de cada uno de (a-f)), en LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3, respectivamente.

Una realización de esta invención es un anticuerpo o la porción de unión al antígeno de este que se une específicamente a la subunidad p19 de IL-23, neutraliza la actividad de IL-23, tiene una KD de menos de aproximadamente 160 pM, y tiene una IC50 de menos de aproximadamente 20 pM.

Otra realización es un anticuerpo, o porción de unión al antígeno de este, que se une a la subunidad de p19 de IL-23 dentro de los residuos de aminoácidos 129 a 159 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO:60.

Otra realización de esta invención es un anticuerpo o la porción de unión al antígeno de este que comprende la región variable de la cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO:52, una región variable de la cadena liviana que se muestra en la SEQ ID NO:57, una región constante de la cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO:62 y la región constante de la cadena liviana que se muestra en la SEQ ID NO:63.

Otra realización de la presente invención es un anticuerpo o la porción de unión al antígeno de este que se une específicamente a la subunidad p19 de IL-23 que comprende una región variable de la cadena liviana que contiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO:57 y una región variable de la cadena pesada que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:48 o 52.

Otra realización de la invención proporciona anticuerpos monoclonales anti-IL23 humanizados, y sus porciones de unión al antígeno, que se unen a un epitopo específico que comprende los residuos de aminoácidos 129 a 159 de la subunidad p19 de IL-23; (residuos 129-159 de la SEQ ID NO: 60), y antagonizan o neutralizan al menos una actividad biológica in vitro o in vivo asociada con IL-23 o una porción de este.

En otra realización, los anticuerpos de la invención tienen una IC50 menor o igual a aproximadamente 100 pM, 75 pM, 50 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 13 pM, 10 pM, 8 pM, 5 pM, 2 pM o 1 pM en un ensayo de esplenocitos murinos in vitro como se describe en el Ejemplo 1. Preferentemente, los anticuerpos de la invención tienen una IC50 menor o igual a aproximadamente 20 pM.

En otra realización, los anticuerpos de la invención se caracterizan por una fuerte afinidad de unión (KD) por la subunidad p19 de la IL-23 humana, es decir, menor que aproximadamente 160 pM, 100 pM, 75 pM, 50 pM o 25 pM. Preferentemente, los anticuerpos de la invención tienen una KD menor que aproximadamente 100 pM. Más aún, los anticuerpos de la invención se caracterizan también con una constante de velocidad koff de la subunidad p19 de IL-23 humana de menos de 4 x 10-4 seg -1 .

Otra realización de la presente invención incluye el anticuerpo aislado de cualquiera de las realizaciones anteriores en las que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, un anticuerpo sustancialmente intacto, un anticuerpo quimérico, un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2 o un fragmento Fv de cadena simple. Preferentemente, el anticuerpo aislado, o porción de unión al antígeno de este de cualquiera de las realizaciones anteriores es un anticuerpo humanizado.

La invención incluye ácidos nucleicos aislados que comprenden polinucleótidos que codifican los anticuerpos descritos y reivindicados en la presente memoria. La invención también abarca células huésped transfectadas con vectores que contienen estos polinucleótidos que expresan los anticuerpos descritos y reivindicados en la presente memoria.

La invención abarca un procedimiento para tratar la enfermedad autoinmune que comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo descrito y reivindicado en la presente memoria. Preferentemente, la enfermedad autoinmune tratada es esclerosis múltiple.

Finalmente, la invención abarca el uso de un anticuerpo para la fabricación de

un medicamento para tratar una enfermedad autoinmune en un sujeto que lo necesita.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Esta presente invención proporciona secuencias de aminoácidos de anticuerpos humanos aislados, o porciones de unión al antígeno de estos, que se unen específicamente a la subunidad p19 de IL-23 y son útiles para el tratamiento de la enfermedad autoinmune.

A fin de que la presente invención se pueda comprender más fácilmente, primero se definen ciertos términos.

La subunidad p19 de la IL-23 humana es un polipéptido de 189 aminoácidos que contiene una secuencia líder de 21 aminoácidos [SEQ ID NO:60]. El término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, se refiere a moléculas de inmunoglobulina compuestas de cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas livianas (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta de una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente memoria como HCVR o VH) y una región constante de la cadena pesada (abreviada en la presente memoria como HCCR o CH). La región constante de la cadena pesada está compuesta de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena liviana está compuesta de una región variable de la cadena liviana (abreviada en la presente memoria como LCVR o VL) y una región constante de la cadena liviana (abreviada en la presente memoria como LCCR). La región constante de la cadena liviana está compuesta de un dominio, CL.

Las regiones HCVR y LCVR también se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad ("CDR"), interpuestas con las regiones que están más conservadas, denominadas regiones estructurales ("FR"). Cada HCVR y LCVR está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino terminal al extremo carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En la presente memoria las 3 CDR de la cadena pesada se denominan como "HCDR1, HCDR2 y HCDR3" y las 3 CDR de la cadena liviana se denominan como "LCDR1, LCDR2 y LCDR3". Las CDR contienen la mayoría de los residuos que forman interacciones específicas con el antígeno. La numeración y ubicación de los residuos de aminoácidos de las CDR dentro de las regiones HCVR y LCVR está de acuerdo con la bien conocida convención de numeración de Kabat.

Las cadenas livianas se clasifican como kappa y lambda. Las cadenas pesadas

se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo

como IgG (subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas livianas y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de aproximadamente 3 o más aminoácidos.

La expresión "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo, como se usa en la presente memoria, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, la subunidad p19 de la IL-23). Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo se puede realizar con fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb, que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Por otra parte, si bien los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, estos se pueden unir, usando procedimientos recombinantes, con un conector sintético que permite obtenerlos como una cadena de proteína simple en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv). Tales anticuerpos de cadena simple están comprendidos dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo. Otras formas de anticuerpos de cadena simple, tales como los diacuerpos, también están comprendidos. Los diacuerpos son anticuerpos biespecíficos bivalentes en los que los dominios VH y VL se expresan en una cadena de polipéptidos simple, pero usando un conector que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena, de este modo se fuerza a los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno.

Las CDR de la región de unión al antígeno de los anticuerpos de la invención son completa o sustancialmente de origen murino, opcionalmente con ciertos residuos de aminoácidos alterados, por ejemplo, sustituidos con un residuo de aminoácido diferente, (ver por ejemplo, Tablas 1 y 2) para optimizar una propiedad particular del anticuerpo, por ejemplo, KD, koff, IC50. En otras realizaciones, la región de unión al antígeno de un anticuerpo para IL-23 de la invención puede derivar de otras especies no humanas que incluyen, pero sin limitación, conejo, rata o hámster. En forma alternativa, la región de unión al antígeno puede derivar de una secuencia humana.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente memoria no se limita a los anticuerpos producidos mediante la tecnología de hibridomas. "Anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que deriva de una sola copia o clon, que incluye por ejemplo, un clon eucariótico, procariótico o fago, y no al procedimiento por el cual se produce. Un "anticuerpo monoclonal" puede ser un anticuerpo intacto (que comprende una región Fc completa o de longitud completa), un anticuerpo sustancialmente intacto, o una porción o fragmento de un anticuerpo que comprende una porción de unión al antígeno, por ejemplo, un fragmento Fab, fragmento Fab’ o fragmento F(ab’)2 de un anticuerpo murino o de un anticuerpo quimérico, humanizado

o humano.

El término "anticuerpo humanizado" significa un anticuerpo que está compuesto parcial o totalmente de secuencias de aminoácidos derivadas de una línea germinal de anticuerpos humanos o una secuencia reordenada y obtenida por la alteración de la secuencia de un anticuerpo que tiene regiones determinantes de complementariedad (CDR) no humanas (preferentemente, un anticuerpo monoclonal de ratón). Las regiones estructurales de las regiones variables están sustituidas por las regiones estructurales humanas correspondientes (o una porción significativa o sustancial de estas, es decir, al menos aproximadamente 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, y siguen la numeración de Kabat) y están codificadas por la información de la secuencia de ácidos nucleicos que se produce en la región de la inmunoglobulina de la línea germinal humana o en formas recombinadas o mutadas de esta, sean o no dichos anticuerpos producidos en una célula humana.

Las CDR de un anticuerpo humanizado se pueden alterar u optimizar a partir de las CDR de un anticuerpo original no humano del cual se originan para generar las propiedades deseadas, por ejemplo, especificidad, afinidad y/o unión preferencial. Las CDR alteradas u optimizadas pueden tener sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácidos cuando se comparan con las CDR originales, preferentemente aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 total dentro de los seis dominios de las CDR. Por ejemplo, las posiciones de aminoácidos de las CDR que están en las SEQ ID NOS: 44-59 son posiciones que se han alterado a partir de las CDR mostradas para Mab3A8. En forma alternativa, el anticuerpo Mab3A8 murino puede ser un anticuerpo original para la comparación de las CDR de un anticuerpo de la invención. Como se describe en la presente memoria, el anticuerpo en el contexto de un anticuerpo humanizado no se limita a un anticuerpo de longitud completa y puede incluir fragmentos y formas de cadena simple.

La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en la presente memoria, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, los anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpo humano recombinante, los anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para los genes de inmunoglobulina humanos o los anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involucra el empalme de las secuencias del gen de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a la mutagénesis in vitro y en consecuencia las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, si bien derivan de y se relacionan con las secuencias VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal del anticuerpo humano in vivo.

Un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a la subunidad p19 de la IL-23 humana está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a otros antígenos). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a la subunidad p19 de la IL-23 humana, sin embargo, puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de IL-23 de otras especies. Más aún, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos.

Un "anticuerpo neutralizante", como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo cuya unión a la subunidad p19 de la IL-23 humana produce la inhibición de la actividad biológica de la IL-23 humana. La medición de uno o más indicadores de la actividad biológica de IL-23 determinada mediante el bioensayo de esplenocitos de ratón [Ejemplo 1] o el ensayo de neutralización de IL-23 humana [Ejemplo 2] pueden evaluar esta inhibición de la actividad biológica de la IL-23 humana.

Un anticuerpo "variante", se refiere en la presente memoria a una molécula que difiere en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos del anticuerpo "original" en virtud de la adición, supresión y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia del anticuerpo original. En una realización preferida, la variante del anticuerpo comprende al menos una adición, supresión y/o sustitución de aminoácidos en las regiones de CDR del anticuerpo original (por ejemplo, de uno a aproximadamente diez, y preferentemente 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8). La identidad u homología con respecto a la variante de la secuencia del anticuerpo se define en la presente memoria como el porcentaje de los residuos de aminoácidos de la variante de la secuencia del anticuerpo que son idénticos a los residuos del anticuerpo original después del alineamiento de las secuencias y la introducción de brechas, si fuera necesario, para obtener el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La variante del anticuerpo retiene la capacidad de unirse al antígeno, o preferentemente al epitopo, al que se une el anticuerpo original y preferentemente tiene al menos una propiedad o bioactividad que es superior a la del anticuerpo original. Por ejemplo, la variante de anticuerpo preferentemente tiene mayor afinidad de unión, velocidad de disociación más lenta, IC50 inferior o capacidad aumentada de inhibir una bioactividad del antígeno respecto el anticuerpo original. Una variante del anticuerpo de interés particular en la presente memoria es una que muestra una mejora de al menos aproximadamente 2 veces, preferentemente al menos aproximadamente 5 veces, 10 veces o 20 veces en una propiedad o bioactividad en comparación con el anticuerpo original.

El anticuerpo "original" en la presente memoria es uno que contiene la secuencia de aminoácidos usada para la preparación de una variante de anticuerpo. El anticuerpo original puede tener una secuencia estructural de origen murino, pero preferentemente la secuencia estructural es completa o sustancialmente de origen humano. El anticuerpo original puede ser un anticuerpo murino, quimérico, humanizado o humano.

Los anticuerpos que "se unen específicamente" se unen a la subunidad p19 de la IL-23 humana pero no se unen a la subunidad p40 de la IL-23 humana. Un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 humana puede exhibir cierta reactividad cruzada con IL-23 de otras especies.

El término "epitopo" se refiere a esa porción de una molécula capaz de ser reconocida por y a la que se une un anticuerpo en una o más regiones de unión al antígeno del anticuerpo. Los epitopos a menudo consisten en un grupo de moléculas químicamente activas en superficie tales como cadenas laterales de aminoácidos o azúcar y tienen características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas. Por "epitopo inhibidor" y/o "epitopo neutralizante" se considera un epitopo, que en el contexto de la molécula antigénica intacta y cuando se une un anticuerpo específico al epitopo, produce pérdida o disminución de una actividad biológica de la molécula in vivo o in vitro o en un organismo que contiene la molécula.

El término "epitopo antigénico" como se usa en la presente memoria, se define como una porción de un polipéptido a la que se puede unir específicamente un anticuerpo determinado por cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, por inmunoensayos convencionales. Un “epitopo no lineal" o "epitopo conformacional" comprende polipéptidos (o aminoácidos) no contiguos dentro de la proteína antigénica a la que se une un anticuerpo específico para el epitopo.

El término "kon", como se usa en la presente memoria se considera que se refiere a la asociación o constante de velocidad de asociación, o velocidad de reacción específica, de la reacción directa o de formación de complejo, medida en unidades:

M-1 -1

seg .

El término "koff", como se usa en la presente memoria, se considera que se refiere a la disociación o constante de velocidad de disociación, o velocidad de reacción específica, para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno, medida en unidades: seg-1 .

El término "KD", como se usa en la presente memoria, se considera que se refiere a la constante de disociación de una interacción particular anticuerpo-antígeno. Se calcula mediante la fórmula:

imagen1

Los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos de alta afinidad, que

generalmente exhiben valores bajos de koff. Para los fines de la presente divulgación, 10-10

el término "afinidad alta" se refiere a una afinidad o KD de entre 1,6 x M a aproximadamente 4,5 x 10-11M.

El término "potencia" es una medición de actividad biológica y se designa como IC50, o concentración efectiva del anticuerpo necesaria para neutralizar el 50% de la bioactividad de IL-23 en esplenocitos de ratón en el bioensayo descrito en el Ejemplo

1. La expresión "molécula de ácido nucleico", como se usa en la presente

memoria, se refiere a moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido

nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario.

La expresión "molécula de ácido nucleico aislada", como se usa en la presente memoria en referencia a los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o porciones de anticuerpo (por ejemplo, VH, VL, CDR3) que se unen a la IL-23 humana, se refiere a una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo o la porción del anticuerpo están libres de otras secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos o las porciones de anticuerpo que se unen a antígenos diferentes de la IL-23 humana, estas otras secuencias pueden flanquear naturalmente el ácido nucleico en el ADN genómico humano. En consecuencia, por ejemplo, un ácido nucleico aislado de la invención que codifica una región VH de un anticuerpo anti-IL-23 humano no contiene otras secuencias que codifican otras regiones VH que se unen a antígenos diferentes de la IL-23 humana.

El término "vector", como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que puede ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que segmentos de ADN se pueden ligar en el genoma viral.

La expresión "célula huésped recombinante" (o sólo "célula huésped"), como se usa en la presente memoria, se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante.

El anticuerpo monoclonal 3A8 es un anticuerpo monoclonal murino (MAb3A8) que se une específicamente a un epitopo de la subunidad p19 de la IL-23 humana. MAb3A8 se humanizó y optimizó, lo que produjo anticuerpos de alta afinidad con actividad neutralizadora de IL-23 potente y altamente específica para la subunidad p19 pero no la subunidad p40 de la IL-23.

Los anticuerpos o sus porciones de unión al antígeno de preferencia de la presente invención exhiben alta afinidad (valores bajos de KD) para el mismo epitopo que MAb3A8 y tienen afinidad de unión superior a la observada para MAb3A8. Las propiedades de unión que definen los anticuerpos de la presente invención residen únicamente en las regiones variables del anticuerpo, más específicamente las regiones de CDR del anticuerpo.

El estímulo primario para humanizar los anticuerpos a partir de otras especies

es reducir la posibilidad de que el anticuerpo produzca una respuesta inmune cuando

se inyecta en un paciente humano como un agente terapéutico. Cuanto más humanas sean las secuencias que se emplean en un anticuerpo humanizado, menor será el riesgo de inmunogenicidad. Además, los anticuerpos humanizados inyectados generalmente tienen una vida media más larga en la circulación que los anticuerpos no humanos inyectados. Por otra parte, si se desea una función efectora, debido a que la porción efectora es humana, puede interactuar con las otras partes del sistema inmunológico humano.

Se pueden realizar cambios en las secuencias descriptas en la presente memoria como regiones de la cadena pesada y liviana preferentes sin afectar significativamente las propiedades biológicas del anticuerpo. Esto es especialmente verdadero para las regiones constantes del anticuerpo y las partes de las regiones variables que no influyen en la capacidad de las CDR para unirse a IL-23.

Además, como se describe en la presente memoria, las regiones variables estructurales humanas y sus variantes se pueden usar en la presente invención. Sin embargo, independientemente de la estructura elegida, si la reducción del riesgo de la inmunogenicidad es un objetivo, se minimizan la cantidad de cambios relativos a la estructura humana elegida.

El anticuerpo humanizado de la presente invención puede comprender o derivar de una estructura de la cadena liviana de la línea germinal humana. En realizaciones particulares, la secuencia de la línea germinal de la cadena liviana se selecciona de secuencias de VK humanas que incluyen, pero sin limitación, A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, O12, O14, O18, 02, 04 y 08. En ciertas realizaciones, esta estructura de la cadena liviana de la línea germinal humana se selecciona de V1-11, V1-13, V1-16, V117, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V213, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4 y V5-6.

En otras realizaciones, el anticuerpo humanizado de la presente invención puede comprender o derivar de una estructura de la cadena pesada de la línea germinal humana. En realizaciones particulares, esta estructura de la cadena pesada de la línea germinal humana se selecciona de VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH145, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH315, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1 y VH7-81.

En realizaciones particulares, la región variable de la cadena liviana y/o la región variable de la cadena pesada comprenden una región estructural o al menos una porción de una región estructural (por ejemplo, que contiene 2 o 3 subregiones, tales como FR2 y FR3). En ciertas realizaciones, al menos FRL1, FRL2, FRL3 o FRL4 es completamente humana. En otras realizaciones, al menos FRH1, FRH2, FRH3 o FRH4 es completamente humana. En algunas realizaciones, al menos FRL1, FRL2, FRL3 o FRL4 es una secuencia de la línea germinal (por ejemplo, línea germinal humana) o comprende secuencias de consenso humanas para la estructura particular. En otras realizaciones, al menos FRH1, FRH2, FRH3 o FRH4 es una secuencia de la línea germinal (por ejemplo, línea germinal humana) o comprende secuencias de consenso humanas para la estructura particular. En realizaciones preferidas, el total de la región estructural es una región estructural humana.

Las secuencias de aminoácidos preferidas de la región constante de la cadena pesada humana de los anticuerpos humanizados de la presente invención incluyen la región constante de IgG1 [SEQ ID NO:61] o la región constante de IgG4 [SEQ ID NO:62]. La secuencia de aminoácidos preferida de la región constante de la cadena liviana humana de los anticuerpos humanizados de la presente invención es la región constante de la cadena kappa [SEQ ID NO:63].

Por otra parte, la estructura de la región de la cadena pesada variable humana preferida es VH1-24 [SEQ ID NO: 64] y la estructura de la región de la cadena liviana variable humana es A17 [SEQ ID NO:65]. Las SEQ ID NOS: 64 y 65 representan las secuencias de la línea germinal humana con las CDR nativas. Las CDR del MAb3A8 se añaden junto con las regiones J de mejor coincidencia para formar las regiones variables completas. Se considera que las regiones constantes de cadena pesada o liviana humana adicionales y las secuencias estructurales de la región variable diferentes de las que se describieron antes están contempladas en la presente invención y son conocidas en la técnica.

La presente invención abarca los anticuerpos o sus porciones de unión al antígeno que se unen a un epitopo específico de la subunidad p19 de IL-23 y neutralizan la actividad de IL-23. En consecuencia, las CDR y las regiones variables de la cadena pesada y liviana descriptas en la presente memoria se usan para obtener anticuerpos de longitud completa así como fragmentos y análogos funcionales que mantienen la afinidad de unión de la proteína que emplea las CDR específicas para la subunidad p19 de la IL-23.

La afinidad de unión de MAb3A8 se determina usando resonancia del plasmón superficial (BIAcore™). En estos experimentos el anticuerpo es capturado a baja densidad por la proteína A o el anticuerpo anti-Fc en un chip de BIAcore™ y el ligando fluye adelante. Se mide el aumento de masa en la superficie del chip. Este

5 procedimiento analítico permite la determinación en tiempo real de las velocidades de asociación y disociación para obtener la afinidad (KD) de unión. MAb3A8 tiene una KD de aproximadamente 300 pM (picomolar). Los anticuerpos humanizados de la presente invención, tienen una KD de entre aproximadamente 45 y aproximadamente 160 pM; aproximadamente 45 y aproximadamente 150 pM; aproximadamente 45 y

10 aproximadamente 100 pM; aproximadamente 50 y aproximadamente 95 pM; aproximadamente 60 y aproximadamente 85 pM; y aproximadamente 70 y aproximadamente 80 pM. Preferentemente, los anticuerpos humanizados de la presente invención tienen una KD de menos de aproximadamente 100 pM. Los anticuerpos o sus porciones de unión al antígeno de la presente invención

15 neutralizan la actividad biológica de IL-23. Se utilizan dos ensayos para analizar la capacidad de MAb3A8 y los anticuerpos de la presente invención preferidos para neutralizar la actividad de IL-23 [ver Ejemplos 1 y 2]. La presente invención también se refiere al ADN recombinante que codifica los anticuerpos que, cuando se expresan, se unen específicamente a la subunidad p19 de

20 la IL-23 humana. Preferentemente, el ADN codifica anticuerpos que, cuando se expresan, comprenden una o más de las CDR de las cadenas pesada y liviana de la presente invención [Tablas 1 y 2].

Tabla 1 Secuencias de CDR -Región variable de la cadena pesada (HCDR)

FAb: HCDR1 HCDR2 HCDR3

3A8: GKTFTSYGIN (SEQ ID NO:1) YIYIGNGYTESNEKFKG (SEQ ID NO:5) IGAYYGNFDY (SEQ ID NO: 12)

31: GKTFWSYGIN (SEQ ID NO:3) YIYIGTGYTEPNPKYKG (SEQ ID NO:8) IGGYYGNFAD (SEQ ID NO: 16)

35: GKTFWSYGIN (SEQ ID NO:3) YIYIGTGYTEPNPKYKG (SEQ ID NO:8) IGGYYGNFDQ (SEQ ID NO: 19)

Tabla 2 Secuencias de CDR -Región variable de la cadena liviana (LCVR)

FAb: LCDR1 LCDR2 LCDR3

MAb3A8: KSSQSLLDSDGKTYLN LVSKLDS WQGTHFPLT

(SEQ ID NO:25): (SEQ ID NO: 36) (SEQ ID NO: 39)

31: RSSQSLLISGGNTYLN (SEQ ID NO:28) LVSKLDQ (SEQ ID NO: 37) WQGTYFPLT (SEQ ID NO: 40)

35: RSSQSLLISGGNTYLN (SEQ ID NO:28) LVSKLDQ (SEQ ID NO: 37) WQGTYFPLT (SEQ ID NO: 40)

Los ejemplos de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de los anticuerpos de la presente invención preferidos que utilizan la estructura de VH VH1-24 están representadas como las SEQ ID NOS: 48 y 52. Un

5 ejemplo de una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena liviana de los anticuerpos preferidos de la presente invención que utilizan la estructura de VL de A17 se representa como la SEQ ID NO: 57. Más aún, los ejemplos de anticuerpos de la presente invención se representan por una región constante de la cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO:62 y, una región constante de la cadena

10 liviana que se muestra en la SEQ ID NO: 63. En consecuencia, los ejemplos de anticuerpos de la invención se seleccionan del grupo que consiste en:

(a) un anticuerpo con una LCVR que se muestra en la SEQ ID NO:57, una HCVR que

se muestra en la SEQ ID NO: 48, una LCCR que se muestra en la SEQ ID NO:63, y 15 una HCCR que se muestra en la SEQ ID NO:62;

(b) un anticuerpo con una LCVR que se muestra en la SEQ ID NO:57, una HCVR que se muestra en la SEQ ID NO: 52, una LCCR que se muestra en la SEQ ID NO:63, y una HCCR que se muestra en la SEQ ID NO:62;

Los anticuerpos neutralizantes de la presente invención se obtienen mediante

20 la generación de secuencias génicas apropiadas del anticuerpo, es decir, secuencias de aminoácidos, por la disposición de secuencias de nucleótidos apropiadas y la expresión de estas en una línea celular adecuada. Las secuencias de nucleótidos deseadas se pueden producir usando un procedimiento de mutagénesis basada en codones. Tales procedimientos permiten la producción de algunas y todas las

25 frecuencias de residuos de aminoácidos en cualquiera de las posiciones del codón deseadas dentro de un oligonucleótido. Esto puede incluir sustituciones completamente aleatorias de cualquiera de los 20 aminoácidos en una posición deseada. En forma alternativa, este proceso se puede llevar a cabo de modo de obtener un aminoácido particular en una ubicación deseada dentro de una cadena de

30 aminoácidos, tales como las nuevas secuencias de CDR de acuerdo con la invención.

En suma, la secuencia de nucleótidos apropiada para expresar cualquier secuencia de aminoácidos deseada se puede obtener fácilmente y usando tales procedimientos se pueden reproducir las nuevas secuencias de CDR de la presente invención. Esto origina la capacidad de sintetizar polipéptidos, tales como los anticuerpos, con una cualquiera de las secuencias de aminoácidos deseadas. Por ejemplo, en la actualidad es posible determinar la secuencia de aminoácidos de cualquier dominio deseado de un anticuerpo de elección y, opcionalmente, preparar cadenas de homólogos con uno

o más aminoácidos reemplazados por otros aminoácidos deseados, de modo de brindar una variedad de análogos sustituidos.

En la aplicación de tales procedimientos, se aprecia que debido a la degeneración del código genético, procedimientos tales como la síntesis de oligonucleótidos aleatorios y la síntesis de oligonucleótidos degenerados parciales incorporarán redundancias para los codones que especifican un residuo de aminoácido particular en una posición particular, si bien dichos procedimientos se pueden usar para proporcionar un conjunto maestro de todas las posibles secuencias de aminoácidos y analizarlas para determinar la función óptima como estructuras de anticuerpo o para otros fines. En forma alternativa, tales secuencias de anticuerpos se pueden sintetizar químicamente o generar de otras maneras bien conocidas en la técnica.

De acuerdo con la invención que se desvela en la presente memoria, se pueden generar anticuerpos de alta potencia mejorada por la combinación en una estructura de polipéptido única de una o más nuevas secuencias de CDR que se desvelan en la presente memoria, cada una que muestra de modo independiente la generación de aumento de la potencia o la actividad biológica. De esta manera, se pueden combinar varias nuevas secuencias de aminoácidos en un anticuerpo, en la misma o diferentes CDR, para producir anticuerpos con niveles deseables de actividad biológica. Los cambios de aminoácidos tienen el efecto de producir una disminución de la koff para dicho anticuerpo, preferentemente con un incremento de la afinidad del anticuerpo. Se puede obtener mayor potencia con un valor menor de koff incluso si la afinidad continúa igual o se reduce algo. Tal anticuerpo se produce más ventajosamente por la síntesis de las cadenas de polipéptidos requerida por medio de la síntesis en células manipuladas genéticamente en forma adecuada que tienen incorporadas en ellas las secuencias de nucleótidos apropiadas que codifican las cadenas de polipéptidos requeridos que contienen los segmentos de CDR alterados. A modo de ejemplo no limitante, se pueden emplear dichas nuevas secuencias de CDR y analizar los anticuerpos resultantes en cuanto a potencia o actividad biológica, usando el bioensayos de esplenocitos o el protocolo de neutralización de IL-23 humana descrito en la presente memoria, en los que el anticuerpo demuestra alta afinidad por una estructura antigénica particular, tal como la subunidad p19 de la IL-23 humana.

Por el contrario, se debe apreciar que no todas las ubicaciones dentro de las secuencias de los diferentes dominios del anticuerpo pueden ser iguales ya que las sustituciones de cualquier clase en una ubicación particular pueden ser útiles o perjudiciales. Además, las sustituciones de determinadas clases de aminoácidos en determinadas ubicaciones también pueden ser positivas o negativas respecto de la afinidad. Por ejemplo, puede no ser necesario probar todos los posibles aminoácidos hidrófobos en una posición determinada. Puede ser que ningún aminoácido hidrófobo funcione bien. Por otra parte, un aminoácido ácido o básico en una ubicación determinada puede proporcionar grandes cambios en la afinidad medida.

Como ya se describió, KD se mide por la relación de las constantes kon y koff. Por ejemplo, una kon de 3,1x107 (M-1 seg -1) y una koff de 0,9x10-4(seg-1) se combinarían para dar una KD de 2,9x10-12 M. En consecuencia, la afinidad se puede mejorar al aumentar la kon o disminuir la koff. En forma correspondiente, una disminución de la koff de los anticuerpos de la presente invención probablemente producirá un agente terapéutico más eficaz.

De acuerdo con lo precedente, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales de alta afinidad. Tales anticuerpos, sin embargo, son monoclonales sólo en el sentido de que pueden derivar de un clon de un tipo celular único. Sin embargo, esto no significa limitarlos a un origen particular. Tales anticuerpos se pueden producir fácilmente en células que comúnmente no producen anticuerpos, tales como las células CHO, NSO o COS. Además, tales anticuerpos se pueden producir en otros tipos de células, en especial células de mamíferos e incluso en células de bacterias y plantas, por la manipulación genética de tales células para expresar y ensamblar las cadenas livianas y pesadas del polipéptido que forman el producto del anticuerpo. Además, tales cadenas se pueden sintetizar químicamente, pero debido a que deben ser específicas para un determinante antigénico dado, aún constituirían anticuerpos "monoclonales" dentro del espíritu en que se usa el término. En consecuencia, como se usa en la presente memoria, el término anticuerpo monoclonal tiene por objeto indicar más especificidad y pureza de las moléculas del anticuerpo más que el mero mecanismo usado para la producción de dichos

anticuerpos.

Asimismo como se usa en la presente memoria, el término potencia describe la dependencia del efecto del anticuerpo, cuando se utiliza para su propósito terapéutico deseado, con respecto a la concentración de tal anticuerpo. En consecuencia, potencia significa actividad biológica con respecto a un antígeno determinado. A modo de ejemplo no limitante, la potencia, o actividad biológica, o efecto biológico de un anticuerpo anti-IL-23 se mide mediante el bioensayo de esplenocitos o el protocolo de neutralización de IL-23 humana que se describe en la presente memoria. La potencia relativa de los anticuerpos producidos de acuerdo con los procedimientos de la presente invención, denominada como IC50, normalmente estará en el intervalo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 pM, aproximadamente 1 pM a aproximadamente 50 pM; aproximadamente 1 pM a aproximadamente 25 pM. Preferentemente, la IC50, será aproximadamente 25 pM, 20 pM, 15 pM, 13 pM, 10 pM, 8 pM, 5 pM, 2 pM o 1 pM. Con máxima preferencia, los anticuerpos de la invención tienen una IC50 de aproximadamente 20 pM.

Por el contrario, la afinidad de un anticuerpo por el antígeno es simplemente una medición matemática de la relación de kon a koff. Además, la KD de los anticuerpos producidos de acuerdo con los procedimientos de la presente invención normalmente estará en el intervalo de aproximadamente 2 x 10-10 M a aproximadamente 25 x 10-12 M, preferentemente menor que aproximadamente 160 pM, 100 pM, 75 pM, 50 pM o 25 pM. Con máxima preferencia, los anticuerpos de la invención tienen una KD de menos que aproximadamente 100 pM.

En una realización, los anticuerpos o sus porciones de unión al antígeno de la presente invención comúnmente comprenderán una región constante y una región variable de mamífero, preferentemente humana, dicha región variable que comprende regiones estructurales de cadena pesada y liviana y CDR de cadena pesada y liviana, en las que las regiones estructurales de la cadena pesada y liviana tienen secuencias características de un anticuerpo de mamífero, preferentemente un anticuerpo humano, y en las que las secuencias de CDR son similares a las de un anticuerpo de alguna especie diferente a la humana, preferentemente un ratón.

En una realización de la presente invención, la potencia se aumenta usando un fragmento Fab del anticuerpo neutralizante contra IL-23 humana que tiene una KD de menos de aproximadamente 160 pM y por la disminución del valor de koff a menos de aproximadamente 1x10-3 seg -1, preferentemente menor que aproximadamente 5x10-4 seg -1, con más preferencia menos de aproximadamente 1x10-4 seg -1. Los aminoácidos presentes en las CDR de tales fragmentos Fab se muestran en las Tablas 1 y 2.

En realizaciones específicas, la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado que comprende una KD menor de aproximadamente 160 pM en el que la koff es menor de aproximadamente 1x10-3 seg -1, preferentemente menor de aproximadamente 5x10-4 seg -1, y con máxima preferencia menos de aproximadamente 1x10-4 seg -1 (que incluyen todas sus combinaciones). En consecuencia, los anticuerpos preferidos de la presente invención se unen a la subunidad p19 de la IL-23 humana madura con una KD de aproximadamente 160 pM o menos, tienen una constante de velocidad de disociación koff de 1 x 10-3 seg -1 o menos, y neutralizan la actividad de IL-23 humana.

El ADN que codifica los anticuerpos de la presente invención normalmente incluirá una secuencia de polinucleótidos de control de expresión ligada operativamente a las secuencias codificadoras del anticuerpo, que incluyen regiones promotoras asociadas naturalmente o heterólogas. Preferentemente, las secuencias de control de expresión serán sistemas promotores eucarióticos en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucarióticas, pero también se pueden usar secuencias control para huéspedes procarióticos. Una vez que el vector se ha incorporado en la línea celular huésped apropiada, la célula huésped se propaga en condiciones adecuadas para la expresión de las secuencias de nucleótidos y, si se desea, para la recolección y la purificación de las cadenas livianas, cadenas pesadas, dímeros de cadena liviana/pesada o anticuerpos intactos, fragmentos de unión u otras formas de inmunoglobulina.

Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención capaces de expresar finalmente los anticuerpos deseados se pueden formar a partir de una variedad de polinucleótidos (ADNc o genómico, ARN, oligonucleótidos sintéticos, etc.) y componentes (por ejemplo, regiones V, J, D y C) diferentes, usando cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas. La unión de secuencias genómicas y sintéticas apropiadas es un procedimiento común de producción, pero también se pueden utilizar secuencias de ADNc.

Las secuencias de ADN de la región constante humana se pueden aislar de acuerdo con procedimientos bien conocidos de una variedad de células humanas, pero preferentemente de células B inmortalizadas. Las células fuente adecuadas para las secuencias de polinucleótidos y las células huésped para la expresión y secreción de inmunoglobulina se pueden obtener de un número de fuentes bien conocidas en la técnica.

Como se describe en la presente memoria, además de los anticuerpos

descritos específicamente en la presente memoria, otros anticuerpos "sustancialmente homólogos" modificados se pueden diseñar y manufacturar fácilmente utilizando varias técnicas de ADN recombinante bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las regiones estructurales pueden variar respecto de las secuencias nativas en el nivel de estructura primaria por varias sustituciones, adiciones terminal e intermedia y supresiones de aminoácidos, y similares. Más aún, se puede usar una variedad de regiones estructurales humanas diferentes en forma individual o en combinación como una base para las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención. En general, las modificaciones de los genes se pueden lograr fácilmente por una variedad de técnicas bien conocidas, tales como mutagénesis dirigida a sitios.

En forma alternativa, se pueden producir fragmentos polipeptídicos que comprenden sólo una porción de la estructura del anticuerpo primario, dichos fragmentos poseen una o más actividades de inmunoglobulina (por ejemplo, actividad de fijación del complemento). Estos fragmentos polipeptídicos se pueden producir por la escisión proteolítica de los anticuerpos intactos por procedimientos bien conocidos en la técnica, o por la inserción de codones de detención en las ubicaciones deseadas en los vectores usando mutagénesis dirigida a sitios, tales como después de CH1 para producir fragmentos Fab o después de la región bisagra para producir fragmentos F(ab’)2. Los anticuerpos de cadena simple se pueden producir por la unión de VL y VH con un conector de ADN.

Como se indicó previamente, los polinucleótidos se expresarán en huéspedes después que las secuencias se han ligado operativamente a (es decir, ubicado para asegurar el funcionamiento de) una secuencia de control de expresión. Estos vectores de expresión son normalmente replicables en los organismos huésped tanto como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, por ejemplo, tetracicilina, neomicina y dihidrofolato reductasa, para permitir la detección de estas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

E. coli es un huésped procariótico particularmente útil para la clonación de los polinucleótidos de la presente invención. Otros huéspedes microbianos adecuados para usar incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilus, y otras enterobacteriáceas, tales como Salmonella, Serratia y varias especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procarióticos, también se pueden obtener vectores de expresión, que normalmente contendrán secuencias de control de expresión compatibles con la célula huésped (por ejemplo, un origen de replicación). Además, pueden estar presentes un número de promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptofano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa o un sistema promotor del fago lambda. Los promotores normalmente controlarán la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tienen secuencias del sitio de unión a los ribosomas y similares, para iniciar y completar la transcripción y traducción.

Además de las bacterias, también se pueden usar otros microbios, tales como levaduras, para la expresión. Pichia pastoris es un huésped preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de expresión, tales como promotores, que incluyen 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según corresponda.

El cultivo celular de tejido de mamífero también se puede usar para expresar y producir los polipéptidos de la presente invención. En efecto, se prefieren las células eucarióticas, debido a que se han desarrollado un número de líneas celulares huésped adecuadas capaces de secretar inmunoglobulinas intactas en la técnica, e incluyen las líneas celulares CHO, varias líneas celulares COS, células HeLa, líneas celulares de mieloma, células B transformadas, líneas celulares renales embrionarias humanas o hibridomas. Las líneas celulares preferidas son líneas celulares CHO y de mieloma tales como SP2/0 y NS0.

Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador, y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión de ribosomas, sitios de empalme del ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de transcripción. Las secuencias de control de expresión preferidas son promotores derivados de los genes de inmunoglobulina, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino, citomegalovirus y similares. Los sitios de poliadenilación preferidos incluyen secuencias derivadas de SV40 y hormona de crecimiento bovino.

Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés (por ejemplo, las secuencias codificadoras de cadena pesada y liviana y secuencias de control de expresión) se pueden transferir en la célula huésped por procedimientos bien conocidos, que varían de acuerdo con el tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección de cloruro de calcio se utiliza comúnmente para las células procarióticas, mientras que se pueden usar tratamiento de fosfato de calcio o electroporación para otros huéspedes celulares.

Una vez que se expresan, los anticuerpos se pueden purificar de acuerdo con

procedimientos estándares, que incluyen precipitación con sulfato de amonio, intercambio iónico, afinidad (por ejemplo Proteína A), fase inversa, cromatografía en columna de interacción hidrófoba, electroforesis en gel y similares. Se prefieren inmunoglobulinas sustancialmente puras que tienen al menos aproximadamente 90 a 95% de pureza, y con máxima preferencia 98 a 99% o mayor pureza, para usos farmacéuticos. Una vez purificados, en forma parcial o a homogeneidad, según sea deseado, los polipéptidos posteriormente se pueden usar en forma terapéutica o profiláctica, como se refiere en la presente memoria.

Los anticuerpos de la presente invención son útiles en aplicaciones terapéuticas, profilácticas, de diagnóstico e investigación como se describe en la presente memoria. Un anticuerpo de la invención se puede usar para diagnosticar un trastorno o enfermedad asociado con la expresión de IL-23 humana. De una manera similar, el anticuerpo de la invención se puede usar en un ensayo para controlar los niveles de IL-23 en un sujeto analizado en cuanto a una afección asociada con IL-23. Las aplicaciones de investigación incluyen procedimientos que utilizan el anticuerpo de la invención y una marca para detectar IL-23 en una muestra, por ejemplo, en un fluido orgánico humano o en una célula o extracto tisular. Los anticuerpos de la invención se pueden usar con o sin modificación, y se marcan por la unión covalente o no covalente de un resto detectable. El resto detectable puede ser uno que es capaz de producir, en forma directa o indirecta, una señal detectable.

Una variedad de protocolos convencionales para medir IL-23, que incluyen por ejemplo, ELISA, RIA y FACS, son conocidos en la técnica y proporcionan una base para diagnosticar niveles alterados o anormales de la expresión de IL-23. Los valores de expresión normales o estándares se establecen usando cualquier técnica conocida en la materia, por ejemplo, por la combinación de una muestra que comprende un polipéptido IL-23 con, por ejemplo, los anticuerpos en condiciones adecuadas para formar un complejo de antígeno:anticuerpo. El anticuerpo se marca en forma directa o indirecta con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos.

Por conveniencia, el anticuerpo de la presente invención se puede proporcionar en un kit, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo diagnóstico. Cuando el anticuerpo se marca con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor del sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, se pueden incluir otros aditivos tales como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o un tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos puede variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos se pueden proporcionar como polvos secos, usualmente liofilizados, que incluyen excipientes en los que la disolución proporcionará una solución del reactivo que tiene la concentración apropiada.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para tratar seres humanos que experimentan un trastorno inflamatorio mediado por IL-23 que comprende administrar una dosis efectiva de un anticuerpo específico para la subunidad p19 de la IL-23 humana a un paciente que lo necesita. Los anticuerpos de la presente invención se unen y neutralizan IL-23. Varios trastornos mediados por IL23 incluyen esclerosis múltiple, artritis reumatoide (RA), enfermedad de injerto versus huésped, psoriasis, enfermedad de Crohn, otras enfermedades intestinales inflamatorias y cáncer. Preferentemente, los anticuerpos de IL-23 abarcados por la presente invención se usan para tratar la esclerosis múltiple remitente recidivante, la forma más común de la esclerosis múltiple.

Los anticuerpos, o sus porciones de unión al antígeno, de la presente invención pueden estar en la forma de una composición que comprende el anticuerpo de la invención suspendido en un diluyente o excipiente farmacológicamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar por medios conocidos en la técnica que obtienen el propósito generalmente deseado para tratar enfermedades autoinmunes, preferentemente esclerosis múltiple. La vía de administración preferida es parenteral, definida en la presente memoria en referencia a los modos de administración que incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular. Más preferentemente, la vía de administración es subcutánea y se administra una vez por semana. La dosis administrada será dependiente de la edad, salud y peso del receptor, clase del tratamiento concurrente, si hubiera, frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado.

Las composiciones dentro del ámbito de la invención incluyen todas las composiciones en la que los anticuerpos o la porción de unión al antígeno están presentes en una cantidad que es efectiva para obtener el efecto médico deseado para tratar esclerosis múltiple. Si bien las necesidades individuales pueden variar de un paciente a otro, la determinación de los intervalos óptimos de las cantidades efectivas de todos los componentes está dentro de la capacidad del médico de destreza usual.

Las composiciones farmacéuticas para la administración se diseñan en forma apropiada para el modo de administración seleccionado, y se usan excipientes farmacéuticamente aceptables tales como tampones, tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes estabilizantes, portadores y similares, según sea necesario. Remington’s Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co., Easton PA, última edición, proporciona un compendio de técnicas de formulación que son generalmente conocidas por los profesionales.

La concentración del anticuerpo para IL-23 en las formulaciones puede ser tan baja como aproximadamente 0,1% hasta tanto como 15 o 20% en peso y se seleccionará principalmente sobre la base de los volúmenes, viscosidades, estabilidad del fluido, y demás, de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Las concentraciones preferidas del anticuerpo para IL-23 generalmente estarán en el intervalo de 1 a aproximadamente 100 mg/ml. Preferentemente, 10 a aproximadamente 50 mg/ml.

La formulación puede incluir un tampón. Preferentemente el tampón es un tampón citrato o un tampón de fosfato o una combinación de estos. Generalmente, el pH de la formulación está entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8. Preferentemente, el pH está entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7,5. El pH de la formulación se puede seleccionar para equilibrar la estabilidad del anticuerpo (química y física) y aliviar al paciente al que se la administra. La formulación también puede incluir una sal tal como NaCl. Además, la formulación puede incluir un detergente para evitar la agregación y ayudar al mantenimiento de la estabilidad.

La formulación se puede filtrar en forma estéril después de obtener la formulación, o hacerla de otro modo microbiológicamente aceptable. Se puede añadir un conservante tal como m-cresol o fenol, o una mezcla de estos para evitar el crecimiento microbiano y la contaminación.

Una composición típica para la infusión intravenosa podría tener un volumen de hasta 250 ml de fluido, tal como solución de Ringer estéril, y 1-100 mg por ml, o más de concentración de anticuerpo. Los agentes terapéuticos de la invención se pueden congelar o liofilizar para la conservación y reconstituir en un portador estéril adecuado antes de usar. La liofilización y reconstitución puede producir varios grados de pérdida de actividad de anticuerpo (por ejemplo, con inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a tener mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG). Las dosis pueden tener que ajustarse para compensar.

Si bien los procedimientos anteriores parecen ser los más convenientes y apropiados para la administración de proteínas tales como anticuerpos humanizados, con adecuada adaptación se pueden emplear otras técnicas para la administración, tales como administración transdérmica y administración oral, con la condición de que se diseñe una formulación apropiada. Además, puede ser conveniente emplear formulaciones de liberación controlada usando películas y matrices biodegradables, o minibombas osmóticas, o sistemas de aplicación basados en perlas de dextrano, alginato o colágeno. En síntesis, se dispone de formulaciones para administrar los anticuerpos de la invención y se pueden elegir de una variedad de opciones.

Los niveles de dosis típicos se pueden optimizar usando técnicas clínicas estándares y serán dependientes del modo de administración y la afección del paciente. Generalmente, las dosis estarán en el intervalo de 10 µg/kg/mes a 10 mg/kg/mes.

En otro aspecto, se contemplan los anticuerpos o las porciones de unión al antígeno de la presente invención para usar como un medicamento para el tratamiento de la enfermedad autoinmune.

En aún otro aspecto, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento o la prevención de trastornos o afecciones descritos anteriormente. El artículo de manufactura comprende un recipiente y un rótulo. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición de un anticuerpo de la invención que es efectiva para prevenir o tratar el trastorno o afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja para inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es un anticuerpo antiIL-23 de la invención. El rótulo sobre o asociado con el recipiente indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. El artículo de fabricación también puede comprender un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir adicionalmente otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones

para el uso.

La invención se ilustra por los siguientes ejemplos que no pretenden ser limitantes de ningún modo. Ejemplo 1 Ensayo de inhibición de IL-23

Se usa un ensayo de esplenocitos de ratón para determinar la inhibición de la actividad de IL-23 sobre la base de la capacidad de IL-23 para estimular la secreción de IL-17 de las células del bazo de ratón. Los anticuerpos de la presente invención se compararon con MAb3A8 y un anticuerpo monoclonal murino disponible en el comercio, MAB 1290 (R&D Systems).

El protocolo básico es el siguiente. Se extirparon los bazos de ratones 1 BALB/c o C57BL/6, se recolectaron los esplenocitos y se preparó una suspensión celular única. Los esplenocitos se lavaron y resuspendieron en RPMI completo (que contiene 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de piruvato de sodio, 2,5 mM de HEPES, 1% de L-glutamina, 0,00035% de 2-mercaptoetanol, 1% de penicilina/estreptomicina, 10% de FCS inactivado por calor y 50 ng/ml de IL-2 humano (R&D Systems). Posteriormente, los esplenocitos se siembran a razón de 500.000 células/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos en un volumen de 100 microlitros.

La IL-23 humana (R&D Systems) en una concentración de 10 pM se preincuba con diluciones seriadas al tercio de los anticuerpos de ensayo en un intervalo de 0,001 a 54 microgramos/ml. La incubación se realiza en una placa de ensayo separada a 37°C, 5% de CO2 durante 90 minutos.

Posteriormente se añaden 100 microlitros de cada muestra de preincubación a las placas de cultivo que contienen esplenocitos y se incuba durante 48-72 horas a 37°C, 5% de CO2. Se usa un kit de ELISA sándwich para IL-23 de ratón (M1700, R&D Systems), para medir la cantidad de IL-23 en cada sobrenadante del cultivo. La IC50 es la cantidad de anticuerpo necesaria para neutralizar 50% de la actividad biológica de IL-23 en los esplenocitos de ratón.

La IC50 de MAb3A8 y los anticuerpos de la presente invención comparados con los de MAB1290 en el ensayo de esplenocitos murinos se muestra en la Tabla 3. Los anticuerpos ejemplificados, MAbQF20 y MAbQF37, neutralizan significativamente la estimulación de IL-23 de la secreción de IL-17 a partir de las células de bazo de ratón que tienen valores de IC50 de menos 20 pM.

Tabla 3: IC50 medida en el ensayo de esplenocitos murinos

MUESTRA: SEQ ID NO HCVR/ LCVR SEQ ID NO HCCR/ LCCR IC50 pM

MAb3A8: 4

MAB1290: 2800

MAbQF20: 48/57 62/63 2

MAbQF37: 52/57 62/63 2

Ejemplo 2

Neutralización de la IL-23 humana

5 La IL-23 humana junto con IL-2 inyectada en ratones es capaz de estimular la producción de IL-17 de ratón en células del bazo. Esta estimulación de IL-17 se bloquea con anticuerpos neutralizantes para la subunidad p19 de IL-23 y se demuestra en el siguiente modelo murino in vivo con una lectura ex vivo de la producción de IL

17.

10 Los ratones C57BL/6 se estimulan con una inyección de IL-2 murina (mIL-2), 22 horas antes de la estimulación de los ratones con mIL-2 más IL-23 humana. Dos horas antes de la estimulación con mIL-2 e hIL-23, los ratones se inyectan con un anticuerpo humanizado de alta afinidad de la presente invención o un anticuerpo control de isotipo apareado (IgG4).

15 Posteriormente se establecen los siguientes grupos: A tiempo= 0, una inyección i.p. de mIL-2 solo (5 µg) o mIL-2 (5 µg) más IL-23 humana (10 µg). A las 7 horas, una inyección i.p. de mIL-2 solo (10 µg) o mIL-2 (10 µg) más IL-23 humana (10 µg)

20 A las 23 horas, una inyección i.p. de mIL-2 solo (5 µg) o mIL-2 (5 µg) más IL-23 humana (10 µg) A las 30 horas, los ratones se sacrifican, se extirpan los bazos y se recolectan los esplenocitos y se prepara una sola suspensión celular. Los esplenocitos se lavan en RPMI completo (que contiene 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de piruvato de

25 sodio, 2,5 mM de HEPES, 1% de L-glutamina, 0,00035% de 2-mercaptoetanol, 1% de penicilina/estreptomicina, 10% de suero de ternero fetal inactivado por calor) y se siembran a razón de 200.000 células/200 µl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos que se preincuba con anticuerpo de hámster anti-CD3e de ratón (5 µg/ml en PBS toda la noche a 4°C). La placa de 96 pocillos posteriormente se incuba durante

30 48-72 horas a 37°C, 5% de CO2.

Se usa un kit de ELISA sándwich para IL-17 de ratón (M1700, R&D Systems) para medir la cantidad de IL-17 en cada sobrenadante del cultivo. Como se muestra en la Tabla 4, MAbQF20 y MAbQF37 neutralizan IL-23 y bloquean significativamente la estimulación de IL-17.

Tabla 4

Anticuerpo / Estimulación: Nivel de IL-17 (pg/ml) Experimento 1 Nivel de IL-17 (pg/ml) Experimento 2

Control de isotipo/IL-2/ IL-23: 4100 4500

MAbQF20 / IL-2/ IL-23: 1600 1500

MAbQF37/IL-2 / IL-23: 1600 1700

Ejemplo 3

Afinidad de unión

10 Las afinidades de MAb3A8 y los anticuerpos de la presente invención se determinan usando mediciones de BIAcore (Tabla 3). BIAcore™ es un sistema biosensor automatizado que mide las interacciones moleculares. (Karlsson, et al. (1991) J. Immunol. Methods 145: 229-240). En estos experimentos el anticuerpo se captura en una superficie a baja densidad en un chip BIAcore™. Se usa etil

15 dimetilaminopropil-carbodiimida (EDC) para acoplar grupos amino reactivo a la proteína A en una celda de flujo de un chip sensor de carboxi-metilo (CM5) BIAcore™. La proteína A se diluye en tampón de acetato de sodio, pH 4,5, y se inmoviliza en una celda de flujo de un chip CM5 usando EDC para producir 1000 unidades de respuesta. Los sitios sin reaccionar se bloquean con etanolamina. Se usa una velocidad de flujo

20 de 60 µl/min. Se realizan múltiples ciclos de unión/elución por la inyección de 10 µl de solución de 2 µg/ml de los anticuerpos de la presente invención, seguido por IL-23 humana en concentraciones decrecientes para cada ciclo (por ejemplo, 1500, 750, 375, 188, 94, 47, 23,5, 12 y 0 picomolar). La elución se realiza con glicina-HCl, pH 1,5. Se usa BIAevaluation™ para analizar los datos cinéticos.

25 La KD de MAb3A8 se compara con los anticuerpos de la presente invención y con el anticuerpo monoclonal MAb1290 neutralizante anti-IL23 disponible en el comercio (Tabla 5). Los resultados indican que los anticuerpos ejemplificados, MAbQF20 y MAbQF37, tienen una constante de afinidad 2-6 veces menor que la de MAb3A8 que tiene valores de KD de menos de aproximadamente 160 pM.

30

Tabla 5. Propiedades de unión de los anticuerpos anti-IL-23 para IL-23 humana determinadas por BIAcore (tampón HBS-EP, pH 7,4 a 25°C)

ANTICUERPO: kon (M -1 seg -1) koff (seg -1) KD (pM)

MAb3A8: 3,0x105 9,12 x 10-5 300

MAb1290*: 3,68 x 104 7,68 x 10 -4 21.400

MAbQF20: 1,55x106 1,15 x 10 -4 74

MAbQF37: 1,55 x 106 1,53 x 10 -4 98

*anticuerpo anti-IL-23 humano monoclonal, murino (R&D Systems)

5 Ejemplo 4 Mapeo de epitopos de IL-23

El epitopo de la subunidad p19 de IL-23 reconocido por los anticuerpos humanizados de la presente invención está comprendido dentro de los residuos de aminoácidos 129 a 159 de la SEQ ID NO:60. El epitopo se determina por la

10 espectrometría de masas de intercambio de deuterio en amida (DXMS). DXMS es útil para determinar las interacciones proteína-proteína entre la subunidad p19 de IL-23 y los anticuerpos humanizados de la presente invención. Un fragmento Fab de MAb3A8 se usa como modelo de fragmento de unión. Varios epitopos se identifican con este procedimiento e incluyen además de los residuos 129

15 a 159 de la SEQ ID NO: 60, los residuos 129-152; 151-159; y 134-152, con todas las posiciones del residuo basadas en la SEQ ID NO: 60. Se utiliza un ensayo de competición ELISA estándar para determinar que los anticuerpos humanizados de la presente invención se unen al mismo epitopo que MAb3A8. Los anticuerpos humanizados candidatos se ensayan con MAb3A8

20 biotinilado de una manera dependiente de la concentración. Una competición dependiente de la concentración indica que los anticuerpos competidores se unen al mismo epitopo de la IL-23 madura. En consecuencia, los anticuerpos humanizados de la presente invención se unen al epitopo identificado anteriormente de la subunidad p19 de IL-23 y neutralizan la actividad de IL-23 y de este modo son útiles para tratar

25 trastornos inflamatorios asociados con la expresión de IL-23 tales como la enfermedad autoinmune, preferentemente esclerosis múltiple. Ejemplo 5 Modelo de EAE para esclerosis múltiple

La EAE es una enfermedad desmielinizante mediada por células T CD4+ del sistema nervioso central (SNC) que sirve como modelo para la EM en seres humanos. El mecanismo patogénico del desarrollo de EAE incluye la activación de las células T específicas de antígeno y la diferenciación Th1 seguida por la infiltración de células T y macrófagos en el SNC. La IL-23 estimula la secreción de IL-17 de las células T y la IL17 contribuye a la patología de la esclerosis múltiple (MS). Se han identificado niveles elevados de IL-23 en el suero de pacientes con EM y el análisis de micromatriz de las lesiones de EM de pacientes humanos ha demostrado un aumento de IL-17 (Lock, et al. Nat. Med. 8:500-508, 2002). Las células mononucleares (MNC) que expresan ARNm de IL-17 en sangre o líquido cefalorraquídeo están significativamente elevadas en numerosos pacientes con EM y cantidades mayores de MNC que expresan ARNm de IL-17 se detectaron durante el agravamiento clínico de la EM en comparación con la remisión (Matusevicius, et al. Multiple Sclerosis, 5: 1-1-104, 1999).

El ejemplo descrito en la presente memoria demuestra el efecto de un anticuerpo anti-IL-23 en el modelo de EAE remitente-recidivante, en el que un anticuerpo anti-IL-23 murino inhibe la secreción de IL-17 de las células T y en consecuencia, reduce la puntuación de EAE en el modelo de EAE activo. Para la inducción de enfermedad, se inyectan ratones SJL/J de 8-9 semanas por vía subcutánea en dos sitios del flanco en el día 0 con 100 µl de Adyuvante Completo de Freund (CFA) que contiene 50 µg de PLP 139-151 y 200 µg de Mycobacterium tuberculosis H37 RA. En el día de la primera remisión (día 23-26), los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos de tratamiento: (i) vehículo (PBS), (ii) anticuerpo control isotipo IgG1, 10 mg/kg, y, (iii) anticuerpo murino IgG1 monoclonal anti-IL-23 murina, 10 mg/kg. Se inyectó a los animales con 0,2 ml, i.p., a partir del día de la primera remisión y posteriormente en forma semanal durante 6 semanas.

Los ratones se calificaron desde el día 7 hasta el día 60 por los niveles de parálisis. Los ratones se sacrificaron una semana después del tratamiento final. Los signos clínicos de la enfermedad se desarrollan aproximadamente del día 12 al día 15 con el pico de la enfermedad que ocurre aproximadamente del día 17 al día 22. Los animales individuales fueron calificados subjetivamente por al menos 2 calificadores en forma independiente que eran ciegos con respecto a la identidad de los grupos de tratamiento de acuerdo con la gravedad de la enfermedad clínica del SNC. Grado 0 es normal; Grado 0,5, cojera distal o cola espástica; Grado 1 cola fláccida completa; Grado 1,5 cola fláccida y debilidad de miembros traseros; Grado 2,0 parálisis parcial unilateral de miembros traseros; Grado 2,5 parálisis parcial bilateral de miembros traseros; Grado 3,0 parálisis bilateral completa de miembros traseros; Grado 3,5 parálisis completa de miembros traseros y parcial unilateral de miembros delanteros; Grado 4,0 parálisis total de miembros traseros y delanteros; Grado 5,0 Moribundo o muerte. El grupo de tratamiento del anticuerpo para IL-23 tiene puntuaciones de enfermedad significativamente menores en comparación con el grupo control del

5 isotipo.

Los bazos de los ratones en cada grupo de tratamiento se extirpan y se obtienen suspensiones celulares únicas e individuales de los esplenocitos. Los esplenocitos se cultivan durante 2 días en presencia de PLP (el péptido usado para inducir el inicio de EAE, en consecuencia una re-estimulación de la población celular

10 inmunológica en un contexto ex vivo). Después de 2 días los sobrenadantes del cultivo se analizan para determinar la concentración de 22 citoquinas/quimoquinas (para lo que se utiliza un kit estandarizado por Linco, Inc.). Los sobrenadantes del cultivo del grupo tratado con el Mab control de isotipo tienen una concentración de IL-17 de aproximadamente 450 pg/ml mientras que los sobrenadantes del cultivo del grupo

15 tratado con el Mab anti-IL-23 tienen una concentración de IL-17 de aproximadamente 175 pg/ml. En consecuencia, se observa una reducción significativa (p<0,002) de la concentración de IL-17 de ratón en el grupo tratado con el Mab anti-IL-23.

Listado de secuencias

imagen1

Claims

Reivindicaciones

1. Un anticuerpo monoclonal anti-IL23, o la porción de unión al antígeno de este, que comprende:

(i)

una secuencia de LCDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO:28;

(ii)

una secuencia de LCDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO:37;

(iii) una secuencia de LCDR3 de acuerdo con la ID NO:40;

(iv)

una secuencia de HCDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO:3;

(v)

una secuencia de HCDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO:8; y

(vi)

una secuencia de HCDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:19.
2.

El anticuerpo, o la porción de unión al antígeno de este, de la reivindicación 1 que es un anticuerpo humanizado.
3.

El anticuerpo o la porción de unión al antígeno de este de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la región variable de la cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO:48 o en la SEQ ID NO:52 y una región variable de la cadena liviana que se muestra en la SEQ ID NO:57.
4.

El anticuerpo de la reivindicación 3, en el que la cadena pesada del anticuerpo tiene la región constante de la SEQ ID NO:61 o la región constante de la SEQ ID NO:62 y la cadena liviana del anticuerpo tiene la región constante de la SEQ ID NO:63.
5.

El anticuerpo de la reivindicación 3 en el que la cadena pesada del anticuerpo tiene la región constante que se muestra en la SEQ ID NO: 62 y la cadena liviana del anticuerpo tiene la región constante que se muestra en la SEQ ID NO:63.
6.

Una composición farmacéutica que comprende los siguientes:

(a) el anticuerpo o la porción de unión al antígeno de este de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y (b) un portador farmacéutico aceptable.
7.

Un anticuerpo o la porción de unión al antígeno de este, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso como medicamento.
8.

El uso del el anticuerpo o porción de unión al antígeno de este, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de un medicamento para tratar un paciente con esclerosis múltiples remitente recidivante.
9.

Un anticuerpo o la porción de unión al antígeno de este de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para usar en el tratamiento de la esclerosis múltiple remitente recidivante.