BRPI0615018A2 - anticorpos anti-il-23, ou porção de ligação de antìgeno do mesmo, composição contendo o mesmo e referido uso - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTI-IL-23, OU PORçãO DE LIGAçãO DE ANTIGENO DO MESMO, COMPOSIçãO CONTENDO O MESMO E REFERIDO USO A presente invenção envolve anticorpos isolados, ou porções de ligação de antígeno dos mesmos, que especificamente se ligam à subunidade p19 de IL-23. Estes anticorpos, ou porções de ligação de antígeno dos mesmos, são anticorpos de neutralização de alta afinidade para o tratamento de doença auto-imune.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR-POS ANTI-IL-23, OU PORÇÃO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO DO MESMO,COMPOSIÇÃO CONTENDO O MESMO E REFERIDO USO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção está no campo da medicina, particularmen-te no campo de anticorpos monoclonais contra interleucina 23 (IL-23). Maisespecificamente, a invenção refere-se à neutralização de anticorpos mono-clonais anti-IL-23 para o tratamento de doenças auto-imunes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

IL-23 é uma citoquina acreditada ser importante para ativação deuma faixa de células inflamatórias que são requeridas para a indução de in-flamação crônica. IL-23 tem uma função separada, mas complementar a IL-12, uma citoquina heterodimérica de 70KDa consistindo em subunidadesp40 e p35 covalentemente ligadas. IL-23 é composta da mesma subunidadep40 como IL-12, mas covalentemente emparelhada com uma subunidadep19 (Langrish et. ai, Immunological Reviews 202:96-105, 2004).

Além disso, a IL-23 tem sido implicada para desempenhar umpapel importante em respostas de célula T de memória/patogênica pelapromoção da secreção da citoquina pró-inflamâtoriã lL-17 de células T ativa-das. Existe evidência aumentada que altos níveis de IL-17 estão associadoscom doenças inflamatórias auto-imunes, incluindo artrite reumatóide, psoría-se, e esclerose múltipla (Aggarwal et ai, J. Biol. Chem 278(3):1910-1914,2003). Desse modo, um anticorpo de neutralização para IL-23 inibirá a se-creção e efeitos pró-inflamatórios de IL-17 e, por último, o efeito de IL-17 nasdoenças inflamatórias.

Embora anticorpos para humano tenham sido reportados anteri-ormente, anticorpos de neutralização de alta afinidade para humano IL-23que reconhecem um epítopo específico na subunidade p19, não têm sidorevelados. Sem questão, existe uma necessidade de terapias de modifica-ção de doença para o tratamento de doença auto-imune.

Conseqüentemente, existe uma necessidade de um anticorpo deneutralização de alta afinidade que liga a subunidade p19 de IL-23 e, dessemodo, bloqueia as ações pró-inflamatórias de IL-17, que pode ser utilizadocomo um agente terapêutico. Um anticorpo de alta afinidade que liga especi-ficamente a subunidade p19 de IL-23 é também desejável, em que ele podepermitir que o anticorpo a ser administrado a um paciente subcutaneamentee preferivelmente do que intravenosamente. Existe também uma necessida-de de um anticorpo que liga especificamente a subunidade p19 de IL-23 comum valor IC50 baixo em um ensaio de inibição de IL-23, de modo a gerar umanticorpo terapêutico anti-IL-23 com uma dose terapêutica efetiva mínima. Apresente invenção satisfaz estas necessidades e proporciona vantagens re-acionadas, portanto, proporcionando um tratamento útil de doença auto-imune.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma concretização desta invenção é um anticorpo, ou porção deligação de antígeno do mesmo, que especificamente se liga à subunidadep19 de IL-23, neutraliza a atividade de IL-23, tem um K0 de menos do quecerca de 160pM, e tem um IC5o de menos do que cerca de 20pM.

Outra concretização é um anticorpo, ou porção de ligação deantígeno do mesmo, que se liga à subunidade p19 de IL-23, dentro de resí-duos de aminoácido 129 a 159 da seqüência de aminoácido mostrada emSEQ ID N0:60.

Outra concretização desta invenção é um anticorpo, ou porçãode ligação de antígeno do mesmo, compreendendo a região variável de ca-deia pesada, conforme mostrada em SEQ ID NO: 52; a região variável decadeia leve, conforme mostrada em SEQ ID NO:57, a região constante decadeia pesada, conforme mostrada em SEQ ID NO:62, e a região constantede cadeia leve, conforme mostrada em SEQ ID NO:63.

Outra concretização desta invenção envolve um anticorpo, ouporção de ligação de antígeno do mesmo, que especificamente se liga à su-bunidade p19 de IL-23, compreendendo uma região variável de cadeia pe-sada contendo uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupoconsistindo em SEQ ID NOS:44-55, e uma região variável de cadeia levecontendo uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo con-sistindo em SEQ ID NOS:56-59.

Outra concretização desta invenção é um anticorpo, ou porçãode ligação de antígeno do mesmo, que especificamente se liga à subunidadep19 de IL-23, compreendendo uma região variável de cadeia leve contendouma seqüência de aminoácido conforme mostrada em SEQ ID NO:57, euma região variável de cadeia pesada contendo uma seqüência de aminoá-cido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOS:48, 49, ou 52.

Em outra concretização, um LCVR de um anticorpo monoclonalanti-IL-23 da invenção compreende 1, 2 ou 3 peptídeos selecionados a partirdo grupo consistindo em peptídeos com uma seqüência conforme mostradaem (a) SEQ ID NOs:26-35; (b) SEQ ID NOs:37-38, e (c) SEQ ID N0:40 (istoé, um peptídeo de (a), um peptídeo de (b) e um peptídeo de (c) para um an-ticorpo compreendendo 3 referidos peptídeos), em LCDR1, LCDR2, e LC-DR3, respectivamente.

Em outra concretização, um HCVR de um anticorpo monoclonalanti-IL-23 da invenção compreende 1, 2 ou 3 peptídeos selecionados a partirdo grupo consistindo em peptídeos com uma seqüência conforme mostradaem (a) SEQ ID N0s:1-4; (b) SEQ ID N0s:5-11, e (c) SEQ ID NOs:13-21 (istoé, um peptídeo de (a), um peptídeo de (b) e um peptídeo de (c) para um an-ticorpo compreendendo 3 referidos peptídeos), em HCDR1, HCDR2, e HC-DR3, respectivamente.

A presente invenção proporciona adicionalmente um anticorpomonoclonal anti-IL-23 compreendendo seis peptídeos selecionados a partirdo grupo consistindo em peptídeos com uma seqüência conforme mostradaem (a) SEQ ID NOs:26-35; (b) SEQ ID NOs:37-38, (c) SEQ ID N0:40, (d)SEQ ID NOs:1-4; (e) SEQ ID NOs:5-11, e (f) SEQ ID NOs:13-21 (isto é, umpeptídeo de cada um de (a-f)), em LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HC-DR2, e HCDR3, respectivamente.

A presente invenção proporciona adicionalmente um anticorpomonoclonal anti-IL-23 compreendendo seis peptídeos com uma seqüênciaconforme mostrada em SEQ ID N2Ml, 42, 43, em LCDR1, LCDR2, e LC-DR3, respectivamente, e SEQ ID NOS:22, 23 e 24, HCDR1, HCDR2, e HC-DR3, respectivamente.

Outra concretização da invenção proporciona anticorpos mono-clonais anti-IL-23 humanizados, e porções de ligação de antígeno dos mes-mos, que se ligam a um epítopo específico compreendendo resíduos de a-minoácido 129 a 159 da subunidade p19 de IL-23; (resíduos 129-159 deSEQ ID N0:60), e antagonizam ou neutralizam pelo menos uma atividadebiológica in vitro ou in vivo associada com IL-23, ou uma porção do mesmo.

Em outra concretização, os anticorpos da invenção têm um IC5ode menos do que ou igual à cerca de 100pM, 75pM, 50pM, 25pM, 20pM, 15pM, 13pM, 10pM, 8pM, 5pM, 2pM, ou 1pM em um ensaio de esplenócito demurina in vitro, conforme descrito no Exemplo 1. Preferivelmente1 os anticor-pos da invenção têm um IC5o de menos do que ou igual à cerca de 20pM.

Em outra concretização, os anticorpos da invenção são caracte-rizados por uma forte afinidade de ligação (K0) para a subunidade p19 de IL-23 humano, isto é, menos do que cerca de 160pM, 100pM, 75pM, 50pM, ou25pM. Preferivelmente, os anticorpos da invenção têm um K0 de menos doque cerca de 100pM. Além disso, os anticorpos da invenção são adicional-mente caracterizados com uma taxa kott a partir da subunidade p19 de IL-23humano de menos do que 4 χ 10"4s'1.

Outra concretização da presente invenção inclui o anticorpo iso-lado de qualquer uma das concretizações acima nas quais o anticorpo é umanticorpo de comprimento total, um anticorpo substancialmente intacto, umanticorpo quimérico, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, ou um frag-mento Fv de cadeia simples. Preferivelmente, o anticorpo isolado, ou porçãode ligação de antígeno do mesmo, de qualquer das concretizações acima, éum anticorpo humanizado.

A invenção inclui ácidos nucléicos isolados compreendendo po-linucleotídeos que codificam os anticorpos descritos e reivindicados aqui. Ainvenção também envolve células hospedeiras transfectadas com vetorescontendo estes polinucleotídeos que expressam os anticorpos descritos ereivindicados aqui.A invenção envolve um método de tratamento de doença auto-imune, que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficazde um anticorpo descrito e reivindicado aqui. Preferivelmente, a doença au-to-imune tratada é esclerose múltipla.

Finalmente, a invenção envolve o uso de um anticorpo para afabricação de um medicamento para tratamento de doença auto-imune emum indivíduo em necessidade do mesmo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esta presente invenção proporciona seqüências de aminoácidode anticorpos humanos isolados, ou porções de ligação de antígeno dosmesmos, que especificamente se ligam à subunidade p19 de IL-23, e sãoúteis para o tratamento de doença auto-imune.

De modo que a presente invenção possa ser mais prontamentecompreendida, certos termos são primeiro definidos.

A subunidade p19 de IL-23 humano é um polipeptídeo de ami-noácido 189 contendo um 21 como seqüência líder [SEQ ID N0:60].

O termo "anticorpo", conforme aqui usado, é pretendido para sereferir a moléculas de imunoglobulina compreendidas de quatro cadeias depolipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadaspor ligações de disulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida de uma regi-ão variável de cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH), e umaregião constante de cadeia pesada (abreviada aqui como HCCR ou CH). Aregião constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1,CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável decadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL), e uma região constante decadeia leve (abreviada aqui como LCCR). A região constante de cadeia leveé compreendida de um domínio, CL.

As regiões HCVR e LCVR podem ser adicionalmente subdividi-das em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinaçãode complementaridade ("CDRs"), entremeadas com regiões que são maisconservadas, denominadas regiões de estrutura ("FR"). Cada HCVR e LCVRé composta de três CDRs e quarto FRs, dispostas de amino-terminal paracarbóxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3,FR4. Aqui, as 3 CDRs da cadeia pesada são referidas como "HCDR1, HC-DR2, e HCDR3", e as 3 CDRs da cadeia leve são referidas como "LCDR1,LCDR2 e LCDR3." As CDRs contêm muito dos resíduos que formam intera-ções específicas com o antígeno. A numeração e posicionamento de resí-duos de aminoácido CDR dentro das regiões HCVR e LCVR estão de acor-do com a convenção de numeração de Kabat bem conhecida.

As cadeias leves são classificadas como capa e lâmbda. As ca-deias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou epsilon, edefinem o isótopo do anticorpo como IgG (subclasses IgGi, IgG2, IgG3 eIgG4), IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pe-sadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" decerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindouma região "D" de cerca de 3 ou mais aminoácidos.

O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo, con-forme aqui usado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo queretêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo,a subunidade p19 de IL-23). Foi mostrado que a função de ligação de antí-geno de um anticorpo pode ser realizada pelos fragmentos de um anticorpode comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação envolvidos dentrodo termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo, incluem (i) umfragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL,VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreen-dendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de disulfeto na região dearticulação; (iii) e fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CH1; (iv) umfragmento Fv consistindo dos domínios VL e VH de um braço simples de umanticorpo, (v) um fragmento dAb, que consiste em um domínio VH; e (vi)uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR). Alémdisso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH serem codificadospor genes separados, eles podem ser unidos, usando-se métodos recombi-nantes, por um Iigante sintético que os capacitam a serem produzidos comouma cadeia de proteína simples na qual as regiões VL e VH se emparelhampara formarem moléculas monovalentes (conhecidas como cadeia simplesFv (scFv). Tais anticorpos de cadeia simples são também pretendidos paraserem envolvidos dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de umanticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tais como diacor-pos, são também envolvidas. Os diacorpos são anticorpos bivalentes bies-pecíficos nos quais os domínios VH e VL são expressos em uma cadeia depolipeptídeo simples, mas usando-se um Iigante que é muito curto para per-mitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando,desse modo, os domínios a emparelharem com domínios complementaresde outra cadeia, e criando dois locais de ligação de antígeno.

As CDRs da região de ligação de antígeno dos anticorpos dainvenção são totalmente ou substancialmente de origem murina, opcional-mente com certos resíduos de aminoácidos alterados, por exemplo, substitu-ídos com um resíduo de aminoácido diferente, (ver, por exemplo, Tabelas 1e 2) para otimizar uma propriedade particular do anticorpo, por exemplo, KD,koff, IC50. Em outras concretizações, a região de ligação de antígeno de umanticorpo IL-23 da invenção pode ser derivada de outra espécie não-humanaincluindo, mas não limitado a, coelho, rato ou hamster. Alternativamente, aregião de ligação de antígeno pode ser derivada de seqüência de humano.

O termo "anticorpo monoclonal" conforme aqui usado, não estálimitado a anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridoma. "Anti-corpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado de uma cópiasimples ou clone, incluindo, por exemplo, eucariótico, procariótico, ou clonede fago, e não o método pelo qual ele é produzido. Um "anticorpo monoclo-nal" pode ser um anticorpo intacto (compreendendo uma região de compri-mento completo ou total Fc), um anticorpo substancialmente intacto, ou umaporção ou fragmento de um anticorpo compreendendo uma porção de liga-ção de antígeno, por exemplo, um fragmento Fab, fragmento Fab' ou frag-mento F(ab')2 de um anticorpo de murina, ou de um anticorpo quimérico hu-manizado, ou anticorpo humano.

O termo "anticorpo humanizado" significa um anticorpo que écomposto parcialmente ou totalmente de seqüências de aminoácido deriva-das de uma linha de germe de anticorpo humano, ou uma seqüência rear-ranjada e produzida pela alteração da seqüência de um anticorpo tendo re-giões de determinação de complementaridade (CDR) não-humanas (preferi-velmente um anticorpo monoclonal de camundongo). As regiões de estruturadas regiões variáveis são substituídas por regiões de estrutura humana cor-respondentes (ou uma porção significante ou substancial destas, isto é, pelomenos cerca de 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, e seguem anumeração de Kabat), e são codificadas pela informação da seqüência deácido nucléico que ocorre na região de imunoglobulina de linha de germehumana, ou nas formas recombinadas e que sofreram mutação destas, seou não referidos anticorpos são produzidos em célula humana.

As CDRs de um anticorpo humanizado podem ser alteradas ouotimizadas a partir das CDRs de um anticorpo de origem não-humano doqual eles se originam para gerarem propriedades desejadas, por exemplo,especificidade, afinidade e/ou ligação preferencial. As CDRs alteradas ouotimizadas podem ter substituições, adições e retiradas de aminoácidoquando comparadas a uma CDR de origem, preferivelmente cerca de 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 totais dentro dos seis domínios de CDR. Por exemplo,as posições do aminoácido das CDRs que estão em SEQ ID NOS: 44-59são posições que foram alteradas a partir das CDRs conforme mostrado pa-ra Mab3A8. Alternativamente, anticorpo de murina Mab3A8 pode ser um an-ticorpo de origem para comparação de CDRs de um anticorpo da invenção.Conforme aqui discutido, o anticorpo no contexto de anticorpo humanizadonão está limitado a um anticorpo de comprimento total, e pode incluir frag-mentos e formas de cadeia simples.

O termo "anticorpo humano recombinante", conforme aqui usa-do, é pretendido para incluir todos os anticorpos humanos que são prepara-dos, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como an-ticorpos expressos usando-se um vetor de expressão recombinante transfec-tado em uma célula hospedeira, anticorpos isolados de um recombinante,biblioteca de anticorpo humano combinatorial, anticorpos isolados de umanimal (por exemplo, um camundongo), que é transgênico para genes deimunoglobulina humana, ou anticorpos preparados, expressos, criados ouisolados por quaisquer outros meios que envolvam repartição de seqüênciasde gene de imunoglobulina humana para outras seqüências de DNA. Taisanticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes deri-vadas de seqüências de imunoglobulina de linha de germe humana. Em cer-tas concretizações, contudo, tais anticorpos humanos recombinantes sãosubmetidos à mutagênese in vitro e, desse modo, as seqüências de aminoá-cido das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são seqüênciasque, enquanto derivadas de e relacionadas a seqüências de VH e VL de Ii-nha de germe humana, podem não existirem naturalmente dentro do reper-tório de linha de germe de anticorpo humano in vivo.

Um "anticorpo isolado", conforme aqui usado, é pretendido parase referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpostendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo iso-lado que se liga especificamente à subunidade p19 de IL-23 humano é subs-tancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a outros antí-genos). Um anticorpo isolado que se liga especificamente à subunidade p19de IL-23 humano pode, contudo, ter reatividade cruzada a outros antígenos,tais como moléculas de IL-23 de outras espécies. Além disso, um anticorpoisolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou químicos.

Um "anticorpo de neutralização", conforme aqui usado, é preten-dido para se referir a um anticorpo cuja ligação à subunidade p19 de IL-23humano resulta na inibição da atividade biológica de IL-23 humano. A medi-ção de um ou mais indicadores de atividade biológica de IL-23, conformedeterminada usando-se, ou o bioensaio de esplenócito de camundongo [E-xemplo 1], ou o ensaio de neutralização de IL-23 humano [Exemplo 2], podeacessar esta inibição da atividade biológica do IL-23 humano.

Um anticorpo "variante" refere-se aqui a uma molécula que dife-re na seqüência de aminoácido de uma seqüência de aminoácido de anti-corpo "de origem" em virtude da adição, retirada e/ou substituição de uma oumais resíduo(s) de aminoácido da seqüência de anticorpo de origem. Emuma concretização preferida, o anticorpo variante compreende pelo menosuma adição, retirada e/ou substituição de aminoácido nas regiões CDR doanticorpo de origem (por exemplo, de uma a cerca de dez, e preferivelmente2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8). A identidade ou homologia com relação à seqüência deanticorpo variante é definida aqui como a percentagem de resíduos de ami-noácido na seqüência de anticorpo variante que são idênticas aos resíduosde anticorpo de origem após alinhamento das seqüências e introdução defolgas, se necessário, para alcançar a identidade de seqüência de percenta-gem máxima. O anticorpo variante retém a capacidade de se ligar ao antíge-no, ou preferivelmente, ao epítopo, a qual o anticorpo de origem se liga epreferivelmente tem pelo menos uma propriedade ou bioatividade que é su-perior àquela do anticorpo de origem. Por exemplo, o anticorpo variante pre-ferivelmente tem afinidade de ligação mais forte, taxa mais lenta, IC5o maisbaixo, ou capacidade aumentada de inibir uma bioatividade de antígeno doque o anticorpo de origem. Um anticorpo variante de interesse particular aquié um que mostra aumento de pelo menos cerca de duas vezes, preferivel-mente pelo menos cerca de 5 vezes, 10 vezes ou 20 vezes em uma proprie-dade ou bioatividade quando comparado ao anticorpo de origem.

O anticorpo "de origem" aqui é um que contém a seqüência deaminoácido usada para a preparação de um anticorpo variante. O anticorpode origem pode ter seqüência de estrutura de origem murina, mas preferi-velmente a seqüência de estrutura é totalmente ou substancialmente de ori-gem humana. O anticorpo de origem pode ser um anticorpo de murina, qui-mérico, humanizado ou humano.

Anticorpos que "se ligam especificamente" ligam a subunidadep19 de IL-23 humano, mas não ligam a subunidade p40 de IL-23 humano.Um anticorpo que liga especificamente o IL-23 humano pode mostrar algumareatividade cruzada com o IL-23 de outras espécies.

O termo "epítopo" refere-se àquela porção de uma molécula ca-paz de ser reconhecida por e ligada por um anticorpo em uma ou mais regi-ões de ligação de antígeno de anticorpo. Os epítopos freqüentemente con-sistem de um grupamento de superfície quimicamente ativa de moléculas,tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar, e têm característicasestruturais tri-dimensionais, bem como características de carga específicas.Pela "inibição do epítopo" e/ou "neutralização do epítopo" é pretendido umepítopo, que quando no contexto da molécula antigênica intacta e quandoligado por um anticorpo específico ao epítopo, resultam na perda ou diminui-ção de uma atividade biológica da molécula in vivo ou in vitro, ou em um or-ganismo contendo a molécula. O termo "epítopo antigênico," conforme aquiusado, é definido como uma porção de um polipeptídeo ao qual um anticor-po pode especificamente se ligar conforme determinado por qualquer méto-do bem conhecido na técnica, por exemplo, por imunoensaios convencio-nais. Um "epítopo não-linear" ou "epítopo conformacional" compreende poli-peptídeos não-contíguos (ou aminoácidos) dentro da proteína antigênica aqual um anticorpo específico se liga ao epítopo.

O termo "kon", conforme aqui usado, é pretendido para se referirà associação, ou constante de taxa "on", ou taxa de reação específica deavanço, ou reação de formação de complexo,medida em unidades: M'1s"1.

O termo "koff", conforme aqui usado, é pretendido para se referirà dissociação, ou constante de taxa "off", ou taxa de reação específica, paradissociação de um anticorpo a partir do anticorpo/complexo de antígeno,medida em unidades: s"1.

O termo "KD", conforme aqui usado, é pretendido para se referirà constante de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular.

Ela é calculada pela fórmula:

koff/kon = Kd

Os anticorpos da presente invenção são anticorpos de alta afini-dade, geralmente exibindo baixos valores de koff. Para proposta da presentedescrição, o termo "alta afinidade" refere-se a uma afinidade ou K0 de entre1,6 χ 10"10 M a cerca de 4,5 χ 1011M.

O termo "potência" é uma medição de atividade biológica, e édesignada como IC50, ou concentração eficaz de anticorpo necessária paraneutralizar 50% da bioatividade de IL-23 nos esplenócitos de camundongono bioensaio descrito no Exemplo 1.O termo "molécula de ácido nucléico", conforme aqui usado, épretendido para incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molé-cula de ácido nucléico pode ser de espiral simples ou de espiral dupla, maspreferivelmente é DNA de espiral dupla.

O termo "molécula de ácido nucléico isolada", conforme aquiusado, em referência a ácidos nucléicos que codificam anticorpos ou por-ções de anticorpo (por exemplo, VH, VL, CDR3) que ligam IL-23 humano, épretendido para se referir a uma molécula de ácido nucléico na qual as se-qüências de nucleotídeo que codificam o anticorpo ou porção de anticorposão livres de outras seqüências de nucleotídeo que codificam anticorpos ouporções de anticorpo que ligam antígenos outros do que IL-23 humano, cu-jas outras seqüências podem naturalmente flanquearem o ácido nucléico emDNA genômico humano. Desse modo, por exemplo, um ácido nucléico iso-lado da invenção que codifica uma região de VH de um anticorpo anti-IL-23humano não contém outras seqüências que codificam outras regiões de VHque ligam antígenos outros do que IL-23 humano.

O termo "vetor", conforme aqui usado, é pretendido para se refe-rir a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nu-cléico ao qual ele foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que refere-se a um laço de DNA de espiral dupla circular no qual segmentos de DNAadicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, no qualsegmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral.

O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente"célula hospedeira"), conforme aqui usado, é pretendido para se referir auma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido.

O anticorpo monoclonal 3A8 é um anticorpo monoclonal de mu-rina (MAb3A8) que se liga especificamente a um epítopo na subunidade p19de IL-23 humano. O MAb3A8 foi humanizado e otimizado, resultando emanticorpos de alta afinidade com atividade de neutralização de IL-23 potente,e altamente específicos para subunidade p19, mas não a subunidade p40 deIL-23.

Os anticorpos preferidos, ou porções de ligação de antígeno dosmesmos da presente invenção exibem alta afinidade (valores baixos de KD)para o mesmo epítopo como MAb3A8, e têm afinidade de ligação superioràquela observada para MAb3A8. As propriedades de ligação que definem osanticorpos da presente invenção residem somente nas regiões variáveis doanticorpo, mais especificamente as regiões de CDR do anticorpo.

O ímpeto primário para humanização de anticorpos de outrasespécies é reduzir a possibilidade que o anticorpo causa uma resposta imu-ne quando injetado em um paciente humano como uma terapêutica. Quantomais seqüências humanas são empregadas em um anticorpo humanizado,menor o risco de imunogenicidade. Em adição, os anticorpos humanizadosinjetados têm uma meia-vida mais longa na circulação do que anticorposnão-humanos injetados. Além disso, se função efetuadora é desejada, por-que a porção efetuadora é humana, ela pode interagir melhor com as outraspartes do sistema imune humano. Mudanças podem ser feitas nas seqüên-cias aqui descritas, como regiões de cadeia pesada e leve preferíveis semafetar significantemente as propriedades biológicas do anticorpo. Isto é es-pecialmente verdadeiro para as regiões constantes do anticorpo, e partesdas regiões variáveis que não influenciam a capacidade das CDRs para seligar ao IL-23.

Além disso, conforme discutido aqui, regiões variáveis de estru-tura humana, e variantes destas, podem ser usadas na presente invenção.Contudo, indiferente da estrutura escolhida, se a redução do risco de imuno-genicidade é um foco, o número de mudanças relativas à estrutura humanaescolhida é minimizado.

O anticorpo humanizado da presente invenção pode compreen-der ou ser derivado de uma estrutura de cadeia leve de linha de germe hu-mana. Em concretizações particulares, a seqüência de linha de germe decadeia leve é selecionada a partir de seqüências VK humanas, incluindo,mas não limitadas a, A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26,A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19,L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, 01, 011, 012, 014,018, 02, 04, e 08. Em certas concretizações, esta estrutura de linha degerme humana de cadeia leve é selecionada de V1 -11, V1 -13, V1 -16, V1 -17,Vl-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4,V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4, e V5-6.

Em outras concretizações, o anticorpo humanizado da presenteinvenção pode compreender ou ser derivado de uma estrutura de cadeiapesada de linha de germe humana. Em concretizações particulares, estaestrutura de linha de germe humana de cadeia pesada é selecionada a partirde VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20,VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9,VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1,e VH7-81.

Em concretizações particulares, a região variável de cadeia levee/ou a região variável de cadeia pesada compreendem uma região de estru-tura, ou pelo menos uma porção de uma região de estrutura (por exemplo,contendo 2 ou 3 sub-regiões, tais como FR2 e FR3). Em certas concretiza-ções, pelo menos FRL1, FRL2, FRL3, ou FRL4 é totalmente humana. Emoutras concretizações, pelo menos FRH1, FRH2, FRH3, ou FRH4 é total-mente humana. Em algumas concretizações, pelo menos FRL1, FRL2,FRL3, ou FRL4 é uma seqüência de linha de germe (por exemplo, linha degerme humana), ou compreendem seqüências de consenso humanas para aestrutura particular. Em outras concretizações, pelo menos FRH1, FRH2,FRH3, ou FRH4 é uma seqüência de linha de germe (por exemplo, linha degerme humana), ou compreendem seqüências de consenso humanas para aestrutura particular. Em concretizações preferidas, toda a região de estruturaé região de estrutura humana.

Seqüências de região constante de cadeia pesada preferidas deaminoácido dos anticorpos humanizados da presente invenção incluem aregião constante IgGI, região constante IgGI [SEQ ID NO:61], ou a regiãoconstante lgG4 [SEQ ID NO:62]. A seqüência de aminoácido de região cons-tante de cadeia leve humana preferida do anticorpo humanizado da presenteinvenção é a região constante de cadeia kappa [SEQ ID NO:63].

Além disso, a estrutura de região de cadeia pesada variável hu-mana preferida é VH1-24 [SEQ ID NO:64], e a estrutura de região de cadeialeve variável humana preferida é A17 [SEQ ID NO:65]. SEQ ID NOS: 64 e 65representam as seqüências de linha de germe humanas com CDRs nativos.

As CDRs de MAb3A8 são adicionadas junto com as melhores regiões J hu-manas equiparadas para formar as regiões variáveis completas. É compre-endido que seqüências de estrutura de região constante de cadeia pesadaou leve humanas adicionais outras do que aquelas acima descritas são con-templadas para a presente invenção, e são conhecidas na técnica.

A presente invenção envolve anticorpos ou porções de ligaçãode antígeno dos mesmos, que se ligam a um epítopo específico na subuni-dade p19 de IL-23, e neutralizam a atividade de IL-23. Desse modo, as C-DRs e regiões variáveis de cadeia pesada e leve aqui descritos são usadospara produzir anticorpos de comprimento total, bem como fragmentos fun-cionais e análogos que mantêm a afinidade de ligação da proteína que em-prega as CDRs específicos para subunidade p19 de IL-23.

A afinidade de ligação de MAb3A8 é determinada usando-seressonância de plasmon de superfície (BlAcore®). Nestes experimentos, oanticorpo é capturado em baixa densidade por, ou proteína A, ou anticorpoanti-Fc em um chip BlAcore® chip, e o Iigante é escoado de volta. A compo-sição da massa na superfície do chip é medida. Estes métodos analíticospermitem a determinação em tempo real de ambas as taxas "on" e "off" paraobter afinidade (K0) para ligação. MAb3A8 tem uma K0 de aproximadamente300 pM (picomolar). Os anticorpos humanizados da presente invenção têmuma Kd de entre cerca de 45 e cerca de 160 pM; cerca de 45 e cerca de 150pM; cerca de 45 e cerca de 100 pM; cerca de 50 e cerca de 95 pM; cerca de60 e cerca de 85 pM; e cerca de 70 e cerca de 80pM. Preferivelmente, osanticorpos humanizados da presente invenção têm uma Kd de menos doque cerca de 100pM.

Os anticorpos ou porções de ligação de antígeno dos mesmosda presente invenção neutralizam a atividade biológica de IL-23. Dois ensai-os são utilizados para testar a capacidade de MAb3A8 e anticorpos preferi-dos da presente invenção para neutralizar a atividade de IL-23 [ver Exem-plos 1 e 2].

A presente invenção também é direcionada a anticorpos de codi-ficação de DNA recombinantes que, quando expressos, especificamente seligam à subunidade de IL-23 humano. Preferivelmente, os anticorpos quecodificam DNA que, quando expressos, compreendem uma ou mais dasCDRs de cadeia pesada e leve da presente invenção [Tabelas 1 e 2].

Tabela 1 Seqüências de CDR - Região Variável de Cadeia Pesada (HCDR)

<table>table see original document page 17</column></row><table><table>table see original document page 18</column></row><table><table>table see original document page 19</column></row><table>

*Xi é Tj F, W, ou Y; X2 is Ν, T, S1 R1Y1 ou G; X3 é S ou P; X4 é Eou P; X5 é F ou Y; X6 é A ou G; X7 é D, H1 A, K, Q1 E, ou T; e X8 é Y1 H, Q ou D.

Tabela 2 Seqüências de CDR - Região Variável de Cadeia Leve (LCVR)

<table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 20</column></row><table><table>table see original document page 21</column></row><table>

X9 é Κ, Q, ou R; X10 é D ou I; X11 é D ou G; Xi2 é Κ, N, ou P; Xi3 é L ou K;

X14 é S ou Q; e X15 é H ou Y.

A invenção inclui anticorpos compreendendo as seqüências deconsenso para as CDRs de cadeia leve, conforme representadas por SEQID NOS: 41, 42, e 43, e para as CDRs de cadeia pesada, representadas porSEQ ID NOS: 22, 23 e 24. Seqüências de aminoácido exemplares das regi-ões variáveis de cadeia pesada dos anticorpos preferidos da presente inven-ção que utilizam a estrutura VH VH1-24 são representadas como SEQ IDNOS: 44-55. Seqüências de aminoácido exemplares das regiões variáveisde cadeia leve dos anticorpos preferidos da presente invenção que utilizam aestrutura VL A17 são representadas como SEQ ID NOS: 56-59. O resíduode aminoácido 41 de SEQ ID NOS: 58 e 59 é mudado para o resíduo de mu-rina localizado nesta posição. Além disso, anticorpos exemplares da presen-te invenção são representados por uma região constante de cadeia pesada,conforme mostrado em SEQ ID NO:62 e, uma região constante de cadeialeve, conforme mostrado em SEQ ID NO: 63.

Desse modo, anticorpos exemplares da invenção são seleciona-dos a partir do grupo consistindo em:

(a) um anticorpo com um LCVR, conforme mostrado em SEQ IDNO:57, um HCVR, conforme mostrado em SEQ ID NO: 47, um LCCR, con-forme mostrado em SEQ ID NO:63, e um HCCR, conforme mostrado emSEQ ID NO:62;

(b) um anticorpo com um LCVR, conforme mostrado em SEQ IDNO:57, um HCVR, conforme mostrado em SEQ ID NO: 48, um LCCR, con-forme mostrado em SEQ ID NO:63, e um HCCR, conforme mostrado emSEQ ID NO:62;

(c) um anticorpo com um LCVR, conforme mostrado em SEQ IDNO:57, um HCVR, conforme mostrado em SEQ ID NO: 49, um LCCR, con-forme mostrado em SEQ ID NO:63, e um HCCR, conforme mostrado emSEQ ID NO:62;

(d) um anticorpo com um LCVR, conforme mostrado em SEQ IDNO:57, um HCVR, conforme mostrado em SEQ ID NO: 51, um LCCR, con-forme mostrado em SEQ ID NO:63, e um HCCR, conforme mostrado emSEQ ID NO:62;

(e) um anticorpo com um LCVR, conforme mostrado em SEQ IDNO:57, um HCVR, conforme mostrado em SEQ ID NO: 52, um LCCR, con-forme mostrado em SEQ ID NO:63, e um HCCR, conforme mostrado emSEQ ID NO:62;

(f) um anticorpo com um LCVR, conforme mostrado em SEQ IDNO:57, um HCVR, conforme mostrado em SEQ ID NO: 53, um LCCR, con-forme mostrado em SEQ ID NO:63, e um HCCR1 conforme mostrado emSEQ ID NO:62; e,

(g) um anticorpo com um LCVR, conforme mostrado em SEQ IDNO:57, e, um HCVR1 conforme mostrado em SEQ ID NO: 55, um LCCR1conforme mostrado em SEQ ID NO:63, e um HCCR, conforme mostrado emSEQ ID NO:62.

Os anticorpos de neutralização da presente invenção são alcan-çados através de seqüências de gene de anticorpo apropriadas de geração,isto é, seqüências de aminoácido, pelo arranjo das seqüências de nucleotí-deo apropriadas, e expressão destas em uma linha de célula adequada. Se-qüências de nucleotídeo adequadas podem ser produzidas usando-se ummétodo de mutagênese baseado em códon. Tais procedimentos permitem aprodução de quaisquer e todas as freqüências de resíduos de aminoácidoem quaisquer posições de códon desejadas dentro de um oligonucleotídeo.

Isto pode incluir substituições completamente aleatórias de qualquer dos 20aminoácidos em uma posição desejada/Alternativamente, este processopode ser efetuado de modo a alcançar um aminoácido particular em umalocalização desejada dentro de uma cadeia de aminoácido, tal como as no-vas seqüência de CDR de acordo com a invenção. Em suma, a seqüênciade nucleotídeo apropriada para expressar qualquer seqüência de aminoáci-do desejada pode ser prontamente alcançada, e, usando-se tais procedi-mentos, as novas seqüências de CDR da presente invenção podem ser re-produzidas. Isto resulta na capacidade de sintetizar polipeptídeos, tais comoanticorpos, com quaisquer seqüências desejadas de aminoácido. Por exem-pio, é agora possível determinar a seqüência de aminoácido de qualquerdomínio desejado de um anticorpo de escolha, e, opcionalmente, prepararcadeias homólogas com um ou mais aminoácidos substituídos por outrosaminoácidos desejados, de modo a dar uma faixa de análogos substituídos.

Na aplicação de tais métodos, é para ser apreciado que devido àdegeneração do código genético, tais métodos como síntese de oligonucleo-tídeo aleatória e síntese de oligonucleotídeo degenerado parcial incorpora-rão redundâncias para códons que especificam um resíduo de aminoácidoparticular em uma posição particular, embora tais métodos possam ser usa-dos para proporcionar um conjunto mestre de todas as seqüências de ami-noácido possíveis, e classificar estas para função ótima como estruturas deanticorpo, ou para outras propostas. Alternativamente, tais seqüências deanticorpo podem ser sintetizadas quimicamente, ou geradas em outros mo-dos bem conhecidos àqueles técnicos no assunto.

De acordo corri a invenção aqui revelada, anticorpos de alta po-tência aumentada podem ser gerados pela combinação em uma estrutura depolipeptídeo simples de uma ou mais novas seqüências de CDR, conformeaqui reveladas, cada uma mostrando resultar independentemente em potên-cia aumentada ou atividade biológica. Dessa maneira, várias novas seqüên-cias de aminoácido podem ser combinadas em um anticorpo, nas mesma ouem CDRs diferentes, para produzir anticorpos com níveis desejáveis de ati-vidade biológica. As mudanças de aminoácido têm o efeito de produzir umadiminuição no koft para referido anticorpo, preferivelmente com um aumentona afinidade do anticorpo. Potência mais alta pode ser alcançada com umvalor mais baixo de koff, mesmo se a afinidade permanece a mesma, ou éum tanto reduzida. Tal anticorpo é mais vantajosamente produzido pela sín-tese das cadeias de polipeptídeo requeridas, via síntese em células adequa-damente projetadas tendo incorporadas nestas as seqüências apropriadasde nucleotídeo que codificam para as cadeias requeridas de polipeptídeocontendo os segmentos alterados de CDR. Por meio de um exemplo não-limitativo, tais novas seqüências de CDR podem ser empregadas, e os anti-corpos resultantes classificados para potência, ou atividade biológica, usan-do-se, ou o bio-ensaio de esplenócito, ou o protocolo de neutralização de IL-23 humano aqui descrito, onde o anticorpo demonstra a alta afinidade parauma estrutura antigênica particular, tal como a subunidade p19 de IL-23 hu-mano.

Inversamente, deve ser apreciado que nem todas as localiza-ções dentro das seqüências dos domínios de anticorpo diferentes podem seriguais, em que substituições de qualquer tipo em uma localização particularpodem ser proveitosas ou prejudiciais. Em adição, substituições de certostipos de aminoácidos em certas localizações podem, do mesmo modo, se-rem uma afinidade mais ou menos relacionada. Por exemplo, pode não sernecessário tentar todos os aminoácidos hidrofóbicos possíveis em uma dadaposição. Pode ser que qualquer aminoácido hidrofóbico será também. Poroutro lado, um aminoácido básico ou ácido em uma dada localização podeproporcionar grandes oscilações na afinidade medida.

Conforme já descrito, K0 é medida pela razão das constantes Κ>ηe koff. Por exemplo, uma k™ de 3,1x107(M'1seg"1) e uma Icoff de 0,9x10'4(s"1)se combinariam para dar uma K0 de 2,9x1012M. Desse modo, a afinidadepode ser aperfeiçoada pelo aumento da k™, ou diminuição da koff· Corres-pondentemente, uma diminuição na koff de anticorpos da presente invenção,do mesmo modo, resultará em um agente terapêutico mais eficaz.

De acordo com o precedente, os anticorpos da presente inven-ção são anticorpos monoclonais de alta afinidade. Tais anticorpos, contudo,são monoclonais somente no sentido que eles podem ser derivados de umclone de um tipo de célula simples. Contudo, isto não é significativo paralimitá-los a uma origem particular. Tais anticorpos podem ser prontamenteproduzidos em células que comumente não produzem anticorpos, tais comocélulas de CHO, NSO, ou COS. Em adição, tais anticorpos podem ser produ-zidos em outros tipos de células, especialmente células de mamífero, emesmo células bacteriais ou células de planta, projetando-se geneticamentetais células para expressarem e agregarem as cadeias pesada e leve de po-lipeptídeo que formam o produto de anticorpo. Em adição, tais cadeias po-dem ser quimicamente sintetizadas, mas, visto que elas seriam específicaspara um dado determinante antigênico, ainda constituiriam anticorpos "mo-noclonais" dentro do espírito no qual este termo é usado. Desse modo, con-forme aqui usado, o termo anticorpo monoclonal é pretendido para denotarmais a especificidade e pureza das moléculas de anticorpo preferivelmentedo que o mero mecanismo usado para produção de referidos anticorpos.

Também conforme aqui usado, o termo potência é pretendidopara descrever a dependência do efeito do anticorpo, quando utilizado parasua proposta terapêutica pretendida, na concentração de tal anticorpo. Des-se modo, a potência significa a atividade biológica com relação a um dadoantígeno. Por meio de exemplo não-limitativo, a potência, ou atividade bioló-gica, ou efeito biológico, é medido para um anticorpo anti-IL-23, por, ou bio-ensaio de esplenócito, ou o protocolo de neutralização de IL-23 humano,aqui descritos. A potência relativa dos anticorpos produzidos de acordo comos métodos da presente invenção, designada como IC50, estará tipicamentena faixa de cerca de 1 pM a cerca de 100pM, cerca de 1 pM a cerca de 50pM;cerca de 1pM a cerca de 25pM. Preferivelmente, o IC5o, será cerca de 25pM,20pM, 15pM, 13pM, 10pM, 8pM, 5pM, 2pM, ou 1pM. Mais preferivelmente,os anticorpos da invenção têm um IG50 de cerca de 20pM.

Inversamente, a afinidade de um anticorpo para o antígeno ésimplesmente uma medida matemática da razão de kon para kotf. Em adição,a Kd dos anticorpos produzidos de acordo com os métodos da presente in-venção estarão tipicamente na faixa de cerca de 2 χ 10"10 M a cerca de 25 χ10'12M, preferivelmente menos do que cerca de 160pM, 100pM, 75pM,50pM, ou 25pM. Mais preferivelmente, os anticorpos da invenção têm umaKd de menos do que cerca de 100pM.

Em uma concretização, os anticorpos ou porções de ligação deantígenos dos mesmos, da presente invenção, compreenderão comumenteum mamífero, preferivelmente um ser humano, uma região constante e umaregião variável, referida região variável compreendendo regiões de estruturade cadeia pesada e leve e CDRs de cadeia pesada e leve, no qual as regi-ões de estrutura de cadeia pesada e leve têm características de seqüênciade um anticorpo de mamífero, preferivelmente um anticorpo humano, e noqual as seqüências de CDR são similares àquelas de um anticorpo de algu-mas espécies outras do que um ser humano, preferivelmente um camun-dongo.

Em uma concretização da presente invenção, a potência é au-mentada usando-se um fragmento Fab de anticorpo de neutralização contraIL-23 humano tendo uma K0 de menos do que cerca de 160pM, e pela dimi-nuição do valor de Koff para menos do que cerca de 1x10'3seg"\ preferivel-mente menos do que cerca de 5x10"4seg"1, mais preferivelmente menos doque cerca de 1x10 4S"1. Os aminoácidos presentes nas CDRs de tais frag-mentos Fab são mostrados nas Tabelas 1 e 2.

Em concretizações específicas, a presente invenção refere-se aum anticorpo isolado compreendendo uma K0 de menos do que cerca de160pM no qual a kott é menos do que cerca de 1x103S11 preferivelmentemenos do que cerca de 5x10 4S11 e, mais preferivelmente, menos do quecerca de 1x10"4s'1 (incluindo todas as combinações destas). Desse modo, osanticorpos preferidos da presente invenção se ligam à subunidade p19 de IL-23 humano maduro com uma K0 de cerca de 160pM ou menos, têm umaconstante de taxa K3ff de 1 χ 10"3s"1 ou menos, e neutralizam a atividade deIL-23 humano.

O DNA que codifica os anticorpos da presente invenção incluirátipicamente uma seqüência de polinucleotídeo de controle de expressão o-peravelmente ligada às seqüências de codificação de anticorpo, incluindoregiões promotoras naturalmente associadas, ou heterólogas. Preferivelmen-te, as seqüências de controle de expressão serão sistemas promotores eu-carióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospe-deiras eucarióticas, mas seqüências de controle para hospedeiros eucarióti-cos podem também serem usados. Uma vez que o vetor tenha sido incorpo-rado na linha de célula hospedeira apropriada, a célula hospedeira é propa-gada sob condições adequadas para expressão das seqüências de nucleotí-deos, e, conforme desejado, para a coleta e purificação das cadeias leves,cadeias pesadas, dímeros de cadeia leve/pesada, ou anticorpos intactos,fragmentos de ligação, ou outras formas de imunoglobulina.

As seqüências de ácido nucléico da presente invenção capazesde expressarem por último os anticorpos desejados, podem ser formadas deuma variedade de polinucleotídeos diferentes (genômico ou cDNA, RNA,oligonucleotídeos sintéticos, etc.), e componentes (por exemplo, regiões V,J, D, e C), usando-se qualquer de uma variedade de técnicas bem conheci-das. A união de seqüências genômicas e sintéticas apropriadas é um méto-do comum de produção, mas seqüências de cDNA podem também seremutilizadas.As seqüências de DNA de região constante humana podem serisoladas de acordo com os procedimentos bem conhecidos de uma varieda-de de células humanas, mas preferivelmente de células B imortalizadas. Cé-lulas fontes adequadas para as seqüências de polinucleotídeo e célulashospedeiras para expressão e secreção de imunoglobulina podem ser obti-das de um número de fontes bem conhecidas na técnica.

Conforme aqui descrito, em adição aos anticorpos especifica-mente aqui descritos, outros anticorpos modificados "substancialmente ho-mólogos" podem ser prontamente designados e manufaturados utilizando-sevárias técnicas de DNA recombinante bem conhecidas àqueles técnicos noassunto. Por exemplo, as regiões de estrutura podem variar a partir das se-qüências nativas no nível de estrutura primário por várias substituições deaminoácido, adições terminais e intermediárias e retiradas, e similares. Alémdisso, uma variedade de regiões de estrutura humana diferentes pode serusada simplesmente ou em combinação como uma base para as imunoglo-bulinas humanizadas da presente invenção. Em geral, as modificações dosgenes podem ser prontamente efetuadas por uma variedade de técnicasbem conhecidas, tais como mutagênese direcionada de local.

Alternativamente, fragmentos de polipeptídeo compreendendosomente uma porção da estrutura de anticorpo primária podem ser produzi-dos, cujos fragmentos possuem uma ou mais atividades de imunoglobulina(por exemplo, atividade de fixação de complemento). Estes fragmentos depolipeptídeo podem ser produzidos por clivagem proteolítica de anticorposintactos por métodos bem conhecidos na técnica, ou pela inserção de có-dons de parada nas localizações desejadas em vetores usando mutagênesedirecionada local, tal como após CH1 para produzir fragmentos Fab ou apósa região de articulação produzir fragmentos F(ab')2. Anticorpos de cadeiasimples podem ser produzidos pela união de VL e VH com um Iigante de DNA.

Conforme citado anteriormente, os polinucleotídeos serão ex-pressos em hospedeiros após as seqüências tiverem sido operavelmenteligadas a (isto é, posicionadas para assegurar o funcionamento de) uma se-qüência de controle de expressão. Estes vetores de expressão são tipica-mente replicáveis nos organismos hospedeiros, ou como epissomas, ou co-mo uma parte integral do DNA cromossomal hospedeiro. Comumente, osvetores de expressão conterão marcadores de seleção, por exemplo, tetraci-clina, neomicina, e dihidrofolato reductase, para permitir detecção daquelascélulas transformadas com as seqüências de DNA desejadas.

E. coli é um hospedeiro procariótico útil particularmente paraclonagem dos polinucleotídeos da presente invenção. Outros hospedeirosmicrobiais adequados para uso incluem bacilli, tais como Bacillus subtilus, eoutros enterobacteriaceae, tais como Salmonella, Serratia, e várias espéciesde Pseudomonas. Nestes hospedeiros procarióticos, um pode também pro-duzir vetores de expressão, que conterá tipicamente seqüências de controlede expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma ori-gem de replicação). Em adição, qualquer de um número de promotores bemconhecidos pode estar presente, tais como um sistema promoter de lactose,um sistema promoter de triptofan (trp), um sistema promoter de beta-lactamase, ou um sistema promotor de fago lâmbida. Os promotores tipica-mente controlarão a expressão, opcionalmente com uma seqüência opera-dora, e têm seqüências de local de ligação de ribossoma, e similares, parainiciação e completação de transcrição e translação.

Em adição à bactéria, outros micróbios, tal como levedura, po-dem também serem usados para expressão. Pichia pastoris é um hospedei-ro preferido, com vetores adequados tendo seqüências de controle de ex-pressão, tais como promotores, incluindo 3-fosfoglicerato cinase, ou outrasenzimas glicolíticas, e uma origem de replicação, seqüências de terminação,e similares, conforme desejado.

A cultura de célula de tecido de mamífero pode também ser u-sada para expressar e produzir os polipeptídeos da presente invenção. Ascélulas eucarióticas são atualmente preferidas, porque um número de linhasde células hospedeiras adequadas capazes de secretar imunoglobulinasintactas foi desenvolvido na técnica, e inclui as linhas de células CHO, váriaslinhas de células COS, células HeLa, linhas de células de mieloma, células Btransformadas, linhas de células de rim embriônicas humanas, ou hibrido-mas. Linhas de células preferidas são linhas de células CHO e de mieloma,tais como SP2/0 e NSO.

Os vetores de expressão para estas células podem incluir se-qüências de controle de expressão, tais como uma origem de replicação, umpromotor, um intensificador, e locais de informação de processamento ne-cessários, tais como locais de ligação de ribossoma, locais de repartição deRNA, locais de poliadenilação, e seqüências terminadoras transcricionais.Seqüências de controle de expressão preferidas são promotoras derivadasde genes de imunoglobulina, SV40, adenovírus, vírus papilloma bovino, ci-tomegalovírus, e similares. Locais de poliadenilação preferidos incluem se-qüências derivadas de SV40 e hormônio de crescimento bovino.

Os vetores contendo as seqüências de polinucleotídeos de inte-resse (por exemplo, as seqüências de codificação de cadeia pesada e leve,e seqüências de controle de expressão) podem ser transferidos na célulahospedeira por métodos bem conhecidos, que variam dependendo do tipode hospedeiro celular. Por exemplo, transfecção de cloreto de sódio é co-mumente utilizada para células procarióticas, onde tratamento de cloreto decálcio ou eletroporação podem ser usados para outras células hospedeiras.

Uma vez expressos, os anticorpos podem ser purificados de a-cordo com procedimentos padrão, incluindo precipitação de sulfato de amô-nia, troca de íon, afinidade (por exemplo, Proteína A), cromatografia de colu-na de interação hidrofóbica de fase reversa, eletroforese de gel, e similares.Imunoglobulinas substancialmente puras tendo pelo menos cerca de 90 a95% de pureza são preferidas, por exemplo, para usos farmacêuticos. Umavez purificados, parcialmente ou para homogeneidade conforme desejado,os polipeptídeos podem, em seguida, serem usados terapeuticamente ouprofilaticamente, conforme aqui direcionado.

Os anticorpos da presente invenção são úteis em aplicaçõesterapêuticas, profiláticas, de diagnóstico, e de pesquisa, conforme aqui des-crito. Um anticorpo da invenção pode ser usado para diagnóstico de umaenfermidade ou doença associada com a expressão de IL-23 humano. Emuma maneira similar, o anticorpo da invenção pode ser usado em um ensaiopara monitorar níveis de IL-23 em um indivíduo sendo testado para umacondição associada com IL-23. Aplicações de pesquisa incluem métodosque utilizam o anticorpo da invenção, e uma etiqueta para detectar IL-23 emuma amostra, por exemplo, em um fluido de corpo humano, ou em uma célu-la ou extrato de tecido. Os anticorpos da invenção podem ser usados comou sem modificação, e são rotulados por fixação covalente ou não-covalentede uma porção detectável. A porção detectável pode ser qualquer uma que écapaz de produzir, ou diretamente ou indiretamente, um sinal detectável.

Uma variedade de protocolos convencionais para medição de IL-23, incluindo, por exemplo, ELISAs, RIAs, e FACS, são conhecidos na técni-ca, e proporcionam uma base para diagnóstico alterado ou níveis anormaisde expressão de IL-23. Valores normais ou de expressão padrão são esta-belecidos usando-se quaisquer técnicas conhecidas, por exemplo, pelacombinação de uma amostra compreendendo um polipeptídeo IL-23 com,por exemplo, anticorpos sob condições adequadas para formar um complexode antígeno:anticorpo. O anticorpo é diretamente ou indiretamente rotuladocom uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligadoou não-ligado. Substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas,grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais Iuminescentes e mate-riais radioativos.

Como um material de conveniência, o anticorpo da presente in-venção pode ser provido em um estojo, uma combinação acondicionada dereagentes em quantidades predeterminadas com instruções para realizaçãodo ensaio diagnóstico. Onde o anticorpo é rotulado com uma enzima, o esto-jo incluirá substratos e co-fatores requeridos pela enzima (por exemplo, umprecursor de substrato que proporciona o cromóforo ou fluoróforo detectá-vel). Em adição, outros aditivos podem ser incluídos, tais como estabilizado-res, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão lysis), e simi-lares. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser variadasamplamente para proporcionar concentrações na solução dos reagentes queotimizam substancialmente a sensibilidade do ensaio. Particularmente, osreagentes podem ser providos como pós secos, usualmente liofilizados, in-cluindo excipientes que, em dissolução, proporcionarão uma solução rea-gente tendo a concentração apropriada.

Esta invenção também refere-se a um método de tratamento dehumanos que experimentam uma enfermidade inflamatória mediada por IL-23, que compreende administrar uma dose efetiva de um anticorpo específi-co da subunidade p19 de IL-23 humano a um paciente em necessidade domesmo. Os anticorpos da presente invenção se ligam a e neutralizam IL-23.

Várias enfermidades mediadas por IL-23 incluem esclerose múltipla, artritereumatóide (RA), enxerto versus doença hospedeira, psoríase, doença deCrohn, outras doenças intestinais inflamatórias, e câncer. Preferivelmente,os anticorpos IL-23 envolvidos pela presente invenção são usados para tra-tar esclerose múltipla de remissão de reincidência, a forma mais comum deesclerose múltipla.

Os anticorpos, ou porções de ligação de antígeno dos mesmos,da presente invenção, podem estar na forma de uma composição compre-endendo o anticorpo da invenção suspensa em um diluente ou excipientefarmacologicamente aceitável. Estas composições farmacêuticas podem seradministradas por qualquer meio conhecido na técnica que alcança a pro-posta geralmente pretendida para tratar doenças auto-imunes, preferivel-mente esclerose múltipla. A rota preferida de administração é parenteral,definida aqui como se referindo a modos de administração que incluem inje-ção intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intra-esternal, subcutânea, eintra-articular, e infusão. Mais preferivelmente, a rota de administração ésubcutânea, e é administrada uma vez por semana. A dosagem administra-da será dependente da idade, da saúde, do peso do recipiente, do tipo detratamento concorrente, se houver, da freqüência de tratamento, e da natu-reza do efeito desejado.

As composições dentro do escopo da invenção incluem todas ascomposições nas quais um anticorpo, ou porção de ligação de antígeno, es-tá presente em uma quantidade que é eficaz para alcançar o efeito médicodesejado para tratamento de esclerose múltipla. Enquanto necessidadesindividuais podem variar de um paciente para outro, a determinação das fai-xas ótimas de quantidades efetivas de todos os componentes está dentro dacapacidade do técnico no assunto.

As composições farmacêuticas para administração são designa-das para serem apropriadas para o modo selecionado de administração, eexcipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como, tampões, tensoativos,preservativos, agentes de solubilização, agentes de isotonicidade, agentesde estabilização, veículos, e similares, são usados conforme apropriado.Reminaton's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA,última edição, incorporado aqui por referência, proporciona um compêndiode técnicas de formulação, conforme são geralmente conhecidos aos prati-cantes.

A concentração do anticorpo IL-23 nas formulações pode ser demenos de cerca de 0,1 % a mais de 15 ou 20% por peso, e será selecionadaprincipalmente baseada nos volumes de fluido, viscosidades, estabilidade, eassim por diante, de acordo com o modo particular de administração sele-cionado. Concentrações preferidas do anticorpo IL-23 será geralmente nafaixa de 1 a cerca de 100 mg/mL. Preferivelmente, cerca de 10 a cerca de 50mg/mL.

A formulação pode incluir um tampão. Preferivelmente, o tampãoé um tampão de citrato, ou um tampão de fosfato, ou uma combinação dosmesmos. Geralmente, o pH da formulação é entre cerca de 4 e cerca de 8.Preferivelmente, o pH é entre cerca de 5 e cerca de 7,5. O pH da formulaçãopode ser selecionado para equilibrar a estabilidade do anticorpo (química efísica), e conforto para o paciente quando administrada. A formulação podetambém incluir um sal tal como NaCI. Em adição, a formulação pode incluirum detergente para impedir agregação e auxiliar na manutenção da estabili-dade.

A formulação pode ser filtrada estéril após produção da formula-ção, ou, de outro modo, feita microbiologicamente aceitável. Um preservati-vo, tal como m-cresol ou fenol, ou uma mistura dos mesmos, podem ser adi-cionados para impedir crescimento microbial e contaminação.Uma composição típica para infusão intravenosa pode ter umvolume de mais de 250 mL de fluido, tal como solução estéril de Ringer, e 1-100 mg por mL, ou mais, em concentração de anticorpo. Os agentes tera-pêuticos da invenção podem ser congelados ou Iiofilizados para armazena-mento, e reconstituídos em um transportador estéril adequado antes de uso.

A liofilização e reconstituição podem conduzir a graus variantes de perda deatividade do anticorpo (por exemplo, com imunoglobinas convencionais, osanticorpos IgM tendem a ter maior perda de atividade do que os anticorposIgG). As dosagens podem ter que ser ajustadas para compensar.

Embora os métodos precedentes pareçam ser os mais conveni-entes e apropriados para administração de proteínas, tais como anticorposhumanizados, por adaptação adequada, outras técnicas de administração,tais como administração transdermal e administração oral, podem ser em-pregadas, provido que a formulação correta é designada. Em adição, podeser desejável empregar formulações de liberação controlada usando-se pelí-culas biodegradáveis, ou mini-bombas osmóticas, ou sistemas de liberaçãobaseados em gotas de dextran, alginato, ou colágeno. Em resumo, as formu-lações são disponíveis para administração de anticorpos da invenção, e po-dem ser escolhidas de uma variedade de opções.

Níveis de dosagem típicos podem ser otimizados usando-se téc-nicas clínicas padrões, e serão dependentes do modo de administração e dacondição do paciente. Geralmente, as doses estarão na faixa de 10μg/kg/mês a 10 mg/kg/mês.

Em outro aspecto, os anticorpos, ou porções de ligação de antí-geno dos mesmos, da presente invenção, para uso como um medicamentopara o tratamento de doença auto-imune, são contemplados.

Em ainda outro aspecto, um artigo de fabricação contendo mate-riais úteis para o tratamento ou prevenção das enfermidades ou condiçõesdescritas acima é provido. O artigo de fabricação compreende um recipientee um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos,seringas e tubos de teste. Os recipientes podem ser formados de uma varie-dade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente mantém umacomposição de um anticorpo da invenção que é eficaz para impedir ou tratara enfermidade ou condição, e pode ter um orifício de acesso estéril (por e-xemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa, ou um frascotendo um parador perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O a-gente ativo na composição é um anticorpo anti-IL-23 da invenção. O rótulono, ou associado com o recipiente, indica que a composição é usada paratratamento da condição de escolha. O artigo de fabricação pode adicional-mente compreender um segundo recipiente compreendendo um tampãofarmaceuticamente aceitável, tal como, salina tamponada com fosfato, solu-ção de Ringer e solução de dextrose. Ele pode adicionalmente incluir outrosmateriais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindooutros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e insertos de acondicio-namento com instruções para uso.

A invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos que não sãopretendidos para, de qualquer modo, limitá-la.

Exemplo 1

Ensaio de Inibicão de IL-23

Um ensaio de esplenócito de camundongo é usado para deter-minar a inibição de atividade de IL-23 baseada na capacidade de IL-23 esti-mular secreção de IL-17 de células de baço de camundongo. Os anticorposda presente invenção são comparados a MAb3A8, e a um anticorpo mono-clonal de murina comercialmente disponível, MAB1290 (R&D Systems).

O protocolo básico é conforme segue. Os baços são removidosde camundongos 1 BALB/c ou C57BL/6, e os esplenócitos são colhidos, euma suspensão de célula simples é preparada.

Os esplenócitos são lavados e ressuspensos em RPMI completa(contendo 1% de aminoácidos não-essenciais, 1% de piruvato de sódio, 2,5mM de HEPES, 1% de L-glutamina, 0,00035% de 2-mercaptoetanol, 1% dePen/Strep, 10% de FCS inativado por calor, e 50 ng/mL de IL-2 humano(Sistemas R e D)). Os esplenócitos são, em seguida, semeados em 500.000células/cavidade em uma placa de cultura de 86 cavidades em um volumede 100 microlitros.IL-23 humano (Sistemas R e D) a uma concentração de 10pM épré-incubado com 3 vezes de diluição serial de anticorpos testes sobre umafaixa de 0,001 a 54 microgramas/mL. A incubação é realizada em uma placade ensaio separada a 37e C, 5% de CO2 por 90 minutos.

100 microlitros de cada amostra de pré-incubação são, em se-guida, adicionados à placa de cultura contendo esplenócitos, e incubadaspor 48-72 horas a 379 C, 5% CO2. Um estojo em sanduíche ELISA para IL-23 (M1700, Sistemas R e D), é usado para medir a quantidade de IL-23 emcada sobrenadante de cultura. IC50 é a quantidade de anticorpo necessáriapara neutralizar 50% da bioatividade de IL-23 nos esplenócitos de camun-dongo.

O IC50 de MAb3A8, e os anticorpos da presente invenção, com-parados àqueles de MAB1290 no Ensaio de Esplenócito de Murina, sãomostrados na Tabela 3. Os anticorpos exemplificados, MAbQF20 eMAbQF37, neutralizam significantemente a estimulação de IL-23 de secre-ção de IL-17 de células de baço de camundongo tendo valores IC5o de me-nos do que 20 pM.

Tabela 3: ICsn Medido no Ensaio de Esplenócito de Murina

<table>table see original document page 36</column></row><table>

Exemplo 2

Neutralização de IL-23 humano

IL-23 humano junto com IL-2, injetado em camundongos, é ca-paz de estimular a produção de IL-17 de camundongo em células de baço.Esta estimulação de IL-17 é bloqueada com anticorpos de neutralização pa-ra a subunidade p19 de IL-23, e é demonstrada no seguinte modelo de mu-rina in vivo com uma leitura ex vivo de produção de IL-17.

Os camundongos C57BL/6 são iniciados com uma injeção demurina IL-2 (mlL-2), 22 horas antes da estimulação dos camundongos commlL-2 mais IL-23 humano. Duas horas antes da estimulação com mlL-2 hlL-23, os camundongos são injetados com, ou um anticorpo humanizado dealta afinidade da presente invenção, ou com um anticorpo de controle (lgG4)equiparado por isótopo.

Os seguintes grupos são, em seguida, compostos:No Tempo = O, uma injeção i.p. de mlL-2 somente (5 pg) ou mlL-2 (5 pg) mais IL-23 humano (10 pg)

Em 7 horas, uma injeção i.p. de mlL-2 somente (10 pg) ou mlL-2(10 pg) mais IL-23 humano (10 pg)

Em 23 horas, uma injeção i.p de mlL-2 somente (5 pg) ou mlL-2(5 pg) mais IL-23 humano (10 pg)

Em 30 horas, os camundongos são sacrificados, os baços remo-vidos, e os esplenócitos são colhidos, e uma suspensão de célula simples.Os esplenócitos são lavados em RPMI completa (contendo 1% de am não-essenciais, 1% de piruvato de sódio, 2,5 mM de HEPES, 1% de L-glutamina,0,00035% de 2-mercaptoetanol, 1% de Pen/Strep, 10% de soro de bezerrofetal inativado por calor), e semeados em 200.000 cel em uma placa de cul-tura de 96 cavidades que é pré-revestida com anticorpo anticamundongo cde hamster (5pg/ml em PBS durante a noite a 4eC). A placa de 96 cavidadesé, em seguida, incubada por 48-72 horas a 37QC, 5% CO2.

Um estojo em sanduíche ELISA para IL-17 de camundongo(M1700, Sistemas R e D) é usado para medir a quantidade de IL-17 em cadasobrenadante de cultura. Conforme mostrado na Tabela 4, MAbQF20 eMAbQF37 neutralizam IL-23 e bloqueiam significantemente a estimulação deIL-17.

Tabela 4

<table>table see original document page 37</column></row><table>Exemplo 3

Afinidade de Ligação

As afinidades de MAb3A8 e anticorpos da presente invençãosão determinadas usando-se medições de BIAcore (Tabela 3). BlAcore® éum sistema de biosensor automático que mede as interações moleculares.(Karlsson, et ai (1991) J. Immunol. Methods 145: 229-240). Nestes experi-mentos, o anticorpo é capturado para uma superfície em baixa densidadeem um chip de BlAcore® chip. Etil-dimetilaminopropil-carbodiimida (EDC) éusada para acoplar grupos amino reativos para proteína A para uma célulade fluxo de um chip de sensor de carboxi-metil (CM5) BlAcore®. A proteína Aé diluída em tampão de acetato de sódio, pH 4,5, e imobilizada em uma cé-lula de fluxo de um chip CM5 usando-se EDC para produzir 1000 unidadesde resposta. Locais não-reagidos são bloqueados com etanolamina. Umataxa de fluxo de 60 μΙ/min é usada. Ciclos múltiplos de ligação/eluição sãorealizados pela injeção de 10 μΙ de solução de 2 μg/mL dos anticorpos dapresente invenção, seguido por IL-23 humano em concentrações diminuídaspara cada ciclo (por exemplo, 1500, 750, 375, 188, 94, 47, 23.5, 12, e 0 pi-comolar). A eluição é realizada com glicina-HCI, pH 1,5. BlAevaluation® éusado para analisar os dados cinéticos.

A Kd de MAb3A8 é comparada aos anticorpos da presente in-venção e ao anticorpo monoclonal de neutralização anti-IL23 comercialmen-te disponível MAb1290 (Tabela 5). Os resultados indicam que os anticorposexemplificados, MAbQF20 e MAbQF37, têm uma constante de afinidade 2-6vezes menor do que aquela de MAb3A8 tendo valores de K0 de menos doque cerca de 160 pM.

Tabela 5. Propriedades de ligação de anticorpos IL-23 para IL-23 huma-nodeterminadas por BlAcore (tampão HBS-EP, pH 7,4 a 259C)

<table>table see original document page 38</column></row><table>*anticorpo monoclonal humano anti-IL-23, murina (Sistemas R&D)

Exemplo 4

Mapeamento do Epítopo de IL-23

O epítopo da subunidade p19 de IL-23 reconhecido pelos anti-corpos humanizados da presente invenção é compreendido com resíduos deaminoácido 129 a 159 de SEQ ID N0:60. O epítopo é determinado por Es-pectrometria de Massa de Troca de Deutério Ámida (DXMS).

A DXMS é útil para determinar as interações proteína-proteínaentre a subunidade p19 de IL-23 e anticorpos humanizados da presente in-venção. Um fragmento Fab de MAb3A8 é usado como fragmento de ligaçãomodelo. Vários epítopos são identificados com este procedimento, e inclu-em, em adição aos resíduos 129 a 159 de SEQ ID NO: 60, resíduos 129-152; 151-159; e 134-152, com todas as posições do resíduo baseadas emSEQ ID NO: 60.

Um ensaio de competição ELISA padrão é utilizado para deter-minar que os anticorpos humanizados da presente invenção ligam o mesmoepítopo como MAb3A8. Os anticorpos humanizados candidatos são ensaia-dos com MAb3A8 biotinilatado em uma maneira dependente da concentra-ção. Uma competição dependente da concentração indica que os anticorposde competição ligam o mesmo epítopo no IL-23 maduro. Desse modo, osanticorpos humanizados da presente invenção ligam o epítopo acima identi-ficado da subunidade p19 de IL-23, e neutralizam a atividade de IL-23 e,desse modo, são úteis no tratamento de enfermidades inflamatórias associ-adas com a expressão de IL-23, tal como doença auto-imune, preferivelmen-te esclerose múltipla.

Exemplo 5

Modelo EAE para Esclerose Múltipla

EAE é uma doença de desmielinação mediada por CD4+ célulaT do sistema nervoso central (CNS) que serve como um modelo para MS emhumanos. Os mecanismos patogênicos de desenvolvimento de EAE incluemativação de célula T específica de antígeno, e diferenciação de Th1, seguidapor célula T e infiltração de macrófago no CNS. IL-23 estimula a secreção deIL-17 a partir de células T1 e IL-17 contribui para a patologia de esclerosemúltipla (MS). Níveis elevados de IL-23 foram identificados no soro de paci-entes com MS1 e análise de micro-série de lesões de MS de pacientes hu-manos demonstraram um aumento de IL-17 (Lock, et ai Nat. Med. 8:500-508, 2002). IL-17 mRNA-expressando células mononucleares (MNC) nosangue e fluido cérebro-espinhal são sinificantemente elevados em númerode pacientes com MS1 e números mais altos de IL-17 mRNA-expressandosangue MNC foram detectados durante exacerbação clínica de MS compa-rado à remissão (Matusevicius, etal. Multiple Sclerosis, 5:1-1-104, 1999).

O exemplo aqui descrito demonstra o efeito de um anticorpo ãn-ti-IL-23 no modelo EAE de reincidência-remissão, no qual um anticorpo an-timurina IL-23 inibe a secreção de IL-17 de células T, e, conseqüentemente,reduz a classificação de EAE no modelo de EWAE ativo. Para indução dedoença, camundongos de 8-9 semanas de idade SJL/J são injetados subcu-taneamente em dois pontos no flanco no dia 0 com 100 μΙ de Complete Fre-und's Adjuvant (CFA) contendo 50pg de PLP 139-151 e 200pg de Mycobac-terium tuberculosis H37 RA. No dia da primeira remissão (dia 23-26), os ca-mundongos são aleatoriamente divididos em três grupos de tratamento: (i)veículo (PBS), (ii) anticorpo de controle de isótopo IgGi, 10mg/kg, e, (iii) an-ticorpo IgGi monoclonal murina anti-murina IL-23, 10mg/kg. Os animais sãoinjetados com 0,2ml, i.p., começando no dia da primeira remissão, e, em se-guida, semanalmente por 6 semanas.

Os camundongos são classificados a partir do dia 7 ao dia 60para níveis de paralisia. Os camundongos são sacrificados uma semana a-pós o tratamento final. Os sinais clínicos de doença se desenvolvem cercado dia 12 ao dia 15, com pico de doença ocorrendo a cerca do dia 17 ao dia22. Os animais individuais são subjetivamente classificados por pelo menos2 classificações independentemente, e encobertos à identidade de gruposde tratamento de acordo com a severidade da doença clínica de CNS. Grau0 é normal; Grau 0,5, claudicação distai ou cauda espasmódica; Grau 1Cauda de claudicação completa; Grau 1,5 Cauda claudicante e fraquezaclaudicante posterior; Grau 2,0 paralisia claudicante posterior unilateral par-ciai; Grau 2,5 paralisia bilateral parcial-claudicante posterior; Grau 3,0 parali-sia complete bilateral posterior-claudicante; Grau 3,5 Claudicação completaposterior e paralisia unilateral parcial-paralisia do membro anterior; Grau 4,0Paralisia Total dos membros posteriores e anteriores; Grau 5,0 Moribundoou morto. O grupo de tratamento do anticorpo IL-23 tem significantementeclassificações de doença inferiores conforme comparado ao grupo de contro-le de isótopo.

Os baços dos camundongos em cada grupo de tratamento sãoremovidos e suspensões de célula simples individual dos esplenócitos sãoproduzidas. Os esplenócitos são cultivados por 2 dias na presença de PLP(o peptídeo usado para induzir ataque de EAE, desse modo, uma reestimu-lação da população de célula imune em um assentamento ex-vivo). Após 2dias, os sobrenadantes de cultura são ensaiados para a concentração de 22citocinas/quemocinas (utilizando-se um estojo padronizado por Linco, Inc.).

Os sobrenadantes de cultura a partir do grupo tratado com o controle de isó-topo MAb tem uma concentração de IL-17 de cerca de 450pg/ml, pelo queos sobrenadantes de cultura a partir do grupo tratado com o anti-IL-23 MAbtêm uma concentração de IL-17 de cerca de 175pg/ml. Desse modo, umaredução significante (p<0,002) na concentração de IL-17 de camundongo éobservada no grupo tratado com o anti-IL-23 MAb.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Eli Lilly and Company

<120> "ANTICORPOS ANTI-IL-23, OU PORÇÃO DE LIGAÇÃO DE ANTíGENO DES-TE, COMPOSIÇÃO CONTENDO O MESMO E REFERIDO USO".

<130> X17070

<150> 60/711336

<151> 2005-08-25

<150> 60/772355

<151> 2006-02-10

<160> 65

<170> Patente em versão 3.3

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 1

Gly Lys Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Asn1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 2

Gly Lys Thr Phe Phe Ser Tyr Gly Ile Asn

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 3

Gly Lys Thr Phe Trp Ser Tyr Gly Ile Asn

1 5 10<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 4

Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Tyr Gly Ile Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 5

Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Tyr Thr Glu Ser Asn Glu Lys Phe Lys15 10 15

Gly

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 6

Tyr Ile Tyr Ile Gly Gly Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr Lys1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 7

Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr Lys15 10 15Gly

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 8

Tyr Ile Tyr Ile Gly Thr Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr Lys1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 9

Tyr Ile Tyr Ile Gly Ser Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr Lys1 5 10 15

Gly

<21Ό> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 10

Tyr Ile Tyr Ile Gly Arg Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr Lys1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 17

<212> PRT<213> homo sapiens<400> 11

Tyr Ile Tyr Ile Gly Tyr Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr Lys1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 12

Ile Gly Ala Tyr Tyr Gly Asn Phe Asp Tyr1 5 10

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 13

Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Thr Asp1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 14

Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Asp Asp1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 15Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe His Asp1 5 10

<210> 16<211> 10<212> PRT<213> homo sapiens<400> 16

Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Ala Asp1 5 10

<210> 17<211> 10<212> PRT<213> homo sapiens<400> 17

Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Lys Asp1 5 10

<210> 18<211> 10<212> PRT<213> homo sapiens<400> 18

Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Asp His

1 5 10

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 19

Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Asp Gln1 5 10

<210> 20<211> 10<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 20

Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Gln Asp1 5 10

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 21

Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Glu Asp1 5 10

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> homo sapiens<220>

<221> misc_feature

<222> (5).. (5)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<400> 22

Gly Lys Thr Phe Xaa Ser Tyr Gly Ile Asn

1 5 10

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220><221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<400> 23

Tyr Ile Tyr Ile Gly Xaa Gly Tyr Thr Glu Xaa Asn Xaa Lys Xaa Lys1 5 10 15

Gly

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (3) .. (3)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<400> 24

Ile Gly Xaa Tyr Tyr Gly Asn Phe Xaa Xaa1 5 10

<210> 25<211> 16<212> PRT<213> homo sapiens<400> 25

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn1 5 10 15

<210> 26<211> 16<212> PRT<213> homo sapiens<400> 26

Gln Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Leu Asn1 5 10 15

<210> 27<211> 16<212> PRT<213> homo sapiens<400> 27

Gln Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Gly Lys Thr Tyr Leu Asn1 5 10 15

<210> 28<211> 16<212> PRT<213> homo sapiens<400> 28

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

15 10 15

<210> 29

<211> 16

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 29Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Gly Lys Thr Tyr Leu Asn1 5 10 15

<210> 30

<211> 16

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 30

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 31

<211> 16

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 31

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 32

<211> 16

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 32

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Gly Pro Thr Tyr Leu Asn

15 10 15

<210> 33

<211> 16

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 33

Gln Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Gly Pro Thr Tyr Leu Asn1 5 10 15

<210> 34<211> 16<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 34

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Gly Pro Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 35

<211> 16

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 35

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 36

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser1 5<210> 37<211> 7<212> PRT<213> homo sapiens<400> 37

Leu Val Ser Lys Leu Asp Gln1 5<210> 38<211> 7<212> PRT<213> homo sapiens<400> 38

Lys Val Ser Lys Leu Asp Gln1 5

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 39

Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 40

Trp Gln Gly Thr Tyr Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 41

<211> 16

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural<220><221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<400> 41

Xaa Ser Ser Gln Ser Leu Leu Xaa Ser Xaa Gly Xaa Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> homo sapiens<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<400> 42Xaa Val Ser Lys Leu Asp Xaa

1 5

<210> 43

<211> 9

<212> PRT

<213> homo sapiens<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<400> 43

Trp Gln Gly Thr Xaa Phe Pro Leu Thr

1 5<210> 44

<211> 119

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 44

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Lys Thr Phe Trp Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Gly Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Thr Asp Trp Gly Gln Gly

100 105 HO

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115<210> 45<211> 119<212> PRT<213> homo sapiens<400> 45

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Lys Thr Phe Trp Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Thr Asp Trp Gly Gln Gly

100 105 HO

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115<210> 46<211> 119<212> PRT<213> homo sapiens<400> 46

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Lys Thr Phe Phe Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro. Lys Tyr

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Thr Asp Trp Gly Gln Gly

100 105 HO

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115<210> 47<211> 119<212> PRT<213> homo sapiens<400> 47

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Lys Thr Phe Trp Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe His Asp Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115<210> 48<211> 119<212> PRT<213> homo sapiens<400> 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Lys Thr Phe Trp Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Thr Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Ala Asp Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115<210> 49<2ll> 119<212> PRT<213> homo sapiens<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Lys Thr Phe Trp Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Ser Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe His Asp Trp Gly Gln Gly

100 105 HO

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115<210> 50<211> 119<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 50

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Lys Thr Phe Trp Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Thr Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Lys Asp Trp Gly Gln Gly

100 105 HO

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115<210> 51<211> 119<212> PRT<213> homo sapiens<400> 51

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Lys Thr Phe Trp Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Thr Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr50 55 60Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 HO

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115<210> 52<211> 119<2l2> PRT<213> homo sapiens<400> 52

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Lys Thr Phe Trp Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Thr Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Asp Gln Trp Gly Gln Gly

100 105 HO

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115<210> 53<211> 119<212> PRT<213> homo sapiens<400> 53

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Lys Thr Phe Trp Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Arg Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Gln Asp Trp Gly Gln Gly

100 105 HO

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115<210> 54<211> 119<212> PRT<213> homo sapiens<400> 54

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Lys Thr Phe Trp Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Tyr Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Glu Asp Trp Gly Gln Gly

100 105 HO

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115<210> 55<211> 119<212> PRT<2l3> homo sapiens<400> 55

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Lys Thr Phe Trp Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Ile Gly Thr Gly Tyr Thr Glu Pro Asn Pro Lys Tyr

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Phe Glu Asp Trp Gly Gln Gly

100 105 HO

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115<210> 56<211> 112<212> PRT<213> homo sapiens<400> 56

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser

20 25 30

Gly Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Gln Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr Tyr Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 HO

<210> 57

<211> 112

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 57

/

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly15 10 15

Gln Pró Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser

20 25 30

Gly Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Gln Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly85 90 95Thr Tyr Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 HO

<210> 58

<211> 112

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 58

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser

20 25 30

Gly Gly Pro Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys Leu Asp Gln Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr Tyr Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 HO

<210> 59

<211> 112

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 59

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly15 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser

20 25 30

Gly Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Gln Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr Tyr Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 HO

<210> 60

<211> 189

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 60

Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr1 5 10 15

Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln

20 25 30

Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His

35 40 45

Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr

50 55 60

Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln65 70 75 80

Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly

85 90 95

Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu

100 105 HO

Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu

115 120 125

Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr

130 135 140

Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu145 150 155 160

Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala

165 170 175

Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro180 185

<210> 61

<211> 329

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 61

Ala Ser Phe Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 HO

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Vai. Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu165 170 175Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Glu Trp Glu Thr Trp Arg Arg

275 280 285

Leu Tyr Trp Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly325

<210> 62

<211> 329

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 62

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50

Leu Ser Ser Val65

Tyr Ile Cys Asn

Lys Val Glu Pro100

Pro Ala Pro Glu115

Lys Pro Lys Asp130

Val Val Val Asp145

Tyr Val Asp Gly

Glu Gln Tyr Asn180

His Gln Asp Trp195

Lys Ala Leu Pro210

Gln Pro Arg Glu225

Leu Thr Lys Asn

Pro Ser Asp Ile260

Asn Tyr Lys Thr275

Leu Tyr Ser Lys290

Val Phe Ser Cys

55

Val Thr Val Pro Ser Ser70

Val Asn His Lys Pro Ser85 90

Lys Ser Cys Asp Lys Thr105

Leu Leu Gly Gly Pro Ser120

Thr Leu Met Ile Ser Arg135

Val Ser His Glu Asp Pro150

Val Glu Val His Asn Ala165 170

Ser Thr Tyr Arg Val Val185

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr200

Ala Pro Ile Glu Lys Thr215

Pro Gln Val Tyr Thr Leu230

Gln Val Ser Leu Thr Cys245 250

Ala Val Glu Trp Glu Ser265

Thr Pro Pro Val Leu Asp280

Leu Thr Val Asp Lys Ser295

Ser Val Met His Glu Ala

60

Ser Leu Gly Thr Gln Thr75 80

Asn Thr Lys Val Asp Lys95

His Thr Cys Pro Pro Cys110

Val Phe Leu Phe Pro Pro125

Thr Pro Glu Val Thr Cys140

Glu Val Lys Phe Asn Trp155 160

Lys Thr Lys Pro Arg Glu175

Ser Val Leu Thr Val Leu190

Lys Cys Lys Val Ser Asn205

Ile Ser Lys Ala Lys Gly220

Pro Pro Ser Arg Asp Glu235 240

Leu Val Lys Gly Phe Tyr255

Asn Gly Gln Pro Glu Asn270

Ser Asp Gly Ser Phe Phe285

Arg Trp Gln Gln Gly Asn300

Leu His Asn His Tyr Thr305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly325

<210> 63

<211> 107

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 63

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Pro Arg Thr Leu Gln

35 40 ' 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys100 105

<210> 64

<211> 119

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 64

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His- Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr. Cys

85 90 95

Ala Thr Ile Gly Ala Tyr Tyr Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100- 105 HO

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115<210> 65<211> 112<212> PRT<213> homo sapiens<400> 65

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Thr His Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 HO

Claims (11)

1. Anticorpo, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, ca-racterizado pelo fato de que se liga especificamente à subunidade p19 de IL--23, neutraliza a atividade de IL-23, tem um K0 de entre cerca de 45pM e cer-ca de 160pM, e tem um IC50 de entre cerca de 1 pM e cerca de 20pM.

2. Anticorpo, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, deacordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se liga à subu-nidade p19 de IL-23 dentro dos resíduos de aminoácido 129 a 159 da se-qüência de aminoácido mostrada em SEQ ID N0:60.

3. Anticorpo, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fatode que é um anticorpo humanizado.

4. Anticorpo, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fatode que compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada apartir do grupo consistindo em SEQ ID NOS:44-55, e uma região variável decadeia leve selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOS:56-59.

5. Anticorpo, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fatode que no qual a cadeia pesada do anticorpo tem uma região constante se-lecionada a partir do grupo consistindo em regiões constantes de cadeia pe-sada de IgGi, IgG2, IgG3, e IgG4Iiumanos.

6. Anticorpo, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, ca-racterizado pelo fato de que compreende a região variável de cadeia pesadaconforme mostrada em SEQ ID NO:52, e uma região variável de cadeia leveconforme mostrada em SEQ ID NO:57.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pe-lo fato de que a cadeia pesada do anticorpo tem a região constante confor-me mostrada em SEQ ID NO:62, e a cadeia leve do anticorpo tem a regiãoconstante conforme mostrada em SEQ ID NO:63.

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende o seguinte:(a) o anticorpo, ou porção de ligação de antígeno do mesmo,como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; e(b) um veículo farmacêutico aceitável.

9. Método de tratamento de esclerose múltipla de remissão rein-cidente em um paciente em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fatode que compreende administrar ao referido paciente uma quantidade efetivado anticorpo, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, como definidoem qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

10. Anticorpo, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fatode que é para uso como um medicamento.

11. Uso do anticorpo, ou porção de ligação de antígeno domesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracteriza-do pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratamentode um paciente com esclerose múltipla de remissão reincidente.