KR20080016786A - 당뇨병 치료용 조성물 및 당뇨병 치료 방법 - Google Patents

당뇨병 치료용 조성물 및 당뇨병 치료 방법 Download PDF

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Abstract

벡터는 프로모터, 인트론, 분비성 리더 서열 암호화 핵산, 인간 베타셀룰린(BTC) 암호화 핵산, 또는 그의 기능적 단편, 및 폴리아데닐화 시그널 서열을 기능적으로 연결하는 핵산을 갖고, BTC의 발현이 분비된 성숙 BTC를 생산한다. 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법은 상기 벡터를 갖는 바이러스 입자 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 또한 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 인헨서 영역, β-글로빈 키메라 인트론, 알부민 리더 서열 암호화 핵산, 인간 베타셀룰린(BTC) 암호화 핵산 또는 그의 기능적 단편, 및 SV40 폴리아데닐화 시그널 서열을 기능적으로 연결하는 핵산을 갖고, BTC의 발현이 분비된 성숙 BTC를 생산하는 벡터도 제공된다. 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포도 또한 제공된다.
당뇨병, 인간 베타셀룰린, BTC, 사이노메갈로바이러스

Description

당뇨병 치료용 조성물 및 당뇨병 치료 방법{Compositions and methods for the therapeutic treatment of diabetes}
본 발명은 일반적으로 당뇨병의 치료 및 예방 방법, 더욱 자세하게는 치료를 위한 β 세포의 재생 및 신생에 관한 것이다.
혈당이 정상적으로 조절되는 개인에서, 췌장 호르몬 인슐린은 혈당량 증가에 따라 분비된다. 혈당 증가는 식사 후에 생기며 골격근 및 지방과 같은 말초 조직에 대한 인슐린 작용으로 생긴다. 인슐린은 이들 말초 조직의 세포가 혈액으로부터 글루코오스를 활발하게 흡수하게 하고 이것을 저장 형태로 전환시킨다. 이 과정을 글루코오스 처리(glucose disposal)라 칭한다. 혈당량은 개인이 공복이거나, 중간 상태 또는 충분히 식사를 하였는지 여부에 따라서 한 개인 내에서도 하루 동안 정상치 아래, 정상치 또는 정상치보다 높게 다양할 수 있다. 이들 양을 저혈당, 정상혈당 및 고혈당이라 칭한다. 당뇨병 환자에서, 글루코오스 항상성에서의 이러한 변화는 잘못된 인슐린 분비 또는 작용으로 인하여 조절이 되지 않음으로써, 만성적인 고혈당 상태를 초래한다.
당뇨병(Diabets mellitus)은 약 4-5%가 걸려 있는 흔한 질병이다. 당뇨병을 발병할 위험은 체중 증가에 따라 증가하며, 성인기 발병(adult onset) 당뇨병 환자 의 90%가 비만이다. 따라서, 비만 성인의 빈도가 높아짐에 따라서, 성인기 발병 당뇨병의 빈도도 전 세계적으로 증가하고 있다. 당뇨병은 3가지 주요 형태로 분류된다. 2형 당뇨병은 1개 형태로서 비인슐린 의존형 당뇨병(NIDDM) 또는 성인기 발병 당뇨병이라 칭한다. 1형 당뇨병은 두 번째 형태로서 인슐린 의존형 당뇨병(IDDM)이라 칭한다. 3형 당뇨병은 유전적이며 췌장소도(pancreatic islet) 베타(β) 세포 작용을 제어하는 유전자에서 돌연변이에 기인한 것이다. 당뇨병의 진단은 글루코오스 측정을 기본으로 하고 있으나, 모든 환자의 정확한 분류가 언제나 가능한 것은 아니다. 2형 당뇨병은 성인에서 더욱 흔하고 1형 당뇨병은 어린이와 10대에서 더 우세하다.
1형 및 2형 당뇨병 모두 수명 단축뿐만 아니라 혈관질병 및 죽상동맥경화증과 같은 기타 합병증과 관련된다. 후기 합병증을 예방하기 위한 당뇨병의 장기간 관리는 환자가 1형 또는 2형으로 분류되는지 여부에 상관없이 인슐린 요법을 포함한다. 1형 당뇨병은 인슐린 생산 췌장 β 세포의 거의 완전한 손실과 관련된 자가면역(autoimmune) 질병이다. 이러한 β 세포의 손실은 평생 동안 인슐린에 의존하게 만든다. 1형 당뇨병은 어떤 연령에서도 발병할 수 있고 백인 집단에서 새로 태어나는 아이의 약 0.3 내지 1%가 자신의 일생 동안 이 질병을 발병할 것으로 추산되고 있다.
1형 당뇨병을 치료하고 2형 당뇨병을 어느 정도 치료하기 위해 널리 사용되는 방법은 인슐린 유지 요법으로 전통적으로 구성된다. 이러한 요법은 가장 간단한 형태로서 식사 섭취한 후 또는 하루 동안 일정한 간격으로 정제된 또는 재조합 인 슐린을 환자에게 주사하여 정상 혈당량을 유지하게 하는 것을 포함한다. 이들 주사는 이상적으로는 하루에 4회 빈도를 필요로 한다. 상기 치료 방법은 환자에게 어느 정도 이점을 제공하지만, 이러한 인슐린 치료 방법은 부적절한 혈당 제어를 필요로 할뿐만 아니라 환자의 순응성을 상당히 요하는 문제가 있다.
1형 당뇨병을 치료하는 다른 방법은 인슐린의 계획적인 전달을 가능하게 하는 인슐린 펌프와 같은 장치 이용을 포함한다. 이 방법은 주사를 덜 빈번하게 하므로 상술한 방법에 비하여 바람직할 수 있다. 그러나, 인슐린 펌프 요법의 이용은 3일에 한 번씩 주사 바늘을 교체해야 하는 문제점을 갖는다. 인슐린 유지 요법과 유사하게, 인슐린 펌프 방법은 인슐린의 전달이 혈당량 변화에 따라 조절되는 것이 아니기 때문에 최적 글루코오스 조절을 할 수 없다. 따라서 당뇨병을 치료하는 이들 방법은 부담스러울 뿐만 아니라 적절하지 않다. 또한 이들 방법은 평균 성인 생애 동안에 걸쳐 완전히 효과적인 것은 아니었거나 상기 질병을 예방하는데 효과적인 것으로 나타났다.
생체 활성 인슐린을 당뇨병 환자로 보내기 위한 다양한 세포 요법이 시도되어 왔다. 이들은 유전자 요법, 면역요법 및 인공 β 세포의 이용을 포함한다. 생체 내에서 인슐린 또는 기타 폴리펩티드의 발현을 위한 유전자 요법은 동물 모델에서 간 표적화 바이러스 매개 형질도입(transduction)을 포함하였다. 그러나 이들 방법은 글루코오스 조절된 인슐린 전달을 제공하지 않았고 인슐린 생산 β 세포를 회복하거나 재생하지도 않아 환자 적용에 제한이 있었다.
췌장 소도 β 세포의 유전자 변형 및 인공 베타 세포의 생성은 세포 요법에 의해 당뇨병을 치료하기 위한 방법이다. 인슐린을 발현하기 위한 이종이식물(xenograft) 및 동종이형 세포 전달은 숙주 면역 반응을 예방하기 위해 세포 캡슐화를 필요로 하고, 또 세포 생존 및 인슐린 제어 전달을 위한 문제가 확인되었다. 췌장 및 소도(islet) 이식도 또한 당뇨병 치료 요법으로 시도되었다. 이러한 치료법의 이용은 수용자당 2-5명의 성인 기증자로부터 매칭되는(matched) 조직을 필요로 하기 때문에 그 성공이 제한되었다. 이 방법은 또한 정상 글루코오스 조절된 인슐린 분비를 유지함에 있어서 이식된 조직의 실패 및 적절한 시간에 걸쳐 생존가능하지 못하는 점에서 성공하지 못했다.
따라서 인슐린 생산 β 세포의 생리학적 특성을 회복하는 방식으로 당뇨병 환자에서 글루코오스 항상성을 조절할 수 있는 간단하고 더 효과적인 방법이 요청되고 있다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시키며 그와 관련된 이점을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 프로모터, 인트론, 분비성 리더 서열 암호화 핵산, 인간 베타셀룰린(BTC) 암호화 핵산, 또는 그의 기능적 단편, 및 폴리아데닐화 시그널 서열을 기능적으로 연결하는 핵산을 갖고, BTC의 발현이 분비된 성숙 BTC를 생산하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 인헨서 영역, β-글로빈 키메라 인트론, 알부민 리더 서열 암호화 핵산, 인간 베타셀룰린(BTC) 암호화 핵산 또는 그의 기능적 단편, 및 SV40 폴리아데닐화 시그널 서열을 기능적으로 연결하는 핵산을 갖고, BTC의 발현이 분비된 성숙 BTC를 생산하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 이들 벡터를 함유하는 숙주 세포도 또한 제공된다. 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법도 또한 제공된다. 이 방법은 인간의 분비된 성숙한 베타쿨린(BTC) 또는 그의 기능적 단편을 발현하는 벡터로서 프로모터, 인트론, 분비성 리더 서열 암호화 핵산, 인간 베타셀룰린(BTC) 암호화 핵산, 또는 그의 기능적 단편, 및 폴리아데닐화 시그널 서열을 기능적으로 연결한 핵산을 포함하는 벡터를 갖는 바이러스 입자 유효량을 개인에게 투여하는 것을 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 치료용 폴리펩티드를 생체내 분비하기 위한 재조합 벡터 및 당뇨병의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 상기 벡터는 당뇨병 치료를 위한 인간 베타셀룰린(BTC)의 발현 및 분비에 특히 유용하다. 본 발명의 방법은 인슐린 생산 췌장소도 β 세포를 재생 또는 신생 및 글루코오스 항상성을 회복하기 위해 분비성 BTC를 암호화하는 상기 재조합 벡터를 당뇨병 환자에게 도입하는 것에 관한 것이다. 당뇨병 치료에 있어서 이러한 벡터 및 그 용도의 이점은 BTC가 정상적인 세포 시그널링 경로를 통하여 작용할 수 있는 세포외 환경으로 분비되는 점이다. 이러한 생체내 분비는 당뇨병 환자에서 당뇨병을 완화시키거나 또는 당뇨병을 발병할 우려가 있는 사람에서 당뇨병을 예방한다.
일개 구체예로서, 본 발명은 인간 벡타셀룰린(BTC)를 발현하는 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 아데노바이러스 벡터는 BTC의 분비를 실시하기 위하여 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터/인헨서 및 BTC 코딩 영역에 대하여 5'에 인헨서 영역, β-글로빈 키메라 인트론 및 알부민 리더 서열을 함유한다. BTC 코딩 영역의 3'에 위치하는 것은 SV40 폴리아데닐화 시그널 서열이다. 성숙 BTC를 암호화하는 BTC[1-80]cDNA는 이들 5' 및 3' 발현 및 조절 영역 사이에 삽입되었다.
다른 구체예로서, 본 발명은 알부민 리더 서열에 융합된 인간 BTC cDNA를 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것을 통한 당뇨병의 치료에 관한 것이다. BTC의 분비 발현은 2주 이내에 당뇨병의 완전한 완화를 초래하는 반면에 면역조절제로 처리된 자가면역 당뇨병 NOD 마우스는 100일 이상 동안 정상혈당(normoglycemic)을 유지하였다. 당뇨병의 완화는 췌장에서 β 세포의 BTC-매개된 재생에 기인하였으며 BTC에 대한 리간드인 ErbB-2 수용체의 억제에 의해 폐기되었다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "당뇨병"은 당뇨병(diabetes mellitus)으로 알려진 당뇨병 상태를 의미하기 위한 것이다. 당뇨병은 글루코오스 불내성(intolerance)를 초래하는 인슐린의 상대적 또는 절대적 결핍을 특징으로 하는 만성적 질병이다. 이 용어는 I형, II형 및 유전적 당뇨병을 비롯한 모든 유형의 당뇨병을 포함하는 것으로 이해된다. I형 당뇨병은 인슐린 의존형 당뇨병(IDDM)이라 칭하며 예컨대 청년기 발병 당뇨병을 포함한다. I형 당뇨병은 주로 췌장 β-세포의 파괴에 기인한다. II형 당뇨병은 비인슐린 의존형 당뇨병(NIDDM)이라 칭하며 식사후 인슐린 방출 손상을 일부 특징으로 한다. 인슐린 내성은 II형 당뇨병의 발생을 초래하는 한 인자일 수 있다. 유전적 당뇨병은 β-세포의 기능 및 조절을 방해하는 돌연변이에 기인한 것이다.
당뇨병은 약 75 g의 글루코오스를 경구투여한 후 약 2시간일 때 평가된 바와 같이, 공복 혈당량이 약 140 mg/dl 이상이거나 또는 혈장 혈당량이 약 200 mg/dl 이상인 것을 특징으로 한다. 용어 "당뇨병"은 만성 고혈당을 비롯한 고혈당 및 손상된 글루코오스 내성을 갖는 환자를 포함하는 것으로 의미한다. 고혈당 환자에서 혈장 혈당량은 예컨대 안정한 진단 지시자로 측정된 바와 같은 정상치보다 더 높은 글루코오스 농도를 포함한다. 이러한 고혈당 환자는 당뇨병의 명백한 임상적 증상을 나타낼 우려가 있거나 경향이 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 당뇨병을 나타내는 임상적 증상의 완화를 의미하는 것이다. 임상적 증상의 완화는 예컨대 혈당치 감소 또는 예비치료치 또는 당뇨병 환자와 비교하여 치료된 개인에서 혈액으로부터 글루코오스 제거율 증가를 포함한다. 용어 "치료"는 또한 고혈당이 조절되지 않는 사람에서 정상혈당 반응의 유도를 포함한다. 정상혈당은 임상적으로 정상 또는 저혈당보다 높지만 고혈당 범위보다 낮은 혈당치 범위를 지칭한다. 따라서, 정상혈당 반응은 혈장 글루코오스 농도를 정상치로 감소시키기 위해 글루코오스 흡수를 자극하는 것을 의미한다. 대부분의 성인의 경우, 이러한 값은 약 60-105 mg/dL 혈당 농도 범위, 바람직하게는 약 70-100 mg/dL 범위에 상응하지만, 예컨대 개인의 성별, 나이, 체중, 식이 및 전반적 건강에 따라서 개인에 따라 상이할 수 있다. 당뇨병의 효과적인 치료는 개인의 고혈당 또는 증가된 혈당치를 정상화 또는 정상혈당치로 감소시키는 것이며, 이러한 감소는 직접적으로 인슐린의 분비에 기인한다. 다르게는, 효과적인 치료는 공복 혈당치를 약 140 mg/dL 이하로 감소시키는 것일 수 있다.
용어 "치료"는 당뇨병과 관련된 병리학적 상태 또는 만성 합병증의 심각성의 감소를 포함한다. 이러한 병리학적 상태 또는 만성 합병증은 표 1에 수록하며 또 예컨대 근육 감소, 케토산증, 당뇨, 다뇨증, 당뇨성 미세혈관병증 또는 소혈관 질병, 죽상동맥경화성 혈관 질병 또는 대혈관 질병, 신경병증 및 백내장을 포함한다.
Figure 112007063903697-PCT00001
Figure 112007063903697-PCT00002
부가적인 합병증은 예컨대 일반적 감염 감수성 증가 및 상처 치유 감수성 증가를 포함한다. 용어 "치료"는 또한 미치료 환자에 비교하여 당뇨병 환자의 평균 수명 예상을 증가시키는 것을 포함한다. 다른 병리학적 상태, 만성적 합병증 또는 질병의 표현형 소견은 당업자에게 공지되어 있으며 질병과 관련된 상태, 합병증 또는 소견의 심각성의 감소가 있는 한 당뇨병 치료 측도로서 간단히 이용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "예방"은 당뇨병을 나타내는 임상적 증상을 방해하는 것을 의미한다. 이러한 방해는 예컨대 당뇨병을 발병할 우려가 있는 개인에서 그 질병의 증상을 발현하기 전에 또는 그 질병을 진단하기 전에 정상적인 혈당치를 유지하는 것을 포함한다. 따라서, 용어 "예방"은 개인을 당뇨병 발병으로부터 보호하기 위한 예방 치료를 포함한다. 개인에서 당뇨병을 예방하는 것은 그 질병의 발병을 억제하거나 정지시키는 것을 포함하는 것으로 이해된다. 질병의 발명을 억제 또는 정지하는 것은 예컨대 글루코오스를 혈장에서부터 세포로 전달하지 못하는 것과 같은 비정상적인 글루코오스 대사의 출현을 억제 또는 정지하는 것을 포함한다. 따라서, 효과적인 당뇨병 예방은 당뇨병 가능성이 있는 개인, 예컨대 비만한 개인 또는 당뇨병 가족력이 있는 개인에서 글루코오스-조절된 인슐린 발현에 기인한 글루코오스 항상성의 유지를 포함할 것이다. 상기 질병의 발병을 억제 또는 정지하는 것은 또한 예컨대 당뇨병과 관련된 1 이상의 병리학적 상태 또는 만성적 합병증의 진행을 억제하거나 정지시키는 것을 포함한다. 이러한 당뇨병과 관련된 병리학적 상태의 예는 표 1에 수록되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "베타셀룰린" 또는 "BTC"는 성인의 췌장 및 소장에서 및 태아 체장의 원시적 관세포(duct cell)에서 발현되는 표피 생장인자의 구성원을 의미한다. 뉴클레오타이드 및 추론된 아미노산 서열은 예컨대 Sasada et al., Biochem Biophys Res Commun. 190: 1173-79 (1993) 및 Shing et al., Science 259: 1604-7 (1993)에 기재되어 있다. 베타셀룰린은 인슐린 생산 β 소도(islet) 세포의 재생 및/또는 신생을 유도하는 작용을 한다. BTC의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열의 특정 예는 인간의 BTC 코딩 영역 및 그로부터 추론된 아미노산 서열인 서열번호 1 및 서열번호 2로 하기한 바와 같다. 서열번호 3 내지 5는 성숙한 인간, 소 및 마우스 BTC에 대한 아미노산 서열을 제공하는 반면에, 서열번호 6은 BTC의 콘센서스 아미노산 서열을 제공한다. 인간 BTC cDNA의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 BTC 전구체(pro-BTC)에 상응하는 178개 아미노산 일차 번역 산물을 암호화한다. Pro-BTC는 분비 경로에 대해 편재화하기 위한 가정된 시그널 펩티드(aa13 -26), 숏 프로펩티드(short propeptide)(aa27 -31), EGF 모티프(motif)를 함유하는 성숙 BTC(aa32 -111), 숏 근접막(juxtamembrane) 도메인(aa112 -124), 소수성 트랜스막 도메인(aa125 -138) 및 고도의 친수성 아르기닌/리신 리치(lysine rich) 영역(aa146-154)를 함유하는 세포질 테일 도메인(tail domain)(aa139 -178)을 비롯한 다수의 도메인으로 구성된다.
본 발명의 BTC 폴리펩티드 또는 그의 단편의 β 세포 재생 또는 신생 활성을 파괴하지 않고 작은 변형을 가할 수 있다는 것과 활성을 발휘하기 위해서는 일차 구조의 일부만이 필요할 수 있음이 밝혀져 있다. 이러한 변형은 β 세포 재생 활성 또는 β 세포 신생 활성이 유지되는 한 용어 BTC 및 그의 기능적 단편 내에서 실시되는 것을 포함한다. 또한, 예컨대 다른 단백질, 탄수화물, 지질 또는 세포독성제 또는 세포증식억제제(cytostatic agent)를 비롯한 다양한 분자가 BTC 또는 그의 기능적 단편에 융합될 수 있다. 이러한 변형은 상기 용어의 정의 내에 포함된다.
야생형 BTC 폴리펩티드와 적어도 동일한 β 세포 재생 활성 또는 β 세포 신생 활성을 갖는 펩티드의 작은 변형은 예컨대 천연 산출 아미노산의 보존적 치환 뿐만 아니라 비천연 산출 아미노산, 아미노산 유사체 및 기능적 모방제를 혼입하는 구조적 변형을 포함한다. 예컨대, 리신(Lys)은 아미노산 Arg에 대한 보존적 치환체로 간주된다. 유사하게, 양성 하전된 Arg 또는 Lys 아미노산과 같이 전하를 유사한 전하 및 공간 배열을 갖는 유기 구조물로 치환한 모방제는 생성한 BTC 폴리펩티드 모방제가 기준 BTC 폴리펩티드와 적어도 거의 동일한 β 세포 재생 활성 또는 β 세포 신생 활성을 나타내는 한, 당업자에게 의해 BTC 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편의 작은 변형으로 간주될 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, BTC 폴리펩티드와 관련하여 사용할 때 용어 "기능적 단편"은 전장(full length) BTC와 비교하여 적어도 거의 동일한 β 세포 재생 활성 또는 β 세포 신생 활성을 유지하는 BTC의 일부를 의미하는 것으로 한다. 이러한 기능적 단편은 예컨대 BTC24-76으로 불리고 절단된 N-말단 23 아미노산 및 C-말단 4개 아미노산을 갖는 BTC의 유도체를 포함할 수 있다. BTC24-76은 분화시 2.5배 이상 큰 활성을 나타내고 또 1/10의 분열유발(mitogenic) 활성을 갖는다(Watanabe et al., J. Biol . Chem . 269: 9966-73 (1994)).
본 명세서에 사용된 바와 같이, BTC의 뉴클로에타이드 또는 아미노산 서열과 관련하여 사용될 때 용어 "실질적으로" 또는 "실질적으로 동일한"은 그 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열이 기준 서열과 비교할 때 상당한 정도, 양 또는 수준의 서열 동일성을 나타내는 것을 의미한다. 이러한 서열 동일성은 어떤 아미노산 서열 또는 그를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 BTC로부터 유도된 것인지 또는 BTC와 관련되는지 특징화하기 위한 중요하고 의미있는 것으로 간주된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 이종 핵산을 포함하고, 증식하거나 발현할 수 있는 재조합 DNA 분자를 지칭한다. 아데노 관련된 바이러스 벡터에 관하여 사용될 때, 이 용어는 아데노-관련된 바이러스 DNA의 일부 또는 전부를 갖고 또 비-AAV DNA를 갖는 재조합 DNA 분자를 지칭하는 것이다. 비-AAV DNA는 생장 인자, 효소, 구조 단백질, 항체 또는 항원과 같은 소망하는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 암호화된 폴리펩티드는 전장 폴리펩티드, 또는 전장 폴리펩티드의 활성 또는 면역원성 단편일 수 있다. 비-AAV DNA는 프로모터, 인헨서 등과 같은 적합한 조절 요소에 기능적으로 연결되도록 벡터 내에 위치할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "아데노바이러스 벡터"는 숙주 염색체에 안정한 방식으로 통합될 수 있는 능력을 특징으로 하는 파르보바이러스(parvovirus) 군의 구성원을 지칭한다. 아데노바이러스 벡터는 당해 분야에 공지된 것이며 예컨대 Wivel et al., Adenovirus Vectors . Chapter 5 (p.87-110) 및 Fridemann, T., The Development of Human Gene Therapy . CSHL Press, NY, USA. page 729 (1999)에 기재되어 있다. 이러한 재조합 생체내 전달 및 발현 벡터 패밀리는 광범위한 숙주 세포 및 조직을 감염시킬 수 있고 또 용이하게 조작되어 소망하는 작용을 달성할 수 있다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터 및 본 발명의 치료방법에 유용한 아데노바이러스 벡터의 특정 예는 하기 실시예 I에 기재되어 있다.
아데노바이러스 벡터의 다른 특정 예는 예컨대 헬퍼-의존적 아데노바이러스 벡터 및 아데노-관련된 바이러스를 포함한다. 헬퍼-의존적 아데노벡터(아데노바이러스 벡터)는 모든 바이러스 유전자의 결실을 초래하였다. 이들 아데노바이러스 벡터는 시스(cis)-작용 요소만을 함유하는데, 이것은 좌측 및 우측 전환된 말단 반복 서열뿐만 아니라 벡터 게놈의 캡슐화에 필요한 팩케이징 영역을 포함한다. 이러한 헬퍼 의존적 아데노벡터는 약 600 bp의 아데노바이러스 게놈을 함유한다. 나머지 중재 영역은 비코딩 스터퍼(stuffer) DNA로 채워진다. 바이러스 DNA의 제거는 어떠한 바이러스 유전자도 헬퍼-의존적 아데노바이러스 주쇄로부터 발현을 위해 존재하지 않게 한다. 아데노-관련된 바이러스 벡터는 96%의 양친 아데노-관련된 바이러스 게놈이 결실되었기 때문에 높은 안정성을 제공하는 이점을 갖는다. 아데노-관련된 벡터는 바이러스 유전자를 갖지 않고 대신 목적으로 하는 재조합 유전자를 함유한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "기능적으로 연결된" 또는 그의 등가 용어는 벡터 성분이 공지된 유전자 및 세포 원리에 따라 결합되어 각 성분의 작용이 표적 핵산에서 실시되어야 하는 요건을 허용함을 의미한다. 따라서, 벡터에서 조립된 기능적으로 연결된 핵산 군은 벡터 내에서 결합되어 참조한 코딩 영역 서열의 전사, 번역 및 조절을 유발한다. 예컨대, 기능적으로 연결되면, 코딩 영역 서열은 프레임 내에서 융합되어서 구성 부분으로부터 소망하는 전장 폴리펩티드의 번역을 가능하게 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 세포에 의해 핵산의 전사 및 번역을 의미한다. 발현은 예컨대 구성적이거나 또는 유도성 프로모터 또는 조직 또는 세포 특이적 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 다른 소망하는 핵산과 함께 동시에 발현되거나 또는 다르게는 서로 독립적으로 발현될 수 있다. 이들 공동발현 방법의 다양한 조합은 발현될 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열의 수 및 작용에 따라서 부가적으로 사용될 수 있다. 당업자라면 어떤 공동발현 형태를 이용하여 특정 목적을 달성하거나 소망하는 필요를 충족할 수 있는지를 잘 알고 있거나 결정할 수 있을 것이다. CMV를 사용한 구성적 발현의 특정 예는 하기 실시예 I에 자세하게 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "분비" 또는 "분비된"은 세포외 공간으로 유전자 산물이 발현됨을 의미한다. 분비된 폴리펩티드는 프로폴리펩티드가 세포막을 통하여 이동하도록 리더 서열 또는 시그널 서열을 이용한다. 진핵생물 세포에서, 예컨대 리더 서열은 거친 소포체에서 절단되어 성숙 폴리펩티드를 생성하며 이 성숙 폴리펩티드는 소낭(vesicle)을 통하여 세포 표면에 전달된다. 성숙 폴리펩티드의 발현 및 분비를 실시하기 위해 코딩 서열에 기능적으로 연결된 리더 서열을 함유하는 키메라 유전자 작성물의 제작은 당업자에게 공지되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 세포를 지칭한다. 이 용어는 또한 게놈으로 본 발명의 벡터를 함유하는 바이러스 입자에 의해 감염될 수 있는 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 분비된 성숙 인간 베타쿨린(BTC) 또는 그의 기능적 단편을 발현하는 벡터를 갖는 바이러스 입자의 투여와 관련하여 용어 "유효량"은 투여되는 바이러스 입자의 수가 표적 조직을 감염시켜서 바이러스 입자의 게놈으로부터 발현된 치료적 유전자 산물을 당뇨병의 증상 1 이상을 감소시키는 양으로 분비하게 하기에 충분하다는 것을 의미한다. 예컨대, BTC를 분비하는 바이러스 입자의 유효량은 혈당치의 감소를 초래하거나 또는 글루코오스 항상성을 초래하거나 또는 이들 모두를 초래하는 입자의 수로 구성된다. 또한, 당뇨병의 임상적 소견은 상기 표 1에 기재한 바와 같이 바이러스 입자의 유효량의 측도로서 사용될 수 있다. 유사하게, 바이러스 입자의 유효량은 투여되어서 BTC의 분비를 충분량 지시하여 개인의 생물학적 또는 생화학적 성분 세포 또는 조직 상에 소망하는 효과를 낼 수 있게 하는 바이러스 입자의 수를 의미한다. 예컨대, BTC를 분비하는 바이러스 입자의 유효량은 췌장 β 세포 재생, β 소도 세포 신생 또는 β 소도 세포 재생 및 신생을 유발할 입자의 수로 구성될 수 있다. 인간 개인에 대한 바이러스 입자의 유효량은 예컨대 당업자에게 잘 공지된 사항과 더불어 주어진 가르침과 지시를 따른 당뇨병의 믿을 만한 동물 모델로부터 추정될 수 있다. 마우스 동물 모델에 대한 바이러스 입자의 유효량은 예컨대 약 1 x 108 - 1 x 1014, 바람직하게는 약 1 x 109 - 1 x 1011, 더욱 바람직하게는 약 1 x 1010 - 1 x 1011 을 포함한다. 특히 유용한 유효량은 약 4 x 1011 바이러스 입자이다. 다른 유용한 유효량은 특히 헬퍼-의존적 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련된 바이러스를 사용할 때 예컨대 약 1 x 1012 - 1 x 1014 를 포함한다. 아데노-관련된 바이러스에 대해 특히 유용한 유효량은 약 2.1 x 1012 - 7.0 x 1013 벡터 게놈 유닛이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 개인에게 투여하기에 적합한 용액 또는 매질을 의미한다. 이러한 용액 또는 매질은 화합물 및 폴리펩티드의 안정성 및 세포의 생존성을 유지하는 작용을 할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 공지되어 있고 또 인산염 완충된 염수 또는 매질과 같은 수용액을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 또한 생체내 숙주 세포 또는 조직에 바이러스 입자를 표적화, 부착 또는 감염시키고 및/또는 적절한 방출 전달 또는 면역보호 목적을 위한 바이러스 입자의 능력을 향상 또는 증가시키기는 작용을 하는 부가적 잔기, 화합물 및/또는 제제를 포함한다. 이러한 잔기, 화합물 및/또는 제제는 당업자에게 잘 공지된 것이고 또 예컨대 수용체 리간드, 세포외 매트릭스 분자 또는 그의 성분 및 화학적 전달 제제를 포함할 수 있다.
단리된 분자, 숙주 세포 또는 그의 개체군은 자연에서 정상적으로 발견되는 오염물 또는 물질을 실질적으로 갖지 않는 분자, 숙주 세포 또는 그의 개체군을 지칭한다. 개체군은 2 이상의 분자 또는 숙주 세포의 집단을 지칭한다. 개체군을 형성하는 세포는 동일하거나 상이한 계통일 수 있고 또 세포의 균일 또는 이질적 집단일 수 있다.
본 발명은 프로모터, 인트론, 분비성 리더 서열 암호화 핵산, 인간 베타셀룰린(BTC) 암호화 핵산, 또는 그의 기능적 단편, 및 폴리아데닐화 시그널 서열을 기능적으로 연결하는 핵산을 갖고 BTC의 발현이 분비된 성숙 BTC를 생산하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 분비성 경로를 통하여 발현시 생체활성 BTC로 절단될 수 있는 프로폴리펩티드 또는 프로벡타셀룰린(pro-BTC)을 생성하는 분비성 리더 서열과 함께 베타셀룰린을 암호화하는 핵산을 사용한다. BTC가 인간 치료 목적으로 사용하려는 경우, 분비성 리더 서열은 바람직하게는 인간 공급원으로부터 유도된다. 프로폴리펩티드를 비롯하여, 발현되고 및/또는 분비된 폴리펩티드에 대한 암호화 핵산의 사용은 외인성 폴리펩티드가 바람직하지 않은 면역반응을 유도할 것이라는 가능성을 감소시킨다. 그러나 당업자들은 비-인간 공급원을 포함한 BTC 및 분비성 리더 서열의 다른 공급원이 본 발명의 벡터뿐만 아니라 본 발명의 치료 방법에도 적용될 수 있고, 이 경우 인간 서열과의 서열 동일성 차이는 적다는 것을 잘 알고 있을 것이다.
예시적 BTC 암호화 핵산은 인간 BTC에 대한 서열 번호 1에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 유사하게, 예시적 BTC 암호화 핵산은 인간 BTC에 대한 서열 번호 2에 기재된 바와 같은 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산을 암호화할 수 있다. 유사하게, 예시적 BTC 암호화 핵산은 서열 번호 3-6에 기재된 아미노산중의 하나를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 실질적으로 암호화할 수 있다. 서열 번호 2-6을 암호화는 뉴클레오티드 서열과 비교한 종 기원에 따른 보존적 치환 또는 차이와 같은 미소한 변형은 암호화된 BTC 유전자 산물이 그의 β 소도 재생 또는 신생 활성의 일부 또는 전부를 함유하는 한 본 발명의 벡터에 적용될 수 있다.
본 발명의 암호화 핵산은 BTC의 코딩 영역에 상응하는 서열 또는 그의 기능적 단편을, 분비성 리더 서열에 기능적으로 결합되도록 함유하고 있다. 기능적 결합은 시스 형태 및 생체 내 절단이 생체 활성 BTC의 생성을 초래하는 방식으로 실시된다. 이러한 결합은 절단되어 성숙 폴리펩티드로 된 후 BTC 활성의 감소가 없는 한, 예컨대 암호화 리더 서열을 BTC의 코딩 영역에 직접 융합시키거나 또는 링커 영역을 혼입하는 것에 의해 생길 수 있다. 따라서 시그널 펩티드 절단 시그널은 리더 서열의 분비, 절단 및 활성 BTC의 생성에 상응하는 모든 활성이 생길 수 있는 한, 선택한 리더 서열로부터 유도되거나 또는 이종 리더서열로부터 유도될 수 있다. BTC 및 분비성 리더 서열을 암호화하는 핵산 서열은 이하에 기재된 바와 같이 기타 소망하는 발현 및 조절 요소와 기능적으로 연결된 본 발명의 벡터에 포함된다.
분비성 리더 서열은 분비될 소망하는 진핵생물 폴리펩티드로부터 얻을 수 있다. 인간을 비롯한 다수 게놈의 클로닝 및 서열결정화에 의해, 이용될 수 있는 다양한 진핵생물 리더 서열이 존재한다. 본 발명의 벡터에 사용될 수 있는 에시적 리더 서열을 암호화하는 핵산은 예컨대 서열
Figure 112007063903697-PCT00003
을 갖는 알부민 리더 및
서열
Figure 112007063903697-PCT00004
을 갖는 면역글로불린 카타(Ig κ) 사슬 리더를 포함한다. 본 발명의 벡터에 이용될 수 있는 특히 유용한 분비성 리더 서열은 상기 기재하고 실시예에 기재한 알부민 리더 서열이다.
다양한 발현 및 조절 요소의 어떤 것이라도 상술한 바와 같은 벡터에 암호화된 성숙 BTC의 분비를 실시하도록 본 발명의 벡터에 이용될 수 있다. 이러한 요소는 암호화된 프로-BTC 폴리펩티드의 전사를 위한 적어도 프로모터 서열을 포함한다. 다른 발현 요소는 예컨대 인헨서, 사일렌서(silencer), 조직 특이적 전사 조절 요소, 인트론, 폴리아데닐화 시그널, 전사 종결 시그널 및 번역 개시 부위를 포함한다. 강하고 연속적인 발현이 필요한 경우, 1 이상의 인헨서와 조합되어 사용되는 구성적 또는 유도성 프로모터가 특히 유용한 조합일 수 있다. 유사하게, 발현, 안정성 또는 전사, 번역 또는 전달 효율을 향상시키는 다른 발현 및/또는 조절 요소를 이용하여 본 발명의 성숙 BTC 폴리펩티드의 발현 및 분비량을 유리하게 증가시킬 수 있다. 다른 발현 및/또는 조절 요소는 인트론 또는 폴리아데닐화 시그널과 같은 진핵생물 유전자에서 정상적으로 발견되고 암호화되는 구조의 봉입에서부터 발현이 생길 표적 종에서 코돈 이용에 더욱 친화성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 실질적 변형에 이르기까지 다양할 수 있다. 예컨대, 설치류와 같은 비-인간 BTC 코딩 영역은 아미노산 서열을 실질적으로 변경함 없이 뉴클레오타이드 서열에 일부 또는 다수의 인간 코돈을 혼입하도록 변형될 수 있다. 다르게는, 비-인간 BTC 코딩 영역은 뉴클레오타이드 수준에서 상이하면서도 실질적으로 동일한 인간 아미노산 서열을 암호화하도록 인간화될 수 있다. 이하에 자세하게 기재한 바와 같이, 발현 및/또는 조절 요소의 다양한 다른 조합 및 치환을 이용하여 성숙 BTC 폴리펩티드를 분비하도록 본 발명의 벡터에 이용될 수 있다.
예컨대 적합한 발현 및/또는 조절 요소는 당업자에게 공지되어 있으며 또 예컨대
Figure 112007063903697-PCT00005
에 예시되어 있다. 이러한 발현 및/또는 조절 요소는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 초기 프로모터, 마우스 포유동물 종양 바이러스(MMTV) 스테로이드 유도성 프로모터, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MMLV) 프로모터 등을 포함한다. 기능적으로 연결된 핵산의 조직 특이적 또는 유도성 발현을 제공하는 발현 및/또는 조절 요소도 또한 사용될 수 있다. 이러한 유도성 계는 예컨대 테트라사이클린 유도성 계
Figure 112007063903697-PCT00006
; 중금속에 의해 유도될 수 있는 메랄로티오네인 프로모터; 뮤리스테론과 같은 엑디손 또는 관련 스테로이드에 반응성인 곤충 스테로이드 호르몬
Figure 112007063903697-PCT00007
; 글루코코르토코이드 및 에스트로겐과 같은 스테로이드에 의해 유도된 마우스 포유동물 종양 바이러스(MMTV)
Figure 112007063903697-PCT00008
; 및 온도 변화에 의해 유도될 수 있는 가열 쇼크 프로모터를 포함한다.
강한 구성적 생체내 발현을 위해 특히 적합한 프로모터는 CMV 프로모터이고 하기 실시예 I에 예시되어 있다. 다른 특히 유용한 요소는 CMV 프로모터 및 인헨서 요소, 베타 글로빈 인트론 및 폴라아데닐화 시그널 서열의 기능적 조합물을 포함한다. 본 발명의 벡터에 포함될 수 있는 베타 글로빈 인트론 이외의 다른 인트론은 예컨대 SV40 대형 T 항원을 포함한다. 유사하게, 본 발명의 벡터에 포함될 수 있는 SV 폴리아데닐화 시그널 이외의 폴리아데닐화 시그널은 예컨대 소의 생장 호르몬(BGH) 폴리 A 시그널 및 β-글로빈 폴리 A 시그널을 포함한다. 이러한 요소 전부는 시중에서 구입할 수 있으며 이들의 사용은 당업자에게 공지되어 있다. 당업자들은 특정 숙주 세포에서 발현하기 위해 적절한 프로모터를 잘 알고 있거나 쉽게 결정할 수 있다.
본 발명의 벡터는 공지된 다양한 공급원으로부터 유도되거나 또는 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예컨대 이하에 기재한 바와 같은 치료법에 사용하기 위해, 상기 벡터는 숙주 세포 또는 조직에 도입되어 암호화 핵산 및 기능적으로 연결된 리더 서열 및 기능적으로 연결된 발현 및/또는 조절 요소로부터 성숙 BTC의 발현 및 분비에 영향을 줄 수 있다. 표적화된 유전자 전달에 의해 전달된 발현 벡터뿐만 아니라 투여 후 숙주 세포의 감염을 위한 바이러스 입자를 생성하기 위해 사용될 수 있는 바이러스 벡터를 비롯하여 상기 목적을 위하여 다양한 벡터가 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 숙주 세포 특이성, 발현 및 복제 메카니즘이 소망하는 세포 유형 또는 조직에서 효과적인 도입 및 강인한 발현을 달성하도록 유리하게 고정될 수 있기 때문에 생체 내 유전자 전달에 특히 유용할 수 있다. DNA 바이러스계 벡터 및 레트로바이러스계 벡터 모두는 성숙한 BTC를 발현하여 분비하도록 프로모터, 인트론, 분비성 리더 서열 암호화 핵산, 인간 베타셀룰린(BTC) 암호화 핵산, 또는 그의 기능적 단편, 및 폴리아데닐화 시그널 서열을 기능적으로 연결하기 위한 본 발명의 벡터로서 사용될 수 있다.
본 발명은 아데노바이러스계 벡터에 의해 예시될 수 있다. 아데노바이러스 성분은 예컨대 Ad5 게놈으로부터 또는 당해 분야에 공지된 다른 아데노바이러스 계 벡터로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 벡터의 주쇄 성분으로서 이용될 수 있는 다른 아데노바이러스 계 벡터는 헬퍼 의존적 또는 "gutless" 아데노바이러스 벡터(HDAd)이다. 이 HDAD 아데노바이러스 계 벡터는 대부분의 바이러스 게놈을 갖지 않고 오직 시스-작용 요소만을 함유한다
Figure 112007063903697-PCT00009
. 치료적 유전자 산물의 생체내 전달을 위한 용도는 트랜스진의 연장된 발현 및 무시가능한 독성을 나타내었다
Figure 112007063903697-PCT00010
. 또한 gutless 아데노벡터는 예컨대 재조합 아데노 관련된 바이러스에 비하여 더 높은 형질도입 효율을 갖는다. 하기 실시예 I에 기재한 특이적 아데노바이러스 벡터에 대한 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 9에 나타낸다. 이 벡터는 nt 1-795에서 CMV 프로모터/인헨서 요소; nt 857-989에서 β-글로빈/IgG 키메라 인트론; nt 1095-1166에서 알부민 리더 서열; nt 1167-1406에서 베타셀룰린[1-80]cDNA 코딩 영역; nt 1407-1409에서 중지 코돈 및 nt 1426-1647에서 SV40 후기 폴리A 시그널을 함유한다. 이 벡터 또는 그와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 벡터는 본 발명의 방법에 마찬가지로 사용될 수 있다.
다른 예시적 바이러스 계 벡터는 ATX 폴리펩티드를 세포로 발현하기 위해 사용되는 예컨대 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 렌티바이러스 및 헤르페스 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 기재한 바와 같이, 바이러스 계 시스템은 비교적 고수준의 이종 핵산을 다양한 세포로 도입할 수 있는 이점을 제공한다. 부가적으로, 이러한 바이러스는 이종 DNA를 비분열 세포로 도입할 수 있다. 바이러스 벡터는 예컨대 단순포진 바이러스 벡터(미국특허 5,501,979호), 백시니아 바이러스 벡터(미국특허 5,506,138호), 사이토메갈로바이러스 벡터(미국특허 5,561,063호), 변형된 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 벡터(미국특허 5,693,508호), 아데노바이러스 벡터(미국특허 5,700,470호 및 5,731,172호), 아데노 관련 바이러스 벡터(미국 특허 5,604,090호), 구성적 및 조절가능한 레트로바이러스 벡터(미국특허 4,405,712호; 4,650,764호 및 5,739,018호), 유두종 바이러스 벡터(미국특허 5,674,703호 및 5,719,054호) 등을 포함한다.
본 발명의 벡터 작성 방법 및 코딩 서열 및 발현 및/또는 조절 요소의 기능적 연결을 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 알부민 분비성 리더 서열을 함유하는 BTC를 암호화하는 발현성 핵산 서열의 일례는 서열번호 10에 수록되어 있다. 분비성 BTC/알부민 pro-BTC를 암호화하는 핵산 서열을 작성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예컨대
Figure 112007063903697-PCT00011
에 기재되어 있다. 예컨대, BTC를 암호화하고 분비성 리더 서열을 함유하는 핵산은 중합효소 연쇄반응을 이용하여 얻을 수 있다. 적합한 생물로부터 얻은 조직 또는 세포주는 BTC 또는 리더 서열을 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 하기 실시예 I에 자세하게 예시되어 있다.
프로모터, 인트론, 분비성 리더 서열 암호화 핵산, 인간 베타셀룰린(BTC) 암호화 핵산, 또는 그의 기능적 단편, 및 폴리아데닐화 시그널 서열의 기능적으로 연결한 핵산을 갖는 벡터가 작성되면, 이 벡터는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 분비되고 성숙한 BTC를 발현하도록 확인될 수 있다. 예컨대, 상기 벡터는 BTC를 발현하지 않는 세포에 도입되며 상기 배양 배지는 ELISA 또는 방사성면역분석법(RIA)과 같은 분석법을 이용하여 성숙 인슐린의 존재에 대해 평가되었다. 다르게는, 발현된 생성물은 β 세포 재생 또는 β 세포 신생을 유도하거나 또는 표 1에 수록한 당뇨병 증상 중의 하나 및 병리학적 상태 중의 하나의 심각성을 감소시킨다. 예컨대, 발현된 생성물은 혈당치 감소를 자극하거나 또는 글루코오스를 배양되는 지방세포 또는 근육세포로의 전달을 증가시키는 능력에 대해 시험될 수 있다. 세포로의 전달량 측정은 방사능표지된 글루코오스를 사용함으로써 할 수 있다.
따라서 본 발명은 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 인헨서 영역, β-글로빈 키메라 인트론, 알부민 리더 서열 암호화 핵산, 인간 베타셀룰린 (BTC) 암호화 핵산, 또는 그의 기능적 단편 및 SV 폴리아데닐화 시그널 서열을 기능적으로 연결하는 핵산을 갖는 벡터를 제공하며, BTC의 발현은 분비되고 성숙한 BTC를 생산한다. 바이러스에 대한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9에 나타낸 것과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 BTC 함유 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 예컨대, 본 발명은 숙주 세포 또는 분비되고 성숙한 BTC를 발현할 수 있는 세포 집단을 제공한다. 본 발명의 숙주 세포는 조직 또는 기관으로부터 기인할 수 있다. 일차 세포의 경우, 조직은 소망하는 생장 및 발현 특징을 나타내는 세포에 용이하게 접근할 수 있고 그러한 세포를 함유하도록 선택될 수 있다. 조직 공급원을 선택할 때 부가적 고려사항은 단리되고, 배양되며 변형되어 분비된 형태로 BTC를 발현할 수 있는 세포를 함유하는 조직의 선택을 포함한다. 조직 공급원의 예는 췌장, 근육, 간 또는 피부 조직뿐만 아니라 조혈 기원의 공급원을 포함한다. 따라서, 분비되어 성숙한 BTC를 발현하도록 변형될 수 있는 이들 조직 내의 세포 유형은 단리되고 예컨대 실험 연구, 벡터 유지 및 통과 그리고 세포 요법 수법을 비롯한 목적에 맞게 단리 및 적용될 수 있다. 이러한 세포 유형은 예컨대 β 소도 세포, 근육(평활근, 골격근 또는 심장근), 섬유모세포, 간, 지방, 조혈세포, 상피세포, 내피세포, 내분비 세포, 외분비 세포, 신장 세포, 방광 세포, 비장 세포, 줄기 세포 및 생식 세포를 포함한다. 특히 유용한 숙주 세포는 β 소도 세포를 분화시킬 수 있는 원시세포 또는 줄기 세포를 비롯한 췌장 세포이다. 다른 세포 유형은 당해 분야에 유사하게 공지되어 있고 또 상기 기재한 바와 같은 조직으로부터 조직 공급원으로부터 얻거나 단리할 수 있다. 인간 조직 공급원은 치료적 목적으로 유리하지만, 세포의 기원의 종은 세포가 성숙 BTC를 발현 및 분비하도록 허용하는 특징을 발현하는 세포인 한, 세포의 기원의 종은 어떤 포유동물로부터도 유도될 수 있다.
본 발명은 또한 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 프로모터, 인트론, 분비성 리더 서열 암호화 핵산, 인간 베타셀룰린(BTC) 암호화 핵산, 또는 그의 기능적 단편, 및 폴리아데닐화 시그널 서열의 기능적으로 연결한 핵산을 갖고, 분비된 성숙 인간 베타쿨린(BTC) 또는 그의 기능적 단편을 발현하는 벡터를 갖는 바이러스 입자 유효량을 개인에게 투여하는 것을 포함한다.
다른 구체예로서, 본 발명의 벡터는 일반적 바이러스 입자에 사용될 수 있다. 감염 후 성숙 BTC를 분비할 수 있는 본 발명의 벡터를 함유하는 이러한 바이러스 입자는 당뇨병을 치료 및 예방할 수 있다. 예컨대, 알부민 리더 서열과 융합된 인간 BTC를 함유하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터의 단일 투여는 스트렙토조토신-유도된 당뇨병 NOD.scid 마우스 및 면역조절제로 처리된 자가면역 당뇨병 NOD 마우스 및 100일 이상 동안 정상혈당을 유지한 마우스에서 2주 내에 당뇨병의 완전한 완화를 초래하였다. 당뇨병의 완화는 췌장에서 β 세포의 BTC-매개된 재생에 기인한 것이며 BTC에 대한 리간드인 ErbB-2 수용체를 억제함으로써 폐기될 수 있다. BTC 유전자 요법에 의한 β 세포의 재생은 인간에서 1형 당뇨병의 치료를 위해 가능성 있는 방법일 수 있다.
본 발명의 상기 방법에서 예시된 바이러스 입자는 아데노바이러스 벡터 입지아디. 그러나, 벡터와 관련하여 전술한 바와 같이, 본 명세서에 기재된 교육 내용 및 지도를 고려할 때, 당업자들은 성숙 BTC의 안정한 유전자 전달, 발현 및 분비를 위해 다양한 범위의 바이러스 입자가 사용될 수 있음을 잘 이해할 수 있을 것이다. 아데노바이러스, 다른 DNA 바이러스 계, 레트로바이러스 또는 다른 바이러스이든, 게놈으로 본 발명의 벡터를 갖는 바이러스 입자는 이하에 기재한 바와 같이 당뇨병을 치료하거나 예방하기 위한 본 발명의 방법에 적용될 수 있다. 본 발명의 바이러스 입자는 예컨대 바이러스 게놈을 팩케이징 하기 위해 당해 분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 방법은 본 발명의 벡터를 갖는 아데노바이러스 입자에 관한 하기 실시예 I에 예시되어 있다.
글루코오스 항상성이 부족한 당뇨병 환자는 다양한 투여 경로 및 방법에 의해 상술한 바이러스 입자로 처리될 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료하기에 적합한 환자는 당해 분야에 잘 공지된 당뇨병의 임상적 기준 및 징후 지시자를 이용하여 선택한다. 상기 기재한 바와 같은 당뇨병의 1 이상의 증상 또는 당뇨병에 관련된 병리학의 정확한 임상적 진단은 본 발명의 세포의 투여를 보장할 것이다. 병리학적 증상의 예는 표 1에 포함되어 있다.
가족력, 공복 혈당치 또는 글루코오스 내성 감소와 같은 공지된 징후 지시자에 의해 평가된 바와 같이 당뇨병을 발병할 우려가 있는 개인은 프로인슐린 및 프로테아제를 글루코오스 조절된 방식으로 발현하도록 변형된 세포의 투여를 보장한다. 당업자들은 당뇨병에 걸렸거나 또는 조절되지 않는 글루코오스 흡수를 나타내는 개인을 진단하는 방법을 인식하거나 잘 알고 있으며 또 그 질병의 정도 또는 심각성에 따라서 본 발명의 바이러스 입자를 언제 투여해야 할지 적절히 결정할 수 있으며 또 가장 바람직한 투여 형태도 선택할 수 있다. 예컨대, 오랫동안 1형 질병에 걸린 사람은 BTC의 감염 및 분비를 위한 바이러스 입자의 즉각적 투여를 필요로 할 수 있는 반면에, 오랫동안 2형 질병에 걸린 사람은 다른 기재된 치료법의 효능이 부족하다는 표시가 나타난 후 까지 투여를 지연시킬 수 있다.
프로모터, 인트론, 분비성 리더 서열 암호화 핵산, 인간 베타셀룰린(BTC) 암호화 핵산, 또는 그의 기능적 단편, 및 폴리아데닐화 시그널 서열의 기능적으로 연결한 핵산을 함유하는 벡터로서 숙주 세포에 도입될 때 그 벡터로부터 분비된 성숙 인간 베타쿨린 (BTC) 또는 그의 기능적 단편을 발현할 수 있는 벡터를 갖는 바이러스 입자는 당뇨병의 완화를 위해 당뇨병 치료 또는 치료에 의한 이득을 필요로 하는 것으로 판정된 개인에게 투여될 수 있다. 이러한 바이러스 입자는 당뇨병의 1 이상의 징후 또는 증상을 완화시키기 위해 투여될 수 있다. 예컨대, 당뇨병 환자에게는 당뇨병 진단 후 분비 성숙 BTC를 코딩하는 게놈을 갖는 바이러스 입자를 투여할 수 있다. 바이러스 입자는 표적 조직 및 세포를 감염시켜서 그의 벡터 게놈의 생체내 발현시 성숙 BTC 또는 그의 기능적 단편을 분비할 것이다. BTC 분비는 예컨대 췌장에서 β 소도 세포 재생, 췌장에서 β 소도 세포 신생 또는 췌장에서 β 소도 세포 재생 및 신생 모두를 초래하며 또 이들 세포의 보충 및 글루코오스 항상성의 회복을 초래한다. 당뇨병 치료를 효과적으로 받은 개인은 인슐린 분비 세포의 주입 이후 적어도 하나의 당뇨병 증상의 심각성 감소를 나타낼 것이다. 증상의 심각성 감소는 당업자에 의해 결정되며 이는 당업자에게 명백할 것이다.
덜 심각한 당뇨병 환자에게는 본 발명의 바이러스 입자를 투여할 수 있다. 이러한 환자에서 치료가 필요한지 여부의 결정은 당업자에 의해 행해질 수 있다. 예컨대, 표준 치료 방법에 반응하지 않거나 불량하게 반응하는 당뇨병 환자는 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있다. 오랫동안 체중 감소 또는 운동 처방에 실패하였던 2형 당뇨병 환자는 예컨대 본 발명의 세포 집단을 주입하는 것에 의해 인슐린 저항성을 치료받을 수 있다.
본 발명의 방법은 당뇨병에 대한 다른 요법의 효능을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 다른 방법 사용 효능 또는 사용 용이성을 개선하기 위해 기존 방법 또는 다른 치료 방법과 조합하여 이용될 수 있다. 예컨대, BTC 분비 세포는 인슐린 주사를 매일 맞는 환자 또는 인슐린 펌프를 이용하는 환자에서 본 발명의 바이러스 입자를 투여한 후 생성될 수 있다. BTC 암호화 바이러스 입자의 투여 및 뒤이은 BTC 분비에 의한 감염은 그러한 환자에서 인슐린 주사의 빈도를 감소시킬 수 있다. 인슐린 요법을 받지 않지만 행동 수정 요법, 예컨대 체중 감소를 위해 식이요법 및 운동 처방을 받은 당뇨병 환자에게는 본 발명의 바이러스 입자를 투여할 수 있다. 이러한 환자에서 체중 감소 및 운동 처방과 함께 BTC 바이러스 입자의 투여는 질병의 재발 가능성을 감소시키거나 질병의 증후 또는 증상을 완화시킬 수 있다. 본 발명의 BTC 암호화 바이러스 입자는 내생성 인슐린 분비 세포로부터 자가면역 반응을 갖는 당뇨병 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 당뇨병 환자는 자가면역 반응을 방해하는 면역요법으로 흔히 치료받는다. 이들 환자는 또한 면역요법만으로 얻은 치료 효능보다 더 큰 치료 효능을 얻기 위하여 BTC 분비 및 β 소도 세포의 재생 및/또는 신생을 통하여 치료될 수 있다.
분비된 성숙 BTC를 도입하여 발현하는 본 발명의 바이러스 입자는 β 소도 세포 작용을 증가시킴으로써 글루코오스 흡수 반응을 회복 또는 개시하도록 인슐린을 분비하도록 개인에게 투여될 수 있다. 바이러스 입자 게놈의 통합은 이들 작용의 발현 회복으로 인하여 글루코오스 항상성을 연장시킨다. 당뇨병 환자에게는 당뇨병을 경감 또는 예방하기 위해 유효량의 바이러스 입자를 투여할 수 있다. 이러한 환자는 공복 혈당치가 약 140 mg/dl 이상일 것이다.
주입에 적합한 바이러스 입자의 유효량은 분비된 성숙 BTC를 기능적으로 암호화하도록 변형될 수 있고 또 생체 내에서 치료적으로 유효한 표적 세포 또는 조직에 바이러스를 감염시킨 후 분비된 성숙 BTC 또는 그의 기능적 단편을 다량 발현하기에 충분한 크기 또는 입자 수로 이루어진다. 인간 환자에 대한 바이러스 입자의 유효량은 당업자에게 잘 공지된 본 명세서에 개시된 내용 및 지도를 참조하여 당뇨병의 믿을만한 동물 모델로부터 추정할 수 있다. 마우스 동물 모델에 대한 바이러스 입자의 유효량은 예컨대 약 1 x 108 - 1 x 1012, 바람직하게는 약 1 x 109 - 1 x 1011, 더욱 바람직하게는 약 1 x 1010 - 1 x 1011 을 포함한다. 특히 유용한 유효량은 약 4 x 1011 바이러스 입자이다. 바이러스 입자 수의 선택은 입자의 공급원, 수용체 개인의 상태 및 필요한 BTC 분비량에 따라서 달리할 수 있다. 당업자들은 당분야에 공지된 방법을 이용하여 치료 효과를 내는 바이러스 입자의 적절한 수를 결정하는 방법을 잘 알고 있을 것이다.
분비가능한 BTC를 암호화하는 핵산을 전달하기 위한 본 발명의 바이러스 입자의 투여는 다양한 경로에 의해 실시될 수 있다. 정맥 주사 이외에, 유효량의 바이러스 입자는 예컨대 근육내 주사, 피하 주사, 복강내 주사 또는 조직 또는 기관 부위에 개인에게 투여될 수 있다. 투여를 위해 사용된 바이러스 입자는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 얻고 제조되며 적절한 생리학적 담체에 현탁된다. 예컨대 바이러스 입자는 상기 입자를 함유하는 장치에 연결된 카테터 및 정맥에 삽입된 카테터를 통하여 직접 주입되거나 또는 조직에 직접 주사될 수 있다. 바이러스 입자는 상기 정의되고 이하에 자세하게 논의된 약제학적으로 허용되는 담체에 주입된다. 바이러스 입자는 또한 전달, 표적화 및/또는 치료 효능을 용이하게 하는 다른 분자와 함께 투여될 수 있다. 바이러스 입자는 분비된 성숙 BTC 또는 그의 기능적 단편의 치료량의 충분한 발현을 달성하기 위해 필요에 따라 단일 또는 다수회 투여될 수 있다.
바이러스 입자로 치료된 개인은 식사 후 인슐린 분비량을 측정하는 것에 의해 치료 효능을 모니터링할 수 있다. 이 측정은 혈중 인슐린치를 방사성면역분석 측정법 또는 ELISA법으로 구성될 수 있다. 다르게는, 바이러스 입자를 투여한 후 개인에서 공복 혈당치를 측정하는 것도 치료 효능을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 글루코오스 내성 시험에 의해 결정되는 것과 같은 글루코오스 처리율 감소는 치료의 효능을 확인하기 위해 이용될 수 있다. 부가적으로, 당뇨병과 관련된 적어도 1개의 증상의 완화도 치료 효능 평가에 이용될 수 있다. 당업자들은 치료 효능을 평가 및 진단하는 적합한 수단을 잘 알고 있을 것이다.
본 발명은 당뇨병을 예방하기 위해 이용될 수 있다. 예컨대, 분비성 BTC를 암호화하는 바이러스 입자는 당뇨병을 발병할 우려가 있는 개인 또는 고혈당 환자에게 예방적으로 투여될 수 있다. 본 발명은 예컨대 유전적으로 당뇨병 발병 경향이 있는 사람 또는 인슐린 내성 또는 고혈당이 조절되지 않는 우려가 있는 비만 환자에서 이용될 수 있다. 이들 개인들은 임상적으로 명백한 고혈당의 발병 전 또는 발병한 동안에 표적 세포를 감염시켜서 성숙 BTC를 분비하기 위해 BTC 암호화 바이러스 입자 유효량을 투여받을 수 있다. 후자의 경우는 질병의 예방으로 볼 수 있지만, 또한 만성적으로 증가된 혈당치를 나타내기 전에 정상 글루코오스 항상성을 얻기 때문에 상기 질병의 치료로서 간주될 수도 있다.
개인에서 BTC의 감염 및 분비를 위한 BTC 암호화 바이러스 입자를 투여하는 이외에, 예컨대 생체밖 및 생체내 요법을 위한 유전자 변형할 개인에 본 발명의 벡터를 투여할 수 있다.
BTC를 분비할 수 있는 핵산을 함유하는 본 발명의 바이러스 입자 또는 벡터는 개별적으로 직접 투여되거나 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 공지되어 있고 또 물, 생리학적 완충 염수 또는 글리콜, 글리세롤, 오일, 예컨대 올리브 오일 또는 주사가능한 유기 에스테르와 같은 기타 용매 또는 부형제를 포함한다.
약제학적으로 허용되는 담체는 바이러스 입자의 감염, 벡터 핵산 서열의 흡수 또는 이들 모두를 안정화시키거나 증가시키는 작용을 하는 생리학적으로 허용되는 화합물을 함유할 수 있다. 생리학적으로 허용되는 화합물을 비롯한 약제학적으로 허용되는 담체의 선택은 예컨대 BTC 암호화 바이러스 입자의 투여 경로 및 바이러스 입자의 특정 특징, 예컨대 바이러스가 DNA 바이러스 또는 레트로바이러스를 기본으로 하는지 여부에 따라 달라질 수 있다.
약제학적 조성물은 필요에 따라 o/w 에멀젼, 마이크로에멀젼, 마이셀(micelle), 혼합된 마이셀, 리포좀, 마이크로스피어(microsphere) 또는 기타 중합체 매트릭스에 혼입될 수 있다:
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. 인지질 또는 기타 지질로 구성되는 리포좀은 제조 및 투여가 비교적 간단한 비독성, 생리학적으로 허용되며 대사성 담체이다. 또한, 리포좀은 본 발명의 BTC 암호화 벡터를 그 생물학적 활성에 해를 주지 않고 고효율로 캡슐화할 수 있고, 바람직하게는 그리고 실질적으로 표적 세포에 결합되며 소포의 수성 내용물을 표적 세포에 고효율로 전달하기 때문에 특히 유용하다(Mannino et al., Biotechniques 6: 682 (1988)).
개인에게 본 발명의 벡터를 전달하기 위한 리포좀의 표적화는 수동적이거나 또는 활성적일 수 있다. 수동적 표적화는 예컨대 소포체 계(RES)의 세포에서 및 굴모세혈관을 함유하는 간과 같은 기관에서 축적되는 리포좀의 경향을 이용한다. 리포좀으로 제제화된 벡터는 간의 문맥에 직접적으로 주입될 수 있고 또 간의 RES 세포 농도 및 간에서 순환계의 굴혈관 성질로 인하여 인슐린을 발현하는 간 세포를 효과적으로 변형할 것이다. 벡터를 함유하는 리포좀의 활성 표적화는 특정 리간드를 리포좀에 결합시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 이러한 리간드는 모노클로날 항체, 당, 당지질 또는 표적 세포에 의해 발현된 수용체에 대한 리간드와 같은 단백질을 포함한다. 표적화 방법은 인슐린 발현을 위해 변형될 세포의 유형 또는 조직의 위치에 따라 선택될 수 있다.
분비성 BTC를 암호화하는 바이러스 입자 또는 벡터를 개인에게 투여하는 것은 소망하는 BTC 분비량 또는 조절할 세포의 수에 따라 단일 투여 또는 다수 회 투여로 할 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 전달하는 방법은 예컨대 1996년 12월 3일자 미국특허 5,580,859호에 Felgner 등에 의해 기재된 바와 같이 당해 분야에 공지되어 있다. 다수 회 투여는 변형된 세포의 비율을 증가시키고, 세포당 BTC 복제 수를 증가시키거나 또는 소망하는 지속 시간 동안 변형 세포의 유효 개수를 유지하기 위해 실시될 수 있다. 적어도 1개의 당뇨병 증상이 경감되거나 감소되면 생체내 투여 효율이 달성된다. 치료받은 개인에서 당뇨병 증상 심각성의 감소도 당업자에게 의해 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예의 활성에 실질적으로 영향을 주지 않는 변형은 본 발명의 정의에 포함될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 이하의 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것이고 본 발명을 제한하지 않는다.
도 1은 rAd-CMV-BTC의 전신 투여에 의한 STZ-유도 당뇨병 NOD.scid 및 Balb/c 마우스에서 당뇨병의 완화를 도시한다.
도 2는 증가된 β 세포 질량 및 인슐린에 기인한 rAd-CMV-BTC에 의한 당뇨병 의 완화를 도시한다.
도 3은 ErbB-2가 rAd-CMV-BTC에 의한 당뇨병의 완화에 관여함을 도시한다.
도 4는 rAd-CMV-BTC 치료에 의한 자가면역 당뇨병 NOD 마우스에서 당뇨병의 완화를 도시한다.
실시예 I
베타셀룰린 -유도된 β 세포 재생에 의한 당뇨병의 장기간 완화
이 실시예는 췌장에서 베타셀룰린 발현을 통한 당뇨병 치료를 나타낸다.
베타셀룰린(BTC)를 당뇨병 동물 모델에 도입하여 생체내 발현하기 위하여, 재조합 아데노바이러스 벡터를 작성하였다. rAd-CMV-BTC라 불리는 상기 벡터는 BTC의 분비를 촉진하기 위하여, BTC 코딩 영역 5'에 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터/인헨서 및 인헨서 영역, β-글로빈 키메라 인트론 및 알부민 리더 서열을 함유한다. BTC 코딩 영역 3'에 위치하는 것은 SV40 폴리아데닐화 시그널 서열이다. 성숙 BTC를 암호화하는 BTC[1-80]cDNA는 5' 및 3' 발현 및 조절 영역 사이에 삽입하였다. rAd-CMV-BTC의 개략적인 것은 도 1A에 도시되어 있다. 성숙 BTC를 암호화하는 BTC[1-80]cDNA의 완전한 뉴클레오타이드 및 추정 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 2에 개시되어 있다. rAd-CMV-BTC의 완전 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9에 개시되어 있다. 알부민 시그널 서열을 함유하는 서열번호 9의 암호화된 BTC 프로펩티드는 서열 번호 10에 기재되어 있다.
인간 BTC cDNA를 발현하는 재조합 아데노바이러스(rAd-BTC)는 다음과 같이 제조하였다. 간단히, 완전한 80-아미노산 단백질을 암호화하는 인간 BTC cDNA는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC #1887012)로부터 구입하였다. 이 cDNA를 pCR259 (Qbiogene) 아데노바이러스 전달 벡터의 SmaI 및 NotI 부위에 클로닝하였다. 알부민 리더 펩티드 서열은 SalI 및 SmaI 부위에 삽입하였고 또 SmaI 인식 서열에 의해 부가적으로 삽입된 6-bp 서열은 부위 특이적 돌연변이에 의해 제거하였다. 생성한 발현 카세트는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, β-글로빈/IgG 키메라 인트론 및 시미안 바이러스(SV)40 폴리 A 시그널을 함유하였다. 이러한 카세트를 갖는 아데노바이러스 벡터는 제조자의 방법에 따라 Transpo-AdTM 방법(Qbiogene)을 이용하여 작성하였다. 이 아데노바이러스 벡터를 PacI 으로 선형화하고 리포펙타민-Plus (Invitrogen)을 사용하여 HEK-293 세포로 형질감염시켰다. 형질감염된 지 2주 후 바이러스를 수집하고 저장용으로 하였다. HEK-293 세포를 상기 저장 바이러스에 의해 감염시켜 증폭시키고 또 Becker et al., Methods Cell . Biol. 43 Pt A, 161 (1994)에 의해 기재된 바와 같이 CsCl2-구배 초원심분리에 의해 정제하였다. 대조군으로서, β-갈락토시다아제를 발현하는 재조합 아데노바이러스(rAd-βgal)는 BTC cDNA를 β-갈락토시다아제 cDNA로 치환함으로써 제조하였다. 바이러스 역가는 PCR 및 Prevec, G.L., Biotechnology 20, 363 (1992)에 의해 기재된 방법을 이용한 플라크 형성 유닛 방법에 의해 측정하였다.
먼저, rAD-BTC 작성물에 의한 BTC의 발현 및 분비는 시험관 내에서 조사하였다. 고정된 인간 간세포주, TTNT-16 세포(Okitsu et al., Diabetes 53, 105 (2004))는 rAd-CMV-BTC에 의해 감염시키고 BTC의 생산 및 분비는 항-BTC 항체(R&D systems, USA)를 사용한 면역조직화학적 염색법 및 ELISA법에 의해 조사하였다.
그 결과를 도 1B 및 도 1C에 도시한다. 간단히, 도 1B는 BTC의 발현이 1 x 104 TTNT-16 세포를 rAD-BTC 또는 rAd-βgal으로 5 MOI로 감염한 후 24시간에서 항-인간 BTC 항체로 감염시킴으로써 결정되었음을 도시한다. 결과는 BTC가 rAd-BTC-감염된 TTNT-16 세포에서 분명히 생산되었지만, β-갈락토시다아제를 발현하는 재조합 아데노바이러스(rAd-CMV-βgal)에 감염된 세포에서는 생산되지 않았다. 도 1C는 1 x 106 TTNT-16 세포를 rAD-BTC로 1 또는 10 MOI로 감염시킨 다음 24시간 동안 배양한 후에 상청액으로 분비된 BTC의 양을 도시한다. 미감염 TTNT-16 세포를 대조용(0 MOI)으로 사용하였다. 분비된 BTC의 양은 rAD-CMV-BTC의 투여량에 따라 다르다는 것이 밝혀졌다. 그와 함께, 이들 결과는 rAd-BTC로 감염된 세포는 효율적으로 BTC를 발현하고 분비함을 나타낸다.
둘째, rAd-CMV-BTC의 발현을 생체 내에서 조사하였다. 간단히, 6주령 수컷으로 비만이 아닌 당뇨병/면역결핍증이 심각한(NOD.scid) 마우스 (Jackson Labs)에 스트렙토조토신(STZ; 100 mg/kg 체중, 시트레이트 완충액 중, pH 4.5, i.p.)을 2회 주사하여 고혈당으로 만들고 당뇨병 마우스에게 rAd-CMV-BTC 또는 대조군으로서 rAd-CMV-βgal을 정맥 주사하였다. STZ-유도된 당뇨병 NOD.scid 마우스 또는 자연적인 자가면역 당뇨병 NOD 마우스 (혈당 > 500 mg/dl)는 메톡시플루란 마취하 꼬리 정맥을 통하여 NOD.scid 마우스에게는 2 x 1011 입자 또는 rAd-CMV-BTC 또는 대조군 으로서 rAd-CMV-βgal의 NOD 마우스에게는 4 x 1011 입자를 정맥 주사하였다. 이틀에 한 번씩 혈당치를 측정하였다. 자가면역 당뇨병 마우스에서 새로이 생성된 β 세포의 면역 공격을 방지하기 위하여, 바이러스 주입 이전에 CFA(100 ㎕/마우스, 단일 i.p. 주사) 및/또는 hCG(50 IU/마우스, 3주간 매일 i.p.)를 3일간 주입하였다. 글루코오스 내성 시험은 Lee et al., Nature 408, 483 (2000)에 의해 앞서 기재된 바와 같이 바이러스 주사한 지 4주 후에 실시하였다.
간, 췌장, 비장, 심장, 폐 및 신장과 같은 다양한 조직에서 BTC mRNA의 발현은 주사한 지 4주 후에 RT-PCR에 의해 조사하였다. 간단히, 바이러스 주사한 후 rAd-BTC 및 XX주로 처리된 STZ-유도된 당뇨병 NOD.scid 마우스로부터 다양한 조직을 제거하고, BTC mRNA 및 인슐린 mRNA의 발현은 다음 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 분석하였다:
인간 BTC용 프라이머:
Figure 112007063903697-PCT00013
마우스 인슐린용 프라이머:
Figure 112007063903697-PCT00014
생체내 발현 결과는 도 1D (BTC) 및 도 1E(인슐린)에 도시하며, 이때 기호는 각각 다음에 상응한다: L: 간, Lu: 폐, K: 신장, H: 심장, S: 비장, P: 췌장. 소도 와 같은 세포가 NeuroD 및 BTC를 발현하는 gutless 아데노바이러스로 주사된 STZ-유도된 당뇨병 마우스의 간에서만 생성되는 것으로 보고되었기 때문에 이들 조직에서 인슐린의 발현도 또한 조사하였다(Kojima et al., Nat . Med . 9, 596 (2003)). HPRT의 발현은 내부 대조군으로 사용하였다. BTC mRNA는 모든 시험 조직에서 검출된 것으로 밝혀졌고, 주요 발현은 간에서 관찰되었다. 이들 결과는 BTC가 rAd-CMV-BTC로 처리된 마우스에서 분명히 발현됨을 보여준다. 대조적으로, 인슐린 mRNA는 rAd-BTC-처리된 마우스의 췌장 조직에서만 검출되었지만, 간을 비롯한 다른 조직에서는 검출되지 않았다.
셋째, STZ-유도된 당뇨병 NOD.scid 마우스를 rAd-CMV-BTC로 주사하면 당뇨병의 완화를 유발하는지 여부를 조사하였다. 결과는 도 1F에 나타내며, 여기서 rAd-CMV-BTC (2 x 1011 입자)를 STZ-유도된 당뇨병 NOD.scid (◆) 및 Balb/c 마우스 (●)에 투여하고 혈당치를 측정하였다. 대조군으로서, rAd-CMV-βgal 동일 투여량을 STZ-유도된 당뇨병 NOD.scid 마우스(■)에 투여하였다. 혈당치는 분명히 서서히 감소하였고 바이러스 주사한 지 2주 이내에 정상치에 도달하였다. 정상혈당은 연구 끝까지 100일 이상 동안 유지되었다. 대조적으로, rAd-CMV-βgal로 처리된 마우스는 계속 고혈당이었고 죽었다.
rAd-CMV-BTC 처리후 정상혈당에 도달한 STZ-유도된 당뇨병 마우스에서 글루코오스 내성 시험을 실시하였다. 결과를 도 1G에 나타내며, 여기서 rAd-CMV-BTC 처리(▲) 후 정상인 STZ-유도된 당뇨병 NOD.scid 마우스를 4시간 굶기고 글루코오 스(2 g/kg 체중, i.p.)를 주사하였다. 글루코오스 주사후 지정 시간에 혈당치를 측정하였다. 미처리 NOD.scid 마우스(◆) 및 rAd-βgal-처리된 마우스(■)를 대조군으로 사용하였다.
결과는 rAd-CMV-BTC-처리된 마우스는 정상 마우스와 동일한 글루코오스 제거율을 나타냄을 보여준다. 이들 결과는 BTC 발현이 STZ-유도된 당뇨병 마우스에서 혈당치에 대하여 아무런 영향을 주지 않았던 전의 연구와 대조적이다(Kojima et al., Nat . Med . 9: 596 (2003)). BTC 유전자 요법의 효율에서의 차이는 벡터 및 BTC 유전자 구조뿐만 아니라 발현 형태의 차이에 기인한 것일 수 있다. 예컨대, 상기 연구는 아데노바이러스 벡터를 이용하였고, 전의 연구에서 사용된 헬퍼-의존적 아데노바이러스 벡터에서보다 더 높은 형질감염 효율을 나타낸다. 또한, 분비를 촉진시키기 위하여 알부민 리더 서열을 BTC cDNA의 앞에 삽입하였고 또 사이토메갈로바이러스 프로모터/인헨서 및 β-글로빈 키메라 인트론은 BTC 트랜스진의 강한 발현을 위해 사용되었다. BTC 유전자 요법에 의한 당뇨병의 완전한 완화를 나타내는 본 명세서에 기재된 결과는 우리 센터의 2개의 상이한 독립적인 조사자에 의해 확인되었다.
당뇨병 NOD.scid 마우스를 rAd-CMV-BTC에 의한 처리가 인슐린 생성 세포를 초래하는지 여부를 결정하기 위하여, 간 및 췌장 부분을 항-인슐린 항체로 염색시키고 인슐린-양성 세포의 수를 결정하였다. 이 결과를 도 2A 및 도 2B에 도시한다. 간단히, STZ-유도된 당뇨병 NOD.scid 마우스에 rAd-CMV-BTC (2 x 1011 입자)를 주사 하고 2주 후(BTC-2주) 또는 4주 후(BTC-4주)에 죽였다. rAd-βgal-처리된 당뇨병 NOD.scid 마우스(당뇨병) 및 미처리 NOD.scid 마우스(정상)를 대조군으로 사용하였다. 패널 A는 췌장을 제거하고 헥사톡실린 및 에오신(HE) 또는 항-인슐린 항체(적색) 또는 항-글루카곤 항체(녹색)으로 염색하였다. 패널 B에서, 췌장의 인슐린 함량은 방사성면역분석법 ELISA에 의해 측정하였다.
도 2A 및 도 2B에 도시한 바와 같이, 처리한 지 4주 후, 인슐린-양성 세포는 rAd-CMV-βgal-처리된 마우스에서 보다 rAd-CMV-BTC 처리된 마우스의 췌장에서 5배 더 높게 관찰되었고 또 정상 마우스의 췌장에서 약 40%에 도달하였다. 인슐린 양성 세포는 간에서는 관찰되지 않았다. 소도를 rAd-CMV-BTC 처리한지 2주 후에 항-인슐린 및 항-글루카곤 항체로 이중 염색했을 때, 인슐린 생산 세포는 rAd-CMV-BTC 처리된 마우스의 소도에서 글루카곤 생산 α세포와 개재되어 있는 것으로 밝혀졌는데, 이는 아마도 STZ에 의한 β 세포의 파괴 후 글루카곤 생산 세포가 재배치되고 이어 새로이 형성된 β 세포가 나타나기 때문으로 보인다. 그러나, β 세포는 중앙에 무리를 지어서 rAd-BTC 처리한지 4주 후에 정상 마우스에서 발견된 것과 같이 α 세포에 의해 둘러 싸이며(도 2A), 이는 아마도 소도(islet)의 중앙 영역에서 새로이 형성된 β 세포의 연속적인 증가에 기인한 것으로 보인다.
rAd-BTC 치료가 췌장에서 인슐린 생산 세포의 증가를 초래하는지 확인하기 위하여, rAd-BTC- 및 rAd-βgal-치료된 마우스 및 정상 마우스의 췌장 또는 혈장으로부터 인슐린을 추출하고 그 농도를 Yoon and Notkins, J. Exp . Med . 143: 1170 (1976) 및 Yoon et al., Nature 264: 178 (1978)에 의해 기재된 바와 같은 방사성 면역분석법에 의해 측정하였다. 이 결과를 도 2C 및 도 2D에 도시하며, 이때 패널 C는 글루코오스 로딩(2 g/kg 체중)후 30분 및 희생시키기 전에 ELISA에 의해 측정된 혈청 인슐린 함량을 도시한다. 패널 D는 항-인슐린 항체 염색 후 인슐린-양성 영역의 측정을 도시하며 정상 마우스에서 발견되는 면적 %로서 표시하였다. p<0.01을 rAd-CMV-βgal-처리된 당뇨병 마우스와 비교하였다.
d이는 rAd-CMV-BTC 치료된 마우스(269±22 ng/mg 췌장)의 인슐린 양은 정상 마우스(752±68 ng/mg 췌장)보다는 낮지만 rAd-CMV-βgal 치료된 마우스(116±22 ng/mg 췌장)보다 상당히 더 높았다(도 2C). 혈장 인슐린 양은 글루코오스 로딩 후 ELISA에 의해 측정하였고 rAd-CMV-BTC 처리된 마우스에서 혈장 인슐린 양은 정상 마우스에서 보다는 낮지만(도 2D), rAD-βgal-치료된 당뇨병 마우스와 비교하여 현저히 증가함이 밝혀졌다. 합쳐서 보면, 이들 결과는 인슐린 생산 세포가 rAd-CMV-BTC 처리된 마우스에서 분명히 증가함을 보여주며, rAd-BTC 치료에 의한 당뇨병의 완화는 주로 췌장에서 β 세포의 재생에 기인하였음을 나타낸다. rAd-CMV-BTC 치료된 마우스의 췌장에서 β 세포의 재생에 관련된 가능한 메카니즘은 기존의 β 세포의 복제(Dor et al., Nature 429: 41 (2004)), 비-β 세포를 β 세포로 교차분화(transdifferentiation)(Watada et al., Diabetes 45: 1826 (1996); Yoshida et al., Deabetes 51: 2505 (2002); Mashima et al., Endocrinology 137: 3969 (1996) 및 Ishiyama et al., Diabetologia 41: 623 (1998)) 및 췌장 내의 성인 줄기세포/원시세포로부터 β 세포의 신생(Trucco, M., J. Clin . Invest. 115: 5 (2005); Bouwens, L., Microsc . Res . Tech . 43: 332 (1998) 및 Weir and Bonner-Weir, Nat . Biotechnol. 22: 1095 (2004)를 포함한다.
BTC는 ErbB 수용체에 결합되고 수용체 호모- 또는 헤테로-이합체화, 자가인산화 및 하류 시그널링 경로의 활성화를 유도함으로써 세포 증식 및 분화를 유도하는 것으로 밝혀졌다(Riese et al., Oncogene 12: 345 (1996). ErbB-1 및 ErbB-4의 발현은 정상 인간 췌장의 소도 및 관세포(ductal cell)에서 주로 발견되었다(Miyagawa et al., Endocr . J. 46: 755 (1999)) 또 ErbB-2, ErbB-3 및 ErbB-4는 태아 췌장 발생 동안 췌장에서 발견된 것으로 밝혀졌다(Kritzik et al., J. Endocrinol. 165: 67 (2000)). 마찬가지로, ErbB-2의 발현은 NOD 마우스에서 면역세포에 의해 팽윤된 영역에 인접한 소도 세포에 도입되는 것으로 밝혀졌다. BTC, 표시 생장 인자, 및 뉴로레귤린을 포함한 몇 개의 리간드는 ErbB-1, ErbB-2 또는 ErbB-4에 의해 헤테로이합체화를 통하여 ErbB-2의 인산화 및 활성화를 매개한다(Kritzik et al., 상기 참조). rAd-CMV-BTC 처리된 당뇨병 마우스에서 β 세포의 재생이 ErbB 수용체에 의해 매개되었는지 여부를 결정하였다.
이와 관련하여, 정상 마우스, STZ-유도된 당뇨병 마우스 및 rAd-CMV-BTC 처리된 당뇨병 마우스의 췌장 소도에서 ErbB-1, -2, -3 및 -4dml 발현은 항-ErbB 항체를 사용한 면역조직화학적 염색에 의해 실시하였다. 도 3에 도시된 결과는 rAd-CMV-BTC에 의한 당뇨병의 완화에 관련됨을 보여준다. 요컨대, 패널 A는 ErbB-2가 rAd-CMV-BTC 처리된 마우스 및 rAd-CMV-βgal-처리된 (당뇨병) STZ-유도된 당뇨병 마우스뿐만 아니라 항-ErbB-1, -2, -3- 또는 -4항체에 의해 염색된 미처리 (정상) NOD.scid 마우스로부터 제조한 췌장 분비를 도시한다. 대표적인 소도의 광현미경이 도시되어 있다. 패널 B는 rAd-CMV-BTC (2 x 1011 입자)에 의해 처리된 STZ-유도된 당뇨병 NOD.scid 마우스를 도시한다. 바이러스 주사한 후 3일에, 마우스를 부형제(▼), AG1478(○), ErbB1 수용체 억제제, 또는 AG825(●), ErbB-2 수용체 억제제 (캡티솔 중의 500 ㎍, i.p.)로 10일 동안 하루에 2번씩 처리하였다. 혈당치를 측정하였다.
철야 동안 메타칸(60% 메탄올 v/v, 30% 클로로포름 v/v, 및 10% 빙초산 v/v)에 췌장을 고정함으로써 면역조직화학적 분석을 실시하였고 메틸 알코올의 2회 변화, 메틸 벤조에이트, 크실렌의 2회 변화 및 파라핀으로 매립으로 가공하였다. 파라핀제거 및 재수화 후, 조직 영역을 오븐(95℃ 10분간, 10 mM 시트레이트, pH 6.0)에 두어 항원을 회수하고 블로킹 용액(5% 염소 또는 말 혈청, 1% BSA 및 PBS 중의 0.05% Tween-20)으로 블로킹하였다. 이들 조직을 일차 항원 용액; 기니아-돼지 항-인슐린 (DAKO, 희석 1:500), 토끼 항-글루카곤(DAKO, 희석 1:200), 염소 항-ErbB-1 및 토끼 항-ErbB-2, -3 및 -4(Santacruz, 희석 1: 100)과 함께 배양하였다. 2차 항체의 경우, Cy3-콘쥬게이트된 염소 항-기니아 돼지 IgG (Jackson ImmunoRes., PA 희석 1:200) 및 Cy2-콘쥬게이트된 항-토끼 IgG (Jackson ImmunoRes., PA 희석 1:200), HRP-콘쥬게이트된 염소 항-토끼 IgG (Chemicon, 희석 1:500) 및 HRP-콘쥬게이트된 말 항-염소 IgG (Chemicon, 희석 1:500)을 사용하였다. 레이저 스캐닝 콘포칼 형광 현미경(Zeiss LSM 510)을 사용하여 형광을 영상화하고 퍼옥시다아제 염색은 크로모겐(보라색)으로 VIP를 사용하여 실시하였다(VIP 키트; 벡터 라보라토리스).
티로신 키나아제 억제제를 사용한 생체내 처리는 STZ-유도된 당뇨병 NOD.scid 마우스에 rAd-CMV-BTC (2 x 1011 입자, i.v.)를 주사함으로써 실시하였고 또 100 ㎕의 100 mM 캅티솔(Cydex Inc.) 중의 티로신 키나아제 억제제, AG1478 또는 AG825 (500㎍)fmf 바이러스 주사한 지 3일 후에 시작해서 10일 동안 하루에 2회식 복강내 투여하였다. 부형제 만(100 mM 캅티솔)을 대조군으로 주사하였다. 모든 연구용 그룹 사이의 차이의 통계는 스투덴트(Student)의 t 시험에 의해 분석하였다. P < 0.05 양은 유의한 것으로 판단된다.
ErbB-1은 이들 마우스 모두의 소도에서 약하게 발현되는 것으로 관찰되었고, 또 ErbB-3 및 ErbB-4 발현은 이들 마우스의 소도에서 관찰되지 않았다. 대조적으로, ErbB-2는 rAd-CMV-BTC-처리된 마우스 및 미처리 STZ-유도된 당뇨병 마우스 모두의 췌장 소도에서 정상 마우스와 비교하여 높게 발현되었다(도 3A). ErbB-1 및 ErbB-2 수용체는 소도에서 발현되는 것으로 밝혀졌기 때문에, BTC-유도된 당뇨병의 완화에서 관여를 평가하였다. ErbB-1 및 ErbB-2 수용체 시그널링 경로의 특정 블로커로서 AG1478 또는 AG825를, 바이러스 주사한 후 3일째부터 10일간 STZ-유도된 당뇨병 마우스, rAd-CMV-BTC 처리된 NOD.scid 마우스에 주입한 후 혈당치를 측정하였다. A825의 주사는 rAd-BTC에 의한 당뇨병의 완화를 폐기시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 바이러스 주사한 지 13일째 되는 날에 AG825 주사를 중지하면, 혈당치는 서서히 감소하여 바이러스 주사한 지 23일에 정상혈당으로 되었다(약 100 mg/dl). 당뇨병의 BTC-유도된 완화의 폐기에 대한 AG1478의 효과는 AG825의 효과에 비해 덜 현저하였다(도 3B). 이러한 차이가 AG1478에 의한 ErbB-1 수용체의 불완전한 차단에 기인한 것인지 또는 ErbB-1 및 ErbB-2를 사용한 BTC의 상호작용에서 기능적 차이에 기인한 것인지는 명확하지 않다. 그럼에도 불구하고, 이들 결과는 ErbB-2가 BTC에 의해 당뇨병의 완화에 관여함을 나타낸다.
인간 자가면역 1형 당뇨병의 모델인 자가면역 당뇨병 NOD 마우스에서 rAd-CMV-BTC 유전자 요법의 효과를 조사하였다. rAd-CMV-BTC (4 x 1011 입자, i.v.)를새로이 생긴 당뇨병 NOD 마우스(혈당치 > 500 mg/dl)에 주사하고 혈당치 변화를 평가하였다. 그 결과를 도 4에 나타내며, 이때 패널 A는 rAd-BTC (2 x1011 입자)를 주사하기 전에 CFA(100 ㎕)로 3일간 피하주사된 자가면역 당뇨병 NOD 마우스(혈당치 > 500 mg/dl)를 도시한다. ◆, CFA로 주사된 rAd-BTC; ▲, rAd-BTC 단독; ●, CFA 단독. 패널 B는 바이러스 주사한 지 3개월째에 rAd-CMV-BTC/CFA 처리된 NOD 마우스 췌장의 항-인슐린 항체 염색을 도시한다. 몇 개의 소도는 항-인슐린 항체에 의해 강하게 염색되고 T 세포에 의해 둘러싸이지만, 현저한 침윤은 발견되지 않았다. 패널의 상부는 미처리 당뇨병 NOD의 소도에 상응하는 반면에, 하부는 rAd-CMV-BTC/CFA-처리된 NOD의 소도에 상응한다. 패널 C는 글루코오스 내성 시험의 결과를 도시한다. rAd-CMV-BTC/CFA-처리(◆) 후에 혈당치가 정상화된 당뇨병 NOD 마우스를 4시간 동안 굶긴 다음 글루코오스 (2 g/kg 체중, i.p.)을 주사하였다. 글루코오스 주사 후 지시된 시간에 혈당치는 정상화되었다. CFA 단독 처리된 당뇨병 NOD(▲) 및 비당뇨 NOD 마우스(■)는 대조군으로 사용하였다.
바이러스 주사한 후 4-5일에 혈당치는 300 mg/dl 아래로 감소되는 것으로 관찰되었지만, 바이러스 주사한 후 2주에는 500 mg/dl 이상으로 회복되었는데, 이는 아마도 재생 인슐린 생산 세포가 자가면역 반응에 의해 다시 공격을 받기 때문으로 보인다(도 4A). 완전 프로인트 조제(CFA)는 면역조절성 T 세포의 도입에 의해 NOD 마우스에서 당뇨병을 방지하는 것으로 밝혀졌다(Qin et al., J. Immunol . 150: 2072 (1993)). 마찬가지로, 최근의 연구는 이팩터(effector)와 조절 T 세포 사이의 미세하게 조정된 면역균형의 제어가 NOD 마우스에서 자가면역 당뇨병의 예방을 초래함을 나타내었다(Khil et al., Diabetes 53 (Suppl.1), A43 (2004). 따라서, 당뇨병 NOD 마우스에서 면역 균형의 제어는 rAd-CMV-BTC에 의한 치료 전에 CFA 주사에 의해 평가하였다. 새로이 발생한 당뇨병 NOD 마우스에 CFA(100 ㎕, i.p.)를 주사하고 3일 후 rAd-CMV-BTC (4 x 1011 입자)로 처리한 다음 혈당치를 조사하였다. 결과는 바이러스 주사한지 2-3주에 혈당치가 정상화되었고, 정상혈당치는 실험이 끝날 때까지 90일 이상 동안 유지되었음을 보여준다. CFA만 사용한 당뇨병 NOD의 처리는 혈당치에 아무런 효과를 나타내지 않았다(도 4A).
바이러스 주사한 후 3개월째에 rAd-CMV-BTC 처리된 NOD 마우스의 췌장 영역을 조사하면, 재생된 소도는 면역세포로 둘러싸여 있지만 그들에 의해 침윤되지 않았음이 밝혀졌다(도 4B). CFA를 주사한 rAd-CMV-BTC 처리된 NOD 마우스 및 정상 마우스 사이의 혈당 제거율에 현저한 차이가 없음이 이들 마우스에서 글루코오스 내 성 시험으로 밝혀졌다. 대조적으로, CFA를 주사한 rAd-CMV-βgal-처리된 NOD 대조군 마우스의 혈당치는 측정 매 시간에서 rAd-BTC 처리된 마우스에 비하여 상당히 더 높았다(도 4C). 이들 결과는 면역 균형이 적절히 제어될 때 rAd-BTC 유전자 요법이 자가면역 당뇨병의 완전한 완화를 초래할 수 있음을 나타낸다.
화학적으로 유도되고 자연적인 자가면역 당뇨병 마우스인 당뇨병의 2개 동물 모델을 사용하여, 결과는 rAd-CMV-BTC 처리된 마우스에서 BTC의 구성적 발현 및 분비는 ErbB-2 수용체를 통하여 췌장에서 인슐린 생산 세포의 재생을 유도하여 결국 장기간 동안 당뇨병의 완전한 완화를 초래함을 보여준다. 동물 모델에서 이러한 BTC 유전자 요법의 성공은 인간에서 1형 당뇨병의 치료에 대한 치료 유용성과 더불어 재생된 β 세포의 자가면역 공격을 중지시키는 면역학적 전략을 나타낸다. BTC 유전자 요법은 이식 요법을 제한하는 면역학적으로 일치되는 공여자 소도(islet)의 부족을 극복하며 어떠한 외과적 과정을 필요로 하지 않는다.
본 출원을 통하여 다수의 문헌이 괄호로 표시하여 참조하였다. 이들 문헌에 기재된 내용은 모두 본 발명에 관련되는 기술분야를 더욱 충분히 기재하기 위하여 본 출원에서도 참고문헌으로 포함된다.
본 발명은 예시된 구체예를 예를 들어 기재하였지만, 당업자라면 상술한 바와 같은 특정 실시예 및 연구는 본 발명의 예시일 뿐임을 잘 알고 있을 것이다. 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 한 다양한 변화가 가능함도 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 이하의 특허청구범위에 의해서만 제한된다.
<110> Biotech Institute for International Innovation, Inc. 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Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys 20 25 30 Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys 35 40 45 Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys 50 55 60 Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr 65 70 75 80 <210> 3 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Arg Ala Ala Arg Cys Ser Gly Ala Ser Ser Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ile Ala Leu Gly Leu Val. Ile Leu His Cys Val Val Ala Asp 20 25 30 Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp 35 40 45 Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gin Ser Lys Arg Lys Gly 50 55 60 His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly 65 70 75 80 Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp 85 90 95 Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr Leu 100 105 110 Arg Gly Asp Arg Gly Gln Ile Leu Val Ile Cys Leu Ile Ala Val Met 115 120 125 Val Val Phe Ile Ile Leu Val Ile Gly Val Cys Thr Cys Cys His Pro 130 135 140 Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Lys Glu Glu Glu Met Glu Thr 145 150 155 160 Leu Gly Lys Asp Ile Thr Pro Ile Asn Glu Asp Ile Glu Glu Thr Asn 165 170 175 Ile Ala <210> 4 <211> 178 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 4 Met Ala Arg Ala Ala Pro Gly Ser Gly Ala Ser Pro Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Pro Ala Leu Ala Leu Gly Leu Val Ile Leu His Cys Val Val Ala Asp 20 25 30 Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Asp Asp Gly Leu Leu Cys Gly Asp 35 40 45 His Ala Glu Asn Cys Pro Ala Thr Thr Thr Gin Pro Lys Arg Arg Gly 50 55 60 His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly 65 70 75 80 Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp 85 90 95 Glu Gly Tyr Ala Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr Leu 100 105 110 Arg Gly Asp Arg Gly Gln Ile Leu Val Ile Cys Leu Ile Ala Val Met 115 120 125 Val Ile Phe Ile Ile Leu Val Val Ser Ile Cys Thr Cys Cys His Pro 130 135 140 Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Arg Lys Lys Glu Glu Glu Met Glu Thr 145 150 155 160 Leu Gly Lys Asp Ile Thr Pro Ile Asn Asp Asp Ile Gln Glu Thr Ser 165 170 175 Ile Ala <210> 5 <211> 177 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Asp Pro Thr Ala Pro Gly Ser Ser Val Ser Ser Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Ile Ala Leu Gly Leu Ala Ile Leu His Cys Val Val Ala Asp 20 25 30 Gly Asn Thr Thr Arg Thr Pro Glu Thr Asn Gly Ser Leu Cys Gly Ala 35 40 45 Pro Gly Glu Asn Cys Thr Gly Thr Thr Pro Arg Gln Lys Val Lys Thr 50 55 60 His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile His Gly 65 70 75 80 Arg Cys Arg Phe Val Val Asp Glu Gln Thr Pro Ser Cys Ile Cys Glu 85 90 95 Lys Gly Tyr Phe Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr Leu 100 105 110 Gln Gln Asp Arg Gly Gin Ile Leu Val Val Cys Leu Ile Val Val Met 115 120 125 Val Val Phe Ile Ile Leu Val Thr Gly Val Cys Thr Cys Cys His Pro 130 135 140 Leu Arg Lys His Arg Lys Lys Lys Lys Glu Glu Lys Met Glu Thr Leu 145 150 155 160 Asp Lys Asp Lys Thr Pro Ile Ser Glu Asp Ile Gin Glu Thr Asn Ile 165 170 175 Ala <210> 6 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus alignment sequence of BTC <400> 6 Met Ala Pro Ser Ser Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Ile Leu 1 5 10 15 His Cys Val Val Ala Asp Gly Asn Thr Arg Pro Glu Gly Leu Cys Gly 20 25 30 Glu Asn Cys Thr Thr Lys His Phe Ser. Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys 35 40 45 His Tyr Cys Ile Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Glu Gln Thr Pro Ser 50 55 60 Cys Cys Gly Tyr Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Asp Arg Gly Gin Ile Leu Val Cys Leu Ile Val Met Val Phe Ile Ile 85 90 95 Leu Val Cys Thr Cys Cys His Pro Leu Arg Lys Arg Lys Lys Lys Glu 100 105 110 Glu Met Glu Thr Leu Lys Asp Thr Pro Ile Asp Ile Glu Thr Ile Ala 115 120 125 <210> 7 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary hypothetical leader sequence - not derived from any organism <400> 7 atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60 gtgtttcgtc gagat 75 <210> 8 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary hypothetic leader sequence - not derived from any organism <400> 8 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gac 63 <210> 9 <211> 1647 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic adenoviral vector sequence <220> <221> promoter <222> (1)...(795) <223> CMV Promoter/Enhancer <220> <221> intron <222> (857)...(989) <223> B-Globin/IgG Chimneric Intron <220> <221> polyA_signal <222> (1426)...(1647) <223> SV40 late PolyASignal <220> <221> sig_peptide <222> (1095)...(1166) <223> Albumin leader sequence <220> <221> CDS <222> (1167)...(1406) <223> Betacellilin[1-80] cDNA <400> 9 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660 cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780 tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840 gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa 900 actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac 960 tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta 1020 aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcctc gagaattcac gcgtggtacc 1080 tctagagtcg acccatgaag tgggtaacct ttatttccct tctttttctc tttagctcgg 1140 cttattccag gggtgtgttt cgtcgagatg ggaattccac cagaagtcct gaaactaatg 1200 gcctcctctg tggagaccct gaggaaaact gtgcagctac caccacacaa tcaaagcgga 1260 aaggccactt ctctaggtgc cccaagcaat acaagcatta ctgcatcaaa gggagatgcc 1320 gcttcgtggt ggccgagcag acgccctcct gtgtctgtga tgaaggctac attggagcaa 1380 ggtgtgagag agttgacttg ttttactagg ggcggccgct tcgagcagac atgataagat 1440 acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg 1500 aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca 1560 acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga gatgtgggag gttttttaaa 1620 gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggta 1647 <210> 10 <211> 312 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60 gtgtttcgtc gagatgggaa ttccaccaga agtcctgaaa ctaatggcct cctctgtgga 120 gaccctgagg aaaactgtgc agctaccacc acacaatcaa agcggaaagg ccacttctct 180 aggtgcccca agcaatacaa gcattactgc atcaaaggga gatgccgctt cgtggtggcc 240 gagcagacgc cctcctgtgt ctgtgatgaa ggctacattg gagcaaggtg tgagagagtt 300 gacttgtttt ac 312 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 agtgggtaac ctttatttcc 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 gtaaaacaag tcaactctct c 21 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 aggcttttgt caagcag 17 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 ctgatctaca atgccacg 18

Claims (25)

  1. 프로모터, 인트론, 분비성 리더 서열 암호화 핵산, 인간 베타셀룰린(BTC) 암호화 핵산, 또는 그의 기능적 단편, 및 폴리아데닐화 시그널 서열을 기능적으로 연결하는 핵산을 갖고, BTC의 발현이 분비된 성숙 BTC를 생산하는 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 벡터.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 분비 리더 서열 암호화 핵산은 알부민 또는 면역글로불린 카파 사슬 리더 서열인 벡터.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 분비성 리더 서열 암호화 핵산은 알부민 분비성 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 인간 BTC 암호화 핵산은 서열번호 1과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 인간 BTC 암호화 핵산은 서열번호 2에 기재된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 알부민 분비성 리더 서열 암호화 핵산은 서열번호 7과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  8. 청구항 4에 있어서, 상기 알부민 분비성 리더 서열 암호화 핵산은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-72와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  9. 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 인헨서 영역, β-글로빈 키메라 인트론, 알부민 리더 서열 암호화 핵산, 인간 베타셀룰린(BTC) 암호화 핵산 또는 그의 기능적 단편, 및 SV40 폴리아데닐화 시그널 서열을 기능적으로 연결하는 핵산을 갖고, BTC의 발현이 분비된 성숙 BTC를 생산하는 벡터.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 벡터.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 인간 BTC 암호화 핵산은 서열번호 1과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 인간 BTC 암호화 핵산은 서열번호 2와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 알부민 분비성 리더 서열 암호화 핵산은 서열번호 7과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  14. 청구항 9에 있어서, 상기 알부민 분비성 리더 서열 암호화 핵산은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 1-72와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  15. 청구항 9에 있어서, 서열번호 9에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
  16. 청구항 1, 9 또는 15 중 어느 한 항에 따른 벡터를 함유하는 숙주 세포.
  17. 분비된 성숙 인간 베타쿨린(BTC) 또는 그의 기능적 단편을 발현하는 벡터로서 프로모터, 인트론, 분비성 리더 서열 암호화 핵산, 인간 베타셀룰린(BTC) 암호화 핵산, 또는 그의 기능적 단편, 및 폴리아데닐화 시그널 서열을 기능적으로 연결한 핵산을 포함하는 벡터를 갖는 바이러스 입자 유효량을 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 분비성 리더 서열 암호화 핵산은 알부민 또는 면역글로불린 카파 사슬 리더 서열인 방법.
  20. 청구항 17에 있어서, 상기 분비성 리더 서열 암호화 핵산은 알부민 분비성 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  21. 청구항 17에 있어서, 상기 인간 BTC 암호화 핵산은 서열번호 1과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  22. 청구항 17에 있어서, 상기 인간 BTC 암호화 핵산은 서열번호 2와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  23. 청구항 20에 있어서, 상기 알부민 분비성 리더 서열 암호화 핵산은 서열번호 7과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  24. 청구항 20에 있어서, 상기 알부민 분비성 리더 서열 암호화 핵산은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 1072과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  25. 청구항 17에 있어서, 상기 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체로 투여되는 방법.
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