CN102369285B - 用于增强的抗-IGF1R表达的βGl-IgG内含子 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于靶基因如免疫球蛋白的增强的表达的多核苷酸。也包括用本发明的多核苷酸表达靶基因的方法。

Description

用于增强的抗-IGF1R表达的βGl-IgG内含子

本申请要求2008年11月12日提交的美国临时专利申请号61/113,807的权益，该申请在此通过全文引用并入本文。

发明领域

本发明涉及包含可操作性连接于启动子/β-珠蛋白-γ免疫球蛋白(βGl-IgG)内含子构建体的靶基因的多核苷酸，以及表达所述靶基因的方法。 

发明背景

抗体、抗体片段和其它治疗蛋白的临床和商业成功，导致对在哺乳动物细胞培养物中非常大规模生产的需要。这导致总体生产能力的快速扩展、反应器大小的增加（最高达20,000 L）以及显著增加的努力，用于改进方法效率并伴随制造成本降低。

例如，大多数抗体治疗需要在长时间使用高剂量，这需要每个患者使用大量纯化产品。因此，满足抗体生产需要的制造能力是真正的挑战；期望具有高度多产的制造过程。

用于改进抗体或其它蛋白的体内生产水平的一种手段是制备新的多核苷酸表达构建体，其导致与标准构建体相比，蛋白生产水平提高。本发明解决本领域的此需要。

发明概述

本发明的一部分提供包含β-珠蛋白剪接供体位点和γ免疫球蛋白剪接受体位点的分离的βGl-IgG内含子多核苷酸，其中所述位点间隔约125个核苷酸。除了βGl-IgG内含子，本发明包括用于以高水平表达靶多肽的使用方法。质粒、宿主细胞、主细胞库（master cell banks）和工作细胞库（working cell banks）也形成本发明的部分。

例如，在本发明的一个实施方案中，多核苷酸包含β-珠蛋白剪接供体位点和γ免疫球蛋白剪接受体位点，所述β-珠蛋白剪接供体位点包含核苷酸序列CAGGTAAGTTTA (SEQ ID NO: 4)，所述γ免疫球蛋白剪接受体位点包含核苷酸序列TTTCTCTCCACAGGC (SEQ ID NO: 5)，其中所述位点间隔约125个核苷酸；例如，其中剪接供体位点和剪接受体位点由以下序列间隔开：

(SEQ ID NO: 3的核苷酸51-175)。在本发明的一个实施方案中，βGl-IgG内含子在基因的上游，并且在与所述基因可操作性缔合（operably associated）的启动子下游。基因可以是任何类型，例如，免疫球蛋白，例如，其中所述免疫球蛋白是与IGF1R、IL-23 p19、IL23受体(其任何亚基，如IL-12β1或IL-23R)、IL-17A、PD1或HGF特异性结合的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区（任选包括信号肽）或重链可变区（任选包括信号肽）或这两者，例如，其中该基因编码包含SEQ ID NO: 6、8-11、18或26的氨基酸20-128或SEQ ID NO 31的轻链免疫球蛋白的CDR-L1、CDR-L2 和CDR-L3；和/或其中该基因编码包含SEQ ID NO: 7、12、13、14或22的氨基酸20-137或SEQ ID NO: 30的重链免疫球蛋白的CDR-H1、CDR-H2 和CDR-H3。βGl-IgG内含子可以放置在任何多核苷酸，例如，载体，如质粒载体或病毒载体中。

本发明在其范围内包括含有βGl-IgG内含子的分离的质粒，该质粒的特征在于图1-10中任何一幅图的质粒载体图，例如，其中所述质粒包含SEQ ID NO: 3的核苷酸序列的βGl-IgG内含子核苷酸39-190。

包含本发明的 βGl-IgG内含子的宿主细胞也在本发明的范围内。例如，在宿主细胞中，βGl-IgG内含子多核苷酸可以整合到宿主细胞的染色体DNA中或不整合。此外，宿主细胞可以含有高拷贝数的多核苷酸，例如，每个细胞两个或更多个拷贝。

主细胞库(MCBs)也形成本发明的部分。因此，本发明包括制备主细胞库的方法，该方法包括将本发明的βGl-IgG内含子多核苷酸（例如，显示于图1-10中任何一幅图的质粒载体）导入宿主细胞（如，哺乳动物细胞，如CHO细胞，如CHO-DG44、CHO-K1或CHO-DXB11），选择包含所述多核苷酸的宿主细胞的单克隆群体，培养所述克隆群体，确定来自所述培养物的细胞是否含有细菌、病毒、真菌和/或支原体，并且，如果都没有检测到，则在冷冻条件下在一个或多个容器中保存来自所述培养物的细胞。在本发明的一个实施方案中，主细胞库不含生物污染物，如细菌、病毒、真菌和/或支原体。可以在冷冻条件下保存主细胞库。例如通过描述的制备MCB的方法生产的主细胞库也是本发明的部分。本发明进一步提供制备工作细胞库(WCB)的方法，该方法是通过培养来自本发明的主细胞库的细胞，并且在冷冻下在一个或多个容器中保存来自所述培养物的细胞。类似于制备MCB的方法，该方法可以包括测试WCB中的细菌、病毒、真菌和/或支原体的步骤，并且，如果都没有检测到，则在冷冻下保存来自所述培养物的细胞。例如通过描述的制备WCB的方法生产的工作细胞库也是本发明的部分。例如，在本发明的一个实施方案中，在MCB或WCB中，细胞是在小瓶（如，约200个或更多个）中，所述小瓶含有约10⁷个细胞/小瓶，并且不含可检测水平的细菌、病毒、支原体和真菌。

本发明也提供了用于在宿主细胞（如哺乳动物细胞，如CHO细胞，如CHO-K1、CHO-DXB11或CHO-DG44细胞）中表达由与启动子可操作性缔合的基因编码的靶多肽的方法，该方法包括在表达靶多肽的条件下将启动子和编码靶多肽的多核苷酸之间的、包含β-珠蛋白剪接供体位点和γ免疫球蛋白剪接受体（其中所述位点间隔约125个核苷酸）的βGl-IgG内含子多核苷酸（如质粒pAIG1FRLCb2V1,如包含SEQ ID NO: 35的核苷酸序列的该质粒）导入宿主细胞；并且，任选地，纯化所述靶多肽。在本发明的一个实施方案中，β-珠蛋白剪接供体位点包含核苷酸序列CAGGTAAGTTTA (SEQ ID NO: 4)，免疫球蛋白剪接受体位点包含核苷酸序列TTTCTCTCCACAGGC (SEQ ID NO: 5)，例如，其中剪接供体位点和剪接受体位点由以下序列间隔开：

(SEQ ID NO: 3的核苷酸51-175)。在本发明的一个实施方案中，基因是免疫球蛋白，例如，其中所述免疫球蛋白是与IGF1R特异性结合的抗体的轻链可变区或重链可变区，例如，其中该基因编码包含SEQ ID NO: 6、8-11、18或26的氨基酸20-128或SEQ ID NO 31的轻链免疫球蛋白的CDR-L1、CDR-L2 和CDR-L3；或其中该基因编码包含SEQ ID NO: 7、12、13、14或22的氨基酸20-137或SEQ ID NO: 30的重链免疫球蛋白的CDR-H1、CDR-H2 和CDR-H3。

附图简述

图1. pAIG1FRLCb2V1的质粒图。该质粒的特征图如下所示：

AP(R)

起始: 3965 终止: 4828

(互补的)

VDJ

起始: 5966 终止: 6393

IgG1

起始: 6393 终止: 7373

IgG1非基因组区

DHFR cDNA

起始: 601 终止: 1347

(互补的)

SV40 t Ag内含子

起始: 11916 终止: 600

κ

起始: 10055 终止: 10378

(互补的)

Κ链

VJ

起始: 10379 终止: 10756

(互补的)

IGF-1R的VJ (LCb,人种系序列)

pBR322

起始: 2811 终止: 3019

(互补的)

pBR322

起始: 3020 终止: 5033

TK-潮霉素序列

起始: 7682 终止: 9691

(互补的)

β珠蛋白聚腺苷酸信号

起始: 7398 终止: 7636

β珠蛋白聚腺苷酸信号

起始: 9784 终止: 10032

(互补的)

SV40聚腺苷酸信号

起始: 11669 终止: 11917

MMTV-LTR

起始: 1348 终止: 2810

(互补的)

hCMV/βGl-IgG内含子

起始: 5069 终止: 5910

人CMV启动子/βGl-IgG内含子

hCMV/βGl-IgG内含子

起始: 10778 终止: 11619

(互补的)

人CMV启动子/βGl-IgG

内含子

pBR ORI

起始: 3207 终止: 3207

图2. pAIG1FRLCb2V3的质粒图。该质粒的特征图如下所示:

AP(R)

起始: 3965 终止: 4828

(互补的)

IgG1

起始: 7371 终止: 8351

(互补的)

IgG1非基因组区

VDJ

起始: 8351 终止: 8778

(互补的)

DHFR  cDNA

起始: 601 终止: 1347

(互补的)

SV40 t Ag内含子

起始: 11916 终止: 600

Κ

起始: 10055 终止: 10378

(互补的)

Κ链

VJ

起始: 10379 终止: 10756

(互补的)

IGF-1R的VJ (LCb, 人种系序列)

pBR322

起始: 2811 终止: 3019

(互补的)

pBR322

起始: 3020 终止: 5033

TK-潮霉素序列

起始: 5053 终止: 7062

β珠蛋白聚腺苷酸信号

起始: 7108 终止: 7346

(互补的)

β珠蛋白聚腺苷酸信号

起始: 9784 终止: 10032

(互补的)

SV40 POLYA

起始: 11669 终止: 11917

MMTV-LTR

起始: 1348 终止: 2810

(互补的)

hCMV/βGl-IgG内含子

起始: 8834 终止: 9675

(互补的)

具有βGl-IgG内含子的人CMV启动子

hCMV/βGl-IgG内含子

起始: 10778 终止: 11619

(互补的)

人CMV启动子和βGl-IgG内含子

pBR ORI

起始: 3207 终止: 3207

图3. pAIG1FRV1的质粒图。

            AP(R)

                  起始: 3965  终止: 4828 (互补的)

            VDJ

                  起始: 5824  终止: 6251

                  19D12杂交瘤的IGFR1的VDJ

            IgG1

                  起始: 6241  终止: 7231

                  IgG1非基因组区

            DHFR cDNA

                  起始: 601   终止: 1347 (互补的)

            SV40 t Ag内含子

                  起始: 11740  终止: 600 

            Kap

                  起始: 9898  终止: 10233 (互补的)

                  人抗IGFR基因的Κ链

            VJ

                  起始: 10234  终止: 10614 (互补的)

                  轻链的人抗IGFR基因的VJ结构域

            pBR322

                  起始: 2811  终止: 3019 (互补的)

            pBR322

                  起始: 3020  终止: 5033

            TK-潮霉素序列

                  起始: 7540  终止: 9549 (互补的)

                  Union U-3中测序的TK-潮霉素

            β珠蛋白聚腺苷酸信号

                  起始: 7256  终止: 7494

            β珠蛋白聚腺苷酸信号

                  起始: 9642  终止: 9890 (互补的)

            SV40 聚腺苷酸

                  起始: 11493  终止: 11741

            MMTV-LTR

                  起始: 1348  终止: 2810 (互补的)

            CMV

                  起始: 10801  终止: 11455 (互补的)

            CMV

                  起始: 5069  终止: 5723

            T 7启动子/引发位点

                  起始: 5723  终止: 5742

            T 7启动子/引发位点

                  起始: 10782  终止: 10801 (互补的)

            pBR ORI

                  起始: 3207  终止: 3207

图4. pAIG1FRV3的质粒图。

            AP(R)

                  起始: 3965  终止: 4828 (互补的)

            IgG1

                  起始: 7371  终止: 8361 (互补的)

                  IgG1非基因组区

            VDJ

                  起始: 8351  终止: 8778 (互补的)

                  19D12杂交瘤的IGFR1的VDJ 

            DHFR cDNA

                  起始: 601   终止: 1347 (互补的)

            SV40 t Ag内含子

                  起始: 11740  终止: 600 

            Kap

                  起始: 9898  终止: 10233 (互补的)

                  人抗IGFR基因的Κ链

            VJ

                  起始: 10234  终止: 10614 (互补的)

                  轻链的人抗IGFR 基因的VJ结构域

            pBR322

                  起始: 2811  终止: 3019 (互补的)

            pBR322

                  起始: 3020  终止: 5033

            TK-潮霉素序列

                  起始: 5053  终止: 7062

                  TK-潮霉素

            β珠蛋白聚腺苷酸信号

                  起始: 7108  终止: 7346 (互补的)

            β珠蛋白聚腺苷酸信号

                  起始: 9642  终止: 9890 (互补的)

            SV40聚腺苷酸

                  起始: 11493  终止: 11741

            MMTV-LTR

                  起始: 1348  终止: 2810 (互补的)

            CMV

                  起始: 10801  终止: 11455 (互补的)

            T 7启动子/引发位点

                  起始: 8860  终止: 8879 (互补的)

            CMV

                  起始: 8879  终止: 9533 (互补的)

            T 7启动子/引发位点

                  起始: 10782  终止: 10801 (互补的)

            pBR ORI

                  起始: 3207  终止: 3207

图5. pAIG1FRLCB2-V1K的质粒图。

              AP(R)

                  起始: 3965  终止: 4828 (互补的)

            VDJ

                  起始: 6356  终止: 6356

                   抗-IL10 (12G8)的VDJ区

            IgG1

                  起始: 6361  终止: 7341

                  IgG1非基因组区

            VJ

                  起始: 10368  终止: 10745 (互补的)

            IgK

                  起始: 10013  终止: 10367 (互补的)

                   12G8轻链 (抗-IL10)的VDJ-IgK

            DHFR cDNA

                  起始: 601   终止: 1347 (互补的)

            SV40 t Ag内含子

                  起始: 11899  终止: 600 

            pBR322

                  起始: 2811  终止: 3019 (互补的)

            pBR322

                  起始: 3020  终止: 5033

            TK-潮霉素序列

                  起始: 7650  终止: 9659 (互补的)

                  TK-潮霉素

            β珠蛋白聚腺苷酸信号

                  起始: 7366  终止: 7604

            β珠蛋白聚腺苷酸信号

                  起始: 9763  终止: 9996

            SV40 聚腺苷酸

                  起始: 11652  终止: 11900

            MMTV-LTR

                  起始: 1348  终止: 2810 (互补的)

                hCMV/βGl-IgG内含子

                      起始: 5069  终止: 5910

                  具有杂合内含子的人CMV启动子

                hCMV/βGl-IgG内含子

                        起始: 10773  终止: 11614 (互补的)

                  人CMV启动子和杂合内含子

            pBR ORI

                  起始: 3207  终止: 3207

图6.  pAIL23V1K的质粒图。包含hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-IL-23 Ig.轻链和hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-IL-23 Ig.重链构建体的质粒载体。 βGl-IgG内含子位于核苷酸10906-10755和5760-5911。

图7. pAIL23RV1的质粒图。包含hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-IL-23R Ig.轻链和hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-IL-23R Ig.重链构建体的质粒载体。 βGl-IgG内含子位于核苷酸 10914-10763和5760-5911。

图8.pAIL17AV1的质粒图。包含hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-IL-17 Ig.轻链和hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-IL-17 Ig.重链构建体的质粒载体。 βGl-IgG内含子位于核苷酸10934-10783和5759-5910。

图9.pAPD16V1-GA的质粒图。包含hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-PD1 Ig.轻链和hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-PD1 Ig.重链构建体的质粒载体。βGl-IgG内含子位于核苷酸10871-10720和5759-5910。

图10.pAHGFV1的质粒图。包含hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-HGF Ig.轻链和hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-HGF Ig.重链构建体的质粒载体。βGl-IgG内含子位于核苷酸10922-10771和5760-5911。

发明详述

本发明的一部分提供表达构建体，由所述表达构建体可以以特别高的水平（相对于常规表达构建体）表达靶基因，如免疫球蛋白轻链或重链。例如，本发明包括多核苷酸（如质粒载体），所述多核苷酸包括与启动子可操作性连接的要表达的靶基因（如免疫球蛋白轻链和/或重链基因），其中，在基因和启动子之间，存在构建体，所述构建体包含β-珠蛋白内含子剪接供体位点，接着是约125个核苷酸，然后接着是γ免疫球蛋白内含子受体位点。本发明还包括使用本发明的表达构建体表达靶基因的方法。

分子生物学

根据本发明，可以使用本领域技术范围内的常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。所述技术在文献中完整解释。参见，例如，Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (本文中称作 "Sambrook, et al., 1989"); DNA Cloning:  A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)。

“多核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”包括DNA和RNA。

“多核苷酸序列”、“核酸序列”或“核苷酸序列”是核酸如DNA或RNA中的一系列核苷酸，并且表示任何两个或多个核苷酸的链。

“编码序列”或“编码”表达产物（如RNA、多肽、蛋白或酶）的序列是在表达时导致产生产物的核苷酸序列。

术语“基因”包括编码或对应于特定核糖核苷酸或氨基酸序列的DNA，所述核糖核苷酸或氨基酸序列包括一个或多个RNA分子或蛋白的全部或部分。基因可以从DNA转录为RNA，所述RNA可以翻译或不翻译为氨基酸序列。“靶基因”或“靶多核苷酸”是例如编码实施者意欲表达或正在表达的靶多肽的多核苷酸，所述表达例如是通过将多核苷酸导入用于在例如宿主细胞中表达的表达构建体中。

术语“分离的多核苷酸”或“分离的多肽”等分别包括与通常存在于细胞或重组DNA表达系统中的其它成分部分或完全分开的多核苷酸（如RNA或DNA分子）或多肽。这些成分包括但不限于细胞膜、细胞壁、核糖体、聚合酶、血清成分和外来基因组序列。在本发明的一个实施方案中，分离的多核苷酸或多肽将是分子的基本均质的组合物，但可能含有一些异质性。

本文使用的DNA的“扩增”包括使用聚合酶链反应（PCR）来增加DNA序列混合物内特定DNA序列的浓度。对于PCR的描述，参见Saiki, et al., Science (1988) 239: 487。

如本文使用的，术语“寡核苷酸”包括通常具有至少10个（如10、11、12、13或14个），优选至少15个（如15、16、17、18或19个），更优选至少20个核苷酸（如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个），优选不超过100个核苷酸（如40、50、60、70、80或90个）的核酸，其可以与编码基因的基因组DNA分子、cDNA分子或mRNA分子、mRNA、cDNA或其它感兴趣的核酸杂交。例如，可以通过掺入³²P-核苷酸、³H-核苷酸、¹⁴C-核苷酸、³⁵S-核苷酸或共价缀合于标记如生物素的核苷酸而对寡核苷酸进行标记。在本发明的一个实施方案中，标记的寡核苷酸可以用作探针来检测核酸的存在。在另一实施方案中，寡核苷酸（其中之一或两者可以被标记）可以用作PCR引物，用于克隆基因的全长或片段，或用于检测核酸的存在。通常，合成制备寡核苷酸，例如在核酸合成仪上制备。

可以通过本领域已知的任何方法（如化学测序或酶测序）对任何核酸的序列进行测序。DNA的“化学测序”包括诸如Maxam和Gilbert (1977) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA  74:560)的方法，其中用各个碱基特异性反应随机切割DNA。DNA的“酶测序”可以包括诸如Sanger (Sanger, et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  74:5463)的方法。

在本发明的一个实施方案中，本发明的核酸可以侧接天然调节（表达控制）序列，或可以与异源序列缔合，所述异源序列包括启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其它核糖体结合位点序列、增强子、应答元件、阻抑基因、信号序列、聚腺苷酸化序列、内含子、5’-和3’-非编码区等。

在本发明的一个实施方案中，“启动子”或“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶（如直接或通过其它启动子结合的蛋白或物质）并起始编码序列（如免疫球蛋白，如抗-IGF1R免疫球蛋白）的转录的DNA调节区。通常，启动子序列在其3’末端以转录起始位点为边界，并且向上游延伸（5’方向），以包括起始任何水平的转录所必须的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内可以存在转录起始位点（例如，通过用核酸酶S1作图而方便地确定），以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合域（共有序列）。启动子可以与其它表达控制序列包括启动子和阻抑物序列或与本发明的核酸可操作性缔合。可以用于控制基因表达的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV) 启动子 (美国专利号5,385,839 和5,168,062)、SV40早期启动子区(Benoist, et al., (1981) Nature  290:304-310)、包含在劳斯肉瘤病毒的3’长末端重复序列中的启动子 (Yamamoto, et al., (1980) Cell  22:787-797)、疱疹胸苷激酶启动子 (Wagner, et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  78:1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列 (Brinster, et al., (1982) Nature  296:39-42); 原核表达载体，如β-内酰胺酶启动子(Villa-Komaroff, et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  75:3727-3731),或tac启动子(DeBoer, et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  80:21-25); 也参见Scientific American (1980) 242:74-94中的“来自重组细菌的有用蛋白”; 和来自酵母或其它真菌的启动子，如Gal 4启动子、 ADC (醇脱氢酶) 启动子、PGK (磷酸甘油激酶)启动子或碱性磷酸酶启动子。

当转录或翻译控制序列指导RNA聚合酶介导的编码序列转录为RNA，如mRNA时，所述编码序列在细胞中是在转录或翻译控制序列的“控制下”、与转录或翻译控制序列“功能性缔合(functionally associated with)”或“可操作性连接”或“可操作性缔合(operably associated with)”，所述RNA，如mRNA随后可以进行反式RNA剪接（如果它含有内含子），并且，任选地，翻译为编码序列编码的蛋白。如果βGl-IgG内含子导致相对于无βGl-IgG内含子的启动子而言从启动子的表达水平增加，则启动子是与βGl-IgG内含子可操作性连接的。

术语“表达”表示使得或导致基因，如RNA或DNA中的信息展现出来；例如，通过激活参与相应基因的转录和翻译的细胞功能而产生蛋白。DNA序列可以在细胞中表达，或由细胞表达，以形成“表达产物”，如RNA（如mRNA）或蛋白。表达产物自身也可以描述为由细胞“表达”。

术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”包括这样的运载体（如质粒）：通过其可以将核酸导入宿主细胞，从而转化宿主，并且任选地，促进核酸编码的基因的表达和/或导入的核酸的复制。在本发明的一个实施方案中，载体是自主复制的核酸，如环状质粒。

术语“转化”表示将核酸导入细胞。该术语包括将编码抗-IGF1R、抗-IL23、抗-IL23R、抗-IL17、抗-PD1或抗-HGF抗体或其抗原结合片段的核酸导入细胞中。导入的基因或序列可以称作“克隆”。接受了导入的DNA或RNA的宿主细胞已被“转化”，并且是“转化体”或“克隆”。导入宿主细胞的DNA或RNA可以来自任何来源，包括与宿主细胞相同属或种的细胞，或不同属或种的细胞。可以通过本领域公知的许多方法中的任何方法将质粒导入细胞中。例如，本发明的质粒可以用于通过磷酸钙方法、电穿孔、DEAE-右旋糖酐方法或脂质体方法转化细胞。

术语“宿主细胞”包括任何以下生物的任何细胞：所述生物以任何方式选择、修饰、转染、转化、生长或使用或操作，用于由细胞生产物质，例如由细胞表达或复制基因、DNA或RNA序列、蛋白或酶。宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞，如CHO-K1细胞(ATCC保藏号CRL-9618)、CHO-DG44细胞和CHO-DXB-11细胞。

“表达构建体”是一种多核苷酸，其能够驱动该多核苷酸内编码的靶基因的表达。例如，其中该基因可操作性连接于启动子（如CMV启动子），βGl-IgG内含子位于所述基因和启动子之间。

“启动子/βGl-IgG内含子”是可操作性连接于βGl-IgG内含子的启动子。βGl-IgG内含子导致比缺乏βGl-IgG内含子的情况下从启动子的表达水平更高。

“βGl-IgG内含子”是包含剪接供体（如β-珠蛋白）和剪接受体位点（如IgG）的内含子。

在本发明的一个实施方案中，表达构建体包含Kozak共有序列，如gccgccaccatgg (SEQ ID NO: 1)或gccgccaccatg (SEQ ID NO: 2)。

术语“表达系统”表示宿主细胞和相容的载体，它们在合适的条件下能够表达由该载体携带，并且导入宿主细胞中的蛋白或核酸。常用的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。如上文所提到的，宿主细胞包括CHO（中国仓鼠卵巢）细胞，如CHO-K1或DXB-11；也包括HeLa细胞和NIH 3T3细胞以及NSO细胞（不产生Ig的鼠骨髓瘤细胞系）。

本发明的质粒载体可以包括本领域已知的数种可扩增标记中的任何一种。可扩增标记的使用在Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989))中讨论。用于在耐药哺乳动物细胞中进行基因扩增的有用的选择标记包括DHFR (MTX (氨甲喋呤)抗性) (Alt et al., J. Biol. Chem. 253:1357 (1978); Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA  77:3567 (1980)); 金属硫蛋白 (镉抗性) (Beach et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA  78:210 (1981)); CAD (N-(膦酰乙酰(phosphonoacetyl))-l-天冬氨酸(PALA)抗性) (Wahl et al., J. Biol. Chem. 254: 8679 (1979)); 腺苷酸脱氨酶 (助间型霉素抗性) (Debatisse et al., Mol. Cell. Biol. 6:1776 (1986)); IMP 5’-脱氢酶 (霉酚酸抗性) (Huberman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA  78:3151 (1981))和本领域已知的其它标记(例如，综述于Kaufman et al., Meth. Enzymology 185:537-566 (1988))。

本发明考虑对氨基酸或核苷酸序列进行任何表面或轻微的修饰，所述序列编码本发明的质粒所编码的靶基因，例如，本发明的抗体或其抗原结合片段。多核苷酸序列的“序列-保守变体”是其中给定密码子中一个或多个核苷酸的改变不引起在该位置编码的氨基酸改变的那些。本发明的靶基因的功能-保守变体也是本发明所考虑的。“功能-保守变体”是其中蛋白中一个或多个氨基酸残基改变而不改变多肽总体构象和功能的那些，包括，但决不限于将氨基酸替换为具有相似性质的氨基酸。具有相似性质的氨基酸是本领域公知的。例如，可以互换的极性/亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；可以互换的非极性/疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；可以互换的酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，可以互换的碱性氨基酸包括组氨酸、赖氨酸和精氨酸。氨基酸序列的保守取代是指那些：其中一种亚型的氨基酸（如极性/亲水性）的氨基酸被相同亚型的另一种氨基酸替代；并且，在本发明的一个实施方案中，其中保守取代的多肽保留基本相同水平的生物活性。

本发明包括质粒，所述质粒包含编码靶基因的核酸以及与其杂交的核酸。在本发明的一个实施方案中，核酸在低严格性条件下，更优选在中等严格性条件下，最优选在高严格性条件下杂交。当核酸分子的单链形式在合适的温度和溶液离子强度条件下（参见上文的Sambrook, et al.）能够与另一核酸分子退火时，该核酸分子与另一核酸分子，如cDNA、基因组DNA或RNA是“可杂交的”。温度和离子强度条件决定杂交的“严格性”。在本发明的一个实施方案中，典型的低严格性杂交条件包括55^oC, 5X SSC, 0.1% SDS, 0.25% 乳，并且无甲酰胺;或30%甲酰胺, 5X SSC, 0.5% SDS。典型地，中等严格性杂交条件类似于低严格性条件，不同的是杂交是在40% 甲酰胺中， 5X或6X SSC条件下进行的。高严格性杂交条件类似于低严格性条件，不同的是杂交条件是在50%甲酰胺, 5X或6X SSC中进行的，任选地，在更高温度下进行（如57^oC、59^oC、60^oC、62^oC、63^oC、65^oC或68^oC）。通常，SSC是0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠。杂交需要两个核酸含有互补序列，但是根据杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补程度，它们是本领域公知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性的程度越高，核酸可以杂交的严格性越高。对于长度大于100个核苷酸的杂交体，推导了用于计算解链温度的公式（参见，上文Sambrook, et al., 9.50-9.51）。对于与较短核酸，即寡核苷酸的杂交，错配的位置变得更重要，并且寡核苷酸的长度决定其特异性（参见上文Sambrook, et al., 11.7-11.8）。

本发明也包括了质粒，其包含编码靶多肽的靶核苷酸序列，当通过BLAST算法进行比较时，所述靶多肽包含的氨基酸序列与本发明的参照核苷酸和氨基酸序列（如SEQ ID NOs: 6-31的任意一个）具有至少约70%的同一性，优选至少约80%的同一性，更优选至少约90%的同一性，最优选至少约95%的同一性（如95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%），其中选择所述算法的参数，以得到在各个参照序列的整个长度上各个序列之间的最大匹配。本发明也包括多肽，当用BLAST算法进行比较时，所述多肽包含的氨基酸序列与本发明的参照氨基酸序列（如SEQ ID NOs: 6-31的任意一个）具有至少约70%的相似性，优选至少约80%的相似性，更优选至少约90%的相似性，最优选至少约95%的相似性（如95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%），其中选择所述算法的参数，以得到在各个参照序列的整个长度上各个序列之间的最大匹配。

序列同一性是指进行比较的两个序列的核苷酸或氨基酸之间的精确匹配。序列相似性是指进行比较的两个多肽的氨基酸之间的精确匹配以及不相同的、生物化学相关的氨基酸之间的匹配。上文讨论了具有相似特性并且可以互换的生物化学相关的氨基酸。

以下关于BLAST算法的参考文献在此通过引用并入本文: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., et al., (1991) Methods  3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; and Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York。

内含子

本发明包含多核苷酸，例如，载体（如质粒），其包含启动子（如人巨细胞病毒（CMV）启动子，如人巨细胞病毒的立即-早期启动子-调节区），所述启动子与包含β-珠蛋白剪接供体和免疫球蛋白剪接受体的βGl-IgG内含子可操作性连接，所述启动子/内含子组合与靶基因，如免疫球蛋白可操作性连接。使用本发明的多核苷酸表达所述靶基因的方法也是本发明的部分。如本文讨论的，发现从人CMV启动子进行的基因（如抗-IGF1R免疫球蛋白）的表达在CMV启动子与βGl-IgG内含子 (β-珠蛋白剪接供体/Ig. 剪接受体)连接时显著增加。

例如，在本发明的一个实施方案中，启动子/内含子构建体在与其可操作性连接的靶基因的上游。包括将靶基因与启动子/内含子可操作性连接的用于增加靶基因表达的方法也在本发明的范围内。

在本发明的一个实施方案中，包含β-珠蛋白剪接供体和IgG.剪接受体的βGl-IgG内含子包含以下核苷酸序列：

(SEQ ID NO: 3)。β-珠蛋白剪接供体位点加实线下划线，免疫球蛋白剪接受体加虚线下划线。在本发明的一个实施方案中，β-珠蛋白剪接供体位点包含核苷酸序列CAGGTAAGTTTA (SEQ ID NO: 4)。在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白剪接受体位点来自IgG可变区，例如，包含核苷酸序列TTTCTCTCCACAGGC (SEQ ID NO: 5)。

在本发明的一个实施方案中，βGl-IgG内含子包含

(SEQ ID NO: 3的核苷酸39-190)。

免疫球蛋白

本发明包括实施方案，其包括多核苷酸（如质粒），所述多核苷酸包含与靶基因如免疫球蛋白可操作性缔合的启动子/内含子构建体。在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白包含任选与免疫球蛋白恒定区连接的抗IGF1R免疫球蛋白轻链或重链可变区。

在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白链编码任意以下所述的那些；例如，任意以下免疫球蛋白轻链或重链或其任意CDR。虚线下划线字体编码信号肽。实线下划线字体编码CDRs。无格式字体编码构架区。在本发明的一个实施方案中，抗体链是缺乏信号肽的成熟片段。在本发明的一个实施方案中，表达包含信号肽的未加工的免疫球蛋白链，其从宿主细胞分泌，从而加工和除去信号肽，产生成熟的免疫球蛋白链。所述组合物和表达方法形成本发明的部分。

编码任意以下靶免疫球蛋白氨基酸序列的多核苷酸形成本发明的部分。

19D12/15H12轻链(SEQ ID NO: 6)

19D12/15H12重链(SEQ ID NO: 7)

19D12/15H12轻链-C (LCC) (SEQ ID NO: 8)

19D12/15H12轻链-D (LCD) (SEQ ID NO: 9)

19D12/15H12轻链-E (LCE) (SEQ ID NO: 10)

19D12/15H12轻链-F (LCF) (SEQ ID NO: 11)

19D12/15H12重链-A (HCA)  (SEQ ID NO: 12) 

19D12/15H12重链-B (HCB) (SEQ ID NO: 13)       

参见国际申请公开号WO2003/100008，其中公开了每个序列；该申请在此通过全文引用并入本文。

2C6重链

2C6轻链

9H2重链

9H2轻链

重链免疫球蛋白可变区 # 1.0 序列  

轻链免疫球蛋白可变区# 1.0序列

本发明的实施方案包括那些：其中多核苷酸（如质粒）包含启动子/βGl-IgG内含子构建体，该构建体可操作性连接于一种以上免疫球蛋白，例如，本文所述任意免疫球蛋白的组合（如重链Ig. # 1.0和轻链Ig. #1.0;或LCC 和HCA;或LCF和HCA;或LCC和HCB）。

质粒

本发明的一部分提供了分离的质粒，其展示抗-IGF1R重链和轻链的高水平表达。这些质粒是pAIG1FRLCb2V1和pAIG1FRLCb2V3。这些质粒编码包括LCF和HCA的抗体并指导所述抗体的表达。质粒的序列如下所示：

本发明的一部分进一步提供了分离的质粒，其展示抗-IL-23 p19重链和轻链的高水平表达。一种质粒是pAIL23V1-K。pAIL23V1-K质粒的序列如下所示：

本发明的一部分进一步提供了分离的质粒，其展示抗-IL-23R重链和轻链的高水平表达。一种质粒是pAIL23RV1。pAIL23RV1质粒的序列如下所示：

本发明的一部分进一步提供了分离的质粒，其展示抗- IL-17重链和轻链的高水平表达。一种质粒是pAIL17AV1。pAIL17AV1质粒的序列如下所示：

本发明的一部分进一步提供了分离的质粒，其展示抗- PD1 (程序化死亡1)重链和轻链的高水平表达。一种质粒是pAPD16V1-GA。pAPD16V1-GA质粒的序列如下所示：

本发明的一部分进一步提供了分离的质粒，其展示抗-HGF(肝细胞生长因子)重链和轻链的高水平表达。一种质粒是pAHGFV1。pAHGFV1质粒的序列如下所示：

这些质粒的质粒图在本文也提供在图1-10中。

表达

可以通过本领域已知的数种方法中的任意方法，将包含要表达的靶基因的载体，如质粒（如图1-10）导入宿主细胞中。如果不具有细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，可以通过Graham and Van der Eb, Virology, 52: 546 (1978)描述的磷酸钙沉淀方法进行转化。但是，也可以使用用于将DNA导入细胞中的其它方法，如通过细胞核注射或通过原生质体融合。用于转化的其它方法包括电穿孔、脂质体转化和DEAE-右旋糖酐转化。

如果使用原核细胞（如大肠杆菌如BL21或BD21DE3或HB101或DH1或DH5）或含有实质性细胞壁构造的细胞（如啤酒糖酵母），可以如Cohen, F. N. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. ( USA) 69: 2110 (1972)的描述，通过使用氯化钙的钙处理来进行转化。

可以选择和筛选包含本发明的载体（如图1-10）的宿主细胞，从而鉴定具有用于表达靶基因所必需的特征的克隆。在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中，用于实现最大表达的一种常见方法涉及使用突变细胞系和在数月中对于共转染的选择标记如二氢叶酸还原酶 (DHFR)的选择压力的逐渐增加 (Kaufman et al. (1982)  J. Mol. Biol. 159: 601–621; Schimke et al. (1982) Natl. Cancer Inst. Monogr. 60: 79–86)。为了实现高生产率，用包含与要表达的靶基因组合的功能性DHFR基因的表达载体转化二氢叶酸还原酶(DHFR)阴性细胞系（如CHO细胞系）(Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216–4220)。反应于渐增量的DHFR拮抗剂氨甲蝶呤(MTX)在培养基中的加入，发生载体插入的靶基因的扩增，并且产生携带多个拷贝的重组基因的克隆或亚群，并且可以进行选择(Wurm (1990) Biologicals 18:159–164)。基因扩增过程典型地需要数月，直到获得稳定的细胞系，其显示高靶基因拷贝数和所需蛋白的高生产率。

在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸整合到宿主细胞（如CHO, CHO-K1, CHO-D1 DXB11）DNA中，或是异位的（非整合的）。在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸以每个细胞数个拷贝（如2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20个）存在于细胞中。在表达载体已经整合到宿主细胞的基因组DNA中以改进稳定性的情况下，载体DNA的拷贝数，以及，同时，能够表达的产物量，可以通过选择细胞系而增加，所述细胞系中载体序列在整合到宿主细胞的DNA中之后得到扩增。

本领域已知的数种细胞培养基中的任意培养基都可以用于增殖表达靶基因的细胞。可以获得一些商业上可获得的培养基。如果表达要在治疗上使用的蛋白，则不含动物产物的培养基（如无血清培养基(SFM)）可能是期望的。存在数种本领域已知的方法，通过这些方法可以使得细胞适应于在无血清培养基中生长。例如，直接适应包括仅仅将细胞从补充血清的培养基转换到无血清培养基。序贯适应或戒断（weaning）包括以数个步骤将细胞从补充血清的培养基转换到无血清培养基（如 25% SFM, 50% SFM, 75% SFM, 然后， 90% SFM 进行约3 次传代，然后100% SFM）。序贯适应相对于直接适应倾向于对细胞较不严苛。通常，为了使细胞适应无血清培养基，培养物应该是在对数中期中，> 90%存活，并且以比适应过程中更高的初始细胞接种物进行接种。

包含本发明的宿主细胞的细胞系也可以保存在主细胞库 (MCB)和工作细胞库(WCB)中。典型地，当细胞系要在很多个制造周期中使用时，可以建立由主细胞库或主接种库(master seed bank, MSB)和工作细胞库组成的两层细胞库系统。从单宿主细胞克隆建立细胞系，并且该细胞系用于构成MCB。通常，该MCB必须鉴定和广泛测试污染物，如细菌、真菌、病毒和支原体。可以扩增来自MCB的细胞的样品，用于形成WCB，在制造过程中使用之前，鉴定所述WCB的细胞生存力。MCB或WCB中的细胞可以保存在小瓶中，例如，在低温下（如0^oC或更低, -20^oC或-80^oC）保存。

典型地，工作细胞库包括来自一个小瓶的主库的细胞，所述细胞在保存前已经生长了数代。通常，当将来需要细胞时，从工作细胞库取出它们；然而，当必要时仅仅使用主细胞库，确保具有低传代数的细胞储存物，从而避免细胞培养物内的遗传性变异。

因此，本发明包括制备主细胞库的方法，该方法包括用本发明的质粒转化细胞，如CHO细胞，选择所述转化的细胞的单克隆群体（如在培养板上的单集落生长），培养所述克隆群体（如在液体生长培养基中），确定来自所述培养物的细胞是否含有细菌、病毒、支原体和/或真菌，并且，如果培养物的细胞不含可检测水平的所述物质，在冷冻条件下（如在-80^oC），例如在一个或多个分开的容器，如小瓶（如每小瓶包含约10⁷个细胞）中保存从所述培养物取出的细胞。本发明也包括制备工作细胞库的方法，该方法包括选择来自主细胞库的细胞的样品，使细胞生长，并且将细胞保存在一个或多个容器，如小瓶中。也可以测试用于制备工作细胞库以及主细胞库的细胞的细菌、病毒、支原体或真菌。

本发明也包括主细胞库和/或工作细胞库，其中包含本发明的任何宿主细胞（如本文所述）或来自其的一个或多个细胞。主细胞库或工作细胞库中的细胞可以在冷冻条件下（如0^oC或更低, -20^oC或-80^oC）保存在数百个（如100, 200, 500, 700, 1000,或2000 个小瓶或更多）容器中。

实施例

这些实施例意欲进一步阐明本发明，并不限制本发明。实施例中阐述的任何组合物或方法（全部或部分）都形成本发明的一部分。

实施例1:  抗体表达盒中的内含子元件的评价

通过PCR合成含有与pDSRG的序列的一部分一起存在于质粒pDSRG中的 β-珠蛋白剪接供体和免疫球蛋白剪接受体的βGl-IgG内含子：

(SEQ ID NO: 3)

含有CAGGTAAGTTTA  (SEQ ID NO: 4) 的序列是β-珠蛋白剪接供体，含有TTTCTCTCCACAGGC (SEQ ID NO: 5)的序列是免疫球蛋白受体位点。短斜线表示预测的供体和受体序列之间的剪接位点。

内含子插入在人CMV启动子下游，表达盒的5’侧翼区内，预期增强表达。为此，通过PCR延伸βGl-IgG内含子的5’末端，从而包含CMV启动子的部分序列。用EcoRI消化得到的延伸的PCR产物，用Klenow聚合酶补平，用NcoI消化。同时，也用NheI消化轻链表达质粒pUhCMVIGFRLCb2，用Klenow聚合酶补平，用NcoI消化。然后将内含子连接于pUhCMVIGFRLCb2，用于构建pUIGFRLCb2 (SEQ ID NO: 32)。为了将内含子插入重链表达质粒，用SnaBI和AflII消化PCR延伸的、含内含子的片段。同时，通过SnaBI和AflII消化pUhyg(-)IG1FRhuH，插入内含子，用于构建pUIG1FRmodH (SEQ ID NO: 33)。随后，如下构建含重链和轻链表达盒这两者的单个质粒载体：通过RsrII 和PacI消化pUIGFRLCb2，用于转移轻链表达盒。也通过 RsrII和PacI消化pXBLS，将含有LCB2的轻链表达盒插入构建体pAIGFRLCb2 (SEQ ID NO: 34)中。然后通过BssHII消化pUIG1FRmodH，用于释放携带重链和潮霉素-B磷酸转移酶表达盒的片段。也通过BssHII消化pAIGFRLCb2，在该位点插入重链表达盒，用于构建pAIG1FRLCb2V1 (SEQ ID NO: 35)和pAIG1FRLCb2V3 (SEQ ID NO: 36)。

通过ELISA，评估含有内含子的质粒在瞬时转染中的抗体表达。结果证明，当用在重链和轻链表达盒中都携带该内含子的质粒进行转染时，抗-IGF1R的表达比通过不含内含子的相似质粒进行转染获得的表达高约2-3倍。

评估两个单个表达质粒pAIG1FRLCb2V1和pAIG1FRLCb2V3在KIRA (激酶受体激活) 测定中的生物活性。结果表明，这两个单个表达质粒显示与从19D12杂交瘤获得的纯化抗体相同的生物活性。

通过PCR进一步修饰一些质粒载体，以便在重链和轻链cDNA序列的5’末端掺入Kozak共有序列（下文以粗体显示）。下文指出的引物中的限制位点是加下划线的，并且起始甲硫氨酸密码子(atg)以粗体和斜体表示。

重链的引物对如下所示：

5’引物具有KpnI (ggtacc) 位点以及Kozak序列，3’引物具有ApaI位点(gggccc)。

对于轻链，使用以下引物：

轻链的5’引物具有EcoRI (gaattc) 和PmeI (gtttaaac)位点以及Kozak序列，3’引物具有BsiWI 位点(cgtacg)。将PmeI位点添加到5’引物，作为PCR产物与质粒的成功连接的指示物。

将扩增的重链序列克隆到pUIG1FRmodH/Kan中的KpnI和ApaI位点，用于构建pAIG1FRH-K (SEQ ID NO: 41)，将轻链序列克隆到pAIGFRLCb2中的EcoRI和BsiWI位点，用于构建pAIGFRLCb2(-)L-K (SEQ ID NO: 42)。

然后通过BssHII消化pAIG1FRH-K，用于将重链表达盒连同潮霉素-B抗性基因表达盒一起转移到pAIGFRLCb2(-)L-K。也通过BssHII消化 pAIGFRLCb2(-)L-K，将重链表达盒插入相同位点，用于构建pAIG1FRLCb2V1-K (SEQ ID NO: 43)。

用含有和不含有内含子的表达质粒转染DXB11细胞。βGl-IgG内含子的存在带来了DXB11细胞中抗-IGF1R表达的约2-3倍增加。pAIG1FRV1和pAIG1FRV3是不含内含子的、携带抗-IGF1R的重链和轻链表达盒的质粒。pAIG1FRLCB2V1和pAIGFRLCB2V3是携带抗-IGF1R的重链和轻链表达盒以及内含子的质粒。通过ELISA分析来自转染后3天和5天的上清液。来自ELISA分析的数据在下文列于表1。

ELISA程序

试剂-

·         抗-IGF1R  20.24 mg/mL浓缩物

·         人IgG-包被的平板

·         HRP-缀合的山羊抗-人IgG

·         ELISA稀释液- 0.1% BSA (牛血清白蛋白) / PBST (磷酸缓冲盐水和Tween 20

·         TMB液体底物系统: 来自Pierce的1步涡轮(turbo)系统

·         终止试剂(约2M H₂SO₄) 

程序-

A.  标准曲线的制备

在ELISA稀释液中将纯化的抗-IGF1R稀释到200 ng/mL。

       20,240,000 ng/mL ÷ 200 ng/mL = 1:101200稀释

       加入10μL人IgG1标准物到990 μL ELISA 稀释液(I)。

       通过加入49.4μL的(I)到49950.6 μL ELISA稀释液中稀释到200ng/mL。

制备200 ng/mL标准物的4mL等分物，在4^oC下保存。在测定日，通过将200μL标准物加样到A行并且从顶部标准物到底部进行1:2系列稀释 (3.125 ng/mL)，制备标准曲线的其余部分。用ELISA稀释液作为空白或0 ng/mL标准。

B.  对照的制备

以300 ng/mL制备对照。     

加入74.1 μL的(I)(参见标准曲线的制备)到49925.9 μL的ELISA稀释液中。制备 2.5 mL等分物，在4^oC下保存。

C.  测定

在使用前，使所有试剂加温到室温。

1.      设定标准曲线和未知值的模板表示位置。

2.      用EIA洗涤缓冲液洗涤平板1次。

3.      根据模板，在合适的孔中添加标准物、对照和样品。  

每个孔中的最终体积是100 μL。

覆盖平板，在室温下温育1小时。

4.      在ELISA稀释液中以1:10,000稀释HRP-缀合的抗-huIgG。

通过在990μL 0.1% BSA-PBST中加入10 μL 抗-huIgG储备液，进行最初的1:100稀释，然后通过在34650 μL 0.1% BSA-PBST中加入350μL最初的稀释液，进行另外的1:100稀释。该溶液的最终稀释度是1:10000。

5.      吸出孔中的液体。用EIA洗涤缓冲液洗涤孔4次。

6.      在所有孔中添加100 μL HRP缀合物。覆盖平板，在室温下温育30分钟。

7.      如步骤5那样洗涤孔。

8.      通过在每个孔中加入100 μL TMB底物，在孔中进行显色。

9.      根据孔中蓝色的量，以与步骤8中分配的相同顺序在所有孔中加入50 μL终止试剂。这需要大约2-4分钟。对平板显色2分钟。

10.  在添加终止试剂的30分钟内，用微量滴定板读数器对每个孔的吸光度进行读数，设定波长为450-650 nm。

D. 数据分析-

用4参数对数曲线拟合分析数据。

激酶受体激活(KIRA)测定程序

1) 在不含牛胰岛素的培养基中以200,000个细胞/孔(2.0x10⁶个细胞/mL - 0.1 mL)制备MCF-7细胞。将细胞接种在96孔组织培养板(Falcon # 35-3075)中。每个样品制备双份孔。在CO₂培养箱(5-6% CO₂, 35-37^oC)中孵育平板过夜。

2) 用100μL/孔的抗-IGF1R捕获抗体(可商购的IgG1特异性抗体)包被ELISA板(NUNC MAXI-SORP)。将纯化的、杂交瘤来源的19D12制备到1.0 μg/mL。测试每个批次备用。在4^oC下孵育ELISA板过夜。

3) 从培养箱取出组织培养板。从除了未处理的(EMEM)对照孔的所有孔中取出培养基。采用12通道的多通道移液管，一次取出一行培养基，以防止加样前孔干燥。

4) 为了得到96孔稀释板中的稀释曲线，在第1-10和12列添加100 μl/mL EMEM。添加200 μL/孔5.0 μg/mL的对照Ab到第11列的合适孔中。添加200 μl/孔的样品到第11列的合适孔中。使用系列稀释容器，将100μl (1:2)从第11列转移到第1列（第12列是未处理的细胞对照）。从细胞板的孔取出培养基。将50 μl/孔从稀释板转移到细胞板的对应孔中。在CO₂培养箱(5-6% CO₂, 35-37^oC)中孵育30分钟。

5) 在EMEM (无FBS)中制备75 ng/mL的IGF-I (R&D Systems; Minneapolis, MN)。从培养箱取出组织培养板。从所有孔取出内容物(每次一个平板)。在样品孔以及IGF-I 对照孔中加入100μL孔的IGF-I。在第12列加入100 μl/孔的EMEM。

6)在孵育细胞板同时，封闭以前包被的ELISA板。弃去捕获抗体(倒入容器是可接受的)，并且用纸巾吸干。加入150 μL/孔封闭缓冲液(参见试剂页)。室温下在平板振荡器上将平板轻柔振荡1小时。

7) 在细胞板的IGF-I孵育后，取出组织培养板的所有孔的内容物（所有孔都可以取出/96孔板）。加入100 μL/孔的裂解缓冲液。室温下在平板振荡器上将平板振荡1小时。

8) 在ELISA板的封闭缓冲液孵育后，弃去封闭缓冲液（倒出，吸干）。用150 μL/孔的洗涤缓冲液（参见试剂页）洗涤平板6次。每次洗涤后倒出并吸干。

9) 在细胞板的裂解缓冲液孵育后，将85 μL从细胞板的孔转移到ELISA板的对应孔中。用12通道的多通道移液管，一次转移一整行。在转移前，上下往复轻柔吸取转移体积，从而打碎一些剩余的细胞团。吸取裂解物的时候避免产生气泡。室温下在平板振荡器上将平板振荡2小时。

10) 在稀释缓冲液（参见试剂页）中制备0.2 μg/mL生物素化的抗-磷酸酪氨酸检测Ab - 4G10 (Upstate USA; Lake Placid, NY)。裂解物的孵育后，弃去裂解物（倒出，吸干）。用100 μL/孔的洗涤缓冲液，洗涤ELISA板四次。每次洗涤后倒出并吸干。

11) 在ELISA板中加入100 μL/孔的4G10 Ab (抗-磷酸酪氨酸抗体)。室温下在平板振荡器上将平板轻柔振荡2小时。

12) 在稀释缓冲液中制备0.025 μg/mL的HRP缀合的链霉亲和素(Kirkegaard and Perry Laboratories Inc.; Gaithersburg, MD) 。移入室温下。4G10 (抗-磷酸酪氨酸抗体)孵育后，弃去检测抗体（倒出，吸干）。用100 μL/孔的洗涤缓冲液洗涤ELISA 板4次。每次洗涤后倒出并吸干。

13) 加入100 μL/孔HRP缀合的链霉亲和素。 室温下在平板振荡器上将平板轻柔振荡30分钟。

14) 以组分A与组分B的1:1混合物制备TMB底物(2组分系统，R&D Systems) 。移入室温下。在ELISA板中进行链霉亲和素孵育后，弃去链霉亲和素（倒出，吸干）。用100 μL/孔的洗涤缓冲液洗涤ELISA 板4次。每次洗涤后倒出并吸干。

15)在ELISA板中加入100μL/孔的TMB底物。室温下在平板振荡器上将平板振荡15分钟。

16) TMB孵育后，加入50 μL/孔的1N H₂SO₄ 终止试剂。在平板读数器上以450 nm/570 nm对平板读数。在添加终止试剂的20分钟内对平板读数。

表1. 从各个质粒的抗-IGF1R表达水平

这些数据证明与缺乏βGl-IgG内含子的相关质粒pAIG1FRV1和pAIG1FRV3相比，与含βGl-IgG的质粒pAIG1FRLCB2V1和pAIG1FRLCB2V3相关的优越表达水平。当Kozak共有序列与质粒pAIG1FRLCB2V1的免疫球蛋白基因可操作性缔合以产生pAIG1FRLCB2-V1K时，甚至更高的表达水平是可能的。

通过KIRA测定，分析来自19D12亲本杂交瘤和来自质粒pAIG1FRLCB2V1和pAIG1FRLCB2V3的19D12抗体的生物活性。这些数据在下文示于表2。

表2. 来自19D12杂交瘤和来自含有质粒pAIG1FRLCB2V1和pAIG1FRLCB2V3的CHO-DXB11细胞的抗-IGF1R抗体的评估

“nM Ab” 表示每个测定中使用的抗体的浓度（纳摩尔）。19D12对应于用19D12抗体产生的信号。pAIG1FRLCb2V1和pAIG1FRLCb2V3 对应于用从这两个质粒表达和纯化的抗体(轻链F/重链A)产生的数据。

这些数据证明，pAIG1FRLCb2V1和pAIG1FRLCb2V3质粒产生生物活性的抗-IGF1R抗体。

本发明的范围不限于本文描述的具体实施方案。实际上，本发明的范围包括本文具体阐述的实施方案和本文没有具体阐述的其它实施方案；本文具体阐述的实施方案并不一定是穷举的。除了本文描述的实施方案，本发明的各种变化也是本领域技术人员从前述说明书中可以显而易见的。所述变化意欲落入权利要求的范围。

在本申请通篇引用了专利、专利申请、公开文献、产品说明书和方案，为了所有目的，其公开内容通过全文引用并入本文。

序列表

 

<110>  Schering Corp.

 

<120>  用于增强抗-IGF1R表达的βGl-IgG内含子

 

<130>  UB06856

 

<150>  61/113,807

<151>  2008-11-12

 

<160>  48   

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  13

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  Kozak共有序列

 

<400>  1

gccgccacca tgg                                                          13

 

 

<210>  2

<211>  12

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  Kozak共有序列

 

<400>  2

gccgccacca tg                                                           12

 

 

<210>  3

<211>  194

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  包含β-珠蛋白剪接供体和Ig.剪接受体的杂合内含子

 

<400>  3

attaatacga ctcactatag caattgcacg tgtggccaca ggtaagttta aagctcaggt       60

 

cgagaccggg cctttgtccg gcgctccctt ggagcctacc tagactcagc cggctctcca      120

 

cgctttgcct gaccctgctt gctcaactct acgtctttgt ttcgttttct gttcctttct      180

 

ctccacaggc ttaa                                                         194

 

 

<210>  4

<211>  12

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  β-珠蛋白剪接供体位点

 

<400>  4

caggtaagtt ta                                                           12

 

 

<210>  5

<211>  15

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  Ig.剪接受体位点

 

<400>  5

tttctctcca caggc                                                        15

 

 

<210>  6

<211>  128

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  6

 

Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Val Pro Asp Phe Gln Ser Val

            20                  25                  30         

 

 

Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile

        35                  40                  45             

 

 

Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys

    50                  55                  60                 

 

 

Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg

65                  70                  75                  80 

 

 

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser

                85                  90                  95     

 

 

Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg

            100                 105                 110        

 

 

Leu Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

        115                 120                 125            

 

 

<210>  7

<211>  137

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  7

 

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His

            20                  25                  30         

 

 

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

        35                  40                  45             

 

 

Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

                85                  90                  95     

 

 

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly

        115                 120                 125            

 

 

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

    130                 135        

 

 

<210>  8

<211>  128

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  8

 

Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val

            20                  25                  30         

 

 

Thr Pro Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile

        35                  40                  45             

 

 

Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys

    50                  55                  60                 

 

 

Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg

65                  70                  75                  80 

 

 

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

                85                  90                  95     

 

 

Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg

            100                 105                 110        

 

 

Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

        115                 120                 125            

 

 

<210>  9

<211>  128

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  9

 

Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val

            20                  25                  30         

 

 

Thr Pro Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile

        35                  40                  45             

 

 

Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys

    50                  55                  60                 

 

 

Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg

65                  70                  75                  80 

 

 

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

                85                  90                  95     

 

 

Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg

            100                 105                 110        

 

 

Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

        115                 120                 125            

 

 

<210>  10

<211>  128

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  10

 

Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val

            20                  25                  30         

 

 

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile

        35                  40                  45             

 

 

Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

    50                  55                  60                 

 

 

Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Ile Pro Asp Arg

65                  70                  75                  80 

 

 

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg

                85                  90                  95     

 

 

Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg

            100                 105                 110        

 

 

Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

        115                 120                 125            

 

 

<210>  11

<211>  128

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  11

 

Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val

            20                  25                  30         

 

 

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile

        35                  40                  45             

 

 

Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

    50                  55                  60                 

 

 

Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Ile Pro Asp Arg

65                  70                  75                  80 

 

 

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg

                85                  90                  95     

 

 

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg

            100                 105                 110        

 

 

Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

        115                 120                 125            

 

 

<210>  12

<211>  137

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  12

 

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

            20                  25                  30         

 

 

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

        35                  40                  45             

 

 

Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

                85                  90                  95     

 

 

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly

        115                 120                 125            

 

 

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

    130                 135        

 

 

<210>  13

<211>  137

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  13

 

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

            20                  25                  30         

 

 

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

        35                  40                  45             

 

 

Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

                85                  90                  95     

 

 

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly

        115                 120                 125            

 

 

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

    130                 135        

 

 

<210>  14

<211>  144

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  14

 

Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

            20                  25                  30         

 

 

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

        35                  40                  45             

 

 

Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Lys Gly Tyr Val

65                  70                  75                  80 

 

 

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

                85                  90                  95     

 

 

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Arg Ile Gly Val Ala Ala Ser Tyr Tyr

        115                 120                 125            

 

 

Phe Gly Met Asp Val Trp Gly His Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

    130                 135                 140                

 

 

<210>  15

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  15

 

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His

1               5                   10 

 

 

<210>  16

<211>  17

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  16

 

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Lys Gly Tyr Val Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15     

 

 

Gly

   

 

 

<210>  17

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  17

 

Asp Ile Arg Ile Gly Val Ala Ala Ser Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val

1               5                   10                  15     

 

 

<210>  18

<211>  129

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  18

 

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1               5                   10                  15     

 

 

Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser

            20                  25                  30         

 

 

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

        35                  40                  45             

 

 

Gln Gly Ile Ser Ser Val Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

    50                  55                  60                 

 

 

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val

65                  70                  75                  80 

 

 

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

                85                  90                  95     

 

 

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

            100                 105                 110        

 

 

Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

        115                 120                 125            

 

 

Lys

   

 

 

<210>  19

<211>  11

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  19

 

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Val Leu Ala

1               5                   10     

 

 

<210>  20

<211>  7

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  20

 

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser

1               5          

 

 

<210>  21

<211>  9

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  21

 

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr

1               5                  

 

 

<210>  22

<211>  146

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  22

 

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

            20                  25                  30         

 

 

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

        35                  40                  45             

 

 

Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser

65                  70                  75                  80 

 

 

Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser

                85                  90                  95     

 

 

Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Met Pro Val Ala Gly Pro Gly Tyr Phe

        115                 120                 125            

 

 

Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

    130                 135                 140                

 

 

Ser Ser

145    

 

 

<210>  23

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  23

 

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His

1               5                   10 

 

 

<210>  24

<211>  17

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  24

 

Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln

1               5                   10                  15     

 

 

Gly

   

 

 

<210>  25

<211>  18

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  25

 

Gly Gly Met Pro Val Ala Gly Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr Tyr Gly Met

1               5                   10                  15     

 

 

Asp Val

       

 

 

<210>  26

<211>  130

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  26

 

Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1               5                   10                  15     

 

 

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser

            20                  25                  30         

 

 

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

        35                  40                  45             

 

 

Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

    50                  55                  60                 

 

 

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro

65                  70                  75                  80 

 

 

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

                85                  90                  95     

 

 

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Cys Cys Gln Gln Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

        115                 120                 125            

 

 

Arg Thr

    130

 

 

<210>  27

<211>  12

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  27

 

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala

1               5                   10         

 

 

<210>  28

<211>  7

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  28

 

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1               5          

 

 

<210>  29

<211>  9

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  29

 

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr

1               5                  

 

 

<210>  30

<211>  125

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  30

 

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30         

 

 

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45             

 

 

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60                 

 

 

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80 

 

 

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95     

 

 

Ala Lys Asp Leu Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

            100                 105                 110        

 

 

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120                 125

 

 

<210>  31

<211>  108

<212>  PRT

<213>  人

 

<400>  31

 

Asp Ile Gln Met Thr Gln Phe Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

            20                  25                  30         

 

 

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

        35                  40                  45             

 

 

Tyr Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60                 

 

 

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Cys

                85                  90                  95     

 

 

Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

            100                 105            

 

 

<210>  32

<211>  4699

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  pUIGFRLCB2质粒序列

 

<400>  32

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc       60

 

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga      120

 

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc      180

 

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc      240

 

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag      300

 

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa      360

 

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac      420

 

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg      480

 

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg      540

 

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg      600

 

taaaacgacg gccagtgagc gcgccaccgg tggcccgggc cggtccgact agttaccgat      660

 

gtacgggcca gatatacgcg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt      720

 

acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat      780

 

ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt      840

 

cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa      900

 

actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc      960

 

aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct     1020

 

acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag     1080

 

tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt     1140

 

gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac     1200

 

aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc     1260

 

agagctctct ggctaactag agaacccact gcttactggc ttatcgaaat taatacgact     1320

 

cactatagca attgcacgtg tggccacagg taagtttaaa gctcaggtcg agaccgggcc     1380

 

tttgtccggc gctcccttgg agcctaccta gactcagccg gctctccacg ctttgcctga     1440

 

ccctgcttgc tcaactctac gtctttgttt cgttttctgt tcctttctct ccacaggctt     1500

 

aagaattcta gcgtttaaca tgtcgccatc acaactcatt gggtttctgc tgctctgggt     1560

 

tccagcctcc aggggtgaaa ttgtgctgac tcagagccca ggtaccctgt ctgtgtctcc     1620

 

aggcgagaga gccaccctct cctgccgggc cagtcagagc attggtagta gcttacactg     1680

 

gtaccagcag aaaccaggtc aggctccaag gcttctcatc aagtatgcat cccagtccct     1740

 

ctcagggatc cccgataggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ccctcaccat     1800

 

cagtagactg gagcctgaag atttcgcagt gtattactgt catcagagta gtcgtttacc     1860

 

tcacactttc ggccaaggga ccaaggtgga gatcaaacgt acagtggctg caccatctgt     1920

 

cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct     1980

 

gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca     2040

 

atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct     2100

 

cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga     2160

 

agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta     2220

 

gagggagaag gggccctccg gaggatccag atccccctcg ctttcttgct gtccaatttc     2280

 

tattaaaggt tcctttgttc cctaagtcca actactaaac tgggggatat tatgaagggc     2340

 

cttgagcatc tggattctgc ctaataaaaa acatttattt tcattgcaat gatgtattta     2400

 

aattatttct gaatatttta ctaaaaaggg aatgtgggag gtcagtgcat ttaaaacata     2460

 

aagaaatgaa gagggggatc tgtcgacaag ctctagagag ctccatatgt ggccatcgcg     2520

 

attaattaag cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat     2580

 

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cataataact catgccatga gtttttgcag aataatgttc tattagtcca gccactgtcc     1920

 

cctccttggt atggaaaatc tttccccaaa agtgcattcc tgttcctaga taaatataat     1980

 

catgtacctg ttgtttcatg tcgtcttttt cttcttgaga caacatacac caaggaggtc     2040

 

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cccagtttag tagttggact tagggaacaa aggaaccttt aatagaaatt ggacagcaag     5400

 

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aggaacagaa aacgaaacaa agacgtagag ttgagcaagc agggtcaggc aaagcgtgga     6240

 

gagccggctg agtctaggta ggctccaagg gagcgccgga caaaggcccg gtctcgacct     6300

 

gagctttaaa cttacctgtg gccacacgtg caattgctat agtgagtcgt attaatttcg     6360

 

ataagccagt aagcagtggg ttctctagtt agccagagag ctctgcttat atagacctcc     6420

 

caccgtacac gcctaccgcc catttgcgtc aatggggcgg agttgttacg acattttgga     6480

 

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acccattgac gtcaatggaa agtccctatt ggcgttacta tgggaacata cgtcattatt     6840

 

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gtaacgcgga actccatata tgggctatga actaatgacc ccgtaattga ttactattaa     6960

 

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tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gtatggctga ttatgatctc tagtcaag       7318

 

 

<210>  35

<211>  11928

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  pAIG1FRLCb2V1质粒序列

 

<400>  35

gcactataca tcaaatattc cttattaacc cctttacaaa ttaaaaagct aaaggtacac       60

 

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agtatgttat gattataact gttatgccta cttataaagg ttacagaata tttttccata      180

 

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tctgtaggta gtttgtccaa ttatgtcaca ccacagaagt aaggttcctt cacaaagatc      600

 

gatctaaagc cagcaaaagt cccatggtct tataaaaatg catagcttta ggaggggagc      660

 

agagaacttg aaagcatctt cctgttagtc tttcttctcg tagacttcaa acttatactt      720

 

gatgcctttt tcctcctgga cctcagagag gacgcctggg tattctggga gaagtttata      780

 

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gcaagtttac tcaaaaaatc agcactcttt tatatcttgg tttacataag catttacata     1680

 

agatttggat aaattccaaa agaacatagg aaaatagaac actcagagct cagatcagaa     1740

 

cctttgatac caaaccaagt caggaaacca cttgtctcac atcctcgttt taagaacagt     1800

 

ttgtaaccaa aaacttactt aagccctggg aaccgcaagg ttgggccaat aaaggctatt     1860

 

cataataact catgccatga gtttttgcag aataatgttc tattagtcca gccactgtcc     1920

 

cctccttggt atggaaaatc tttccccaaa agtgcattcc tgttcctaga taaatataat     1980

 

catgtacctg ttgtttcatg tcgtcttttt cttcttgaga caacatacac caaggaggtc     2040

 

tagctctggc gagtctttca cgaaaaggga gggatctata taacacttta tagccattga     2100

 

ctgtaaccca cctatcccaa tttaagtcat atcttcctgt atatggtaag ggggcatctg     2160

 

ttggtctgta gatgtaaggt cccctataag tccctggttg ccaccacctg tctcctattt     2220

 

tgacaaaaac actctttttt ccctttttta cttctaggcc tgtggtcaat agtccttgca     2280

 

cctgttcttc aattgaggtt gagcgtctct ttctattttc tattcccatt tctaacttct     2340

 

gaatttgagt aaaaatagta ctaaaagata atgattcatt tcttaacata gtaactaata     2400

 

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aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa     3780

 

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg     3840

 

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc     3900

 

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acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat     4020

 

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tatgcactgg gttcgccagg ctccaggaaa aggtctggag tggatatcag ttattgatac     6180

 

tcgtggtgcc acatactatg cagactccgt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa     6240

 

tgccaagaac tccttgtatc ttcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca ctgctgtgta     6300

 

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tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag     6600

 

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caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc     6720

 

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ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct     7320

 

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catctggatt ctgcctaata aaaaacattt attttcattg caatgatgta tttaaattat     7560

 

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gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg     8040

 

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tttcgatcag aaacttctcg acagacgtcg cggtgagttc aggctttttc atatctcatt     9240

 

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cgactgcatc tgcgtgttcg aattcgccaa tgacaagacg ctgggcgggg tttgtgtcat     9420

 

catagaacta aagacatgca aatatatttc ttccggggac accgccagca aacgcgagca     9480

 

acgggccacg gggatgaagc agggcggcac ctcgctaacg gattcaccac tccaagaatt     9540

 

ggagccaatc aattcttgcg gagaactgtg aatgcgcaaa ccaacccttg gcagaacata     9600

 

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tggccacata tggcggccgc tcgcgattaa ttaatcgcga tggccacata tggagctctc     9780

 

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gtagttggac ttagggaaca aaggaacctt taatagaaat tggacagcaa gaaagcgagg    10020

 

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gaagccttgg agcctgacct ggtttctgct ggtaccagtg taagctacta ccaatgctct    10620

 

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gagtctaggt aggctccaag ggagcgccgg acaaaggccc ggtctcgacc tgagctttaa    10920

 

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cgcctaccgc ccatttgcgt caatggggcg gagttgttac gacattttgg aaagtcccgt    11100

 

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atagcgatga ctaatacgta gatgtactgc caagtaggaa agtcccataa ggtcatgtac    11280

 

tgggcataat gccaggcggg ccatttaccg tcattgacgt caataggggg cgtacttggc    11340

 

atatgataca cttgatgtac tgccaagtgg gcagtttacc gtaaatactc cacccattga    11400

 

cgtcaatgga aagtccctat tggcgttact atgggaacat acgtcattat tgacgtcaat    11460

 

gggcgggggt cgttgggcgg tcagccaggc gggccattta ccgtaagtta tgtaacgcgg    11520

 

aactccatat atgggctatg aactaatgac cccgtaattg attactatta ataactagtc    11580

 

aataatcaat gtcaacgcgt atatctggcc cgtacatcgt aactagtcgg accgccgcgg    11640

 

actagtgccc gggccaccgg tgctcgaagc ttggatcgat ccagacatga taagatacat    11700

 

tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat    11760

 

ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa    11820

 

caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa    11880

 

gtaaaacctc tacaaatgtg gtatggctga ttatgatctc tagtcaag                 11928

 

 

<210>  36

<211>  11928

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  pAIG1FRLCb2V3质粒序列

 

<400>  36

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aatttttgag catagttatt aatagcagac actctatgcc tgtgtggagt aagaaaaaac      120

 

agtatgttat gattataact gttatgccta cttataaagg ttacagaata tttttccata      180

 

attttcttgt atagcagtgc agctttttcc tttgtggtgt aaatagcaaa gcaagcaaga      240

 

gttctattac taaacacagc atgactcaaa aaacttagca attctgaagg aaagtccttg      300

 

gggtcttcta cctttctctt cttttttgga ggagtagaat gttgagagtc agcagtagcc      360

 

tcatcatcac tagatggcat ttcttctgag caaaacaggt tttcctcatt aaaggcattc      420

 

caccactgct cccattcatc agttccatag gttggaatct aaaatacaca aacaattaga      480

 

atcagtagtt taacacatta tacacttaaa aattttatat ttaccttaga gctttaaatc      540

 

tctgtaggta gtttgtccaa ttatgtcaca ccacagaagt aaggttcctt cacaaagatc      600

 

gatctaaagc cagcaaaagt cccatggtct tataaaaatg catagcttta ggaggggagc      660

 

agagaacttg aaagcatctt cctgttagtc tttcttctcg tagacttcaa acttatactt      720

 

gatgcctttt tcctcctgga cctcagagag gacgcctggg tattctggga gaagtttata      780

 

tttccccaaa tcaatttctg ggaaaaacgt gtcactttca aattcctgca tgatccttgt      840

 

cacaaagagt ctgaggtggc ctggttgatt catggcttcc tggtaaacag aactgcctcc      900

 

gactatccaa accatgtcta ctttacttgc caattccggt tgttcaataa gtcttaaggc      960

 

atcatccaaa cttttggcaa gaaaatgagc tcctcgtggt ggttctttga gttctctact     1020

 

gagaactata ttaattctgt cctttaaagg tcgattcttc tcaggaatgg agaaccaggt     1080

 

tttcctaccc ataatcacca gattctgttt accttccact gaagaggttg tggtcattct     1140

 

ttggaagtac ttgaactcgt tcctgagcgg aggccagggt aggtctccgt tcttgccaat     1200

 

ccccatattt tgggacacgg cgacgatgca gttcaatggt cgaaccatga tggcagcggg     1260

 

gataaaatcc taccagcctt cacgctagga ttgccgtcaa gtttggcgcg aaatcgcagc     1320

 

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cgctcttgtg atgatagcca gacaagaaag agacaataca agacaaacac caaatagtag     1440

 

aaatagagac aagggtcact tatccgaggg tccctgttcg ggcgccagct gccgcagtcg     1500

 

gccgacctga gggtcgccgg ggtctgcggg gggaccctct ggaaagtgaa ggataagtga     1560

 

cgagcggaga cgggatggcg aacagacaca aacacacaag aggtgaatgt taggactgtt     1620

 

gcaagtttac tcaaaaaatc agcactcttt tatatcttgg tttacataag catttacata     1680

 

agatttggat aaattccaaa agaacatagg aaaatagaac actcagagct cagatcagaa     1740

 

cctttgatac caaaccaagt caggaaacca cttgtctcac atcctcgttt taagaacagt     1800

 

ttgtaaccaa aaacttactt aagccctggg aaccgcaagg ttgggccaat aaaggctatt     1860

 

cataataact catgccatga gtttttgcag aataatgttc tattagtcca gccactgtcc     1920

 

cctccttggt atggaaaatc tttccccaaa agtgcattcc tgttcctaga taaatataat     1980

 

catgtacctg ttgtttcatg tcgtcttttt cttcttgaga caacatacac caaggaggtc     2040

 

tagctctggc gagtctttca cgaaaaggga gggatctata taacacttta tagccattga     2100

 

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acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat     4020

 

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gttgctcttg cccggcgtca acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag     4620

 

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ggtgtccccg gaagaaatat atttgcatgt ctttagttct atgatgacac aaaccccgcc     5340

 

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gtccacttcg catattaagg tgacgcgtgt ggcctcgaac accgagcgac cctgcagcga     5460

 

cccgcttaac agcgtcaaca gcgtgccgca gatcccgggg ggcaatgaga tatgaaaaag     5520

 

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cgtggatatg tcctgcgggt aaatagctgc gccgatggtt tctacaaaga tcgttatgtt     5700

 

tatcggcact ttgcatcggc cgcgctcccg attccggaag tgcttgacat tggggaattc     5760

 

agcgagagcc tgacctattg catctcccgc cgtgcacagg gtgtcacgtt gcaagacctg     5820

 

cctgaaaccg aactgcccgc tgttctgcag ccggtcgcgg aggccatgga tgcgatcgct     5880

 

gcggccgatc ttagccagac gagcgggttc ggcccattcg gaccgcaagg aatcggtcaa     5940

 

tacactacat ggcgtgattt catatgcgcg attgctgatc cccatgtgta tcactggcaa     6000

 

actgtgatgg acgacaccgt cagtgcgtcc gtcgcgcagg ctctcgatga gctgatgctt     6060

 

tgggccgagg actgccccga agtccggcac ctcgtgcacg cggatttcgg ctccaacaat     6120

 

gtcctgacgg acaatggccg cataacagcg gtcattgact ggagcgaggc gatgttcggg     6180

 

gattcccaat acgaggtcgc caacatcttc ttctggaggc cgtggttggc ttgtatggag     6240

 

cagcagacgc gctacttcga gcggaggcat ccggagcttg caggatcgcc gcggctccgg     6300

 

gcgtatatgc tccgcattgg tcttgaccaa ctctatcaga gcttggttga cggcaatttc     6360

 

gatgatgcag cttgggcgca gggtcgatgc gacgcaatcg tccgatccgg agccgggact     6420

 

gtcgggcgta cacaaatcgc ccgcagaagc gcggccgtct ggaccgatgg ctgtgtagaa     6480

 

gtactcgccg atagtggaaa ccgacgcccc agcactcgtc cggatcggga gatgggggag     6540

 

gctaactgaa acacggaagg agacaatacc ggaaggaacc cgcgctatga cggcaataaa     6600

 

aagacagaat aaaacgcacg ggtgttgggt cgtttgttca taaacgcggg gttcggtccc     6660

 

agggctggca ctctgtcgat accccaccga gaccccattg gggccaatac gcccgcgttt     6720

 

cttccttttc cccaccccac cccccaagtt cgggtgaagg cccagggctc gcagccaacg     6780

 

tcggggcggc aggccctgcc atagccactg gccccgtggg ttagggacgg ggtcccccat     6840

 

ggggaatggt ttatggttcg tgggggttat tattttgggc gttgcgtggg gtcaggtcca     6900

 

cgactggact gagcagacag acccatggtt tttggatggc ctgggcatgg accgcatgta     6960

 

ctggcgcgac acgaacaccg ggcgtctgtg gctgccaaac acccccgacc cccaaaaacc     7020

 

accgcgcgga tttctggcgt gccaagctag tcgaaagctt ggccggcctg tacatgatca     7080

 

acgcgtgagc tctctagagc ttgtcgacag atccccctct tcatttcttt atgttttaaa     7140

 

tgcactgacc tcccacattc cctttttagt aaaatattca gaaataattt aaatacatca     7200

 

ttgcaatgaa aataaatgtt ttttattagg cagaatccag atgctcaagg cccttcataa     7260

 

tatcccccag tttagtagtt ggacttaggg aacaaaggaa cctttaatag aaattggaca     7320

 

gcaagaaagc gagggggatc tggatcctcc ggacccgtat ctagaatcat cgattcattt     7380

 

acccggagac agggagaggc tcttctgcgt gtagtggttg tgcagagcct catgcatcac     7440

 

ggagcatgag aagacgttcc cctgctgcca cctgctcttg tccacggtga gcttgctgta     7500

 

gaggaagaag gagccgtcgg agtccagcac gggaggcgtg gtcttgtagt tgttctccgg     7560

 

ctgcccattg ctctcccact ccacggcgat gtcgctggga tagaagcctt tgaccaggca     7620

 

ggtcaggctg acctggttct tggtcagctc atcccgggat gggggcaggg tgtacacctg     7680

 

tggttctcgg ggctgccctt tggctttgga gatggttttc tcgatggggg ctgggagggc     7740

 

tttgttggag accttgcact tgtactcctt gccattcagc cagtcctggt gcaggacggt     7800

 

gaggacgctg accacacggt acgtgctgtt gtactgctcc tcccgcggct ttgtcttggc     7860

 

attatgcacc tccacgccgt ccacgtacca gttgaacttg acctcagggt cttcgtggct     7920

 

cacgtccacc accacgcatg tgacctcagg ggtccgggag atcatgaggg tgtccttggg     7980

 

ttttgggggg aagaggaaga ctgacggtcc ccccaggagt tcaggtgctg ggcacggtgg     8040

 

gcatgtgtga gttttgtcac aagatttggg ctcaactttc ttgtccacct tggtgttgct     8100

 

gggcttgtga ttcacgttgc agatgtaggt ctgggtgccc aagctgctgg agggcacggt     8160

 

caccacgctg ctgagggagt agagtcctga ggactgtagg acagccggga aggtgtgcac     8220

 

gccgctggtc agggcgcctg agttccacga caccgtcacc ggttcgggga agtagtcctt     8280

 

gaccaggcag cccagggccg ctgtgccccc agaggtgctc ttggaggagg gtgccagggg     8340

 

gaagaccgat gggcccttgg tggaagctga ggagacggtg accgtggtcc cttggcccca     8400

 

gacgtccata ccgtagtaga agttccccag tcttgcacag taatacacag cagtgtcctc     8460

 

ggctctcagg ctgttcattt gaagatacaa ggagttcttg gcattgtctc tggagatggt     8520

 

gaatcggccc ttcacggagt ctgcatagta tgtggcacca cgagtatcaa taactgatat     8580

 

ccactccaga ccttttcctg gagcctggcg aacccagtgc atagcaaagc tactgaaggt     8640

 

gaatccagag gctgcacagg agagtctcag ggacccccca ggctttacca agcctccccc     8700

 

agactgcacc agctgaacct cacactggac accttttaat atagcaacaa ggaaaaccca     8760

 

gctcagccca aactccataa gggcgaattc caccacactg gactagtgga tccgagctcg     8820

 

gtaccaagct taagcctgtg gagagaaagg aacagaaaac gaaacaaaga cgtagagttg     8880

 

agcaagcagg gtcaggcaaa gcgtggagag ccggctgagt ctaggtaggc tccaagggag     8940

 

cgccggacaa aggcccggtc tcgacctgag ctttaaactt acctgtggcc acacgtgcaa     9000

 

ttgctatagt gagtcgtatt aatttcgata agccagtaag cagtgggttc tctagttagc     9060

 

cagagagctc tgcttatata gacctcccac cgtacacgcc taccgcccat ttgcgtcaat     9120

 

ggggcggagt tgttacgaca ttttggaaag tcccgttgat tttggtgcca aaacaaactc     9180

 

ccattgacgt caatggggtg gagacttgga aatccccgtg agtcaaaccg ctatccacgc     9240

 

ccattgatgt actgccaaaa ccgcatcacc atggtaatag cgatgactaa tacgtagatg     9300

 

tactgccaag taggaaagtc ccataaggtc atgtactggg cataatgcca ggcgggccat     9360

 

ttaccgtcat tgacgtcaat agggggcgta cttggcatat gatacacttg atgtactgcc     9420

 

aagtgggcag tttaccgtaa atactccacc cattgacgtc aatggaaagt ccctattggc     9480

 

gttactatgg gaacatacgt cattattgac gtcaatgggc gggggtcgtt gggcggtcag     9540

 

ccaggcgggc catttaccgt aagttatgta acgcggaact ccatatatgg gctatgaact     9600

 

aatgaccccg taattgatta ctattaataa ctagtcaata atcaatgtca acgcgtatat     9660

 

ctggcccgta catcggtagc tgagggttta aacggcgcgc ggccggccgg taccacgcgt     9720

 

tggccacata tggcggccgc tcgcgattaa ttaatcgcga tggccacata tggagctctc     9780

 

tagagcttgt cgacagatcc ccctcttcat ttctttatgt tttaaatgca ctgacctccc     9840

 

acattccctt tttagtaaaa tattcagaaa taatttaaat acatcattgc aatgaaaata     9900

 

aatgtttttt attaggcaga atccagatgc tcaaggccct tcataatatc ccccagttta     9960

 

gtagttggac ttagggaaca aaggaacctt taatagaaat tggacagcaa gaaagcgagg    10020

 

gggatctgga tcctccggag ggccccttct ccctctaaca ctctcccctg ttgaagctct    10080

 

ttgtgacggg cgagctcagg ccctgatggg tgacttcgca ggcgtagact ttgtgtttct    10140

 

cgtagtctgc tttgctcagc gtcagggtgc tgctgaggct gtaggtgctg tccttgctgt    10200

 

cctgctctgt gacactctcc tgggagttac ccgattggag ggcgttatcc accttccact    10260

 

gtactttggc ctctctggga tagaagttat tcagcaggca cacaacagag gcagttccag    10320

 

atttcaactg ctcatcagat ggcgggaaga tgaagacaga tggtgcagcc actgtacgtt    10380

 

tgatctccac cttggtccct tggccgaaag tgtgaggtaa acgactactc tgatgacagt    10440

 

aatacactgc gaaatcttca ggctccagtc tactgatggt gagggtgaaa tctgtcccag    10500

 

atccactgcc actgaaccta tcggggatcc ctgagaggga ctgggatgca tacttgatga    10560

 

gaagccttgg agcctgacct ggtttctgct ggtaccagtg taagctacta ccaatgctct    10620

 

gactggcccg gcaggagagg gtggctctct cgcctggaga cacagacagg gtacctgggc    10680

 

tctgagtcag cacaatttca cccctggagg ctggaaccca gagcagcaga aacccaatga    10740

 

gttgtgatgg cgacatgtta aacgctagaa ttcttaagcc tgtggagaga aaggaacaga    10800

 

aaacgaaaca aagacgtaga gttgagcaag cagggtcagg caaagcgtgg agagccggct    10860

 

gagtctaggt aggctccaag ggagcgccgg acaaaggccc ggtctcgacc tgagctttaa    10920

 

acttacctgt ggccacacgt gcaattgcta tagtgagtcg tattaatttc gataagccag    10980

 

taagcagtgg gttctctagt tagccagaga gctctgctta tatagacctc ccaccgtaca    11040

 

cgcctaccgc ccatttgcgt caatggggcg gagttgttac gacattttgg aaagtcccgt    11100

 

tgattttggt gccaaaacaa actcccattg acgtcaatgg ggtggagact tggaaatccc    11160

 

cgtgagtcaa accgctatcc acgcccattg atgtactgcc aaaaccgcat caccatggta    11220

 

atagcgatga ctaatacgta gatgtactgc caagtaggaa agtcccataa ggtcatgtac    11280

 

tgggcataat gccaggcggg ccatttaccg tcattgacgt caataggggg cgtacttggc    11340

 

atatgataca cttgatgtac tgccaagtgg gcagtttacc gtaaatactc cacccattga    11400

 

cgtcaatgga aagtccctat tggcgttact atgggaacat acgtcattat tgacgtcaat    11460

 

gggcgggggt cgttgggcgg tcagccaggc gggccattta ccgtaagtta tgtaacgcgg    11520

 

aactccatat atgggctatg aactaatgac cccgtaattg attactatta ataactagtc    11580

 

aataatcaat gtcaacgcgt atatctggcc cgtacatcgt aactagtcgg accgccgcgg    11640

 

actagtgccc gggccaccgg tgctcgaagc ttggatcgat ccagacatga taagatacat    11700

 

tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat    11760

 

ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa    11820

 

caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa    11880

 

gtaaaacctc tacaaatgtg gtatggctga ttatgatctc tagtcaag                 11928

 

 

<210>  37

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  5'引物

 

<400>  37

gcttggtacc gccgccacca tggagtttgg gctgagctgg gtttt                       45

 

 

<210>  38

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  3'引物

 

<400>  38

agaccgatgg gcccttggtg gaagctgagg                                        30

 

 

<210>  39

<211>  48

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  5'引物

 

<400>  39

gaattcgttt aaacgccgcc accatgtcgc catcacaact cattgggt                    48

 

 

<210>  40

<211>  33

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  3'引物

 

<400>  40

ccaccgtacg tttgatctcc accttggtcc ctt                                    33

 

 

<210>  41

<211>  8376

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  pAIG1FRH-K质粒序列

 

<400>  41

tataaatcaa aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt       60

 

ccactattaa agaacgtgga ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat      120

 

ggcccactac gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca      180

 

ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac      240

 

gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta      300

 

gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg      360

 

tcccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg      420

 

ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca      480

 

gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg agcgcgctgg ccggcctgtg      540

 

cgaacgccag caagacgtag cccagcgcgt cggccccgag atgcgccgcg tgcggctgct      600

 

ggagatggcg gacgcgatgg atatgttctg ccaagggttg gtttgcgcat tcacagttct      660

 

ccgcaagaat tgattggctc caattcttgg agtggtgaat ccgttagcga ggtgccgccc      720

 

tgcttcatcc ccgtggcccg ttgctcgcgt ttgctggcgg tgtccccgga agaaatatat      780

 

ttgcatgtct ttagttctat gatgacacaa accccgccca gcgtcttgtc attggcgaat      840

 

tcgaacacgc agatgcagtc ggggcggcgc ggtccgaggt ccacttcgca tattaaggtg      900

 

acgcgtgtgg cctcgaacac cgagcgaccc tgcagcgacc cgcttaacag cgtcaacagc      960

 

gtgccgcaga tcccgggggg caatgagata tgaaaaagcc tgaactcacc gcgacgtctg     1020

 

tcgagaagtt tctgatcgaa aagttcgaca gcgtctccga cctgatgcag ctctcggagg     1080

 

gcgaagaatc tcgtgctttc agcttcgatg taggagggcg tggatatgtc ctgcgggtaa     1140

 

atagctgcgc cgatggtttc tacaaagatc gttatgttta tcggcacttt gcatcggccg     1200

 

cgctcccgat tccggaagtg cttgacattg gggaattcag cgagagcctg acctattgca     1260

 

tctcccgccg tgcacagggt gtcacgttgc aagacctgcc tgaaaccgaa ctgcccgctg     1320

 

ttctgcagcc ggtcgcggag gccatggatg cgatcgctgc ggccgatctt agccagacga     1380

 

gcgggttcgg cccattcgga ccgcaaggaa tcggtcaata cactacatgg cgtgatttca     1440

 

tatgcgcgat tgctgatccc catgtgtatc actggcaaac tgtgatggac gacaccgtca     1500

 

gtgcgtccgt cgcgcaggct ctcgatgagc tgatgctttg ggccgaggac tgccccgaag     1560

 

tccggcacct cgtgcacgcg gatttcggct ccaacaatgt cctgacggac aatggccgca     1620

 

taacagcggt cattgactgg agcgaggcga tgttcgggga ttcccaatac gaggtcgcca     1680

 

acatcttctt ctggaggccg tggttggctt gtatggagca gcagacgcgc tacttcgagc     1740

 

ggaggcatcc ggagcttgca ggatcgccgc ggctccgggc gtatatgctc cgcattggtc     1800

 

ttgaccaact ctatcagagc ttggttgacg gcaatttcga tgatgcagct tgggcgcagg     1860

 

gtcgatgcga cgcaatcgtc cgatccggag ccgggactgt cgggcgtaca caaatcgccc     1920

 

gcagaagcgc ggccgtctgg accgatggct gtgtagaagt actcgccgat agtggaaacc     1980

 

gacgccccag cactcgtccg gatcgggaga tgggggaggc taactgaaac acggaaggag     2040

 

acaataccgg aaggaacccg cgctatgacg gcaataaaaa gacagaataa aacgcacggg     2100

 

tgttgggtcg tttgttcata aacgcggggt tcggtcccag ggctggcact ctgtcgatac     2160

 

cccaccgaga ccccattggg gccaatacgc ccgcgtttct tccttttccc caccccaccc     2220

 

cccaagttcg ggtgaaggcc cagggctcgc agccaacgtc ggggcggcag gccctgccat     2280

 

agccactggc cccgtgggtt agggacgggg tcccccatgg ggaatggttt atggttcgtg     2340

 

ggggttatta ttttgggcgt tgcgtggggt caggtccacg actggactga gcagacagac     2400

 

ccatggtttt tggatggcct gggcatggac cgcatgtact ggcgcgacac gaacaccggg     2460

 

cgtctgtggc tgccaaacac ccccgacccc caaaaaccac cgcgcggatt tctggcgtgc     2520

 

caagctagtc gaaagcttgg ccggcctgta catgatcaac gcgtgagctc tctagagctt     2580

 

gtcgacagat ccccctcttc atttctttat gttttaaatg cactgacctc ccacattccc     2640

 

tttttagtaa aatattcaga aataatttaa atacatcatt gcaatgaaaa taaatgtttt     2700

 

ttattaggca gaatccagat gctcaaggcc cttcataata tcccccagtt tagtagttgg     2760

 

acttagggaa caaaggaacc tttaatagaa attggacagc aagaaagcga gggggatctg     2820

 

gatcctccgg acccgtatct agaatcatcg attcatttac ccggagacag ggagaggctc     2880

 

ttctgcgtgt agtggttgtg cagagcctca tgcatcacgg agcatgagaa gacgttcccc     2940

 

tgctgccacc tgctcttgtc cacggtgagc ttgctgtaga ggaagaagga gccgtcggag     3000

 

tccagcacgg gaggcgtggt cttgtagttg ttctccggct gcccattgct ctcccactcc     3060

 

acggcgatgt cgctgggata gaagcctttg accaggcagg tcaggctgac ctggttcttg     3120

 

gtcagctcat cccgggatgg gggcagggtg tacacctgtg gttctcgggg ctgccctttg     3180

 

gctttggaga tggttttctc gatgggggct gggagggctt tgttggagac cttgcacttg     3240

 

tactccttgc cattcagcca gtcctggtgc aggacggtga ggacgctgac cacacggtac     3300

 

gtgctgttgt actgctcctc ccgcggcttt gtcttggcat tatgcacctc cacgccgtcc     3360

 

acgtaccagt tgaacttgac ctcagggtct tcgtggctca cgtccaccac cacgcatgtg     3420

 

acctcagggg tccgggagat catgagggtg tccttgggtt ttggggggaa gaggaagact     3480

 

gacggtcccc ccaggagttc aggtgctggg cacggtgggc atgtgtgagt tttgtcacaa     3540

 

gatttgggct caactttctt gtccaccttg gtgttgctgg gcttgtgatt cacgttgcag     3600

 

atgtaggtct gggtgcccaa gctgctggag ggcacggtca ccacgctgct gagggagtag     3660

 

agtcctgagg actgtaggac agccgggaag gtgtgcacgc cgctggtcag ggcgcctgag     3720

 

ttccacgaca ccgtcaccgg ttcggggaag tagtccttga ccaggcagcc cagggccgct     3780

 

gtgcccccag aggtgctctt ggaggagggt gccaggggga agaccgatgg gcccttggtg     3840

 

gaagctgagg agacggtgac cgtggtccct tggccccaga cgtccatacc gtagtagaag     3900

 

ttccccagtc ttgcacagta atacacagca gtgtcctcgg ctctcaggct gttcatttga     3960

 

agatacaagg agttcttggc attgtctctg gagatggtga atcggccctt cacggagtct     4020

 

gcatagtatg tggcaccacg agtatcaata actgatatcc actccagacc ttttcctgga     4080

 

gcctggcgaa cccagtgcat agcaaagcta ctgaaggtga atccagaggc tgcacaggag     4140

 

agtctcaggg accccccagg ctttaccaag cctcccccag actgcaccag ctgaacctca     4200

 

cactggacac cttttaatat agcaacaagg aaaacccagc tcagcccaaa ctccatggtg     4260

 

gcggcggtac caagcttaag cctgtggaga gaaaggaaca gaaaacgaaa caaagacgta     4320

 

gagttgagca agcagggtca ggcaaagcgt ggagagccgg ctgagtctag gtaggctcca     4380

 

agggagcgcc ggacaaaggc ccggtctcga cctgagcttt aaacttacct gtggccacac     4440

 

gtgcaattgc tatagtgagt cgtattaatt tcgataagcc agtaagcagt gggttctcta     4500

 

gttagccaga gagctctgct tatatagacc tcccaccgta cacgcctacc gcccatttgc     4560

 

gtcaatgggg cggagttgtt acgacatttt ggaaagtccc gttgattttg gtgccaaaac     4620

 

aaactcccat tgacgtcaat ggggtggaga cttggaaatc cccgtgagtc aaaccgctat     4680

 

ccacgcccat tgatgtactg ccaaaaccgc atcaccatgg taatagcgat gactaatacg     4740

 

tagatgtact gccaagtagg aaagtcccat aaggtcatgt actgggcata atgccaggcg     4800

 

ggccatttac cgtcattgac gtcaataggg ggcgtacttg gcatatgata cacttgatgt     4860

 

actgccaagt gggcagttta ccgtaaatag tccacccatt gacgtcaatg gaaagtccct     4920

 

attggcgtta ctatgggaac atacgtcatt attgacgtca atgggcgggg gtcgttgggc     4980

 

ggtcagccag gcgggccatt taccgtaagt tatgtaacgc ggaactccat atatgggcta     5040

 

tgaactaatg accccgtaat tgattactat taataactag tcaataatca atgtcaacgc     5100

 

gtatatctgg cccgtacatc ggtagctgag ggtttaaacg gcgcgcttgg cgtaatcatg     5160

 

gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc     5220

 

cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc     5280

 

gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat     5340

 

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tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt     5460

 

aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca     5520

 

gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc     5580

 

ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact     5640

 

ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct     5700

 

gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag     5760

 

ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca     5820

 

cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa     5880

 

cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc     5940

 

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag     6000

 

aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg     6060

 

tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca     6120

 

gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc     6180

 

tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag     6240

 

gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata     6300

 

tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat     6360

 

ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg     6420

 

ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc     6480

 

tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc     6540

 

aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc     6600

 

gccagttaat agtttgcgca acgcctgaat cgccccatca tccagccaga aagtgaggga     6660

 

gccacggttg atgagagctt tgttgtaggt ggaccagttg gtgattttga acttttgctt     6720

 

tgccacggaa cggtctgcgt tgtcgggaag atgcgtgatc tgatccttca actcagcaaa     6780

 

agttcgattt attcaacaaa gccgccgtcc cgtcaagtca gcgtaatgct ctgccagtgt     6840

 

tacaaccaat taaccaattc tgattagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat     6900

 

ttattcatat caggattatc aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga     6960

 

gaaaactcac cgaggcagtt ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg     7020

 

actcgtccaa catcaataca acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt     7080

 

gagaaatcac catgagtgac gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctt atgcatttct     7140

 

ttccagactt gttcaacagg ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact cgcatcaacc     7200

 

aaaccgttat tcattcgtga ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc gctgttaaaa     7260

 

ggacaattac aaacaggaat cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca     7320

 

atattttcac ctgaatcagg atattcttct aatacctgga atgctgtttt cccggggatc     7380

 

gcagtggtga gtaaccatgc atcatcagga gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga     7440

 

ggcataaatt ccgtcagcca gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc attggcaacg     7500

 

ctacctttgc catgtttcag aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata caatcgatag     7560

 

attgtcgcac ctgattgccc gacattatcg cgagcccatt tatacccata taaatcagca     7620

 

tccatgttgg aatttaatcg cggcctcgag caagacgttt cccgttgaat atggctcata     7680

 

acaccccttg tattactgtt tatgtaagca gacagtttta ttgttcatga tgatatattt     7740

 

ttatcttgtg caatgtaaca tcagagattt tgagacacaa cgtggctttg ttgaataaat     7800

 

cgaacttttg ctgagttgaa ggatcagatc acgcatcttc ccgacaacgc agaccgttcc     7860

 

gtggcaaagc aaaagttcaa aatcaccaac tggtccacct acaacaaagc tctcatcaac     7920

 

cgtggctccc tcactttctg gctggatgat ggggcgattc aggcgttctt cggggcgaaa     7980

 

actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa     8040

 

ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca     8100

 

aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct     8160

 

ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga     8220

 

atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc     8280

 

taaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca     8340

 

ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atccct                               8376

 

 

<210>  42

<211>  7333

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  pAIGFRLCb2(-)L-K质粒序列

 

<400>  42

gcactataca tcaaatattc cttattaacc cctttacaaa ttaaaaagct aaaggtacac       60

 

aatttttgag catagttatt aatagcagac actctatgcc tgtgtggagt aagaaaaaac      120

 

agtatgttat gattataact gttatgccta cttataaagg ttacagaata tttttccata      180

 

attttcttgt atagcagtgc agctttttcc tttgtggtgt aaatagcaaa gcaagcaaga      240

 

gttctattac taaacacagc atgactcaaa aaacttagca attctgaagg aaagtccttg      300

 

gggtcttcta cctttctctt cttttttgga ggagtagaat gttgagagtc agcagtagcc      360

 

tcatcatcac tagatggcat ttcttctgag caaaacaggt tttcctcatt aaaggcattc      420

 

caccactgct cccattcatc agttccatag gttggaatct aaaatacaca aacaattaga      480

 

atcagtagtt taacacatta tacacttaaa aattttatat ttaccttaga gctttaaatc      540

 

tctgtaggta gtttgtccaa ttatgtcaca ccacagaagt aaggttcctt cacaaagatc      600

 

gatctaaagc cagcaaaagt cccatggtct tataaaaatg catagcttta ggaggggagc      660

 

agagaacttg aaagcatctt cctgttagtc tttcttctcg tagacttcaa acttatactt      720

 

gatgcctttt tcctcctgga cctcagagag gacgcctggg tattctggga gaagtttata      780

 

tttccccaaa tcaatttctg ggaaaaacgt gtcactttca aattcctgca tgatccttgt      840

 

cacaaagagt ctgaggtggc ctggttgatt catggcttcc tggtaaacag aactgcctcc      900

 

gactatccaa accatgtcta ctttacttgc caattccggt tgttcaataa gtcttaaggc      960

 

atcatccaaa cttttggcaa gaaaatgagc tcctcgtggt ggttctttga gttctctact     1020

 

gagaactata ttaattctgt cctttaaagg tcgattcttc tcaggaatgg agaaccaggt     1080

 

tttcctaccc ataatcacca gattctgttt accttccact gaagaggttg tggtcattct     1140

 

ttggaagtac ttgaactcgt tcctgagcgg aggccagggt aggtctccgt tcttgccaat     1200

 

ccccatattt tgggacacgg cgacgatgca gttcaatggt cgaaccatga tggcagcggg     1260

 

gataaaatcc taccagcctt cacgctagga ttgccgtcaa gtttggcgcg aaatcgcagc     1320

 

cctgagctgt cccccccccc aagctcagat ctgagcttgg tccctatggt gagtccgttc     1380

 

cgctcttgtg atgatagcca gacaagaaag agacaataca agacaaacac caaatagtag     1440

 

aaatagagac aagggtcact tatccgaggg tccctgttcg ggcgccagct gccgcagtcg     1500

 

gccgacctga gggtcgccgg ggtctgcggg gggaccctct ggaaagtgaa ggataagtga     1560

 

cgagcggaga cgggatggcg aacagacaca aacacacaag aggtgaatgt taggactgtt     1620

 

gcaagtttac tcaaaaaatc agcactcttt tatatcttgg tttacataag catttacata     1680

 

agatttggat aaattccaaa agaacatagg aaaatagaac actcagagct cagatcagaa     1740

 

cctttgatac caaaccaagt caggaaacca cttgtctcac atcctcgttt taagaacagt     1800

 

ttgtaaccaa aaacttactt aagccctggg aaccgcaagg ttgggccaat aaaggctatt     1860

 

cataataact catgccatga gtttttgcag aataatgttc tattagtcca gccactgtcc     1920

 

cctccttggt atggaaaatc tttccccaaa agtgcattcc tgttcctaga taaatataat     1980

 

catgtacctg ttgtttcatg tcgtcttttt cttcttgaga caacatacac caaggaggtc     2040

 

tagctctggc gagtctttca cgaaaaggga gggatctata taacacttta tagccattga     2100

 

ctgtaaccca cctatcccaa tttaagtcat atcttcctgt atatggtaag ggggcatctg     2160

 

ttggtctgta gatgtaaggt cccctataag tccctggttg ccaccacctg tctcctattt     2220

 

tgacaaaaac actctttttt ccctttttta cttctaggcc tgtggtcaat agtccttgca     2280

 

cctgttcttc aattgaggtt gagcgtctct ttctattttc tattcccatt tctaacttct     2340

 

gaatttgagt aaaaatagta ctaaaagata atgattcatt tcttaacata gtaactaata     2400

 

atctacctat tggattggtc ttattggtaa aaatataatt tttagcaagc attcttattt     2460

 

ctatttctga aggacaaaat cgatgcggct tgtaagagga agttggctgt ggtccttgcc     2520

 

tcaggaggaa ggtcgagttc tccgaattgt ttagattgta atcttgcaca gaagagctat     2580

 

taaaagagtc aagggtgaga gccctgcgag cacgaaccgc aacttccccc aatagcccca     2640

 

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taacaatgcg ctcatcgtca tcctcggcac cgtcaccctg gatgctgtag gcataggctt     2940

 

ggttatgccg gtactgccgg gcctcttgcg ggatatcgtc cattccgaca gcatcgccag     3000

 

tcactatggc gtgctgctag cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg     3060

 

tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag     3120

 

aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc     3180

 

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca     3240

 

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tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc     3420

 

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tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg     3600

 

ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta     3660

 

tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca     3720

 

aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa     3780

 

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aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc     3900

 

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg     3960

 

acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat     4020

 

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gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt     4320

 

cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa     4380

 

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cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct     4500

 

tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga     4560

 

gttgctcttg cccggcgtca acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag     4620

 

tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga     4680

 

gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca     4740

 

ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg     4800

 

cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc     4860

 

agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag     4920

 

gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagagacc attattatca     4980

 

tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa gaattgtcta     5040

 

gaggcgcgcc gtttaaaccc tcagctgatc atccggatgt acagcgcgcg gccggccggt     5100

 

accacgcgtt ggccacatat ggcggccgct cgcgattaat taatcgcgat ggccacatat     5160

 

ggagctctct agagcttgtc gacagatccc cctcttcatt tctttatgtt ttaaatgcac     5220

 

tgacctccca cattcccttt ttagtaaaat attcagaaat aatttaaata catcattgca     5280

 

atgaaaataa atgtttttta ttaggcagaa tccagatgct caaggccctt cataatatcc     5340

 

cccagtttag tagttggact tagggaacaa aggaaccttt aatagaaatt ggacagcaag     5400

 

aaagcgaggg ggatctggat cctccggagg gccctggatc ctcctacgta tctagaatca     5460

 

tcgattaaca ctctcccctg ttgaagctct ttgtgacggg cgagctcagg ccctgatggg     5520

 

tgacttcgca ggcgtagact ttgtgtttct cgtagtctgc tttgctcagc gtcagggtgc     5580

 

tgctgaggct gtaggtgctg tccttgctgt cctgctctgt gacactctcc tgggagttac     5640

 

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tcagcaggca cacaacagag gcagttccag atttcaactg ctcatcagat ggcgggaaga     5760

 

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ttgctatagt gagtcgtatt aatttcgata agccagtaag cagtgggttc tctagttagc     6420

 

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ccattgacgt caatggggtg gagacttgga aatccccgtg agtcaaaccg ctatccacgc     6600

 

ccattgatgt actgccaaaa ccgcatcacc atggtaatag cgatgactaa tacgtagatg     6660

 

tactgccaag taggaaagtc ccataaggtc atgtactggg cataatgcca ggcgggccat     6720

 

ttaccgtcat tgacgtcaat agggggcgta cttggcatat gatacacttg atgtactgcc     6780

 

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gttactatgg gaacatacgt cattattgac gtcaatgggc gggggtcgtt gggcggtcag     6900

 

ccaggcgggc catttaccgt aagttatgta acgcggaact ccatatatgg gctatgaact     6960

 

aatgaccccg taattgatta ctattaataa ctagtcaata atcaatgtca acgcgtatat     7020

 

ctggcccgta catcggtaac tagtcggacc ggcccgggcc accggtgctc gaagcttgga     7080

 

tcgatccaga catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt     7140

 

gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa     7200

 

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atctctagtc aag                                                        7333

 

 

<210>  43

<211>  11912

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  pAIG1FRLCb2V1-K质粒序列

 

<400>  43

gcactataca tcaaatattc cttattaacc cctttacaaa ttaaaaagct aaaggtacac       60

 

aatttttgag catagttatt aatagcagac actctatgcc tgtgtggagt aagaaaaaac      120

 

agtatgttat gattataact gttatgccta cttataaagg ttacagaata tttttccata      180

 

attttcttgt atagcagtgc agctttttcc tttgtggtgt aaatagcaaa gcaagcaaga      240

 

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gggtcttcta cctttctctt cttttttgga ggagtagaat gttgagagtc agcagtagcc      360

 

tcatcatcac tagatggcat ttcttctgag caaaacaggt tttcctcatt aaaggcattc      420

 

caccactgct cccattcatc agttccatag gttggaatct aaaatacaca aacaattaga      480

 

atcagtagtt taacacatta tacacttaaa aattttatat ttaccttaga gctttaaatc      540

 

tctgtaggta gtttgtccaa ttatgtcaca ccacagaagt aaggttcctt cacaaagatc      600

 

gatctaaagc cagcaaaagt cccatggtct tataaaaatg catagcttta ggaggggagc      660

 

agagaacttg aaagcatctt cctgttagtc tttcttctcg tagacttcaa acttatactt      720

 

gatgcctttt tcctcctgga cctcagagag gacgcctggg tattctggga gaagtttata      780

 

tttccccaaa tcaatttctg ggaaaaacgt gtcactttca aattcctgca tgatccttgt      840

 

cacaaagagt ctgaggtggc ctggttgatt catggcttcc tggtaaacag aactgcctcc      900

 

gactatccaa accatgtcta ctttacttgc caattccggt tgttcaataa gtcttaaggc      960

 

atcatccaaa cttttggcaa gaaaatgagc tcctcgtggt ggttctttga gttctctact     1020

 

gagaactata ttaattctgt cctttaaagg tcgattcttc tcaggaatgg agaaccaggt     1080

 

tttcctaccc ataatcacca gattctgttt accttccact gaagaggttg tggtcattct     1140

 

ttggaagtac ttgaactcgt tcctgagcgg aggccagggt aggtctccgt tcttgccaat     1200

 

ccccatattt tgggacacgg cgacgatgca gttcaatggt cgaaccatga tggcagcggg     1260

 

gataaaatcc taccagcctt cacgctagga ttgccgtcaa gtttggcgcg aaatcgcagc     1320

 

cctgagctgt cccccccccc aagctcagat ctgagcttgg tccctatggt gagtccgttc     1380

 

cgctcttgtg atgatagcca gacaagaaag agacaataca agacaaacac caaatagtag     1440

 

aaatagagac aagggtcact tatccgaggg tccctgttcg ggcgccagct gccgcagtcg     1500

 

gccgacctga gggtcgccgg ggtctgcggg gggaccctct ggaaagtgaa ggataagtga     1560

 

cgagcggaga cgggatggcg aacagacaca aacacacaag aggtgaatgt taggactgtt     1620

 

gcaagtttac tcaaaaaatc agcactcttt tatatcttgg tttacataag catttacata     1680

 

agatttggat aaattccaaa agaacatagg aaaatagaac actcagagct cagatcagaa     1740

 

cctttgatac caaaccaagt caggaaacca cttgtctcac atcctcgttt taagaacagt     1800

 

ttgtaaccaa aaacttactt aagccctggg aaccgcaagg ttgggccaat aaaggctatt     1860

 

cataataact catgccatga gtttttgcag aataatgttc tattagtcca gccactgtcc     1920

 

cctccttggt atggaaaatc tttccccaaa agtgcattcc tgttcctaga taaatataat     1980

 

catgtacctg ttgtttcatg tcgtcttttt cttcttgaga caacatacac caaggaggtc     2040

 

tagctctggc gagtctttca cgaaaaggga gggatctata taacacttta tagccattga     2100

 

ctgtaaccca cctatcccaa tttaagtcat atcttcctgt atatggtaag ggggcatctg     2160

 

ttggtctgta gatgtaaggt cccctataag tccctggttg ccaccacctg tctcctattt     2220

 

tgacaaaaac actctttttt ccctttttta cttctaggcc tgtggtcaat agtccttgca     2280

 

cctgttcttc aattgaggtt gagcgtctct ttctattttc tattcccatt tctaacttct     2340

 

gaatttgagt aaaaatagta ctaaaagata atgattcatt tcttaacata gtaactaata     2400

 

atctacctat tggattggtc ttattggtaa aaatataatt tttagcaagc attcttattt     2460

 

ctatttctga aggacaaaat cgatgcggct tgtaagagga agttggctgt ggtccttgcc     2520

 

tcaggaggaa ggtcgagttc tccgaattgt ttagattgta atcttgcaca gaagagctat     2580

 

taaaagagtc aagggtgaga gccctgcgag cacgaaccgc aacttccccc aatagcccca     2640

 

ggcaaagcag agctatgcca agtttgcagc agagaatgaa tatgtctttg tctgatgggc     2700

 

tcatccgttt gtgcgcagac gggtcgtcct tggtgggaaa caaccccttg gctgcttctc     2760

 

ccctaggtgt aggacactct cgggagttca accatttctg cccaagctca gatctgagct     2820

 

ttaatgcggt agtttatcac agttaaattg ctaacgcagt caggcaccgt gtatgaaatc     2880

 

taacaatgcg ctcatcgtca tcctcggcac cgtcaccctg gatgctgtag gcataggctt     2940

 

ggttatgccg gtactgccgg gcctcttgcg ggatatcgtc cattccgaca gcatcgccag     3000

 

tcactatggc gtgctgctag cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg     3060

 

tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag     3120

 

aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc     3180

 

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca     3240

 

aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt     3300

 

ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc     3360

 

tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc     3420

 

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc     3480

 

ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact     3540

 

tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg     3600

 

ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta     3660

 

tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca     3720

 

aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa     3780

 

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg     3840

 

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc     3900

 

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg     3960

 

acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat     4020

 

ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg     4080

 

gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa     4140

 

taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca     4200

 

tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc     4260

 

gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt     4320

 

cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa     4380

 

aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat     4440

 

cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct     4500

 

tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga     4560

 

gttgctcttg cccggcgtca acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag     4620

 

tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga     4680

 

gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca     4740

 

ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg     4800

 

cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc     4860

 

agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag     4920

 

gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagagacc attattatca     4980

 

tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa gaattgtcta     5040

 

gaggcgcgcc gtttaaaccc tcagctaccg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt     5100

 

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata     5160

 

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc     5220

 

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc     5280

 

attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt     5340

 

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt     5400

 

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca     5460

 

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg     5520

 

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc     5580

 

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg     5640

 

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca     5700

 

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag caattgcacg tgtggccaca     5760

 

ggtaagttta aagctcaggt cgagaccggg cctttgtccg gcgctccctt ggagcctacc     5820

 

tagactcagc cggctctcca cgctttgcct gaccctgctt gctcaactct acgtctttgt     5880

 

ttcgttttct gttcctttct ctccacaggc ttaagcttgg taccgccgcc accatggagt     5940

 

ttgggctgag ctgggttttc cttgttgcta tattaaaagg tgtccagtgt gaggttcagc     6000

 

tggtgcagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag     6060

 

cctctggatt caccttcagt agctttgcta tgcactgggt tcgccaggct ccaggaaaag     6120

 

gtctggagtg gatatcagtt attgatactc gtggtgccac atactatgca gactccgtga     6180

 

agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt caaatgaaca     6240

 

gcctgagagc cgaggacact gctgtgtatt actgtgcaag actggggaac ttctactacg     6300

 

gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcttcc accaagggcc     6360

 

catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg     6420

 

gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc     6480

 

tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca     6540

 

gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga     6600

 

atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa     6660

 

ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct     6720

 

tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg     6780

 

tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg     6840

 

aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg     6900

 

tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg     6960

 

tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc     7020

 

cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg     7080

 

tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga     7140

 

gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct     7200

 

ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct     7260

 

tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc     7320

 

tgtctccggg taaatgaatc gatgattcta gatacgggtc cggaggatcc agatccccct     7380

 

cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt tccctaagtc caactactaa     7440

 

actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct gcctaataaa aaacatttat     7500

 

tttcattgca atgatgtatt taaattattt ctgaatattt tactaaaaag ggaatgtggg     7560

 

aggtcagtgc atttaaaaca taaagaaatg aagaggggga tctgtcgaca agctctagag     7620

 

agctcacgcg ttgatcatgt acaggccggc caagctttcg actagcttgg cacgccagaa     7680

 

atccgcgcgg tggtttttgg gggtcggggg tgtttggcag ccacagacgc ccggtgttcg     7740

 

tgtcgcgcca gtacatgcgg tccatgccca ggccatccaa aaaccatggg tctgtctgct     7800

 

cagtccagtc gtggacctga ccccacgcaa cgcccaaaat aataaccccc acgaaccata     7860

 

aaccattccc catgggggac cccgtcccta acccacgggg ccagtggcta tggcagggcc     7920

 

tgccgccccg acgttggctg cgagccctgg gccttcaccc gaacttgggg ggtggggtgg     7980

 

ggaaaaggaa gaaacgcggg cgtattggcc ccaatggggt ctcggtgggg tatcgacaga     8040

 

gtgccagccc tgggaccgaa ccccgcgttt atgaacaaac gacccaacac ccgtgcgttt     8100

 

tattctgtct ttttattgcc gtcatagcgc gggttccttc cggtattgtc tccttccgtg     8160

 

tttcagttag cctcccccat ctcccgatcc ggacgagtgc tggggcgtcg gtttccacta     8220

 

tcggcgagta cttctacaca gccatcggtc cagacggccg cgcttctgcg ggcgatttgt     8280

 

gtacgcccga cagtcccggc tccggatcgg acgattgcgt cgcatcgacc ctgcgcccaa     8340

 

gctgcatcat cgaaattgcc gtcaaccaag ctctgataga gttggtcaag accaatgcgg     8400

 

agcatatacg cccggagccg cggcgatcct gcaagctccg gatgcctccg ctcgaagtag     8460

 

cgcgtctgct gctccataca agccaaccac ggcctccaga agaagatgtt ggcgacctcg     8520

 

tattgggaat ccccgaacat cgcctcgctc cagtcaatga ccgctgttat gcggccattg     8580

 

tccgtcagga cattgttgga gccgaaatcc gcgtgcacga ggtgccggac ttcggggcag     8640

 

tcctcggccc aaagcatcag ctcatcgaga gcctgcgcga cggacgcact gacggtgtcg     8700

 

tccatcacag tttgccagtg atacacatgg ggatcagcaa tcgcgcatat gaaatcacgc     8760

 

catgtagtgt attgaccgat tccttgcggt ccgaatgggc cgaacccgct cgtctggcta     8820

 

agatcggccg cagcgatcgc atccatggcc tccgcgaccg gctgcagaac agcgggcagt     8880

 

tcggtttcag gcaggtcttg caacgtgaca ccctgtgcac ggcgggagat gcaataggtc     8940

 

aggctctcgc tgaattcccc aatgtcaagc acttccggaa tcgggagcgc ggccgatgca     9000

 

aagtgccgat aaacataacg atctttgtag aaaccatcgg cgcagctatt tacccgcagg     9060

 

acatatccac gccctcctac atcgaagctg aaagcacgag attcttcgcc ctccgagagc     9120

 

tgcatcaggt cggagacgct gtcgaacttt tcgatcagaa acttctcgac agacgtcgcg     9180

 

gtgagttcag gctttttcat atctcattgc cccccgggat ctgcggcacg ctgttgacgc     9240

 

tgttaagcgg gtcgctgcag ggtcgctcgg tgttcgaggc cacacgcgtc accttaatat     9300

 

gcgaagtgga cctcggaccg cgccgccccg actgcatctg cgtgttcgaa ttcgccaatg     9360

 

acaagacgct gggcggggtt tgtgtcatca tagaactaaa gacatgcaaa tatatttctt     9420

 

ccggggacac cgccagcaaa cgcgagcaac gggccacggg gatgaagcag ggcggcacct     9480

 

cgctaacgga ttcaccactc caagaattgg agccaatcaa ttcttgcgga gaactgtgaa     9540

 

tgcgcaaacc aacccttggc agaacatatc catcgcgtcc gccatctcca gcagccgcac     9600

 

gcggcgcatc tcggggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc acaggccggc     9660

 

cagcgcgcgg ccggccggta ccacgcgttg gccacatatg gcggccgctc gcgattaatt     9720

 

aatcgcgatg gccacatatg gagctctcta gagcttgtcg acagatcccc ctcttcattt     9780

 

ctttatgttt taaatgcact gacctcccac attccctttt tagtaaaata ttcagaaata     9840

 

atttaaatac atcattgcaa tgaaaataaa tgttttttat taggcagaat ccagatgctc     9900

 

aaggcccttc ataatatccc ccagtttagt agttggactt agggaacaaa ggaaccttta     9960

 

atagaaattg gacagcaaga aagcgagggg gatctggatc ctccggaggg ccctggatcc    10020

 

tcctacgtat ctagaatcat cgattaacac tctcccctgt tgaagctctt tgtgacgggc    10080

 

gagctcaggc cctgatgggt gacttcgcag gcgtagactt tgtgtttctc gtagtctgct    10140

 

ttgctcagcg tcagggtgct gctgaggctg taggtgctgt ccttgctgtc ctgctctgtg    10200

 

acactctcct gggagttacc cgattggagg gcgttatcca ccttccactg tactttggcc    10260

 

tctctgggat agaagttatt cagcaggcac acaacagagg cagttccaga tttcaactgc    10320

 

tcatcagatg gcgggaagat gaagacagat ggtgcagcca ccgtacgttt gatctccacc    10380

 

ttggtccctt ggccgaaagt gtgaggtaaa cgactactct gatgacagta atacactgcg    10440

 

aaatcttcag gctccagtct actgatggtg agggtgaaat ctgtcccaga tccactgcca    10500

 

ctgaacctat cggggatccc tgagagggac tgggatgcat acttgatgag aagccttgga    10560

 

gcctgacctg gtttctgctg gtaccagtgt aagctactac caatgctctg actggcccgg    10620

 

caggagaggg tggctctctc gcctggagac acagacaggg tacctgggct ctgagtcagc    10680

 

acaatttcac ccctggaggc tggaacccag agcagcagaa acccaatgag ttgtgatggc    10740

 

gacatggtgg cggcgtttaa acgaattctt aagcctgtgg agagaaagga acagaaaacg    10800

 

aaacaaagac gtagagttga gcaagcaggg tcaggcaaag cgtggagagc cggctgagtc    10860

 

taggtaggct ccaagggagc gccggacaaa ggcccggtct cgacctgagc tttaaactta    10920

 

cctgtggcca cacgtgcaat tgctatagtg agtcgtatta atttcgataa gccagtaagc    10980

 

agtgggttct ctagttagcc agagagctct gcttatatag acctcccacc gtacacgcct    11040

 

accgcccatt tgcgtcaatg gggcggagtt gttacgacat tttggaaagt cccgttgatt    11100

 

ttggtgccaa aacaaactcc cattgacgtc aatggggtgg agacttggaa atccccgtga    11160

 

gtcaaaccgc tatccacgcc cattgatgta ctgccaaaac cgcatcacca tggtaatagc    11220

 

gatgactaat acgtagatgt actgccaagt aggaaagtcc cataaggtca tgtactgggc    11280

 

ataatgccag gcgggccatt taccgtcatt gacgtcaata gggggcgtac ttggcatatg    11340

 

atacacttga tgtactgcca agtgggcagt ttaccgtaaa tagtccaccc attgacgtca    11400

 

atggaaagtc cctattggcg ttactatggg aacatacgtc attattgacg tcaatgggcg    11460

 

ggggtcgttg ggcggtcagc caggcgggcc atttaccgta agttatgtaa cgcggaactc    11520

 

catatatggg ctatgaacta atgaccccgt aattgattac tattaataac tagtcaataa    11580

 

tcaatgtcaa cgcgtatatc tggcccgtac atcggtaact agtcggaccg gcccgggcca    11640

 

ccggtgctcg aagcttggat cgatccagac atgataagat acattgatga gtttggacaa    11700

 

accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct    11760

 

ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg cattcatttt    11820

 

atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa    11880

 

tgtggtatgg ctgattatga tctctagtca ag                                  11912

 

 

<210>  44

<211>  11893

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  pAIL23V1-K质粒序列

 

<400>  44

ggcactatac atcaaatatt ccttattaac ccctttacaa attaaaaagc taaaggtaca       60

 

caatttttga gcatagttat taatagcaga cactctatgc ctgtgtggag taagaaaaaa      120

 

cagtatgtta tgattataac tgttatgcct acttataaag gttacagaat atttttccat      180

 

aattttcttg tatagcagtg cagctttttc ctttgtggtg taaatagcaa agcaagcaag      240

 

agttctatta ctaaacacag catgactcaa aaaacttagc aattctgaag gaaagtcctt      300

 

ggggtcttct acctttctct tcttttttgg aggagtagaa tgttgagagt cagcagtagc      360

 

ctcatcatca ctagatggca tttcttctga gcaaaacagg ttttcctcat taaaggcatt      420

 

ccaccactgc tcccattcat cagttccata ggttggaatc taaaatacac aaacaattag      480

 

aatcagtagt ttaacacatt atacacttaa aaattttata tttaccttag agctttaaat      540

 

ctctgtaggt agtttgtcca attatgtcac accacagaag taaggttcct tcacaaagat      600

 

cgatctaaag ccagcaaaag tcccatggtc ttataaaaat gcatagcttt aggaggggag      660

 

cagagaactt gaaagcatct tcctgttagt ctttcttctc gtagacttca aacttatact      720

 

tgatgccttt ttcctcctgg acctcagaga ggacgcctgg gtattctggg agaagtttat      780

 

atttccccaa atcaatttct gggaaaaacg tgtcactttc aaattcctgc atgatccttg      840

 

tcacaaagag tctgaggtgg cctggttgat tcatggcttc ctggtaaaca gaactgcctc      900

 

cgactatcca aaccatgtct actttacttg ccaattccgg ttgttcaata agtcttaagg      960

 

catcatccaa acttttggca agaaaatgag ctcctcgtgg tggttctttg agttctctac     1020

 

tgagaactat attaattctg tcctttaaag gtcgattctt ctcaggaatg gagaaccagg     1080

 

ttttcctacc cataatcacc agattctgtt taccttccac tgaagaggtt gtggtcattc     1140

 

tttggaagta cttgaactcg ttcctgagcg gaggccaggg taggtctccg ttcttgccaa     1200

 

tccccatatt ttgggacacg gcgacgatgc agttcaatgg tcgaaccatg atggcagcgg     1260

 

ggataaaatc ctaccagcct tcacgctagg attgccgtca agtttggcgc gaaatcgcag     1320

 

ccctgagctg tccccccccc caagctcaga tctgagcttg gtccctatgg tgagtccgtt     1380

 

ccgctcttgt gatgatagcc agacaagaaa gagacaatac aagacaaaca ccaaatagta     1440

 

gaaatagaga caagggtcac ttatccgagg gtccctgttc gggcgccagc tgccgcagtc     1500

 

ggccgacctg agggtcgccg gggtctgcgg ggggaccctc tggaaagtga aggataagtg     1560

 

acgagcggag acgggatggc gaacagacac aaacacacaa gaggtgaatg ttaggactgt     1620

 

tgcaagttta ctcaaaaaat cagcactctt ttatatcttg gtttacataa gcatttacat     1680

 

aagatttgga taaattccaa aagaacatag gaaaatagaa cactcagagc tcagatcaga     1740

 

acctttgata ccaaaccaag tcaggaaacc acttgtctca catcctcgtt ttaagaacag     1800

 

tttgtaacca aaaacttact taagccctgg gaaccgcaag gttgggccaa taaaggctat     1860

 

tcataataac tcatgccatg agtttttgca gaataatgtt ctattagtcc agccactgtc     1920

 

ccctccttgg tatggaaaat ctttccccaa aagtgcattc ctgttcctag ataaatataa     1980

 

tcatgtacct gttgtttcat gtcgtctttt tcttcttgag acaacataca ccaaggaggt     2040

 

ctagctctgg cgagtctttc acgaaaaggg agggatctat ataacacttt atagccattg     2100

 

actgtaaccc acctatccca atttaagtca tatcttcctg tatatggtaa gggggcatct     2160

 

gttggtctgt agatgtaagg tcccctataa gtccctggtt gccaccacct gtctcctatt     2220

 

ttgacaaaaa cactcttttt tccctttttt acttctaggc ctgtggtcaa tagtccttgc     2280

 

acctgttctt caattgaggt tgagcgtctc tttctatttt ctattcccat ttctaacttc     2340

 

tgaatttgag taaaaatagt actaaaagat aatgattcat ttcttaacat agtaactaat     2400

 

aatctaccta ttggattggt cttattggta aaaatataat ttttagcaag cattcttatt     2460

 

tctatttctg aaggacaaaa tcgatgcggc ttgtaagagg aagttggctg tggtccttgc     2520

 

ctcaggagga aggtcgagtt ctccgaattg tttagattgt aatcttgcac agaagagcta     2580

 

ttaaaagagt caagggtgag agccctgcga gcacgaaccg caacttcccc caatagcccc     2640

 

aggcaaagca gagctatgcc aagtttgcag cagagaatga atatgtcttt gtctgatggg     2700

 

ctcatccgtt tgtgcgcaga cgggtcgtcc ttggtgggaa acaacccctt ggctgcttct     2760

 

cccctaggtg taggacactc tcgggagttc aaccatttct gcccaagctc agatctgagc     2820

 

tttaatgcgg tagtttatca cagttaaatt gctaacgcag tcaggcaccg tgtatgaaat     2880

 

ctaacaatgc gctcatcgtc atcctcggca ccgtcaccct ggatgctgta ggcataggct     2940

 

tggttatgcc ggtactgccg ggcctcttgc gggatatcgt ccattccgac agcatcgcca     3000

 

gtcactatgg cgtgctgcta gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg     3060

 

gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca     3120

 

gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac     3180

 

cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac     3240

 

aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg     3300

 

tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac     3360

 

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat     3420

 

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag     3480

 

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac     3540

 

ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt     3600

 

gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt     3660

 

atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc     3720

 

aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga     3780

 

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac     3840

 

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc     3900

 

cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct     3960

 

gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca     4020

 

tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct     4080

 

ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca     4140

 

ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc     4200

 

atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg     4260

 

cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct     4320

 

tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa     4380

 

aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta     4440

 

tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc     4500

 

ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg     4560

 

agttgctctt gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa     4620

 

gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg     4680

 

agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc     4740

 

accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg     4800

 

gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat     4860

 

cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata     4920

 

ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagagac cattattatc     4980

 

atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattgtct     5040

 

agaggcgcgc cgtttaaacc ctcagctacc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat     5100

 

tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat     5160

 

atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac     5220

 

ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc     5280

 

cattgacgtc aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg     5340

 

tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat     5400

 

tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc     5460

 

atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt     5520

 

gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac     5580

 

caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc     5640

 

ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc     5700

 

actgcttact ggcttatcga aattaatacg actcactata gcaattgcac gtgtggccac     5760

 

aggtaagttt aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac     5820

 

ctagactcag ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg     5880

 

tttcgttttc tgttcctttc tctccacagg cttaagctcg aggccgccac catggctgtg     5940

 

ctggggctgc tgttctgcct ggtgacattc ccaagctgtg tgctgtccca ggtgcagctg     6000

 

gtgcagtctg gcgctgaggt gaagaagcct ggcgcctccg tgaaggtctc ctgcaaggct     6060

 

tctggctaca tcttcatcac ctactggatg acctgggtgc ggcaggcccc tggccagggg     6120

 

ctggagtgga tgggccagat cttccctgcc agcggctctg cagactacaa cgagaagttc     6180

 

gaaggcagag tcaccatgac cacagacaca tccaccagca cagcctacat ggagctgagg     6240

 

agcctgagat ctgacgacac cgccgtgtat tactgtgcca gaggcggtgg cggattcgct     6300

 

tactggggcc agggcaccct ggtcaccgtc tccagcgcta gcaccaaggg cccatcggtc     6360

 

ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg     6420

 

gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc     6480

 

ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg     6540

 

gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag     6600

 

cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca     6660

 

tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca     6720

 

aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac     6780

 

gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat     6840

 

aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc     6900

 

ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac     6960

 

aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa     7020

 

ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg     7080

 

acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg     7140

 

cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc     7200

 

ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc     7260

 

tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg     7320

 

ggtaaatgaa tcgatgattc tagatacggg tccggaggat ccagatcccc ctcgctttct     7380

 

tgctgtccaa tttctattaa aggttccttt gttccctaag tccaactact aaactggggg     7440

 

atattatgaa gggccttgag catctggatt ctgcctaata aaaaacattt attttcattg     7500

 

caatgatgta tttaaattat ttctgaatat tttactaaaa agggaatgtg ggaggtcagt     7560

 

gcatttaaaa cataaagaaa tgaagagggg gatctgtcga caagctctag agagctcacg     7620

 

cgttgatcat gtacaggccg gccaagcttt cgactagctt ggcacgccag aaatccgcgc     7680

 

ggtggttttt gggggtcggg ggtgtttggc agccacagac gcccggtgtt cgtgtcgcgc     7740

 

cagtacatgc ggtccatgcc caggccatcc aaaaaccatg ggtctgtctg ctcagtccag     7800

 

tcgtggacct gaccccacgc aacgcccaaa ataataaccc ccacgaacca taaaccattc     7860

 

cccatggggg accccgtccc taacccacgg ggccagtggc tatggcaggg cctgccgccc     7920

 

cgacgttggc tgcgagccct gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg     7980

 

aagaaacgcg ggcgtattgg ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc     8040

 

cctgggaccg aaccccgcgt ttatgaacaa acgacccaac acccgtgcgt tttattctgt     8100

 

ctttttattg ccgtcatagc gcgggttcct tccggtattg tctccttccg tgtttcagtt     8160

 

agcctccccc atctcccgat ccggacgagt gctggggcgt cggtttccac tatcggcgag     8220

 

tacttctaca cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg cgggcgattt gtgtacgccc     8280

 

gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga ccctgcgccc aagctgcatc     8340

 

atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata gagttggtca agaccaatgc ggagcatata     8400

 

cgcccggagc cgcggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc cgctcgaagt agcgcgtctg     8460

 

ctgctccata caagccaacc acggcctcca gaagaagatg ttggcgacct cgtattggga     8520

 

atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt atgcggccat tgtccgtcag     8580

 

gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg acttcggggc agtcctcggc     8640

 

ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca ctgacggtgt cgtccatcac     8700

 

agtttgccag tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat atgaaatcac gccatgtagt     8760

 

gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg ctcgtctggc taagatcggc     8820

 

cgcagcgatc gcatccatgg cctccgcgac cggctgcaga acagcgggca gttcggtttc     8880

 

aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag atgcaatagg tcaggctctc     8940

 

gctgaattcc ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc gcggccgatg caaagtgccg     9000

 

ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta tttacccgca ggacatatcc     9060

 

acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg ccctccgaga gctgcatcag     9120

 

gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg acagacgtcg cggtgagttc     9180

 

aggctttttc atatctcatt gccccccggg atctgcggca cgctgttgac gctgttaagc     9240

 

gggtcgctgc agggtcgctc ggtgttcgag gccacacgcg tcaccttaat atgcgaagtg     9300

 

gacctcggac cgcgccgccc cgactgcatc tgcgtgttcg aattcgccaa tgacaagacg     9360

 

ctgggcgggg tttgtgtcat catagaacta aagacatgca aatatatttc ttccggggac     9420

 

accgccagca aacgcgagca acgggccacg gggatgaagc agggcggcac ctcgctaacg     9480

 

gattcaccac tccaagaatt ggagccaatc aattcttgcg gagaactgtg aatgcgcaaa     9540

 

ccaacccttg gcagaacata tccatcgcgt ccgccatctc cagcagccgc acgcggcgca     9600

 

tctcggggcc gacgcgctgg gctacgtctt gctggcgttc gcacaggccg gccagcgcgc     9660

 

ggccggccgg taccacgcgt tggccacata tggcggccgc tcgcgattaa ttaatcgcga     9720

 

tggccacata tggagctctc tagagcttgt cgacagatcc ccctcttcat ttctttatgt     9780

 

tttaaatgca ctgacctccc acattccctt tttagtaaaa tattcagaaa taatttaaat     9840

 

acatcattgc aatgaaaata aatgtttttt attaggcaga atccagatgc tcaaggccct     9900

 

tcataatatc ccccagttta gtagttggac ttagggaaca aaggaacctt taatagaaat     9960

 

tggacagcaa gaaagcgagg gggatctgga tcctcctacg tatctagaat catcgattaa    10020

 

cactctcccc tgttgaagct ctttgtcacg gggctgctca ggccctgatg ggtcacctcg    10080

 

caggcgtaca ccttgtgttt ctcgtagtct gctttgctca gggtcagggt gctgctcagg    10140

 

ctgtaggtgc tgtccttgct gtcctgctct gtcacgctct cctgggagtt gccgctctgg    10200

 

agggcgttat ccaccttcca ctgcaccttg gcctctctgg gatagaagtt attcagcagg    10260

 

cacaccacgg aggcagttcc agacttcagc tgctcatcag atggagggaa gatgaacaca    10320

 

gatggtgcag ccaccgtacg cttgatctcc accttggtgc cctggccgaa ggtgaatgga    10380

 

attccgtagt ggtgctgaca gtagtaggtg gcgaagtcct caggctgcag gctgctgatg    10440

 

gtcagggtga agtctgtccc agagccgctg ccgctgaacc tggatggcac cccttcagcc    10500

 

agggtcttgg cgttatagat cagcagctta ggggccttcc ctggcttctg ctgataccag    10560

 

gccaggtagc tgtagatgtt ctcgctggtc ctgcaggtga tggtcactct gtcgcccaca    10620

 

gaggcagaca gggaggatgg agactgggtc atctggatat cacatctcat ggctggcagg    10680

 

aacagcacca gcagccccag cagctgcact ggagccatgg tggcggcctc gagaagctta    10740

 

agtttaattc ttaagcctgt ggagagaaag gaacagaaaa cgaaacaaag acgtagagtt    10800

 

gagcaagcag ggtcaggcaa agcgtggaga gccggctgag tctaggtagg ctccaaggga    10860

 

gcgccggaca aaggcccggt ctcgacctga gctttaaact tacctgtggc cacacgtgca    10920

 

attgctatag tgagtcgtat taatttcgat aagccagtaa gcagtgggtt ctctagttag    10980

 

ccagagagct ctgcttatat agacctccca ccgtacacgc ctaccgccca tttgcgtcaa    11040

 

tggggcggag ttgttacgac attttggaaa gtcccgttga ttttggtgcc aaaacaaact    11100

 

cccattgacg tcaatggggt ggagacttgg aaatccccgt gagtcaaacc gctatccacg    11160

 

cccattgatg tactgccaaa accgcatcac catggtaata gcgatgacta atacgtagat    11220

 

gtactgccaa gtaggaaagt cccataaggt catgtactgg gcataatgcc aggcgggcca    11280

 

tttaccgtca ttgacgtcaa tagggggcgt acttggcata tgatacactt gatgtactgc    11340

 

caagtgggca gtttaccgta aatagtccac ccattgacgt caatggaaag tccctattgg    11400

 

cgttactatg ggaacatacg tcattattga cgtcaatggg cgggggtcgt tgggcggtca    11460

 

gccaggcggg ccatttaccg taagttatgt aacgcggaac tccatatatg ggctatgaac    11520

 

taatgacccc gtaattgatt actattaata actagtcaat aatcaatgtc aacgcgtata    11580

 

tctggcccgt acatcggtaa ctagtcggac cggcccgggc caccggtgct cgaagcttgg    11640

 

atcgatccag acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag    11700

 

tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata    11760

 

agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg    11820

 

gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtat ggctgattat    11880

 

gatctctagt caa                                                       11893

 

 

<210>  45

<211>  11901

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  pAIL23RV1质粒序列

 

<400>  45

ggcactatac atcaaatatt ccttattaac ccctttacaa attaaaaagc taaaggtaca       60

 

caatttttga gcatagttat taatagcaga cactctatgc ctgtgtggag taagaaaaaa      120

 

cagtatgtta tgattataac tgttatgcct acttataaag gttacagaat atttttccat      180

 

aattttcttg tatagcagtg cagctttttc ctttgtggtg taaatagcaa agcaagcaag      240

 

agttctatta ctaaacacag catgactcaa aaaacttagc aattctgaag gaaagtcctt      300

 

ggggtcttct acctttctct tcttttttgg aggagtagaa tgttgagagt cagcagtagc      360

 

ctcatcatca ctagatggca tttcttctga gcaaaacagg ttttcctcat taaaggcatt      420

 

ccaccactgc tcccattcat cagttccata ggttggaatc taaaatacac aaacaattag      480

 

aatcagtagt ttaacacatt atacacttaa aaattttata tttaccttag agctttaaat      540

 

ctctgtaggt agtttgtcca attatgtcac accacagaag taaggttcct tcacaaagat      600

 

cgatctaaag ccagcaaaag tcccatggtc ttataaaaat gcatagcttt aggaggggag      660

 

cagagaactt gaaagcatct tcctgttagt ctttcttctc gtagacttca aacttatact      720

 

tgatgccttt ttcctcctgg acctcagaga ggacgcctgg gtattctggg agaagtttat      780

 

atttccccaa atcaatttct gggaaaaacg tgtcactttc aaattcctgc atgatccttg      840

 

tcacaaagag tctgaggtgg cctggttgat tcatggcttc ctggtaaaca gaactgcctc      900

 

cgactatcca aaccatgtct actttacttg ccaattccgg ttgttcaata agtcttaagg      960

 

catcatccaa acttttggca agaaaatgag ctcctcgtgg tggttctttg agttctctac     1020

 

tgagaactat attaattctg tcctttaaag gtcgattctt ctcaggaatg gagaaccagg     1080

 

ttttcctacc cataatcacc agattctgtt taccttccac tgaagaggtt gtggtcattc     1140

 

tttggaagta cttgaactcg ttcctgagcg gaggccaggg taggtctccg ttcttgccaa     1200

 

tccccatatt ttgggacacg gcgacgatgc agttcaatgg tcgaaccatg atggcagcgg     1260

 

ggataaaatc ctaccagcct tcacgctagg attgccgtca agtttggcgc gaaatcgcag     1320

 

ccctgagctg tccccccccc caagctcaga tctgagcttg gtccctatgg tgagtccgtt     1380

 

ccgctcttgt gatgatagcc agacaagaaa gagacaatac aagacaaaca ccaaatagta     1440

 

gaaatagaga caagggtcac ttatccgagg gtccctgttc gggcgccagc tgccgcagtc     1500

 

ggccgacctg agggtcgccg gggtctgcgg ggggaccctc tggaaagtga aggataagtg     1560

 

acgagcggag acgggatggc gaacagacac aaacacacaa gaggtgaatg ttaggactgt     1620

 

tgcaagttta ctcaaaaaat cagcactctt ttatatcttg gtttacataa gcatttacat     1680

 

aagatttgga taaattccaa aagaacatag gaaaatagaa cactcagagc tcagatcaga     1740

 

acctttgata ccaaaccaag tcaggaaacc acttgtctca catcctcgtt ttaagaacag     1800

 

tttgtaacca aaaacttact taagccctgg gaaccgcaag gttgggccaa taaaggctat     1860

 

tcataataac tcatgccatg agtttttgca gaataatgtt ctattagtcc agccactgtc     1920

 

ccctccttgg tatggaaaat ctttccccaa aagtgcattc ctgttcctag ataaatataa     1980

 

tcatgtacct gttgtttcat gtcgtctttt tcttcttgag acaacataca ccaaggaggt     2040

 

ctagctctgg cgagtctttc acgaaaaggg agggatctat ataacacttt atagccattg     2100

 

actgtaaccc acctatccca atttaagtca tatcttcctg tatatggtaa gggggcatct     2160

 

gttggtctgt agatgtaagg tcccctataa gtccctggtt gccaccacct gtctcctatt     2220

 

ttgacaaaaa cactcttttt tccctttttt acttctaggc ctgtggtcaa tagtccttgc     2280

 

acctgttctt caattgaggt tgagcgtctc tttctatttt ctattcccat ttctaacttc     2340

 

tgaatttgag taaaaatagt actaaaagat aatgattcat ttcttaacat agtaactaat     2400

 

aatctaccta ttggattggt cttattggta aaaatataat ttttagcaag cattcttatt     2460

 

tctatttctg aaggacaaaa tcgatgcggc ttgtaagagg aagttggctg tggtccttgc     2520

 

ctcaggagga aggtcgagtt ctccgaattg tttagattgt aatcttgcac agaagagcta     2580

 

ttaaaagagt caagggtgag agccctgcga gcacgaaccg caacttcccc caatagcccc     2640

 

aggcaaagca gagctatgcc aagtttgcag cagagaatga atatgtcttt gtctgatggg     2700

 

ctcatccgtt tgtgcgcaga cgggtcgtcc ttggtgggaa acaacccctt ggctgcttct     2760

 

cccctaggtg taggacactc tcgggagttc aaccatttct gcccaagctc agatctgagc     2820

 

tttaatgcgg tagtttatca cagttaaatt gctaacgcag tcaggcaccg tgtatgaaat     2880

 

ctaacaatgc gctcatcgtc atcctcggca ccgtcaccct ggatgctgta ggcataggct     2940

 

tggttatgcc ggtactgccg ggcctcttgc gggatatcgt ccattccgac agcatcgcca     3000

 

gtcactatgg cgtgctgcta gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg     3060

 

gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca     3120

 

gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac     3180

 

cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac     3240

 

aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg     3300

 

tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac     3360

 

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat     3420

 

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag     3480

 

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac     3540

 

ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt     3600

 

gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt     3660

 

atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc     3720

 

aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga     3780

 

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac     3840

 

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc     3900

 

cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct     3960

 

gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca     4020

 

tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct     4080

 

ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca     4140

 

ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc     4200

 

atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg     4260

 

cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct     4320

 

tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa     4380

 

aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta     4440

 

tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc     4500

 

ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg     4560

 

agttgctctt gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa     4620

 

gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg     4680

 

agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc     4740

 

accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg     4800

 

gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat     4860

 

cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata     4920

 

ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagagac cattattatc     4980

 

atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattgtct     5040

 

agaggcgcgc cgtttaaacc ctcagctacc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat     5100

 

tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat     5160

 

atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac     5220

 

ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc     5280

 

cattgacgtc aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg     5340

 

tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat     5400

 

tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc     5460

 

atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt     5520

 

gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac     5580

 

caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc     5640

 

ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc     5700

 

actgcttact ggcttatcga aattaatacg actcactata gcaattgcac gtgtggccac     5760

 

aggtaagttt aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac     5820

 

ctagactcag ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg     5880

 

tttcgttttc tgttcctttc tctccacagg cttaagctcg aggccgccac catggctgtg     5940

 

ctggggctgc tgttctgcct ggtgacattc ccaagctgtg tgctgtccca ggtgcagctg     6000

 

gtgcagtctg gcgctgaggt gaagaagcct ggcgcctccg tgaaggtctc ctgcaaggct     6060

 

tctggctaca cattcaccaa ctacgctatg aactgggtgc ggcaggcccc tggccagggg     6120

 

ctggagtgga tgggctggat caacacttac accggtgagc caacctacag cgacgacttc     6180

 

aagggcagag tcaccttcac cctggacaca tccaccagca cagcctacat ggagctgagg     6240

 

agcctgagat ctgacgacac cgccgtgtat tactgtgcca gaggtggagg ctacgatgag     6300

 

gactacttcg actactgggg ccagggcacc ctggtcaccg tctccagcgc tagcaccaag     6360

 

ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc     6420

 

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc     6480

 

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc     6540

 

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac     6600

 

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac     6660

 

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc     6720

 

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc     6780

 

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc     6840

 

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt     6900

 

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc     6960

 

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg     7020

 

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac     7080

 

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg     7140

 

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac     7200

 

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac     7260

 

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc     7320

 

tccctgtctc cgggtaaata aatcgatgat tctagatacg ggtccggagg atccagatcc     7380

 

ccctcgcttt cttgctgtcc aatttctatt aaaggttcct ttgttcccta agtccaacta     7440

 

ctaaactggg ggatattatg aagggccttg agcatctgga ttctgcctaa taaaaaacat     7500

 

ttattttcat tgcaatgatg tatttaaatt atttctgaat attttactaa aaagggaatg     7560

 

tgggaggtca gtgcatttaa aacataaaga aatgaagagg gggatctgtc gacaagctct     7620

 

agagagctca cgcgttgatc atgtacaggc cggccaagct ttcgactagc ttggcacgcc     7680

 

agaaatccgc gcggtggttt ttgggggtcg ggggtgtttg gcagccacag acgcccggtg     7740

 

ttcgtgtcgc gccagtacat gcggtccatg cccaggccat ccaaaaacca tgggtctgtc     7800

 

tgctcagtcc agtcgtggac ctgaccccac gcaacgccca aaataataac ccccacgaac     7860

 

cataaaccat tccccatggg ggaccccgtc cctaacccac ggggccagtg gctatggcag     7920

 

ggcctgccgc cccgacgttg gctgcgagcc ctgggccttc acccgaactt ggggggtggg     7980

 

gtggggaaaa ggaagaaacg cgggcgtatt ggccccaatg gggtctcggt ggggtatcga     8040

 

cagagtgcca gccctgggac cgaaccccgc gtttatgaac aaacgaccca acacccgtgc     8100

 

gttttattct gtctttttat tgccgtcata gcgcgggttc cttccggtat tgtctccttc     8160

 

cgtgtttcag ttagcctccc ccatctcccg atccggacga gtgctggggc gtcggtttcc     8220

 

actatcggcg agtacttcta cacagccatc ggtccagacg gccgcgcttc tgcgggcgat     8280

 

ttgtgtacgc ccgacagtcc cggctccgga tcggacgatt gcgtcgcatc gaccctgcgc     8340

 

ccaagctgca tcatcgaaat tgccgtcaac caagctctga tagagttggt caagaccaat     8400

 

gcggagcata tacgcccgga gccgcggcga tcctgcaagc tccggatgcc tccgctcgaa     8460

 

gtagcgcgtc tgctgctcca tacaagccaa ccacggcctc cagaagaaga tgttggcgac     8520

 

ctcgtattgg gaatccccga acatcgcctc gctccagtca atgaccgctg ttatgcggcc     8580

 

attgtccgtc aggacattgt tggagccgaa atccgcgtgc acgaggtgcc ggacttcggg     8640

 

gcagtcctcg gcccaaagca tcagctcatc gagagcctgc gcgacggacg cactgacggt     8700

 

gtcgtccatc acagtttgcc agtgatacac atggggatca gcaatcgcgc atatgaaatc     8760

 

acgccatgta gtgtattgac cgattccttg cggtccgaat gggccgaacc cgctcgtctg     8820

 

gctaagatcg gccgcagcga tcgcatccat ggcctccgcg accggctgca gaacagcggg     8880

 

cagttcggtt tcaggcaggt cttgcaacgt gacaccctgt gcacggcggg agatgcaata     8940

 

ggtcaggctc tcgctgaatt ccccaatgtc aagcacttcc ggaatcggga gcgcggccga     9000

 

tgcaaagtgc cgataaacat aacgatcttt gtagaaacca tcggcgcagc tatttacccg     9060

 

caggacatat ccacgccctc ctacatcgaa gctgaaagca cgagattctt cgccctccga     9120

 

gagctgcatc aggtcggaga cgctgtcgaa cttttcgatc agaaacttct cgacagacgt     9180

 

cgcggtgagt tcaggctttt tcatatctca ttgccccccg ggatctgcgg cacgctgttg     9240

 

acgctgttaa gcgggtcgct gcagggtcgc tcggtgttcg aggccacacg cgtcacctta     9300

 

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aatgacaaga cgctgggcgg ggtttgtgtc atcatagaac taaagacatg caaatatatt     9420

 

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tgaatgcgca aaccaaccct tggcagaaca tatccatcgc gtccgccatc tccagcagcc     9600

 

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cggccagcgc gcggccggcc ggtaccacgc gttggccaca tatggcggcc gctcgcgatt     9720

 

aattaatcgc gatggccaca tatggagctc tctagagctt gtcgacagat ccccctcttc     9780

 

atttctttat gttttaaatg cactgacctc ccacattccc tttttagtaa aatattcaga     9840

 

aataatttaa atacatcatt gcaatgaaaa taaatgtttt ttattaggca gaatccagat     9900

 

gctcaaggcc cttcataata tcccccagtt tagtagttgg acttagggaa caaaggaacc     9960

 

tttaatagaa attggacagc aagaaagcga gggggatctg gatcctttaa cactctcccc    10020

 

tgttgaagct ctttgtgacg ggcgagctca ggccctgatg ggtgacttcg caggcgtaga    10080

 

ctttgtgttt ctcgtagtct gctttgctca gcgtcagggt gctgctgagg ctgtaggtgc    10140

 

tgtccttgct gtcctgctct gtgacactct cctgggagtt acccgattgg agggcgttat    10200

 

ccaccttcca ctgtactttg gcctctctgg gatagaagtt attcagcagg cacacaacag    10260

 

aggcagttcc agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa gatgaagaca gatggtgcag    10320

 

ccaccgtacg tttgatttcc accttggtcc cctgtccaaa ggtccatggt gtgtcatagt    10380

 

gctgctgaca gtagtacacg cccacatctt cggcctccac ccggctgatc ttcagagtga    10440

 

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cgaaatagat cagcagctga gggctctgcc ctggtttctg cagataccag gccaggtagg    10560

 

tcttctggtt gatggtgttg aacaggctct ggctgctctt gcagctgatg ctggctggct    10620

 

ctccgggtgt cacaggcagg gacagtggag actgggtcat cacgatatca catctcatgg    10680

 

ctggcaggaa cagcaccagc agccccagca gctgcactgg agccatggtg gcggcctcga    10740

 

gaagcttaag tttaattctt aagcctgtgg agagaaagga acagaaaacg aaacaaagac    10800

 

gtagagttga gcaagcaggg tcaggcaaag cgtggagagc cggctgagtc taggtaggct    10860

 

ccaagggagc gccggacaaa ggcccggtct cgacctgagc tttaaactta cctgtggcca    10920

 

cacgtgcaat tgctatagtg agtcgtatta atttcgataa gccagtaagc agtgggttct    10980

 

ctagttagcc agagagctct gcttatatag acctcccacc gtacacgcct accgcccatt    11040

 

tgcgtcaatg gggcggagtt gttacgacat tttggaaagt cccgttgatt ttggtgccaa    11100

 

aacaaactcc cattgacgtc aatggggtgg agacttggaa atccccgtga gtcaaaccgc    11160

 

tatccacgcc cattgatgta ctgccaaaac cgcatcacca tggtaatagc gatgactaat    11220

 

acgtagatgt actgccaagt aggaaagtcc cataaggtca tgtactgggc ataatgccag    11280

 

gcgggccatt taccgtcatt gacgtcaata gggggcgtac ttggcatatg atacacttga    11340

 

tgtactgcca agtgggcagt ttaccgtaaa tagtccaccc attgacgtca atggaaagtc    11400

 

cctattggcg ttactatggg aacatacgtc attattgacg tcaatgggcg ggggtcgttg    11460

 

ggcggtcagc caggcgggcc atttaccgta agttatgtaa cgcggaactc catatatggg    11520

 

ctatgaacta atgaccccgt aattgattac tattaataac tagtcaataa tcaatgtcaa    11580

 

cgcgtatatc tggcccgtac atcggtaact agtcggaccg gcccgggcca ccggtgctcg    11640

 

aagcttggat cgatccagac atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta    11700

 

gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa    11760

 

ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg cattcatttt atgtttcagg    11820

 

ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtatgg    11880

 

ctgattatga tctctagtca a                                              11901

 

 

<210>  46

<211>  11922

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  pAIL17AV1质粒序列

 

<400>  46

gcactataca tcaaatattc cttattaacc cctttacaaa ttaaaaagct aaaggtacac       60

 

aatttttgag catagttatt aatagcagac actctatgcc tgtgtggagt aagaaaaaac      120

 

agtatgttat gattataact gttatgccta cttataaagg ttacagaata tttttccata      180

 

attttcttgt atagcagtgc agctttttcc tttgtggtgt aaatagcaaa gcaagcaaga      240

 

gttctattac taaacacagc atgactcaaa aaacttagca attctgaagg aaagtccttg      300

 

gggtcttcta cctttctctt cttttttgga ggagtagaat gttgagagtc agcagtagcc      360

 

tcatcatcac tagatggcat ttcttctgag caaaacaggt tttcctcatt aaaggcattc      420

 

caccactgct cccattcatc agttccatag gttggaatct aaaatacaca aacaattaga      480

 

atcagtagtt taacacatta tacacttaaa aattttatat ttaccttaga gctttaaatc      540

 

tctgtaggta gtttgtccaa ttatgtcaca ccacagaagt aaggttcctt cacaaagatc      600

 

gatctaaagc cagcaaaagt cccatggtct tataaaaatg catagcttta ggaggggagc      660

 

agagaacttg aaagcatctt cctgttagtc tttcttctcg tagacttcaa acttatactt      720

 

gatgcctttt tcctcctgga cctcagagag gacgcctggg tattctggga gaagtttata      780

 

tttccccaaa tcaatttctg ggaaaaacgt gtcactttca aattcctgca tgatccttgt      840

 

cacaaagagt ctgaggtggc ctggttgatt catggcttcc tggtaaacag aactgcctcc      900

 

gactatccaa accatgtcta ctttacttgc caattccggt tgttcaataa gtcttaaggc      960

 

atcatccaaa cttttggcaa gaaaatgagc tcctcgtggt ggttctttga gttctctact     1020

 

gagaactata ttaattctgt cctttaaagg tcgattcttc tcaggaatgg agaaccaggt     1080

 

tttcctaccc ataatcacca gattctgttt accttccact gaagaggttg tggtcattct     1140

 

ttggaagtac ttgaactcgt tcctgagcgg aggccagggt aggtctccgt tcttgccaat     1200

 

ccccatattt tgggacacgg cgacgatgca gttcaatggt cgaaccatga tggcagcggg     1260

 

gataaaatcc taccagcctt cacgctagga ttgccgtcaa gtttggcgcg aaatcgcagc     1320

 

cctgagctgt cccccccccc aagctcagat ctgagcttgg tccctatggt gagtccgttc     1380

 

cgctcttgtg atgatagcca gacaagaaag agacaataca agacaaacac caaatagtag     1440

 

aaatagagac aagggtcact tatccgaggg tccctgttcg ggcgccagct gccgcagtcg     1500

 

gccgacctga gggtcgccgg ggtctgcggg gggaccctct ggaaagtgaa ggataagtga     1560

 

cgagcggaga cgggatggcg aacagacaca aacacacaag aggtgaatgt taggactgtt     1620

 

gcaagtttac tcaaaaaatc agcactcttt tatatcttgg tttacataag catttacata     1680

 

agatttggat aaattccaaa agaacatagg aaaatagaac actcagagct cagatcagaa     1740

 

cctttgatac caaaccaagt caggaaacca cttgtctcac atcctcgttt taagaacagt     1800

 

ttgtaaccaa aaacttactt aagccctggg aaccgcaagg ttgggccaat aaaggctatt     1860

 

cataataact catgccatga gtttttgcag aataatgttc tattagtcca gccactgtcc     1920

 

cctccttggt atggaaaatc tttccccaaa agtgcattcc tgttcctaga taaatataat     1980

 

catgtacctg ttgtttcatg tcgtcttttt cttcttgaga caacatacac caaggaggtc     2040

 

tagctctggc gagtctttca cgaaaaggga gggatctata taacacttta tagccattga     2100

 

ctgtaaccca cctatcccaa tttaagtcat atcttcctgt atatggtaag ggggcatctg     2160

 

ttggtctgta gatgtaaggt cccctataag tccctggttg ccaccacctg tctcctattt     2220

 

tgacaaaaac actctttttt ccctttttta cttctaggcc tgtggtcaat agtccttgca     2280

 

cctgttcttc aattgaggtt gagcgtctct ttctattttc tattcccatt tctaacttct     2340

 

gaatttgagt aaaaatagta ctaaaagata atgattcatt tcttaacata gtaactaata     2400

 

atctacctat tggattggtc ttattggtaa aaatataatt tttagcaagc attcttattt     2460

 

ctatttctga aggacaaaat cgatgcggct tgtaagagga agttggctgt ggtccttgcc     2520

 

tcaggaggaa ggtcgagttc tccgaattgt ttagattgta atcttgcaca gaagagctat     2580

 

taaaagagtc aagggtgaga gccctgcgag cacgaaccgc aacttccccc aatagcccca     2640

 

ggcaaagcag agctatgcca agtttgcagc agagaatgaa tatgtctttg tctgatgggc     2700

 

tcatccgttt gtgcgcagac gggtcgtcct tggtgggaaa caaccccttg gctgcttctc     2760

 

ccctaggtgt aggacactct cgggagttca accatttctg cccaagctca gatctgagct     2820

 

ttaatgcggt agtttatcac agttaaattg ctaacgcagt caggcaccgt gtatgaaatc     2880

 

taacaatgcg ctcatcgtca tcctcggcac cgtcaccctg gatgctgtag gcataggctt     2940

 

ggttatgccg gtactgccgg gcctcttgcg ggatatcgtc cattccgaca gcatcgccag     3000

 

tcactatggc gtgctgctag cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg     3060

 

tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag     3120

 

aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc     3180

 

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca     3240

 

aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt     3300

 

ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc     3360

 

tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc     3420

 

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc     3480

 

ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact     3540

 

tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg     3600

 

ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta     3660

 

tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca     3720

 

aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa     3780

 

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg     3840

 

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc     3900

 

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg     3960

 

acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat     4020

 

ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg     4080

 

gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa     4140

 

taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca     4200

 

tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc     4260

 

gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt     4320

 

cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa     4380

 

aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat     4440

 

cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct     4500

 

tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga     4560

 

gttgctcttg cccggcgtca acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag     4620

 

tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga     4680

 

gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca     4740

 

ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg     4800

 

cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc     4860

 

agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag     4920

 

gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagagacc attattatca     4980

 

tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa gaattgtcta     5040

 

gaggcgcgcc gtttaaaccc tcagctaccg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt     5100

 

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata     5160

 

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc     5220

 

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc     5280

 

attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt     5340

 

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt     5400

 

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca     5460

 

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg     5520

 

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc     5580

 

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg     5640

 

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca     5700

 

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag caattgcacg tgtggccaca     5760

 

ggtaagttta aagctcaggt cgagaccggg cctttgtccg gcgctccctt ggagcctacc     5820

 

tagactcagc cggctctcca cgctttgcct gaccctgctt gctcaactct acgtctttgt     5880

 

ttcgttttct gttcctttct ctccacaggc ttaagagtac tgccgccacc atggctgtgc     5940

 

tggggctgct gttctgcctg gtgacattcc caagctgtgt gctgtcccag gtgcagctgc     6000

 

aggagtctgg accaggcctg gtgaagccta gcgagaccct gagcctgacc tgtaccgtgt     6060

 

ctggattcag cctgcccagc cacagcgtga gctggatcag acagcctcca ggcaagggac     6120

 

tggagtggat cggcatcatt tggaatcaag gcggcactga ctataacagc gccttcaaga     6180

 

gccgcgtgac catctccgtg gacacctcca agaaccagtt cagcctgaag ctgagcagcg     6240

 

tgaccgctgc cgacaccgct gtgtattact gtgccagaaa tgcatacatc accgactact     6300

 

attacgagaa ctacttcatg gatgcctggg gacagggcac cctggtgacc gtgagctccg     6360

 

ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg     6420

 

gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt     6480

 

ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag     6540

 

gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct     6600

 

acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca     6660

 

aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac     6720

 

cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg     6780

 

aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt     6840

 

acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca     6900

 

gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg     6960

 

agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca     7020

 

aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc     7080

 

tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg     7140

 

ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc     7200

 

tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc     7260

 

agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc     7320

 

agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gaatcgatga ttctagatac gggtccggag     7380

 

gatccagatc cccctcgctt tcttgctgtc caatttctat taaaggttcc tttgttccct     7440

 

aagtccaact actaaactgg gggatattat gaagggcctt gagcatctgg attctgccta     7500

 

ataaaaaaca tttattttca ttgcaatgat gtatttaaat tatttctgaa tattttacta     7560

 

aaaagggaat gtgggaggtc agtgcattta aaacataaag aaatgaagag ggggatctgt     7620

 

cgacaagctc tagagagctc acgcgttgat catgtacagg ccggccaagc tttcgactag     7680

 

cttggcacgc cagaaatccg cgcggtggtt tttgggggtc gggggtgttt ggcagccaca     7740

 

gacgcccggt gttcgtgtcg cgccagtaca tgcggtccat gcccaggcca tccaaaaacc     7800

 

atgggtctgt ctgctcagtc cagtcgtgga cctgacccca cgcaacgccc aaaataataa     7860

 

cccccacgaa ccataaacca ttccccatgg gggaccccgt ccctaaccca cggggccagt     7920

 

ggctatggca gggcctgccg ccccgacgtt ggctgcgagc cctgggcctt cacccgaact     7980

 

tggggggtgg ggtggggaaa aggaagaaac gcgggcgtat tggccccaat ggggtctcgg     8040

 

tggggtatcg acagagtgcc agccctggga ccgaaccccg cgtttatgaa caaacgaccc     8100

 

aacacccgtg cgttttattc tgtcttttta ttgccgtcat agcgcgggtt ccttccggta     8160

 

ttgtctcctt ccgtgtttca gttagcctcc cccatctccc gatccggacg agtgctgggg     8220

 

cgtcggtttc cactatcggc gagtacttct acacagccat cggtccagac ggccgcgctt     8280

 

ctgcgggcga tttgtgtacg cccgacagtc ccggctccgg atcggacgat tgcgtcgcat     8340

 

cgaccctgcg cccaagctgc atcatcgaaa ttgccgtcaa ccaagctctg atagagttgg     8400

 

tcaagaccaa tgcggagcat atacgcccgg agccgcggcg atcctgcaag ctccggatgc     8460

 

ctccgctcga agtagcgcgt ctgctgctcc atacaagcca accacggcct ccagaagaag     8520

 

atgttggcga cctcgtattg ggaatccccg aacatcgcct cgctccagtc aatgaccgct     8580

 

gttatgcggc cattgtccgt caggacattg ttggagccga aatccgcgtg cacgaggtgc     8640

 

cggacttcgg ggcagtcctc ggcccaaagc atcagctcat cgagagcctg cgcgacggac     8700

 

gcactgacgg tgtcgtccat cacagtttgc cagtgataca catggggatc agcaatcgcg     8760

 

catatgaaat cacgccatgt agtgtattga ccgattcctt gcggtccgaa tgggccgaac     8820

 

ccgctcgtct ggctaagatc ggccgcagcg atcgcatcca tggcctccgc gaccggctgc     8880

 

agaacagcgg gcagttcggt ttcaggcagg tcttgcaacg tgacaccctg tgcacggcgg     8940

 

gagatgcaat aggtcaggct ctcgctgaat tccccaatgt caagcacttc cggaatcggg     9000

 

agcgcggccg atgcaaagtg ccgataaaca taacgatctt tgtagaaacc atcggcgcag     9060

 

ctatttaccc gcaggacata tccacgccct cctacatcga agctgaaagc acgagattct     9120

 

tcgccctccg agagctgcat caggtcggag acgctgtcga acttttcgat cagaaacttc     9180

 

tcgacagacg tcgcggtgag ttcaggcttt ttcatatctc attgcccccc gggatctgcg     9240

 

gcacgctgtt gacgctgtta agcgggtcgc tgcagggtcg ctcggtgttc gaggccacac     9300

 

gcgtcacctt aatatgcgaa gtggacctcg gaccgcgccg ccccgactgc atctgcgtgt     9360

 

tcgaattcgc caatgacaag acgctgggcg gggtttgtgt catcatagaa ctaaagacat     9420

 

gcaaatatat ttcttccggg gacaccgcca gcaaacgcga gcaacgggcc acggggatga     9480

 

agcagggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga attggagcca atcaattctt     9540

 

gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac atatccatcg cgtccgccat     9600

 

ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg gccgacgcgc tgggctacgt cttgctggcg     9660

 

ttcgcacagg ccggccagcg cgcggccggc cggtaccacg cgttggccac atatggcggc     9720

 

cgctcgcgat taattaatcg cgatggccac atatggagct ctctagagct tgtcgacaga     9780

 

tccccctctt catttcttta tgttttaaat gcactgacct cccacattcc ctttttagta     9840

 

aaatattcag aaataattta aatacatcat tgcaatgaaa ataaatgttt tttattaggc     9900

 

agaatccaga tgctcaaggc ccttcataat atcccccagt ttagtagttg gacttaggga     9960

 

acaaaggaac ctttaataga aattggacag caagaaagcg agggggatct ggatcctccg    10020

 

gagggcccct tctccctcta acactctccc ctgttgaagc tctttgtgac gggcgagctc    10080

 

aggccctgat gggtgacttc gcaggcgtag actttgtgtt tctcgtagtc tgctttgctc    10140

 

agcgtcaggg tgctgctgag gctgtaggtg ctgtccttgc tgtcctgctc tgtgacactc    10200

 

tcctgggagt tacccgattg gagggcgtta tccaccttcc actgtacttt ggcctctctg    10260

 

ggatagaagt tattcagcag gcacacaaca gaggcagttc cagatttcaa ctgctcatca    10320

 

gatggcggga agatgaagac agatggtgca gccaccgtac gtttgatttc caccttggtc    10380

 

ccctgtccaa aggtgtaggg tgtgtaatag ctctgctgac agtagtacac gcccacatct    10440

 

tcggcctcca cccggctgat cttcagagtg aaatctgtcc cagatccgct gccgctgaac    10500

 

ctgtctggca ccccgctctg ccgggtgctg gtccaataga tcagcagctg agggctctgc    10560

 

cctggtttct gcagatacca ggccaggtag ttcttctggt tctcgctgaa cagcaggctc    10620

 

tggctgctct tgcagctgat gctggctggc tctccgggtg tcacaggcag ggacagtgga    10680

 

gactgggtca tcacgatatc acatctcatg gctggcagga acagcaccag cagccccagc    10740

 

agctgcactg gagccatggt ggcggcgcta gcgaattctt aagcctgtgg agagaaagga    10800

 

acagaaaacg aaacaaagac gtagagttga gcaagcaggg tcaggcaaag cgtggagagc    10860

 

cggctgagtc taggtaggct ccaagggagc gccggacaaa ggcccggtct cgacctgagc    10920

 

tttaaactta cctgtggcca cacgtgcaat tgctatagtg agtcgtatta atttcgataa    10980

 

gccagtaagc agtgggttct ctagttagcc agagagctct gcttatatag acctcccacc    11040

 

gtacacgcct accgcccatt tgcgtcaatg gggcggagtt gttacgacat tttggaaagt    11100

 

cccgttgatt ttggtgccaa aacaaactcc cattgacgtc aatggggtgg agacttggaa    11160

 

atccccgtga gtcaaaccgc tatccacgcc cattgatgta ctgccaaaac cgcatcacca    11220

 

tggtaatagc gatgactaat acgtagatgt actgccaagt aggaaagtcc cataaggtca    11280

 

tgtactgggc ataatgccag gcgggccatt taccgtcatt gacgtcaata gggggcgtac    11340

 

ttggcatatg atacacttga tgtactgcca agtgggcagt ttaccgtaaa tagtccaccc    11400

 

attgacgtca atggaaagtc cctattggcg ttactatggg aacatacgtc attattgacg    11460

 

tcaatgggcg ggggtcgttg ggcggtcagc caggcgggcc atttaccgta agttatgtaa    11520

 

cgcggaactc catatatggg ctatgaacta atgaccccgt aattgattac tattaataac    11580

 

tagtcaataa tcaatgtcaa cgcgtatatc tggcccgtac atcggtaact agtcggaccg    11640

 

gcccgggcca ccggtgctcg aagcttggat cgatccagac atgataagat acattgatga    11700

 

gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga    11760

 

tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg    11820

 

cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa    11880

 

cctctacaaa tgtggtatgg ctgattatga tctctagtca ag                       11922

 

 

<210>  47

<211>  11859

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  pAPD16V1-GA质粒序列

 

<400>  47

gcactataca tcaaatattc cttattaacc cctttacaaa ttaaaaagct aaaggtacac       60

 

aatttttgag catagttatt aatagcagac actctatgcc tgtgtggagt aagaaaaaac      120

 

agtatgttat gattataact gttatgccta cttataaagg ttacagaata tttttccata      180

 

attttcttgt atagcagtgc agctttttcc tttgtggtgt aaatagcaaa gcaagcaaga      240

 

gttctattac taaacacagc atgactcaaa aaacttagca attctgaagg aaagtccttg      300

 

gggtcttcta cctttctctt cttttttgga ggagtagaat gttgagagtc agcagtagcc      360

 

tcatcatcac tagatggcat ttcttctgag caaaacaggt tttcctcatt aaaggcattc      420

 

caccactgct cccattcatc agttccatag gttggaatct aaaatacaca aacaattaga      480

 

atcagtagtt taacacatta tacacttaaa aattttatat ttaccttaga gctttaaatc      540

 

tctgtaggta gtttgtccaa ttatgtcaca ccacagaagt aaggttcctt cacaaagatc      600

 

gatctaaagc cagcaaaagt cccatggtct tataaaaatg catagcttta ggaggggagc      660

 

agagaacttg aaagcatctt cctgttagtc tttcttctcg tagacttcaa acttatactt      720

 

gatgcctttt tcctcctgga cctcagagag gacgcctggg tattctggga gaagtttata      780

 

tttccccaaa tcaatttctg ggaaaaacgt gtcactttca aattcctgca tgatccttgt      840

 

cacaaagagt ctgaggtggc ctggttgatt catggcttcc tggtaaacag aactgcctcc      900

 

gactatccaa accatgtcta ctttacttgc caattccggt tgttcaataa gtcttaaggc      960

 

atcatccaaa cttttggcaa gaaaatgagc tcctcgtggt ggttctttga gttctctact     1020

 

gagaactata ttaattctgt cctttaaagg tcgattcttc tcaggaatgg agaaccaggt     1080

 

tttcctaccc ataatcacca gattctgttt accttccact gaagaggttg tggtcattct     1140

 

ttggaagtac ttgaactcgt tcctgagcgg aggccagggt aggtctccgt tcttgccaat     1200

 

ccccatattt tgggacacgg cgacgatgca gttcaatggt cgaaccatga tggcagcggg     1260

 

gataaaatcc taccagcctt cacgctagga ttgccgtcaa gtttggcgcg aaatcgcagc     1320

 

cctgagctgt cccccccccc aagctcagat ctgagcttgg tccctatggt gagtccgttc     1380

 

cgctcttgtg atgatagcca gacaagaaag agacaataca agacaaacac caaatagtag     1440

 

aaatagagac aagggtcact tatccgaggg tccctgttcg ggcgccagct gccgcagtcg     1500

 

gccgacctga gggtcgccgg ggtctgcggg gggaccctct ggaaagtgaa ggataagtga     1560

 

cgagcggaga cgggatggcg aacagacaca aacacacaag aggtgaatgt taggactgtt     1620

 

gcaagtttac tcaaaaaatc agcactcttt tatatcttgg tttacataag catttacata     1680

 

agatttggat aaattccaaa agaacatagg aaaatagaac actcagagct cagatcagaa     1740

 

cctttgatac caaaccaagt caggaaacca cttgtctcac atcctcgttt taagaacagt     1800

 

ttgtaaccaa aaacttactt aagccctggg aaccgcaagg ttgggccaat aaaggctatt     1860

 

cataataact catgccatga gtttttgcag aataatgttc tattagtcca gccactgtcc     1920

 

cctccttggt atggaaaatc tttccccaaa agtgcattcc tgttcctaga taaatataat     1980

 

catgtacctg ttgtttcatg tcgtcttttt cttcttgaga caacatacac caaggaggtc     2040

 

tagctctggc gagtctttca cgaaaaggga gggatctata taacacttta tagccattga     2100

 

ctgtaaccca cctatcccaa tttaagtcat atcttcctgt atatggtaag ggggcatctg     2160

 

ttggtctgta gatgtaaggt cccctataag tccctggttg ccaccacctg tctcctattt     2220

 

tgacaaaaac actctttttt ccctttttta cttctaggcc tgtggtcaat agtccttgca     2280

 

cctgttcttc aattgaggtt gagcgtctct ttctattttc tattcccatt tctaacttct     2340

 

gaatttgagt aaaaatagta ctaaaagata atgattcatt tcttaacata gtaactaata     2400

 

atctacctat tggattggtc ttattggtaa aaatataatt tttagcaagc attcttattt     2460

 

ctatttctga aggacaaaat cgatgcggct tgtaagagga agttggctgt ggtccttgcc     2520

 

tcaggaggaa ggtcgagttc tccgaattgt ttagattgta atcttgcaca gaagagctat     2580

 

taaaagagtc aagggtgaga gccctgcgag cacgaaccgc aacttccccc aatagcccca     2640

 

ggcaaagcag agctatgcca agtttgcagc agagaatgaa tatgtctttg tctgatgggc     2700

 

tcatccgttt gtgcgcagac gggtcgtcct tggtgggaaa caaccccttg gctgcttctc     2760

 

ccctaggtgt aggacactct cgggagttca accatttctg cccaagctca gatctgagct     2820

 

ttaatgcggt agtttatcac agttaaattg ctaacgcagt caggcaccgt gtatgaaatc     2880

 

taacaatgcg ctcatcgtca tcctcggcac cgtcaccctg gatgctgtag gcataggctt     2940

 

ggttatgccg gtactgccgg gcctcttgcg ggatatcgtc cattccgaca gcatcgccag     3000

 

tcactatggc gtgctgctag cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg     3060

 

tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag     3120

 

aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc     3180

 

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca     3240

 

aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt     3300

 

ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc     3360

 

tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc     3420

 

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc     3480

 

ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact     3540

 

tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg     3600

 

ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta     3660

 

tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca     3720

 

aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa     3780

 

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg     3840

 

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc     3900

 

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg     3960

 

acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat     4020

 

ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg     4080

 

gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa     4140

 

taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca     4200

 

tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc     4260

 

gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt     4320

 

cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa     4380

 

aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat     4440

 

cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct     4500

 

tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga     4560

 

gttgctcttg cccggcgtca acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag     4620

 

tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga     4680

 

gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca     4740

 

ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg     4800

 

cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc     4860

 

agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag     4920

 

gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagagacc attattatca     4980

 

tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa gaattgtcta     5040

 

gaggcgcgcc gtttaaaccc tcagctaccg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt     5100

 

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata     5160

 

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc     5220

 

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc     5280

 

attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt     5340

 

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt     5400

 

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca     5460

 

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg     5520

 

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc     5580

 

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg     5640

 

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca     5700

 

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag caattgcacg tgtggccaca     5760

 

ggtaagttta aagctcaggt cgagaccggg cctttgtccg gcgctccctt ggagcctacc     5820

 

tagactcagc cggctctcca cgctttgcct gaccctgctt gctcaactct acgtctttgt     5880

 

ttcgttttct gttcctttct ctccacaggc ttaagctcga ggccgccacc atggccgtgc     5940

 

tgggcctgct gttctgcctg gtgaccttcc cttcctgcgt gctgtcccag gtgcagctgg     6000

 

tgcagtccgg cgtggaggtg aagaagcctg gcgcctccgt caaggtgtcc tgtaaggcct     6060

 

ccggctacac cttcaccaac tactacatgt actgggtgcg gcaggcccca ggccagggac     6120

 

tggagtggat gggcggcatc aacccttcca acggcggcac caacttcaac gagaagttca     6180

 

agaaccgggt gaccctgacc accgactcct ccaccacaac cgcctacatg gaactgaagt     6240

 

ccctgcagtt cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gcgggactac cggttcgaca     6300

 

tgggcttcga ctactggggc cagggcacca ccgtgaccgt gtcctccgct agcaccaagg     6360

 

gcccttccgt gttccctctg gccccttgct cccggtccac ctccgagtcc accgccgctc     6420

 

tgggctgtct ggtgaaggac tacttccctg agcctgtgac cgtgagctgg aactctggcg     6480

 

ccctgacctc cggcgtgcac accttccctg ccgtgctgca gtcctccggc ctgtactccc     6540

 

tgtcctccgt ggtgaccgtg ccttcctcct ccctgggcac caagacctac acctgcaacg     6600

 

tggaccacaa gccttccaac accaaggtgg acaagcgggt ggagtccaag tacggccctc     6660

 

cttgccctcc ctgccctgcc cctgagttcc tgggcggacc ctccgtgttc ctgttccctc     6720

 

ctaagcctaa ggacaccctg atgatctccc ggacccctga ggtgacctgc gtggtggtgg     6780

 

acgtgtccca ggaagatcct gaggtccagt tcaattggta cgtggatggc gtggaggtgc     6840

 

acaacgccaa gaccaagcct cgggaggaac agttcaactc cacctaccgg gtggtgtctg     6900

 

tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga atacaagtgc aaggtcagca     6960

 

acaagggcct gccctcctcc atcgagaaaa ccatctccaa ggccaagggc cagcctcgcg     7020

 

agcctcaggt gtacaccctg cctcctagcc aggaagagat gaccaagaat caggtgtccc     7080

 

tgacatgcct ggtgaagggc ttctaccctt ccgatatcgc cgtggagtgg gagagcaacg     7140

 

gccagccaga gaacaactac aagaccaccc ctcctgtgct ggactccgac ggctccttct     7200

 

tcctgtactc caggctgacc gtggacaagt cccggtggca ggaaggcaac gtcttttcct     7260

 

gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg tccctgtctc     7320

 

tgggcaagtg aatcgatgga tccagatccc cctcgctttc ttgctgtcca atttctatta     7380

 

aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac taaactgggg gatattatga agggccttga     7440

 

gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt tattttcatt gcaatgatgt atttaaatta     7500

 

tttctgaata ttttactaaa aagggaatgt gggaggtcag tgcatttaaa acataaagaa     7560

 

atgaagaggg ggatctgtcg acaagctcta gagagctcac gcgttgatca tgtacaggcc     7620

 

ggccaagctt tcgactagct tggcacgcca gaaatccgcg cggtggtttt tgggggtcgg     7680

 

gggtgtttgg cagccacaga cgcccggtgt tcgtgtcgcg ccagtacatg cggtccatgc     7740

 

ccaggccatc caaaaaccat gggtctgtct gctcagtcca gtcgtggacc tgaccccacg     7800

 

caacgcccaa aataataacc cccacgaacc ataaaccatt ccccatgggg gaccccgtcc     7860

 

ctaacccacg gggccagtgg ctatggcagg gcctgccgcc ccgacgttgg ctgcgagccc     7920

 

tgggccttca cccgaacttg gggggtgggg tggggaaaag gaagaaacgc gggcgtattg     7980

 

gccccaatgg ggtctcggtg gggtatcgac agagtgccag ccctgggacc gaaccccgcg     8040

 

tttatgaaca aacgacccaa cacccgtgcg ttttattctg tctttttatt gccgtcatag     8100

 

cgcgggttcc ttccggtatt gtctccttcc gtgtttcagt tagcctcccc catctcccga     8160

 

tccggacgag tgctggggcg tcggtttcca ctatcggcga gtacttctac acagccatcg     8220

 

gtccagacgg ccgcgcttct gcgggcgatt tgtgtacgcc cgacagtccc ggctccggat     8280

 

cggacgattg cgtcgcatcg accctgcgcc caagctgcat catcgaaatt gccgtcaacc     8340

 

aagctctgat agagttggtc aagaccaatg cggagcatat acgcccggag ccgcggcgat     8400

 

cctgcaagct ccggatgcct ccgctcgaag tagcgcgtct gctgctccat acaagccaac     8460

 

cacggcctcc agaagaagat gttggcgacc tcgtattggg aatccccgaa catcgcctcg     8520

 

ctccagtcaa tgaccgctgt tatgcggcca ttgtccgtca ggacattgtt ggagccgaaa     8580

 

tccgcgtgca cgaggtgccg gacttcgggg cagtcctcgg cccaaagcat cagctcatcg     8640

 

agagcctgcg cgacggacgc actgacggtg tcgtccatca cagtttgcca gtgatacaca     8700

 

tggggatcag caatcgcgca tatgaaatca cgccatgtag tgtattgacc gattccttgc     8760

 

ggtccgaatg ggccgaaccc gctcgtctgg ctaagatcgg ccgcagcgat cgcatccatg     8820

 

gcctccgcga ccggctgcag aacagcgggc agttcggttt caggcaggtc ttgcaacgtg     8880

 

acaccctgtg cacggcggga gatgcaatag gtcaggctct cgctgaattc cccaatgtca     8940

 

agcacttccg gaatcgggag cgcggccgat gcaaagtgcc gataaacata acgatctttg     9000

 

tagaaaccat cggcgcagct atttacccgc aggacatatc cacgccctcc tacatcgaag     9060

 

ctgaaagcac gagattcttc gccctccgag agctgcatca ggtcggagac gctgtcgaac     9120

 

ttttcgatca gaaacttctc gacagacgtc gcggtgagtt caggcttttt catatctcat     9180

 

tgccccccgg gatctgcggc acgctgttga cgctgttaag cgggtcgctg cagggtcgct     9240

 

cggtgttcga ggccacacgc gtcaccttaa tatgcgaagt ggacctcgga ccgcgccgcc     9300

 

ccgactgcat ctgcgtgttc gaattcgcca atgacaagac gctgggcggg gtttgtgtca     9360

 

tcatagaact aaagacatgc aaatatattt cttccgggga caccgccagc aaacgcgagc     9420

 

aacgggccac ggggatgaag cagggcggca cctcgctaac ggattcacca ctccaagaat     9480

 

tggagccaat caattcttgc ggagaactgt gaatgcgcaa accaaccctt ggcagaacat     9540

 

atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg cacgcggcgc atctcggggc cgacgcgctg     9600

 

ggctacgtct tgctggcgtt cgcacaggcc ggccagcgcg cggccggccg gtaccacgcg     9660

 

ttggccacat atggcggccg ctcgcgatta attaatcgcg atggccacat atggagctct     9720

 

ctagagcttg tcgacagatc cccctcttca tttctttatg ttttaaatgc actgacctcc     9780

 

cacattccct ttttagtaaa atattcagaa ataatttaaa tacatcattg caatgaaaat     9840

 

aaatgttttt tattaggcag aatccagatg ctcaaggccc ttcataatat cccccagttt     9900

 

agtagttgga cttagggaac aaaggaacct ttaatagaaa ttggacagca agaaagcgag     9960

 

ggggatctgg atccctccct tcagcactcg ccccggttga aggacttggt cacagggctg    10020

 

gacaggccct ggtgggtcac ctcgcaggcg tacaccttgt gcttctcgta gtcggccttg    10080

 

gacagggtca gggtggagga cagggagtag gtgctgtcct tggagtcctg ctcggtgacg    10140

 

gattcctggg agttgccgga ctgcagggca ttgtccacct tccactgcac cttggcctcc    10200

 

cgagggtaga agttgttcag caggcacacc acggaggcgg tgccggactt cagctgctcg    10260

 

tcggagggag ggaagatgaa cacggaagga gcggccaccg tacgcttgat ctccagcttg    10320

 

gtgccctggc cgaaggtcag aggcaggtcc cgggagtgct ggcagtagta cacgcccacg    10380

 

tcctcggcct ccacccggga gatcttcagg gtgaagtcgg tgccgctgcc ggagccggag    10440

 

aaccggtcag gcacgccgga ctccaggtag gaggccaggt agatcagcag ctggggggac    10500

 

tggccaggct tctgcagata ccagtgcagg taggagtagc cggaggtgga cacgcccttg    10560

 

gaggcccggc aggagatgga ggcaggctcg ccaggggtca caggcaggga cagaggggac    10620

 

tgggtcagca cgatctcgca ccgcatggca ggcaggaaca gcaccagcag gcccagcagc    10680

 

tgcacagggg ccatggtggc ggcctcgagg aattcttaag cctgtggaga gaaaggaaca    10740

 

gaaaacgaaa caaagacgta gagttgagca agcagggtca ggcaaagcgt ggagagccgg    10800

 

ctgagtctag gtaggctcca agggagcgcc ggacaaaggc ccggtctcga cctgagcttt    10860

 

aaacttacct gtggccacac gtgcaattgc tatagtgagt cgtattaatt tcgataagcc    10920

 

agtaagcagt gggttctcta gttagccaga gagctctgct tatatagacc tcccaccgta    10980

 

cacgcctacc gcccatttgc gtcaatgggg cggagttgtt acgacatttt ggaaagtccc    11040

 

gttgattttg gtgccaaaac aaactcccat tgacgtcaat ggggtggaga cttggaaatc    11100

 

cccgtgagtc aaaccgctat ccacgcccat tgatgtactg ccaaaaccgc atcaccatgg    11160

 

taatagcgat gactaatacg tagatgtact gccaagtagg aaagtcccat aaggtcatgt    11220

 

actgggcata atgccaggcg ggccatttac cgtcattgac gtcaataggg ggcgtacttg    11280

 

gcatatgata cacttgatgt actgccaagt gggcagttta ccgtaaatag tccacccatt    11340

 

gacgtcaatg gaaagtccct attggcgtta ctatgggaac atacgtcatt attgacgtca    11400

 

atgggcgggg gtcgttgggc ggtcagccag gcgggccatt taccgtaagt tatgtaacgc    11460

 

ggaactccat atatgggcta tgaactaatg accccgtaat tgattactat taataactag    11520

 

tcaataatca atgtcaacgc gtatatctgg cccgtacatc ggtaactagt cggaccggcc    11580

 

cgggccaccg gtgctcgaag cttggatcga tccagacatg ataagataca ttgatgagtt    11640

 

tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc    11700

 

tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat    11760

 

tcattttatg tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct    11820

 

ctacaaatgt ggtatggctg attatgatct ctagtcaag                           11859

 

 

<210>  48

<211>  11909

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223>  pAHGFV1质粒序列

 

<400>  48

ggcactatac atcaaatatt ccttattaac ccctttacaa attaaaaagc taaaggtaca       60

 

caatttttga gcatagttat taatagcaga cactctatgc ctgtgtggag taagaaaaaa      120

 

cagtatgtta tgattataac tgttatgcct acttataaag gttacagaat atttttccat      180

 

aattttcttg tatagcagtg cagctttttc ctttgtggtg taaatagcaa agcaagcaag      240

 

agttctatta ctaaacacag catgactcaa aaaacttagc aattctgaag gaaagtcctt      300

 

ggggtcttct acctttctct tcttttttgg aggagtagaa tgttgagagt cagcagtagc      360

 

ctcatcatca ctagatggca tttcttctga gcaaaacagg ttttcctcat taaaggcatt      420

 

ccaccactgc tcccattcat cagttccata ggttggaatc taaaatacac aaacaattag      480

 

aatcagtagt ttaacacatt atacacttaa aaattttata tttaccttag agctttaaat      540

 

ctctgtaggt agtttgtcca attatgtcac accacagaag taaggttcct tcacaaagat      600

 

cgatctaaag ccagcaaaag tcccatggtc ttataaaaat gcatagcttt aggaggggag      660

 

cagagaactt gaaagcatct tcctgttagt ctttcttctc gtagacttca aacttatact      720

 

tgatgccttt ttcctcctgg acctcagaga ggacgcctgg gtattctggg agaagtttat      780

 

atttccccaa atcaatttct gggaaaaacg tgtcactttc aaattcctgc atgatccttg      840

 

tcacaaagag tctgaggtgg cctggttgat tcatggcttc ctggtaaaca gaactgcctc      900

 

cgactatcca aaccatgtct actttacttg ccaattccgg ttgttcaata agtcttaagg      960

 

catcatccaa acttttggca agaaaatgag ctcctcgtgg tggttctttg agttctctac     1020

 

tgagaactat attaattctg tcctttaaag gtcgattctt ctcaggaatg gagaaccagg     1080

 

ttttcctacc cataatcacc agattctgtt taccttccac tgaagaggtt gtggtcattc     1140

 

tttggaagta cttgaactcg ttcctgagcg gaggccaggg taggtctccg ttcttgccaa     1200

 

tccccatatt ttgggacacg gcgacgatgc agttcaatgg tcgaaccatg atggcagcgg     1260

 

ggataaaatc ctaccagcct tcacgctagg attgccgtca agtttggcgc gaaatcgcag     1320

 

ccctgagctg tccccccccc caagctcaga tctgagcttg gtccctatgg tgagtccgtt     1380

 

ccgctcttgt gatgatagcc agacaagaaa gagacaatac aagacaaaca ccaaatagta     1440

 

gaaatagaga caagggtcac ttatccgagg gtccctgttc gggcgccagc tgccgcagtc     1500

 

ggccgacctg agggtcgccg gggtctgcgg ggggaccctc tggaaagtga aggataagtg     1560

 

acgagcggag acgggatggc gaacagacac aaacacacaa gaggtgaatg ttaggactgt     1620

 

tgcaagttta ctcaaaaaat cagcactctt ttatatcttg gtttacataa gcatttacat     1680

 

aagatttgga taaattccaa aagaacatag gaaaatagaa cactcagagc tcagatcaga     1740

 

acctttgata ccaaaccaag tcaggaaacc acttgtctca catcctcgtt ttaagaacag     1800

 

tttgtaacca aaaacttact taagccctgg gaaccgcaag gttgggccaa taaaggctat     1860

 

tcataataac tcatgccatg agtttttgca gaataatgtt ctattagtcc agccactgtc     1920

 

ccctccttgg tatggaaaat ctttccccaa aagtgcattc ctgttcctag ataaatataa     1980

 

tcatgtacct gttgtttcat gtcgtctttt tcttcttgag acaacataca ccaaggaggt     2040

 

ctagctctgg cgagtctttc acgaaaaggg agggatctat ataacacttt atagccattg     2100

 

actgtaaccc acctatccca atttaagtca tatcttcctg tatatggtaa gggggcatct     2160

 

gttggtctgt agatgtaagg tcccctataa gtccctggtt gccaccacct gtctcctatt     2220

 

ttgacaaaaa cactcttttt tccctttttt acttctaggc ctgtggtcaa tagtccttgc     2280

 

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aatctaccta ttggattggt cttattggta aaaatataat ttttagcaag cattcttatt     2460

 

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ttaaaagagt caagggtgag agccctgcga gcacgaaccg caacttcccc caatagcccc     2640

 

aggcaaagca gagctatgcc aagtttgcag cagagaatga atatgtcttt gtctgatggg     2700

 

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tttaatgcgg tagtttatca cagttaaatt gctaacgcag tcaggcaccg tgtatgaaat     2880

 

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tggttatgcc ggtactgccg ggcctcttgc gggatatcgt ccattccgac agcatcgcca     3000

 

gtcactatgg cgtgctgcta gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg     3060

 

gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca     3120

 

gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac     3180

 

cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac     3240

 

aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg     3300

 

tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac     3360

 

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat     3420

 

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag     3480

 

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac     3540

 

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gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt     3660

 

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aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga     3780

 

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac     3840

 

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc     3900

 

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gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca     4020

 

tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct     4080

 

ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca     4140

 

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atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg     4260

 

cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct     4320

 

tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa     4380

 

aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta     4440

 

tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc     4500

 

ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg     4560

 

agttgctctt gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa     4620

 

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gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat     4860

 

cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata     4920

 

ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagagac cattattatc     4980

 

atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattgtct     5040

 

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tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat     5160

 

atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac     5220

 

ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc     5280

 

cattgacgtc aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg     5340

 

tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat     5400

 

tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc     5460

 

atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt     5520

 

gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac     5580

 

caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc     5640

 

ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc     5700

 

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aggtaagttt aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac     5820

 

ctagactcag ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg     5880

 

tttcgttttc tgttcctttc tctccacagg cttaaaacgc cgccaccatg gggtcaaccg     5940

 

ccatcctcgc cctcctcctg gctgttctcc aaggagtctg tgccgaagtg cagctggtgc     6000

 

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gatacagctt taccacctac tggatgcact gggtgcgcca gatgcccggg aaaggcctgg     6120

 

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gccaggtcac catctcagct gacaagtcca tcagcactgc ctacctgcag tggagcagcc     6240

 

tgaaggcctc ggacaccgcc atgtattact gtgcgagaaa ctatgttggt agcatctttg     6300

 

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tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca     6480

 

gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg     6540

 

tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca     6600

 

agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca     6660

 

catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc     6720

 

caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg     6780

 

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ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg     6900

 

tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca     6960

 

acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag     7020

 

aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc     7080

 

tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg     7140

 

ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct     7200

 

tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat     7260

 

gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc     7320

 

cgggtaaatg aatcgatgat tctagatacg ggtccggagg atccagatcc ccctcgcttt     7380

 

cttgctgtcc aatttctatt aaaggttcct ttgttcccta agtccaacta ctaaactggg     7440

 

ggatattatg aagggccttg agcatctgga ttctgcctaa taaaaaacat ttattttcat     7500

 

tgcaatgatg tatttaaatt atttctgaat attttactaa aaagggaatg tgggaggtca     7560

 

gtgcatttaa aacataaaga aatgaagagg gggatctgtc gacaagctct agagagctca     7620

 

cgcgttgatc atgtacaggc cggccaagct ttcgactagc ttggcacgcc agaaatccgc     7680

 

gcggtggttt ttgggggtcg ggggtgtttg gcagccacag acgcccggtg ttcgtgtcgc     7740

 

gccagtacat gcggtccatg cccaggccat ccaaaaacca tgggtctgtc tgctcagtcc     7800

 

agtcgtggac ctgaccccac gcaacgccca aaataataac ccccacgaac cataaaccat     7860

 

tccccatggg ggaccccgtc cctaacccac ggggccagtg gctatggcag ggcctgccgc     7920

 

cccgacgttg gctgcgagcc ctgggccttc acccgaactt ggggggtggg gtggggaaaa     7980

 

ggaagaaacg cgggcgtatt ggccccaatg gggtctcggt ggggtatcga cagagtgcca     8040

 

gccctgggac cgaaccccgc gtttatgaac aaacgaccca acacccgtgc gttttattct     8100

 

gtctttttat tgccgtcata gcgcgggttc cttccggtat tgtctccttc cgtgtttcag     8160

 

ttagcctccc ccatctcccg atccggacga gtgctggggc gtcggtttcc actatcggcg     8220

 

agtacttcta cacagccatc ggtccagacg gccgcgcttc tgcgggcgat ttgtgtacgc     8280

 

ccgacagtcc cggctccgga tcggacgatt gcgtcgcatc gaccctgcgc ccaagctgca     8340

 

tcatcgaaat tgccgtcaac caagctctga tagagttggt caagaccaat gcggagcata     8400

 

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tgctgctcca tacaagccaa ccacggcctc cagaagaaga tgttggcgac ctcgtattgg     8520

 

gaatccccga acatcgcctc gctccagtca atgaccgctg ttatgcggcc attgtccgtc     8580

 

aggacattgt tggagccgaa atccgcgtgc acgaggtgcc ggacttcggg gcagtcctcg     8640

 

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gtgtattgac cgattccttg cggtccgaat gggccgaacc cgctcgtctg gctaagatcg     8820

 

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gcgggtcgct gcagggtcgc tcggtgttcg aggccacacg cgtcacctta atatgcgaag     9300

 

tggacctcgg accgcgccgc cccgactgca tctgcgtgtt cgaattcgcc aatgacaaga     9360

 

cgctgggcgg ggtttgtgtc atcatagaac taaagacatg caaatatatt tcttccgggg     9420

 

acaccgccag caaacgcgag caacgggcca cggggatgaa gcagggcggc acctcgctaa     9480

 

cggattcacc actccaagaa ttggagccaa tcaattcttg cggagaactg tgaatgcgca     9540

 

aaccaaccct tggcagaaca tatccatcgc gtccgccatc tccagcagcc gcacgcggcg     9600

 

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gcggccggcc ggtaccacgc gttggccaca tatggcggcc gctcgcgatt aattaatcgc     9720

 

gatggccaca tatggagctc tctagagctt gtcgacagat ccccctcttc atttctttat     9780

 

gttttaaatg cactgacctc ccacattccc tttttagtaa aatattcaga aataatttaa     9840

 

atacatcatt gcaatgaaaa taaatgtttt ttattaggca gaatccagat gctcaaggcc     9900

 

cttcataata tcccccagtt tagtagttgg acttagggaa caaaggaacc tttaatagaa     9960

 

attggacagc aagaaagcga gggggatctg gatcctccta cgtatctaga atcatcgatt    10020

 

aacactctcc cctgttgaag ctctttgtca cggggctgct caggccctga tgggtcacct    10080

 

cgcaggcgta caccttgtgt ttctcgtagt ctgctttgct cagggtcagg gtgctgctca    10140

 

ggctgtaggt gctgtccttg ctgtcctgct ctgtcacgct ctcctgggag ttgccgctct    10200

 

ggagggcgtt atccaccttc cactgcacct tggcctctct gggatagaag ttattcagca    10260

 

ggcacaccac ggaggcagtt ccagacttca gctgctcatc agatggaggg aagatgaaca    10320

 

cagatggtgc agccaccgta cgtttgatct ccagcttggt cccctggcca aacgtgtacg    10380

 

gatagttgta actctgccca cagtagtaag ttgcaaaatc ttcaggttgc agactgctga    10440

 

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cagatgcaga cagggaggat ggagactggg tcatctggat gtcacatctg gcacctcgga    10680

 

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tggtatggct gattatgatc tctagtcaa                                      11909

 

 

 

Claims (43)

1.分离的质粒载体，所述载体包含由β-珠蛋白剪接供体位点、γ免疫球蛋白剪接受体位点和所述位点之间的间隔核苷酸序列组成的多核苷酸，其中所述β-珠蛋白剪接供体位点的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示，所述γ免疫球蛋白剪接受体位点的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，并且所述间隔核苷酸序列为SEQ ID NO: 3的第51-175位核苷酸；所述多核苷酸可操作性连接于启动子，所述多核苷酸和启动子可操作性连接于编码抗-IGF1R、抗-IL-23 p19、抗-IL23受体、抗-IL-17、抗-PD1或抗-HGF抗体免疫球蛋白轻链或重链的基因，所述链任选融合于免疫球蛋白恒定区。

2.权利要求1的质粒载体，其中所述启动子是CMV启动子。

3.权利要求1的质粒载体，其中所述基因编码与κ免疫球蛋白恒定区融合的免疫球蛋白轻链。

4.权利要求1的质粒载体，其中所述基因编码与γ-1免疫球蛋白恒定区融合的免疫球蛋白重链。

5.权利要求4的质粒载体，其中所述基因编码包含SEQ ID NO: 6、8-11、18或26的第20-128位氨基酸或SEQ ID NO 31的轻链免疫球蛋白的CDR-L1、CDR-L2 和CDR-L3；或其中所述基因编码包含SEQ ID NO: 7、12、13、14或22的第20-137位氨基酸或SEQ ID NO: 30的重链免疫球蛋白的CDR-H1、CDR-H2 和CDR-H3。

6.权利要求5的质粒载体，其中所述基因编码SEQ ID NO: 8、9、10或11的第20-128位氨基酸。

7.权利要求5的质粒载体，其中所述基因编码SEQ ID NO: 12或13的第20-137位氨基酸。

8.权利要求1的分离的质粒载体，其特征在于选自图1、2和5-10的图中所示的质粒图。

9.权利要求1的质粒载体，其中所述多核苷酸如SEQ ID NO: 3的第39-190位核苷酸所示。

10.分离的宿主细胞，其包含权利要求1的质粒载体。

11.权利要求10的宿主细胞，其中所述质粒载体整合到宿主细胞的染色体DNA中。

12.权利要求11的宿主细胞，其包含两个或更多个拷贝的所述质粒载体。

13.权利要求10的宿主细胞，其中所述质粒载体不整合到宿主细胞的染色体DNA中。

14.权利要求13的宿主细胞，其包含两个或更多个拷贝的所述质粒载体。

15.制备主细胞库的方法，该方法包括将权利要求1的质粒载体导入宿主细胞，选择包含所述质粒载体的宿主细胞的单克隆群体，培养所述克隆群体，确定来自所述培养物的细胞是否含有细菌、病毒、真菌和/或支原体，并且，如果都没有检测到，则在冷冻条件下在一个或多个容器中保存来自所述培养物的细胞。

16.权利要求15的方法，其中所述质粒载体包含图1或2的质粒图。

17.权利要求16的方法，其中所述质粒载体包含图6、7、8、9或10的质粒图。

18.权利要求15的方法，其中所述细菌、病毒、真菌和/或支原体是选自下组的一个或多个成员：人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、人巨细胞病毒、人嗜T淋巴细胞病毒、EB病毒、人单纯疱疹病毒、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

19.通过权利要求15的方法生产的主细胞库。

20.制备工作细胞库的方法，该方法包括培养来自权利要求19的主细胞库的细胞，并且在冷冻下在一个或多个容器中保存来自所述培养物的细胞。

21.权利要求20的方法，其中所述质粒载体包含图1或2的质粒图。

22.权利要求20的方法，其中所述质粒载体包含图6、7、8、9或10的质粒图。

23.权利要求20的方法，其中测试所述培养的细胞的细菌、病毒、真菌和/或支原体，并且，如果都没有检测到，则在冷冻下保存来自所述培养物的细胞。

24.通过权利要求20的方法生产的工作细胞库。

25.包含权利要求10的宿主细胞的主细胞库。

26.权利要求25的主细胞库，其中所述细胞是在小瓶中，所述小瓶含有约10⁷个细胞/小瓶，并且不含可检测水平的细菌、病毒、支原体和真菌。

27.权利要求26的主细胞库，其包含200个或更多个小瓶的所述细胞。

28.权利要求25的主细胞库，其包含CHO-DXB11细胞，所述细胞包含特征在于图1的质粒图的质粒载体。

29.权利要求25的主细胞库，其包含CHO-DXB11细胞，所述细胞包含特征在于图2的质粒图的质粒载体。

30.包含权利要求10的宿主细胞的工作细胞库。

31.权利要求30的工作细胞库，其中所述细胞是在小瓶中，所述小瓶含有约10⁷个细胞/小瓶，并且不含可检测水平的细菌、病毒、支原体和真菌。

32.权利要求31的工作细胞库，其包含200个或更多个小瓶的所述细胞。

33.权利要求30的工作细胞库，其包含CHO-DXB11细胞，所述细胞包含特征在于图1的质粒图的质粒载体。

34.权利要求30的工作细胞库，其包含CHO-DXB11细胞，所述细胞包含特征在于图2的质粒图的质粒载体。

35.用于在宿主细胞中表达由与启动子可操作性缔合的基因编码的靶多肽的方法，所述基因编码抗-IGF1R、抗-IL-23 p19、抗-IL23受体、抗-IL-17、抗-PD1或抗-HGF抗体免疫球蛋白轻链或重链，所述链任选融合于免疫球蛋白恒定区，该方法包括将权利要求1的质粒载体导入宿主细胞，并且在表达靶多肽的条件下培养所述宿主细胞。

36.权利要求35的方法，进一步包括纯化所述靶多肽。

37.权利要求35的方法，其中所述基因编码包含SEQ ID NO: 6、8-11、18或26的第20-128位氨基酸或SEQ ID NO 31的轻链免疫球蛋白的CDR-L1、CDR-L2 和CDR-L3；或其中所述基因编码包含SEQ ID NO: 7、12、13、14或22的第20-137位氨基酸或SEQ ID NO: 30的重链免疫球蛋白的CDR-H1、CDR-H2 和CDR-H3。

38.权利要求37的方法，其中所述基因编码SEQ ID NO: 8、9、10或11的第20-128位氨基酸。

39.权利要求37的方法，其中所述基因编码SEQ ID NO: 12或13的第20-137位氨基酸。

40.权利要求37的方法，进一步包括分离所述多肽。

41.权利要求37的方法，其中所述基因、启动子和多核苷酸是在质粒载体中，所述质粒载体的特征在于图1的质粒图。

42.权利要求41的方法，其中所述特征在于图1的质粒图的质粒载体包含SEQ ID NO: 35的核苷酸序列。

43.权利要求42的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

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