JP2012508563A - 抗IGF1R発現の増強のためのβGl−IGGイントロン - Google Patents
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Abstract
本発明は、例えば免疫グロブリンのような標的遺伝子の発現の増強のためのポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドを使用する標的遺伝子の発現方法も含まれる。
Description
本発明は、プロモーター/ベータ−グロビン免疫グロビンガンマ(βGl−IgG)イントロン構築物に機能的に連結された標的遺伝子を含むポリヌクレオチドおよびそのような標的遺伝子の発現方法に関する。
抗体、抗体フラグメントおよび他の治療用タンパク質の臨床的および商業的成功は哺乳類細胞培養内での非常に大規模な製造の必要性を招いた。これは全体的な製造能力の急速な拡大、リアクターのサイズの増加(20,000Lまで)、ならびにプロセス効率の改善およびそれに伴う製造コスト削減のための努力の著しい増大を招いた。
例えば、ほとんどの抗体療法は長期にわたって高い用量を要し、これは患者1人当たり大量の精製製品を必要とする。したがって、抗体製造の需要を満たすための製造能力はかなりの難題であり、高い生産性の製造方法を得ることが望ましい。
抗体または他のタンパク質のインビボ生産レベルを改善するための1つの手段は、標準的な構築物の場合と比較して増加したレベルのタンパク質産生を引き起こす新規ポリヌクレオチド発現構築物を作製することである。本発明は当技術におけるこの要求に対処するものである。
発明の概括
本発明は1つには、ベータ−グロビンスプライスドナー部位および免疫グロブリンガンマスプライスアクセプター部位(それらの部位は約125ヌクレオチドにより分離されている)を含む単離されたβGl−IgGイントロンポリヌクレオチドを提供する。βGl−IgGイントロンに加えて、本発明は、標的ポリペプチドを高レベルで発現させるための使用方法を含む。プラスミド、宿主細胞、マスター細胞バンクおよび実施用細胞バンクも本発明の一部を構成する。
本発明は1つには、ベータ−グロビンスプライスドナー部位および免疫グロブリンガンマスプライスアクセプター部位(それらの部位は約125ヌクレオチドにより分離されている)を含む単離されたβGl−IgGイントロンポリヌクレオチドを提供する。βGl−IgGイントロンに加えて、本発明は、標的ポリペプチドを高レベルで発現させるための使用方法を含む。プラスミド、宿主細胞、マスター細胞バンクおよび実施用細胞バンクも本発明の一部を構成する。
例えば、本発明の1つの実施形態においては、該ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列CAGGTAAGTTTA(配列番号4)を含むベータ−グロビンスプライスドナー部位と、ヌクレオチド配列TTTCTCTCCACAGGC(配列番号5)を含む免疫グロブリンガンマスプライスアクセプター部位とを含み、ここで、それらの部位は約125ヌクレオチドにより分離されており、例えば、該スプライスドナー部位および該スプライスアクセプター部位は配列
(配列番号3のヌクレオチド51−175)により分離されている。本発明の1つの実施形態においては、βGl−IgGイントロンは遺伝子の上流、かつ、該遺伝子に機能的に連結されているプロモーターの下流に位置する。該遺伝子は、任意のタイプの遺伝子、例えば免疫グロブリンの遺伝子であることが可能であり、例えば、この場合、該免疫グロブリンは、IGF1R、IL−23 p19、IL23受容体(その任意のサブユニット、例えばIL−12β1またはIL−23R)、IL−17A、PD1またはHGFに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントの軽鎖可変領域(場合によってはシグナルペプチドを含む)または重鎖可変領域(場合によってはシグナルペプチドを含む)またはそれらの両方であり、例えば、この場合、該遺伝子は、配列番号6、8〜11、18もしくは26のアミノ酸20−128または配列番号31を含む軽鎖免疫グロブリンのCDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3をコードしており、ならびに/または、この場合、該遺伝子は、配列番号7、12、13、14もしくは22のアミノ酸20−137または配列番号30を含む重鎖免疫グロブリンのCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3をコードしている。該βGl−IgGイントロンは任意のポリヌクレオチド、例えばベクター、例えばプラスミドベクターまたはウイルスベクター内に配置されうる。
本発明はその範囲内に、図1〜10のいずれかのプラスミドベクター地図により特徴づけられるβGl−IgGイントロンを含む単離されたプラスミドを含み、例えば、この場合、該プラスミドは配列番号3のヌクレオチド配列のβGl−IgGイントロンヌクレオチド39−190を含む。
本発明のβGl−IgGイントロンを含む宿主細胞も本発明の範囲内である。例えば、該宿主細胞においては、該βGl−IgGイントロンポリヌクレオチドは宿主細胞の染色体DNA内に組込まれることが可能であり、あるいは組込まれないことが可能である。さらに、該宿主細胞は該ポリヌクレオチドの高コピー数、例えば、細胞当たり2以上のコピーを含有しうる。
マスター細胞バンク(MCB)も本発明の一部を構成する。したがって、本発明は、本発明のβGl−IgGイントロンポリヌクレオチド(例えば、図1〜10のいずれかに示されているプラスミドベクター)を宿主細胞(例えば哺乳類細胞、例えばCHO細胞、例えばCHO−DG44、CHO−K1またはCHO−DXB11)内に導入し、該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞の単一のクローン集団を選択し、該クローン集団を培養し、該培養からの細胞が細菌、ウイルス、真菌および/またはマイコプラズマを含有するかどうかを判定し、何も検出されなかった場合には、該培養からの細胞を1以上の容器内に冷却下で保存することを含む、マスター細胞バンクの製造方法を含む。本発明の1つの実施形態においては、該マスター細胞バンクは、生物学的汚染物、例えば細菌、ウイルス、真菌および/またはマイコプラズマを含有しない。該マスター細胞バンクは冷却下で保存されうる。マスター細胞バンク(例えば、MCBの記載製造方法により製造されたもの)も本発明の一部である。本発明は更に、本発明のマスター細胞バンクからの細胞を培養し、該培養からの細胞を1以上の容器内に冷却下で保存することによる実施用細胞バンク(WCB)の製造方法を提供する。MCBの製造方法と同様に、この方法は、細菌、ウイルス、真菌および/またはマイコプラズマに関して該WCBを試験するための、そして何も検出されなかった場合には該培養からの細胞を冷却下で保存するための工程を含みうる。実施用細胞バンク(例えば、WCBの記載製造方法により製造されたもの)も本発明の一部である。例えば、本発明の1つの実施形態においては、該MCBまたはWCBにおいて、該細胞は、バイアル1個当たり約107個の細胞を含むバイアル(例えば、約200個以上)内に存在し、検出可能レベルの細菌、ウイルス、マイコプラズマおよび真菌を含有しない。
本発明はまた、プロモーターに機能的に連結された遺伝子によりコードされる標的ポリペプチドを宿主細胞(例えば哺乳類細胞、例えばCHO細胞、例えばCHO−K1、CHO−DXB11またはCHO−DG44細胞)内で発現させるための方法であって、該標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えばプラスミドpAIG1FRLCb2V1、例えば配列番号35のヌクレオチド配列を含む該プラスミド)と該プロモーターとの間にベータ−グロビンスプライスドナー部位および免疫グロブリンガンマスプライスアクセプター部位(ここで、これらの部位は約125ヌクレオチドにより分離されている)を含むβGl−IgGイントロンポリヌクレオチドを、該標的ポリペプチドが発現される条件下、宿主細胞内に導入し、場合によっては該標的ポリペプチドを精製することを含む方法を提供する。本発明の1つの実施形態においては、該ベータ−グロビンスプライスドナー部位はヌクレオチド配列CAGGTAAGTTTA(配列番号4)を含み、該免疫グロブリンスプライスアクセプター部位はヌクレオチド配列TTTCTCTCCACAGGC(配列番号5)を含み、ここで、該スプライスドナー部位および該スプライスアクセプター部位は配列
(配列番号3のヌクレオチド51−175)により分離されている。本発明の1つの実施形態においては、該遺伝子は免疫グロブリンであり、例えば、この場合、該免疫グロブリンは、IGF1Rに特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域または重鎖可変領域であり、例えば、この場合、該遺伝子は、配列番号6、8〜11、18もしくは26のアミノ酸20−128または配列番号31を含む軽鎖免疫グロブリンのCDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3をコードしており、または、この場合、該遺伝子は、配列番号7、12、13、14もしくは22のアミノ酸20−137または配列番号30を含む重鎖免疫グロブリンのCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3をコードしている。
発明の詳細な説明
本発明は1つには、通常の発現構築物と比較して特に高いレベルで標的遺伝子、例えば免疫グロブリン軽鎖または重鎖が発現されうる発現構築物を提供する。例えば、本発明は、プロモーターに機能的に連結された、発現されるべき標的遺伝子(例えば、免疫グロブリン軽鎖および/または重鎖遺伝子)を含むポリヌクレオチド(例えば、プラスミドベクター)を含み、ここで、該遺伝子とプロモーターとの間に、ベータ−グロビンイントロンスプライスドナー部位およびそれに続く約125ヌクレオチドおよびそれに続く免疫グロブリンガンマイントロンアクセプター部位を含む構築物が存在する。本発明はまた、本発明の発現構築物を使用する該標的遺伝子の発現方法を含む。
本発明は1つには、通常の発現構築物と比較して特に高いレベルで標的遺伝子、例えば免疫グロブリン軽鎖または重鎖が発現されうる発現構築物を提供する。例えば、本発明は、プロモーターに機能的に連結された、発現されるべき標的遺伝子(例えば、免疫グロブリン軽鎖および/または重鎖遺伝子)を含むポリヌクレオチド(例えば、プラスミドベクター)を含み、ここで、該遺伝子とプロモーターとの間に、ベータ−グロビンイントロンスプライスドナー部位およびそれに続く約125ヌクレオチドおよびそれに続く免疫グロブリンガンマイントロンアクセプター部位を含む構築物が存在する。本発明はまた、本発明の発現構築物を使用する該標的遺伝子の発現方法を含む。
分子生物学
本発明においては、当技術分野の技量の範囲内の通常の分子生物学、微生物学および組換えDNA技術が用いられうる。そのような技術は文献中に十分に説明されている。例えば、Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(本明細書中では「Sambrookら,1989」);DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and Il(D.N.Glover編.1985);Oligonucleotide Synthesis(MJ.Gaitら.1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & SJ.Higgins編(1985));Transcription And Translation(B.D.Hames & SJ.Higgins編,(1984));Animal Cell Culture(R.I.Freshney編,(1986));Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,(1986));B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubelら,(編),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(1994)を参照されたい。
本発明においては、当技術分野の技量の範囲内の通常の分子生物学、微生物学および組換えDNA技術が用いられうる。そのような技術は文献中に十分に説明されている。例えば、Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(本明細書中では「Sambrookら,1989」);DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and Il(D.N.Glover編.1985);Oligonucleotide Synthesis(MJ.Gaitら.1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & SJ.Higgins編(1985));Transcription And Translation(B.D.Hames & SJ.Higgins編,(1984));Animal Cell Culture(R.I.Freshney編,(1986));Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,(1986));B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubelら,(編),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(1994)を参照されたい。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」はDNAおよびRNAを含む。
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は核酸、例えばDNAまたはRNA中の一連のヌクレオチドであり、2以上のヌクレオチドの鎖のいずれかを意味する。
発現産物、例えばRNA、ポリペプチド、タンパク質または酵素を「コード」する配列または「コード配列」は、発現されると該産物の産生をもたらすヌクレオチド配列である。
「遺伝子」なる語は、1以上のRNA分子またはタンパク質の全部または一部を含むリボヌクレオチドまたはアミノ酸の特定の配列をコードする又はそれに対応するDNAを含む。遺伝子は、アミノ酸配列へと翻訳されてもされなくてもよいDNAまたはRNAから転写されうる。「標的遺伝子」または「標的ポリヌクレオチド」は、例えば宿主細胞における発現のための発現構築物内に該ポリヌクレオチドを導入することにより、例えば実施者が発現させることを意図する又は発現させている標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたポリペプチド」などの語は、細胞において又は組換えDNA発現系において通常見出される他の成分から部分的または完全に分離された、それぞれ、ポリヌクレオチド(例えば、RNAまたはDNA分子)またはポリペプチドを含む。これらの成分には、細胞膜、細胞壁、リボソーム、ポリメラーゼ、血清成分および外来性ゲノム配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本発明の1つの実施形態においては、実質的に均一な分子組成物であるが、ある程度の不均一性を伴いうる。
本明細書中で用いるDNAの「増幅」は、DNA配列の混合物中の特定のDNA配列の濃度を増加させるためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用を含む。PCRの説明に関しては、例えば、Saikiら,Science(1988)239:487を参照されたい。
本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」なる語は、遺伝子、mRNA、cDNAまたは関心のある他の核酸をコードするゲノムDNA分子、cDNA分子またはmRNA分子にハイブリダイズ可能でありうる、一般には少なくとも10(例えば、10、11、12、13または14)、好ましくは少なくとも15(例えば、15、16、17、18または19)、より好ましくは少なくとも20ヌクレオチド(例えば、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30)、好ましくは100ヌクレオチド以下(例えば、40、50、60、70、80または90)の核酸を含む。オリゴヌクレオチドは、例えば、32P−ヌクレオチド、3H−ヌクレオチド、14C−ヌクレオチド、35S−ヌクレオチドの取り込みにより、または例えばビオチンのような標識が共有結合したヌクレオチドの取り込みにより、標識されうる。本発明の1つの実施形態においては、標識されたオリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用されうる。もう1つの実施形態においては、オリゴヌクレオチド(そのうちの一方または両方が標識されうる)は、完全長または断片の遺伝子をクローニングするための又は核酸の存在を検出するためのPCRプライマーとして使用されうる。一般に、オリゴヌクレオチドは、例えば核酸合成装置により、合成的に製造される。
いずれの核酸の配列も、当技術分野で公知のいずれかの方法(例えば、化学的配列決定または酵素的配列決定)により配列決定されうる。DNAの「化学的配列決定」は、例えば、個々の塩基特異的反応を用いてDNAがランダムに切断されるMaxamおよびGilbert(1977)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:560)の方法のような方法を含む。DNAの「酵素的配列決定」は、例えば、Sanger(Sangerら,(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463)の方法のような方法を含みうる。
本発明の核酸は、本発明の1つの実施形態においては、天然調節(発現制御)配列に隣接していることが可能であり、あるいはプロモーター、内部リボソーム進入部位(IRES)および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答要素、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、5’−および3’−非コード領域などを含む異種配列に結合していることが可能である。
「プロモーター」または「プロモーター配列」は、本発明の1つの実施形態においては、細胞内で(例えば、直接的に又は他のプロモーター結合タンパク質もしくは物質を介して)RNAポリメラーゼに結合しコード配列(例えば免疫グロブリン、例えば抗IGF1R免疫グロブリン)の転写を開始させうるDNA調節領域である。プロモーター配列は、一般に、その3’末端において、転写開始部位に結合しており、いずれかのレベルで転写を開始させるのに必要な最少数の塩基または要素を含むよう上流(5’方向)に伸長している。該プロモーター配列内には、転写開始部位(簡便には、例えば、ヌクレアーゼS1でのマッピングにより定められる)、およびRNAポリメラーゼの結合をもたらすタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)が存在しうる。該プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含む他の発現制御配列に、または本発明の核酸に機能的に結合していることが可能である。遺伝子発現を制御するために使用されうるプロモーターには、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(米国特許第5,385,839号および第5,168,062号)、SV40初期プロモーター領域(Benoistら,(1981)Nature 290:304−310)、ラウス肉腫ウイルスの3’長末端反復配列に含有されるプロモーター(Yamamotoら,(1980)Cell 22:787−797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1441−1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら,(1982)Nature 296:39−42);原核生物発現プロモーター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター(Villa−Komaroffら,(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3727−3731)、またはtacプロモーター(DeBoerら,(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21−25)(Scientific American(1980)242:74−94における“Useful proteins from recombinant bacteria”も参照されたい);および酵母または他の真菌由来のプロモーター要素、例えばGal 4プロモーター、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーターまたはアルカリホスファターゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。
コード配列が細胞内の転写または翻訳制御配列「の制御下にある」、「に機能的に結合されている」または「に機能的に連結されている」または「に作動可能様態で結合されている」と言えるのは、該配列がRNA、例えばmRNAへの該コード配列のRNAポリメラーゼ媒介性転写を導く場合であり、ついで該RNAは(それがイントロンを含有する場合には)トランスRNAスプライシングされることが可能であり、場合によっては、該コード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳されうる。プロモーターがβGl−IgGイントロンに機能的に連結されていると言えるのは、該βGl−IgGイントロンの非存在下の該プロモーターと比較して増加した、該プロモーターからの発現のレベルを、該イントロンがもたらす場合である。
「発現する」および「発現」なる語は、例えば、対応遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによりタンパク質を産生させることにより、遺伝子、例えばRNAまたはDNA内の情報が現れることを可能にする又はもたらすこと意味する。DNA配列は細胞内で又は細胞により発現されて、「発現産物」、例えばRNA(例えばmRNA)またはタンパク質を生成しうる。該発現産物自体も該細胞により「発現される」と言うことが可能である。
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」なる語は、核酸が宿主細胞に導入されて宿主細胞を形質転換し、場合によっては、該核酸によりコードされる遺伝子の発現および/または該導入核酸の複製を促進することを媒介しうるビヒクル(例えば、プラスミド)を含む。本発明の1つの実施形態においては、該ベクターは、自律複製性核酸、例えば環状プラスミドである。
「形質転換」なる語は細胞内への核酸の導入を意味する。該用語は、抗IGF1R、抗IL23、抗IL23R、抗IL17、抗PD1もしくは抗HGF抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントをコードする核酸の、細胞内への導入を含む。該導入遺伝子または配列は「クローン」と称されうる。該導入DNAまたはRNAを受け入れる宿主細胞は「形質転換」され、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるDNAまたはRNAは、宿主細胞と同じ属もしくは種の細胞または異なる属もしくは種の細胞を含む任意の起源に由来することが可能である。プラスミドは、当技術分野で一般に公知である多数の方法のいずれかにより細胞内に導入されうる。例えば、本発明のプラスミドは、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、DEAE−デキストラン法またはリポソーム法により細胞を形質転換するために使用されうる。
「宿主細胞」なる語は、該細胞による物質の産生、例えば、該細胞による遺伝子、DNAもしくはRNA配列、タンパク質または酵素の発現または複製のために任意の様態で選択され、修飾され、トランスフェクトされ、形質転換され、成長され又は使用され若しくは操作される任意の生物の任意の細胞を含む。宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、例えばCHO−K1細胞(ATCCアクセッション番号CRL−9618)、CHO−DG44細胞およびCHO−DXB−11細胞が含まれる。
「発現構築物」は、標的遺伝子の発現を駆動しうるポリヌクレオチドであり、ここで、該標的遺伝子は該ポリヌクレオチド内にコードされている。例えば、該遺伝子がプロモーター(例えば、CMVプロモーター)に機能的に連結されており、それらの間にβGl−IgGイントロンが位置する。
「プロモーター/βGl−IgGイントロン」は、βGl−IgGイントロンに機能的に連結されたプロモーターである。該βGl−IgGイントロンは、該βGl−IgGイントロンの非存在下より高いレベルの、該プロモーターからの発現を引き起こす。
「βGl−IgGイントロン」は、スプライスドナー部位(例えば、ベータ−グロビン)とスプライスアクセプター部位(例えば、IgG)とを含むイントロンである。
本発明の1つの実施形態においては、発現構築物は、コザックコンセンサス配列、例えばgccgccaccatgg(配列番号1)またはgccgccaccatg(配列番号2)を含む。
「発現系」なる語は、宿主細胞および和合性ベクターを意味し、これらは、該ベクターにより運ばれ該宿主細胞内に導入されるタンパク質または核酸を適当な条件下で発現しうる。一般的な発現系には、大腸菌(E.coli)宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳類宿主細胞およびベクターが含まれる。前記のとおり、宿主細胞には、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞、例えばCHO−K1またはDXB−11;そしてまた、HeLa細胞およびNIH 3T3細胞およびNSO細胞(非Ig産生性マウス骨髄腫細胞系)が含まれる。
本発明のプラスミドベクターには、当技術分野で公知の幾つかの増幅可能なマーカーのいずれかが含まれうる。増幅可能なマーカーの使用はManiatis,Molecular Biology:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY(1989)に記載されている。薬物耐性哺乳類細胞における遺伝子増幅のための有用な選択マーカーには、DHFR(MTX(メトトレキセート)耐性)(Altら,J.Biol.Chem.253:1357(1978);Wiglerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:3567(1980));メタロチオネイン(カドミウム耐性)(Beachら,Proc Natl.Acad.Sci.USA 78:210(1981));CAD(N−(ホスホノアセチル)−l−アスパルタート(PALA)耐性)(Wahlら,J.Biol.Chem.254:8679(1979));アデニル酸デアミナーゼ(コホルマイシン耐性)(Debatisseら,Mol.Cell.Biol.6:1776(1986));IMP 5’−デヒドロゲナーゼ(ミコフェノール酸耐性)(Hubermanら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:3151(1981))および当技術分野で公知の他のマーカー(例えば、Kaufmanら,Meth.Enzymology 185:537−566(1988)において概説されている)が含まれる。
本発明は、例えば本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントのような、本発明のプラスミドによりコードされる標的遺伝子をコードするアミノ酸またはヌクレオチド配列への任意の表面的な又は若干の修飾を想定している。ポリヌクレオチド配列の「配列保存的変異体」は、与えられたコドンにおける1以上のヌクレオチドの変化が、その位置でコードされるアミノ酸の変化を全く引き起こさないものである。本発明の標的遺伝子の機能保存的変異体も本発明で想定される。「機能保存的変異体」は、類似特性を有するアミノ酸でのアミノ酸の置換(何らこれに限定されるものではない)を含む、該ポリペプチドの全体的コンホメーションおよび機能を変化させることなくタンパク質内の1以上のアミノ酸残基が改変されているものである。類似特性を有するアミノ酸は当技術分野でよく知られている。例えば、交換可能でありうる極性/親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、トレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、交換可能でありうる無極性/親水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ、交換可能でありうるアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、交換可能でありうる塩基性アミノ酸には、ヒスチジン、リシンおよびアルギニンが含まれる。アミノ酸配列の保存的置換は、1つのサブタイプ(例えば、極性/親水性)のアミノ酸が同一サブタイプの別のアミノ酸で置換される置換を意味し、本発明の1つの実施形態においては、保存的に置換されたポリペプチドは、実質的に同じレベルの生物活性を保有する。
本発明は、標的遺伝子をコードする核酸とそれにハイブリダイズする核酸とを含むプラスミドを含む。本発明の1つの実施形態においては、該核酸は、低いストリンジェンシー条件下、より好ましくは中等度のストリンジェンシー条件下、最も好ましくは高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液イオン強度の適当な条件下(Sambrookら,前掲を参照されたい)で他方の核酸分子にアニールしうる場合、核酸分子は、別の核酸分子、例えばcDNA、ゲノムDNAまたはRNAに「ハイブリダイズ可能」である。温度およびイオン強度の条件は該ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。典型的な低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件には、本発明の1つの実施形態においては、55℃、5×SSC、0.1% SDS、0.25% 乳および無ホルムアミド;または30% ホルムアミド、5×SSC、0.5% SDSを含む。典型的な中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、5×または6×SSCを含有する40% ホルムアミド中でハイブリダイゼーションを行うこと以外は、低いストリンジェンシー条件に類似している。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、50% ホルムアミド、5×または6×SSC中、そして場合によっては、より高い温度(例えば、57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃または68℃)でハイブリダイゼーションを行うこと以外は、低いストリンジェンシー条件に類似している。一般に、SSCは0.15M NaClおよび0.015M クエン酸Naである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチが可能であるが、ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補的配列を含有することを要する。核酸のハイブリダイゼーションのための適当なストリンジェンシーは核酸の長さ及び相補性の度合、当技術分野でよく知られた変数に左右される。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合が大きくなればなるほど、それらの核酸がハイブリダイズしうるストリンジェンシーは高くなる。100ヌクレオチド長を超えるハイブリッドの場合、融解温度を計算するための式が導かれている(Sambrookら,前掲,9.50−9.51を参照されたい)。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要となり、該オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する(Sambrookら,前掲,11.7−11.8)。
BLASTアルゴリズム(この場合、該アルゴリズムのパラメーターは、それぞれの基準配列の全長にわたってそれぞれの配列間で最大の一致が得られるように選択される)により比較を行った場合に本発明の基準ヌクレオチドおよびアミノ酸配列(例えば、配列番号6〜31のいずれか)に対して少なくとも約70%同一である、好ましくは少なくとも約80%同一である、より好ましくは少なくとも約90%同一である、最も好ましくは少なくとも約95%(例えば、95%、96%、97%、98%、99%、100%)同一であるアミノ酸配列を含む標的ポリペプチドをコードする標的ヌクレオチド配列を含むプラスミドも、本発明に含まれる。BLASTアルゴリズム(この場合、該アルゴリズムのパラメーターは、それぞれの基準配列の全長にわたってそれぞれの配列間で最大の一致が得られるように選択される)により比較を行った場合に本発明の基準アミノ酸配列(例えば、配列番号6〜31のいずれか)に対して少なくとも約70%類似している、好ましくは少なくとも約80%類似している、より好ましくは少なくとも約90%類似している、最も好ましくは少なくとも約95%(例えば、95%、96%、97%、98%、99%、100%)類似しているアミノ酸配列を含むポリペプチドも、本発明に含まれる。
配列同一性は、比較されている2つの配列のヌクレオチドまたはアミノ酸間の厳密な一致(マッチ)を意味する。配列類似性は、生化学的に関連している非同一アミノ酸間の一致に加えて、比較されている2つのポリペプチドのアミノ酸間の厳密な一致の両方を意味する。類似特性を共有しており交換可能でありうる生化学的に関連しているアミノ酸は前記で説明されている。
BLASTアルゴリズムに関する以下の参考文献を参照により本明細書に組み入れることとする:BLASTアルゴリズム:Altschul,S.F.ら,(1990)J.Mol.Biol.215:403−410;Gish,W.ら,(1993)Nature Genet.3:266−272;Madden,T.Lら,(1996)Meth.Enzymol.266:131−141;Altschul,S.F.ら,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389−3402;Zhang,J.ら,(1997)Genome Res.7:649−656;Wootton,J.C.ら,(1993)Comput.Chem.17:149−163;Hancock,J.M.ら,(1994)Comput.Appl.Biosci.10:67−70;アライメントスコアリング系:Dayhoff,M.O.ら,“A model of evolutionary change in proteins.”in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(編),pp.345−352,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC;Schwartz,R.M.ら,“Matrices for detecting distant relationships.”in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)vol.5,suppl.3.“M.O.Dayhoff(編),pp.353−358,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC;Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219:555−565;States,D.J.ら,(1991)Methods 3:66−70;Henikoff,S.ら,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915−10919;Altschul,S.F.ら,(1993)J.Mol.Evol.36:290−300;アライメント統計学:Karlin,S.ら,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−2268;Karlin,S.ら,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877;Dembo,A.ら,(1994)Ann.Prob.22:2022−2039;およびAltschul,S.F.“Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments.”in Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai編),(1997)pp.1−14,Plenum,New York。
イントロン
本発明は、ベータ−グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンスプライスアクセプターを含むβGl−IgGイントロンに機能的に連結されたプロモーター(ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーター−調節領域)(そのプロモーター/イントロンの組合せは標的遺伝子、例えば免疫グロブリンに機能的に連結されている)を含むポリヌクレオチド、例えばベクター(例えばプラスミド)を含む。本発明のポリヌクレオチドを使用するそのような標的遺伝子の発現方法も本発明の一部である。本明細書に記載されているとおり、CMVプロモーターがβGl−IgGイントロン(ベータ−グロビンスプライスドナー/Ig.スプライスアクセプター)に連結されている場合に、ヒトCMVプロモーターからの例えば抗IGF1R免疫グロブリンのような遺伝子の発現が著しく増加することが、本発明において見出された。
本発明は、ベータ−グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンスプライスアクセプターを含むβGl−IgGイントロンに機能的に連結されたプロモーター(ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーター−調節領域)(そのプロモーター/イントロンの組合せは標的遺伝子、例えば免疫グロブリンに機能的に連結されている)を含むポリヌクレオチド、例えばベクター(例えばプラスミド)を含む。本発明のポリヌクレオチドを使用するそのような標的遺伝子の発現方法も本発明の一部である。本明細書に記載されているとおり、CMVプロモーターがβGl−IgGイントロン(ベータ−グロビンスプライスドナー/Ig.スプライスアクセプター)に連結されている場合に、ヒトCMVプロモーターからの例えば抗IGF1R免疫グロブリンのような遺伝子の発現が著しく増加することが、本発明において見出された。
例えば、本発明の1つの実施形態においては、該プロモーター/イントロン構築物は、それが機能的に連結されている標的遺伝子の上流に位置する。該プロモーター/イントロンに標的遺伝子を機能的に連結することを含む該標的遺伝子の発現を増加させるための方法も本発明の範囲内である。
(配列番号3)を含む。該ベータグロビンスプライスドナー部位は実線の下線で示されており、該免疫グロブリンスプライスアクセプターは破線の下線で示されている。本発明の1つの実施形態においては、該ベータグロビンスプライスドナー部位はヌクレオチド配列CAGGTAAGTTTA(配列番号4)を含む。本発明の1つの実施形態においては、該免疫グロブリンスプライスアクセプター部位は、例えばヌクレオチド配列TTTCTCTCCACAGGC(配列番号5)を含むIgG可変領域から誘導される。
(配列番号3のヌクレオチド39−190)を含む。
免疫グロブリン
本発明は、例えば免疫グロブリンのような標的遺伝子に機能的に結合されたプロモーター/イントロン構築物を含むポリヌクレオチド(例えば、プラスミド)を含む実施形態を含む。本発明の1つの実施形態においては、該免疫グロブリンは、場合によっては免疫グロブリン定常領域に連結された、抗IGF1R免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域を含む。
本発明は、例えば免疫グロブリンのような標的遺伝子に機能的に結合されたプロモーター/イントロン構築物を含むポリヌクレオチド(例えば、プラスミド)を含む実施形態を含む。本発明の1つの実施形態においては、該免疫グロブリンは、場合によっては免疫グロブリン定常領域に連結された、抗IGF1R免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域を含む。
本発明の1つの実施形態においては、該免疫グロブリン鎖は、以下に記載されているもののいずれか、例えば、以下の免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖のいずれか又はそのCDRのいずれかをコードしている。点線の下線が付された記号はシグナルペプチドをコードしている。実線の下線が付された記号はCDRをコードしている。無修飾文字はフレームワーク領域をコードしている。本発明の1つの実施形態においては、抗体鎖は、シグナルペプチドを欠く成熟フラグメントである。本発明の1つの実施形態においては、シグナルペプチドを含むプロセシングされていない免疫グロブリン鎖が発現され、宿主細胞から分泌され、それにより該シグナルペプチドがプロセシングされ除去されて成熟免疫グロブリン鎖を与える。そのような組成物および発現方法は本発明の一部を構成する。
以下の標的免疫グロブリンアミノ酸配列のいずれかをコードするポリヌクレオチドは本発明の一部を構成する。
国際出願公開第WO2003/100008号(これに各配列が開示されている;その全体を参照により本明細書に組み入れることとする)を参照されたい。
(配列番号14)
2C6 CDR−H1:GFTFDDYAMH(配列番号15)
2C6 CDR−H2:GISWNSGSKGYVDSVKG(配列番号16)
2C6 CDR−H3:DIRIGVAASYYFGMDV(配列番号17)
2C6軽鎖
2C6 CDR−H1:GFTFDDYAMH(配列番号15)
2C6 CDR−H2:GISWNSGSKGYVDSVKG(配列番号16)
2C6 CDR−H3:DIRIGVAASYYFGMDV(配列番号17)
2C6軽鎖
(配列番号18)
2C6 CDR−L1:RASQGISSVLA(配列番号19)
2C6 CDR−L2:DASSLES(配列番号20)
2C6 CDR−L3:QQFNSYPYT(配列番号21)
9H2重鎖
2C6 CDR−L1:RASQGISSVLA(配列番号19)
2C6 CDR−L2:DASSLES(配列番号20)
2C6 CDR−L3:QQFNSYPYT(配列番号21)
9H2重鎖
(配列番号22)
9H2 CDR−H1:GYTFTSYVMH(配列番号23)
9H2 CDR−H2:WINAGNGNTKYSQKFQG(配列番号24)
9H2 CDR−H3:GGMPVAGPGYFYYYGMDV(配列番号25)
9H2軽鎖
9H2 CDR−H1:GYTFTSYVMH(配列番号23)
9H2 CDR−H2:WINAGNGNTKYSQKFQG(配列番号24)
9H2 CDR−H3:GGMPVAGPGYFYYYGMDV(配列番号25)
9H2軽鎖
(配列番号26)
9H2 CDR−L1:RASQSVSRSYLA(配列番号27)
9H2 CDR−L2:GASSRAT(配列番号28)
9H2 CDR−L3:QQYGSSPWT(配列番号29)
重鎖免疫グロブリン可変領域#1.0配列
9H2 CDR−L1:RASQSVSRSYLA(配列番号27)
9H2 CDR−L2:GASSRAT(配列番号28)
9H2 CDR−L3:QQYGSSPWT(配列番号29)
重鎖免疫グロブリン可変領域#1.0配列
(配列番号31)
本発明の実施形態は、該ポリペプチド(例えば、プラスミド)が、2以上の免疫グロブリン、例えば、本明細書に記載のもののいずれかの組合せ(例えば、重鎖Ig.#1.0および軽鎖Ig.#1.0;またはLCCおよびHCA;またはLCFおよびHCA;またはLCCおよびHCB)に機能的に連結されたプロモーター/βGl−IgGイントロン構築物を含む実施形態を含む。
本発明の実施形態は、該ポリペプチド(例えば、プラスミド)が、2以上の免疫グロブリン、例えば、本明細書に記載のもののいずれかの組合せ(例えば、重鎖Ig.#1.0および軽鎖Ig.#1.0;またはLCCおよびHCA;またはLCFおよびHCA;またはLCCおよびHCB)に機能的に連結されたプロモーター/βGl−IgGイントロン構築物を含む実施形態を含む。
プラスミド
本発明は1つには、抗IGF1R重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。これらのプラスミドはpAIG1FRLCb2V1およびpAIG1FRLCb2V3である。これらのプラスミドは、LCFおよびHCAを含む抗体をコードしており、該抗体の発現を導く。該プラスミドの配列を以下に示す。
本発明は1つには、抗IGF1R重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。これらのプラスミドはpAIG1FRLCb2V1およびpAIG1FRLCb2V3である。これらのプラスミドは、LCFおよびHCAを含む抗体をコードしており、該抗体の発現を導く。該プラスミドの配列を以下に示す。
(配列番号36)
本発明は更に、1つには、抗IL23 p19重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。1つのプラスミドはpAIL23V1−Kである。pAIL23V1−Kプラスミドの配列を以下に示す。
本発明は更に、1つには、抗IL23 p19重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。1つのプラスミドはpAIL23V1−Kである。pAIL23V1−Kプラスミドの配列を以下に示す。
(配列番号44)
本発明は更に、1つには、抗IL23R重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。1つのプラスミドはpAIL23RV1である。pAIL23RV1プラスミドの配列を以下に示す。
本発明は更に、1つには、抗IL23R重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。1つのプラスミドはpAIL23RV1である。pAIL23RV1プラスミドの配列を以下に示す。
(配列番号45)
本発明は更に、1つには、抗IL17重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。1つのプラスミドはpAIL17AV1である。pAIL17AV1プラスミドの配列を以下に示す。
本発明は更に、1つには、抗IL17重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。1つのプラスミドはpAIL17AV1である。pAIL17AV1プラスミドの配列を以下に示す。
(配列番号46)
本発明は更に、1つには、抗PD1(プログラム死1)重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。1つのプラスミドはpAPD16V1−GAである。pAPD16V1−GAプラスミドの配列を以下に示す。
本発明は更に、1つには、抗PD1(プログラム死1)重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。1つのプラスミドはpAPD16V1−GAである。pAPD16V1−GAプラスミドの配列を以下に示す。
(配列番号47)
本発明は更に、1つには、抗HGF(肝細胞増殖因子)重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。1つのプラスミドはpAHGFV1である。pAHGFV1プラスミドの配列を以下に示す。
本発明は更に、1つには、抗HGF(肝細胞増殖因子)重鎖および軽鎖の高レベルの発現を示す単離されたプラスミドを提供する。1つのプラスミドはpAHGFV1である。pAHGFV1プラスミドの配列を以下に示す。
(配列番号48)
これらのプラスミドのプラスミド地図は本出願の図1〜10においても記載されている。
これらのプラスミドのプラスミド地図は本出願の図1〜10においても記載されている。
発現
発現されるべき標的遺伝子を含むベクター、例えばプラスミド(例えば図1〜10)は、当技術分野で公知の幾つかの方法のいずれかにより宿主細胞内に導入されうる。細胞壁バリヤーを伴わない細胞が宿主細胞として使用される場合、形質転換は、GrahamおよびVan der Eb,Virology,52:546(1978)に記載されているリン酸カルシウム沈殿法により行われうる。しかし、DNAを細胞内に導入するための他の方法、例えば核注入またはプロトプラスト融合も用いられうる。形質転換のための他の方法には、エレクトロポレーション、リポソーム形質転換およびDEAE−デキストラン形質転換が含まれる。
発現されるべき標的遺伝子を含むベクター、例えばプラスミド(例えば図1〜10)は、当技術分野で公知の幾つかの方法のいずれかにより宿主細胞内に導入されうる。細胞壁バリヤーを伴わない細胞が宿主細胞として使用される場合、形質転換は、GrahamおよびVan der Eb,Virology,52:546(1978)に記載されているリン酸カルシウム沈殿法により行われうる。しかし、DNAを細胞内に導入するための他の方法、例えば核注入またはプロトプラスト融合も用いられうる。形質転換のための他の方法には、エレクトロポレーション、リポソーム形質転換およびDEAE−デキストラン形質転換が含まれる。
原核生物細胞(例えば大腸菌(E.coli)、例えばBL21またはBD21DE3またはHB101またはDH1またはDH5)、または実質的な細胞壁構造体を含有する細胞(例えば、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae))が使用される場合には、形質転換は、Cohen,F.N.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)69:2110(1972)に記載されている塩化カルシウムを使用するカルシウム処理によるものでありうる。
本発明のベクター(例えば、図1〜10)を含む宿主細胞は、標的遺伝子の発現のための必要な特性を有するクローンを特定するために選択され、スクリーニングされうる。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞においては、最大発現を達成するための1つの一般的なアプローチは、突然変異細胞系の使用、およびコトランスフェクトされた選択マーカー、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)(Kaufmanら(1982)J.Mol.Biol.159:601−621;Schimkeら(1982)Natl.Cancer Inst.Monogr.60:79−86)に関する数ヶ月にわたる選択圧の漸増を含む。高い生産率を達成するためには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)陰性細胞系(例えば、CHO細胞系)(Urlaubら(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216−4220)を、発現すべき標的遺伝子と共に機能性DHFR遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換する。培地への漸増量のDHFRアンタゴニストメトトレキセート(MTX)の添加に応答して該ベクター挿入標的遺伝子の増幅が生じ、該組換え遺伝子の複数のコピーを含有するクローンまたは亜集団を生成させ、選択することが可能である(Wum(1990)Biologicals 18:159−164)。該遺伝子増幅法は、高い標的遺伝子コピー数および所望のタンパク質の高い生産率を示す安定な細胞系が得られるまでに、典型的には数ヶ月を要する。
本発明の1つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは宿主細胞(例えば、CHO、CHO−K1、CHO−D1 DXB11)DNA内に組込まれるか、または異所性(非組込み性)である。本発明の1つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは該細胞内に細胞当たり数コピー(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20コピー)で存在する。安定性を改善するために発現ベクターが宿主細胞のゲノムDNA内に組込まれている場合には、該宿主細胞のDNA内への組込み後に該ベクター配列が増幅されている細胞系を選択することにより、該ベクターDNAのコピー数、ひいては発現されうる産物の量を増加させることが可能である。
標的遺伝子を発現する細胞を増殖させるためには、当技術分野で公知の幾つかの細胞培養培地のいずれかが使用されうる。幾つかの商業的に入手可能な培地が利用可能である。治療用に使用されるタンパク質を発現させる場合には、動物産物非含有培地(例えば、無血清培地(SFM))が望ましいかもしれない。無血清培地内での増殖に細胞を適応させることが可能な幾つかの方法が当技術分野で公知である。例えば、直接適応は、細胞を血清補足培地から無血清培地へと単に移すことを含む。逐次適応またはウィーニング(weaning)は、細胞を血清補足培地から無血清培地へと幾つかの段階(例えば、25% SFM、50% SFM、75% SFM、ついで90% SFM(約3継代)、ついで100% SFM)で移すことを含む。逐次適応は、細胞に対する過酷さが直接適応より低い傾向にある。一般に、細胞を無血清培地に適応させるためには、該培養は中期対数期にあるべきであり、90%を超える生存率を示すべきであり、適応中より高い初期細胞接種物数で接種されるべきである。
また、本発明の宿主細胞を含有する細胞系はマスター細胞バンク(MCB)および実施用細胞バンク(WCB)中で保存されうる。典型的には、細胞系が多数の製造サイクルにわたって使用される場合には、マスター細胞バンクまたはマスターシードバンク(MSB)と実施細胞バンクとからなる2段式細胞保存系が確立されうる。細胞系は単一宿主細胞クローンから樹立され、この細胞系は、MCBを形成するために使用される。一般に、このMCBは、汚染物、例えば細菌、真菌、ウイルスおよびマイコプラズマに関して特徴づけられ、徹底的に試験されなければならない。MCBからの細胞のサンプルは、WCBを形成するために増殖されることが可能であり、これは、製造プロセスにおいて使用される前に細胞生存性に関して特徴づけられる。MCBまたはWCBにおける細胞はバイアル内で、例えば低温(例えば0℃以下、−20℃または−80℃)で保存されうる。
典型的には、該実施用細胞バンクは、保存前に数継代にわたって増殖されたマスターバンクのバイアルの1つからの細胞を含む。一般に、将来の細胞が必要な場合、それは該実施用細胞バンクから採取され、一方、該細胞培養内の遺伝的変異を回避するために低い継代数を有する細胞のストックが確保されるよう、該マスター細胞バンクは、必要な場合だけ使用される。
したがって、本発明は、細胞、例えばCHO細胞を本発明のプラスミドで形質転換し、該形質転換細胞の単一クローン集団を選択し(例えば、培養プレート上の単コロニー増殖)、該クローン集団を(例えば、液体増殖培地内で)培養し、該培養からの細胞が細菌、ウイルス、マイコプラズマおよび/または真菌を含有するかどうか、ならびに該培養の細胞が検出可能レベルのそのような因子を含有しないかどうかを判定し、そのような培養から採取された細胞を例えば1以上の別々の容器、例えばバイアル(例えば、バイアル当たり約107個の細胞を含む)内に冷却下(例えば、−80℃)で保存することを含む、マスター細胞バンクの製造方法を含む。本発明はまた、マスター細胞バンクからの細胞のサンプルを選択し、該細胞を増殖(成長)させ、該細胞を1以上の容器、例えばバイアル内に保存することを含む、実施用細胞バンクの製造方法を含む。実施用細胞バンクを製造するために使用される細胞も、該マスター細胞バンクの場合と同様に、細菌、ウイルス、マイコプラズマまたは真菌に関して試験されうる。
本発明はまた、本発明のいずれかの宿主細胞(例えば、本明細書に記載のもの)またはそれらからの1以上の細胞を含むマスター細胞バンクおよび/または実施用細胞バンクを含む。マスター細胞バンクまたは実施用細胞バンク内の細胞は、数百個(例えば、100、200、500、700、1000または2000バイアル以上)の容器、例えばバイアル(例えば、ガラスバイアル)内に冷却下(例えば、0℃以下、−20℃または−80℃)で保存されうる。
AP(R)
開始:3965 終結:4828(相補的)
VDJ
開始:5824 終結:6251
19D12ハイブリドーマのIGFR1のVDJ
IgG1
開始:6241 終結:7231
IgG1非ゲノム領域
DHFR cDNA
開始:601 終結:1347(相補的)
SV40 t Agイントロン
開始:11740 終結:600
Kap
開始:9898 終結:10233(相補的)
hu−抗IGFR遺伝子のカッパ鎖
VJ
開始:10234 終結:10614(相補的)
軽鎖に関するhu−抗IGFR遺伝子のVJドメイン
pBR322
開始:2811 終結:3019(相補的)
pBR322
開始:3020 終結:5033
TK−ヒグロマイシンseq
開始:7540 終結:9549(相補的)
Union U−3におけるTK−ヒグロマイシン配列
ベータグロビンポリAシグナル
開始:7256 終結:7494
ベータグロビンpAシグナル
開始:9642 終結:9890(相補的)
SV40ポリA
開始:11493 終結:11741
MMTV−LTR
開始:1348 終結:2810(相補的)
CMV
開始:10801 終結:11455(相補的)
CMV
開始:5069 終結:5723
T7プロモーター/プライミング部位
開始:5723 終結:5742
T7プロモーター/プライミング部位
開始:10782 終結:10801(相補的)
pBR ORI
開始:3207 終結:3207
pAIG1FRV3のプラスミド地図。
開始:3965 終結:4828(相補的)
VDJ
開始:5824 終結:6251
19D12ハイブリドーマのIGFR1のVDJ
IgG1
開始:6241 終結:7231
IgG1非ゲノム領域
DHFR cDNA
開始:601 終結:1347(相補的)
SV40 t Agイントロン
開始:11740 終結:600
Kap
開始:9898 終結:10233(相補的)
hu−抗IGFR遺伝子のカッパ鎖
VJ
開始:10234 終結:10614(相補的)
軽鎖に関するhu−抗IGFR遺伝子のVJドメイン
pBR322
開始:2811 終結:3019(相補的)
pBR322
開始:3020 終結:5033
TK−ヒグロマイシンseq
開始:7540 終結:9549(相補的)
Union U−3におけるTK−ヒグロマイシン配列
ベータグロビンポリAシグナル
開始:7256 終結:7494
ベータグロビンpAシグナル
開始:9642 終結:9890(相補的)
SV40ポリA
開始:11493 終結:11741
MMTV−LTR
開始:1348 終結:2810(相補的)
CMV
開始:10801 終結:11455(相補的)
CMV
開始:5069 終結:5723
T7プロモーター/プライミング部位
開始:5723 終結:5742
T7プロモーター/プライミング部位
開始:10782 終結:10801(相補的)
pBR ORI
開始:3207 終結:3207
AP(R)
開始:3965 終結:4828(相補的)
IgG1
開始:7371 終結:8361(相補的)
IgG1非ゲノム領域
VDJ
開始:8351 終結:8778(相補的)
19D12ハイブリドーマのIGFR1のVDJ
DHFR cDNA
開始:601 終結:1347(相補的)
SV40 t Agイントロン
開始:11740 終結:600
Kap
開始:9898 終結:10233(相補的)
hu−抗IGFR遺伝子のカッパ鎖
VJ
開始:10234 終結:10614(相補的)
軽鎖に関するhu−抗IGFR遺伝子のVJドメイン
pBR322
開始:2811 終結:3019(相補的)
pBR322
開始:3020 終結:5033
TK−ヒグロマイシンseq
開始:5053 終結:7062
TK−ヒグロマイシン
ベータグロビンポリAシグナル
開始:7108 終結:7346(相補的)
ベータグロビンpAシグナル
開始:9642 終結:9890(相補的)
SV40ポリA
開始:11493 終結:11741
MMTV−LTR
開始:1348 終結:2810(相補的)
CMV
開始:10801 終結:11455(相補的)
T7プロモーター/プライミング部位
開始:8860 終結:8879(相補的)
CMV
開始:8879 終結:9533(相補的)
T7プロモーター/プライミング部位
開始:10782 終結:10801(相補的)
pBR ORI
開始:3207 終結:3207
pAIG1FRLCB2−V1Kのプラスミド地図。
開始:3965 終結:4828(相補的)
IgG1
開始:7371 終結:8361(相補的)
IgG1非ゲノム領域
VDJ
開始:8351 終結:8778(相補的)
19D12ハイブリドーマのIGFR1のVDJ
DHFR cDNA
開始:601 終結:1347(相補的)
SV40 t Agイントロン
開始:11740 終結:600
Kap
開始:9898 終結:10233(相補的)
hu−抗IGFR遺伝子のカッパ鎖
VJ
開始:10234 終結:10614(相補的)
軽鎖に関するhu−抗IGFR遺伝子のVJドメイン
pBR322
開始:2811 終結:3019(相補的)
pBR322
開始:3020 終結:5033
TK−ヒグロマイシンseq
開始:5053 終結:7062
TK−ヒグロマイシン
ベータグロビンポリAシグナル
開始:7108 終結:7346(相補的)
ベータグロビンpAシグナル
開始:9642 終結:9890(相補的)
SV40ポリA
開始:11493 終結:11741
MMTV−LTR
開始:1348 終結:2810(相補的)
CMV
開始:10801 終結:11455(相補的)
T7プロモーター/プライミング部位
開始:8860 終結:8879(相補的)
CMV
開始:8879 終結:9533(相補的)
T7プロモーター/プライミング部位
開始:10782 終結:10801(相補的)
pBR ORI
開始:3207 終結:3207
AP(R)
開始:3965 終結:4828(相補的)
VDJ
開始:6356 終結:6356
抗IL10(12G8)のVDJ領域
IgG1
開始:6361 終結:7341
IgG1非ゲノム領域
VJ
開始:10368 終結:10745(相補的)
IgK
開始:10013 終結:10367(相補的)
12G8軽鎖(抗IL10)のVDJ−IgK
DHFR cDNA
開始:601 終結:1347(相補的)
SV40 t Agイントロン
開始:11899 終結:600
pBR322
開始:2811 終結:3019(相補的)
pBR322
開始:3020 終結:5033
TK−ヒグロマイシンseq
開始:7650 終結:9659(相補的)
TK−ヒグロマイシン
ベータグロビンポリAシグナル
開始:7366 終結:7604
ベータグロビンpAシグナル
開始:9763 終結:9996
SV40ポリA
開始:11652 終結:11900
MMTV−LTR
開始:1348 終結:2810(相補的)
hCMV/βGl−IgGイントロン
開始:5069 終結:5910
ハイブリッドイントロンを伴うヒトCMVプロモーター
hCMV/βGl−IgGイントロン
開始:10773 終結:11614(相補的)
ヒトCMVプロモーターおよびハイブリッドイントロン
pBR ORI
開始:3207 終結:3207
pAIL23V1Kのプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10906−10755および5760−5911に位置する。
pAIL23V1Kのプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10906−10755および5760−5911に位置する。
pAIL23V1Kのプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10906−10755および5760−5911に位置する。
pAIL23V1Kのプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10906−10755および5760−5911に位置する。
pAIL23V1Kのプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10906−10755および5760−5911に位置する。
pAIL23RV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23R Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10914−10763および5760−5911に位置する。
pAIL23RV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23R Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10914−10763および5760−5911に位置する。
pAIL23RV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23R Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10914−10763および5760−5911に位置する。
pAIL23RV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23R Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10914−10763および5760−5911に位置する。
pAIL23RV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL23R Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10914−10763および5760−5911に位置する。
pAIL17AV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL17 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL17 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10934−10783および5759−5910に位置する。
pAIL17AV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL17 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL17 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10934−10783および5759−5910に位置する。
pAIL17AV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL17 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL17 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10934−10783および5759−5910に位置する。
pAIL17AV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL17 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL17 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10934−10783および5759−5910に位置する。
pAIL17AV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL17 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗IL17 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10934−10783および5759−5910に位置する。
pAPD16V1−GAのプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗PD1 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗PD1 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10871−10720および5759−5910に位置する。
pAPD16V1−GAのプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗PD1 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗PD1 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10871−10720および5759−5910に位置する。
pAPD16V1−GAのプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗PD1 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗PD1 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10871−10720および5759−5910に位置する。
pAPD16V1−GAのプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗PD1 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗PD1 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10871−10720および5759−5910に位置する。
pAPD16V1−GAのプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗PD1 Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗PD1 Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10871−10720および5759−5910に位置する。
pAHGFV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗HGF Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗HGF Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10922−10771および5760−5911に位置する。
pAHGFV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗HGF Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗HGF Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10922−10771および5760−5911に位置する。
pAHGFV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗HGF Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗HGF Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10922−10771および5760−5911に位置する。
pAHGFV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗HGF Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗HGF Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10922−10771および5760−5911に位置する。
pAHGFV1のプラスミド地図。hCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗HGF Ig.軽鎖およびhCMVプロモーター−(βGl−IgGイントロン)−抗HGF Ig.重鎖構築物を含むプラスミドベクター。βGl−IgGイントロンは10922−10771および5760−5911に位置する。
開始:3965 終結:4828(相補的)
VDJ
開始:6356 終結:6356
抗IL10(12G8)のVDJ領域
IgG1
開始:6361 終結:7341
IgG1非ゲノム領域
VJ
開始:10368 終結:10745(相補的)
IgK
開始:10013 終結:10367(相補的)
12G8軽鎖(抗IL10)のVDJ−IgK
DHFR cDNA
開始:601 終結:1347(相補的)
SV40 t Agイントロン
開始:11899 終結:600
pBR322
開始:2811 終結:3019(相補的)
pBR322
開始:3020 終結:5033
TK−ヒグロマイシンseq
開始:7650 終結:9659(相補的)
TK−ヒグロマイシン
ベータグロビンポリAシグナル
開始:7366 終結:7604
ベータグロビンpAシグナル
開始:9763 終結:9996
SV40ポリA
開始:11652 終結:11900
MMTV−LTR
開始:1348 終結:2810(相補的)
hCMV/βGl−IgGイントロン
開始:5069 終結:5910
ハイブリッドイントロンを伴うヒトCMVプロモーター
hCMV/βGl−IgGイントロン
開始:10773 終結:11614(相補的)
ヒトCMVプロモーターおよびハイブリッドイントロン
pBR ORI
開始:3207 終結:3207
実施例
これらの実施例は本発明を更に明瞭にすることを意図するものであり、本発明を限定するものではない。該実施例に記載されている組成物または方法はいずれも、全体的または部分的に、本発明の一部を構成する。
これらの実施例は本発明を更に明瞭にすることを意図するものであり、本発明を限定するものではない。該実施例に記載されている組成物または方法はいずれも、全体的または部分的に、本発明の一部を構成する。
抗体発現カセットにおけるイントロン要素の評価
免疫グロブリンスプライスアクセプターおよびpDSRGの配列の一部と共にプラスミドpDSRG中に存在するβ−グロビンスプライスドナーを含有するβGl−IgGイントロンをPCRにより合成した。
免疫グロブリンスプライスアクセプターおよびpDSRGの配列の一部と共にプラスミドpDSRG中に存在するβ−グロビンスプライスドナーを含有するβGl−IgGイントロンをPCRにより合成した。
(配列番号38)
CAGGTAAGTTTA(配列番号4)を含有する配列はβ−グロビンスプライスドナーであり、TTTCTCTCCACAGGC(配列番号5)を含有する配列は免疫グロブリンアクセプター部位である。スラッシュは該ドナーおよびアクセプター配列間の推定スプライス部位を表す。
CAGGTAAGTTTA(配列番号4)を含有する配列はβ−グロビンスプライスドナーであり、TTTCTCTCCACAGGC(配列番号5)を含有する配列は免疫グロブリンアクセプター部位である。スラッシュは該ドナーおよびアクセプター配列間の推定スプライス部位を表す。
発現増強のために、該イントロンを、該発現カセットの5’隣接領域内の、ヒトCMVプロモーターの下流に挿入した。これを行うために、該CMVプロモーターの部分配列を含有するよう、該βGl−IgGイントロンの5’末端をPCRにより伸長させた。得られた伸長PCR産物をEcoRIで消化し、クレノウポリメラーゼで埋め、NcoIで消化した。同時に、軽鎖発現プラスミドpUhCMVIGFRLCb2もNheIで消化し、クレノウポリメラーゼで埋め、NcoIで消化した。ついで該イントロンをpUhCMVIGFRLCb2に連結してpUIGFRLCb2(配列番号32)を構築した。該イントロンを該重鎖発現プラスミド内に挿入するために、該PCR伸長イントロン含有断面をSnaBIおよびAflIIで消化した。同時に、pUhyg(−)IG1FRhuHをSnaBIおよびAflIIにより消化し、該イントロンを挿入してpUIG1FRmodH(配列番号3)を構築した。ついで、重鎖および軽鎖発現カセットの両方を含有する単一プラスミドベクターを以下のとおりに構築した。pUIGFRLCb2をRsrIIおよびPacIにより消化して該軽鎖発現カセットを移した。また、pXBLSをRsrIIおよびPacIにより消化し、LCB2含有軽鎖発現カセットを挿入してpAIGFRLCb2(配列番号34)を構築した。ついでpUIG1FRmodHをBssHIIにより消化して、重鎖およびヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ発現カセットを含有する断片を遊離させた。また、pAIGFRLCb2をBssHIIにより消化し、該重鎖発現カセットを該部位に挿入してpAIG1FRLCb2V1(配列番号35)およびpAIG1FRLCb2V3(配列番号36)を構築した。
該イントロン含有プラスミドを、ELISAにより、一過性トランスフェクションにおける抗体発現に関して評価した。重鎖および軽鎖発現カセットの両方において該イントロンを含有するプラスミドで該トランスフェクションを行った場合、抗IGF1Rの発現は、該イントロンを含有しない類似プラスミドによるトランスフェクションから得られたものより約2〜3倍高いことを、結果は示した。
2つの単一発現プラスミドpAIG1FRLCb2V1およびpAIG1FRLCb2V3をKIRA(キナーゼ受容体活性化)アッセイにおける生物活性に関して評価した。該単一発現プラスミドは共に、19D12ハイブリドーマから得られた精製抗体により示されるのと同等の生物活性を示すことを、結果は示唆している。
コザックコンセンサス配列(以下に太字で示されている)を重鎖および軽鎖cDNA配列の5’末端に組込むために、幾つかのプラスミドベクターをPCRにより更に修飾した。以下に示すプライマー内の制限部位は下線で示されており、開始メチオニンコドン(atg)は太字およびイタリック体で示されている。
該5’プライマーはコザック配列と共にKpnI(ggtacc)部位を有し、3’プライマーはApaI部位(gggccc)を有する。
該軽鎖のための5’プライマーはコザック配列と共にEcoRI(gaattc)およびPmeI(gtttaaac)部位を有し、3’プライマーはBsiWI部位(cgtacg)を有する。該プラスミドへの該PCR産物の連結の成功の指標として利用するためのPmeI部位を該5’プライマーに付加した。
増幅された重鎖配列をpUIG1FRmodH/Kan内のKpnIおよびApaI部位にクローニングしてpAIG1FRH−K(配列番号41)を構築し、該軽鎖配列をpAIGFRLCb2内のEcoRIおよびBsiWI部位にクローニングしてpAIGFRLCb2(−)L−K(配列番号42)を構築した。
ついでpAIG1FRH−KをBssHIIにより消化して、該重鎖発現カセットを該ヒグロマイシンB耐性遺伝子発現カセットと共にpAIGFRLCb2(−)L−Kに移した。pAIGFRLCb2(−)L−KもBssHIIにより消化し、該重鎖発現カセットを同じ部位に挿入してpAIG1FRLCb2V1−K(配列番号43)を構築した。
DXB11細胞を、イントロンを伴う発現プラスミドおよびイントロンを伴わない発現プラスミドでトランスフェクトした。βGl−IgGイントロンの存在はDXB11細胞内の抗IGF1Rの発現における2〜3倍の増加をもたらした。pAIG1FRV1およびpAIG1FRV3は、該イントロンを伴わない抗IGF1Rの重鎖発現カセットおよび軽鎖発現カセットの両方を含有するプラスミドであった。pAIG1FRLCB2V1およびpAIGFRLCB2V3は、該イントロンを伴う抗IGF1Rの重鎖発現カセットおよび軽鎖発現カセットの両方を含有するプラスミドであった。トランスフェクションの3日後および5日後の上清をELISAにより分析した。該ELISA分析からのデータを以下の表1に示す。
ELISA法
試薬:
・抗IGF1R 20.24mg/mL 濃縮物
・ヒトIgGコート化プレート
・HRP結合ヤギ抗ヒトIgG
・ELISA希釈剤 − 0.1% BSA(ウシ血清アルブミン)/PBST(リン酸緩衝食塩水およびTween20)
・TMB液体基質系:Pierceの1工程ターボ系
・停止試薬(〜2M H2SO4)
方法:
A.標準曲線の作成
精製抗IGF1RをELISA希釈剤中で200ng/mLまで希釈した。
試薬:
・抗IGF1R 20.24mg/mL 濃縮物
・ヒトIgGコート化プレート
・HRP結合ヤギ抗ヒトIgG
・ELISA希釈剤 − 0.1% BSA(ウシ血清アルブミン)/PBST(リン酸緩衝食塩水およびTween20)
・TMB液体基質系:Pierceの1工程ターボ系
・停止試薬(〜2M H2SO4)
方法:
A.標準曲線の作成
精製抗IGF1RをELISA希釈剤中で200ng/mLまで希釈した。
20,240,000ng/mL÷200ng/mL=1:101200希釈。
10μLのヒト標準物を990μLのELISA希釈剤に加えた(I)。
49.4μLの(I)を49950.6μLのELISA希釈剤に加えることにより200ng/mLに希釈した。
200ng/mL 標準物の4mLアリコートを調製し、4℃で保存した。アッセイ当日、200μLの標準物をA行にローディングすることにより該標準曲線の残部を作成し、最上標準物から底(3.125ng/mL)まで1:2系列希釈を行った。ELISA希釈剤をブランクまたは0ng/mL 標準物として使用した。
B.対照の調製
対照を300ng/mLで調製した。
対照を300ng/mLで調製した。
74.1μLの(I)(「標準曲線の作成」を参照されたい)を49925.9μLのELISA希釈剤に加えた。2.5mLのアリコートを調製し、4℃で保存した。
C.アッセイ
全ての試薬を、それらを使用する前に室温に加温した。
全ての試薬を、それらを使用する前に室温に加温した。
1.標準曲線の位置を示す鋳型および未知物質を準備した。
2.プレートをEIA洗浄バッファーで洗浄した(1×)。
3.該鋳型に従って標準物、対照およびサンプルを適当なウェルに加えた。各ウェル内の最終容量は100μLであった。該プレートをカバーで覆い、室温で1時間インキュベートした。
4.HRP結合抗huIgGをELISA希釈剤中で1:10,000希釈した。
10μLの抗huIgGストックを990μLの0.1% BSA−PBSTに加えることにより初期1:100希釈を行い、ついで350μLの該初期希釈液を34650μLの0.1% BSA−PBSTに加えることにより追加的な1:100希釈を行った。この溶液の最終希釈度は1:10000であった。
5.該ウェル内の液体を吸引した。該ウェルをEIA洗浄バッファーで4回洗浄した。
6.100μLの該HRPコンジュゲートを全ウェルに加えた。該プレートをカバーで覆い、室温で30分間インキュベートした。
7.工程5と同様にして該ウェルを洗浄した。
8.100μLのTMB基質を各ウェルに加えることにより該ウェル内で発色させた。
9.該ウェル内の青色の量に応じて、50μLの停止試薬を、工程8において分注したのと同じ順序で全ウェルに加えた。これは約2〜4分間を要した。プレートを2分間、展開させた。
10.停止試薬の添加の30分以内に、波長を450〜650nmに設定したマイクロプレートリーダーを使用して各ウェルの吸光度を読取った。
D.データ解析:
4パラメーターロジスティック曲線フィットを用いてデータを解析した。
4パラメーターロジスティック曲線フィットを用いてデータを解析した。
キナーゼ受容体活性化(KIRA)アッセイ法
1)MCF−7細胞を、ウシインスリンを含有しない培地内で200,000細胞/ウェル(2.0×106細胞/mL−0.1mL)で調製した。細胞を96ウェル組織培養プレート(Falcon#35−3075)内に播いた。サンプル当たり2通りのウェルを調製した。プレートをCO2インキュベーター(5〜6% CO2、35〜37℃)内で一晩インキュベートした。
1)MCF−7細胞を、ウシインスリンを含有しない培地内で200,000細胞/ウェル(2.0×106細胞/mL−0.1mL)で調製した。細胞を96ウェル組織培養プレート(Falcon#35−3075)内に播いた。サンプル当たり2通りのウェルを調製した。プレートをCO2インキュベーター(5〜6% CO2、35〜37℃)内で一晩インキュベートした。
2)ELISAプレート(NUNC MAXI−SORP)を100μL/ウェル 抗IGF1R捕捉抗体(商業的に入手可能なIgG1特異的抗体)でコートした。精製ハイブリドーマ由来19D12を1.0μg/mLに調製した。使用のために各バッチを試験した。ELISAプレートを4℃で一晩インキュベートした。
3)組織培養プレートをインキュベーターから取り出した。未処理(EMEM)
対照ウェル以外の全てのウェルから培地を抜き取った。サンプル添加前にウェルが乾燥するのを防ぐために、12チャネル多チャネルピペットを使用して1つの行の該培地を同時に除去した。
対照ウェル以外の全てのウェルから培地を抜き取った。サンプル添加前にウェルが乾燥するのを防ぐために、12チャネル多チャネルピペットを使用して1つの行の該培地を同時に除去した。
4)96ウェル希釈プレートにおける希釈曲線のために、100μl/mL EMEMを第1〜10および12列に加えた。5.0μg/mLの200μL/ウェルの対照Abを第11列の適当なウェルに加えた。200μl/ウェルのサンプルを第11列の適当なウェルに加えた。系列希釈装置を使用して、100μl(1:2)を第11列から第1列に移した(第12列は未処理細胞対照である)。細胞プレートのウェルから培地を除去した。50μ/ウェルを希釈プレートから細胞プレートの対応ウェルに移した。CO2インキュベーター(5〜6% CO2、35〜37℃)内で30分間インキュベートした。
5)IGF−I(R&D Systems;Minneapolis,MN)をEMEM(無FBS)中で75ng/mLに調製した。インキュベーターから組織培養プレートを取り出した。全てのウェルから(1つのプレートは同時に)内容物を抜き取った。100μL/ウェルのIGF−IをサンプルウェルおよびIGF−I対照ウェルに加えた。100μl/ウェルのEMEMを第12列に加えた。
6)細胞プレートをインキュベートしながら、予めコートされたELISAプレートをブロッキングした。捕捉抗体を捨て(容器内にあけること(ダンプ)が許容される)、紙タオル上にブロットした。150μL/ウェルのブロッキングバッファー(試薬シートを参照されたい)を加えた。プレートシェーカー上、プレートを室温で1時間、穏やかに振とうした。
7)細胞プレートのIGF−Iインキュベーションの後、組織培養プレートの全ウェルの内容物を抜き取った(96ウェルプレートのうちの全ウェルが抜き取られうる)。100μL/ウェルの細胞溶解バッファーを加えた。プレートシェーカー上、室温で1時間、プレートを振とうした。
8)ELISAプレートのブロッキングバッファーインキュベーションの後、ブロックバッファーを捨てた(ダンプ、ブロット)。プレートを150μL/ウェルの洗浄バッファー(試薬シートを参照されたい)で洗浄した(6×)。各洗浄の後、ダンプし、ブロットした。
9)細胞プレートの細胞溶解バッファーインキュベーションの後、85μLを細胞プレートウェルからELISAプレートの対応ウェルに移した。12チャネル多チャネルピペットを使用して行の全体を一度に移した。移す前に、残存細胞凝塊の幾らかを破壊するために、移す容量を穏やかに上下にピペッティングした。該ライセートをピペッティングする際、発泡するのを避けた。プレートシェーカー上、室温で2時間、プレートを振とうした。
10)ビオチン化抗ホスホチロシン検出Ab−4G10(Upstate USA;Lake Placid,NY)を希釈バッファー(試薬シートを参照されたい)中で0.2μg/mLで調製した。室温にした。ライセートのインキュベーションの後、該ライセートを捨てた(ダンプ、ブロット)。ELISAプレートを100μL/ウェルの洗浄バッファーで洗浄した(4×)。各洗浄後、ダンプし、プロットした。
11)100μL/ウェルの4G10 Ab(抗ホスホチロシン抗体)をELISAプレートに加えた。プレートシェーカー上、室温で2時間、プレートを穏やかに振とうした。
12)HRP結合ストレプトアビジン(Kirkegaard and Perry Laboratories Inc.;Gaithersburg,MD)を希釈バッファー中で0.025μg/mLで調製した。室温にした。4G10(抗ホスホチロシン抗体)のインキュベーションの後、該検出抗体を捨てた(ダンプ、ブロット)。ELISAプレートを100μL/ウェルの洗浄バッファーで洗浄した(4×)。各洗浄後、ダンプし、プロットした。
13)100μL/ウェルのHRP結合ストレプトアビジンを加えた。プレートシェーカー上、室温で30分間、プレートを穏やかに振とうした。
14)TMB基質(2成分系,R&D Systems)を成分Aと化合物Bとの1:1混合物で調製した。室温にした。ELISAプレート内での該ストレプトアビジンインキュベーションの後、該ストレプトアビジンを捨てた(ダンプ、ブロット)。ELISAプレートを100μL/ウェルの洗浄バッファーで洗浄した(4×)。各洗浄後、ダンプし、ブロットした。
15)100μL/ウェルのTMB基質をELISAプレートに加えた。プレートシェーカー上、室温で15分間、プレートを振とうした。
16)TMBインキュベーション後、50μL/ウェルの1N H2SO4停止剤を加えた。プレートをプレートリーダー(Molecular Devices)上、450nm/570nmで読取った。停止剤の添加の20分以内に、プレートを読取った。
これらのデータは、該βGl−IgGイントロンを欠く関連プラスミドpAIG1FRV1およびpAIG1FRV3と比べて高い、βGl−IgG含有プラスミドpAIG1FRLCB2V1およびpAIG1FRLCB2V3に関連した発現レベルを示している。コザックコンセンサス配列をプラスミドpAIG1FRLCB2V1の免疫グロブリン遺伝子に機能的に結合させてpAIG1FRLCB2−V1Kを得た場合に、より一層高い発現レベルが可能であった。
19D12親ハイブリドーマからの並びにプラスミドpAIG1FRLCB2V1およびpAIG1FRLCB2V3からの19D12抗体の生物活性をKIRAアッセイにより分析した。これらのデータを以下の表2に示す。
これらのデータは、pAIG1FRLCb2V1およびpAIG1FRLCb2V3プラスミドが、生物学的に活性な抗IGF1R抗体を生成することを示した。
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態により範囲において限定されるものではない。実際、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載されている実施形態、および本明細書に具体的に記載されていない他の実施形態を含み、本明細書に具体的に記載されている実施形態は必ずしも包括的なものではない。本明細書に記載されているものに加えて本発明の種々の修飾が前記説明から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
本出願の全体にわたり特許、特許出願、刊行物、産物説明およびプロトコールが引用されているが、それらの開示の全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れることとする。
Claims (50)
- ベータ−グロビンスプライスドナー部位および免疫グロブリンガンマスプライスアクセプター部位(それらの部位は約125ヌクレオチドにより分離されている)を含む、プロモーターに機能的に連結された単離されたポリヌクレオチドであって、それらの部位およびプロモーターが、抗IGF1R、抗IL23 p19、抗IL23受容体、抗IL17、抗PD1または抗HGF抗体免疫グロブリン軽鎖または重鎖(それらの鎖は免疫グロブリン定常領域に機能的に融合されている)をコードする遺伝子に機能的に連結されている、単離されたポリヌクレオチド。
- ヌクレオチド配列CAGGTAAGTTTA(配列番号4)を含むベータ−グロビンスプライスドナー部位、およびヌクレオチド配列TTTCTCTCCACAGGC(配列番号5)を含む免疫グロブリンガンマスプライスアクセプター部位(それらの部位は約125ヌクレオチドにより分離されている)を含む、請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 該プロモーターがCMVプロモーターである、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 該遺伝子が、カッパ免疫グロブリン定常領域に融合した免疫グロブリン軽鎖をコードしている、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 該遺伝子が、ガンマ−1免疫グロブリン定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖をコードしている、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 該遺伝子が、配列番号6、8〜11、18もしくは26のアミノ酸20−128または配列番号31を含む軽鎖免疫グロブリンのCDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3をコードしている、あるいは該遺伝子が、配列番号7、12、13、14もしくは22のアミノ酸20−137または配列番号30を含む重鎖免疫グロブリンのCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3をコードしている、請求項6記載のポリヌクレオチド。
- 該遺伝子が配列番号8、9、10または11のアミノ酸20−128をコードしている、請求項7記載のポリヌクレオチド。
- 該遺伝子が配列番号12または13のアミノ酸20−137をコードしている、請求項7記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1記載のポリヌクレオチドを含む単離されたプラスミドベクター。
- 図1〜10よりなる群から選択される図面に記載されているプラスミド地図により特徴づけられる単離されたプラスミドベクター。
- 配列番号3のヌクレオチド配列のヌクレオチド39−190を含む、請求項10記載のプラスミド。
- 請求項1記載のポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞。
- 該ポリヌクレオチドが該宿主細胞の染色体DNA内に組込まれている、請求項13記載の宿主細胞。
- 該ポリヌクレオチドのコピーの2以上を含む、請求項14記載の宿主細胞。
- 該ポリヌクレオチドが該宿主細胞の染色体DNA内に組込まれていない、請求項13記載の宿主細胞。
- 該ポリヌクレオチドのコピーの2以上を含む、請求項16記載の宿主細胞。
- 請求項1記載のポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入し、該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞の単一クローン集団を選択し、該クローン集団を培養し、該培養からの細胞が細菌、ウイルス、真菌および/またはマイコプラズマを含有するかどうかを判定し、何も検出されなければ、該培養からの細胞を1以上の容器内に冷却下で保存することを含む、マスター細胞バンクの製造方法。
- 該ポリヌクレオチドが、図1または2のプラスミド地図を含むプラスミド内に存在する、請求項18記載の製造方法。
- 該ポリヌクレオチドが、図6、7、8、9または10のプラスミド地図を含むプラスミド内に存在する、請求項18記載の製造方法。
- 該細菌、ウイルス、真菌および/またはマイコプラズマが、ヒト免疫不全ウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトTリンパ球親和性ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒト単純ヘルペスウイルス、大腸菌(Escherichia coli)およびスタヒロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)よりなる群から選択される1以上のメンバーである、請求項18記載の製造方法。
- 請求項18記載の製造方法により製造されたマスター細胞バンク。
- 請求項22記載のマスター細胞バンクからの細胞を培養し、該培養からの細胞を1以上の容器内に冷却下で保存することを含む、実施用細胞バンクの製造方法。
- 該ポリヌクレオチドが、図1または2のプラスミド地図を含むプラスミド内に存在する、請求項23記載の製造方法。
- 該ポリヌクレオチドが、図6、7、8、9または10のプラスミド地図を含むプラスミド内に存在する、請求項23記載の製造方法。
- 該培養細胞を細菌、ウイルス、真菌および/またはマイコプラズマに関して試験し、何も検出されなかったら、該培養からの細胞を冷却下で保存する、請求項23記載の製造方法。
- 請求項23記載の製造方法により製造された実施用細胞バンク。
- 請求項13記載の宿主細胞を含むマスター細胞バンク。
- 該細胞が、バイアル当たり約107個の細胞を含むバイアル内に存在し、検出可能レベルの細菌、ウイルス、マイコプラズマおよび真菌を含有しない、請求項28記載のマスター細胞バンク。
- 該細胞のバイアルの200個以上を含む、請求項29記載のマスター細胞バンク。
- 図1のプラスミド地図により特徴づけられるプラスミドを含むCHO−DXB11細胞を含む、請求項28記載のマスター細胞バンク。
- 図2のプラスミド地図により特徴づけられるプラスミドを含むCHO−DXB11細胞を含む、請求項28記載のマスター細胞バンク。
- 請求項13記載の宿主細胞を含む実施用細胞バンク。
- 該細胞が、バイアル当たり約107個の細胞を含むバイアル内に存在し、検出可能レベルの細菌、ウイルス、マイコプラズマおよび真菌を含有しない、請求項33記載の実施用細胞バンク。
- 該細胞のバイアルの200個以上を含む、請求項34記載の実施用細胞バンク。
- 図1のプラスミド地図により特徴づけられるプラスミドを含むCHO−DXB11細胞を含む、請求項33記載の実施用細胞バンク。
- 図2のプラスミド地図により特徴づけられるプラスミドを含むCHO−DXB11細胞を含む、請求項33記載の実施用細胞バンク。
- プロモーターに機能的に結合された遺伝子によりコードされる標的ポリペプチドを宿主細胞内で発現させるための方法であって、該標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと該プロモーターとの間にベータ−グロビンスプライスドナー部位および免疫グロブリンガンマスプライスアクセプター部位(それらの部位は約125ヌクレオチドにより分離されている)を含むβGl−IgGイントロンポリヌクレオチドを該宿主細胞内に導入し、該標的ポリペプチドが発現される条件下で該宿主細胞を培養することを含む方法。
- 該標的ポリペプチドを精製することを更に含む、請求項38記載の方法。
- 該ベータ−グロビンスプライスドナー部位がヌクレオチド配列CAGGTAAGTTTA(配列番号4)を含み、該免疫グロブリンスプライスアクセプター部位がヌクレオチド配列TTTCTCTCCACAGGC(配列番号5)を含む、請求項38記載の方法。
- 該遺伝子が免疫グロブリンをコードしている、請求項38記載の方法。
- 該免疫グロブリンが、IGF1R、IL−23、IL−23受容体、IL−17、PD1またはHGFに特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域または重鎖可変領域である、請求項42記載の方法。
- 該遺伝子が、配列番号6、8〜11、18もしくは26のアミノ酸20−128または配列番号31を含む軽鎖免疫グロブリンのCDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3をコードしている、あるいは該遺伝子が、配列番号7、12、13、14もしくは22のアミノ酸20−137または配列番号30を含む重鎖免疫グロブリンのCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3をコードしている、請求項43記載の方法。
- 該遺伝子が配列番号8、9、10または11のアミノ酸20−128をコードしている、請求項44記載の方法。
- 該遺伝子が配列番号12または13のアミノ酸20−137をコードしている、請求項44記載の方法。
- 該ポリペプチドを単離することを更に含む、請求項44記載の方法。
- 該遺伝子、プロモーターおよびポリヌクレオチドが、図1のプラスミド地図により特徴づけられるプラスミド内に存在する、請求項44記載の方法。
- 図1のプラスミド地図により特徴づけられるプラスミドが配列番号35のヌクレオチド配列を含む、請求項48記載の方法。
- 該宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項49記載の方法。
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