KR20010074466A - 당뇨병 치료제 - Google Patents
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Abstract
치료를 필요로 하는 환자의 당뇨병을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 상기 방법은 성숙한 인슐린 분비 세포로의 췌장 섬세포 전구체 세포들의 분화를 효과적으로 촉진시키는 가스트린/CCK 수용체 리간드 및/또는 EGF 수용체 리간드를 포함하는 조성물을 개인에게 투여함으로써 이들을 필요로 하는 개인에게서 당뇨병을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 조성물은 전신적으로 투여될 수 있으며, 또한 가스트린/CCK 수용체 리간드 유전자 예를 들어, 프레프로가스트린 펩티드 전구체 유전자 및 EGF 수용체 리간드 유전자 예를 들어, TGF-α 유전자중의 어느 하나 또는 양자 모두를 부가한 유전자 전이 세포에 의해 발현된다. 상기 방법은 또한 배양된 췌장 섬을 환자에게 이식시키는 것을 포함하며, 여기서 성숙된 인슐린 분비 세포가 가스트린/CCK 수용체 리간드 및 EGF 수용체 리간드에 의해 증식된다.
Description
당뇨병은 모든 연령층 및 인구에 걸쳐 가장 보편적인 내분비 질환 중 하나이다. 임상학적인 병질 및 사망률에 추가적으로, 당뇨병에 대한 경제적 비용은 엄청나며, 미국에서만 연간 900억 달러를 초과하고, 당뇨병의 확산은 2010년에 2배 이상 증가할 것으로 예상된다.
당뇨병에는 2가지 주요 형태가 있다: 모든 경우의 5내지 10%에 해당하는 인슐린 의존성(타입 1) 당뇨병(IDDM) 및 경우의 대략 90%를 포함하는 인슐린 비의존성(타입 2) 당뇨병(NIDDM). 타입 2 당뇨병은 노령화와 관련되어 있지만 소위 젊은이의 성숙기에 개시되는 당뇨병(MODY)인 NIDDM으로 진단되는 젊은이의 수가 증가하는 추세이다. 타입 1 및 타입 2 모두의 경우에서, 인슐린 분비의 상실이 존재하며, 이는 췌장에서의 β-세포의 파괴 또는 인슐린의 분비 또는 생성의 결함을 통해 일어난다. NIDDM에서, 환자들은 전형적으로 최적 다이어트에 대한 식이요법, 체중 감량 및 운동에 의한 치료를 받는다. 약물 치료는 이것들이 더 이상 적당한 대사 조절을 제공하지 않는다고 판단될 때 시작한다. 초기 약물 치료는 β-세포 인슐린 분비를 자극시키는 설포닐요소를 포함하지만, 또한 비구아니드, α-글루코시다제 저해제, 티아졸리덴디온 및 공동 치료를 포함할 수 있다. 그러나 타입 2 당뇨병에서 작동하는 질병 메카니즘의 진행성을 제어하기 어렵다는 것은 주목할 만 하다. 모든 약물 치료된 당뇨병 환자 중 50% 이상은 약물 투여에 상관없이 6년 이내에 빈약한 글리세르닉 제어를 나타낸다. 인슐린 치료는 타입 2 당뇨병의 치료에서 마지막 행선지로써 주로 간주되며, 인슐린의 사용에 대한 환자의 내성이 존재한다.
췌방 도세포는 태아 도관의 췌장 내피에 있는 내배엽 스템 세포로부터 발생하며, 이것은 또한 외분비성 췌장으로 발달하는 분화다능성 스템 세포를 포함한다[참조 : Teitelman and Lee,Developmental Biology, 121:454-466 (1987); Pictet and Rutter,Development of the embryonic encocrine pancreas, in Endocrinology, Handbook of Physiology, ed. R.O. Greep and E.B. Astwood (1972), American Physiological Society: Washington, D.C., p.25-66]. 도세포 발생은 극적인 변화기에 의해 강조되는 태아 임신 동안 분리된 발생 단계들을 통해 진행된다. 처음 기간은 최초분화 단계이며 최초분화된 세포에 의한 인슐린 및 글루카곤의 발현에 의해 명백해진 바와 같이, 도세포에 분화다능 스템 세포가 연결됨을특징으로 한다. 이 최초분화된 세포들은 도세포 특이적 유전자 산물을 낮은 수준으로만 발현시키고 성숙한 도세포의 세포분화가 결여된 도세포 전구체 세포들을 포함한다[참조 : Pictet and Rutter,supra]. 마우스 임신에서 16일 경에, 최초분화된 췌장은 도세포들의 세포분화 및 도세포 특이적 유전자 발현의 수 백배 증가를 특징으로 하는 신속한 성장 및 분화기를 시작한다. 조직학적으로, 도세포 형성(신발생)은 췌장 도관으로부터 증식하는 도세포 돌기로서 분명해진다(췌도세포증). 출생 직전에 도세포 성장의 속도는 느려지며, 도세포 신발생 및 췌도세포증은 훨씬 불분명해진다. 이에 수반하여, 도세포들은 인슐린 유전자 발현의 최대 수준으로 완전하게 분화된 상태에 이르게 된다. 그러므로, 많은 기관들과 마찬가지로, 세포 분화의 완성은 감소된 재생성 잠재능을 수반하며; 분화된 성숙한 췌장은 발생중인 췌장과 같은 동일한 재생성 잠재능 또는 번식 능력을 가지고 있지 않다.
최초분화된 전구체들의 분화는 췌장의 후기 태아 발생 동안 일어나며, 도세포 분화를 조절하는 인자들은 이 기간 동안에 췌장에서 발현되는 것 같다. 도세포 발생 동안 발현된 유전자들 중 하나는 위장내 펩티드인 가스트린을 암호화한다. 가스트린은 산 분비를 조절하는 가스트린 호르몬으로서 성인에서 작용하지만, 태아에서 가스트린이 발현되는 주요 부위는 췌장의 도세포이다[참조 : Brand and Fuller,J. Biol. Chem.,263:5341-5347 (1988)]. 췌장의 도세포에서 가스트린의 발현은 일시적이다. 최초분화된 도세포 전구체들이 분화된 도세포를 형성할 때의 기간으로 한정된다. 도세포 발생에서 췌장의 가스트린의 중요성은 알려지지 않았지만, 일부 임상학자들은 다음과 같은 도세포 발생에서 가스트린에 대한 법칙을 제안하고 있다. 예를 들어, 가스트린을 발현시키는 도세포 종양에 의해 발생된 고가스트린혈증 및 위축성 위염은 분화중인 태아 도세포에서 관찰된 것과 유사한 췌도세포증을 수반한다[참조 : Sacchi et al.,Virchows Archiv B,48:261-276 (1985); and Heitz et al.,Diabetes,26:632-642 (1997)]. 또한, 췌장 가스트린의 비정상적인 지속성이 유아성 췌도세포증의 경우에서 보고되었다[참조 : Hollande et al.,Gastroenterology,71:251-262 (1976)]. 그러나, 췌도세포증과 가스트린 자극간의 우연적 관계가 성립한다는 관찰은 없었다.
그러므로 초기 IDDM의 치료 및 NIDDM에서 β-세포 결함의 방지에서 가치가 있을 수 있는 도세포 재생성을 자극시키는 약제의 동정에 관심을 가지고 있다.
본 명세서에 참조된 인용들이 본 발명에 대해 선행 기술이라는 승인으로서 파악되서는 안될 것이다.
관련 문헌
3개의 생장 인자들을 태아 췌장, 가스트린의 발생에 포함시켰으며, 생장 인자 α(TGF-α) 및 상피 생장 인자(EGF)를 형질전환시켰다[참조 : Brand and Fuller,J. Biol. Chem.263:5341-5347]. TGF-α 또는 가스트린 단독을 과잉 발현시키는 트랜스제닉 마우스들은 활발한 도세포 성장을 보여주지 않았지만, 이동유전자 전부를 발현시키는 마우스는 현저하게 증가된 도세포 질량을 나타내었다[참조 : Wang et al, (1993)J. Clin. Invest. 92:1349-1356]. 보웬스 및 피펠러스(Bouwens and Pipeleers)는 문헌[참조 : (1998)Diabetoligia41:629-633]에서 정상적인 인간 췌장에서 β-세포가 고비율로 돌기를 생성시키며 모든 β-세포 중 15%가 단일유닛으로서 발견됨을 보고하였다. 단일 β-세포 초점은 어른(자극되지 않은) 래트 췌장에서 보편적으로 발견되지 않으며; 왕 등(Wang et al)은 문헌[참조 : (1995) Diabetologia 38:1405-1411]에서 전체 β-세포수의 대략적으로 1%에 대한 빈도수를 보고하였다.
캡슐화된 도세포 이식 후에 타입 1 당뇨병 환자에서 인슐린 독립성은 문헌[참조 : Soon-Shiong et al., (1994)Lancet 343:950-51]에 기술되어 있다. 또한 다음 문헌들[참조 : Sasakiet al., (1998 Jun 15)Transplantation 65(11):1510-1512; Zhouet al., (1998 May)Am. J. Physiol. 274(5 Pt 1):C1356-1362; Soon-Shionget al., (1990 Jun)Postgrad. Med. 87(8):133-134; Kendallet al., (1996 Jun)Diabetes Metab 22(3):157-163; Sandleret al(1997 Jun)Transplantation 63(12):1712-1718; Suzukiet al(1998 Jan)Cell Transplant 7(1):47-52; Soon-Shionget al(1993 Jun)Proc Natl Acad Sci USA 90(12):5843-5847; Soon-Shionget al(1992 Nov)Transplantation 54(5): 769-774; Soon-Shionget al(1992 Oct)ASAIO J 38(4):851-854; Benhamouet al(1998 Jun)Diabetes Metab 24(3):215-224; Christiansenet al(1994 Dec)J Clin Endocrinol Metab 79(6):1561-1569; Fragaet al(1998 Apr)Transplantation 65(8):1060-1066; Korsgrenet al(1993)Ups J Med Sci 98(1):39-52; Newgardet al(1997 Jul)Diabetologiz 40 Suppl 2:S42-S47]을 참조하라.
발명의 요약
본 발명은 가스트린/CCK 수용체 리간드, EGF 수용체 리간드 또는 성숙한 인슐린 분비 세포들로의 환자의 췌장 도세포 전구체 세포들의 효과적인 분화를 위해 충분한 양으로 둘 모두의 조합물을 투여함으로써 이들을 필요로 하는 환자에게서 당뇨병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이 조성물은 전신 투여될 수 있거나 췌장 도세포 전구체 세포들에서 기능적인 전사 및 번역 조절 부위들과 함께, 가스트린 CCK 수용체 리간드에 대한 코딩 서열 또는 EGF 수용체 리간드에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 제조물이 발현 벡터에 포함되어 있는 숙주 세포에 의해 동일계내에서 발현될 수 있다. 또한 본 발명은 도세포에서 췌장 베타 세포들의 수를 증가시키기 위한 가스트린/CCK 수용체 리간드 및 EGF 수용체 리간드의 충분한 양에 배양액에 노출되어 있는 당뇨병 환자 췌장 도세포내로 이식시킴으로써 이들을 필요로 하는 환자들의 당뇨병을 치료하기 위한 방법들 및 조성물들을 제공하며; 임의로 췌장 베타 세포의 군집이 이식 이전에 β-세포의 군집을 확장시키기에 충분한 시간동안 배양액내에서 성장될 수 있다. 이 방법 및 조성물은 당뇨병을 가진 환자들을 치료하는 데 사용된다.
도면의 간략한 설명
도 1A는 면역페록시다제 염색법으로 TGF-α트랜스제닉 췌장으로부터의 성숙기 도곤에서 수많은 인슐린 염색 세포들을 보여주는 이미지이다. 도 1B는 인슐린에 대해 약하게 연색된 대부분의 도관 세포들을 보여주는 이미지이지만, 종종 도관 세포들을 인접한 도세포로서 동일한 강도의 인슐린 염색을 사용하여 염색하였다.
도 2A는 키메라 인슐린 프로모터-가스트린(INSGAS) 전달 유전자의 구조를 개략적으로 보여준다. 도 2B는 INSGAS 트랜스제닉 마우스로부터의 췌장 추출물의 방사선면역검정이 내생적인 뮤린 유전자로부터 발현된 위의 공동에서의 가스트린 함량을 초과하는 높은 수준의 가스트린 면역활성을 보여줌을 도시하였다. INSGAS 트랜스제닉 마우스는 출생 후 췌장에 가스트린의 높은 발현율을 가진다.
도 3A는 실시예 3에 의해 보고된 연구에서 사용된 INSGAS/TGF-α 마우스의 췌장 조직학에 대한 이미지이다. INSGAS/TGF-α 췌장은 증가된 도관 복합체의 일부 부위 및 약간 증가된 간질성 세포질을 가지고 있다. 도 3A에서 제시된 영역은 사용된 5마리 동물들에서 가장 심각하게 비정상적인 조직학을 가지고 있다. 도 3B는 실시예 3으로부터의 대조군 마우스의 췌장 조직학에 대한 이미지이다. 도 3C는 실시예 3으로부터의 TGF-α 마우스의 췌장 조직학에 대한 이미지이다. 실시예 3에서 보고된 연구로부터의 TGF-α 마우스 췌장의 이 영역은 전형적인 것이며 간질성 세포질 및 자판 등(Jhappanet al.)의 문헌[참조 :supra]에 기술되어 있는 붉은색의 도관 성숙기와 결합된 섬유증을 보여준다.
도 4A는 포인트를 도해하고 = 형태측정 자료를 집계하여 그래프로 표현한 막대그래프이며 17주에 INSGAS/TGF-α 마우스의 췌장이 실시예 3에서 보고된 연구에 기초한 TGF-α 마우스의 췌장보다 낮은 도관 질량을 가짐을 확인시켰다. 도 4B는 포인트를 도해하고=형태 측정 자료를 집계하여 그래프로 표현한 막대그래프이며 INSGAS/TGF-α 췌장에서 가스트린 및 TGF-α의 동시 발현이 비트랜스제닉 대조군 마우스에 상응하는 도세포 질량에 비해 도세포 질량을 현저하게 증가시켰음을 보여준다. 또한 TGF-α단독 발현은 도세포 질량을 증가시키지 않았다. 이 자료들은 실시예 3에 기술된 연구에 기초한 것이다.
도 5는 PBS로 처리된 스트렙토조토신 유도된 당료병 걸린 위스타(Wistar) 래트에서의 글루코오스 내성에 대한 TGF-α와 가스트린(빈 원), 또는 10일 동안 복강내로 주입된 TFG-α와 가스트린의 조합체(빈 정사각형)의 효과를 도시하는 도면이다.
도 6은 실시예 7에 기술된 바와 같은 상응하는 PBS 대조군(n= 그룹당 6)과 함께 처리된 주커(Zucker) 래트의 3개 그룹에서의 β-세포 신생물에 대한 TGF-α와 가스트린 처리의 효과를 도시하는 도면이다. (1)로 표시된 바아(bar)는 여윈 래트의 TFG+가스트린을 나타내고, (4)로 표시된 바아는 살찐 래트의 TGF+가스트린을 나타내며, (5)로 표시된 바아는 살찐 래트의 PBS 대조군을 나타내고, (3)으로 표시된 바아는 pre TGF+가스트린을 나타내며, (2)로 표시된 바아는 여윈 래트의 PBS 대조군을 나타낸다. TGF-α 및 가스트린은 PBS 처리된 대조군 동물과 비교하여 연구된 모든 그룹에서의 단일 β-세포 병소의 상대적인 비율을 상당히 증가시켰다. 그룹 4와 5는 그룹 1과 2가 상당히 다른 것과 같이(p<0.0041) 상당히 다르다(p<0.0015).
도 7은 여윈 및 살찐 주커 래트에서의 β-세포 신생물에 대한 TGF-α 및 가스트린 처리의 효과를 도시하는 도면이다. β-세포 신생물은 전체 β-세포 및 새로이 발생된 단일 β-세포 병소를 미분 계수함으로써 정량되고 이러한 정량치는 계수된 전체 β-세포의 백분율로서 표현된다. 성장 인자 조합체로 처리된 여윈 루커 래트에서의 단일 β-세포 병소의 백분율은 상응하는 PBS 대조군에서의 3.9±1.0(p=0.004)와 비교하여 10.5±0.9였다(도 7a 및 7b). 살찐 루커 래트에서, 전처리군에서의 단일 β-세포 병소의 백분율은 상응하는 대조군에서의4.2±1.1(p=0.0015)과 비교하여 8.7±1.3이었다(도 7c 및 7d). 도 7e는 도 7c의 관 영역의 400 배율로 확대한 것이며, β-세포 신생물에 특성적인 관 상피 세포로부터의 인슐린 함유 β-세포가 자라는 명백한 증거를 제공한다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 췌장도 전구 세포를 분화시켜 인슐린 분비 세포를 성장시키기에 충분한 양으로 가스트린과 같은 가스트린/CCK 수용체 리간드, TGF-α와 같은 EGF 수용체 리간드 또는 이 둘의 조합체를 제공하는 조성물을 당뇨병 환자에게 투여함으로써 당뇨병 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 조성물이 전신에 투여될 때, 일반적으로 생리학적으로 허용되는 담체 형태로 주사, 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 제공된다. 조성물이 동일계내에서 발혈될 때, 췌장도 전구 세포는 췌장도 전구 세포에서 요망되는 수용체 리간드(들)의 발현을 목적으로 제공되는 발현 벡터에서의 하나 이상의 핵산 발현 구성물에 의해 생체외 또는 생체내에서 형질전환된다. 예로서, 발현 구성물은 췌장도 전구 세포에서의 발현을 목적으로 제공되는 전사 및 번역 조절 영역과 더불어, 발현 후에 가스트린으로 진행되는 프레프로가스트린 펩티드 전구체 코딩 서열과 같은 CCK 수용체 리간드에 대한 코딩 서열 또는 TGF-α와 같은 EGF 수용체 리간드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 전사 조절 영역은 구성성분일 수 있거나 예를 들어 인슐린 유전자로부터 전사 조절 영역과 같은 세포내 글루코오스 농축물을 증가시킴으로써 유도될 수 있다. 형질전환은 어떠한 적합한 발현 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스 발현 벡터를 사용하여 수행된다. 형질전환이 생체외에서 수행될 때, 형질전환된 세포는 예를 들어 신장낭을 사용하여 당뇨병 환자에 이식된다. 대안적으로, 췌장도 세포는 당뇨병 환자에게로의 이식 전에 췌장도에서의 취장 β-세포의 수를 증가시키기 위한 가스트린/CCK 수용체 리간드 및/또는 EGF 수용체 리간드의 충분한 양으로 생체외에서 처리된다. 필요한 경우, 췌장 β-세포의 개체수는 동일한 수용체 리간드(들)과 이들을 접촉시킴으로써 이식전에 배양액에서 확대된다.
본 발명은 당뇨병 환자를 치료하기 위한 현재의 방법에 비해 보다 우수한 장점을 제공한다. 성인 췌장을 자극하여 재생시키기 위한 수단을 제공함으로써, 통상의 약물치료(타입 2) 또는 인슐린 치료(타입 1 및 타입 2)에 대한 요건이 감소되고 심지어는 생략될 뿐만 아니라 정상적인 혈중 글루코오스 농도의 유지는 보다 약화된 당뇨 합병증을 어느 정도 감소시킬 수 있다. 당뇨 합병증은 망막, 신장, 신경에서의 작은 혈관에 미치는 합병증(미세혈관 합병증), 및 심장, 뇌 및 하지에 공급되는 커다란 혈관에 영향을 미치는 합병증(거대혈관 합병증)을 포함한다. 당뇨 거대혈관 합병증은 20-74세의 사람들의 새로운 맹인의 주된 원인이며, 말기 신장병의 모든 새로운 경우의 35%를 차지한다. 당뇨병 환자의 60% 이상이 신경 장애에 의해 영향을 받는다. 주로 거대 혈관 질환의 결과로서 미국에서의 모든 비외상성 절단수술의 50%의 원인이 되는 당뇨병 및 당뇨병 환자는 비당뇨병 환자의 사망률의 2.5배인 관상동맥질환으로부터의 사망률을 갖는다. 고혈당증은 당뇨병 거대혈관 합병증을 개시하고 진행과정을 촉진시키는 것으로 믿어진다. 다양한 현재의 치료법을 사용해서는 고혈당증을 적절하게 조절할 수 없으므로, 당뇨 합병증의 진행을 억제하거나 감소시키지 못한다.
본원에서 사용되는 용어 "가스트린/CCK 수용체 리간드"는 가스트린/CCK 수용체를 자극시키는 화합물을 포함한다. 이러한 가스트린/CCK 수용체 리간드의 예로는 가스트린 34(큰 가스트린), 가스트린 17(작은 가스트린) 및 가스트린 8(소형 가스트린)과 같은 다양한 형태의 가스트린; CCK 58, CCK 33, CCK 22, CCK 12 및 CCK 8과 같은 다양한 형태의 콜레시스토키닌(cholecystotknin)을 포함하며, 단독으로 또는 EGF 수용체 리간드와 조합된 그 밖의 가스트린/CCK 수용체 리간드는 성숙한 췌장에서의 세포 분화를 유도하여 인슐린 분비 췌장도 세포를 형성시킬 수 있다. 또한, 활성 유사체, 단편 및 그 밖의 변형된 형태도 고려된다. 이러한 리간드는 또한 내인성 가스트린, 콜레시스토키닌 또는 유사하게는 조직 저장 부위로부터의 활성 펩티드의 분비를 증가시키는 화합무을 포함한다. 이들의 예로는 위산 분비를 억제하는 오메프라졸(omeprazole)과 CCK 자극을 증가시키는 대두 트립신 억제제가 있다.
본원에서 사용되는 용어 "EGF 수용체 리간드"는 동일한 또는 인접한 조직에서 또는 동일 개체에서의 가스트린/CCK 수용체가 자극될 때, 인슐린 생성 췌장도 세포의 신생물이 도입되도록 EGF 수용체를 자극하는 화합물을 포함한다. EGF 수용체 리간드의 예로는 EGF1-48, EGF1-52, EGF1-49를 포함하여, EGF1-53, 및 이들의 단편 및 활성 유사체가 있다[참조예: USPN 5,434,135호]. 그 밖의 예로는 1-48, 1-47, 및 암피레귤린 및 폭스(pox) 바이러스 성장 인자와 같은 그 밖의 EGF 수용체 리간드 뿐만 아니라 가스트린/CCK 수용체 리간드에 의해 동일한 상승 작용을 나타내는 그 밖의 EGF 수용체 리간드를 포함하여, TGF-α 수용체 리간드(1-50) 및 이들의 단편 및 활성 유사체가 있다. 이들은 활성 유사체, 단편 및 이들의 변형체를 포함한다[참고문헌: Carpenter and Wahl, Chapter 4 inPeptide Growth Factors(Eds, Sporn and Roberts), Springer Verlag, (1990)].
본 발명의 주요 일면은 췌장도 전구 세포를 분화시켜 인슐린 분비 세포를 성장시키는데 충분한 양으로 가스트린/CCK 수용체 리간드 및/또는 EGF 수용체 리간드를 포함하는 조성물을 피검체에게 투여함으로써 당뇨병 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방식으로 분화된 세포는 잔류하는 췌장관에서의 잠복성 췌장도 전구 세포이다. 본 발명 방법의 한 구체예로는 분화 재생성 양의 가스트린/CCK 수용체 리간드 및 EGF 수용체 리간드, 바람직하게는 TGF-α를 단독으로 또는 조합하여 피검체에, 바람직하게는 전신에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명 방법의 또 다른 구체예로는 가스트린/CCK 수용체 리간드 및/또는 EGF 수용체 리간드를 포유동물의 외식된 췌장 조직의 췌장도 전구 세포에 제공하고, 이와 같이 자극된 췌장 세포를 포유동물에 재도입시키는 것을 포함한다.
본 발명 방법의 또 다른 구체예로는 가스트린/CCK 수용체 리간드 및/또는 EGF 수용체 리간드를 포유동물로부터 외식된 췌장 조직의 췌장도 전구 세포에 제공하여 β-세포의 개체수를 늘리는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예로서, 가스트린/CCK 수용체 리간드 자극은 상기 전구 세포내로 형질전환적으로 도입된 키메라 인슐린 프로모터-가스트린 융합 유전자 구성물의 발현에 의해 수행된다. 또 다른 구체예로서, EGF 수용체 리간드 자극은 포유동물내로 형질전환적으로 도입된 EGF 수용체 리간드 유전자의 발현에 의해 수행된다. EGF 유전자의 서열은 USPN 제 5,434,135호에 제시되어 있다.
또 다른 구체예로서, 가스트린/CCK 수용체 리간드 및 EGF 수용체 리간드에 의한 자극은 (i) 프레프로가스트린 펩티드 전구 유전자 및 (ii) 포유동물내로 안정하게 도입된 EGF 수용체 리간드 유전자의 발현에 의해 수행된다.
또 다른 일면으로서, 본 발명은 가스트린/CCL 수용체 리간드와 EGF 수용체 리간드의 조합체로 상기 세포를 자극시킴으로써 포유동물의 췌장도 전구 세포의 분화를 수행시키기 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 일면의 바람직한 구체예로서, 가스트린 자극은 포유동물내로 안정하게 도입된 프레프로가스트린 펩티드 전구 유전자의 발현에 의해 수행된다. 이러한 발현은 인슐린 프로모터에 의해 조절된다. EGF 수용체 리간드, 예를 들어, TGF-α 자극은 포유동물내로 형질전환적으로 도입된 EGF 수용체 리간드 유전자의 발현에 의해 수행된다. 가스트린 및 TGF-α에 의한 자극은 바람직하게는 (i) 프레프로가스트린 펩티드 전구 유전자와 (ii) 포유동물내로 도입된 EGF 수용체 리간드의 공동 발현에 의해 수행된다. 유전자의 전사를 유도할 수 있는 적절한 프로모터는 바이러스 프로모터와 세포 프로모터 둘 모두이다. 바이러스 프로모터는 즉시형 초기 시토메갈로바이러스(CVM) 프로모터[참고문헌: Boshart et al(1985) Cell 41:451-530], SV40 프로모터[참고문헌: Subramani et al (1981) Mol.Cell. Biol. 1:854-864] 및 아데노바이러스 2로부터의 거대한 후기 프로모터[참고문헌: Kaufman and Sharp (1982) Mol. Cell. Biol. 2: 1304-13199]를 포함한다. 바람직하게는, 가스트린/CCK 수용체 리간드 유전자 및 EGF 수용체 리간드중의 하나 또는 둘 모두의 발현은 인슐린 프로모터에 의해 조절된다.
본 발명의 또 다른 일면은 핵산 구성물이다. 이러한 구성물은 프레프로가스트린 펩티드 전구체를 코딩하는 핵산 서열, 및 5'에 위치하며 프레프로가스트린 펩티드전구체를 코딩하는 서열의 전사를 지지하는데 효과적인 전사 조절 서열을 포함한다. 바람직하게는, 인슐린 전사 조절 서열은 적어도 하나의 인술린 프로모터를 포함한다. 바람직한 구체예로서, 프레프로가스트린 펩티드 전구체를 코딩하는 핵산 서열은 사람 가스트린 유전자의 엑손 2 및 3을 함유하고 임의로 또한 인트론 1 및 2를 포함하는 폴리누클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 (i) 포유동물의 EGF 수용체 리간드, 예를 들어, TGF 및 이들의 전사 조절 서열을 코딩하는 핵산 서열; 및 (ii) 프레프로가스트린 펩티드 전구체 및 이들의 전사 조절 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트이다. 바람직하게는, EGF 수용체 리간드에 대한 전사 조절 서열은 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터와 같은 강한 비-조직 특이적 프로모터이다. 바람직하게는, 프레프로가스트린 펩티드 전구체에 대한 전사 조절 서열은 인슐린 프로모터이다. 이것의 바람직한 형태의 구체예는 프레프로가스트린 펩티드 전구체를 코딩하는 핵산 서열이 사람 가스트린 유전자의 인트론 1 및 2 및 엑손 2 및 3을 함유하는 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일면은 프레프로가스트린 펩티드 전구체 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 pGem1과 같은 플라스미드일 수 있거나 인슐린 프로모터를 포함하는 전사 조절 서열을 갖는 파아지일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은 (1) 강한 비-조직 특이적 프로모터, 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터의 조절하에서 포유동물 EGF 수용체 리간드, 예를 들어, TGF-α를 코딩하는 핵산 서열; 및 인슐린 프로모터의 조절하에서 프레프로가스트린 펩티드 전구체 코딩 서열을 갖는 것을 포함하는 벡터의 조성물에 관한 것이다. 각각의 벡터는 이러한 관점에서 볼 때 플라스미드 pGem1과 같은 플라스미드 또는 파아지일 수 있다. 대안적으로, 발현 카세트 또는 벡터는 적합한 조직 영양교환에 의해 바이러스 벡터내로 삽입될 수 있다.
`바이러스 벡터의 예로는 단순 포진 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 등이 포함된다[참조: Blomer et al(1996)Humnan Molecular Genetics5 Spec. No:1397-404; and Robbinset al(1998)Trends in Biotechnology16:35-40]. 아데노바이러스 매개 유전자 치료는 낭포성 섬유증을 앓고 있는 환자의 비강 상피 조직의 염화물 운반 결함을 일시적으로 보정하는데 성공적으로 사용되어 왔다.
본 발명의 또 다른 일면은 프레프로가스틴을 코드화하는 안정하게 통합된 유전자를 발현시킬 수 있는 세포를 포함하는 사람을 제외한 포유 동물 또는 포유 동물의 조직에 관한 것이다. 이러한 일면의 또 다른 구체예는 (i) 프레프로가스트린 펩티드 전구체 유전자; 및/또는 (ii) EGF 수용체 리간드, 예를 들어, 사람을 제외한 포유 동물, 포유 동물 조직 또는 세포에 안정하게 통합된 TGF-α 유전자를 동시발현시킬 수 있는 사람을 제외한 포유 동물에 관한 것이다. 포유 동물 조직 또는 세포는 사람 조직 또는 세포일 수 있다.
치료적 투여 및 조성물
투여 형태는 경피, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내 및 경구 경로를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 화합물은 예를 들어, 상피 또는 점막 내층(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장점막 등)을 통한 흡수에 의한 주사 또는 환약 주입으로 편리한 경로로 투여될 수 있으며, 그 밖의 생활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 투여가 바람직하다.
본 발명은 또한 약제 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 치료 유효량의 치료제 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체에는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합물이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다. 제형은 투여 형태에 맞추어야 한다. 본 발명에 사용하기 위한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제형은 본원에서 참고 문헌으로 인용되는 문헌(Remington'sPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17thed.(1985))으로부터 알 수 있다. 약제 전달 방법의 개요에 대해서도 본원에서 참고 문헌으로 인용되는 문헌을 참조한다[참조: Langer(1990)Science 249:1527-1533].
본 발명의 약제 조성물을 제조함에 있어서, 본 발명의 조성물을 개질시켜 약물 동력학 및 생체분포도를 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 약물 동력학의 일반적인 논의는 문헌을 참조한다[참조: 상기의 Remington'sPharmaceutical Sciences, Chapters 37-39]. 약물 동력학 및 생체분포도를 변경시키는 많은 방법이 당해 통상의 기술자들에게 공지되어 있다[참조예: 상기 Langer의 문헌]. 이러한 방법의 예에는 단백질, 지질(예를 들어, 리포좀), 탄수화물 또는 합성 중합체와 같은 물질로 구성된 소포내 시제를 보호하는 방법이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 시제는 약물 동력학 및 생체 분포도 특성을 향상시키기 위해 리포좀에 혼입될 수 있다. 여러 가지 방법이 본원에서 참고 문헌으로 인용되는 문헌에 기술된 바와 같이 리포좀을 제조하는데 이용할 수 있다[참조: Szoka et al(1980) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467, U.S. Pat. Nos. 4,235,871, 4,501,728 및 4,837,028]. 다양한 그 밖의 전달 시스템이 공지되어 있으며, 예를 들어, 마이크로입자, 마이크로캡슐 등과 같은 본 발명의 치료제를 투여하는 데 사용될 수 있다.
경우에 따라, 본 발명의 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 에멀젼제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 조성물은 또한 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환약, 캡슐, 서방성 제형 또는 분말일 수 있다. 조성물은 좌제로서 전통적인 결합제 및 트리글리세라이드와 같은 담체와 함께 제형될 수 있다. 경구 제형은 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 조성물은 사람에게 정맥내 투여하기에 적합한 약제 조성물과 같은 통상의 절차에 따라 제형된다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 살균된 등장성 수성 완충액 상태의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 용해제 및 주입 부위에서의 통증을 완화시키기 위한 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 투여 단위 형태, 예를 들어, 무수 동결 건조된 분말 또는물 비함유 농축물로서 활성제의 품질을 지시하는 앰푸울 또는 작은 봉지와 같은 밀폐식으로 밀봉된 용기내에 함께 혼합되거나 개별적으로 공급된다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 살균된 약제 등급의 물 또는 염수를 포함하는 주사 용기에 분배될 수 있다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 주입을 위한 살균된 물 또는 염수의 앰푸울이 투여하기 전에 성분이 혼합되도록 제공될 수 있다.
본 발명의 치료제는 중성 또는 염의 형태로 제형될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것과 같은 유리 아미노기로 형성된 것들과, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 및 기타 2가 양이온, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것들과 같은 유리 카르복실기로 형성된 것들이 포함된다.
특정 질병 이나 상태를 치료하는 데 효과적인 본 발명의 치료제의 양은 질환 또는 상태의 특성에 따라 좌우될 것이며, 표준 임상 기술에 의해 측정될 수 있다. 제형에 사용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로 및 질병 또는 질환의 중증도에 따라 좌우될 것이며, 의사의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 그러나, 정맥내 투여에 적합한 투여량 범위는 일반적으로 kg 체중 당 약 20 내지 500㎍의 활성 성분이다. 비강내 투여에 적합한 투여범위는 일반적으로 약 0.01pg/kg 체중 내지 1mg/kg 체중이다. 효과적인 투여량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 투여-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 좌제는 일반적으로 0.5 내지 10중량%의 활성 성분을 함유하며, 경구 제형은 바람직하게는 10% 내지 95%의 활성 성분을 함유한다.
본 발명의 유전자 치료 방법에서, 생체내 트랜스펙션은 지질 담체, 특히 양이온계 지질 담체에 착화되거나 바이러스 벡터, 예를 들어, 재조합 아데노바이러스에 삽입된 네이키드 DNA로서, 치료적 전사 또는 발현 벡터를 포유 동물 숙주에 도입시키므로써 얻어진다. 포유 동물숙주로의 도입은, 정맥내 또는 복강내 주입, 기관내, 포막내, 비경구적으로, 관절내, 비강내, 근육내, 국부적으로, 경피적으로, 점가 표면으로의 도포, 각막 인스톨레이션을 포함하는 여러 가지 경로에 의해 이루어질 수 있다. 특히 가치가 있는 것은 치료적 발현 벡터를 순환성 체액 또는 체강 또는 체공에 도입시키는 것이다. 따라서, 정맥내 투여 및 포막내 투여는, 벡터가 이러한 투여 경로 이후에 광범위하게 퍼지기 때문에 특히 가치가 있으며, 에어로졸 투여는 체강 또는 체공에 도입시에 사용된다. 투여 경로 및 투여 부위에 따라 특정 세포 및 조직이 표적될 수 있다. 예를 들어, 혈류 방향으로 주입 부위에 가장 근접한 조직이 특이적 표적화의 부재시에도 트랜스펙션될 수 있다. 지질 담체가 사용되는 경우에, 담체는 변형되어 부위 유도 분자를 사용하여 특정 유형의 세포에 대한 착물로 유도될 수 있다. 따라서, 특정 수용체 또는 그 밖의 세포 표면 단백질에 대한 항체 또는 리간드가 특정 표면 단백질과 관련된 표적 세포와 함께 사용될 수 있다.
약제 조성물에 대해 상기 기술된 바와 같이 탈이온수, 염수, 인산염 완충 염수, 수중의 5% 덱스트로스 등과 같은 생리학적으로 허용되는 매질이 투여 경로에 따라 DNA, 재조합 바이러스 벡터 또는 지질 담체를 투여하는데 사용될 수 있다. 완충제, 안정화제, 살생물제 등과 같은 기타 성분이 제형에 포함될 수 있다. 이들성분은 문헌에 광범위하게 예시되어 있어, 본원에서 구체적으로 기술할 필요가 없다. 고급 염, 킬레이트화제 등을 포함하는 착물의 응집을 유발시킬 수 있는 희석제 또는 희석제 성분은 피해져야 한다.
사용되는 치료제 벡터의 양은 표적 조직에서의 발현의 치료 수준을 제공하기에 충분한 양일 것이다. 발현의 치료 수준은 혈액 글루코오스를 정상 수준으로 감소시키는데 충분한 발현량이다. 또한, 사용되는 핵산 벡터의 투여량은 생체내 감염된 조직에서 트랜스유전자 발현의 목적하는 수준을 일으키기에 충분해야 한다. 아데노바이러스 VA 유전자와 같은 다른 DNA 서열은 투여 매질 중에 포함될 수 잇으며, 대상이 되는 유전자와 공동 트랜스펙션될 수 있다. 아데노바이러스 VA 유전자 생성물을 위한 유전자 코딩의 존재는 경우에 따라 발현 카셋으로부터 전사된 mRNA의 전사를 상당히 증진시킬 수 있다.
다수의 인자가 트랜스펙션된 조직에서의 발현량에 영향을 미칠 수 있으며, 이에 따라 특정 목적에 맞추어 발현 수준을 변형시키는데 사용될 수 있다. 높은 수준의 발현이 요망되는 경우에, 모든 인자가 최적화될 수 있으며, 낮은 발현이 요망되는 경우에는 하나 이상의 파라미터가 변형되어 목적하는 수준의 발현을 얻을 수 있다. 예를 들어, 높은 발현이 치료 윈도우를 초과할 경우에는, 덜한 최적 조건이 사용될 수 있다.
재조합 유전자의 발현 수준 및 조직은 상기 기재된 바와 같은 mRNA 수준 및/또는 폴리펩티드 또는 단백질의 수준에서 측정될 수 있다. 유전자 생성물은 조직내 생활성을 측정하므로써 정량화될 수 있다. 예를 들어, 단백질 활성은 상기 기재된 바와 같이 면역검정에 의해, 혈액 글루코스와 같은 생물학적 검정에 의해, 또는 발현 카셋에 존재하는 리포터 유전자 생성물 또는 유전자 생성물을 특이적으로 인지하는 항체로 프로우빙하는 것과 같은 면역착색 기법에 의한 트랜스펙션된 세포에서의 유전자 생성물을 확인하므로써 측정될 수 있다.
일반적으로, 치료 카셋은 환자의 게놈으로 통합되지 않는다. 필요에 따라, 이러한 치료는 달성되는 결과에 따라 특별하게 반복될 수 있다. 이러한 치료가 반복되는 경우, 환자는 치료에 대해 불리한 면역 또는 기타 반응이 없는가를 확실히 하기 위해 모니터링될 수 있다.
본 발명은 또한 시험관내 췌장 β-세포의 개체군을 확장시키는 방법을 제공한다. 적합 도너로부터 췌장을 분리하고, 세포를 단리시키고, 시험관내에서 성장시킨다. 사용되는 세포는 사람 시신, 돼지 태아, 또는 기타 적합한 췌장 세포 공급원을 포함하는 포유 동물 도너로부터의 샘플로부터 얻어진다. 사람 세포가 사용되는 경우, 가능하면 세포는 수용자에게 맞는 주요 조직적합성을 가져야 한다. 세포의 정제는 분리된 췌장의 효소(예를 들어, 콜라게나제) 분해 후의 구배 분리에 의해 달성될 수 있다. 정제된 세포는 세포의 생존이 가능하도록 충분량의 영양소뿐만 아니라, 인슐린 분비 췌장 β-세포의 형성이 가능하도록 가스트린/CCK 수용체 리간드 및 EGF 수용체 리간드를 함유하는 충분량의 β-세포 증식 유도 조성물을 함유하는 매질 중에서 배양된다. 본 발명에 따르면, 인슐린 분비 췌장 β-세포를 자극한 후, β 세포는 이를 필요로 하는 환자에 이식되기 전에 배양물에 직접 전개되거나, β세포 증식 유도 조성물로 처리한 후에 직접 이식될 수 있다.
이식 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 얻어진 인슐린 분비 췌장 β-세포를, 시클로스포린과 같은 면역억제제와 함께 이식시키는 것을 포함한다. 인슐린 생성 세포는 또한 이식전에 반투과성 막으로 캡슐화될 수 있다. 이러한 막은 캡슐화된 세포로부터 인슐린 분비를 허용하면서 면역물질 공격으로부터 세포를 보호한다. 이식되어야 하는 세포의 수는 환자 1kg당 10,000 내지 20,000개의 인슐린 생성 β-세포로 추정된다. 반복되는 이식물질이 필요에 따라 효과적인 치료적 수의 인슐린 분비 세포를 유지시키는 데 요구될 수 있다. 이식 수용자는 또한 본 발명에 따르면 충분량의 가스트린/CCK 수용체 리간드 및 EGF 수용체 리간드가 제공되어 이식된 인슐린 분리 β 세포의 증식을 유도할 수 있다.
당뇨병 치료의 효과는 하기와 같이 평가될 수 있다. 가능하면, 임상적 효능 뿐만 아니라 치료 양식의 생물학적 효능 모두가 평가된다. 예컨대, 질환 자체는 혈당 증가에 의해 나타나므로, 치료의 생물학적 효능은 예컨대 평가된 혈당의 정상 복귀를 관찰함으로써 평가될 수 있다. 임상적 효능, 즉 기본적인 효과가 있는 치료가 질환의 경과를 변화시키는데 유효한가를 측정하는 것은 보다 어려울 수 있다. 생물학적 효능의 평가가 임상적 효능을 위한 대용 종말점으로서 크게 효과가 있지만, 그것이 결정적인 것은 아니다. 따라서, 예컨대 6개월의 기간 후에 β-세포 재생을 지시할 수 있는 임상적 종말점을 측정하는 것은 치료 양생법의 임상적 효능을 지시할 수 있다.
표제 조성물은 하나 이상의 절차에 사용되는 키트로서 제공될 수 있다. 유전적 요법용 키트는 일반적으로 치료적 DNA 작제물을 미토콘드리아성 표적 서열 펩티드 함유 또는 무함유의 나출 DNA로서, 재조합 바이러스 벡터로서 또는 지질 담체와 착화된 것으로서 포함할 것이다. 부가적으로, 지질 담체는 제공된 DNA와의 착화하기 위한 별개의 용기에 제공될 수 있다. 키트는 사용전에 추가로 희석될 수 있는 유효 약제를 농축물로서(동결건조된 조성물 포함) 포함하는 조성물을 포함하거나 바이알이 하나 이상의 투여량을 포함할 수 있는 사용 농도로 제공될 수 있다. 편의상, 키트에서 단일 투여량들은 의사가 바이알을 직접 사용할 수 있도록, 목적하는 양 및 농도의 약제를 가지는 멸균 바이알에 제공될 수 있다. 바이알이 직접 사용하기 위한 조성물을 함유한 경우, 일반적으로 상기 방법과 함께 사용하기 위한 다른 시약은 필요없다. 이러한 키트와 관련하여 약제 또는 생물학적 제제의 제조, 사용 또는 판매 관리청에 의해 기술된 형식의 통지가 있을 수 있고, 이 통지는 제조, 사용 또는 판매청의 인간 투여에 대한 허가를 나타낸다.
하기 실시예를 한정이 아닌 예시의 형식으로 제공한다.
실시예
재료 및 방법
하기 재료 및 방법을 달리 언급이 있는 경우를 제외하고 하기 기재된 실제 실시예에 의해 보고된 연구에서 사용하였다.
동물 . FAB 및 CD종의 마우스를 Taconic Farms, Inc., Germantown, NY로부터 입수하였다. 사용된 TGF-α 유전자이식 주 MT-42는 메탈로티오네인 프로모터로부터 고수준의 TGF-α를 발현시키며, Jhappanet al, Cell, 61:1137-1146(1990)에 기재되어 있다. 정상 Wilstar 및 Zucker 랫트에게 임의량의 표준 식이와 함께 자유로운 수분 섭취를 시켰고 각 시험 개시전에 한주간 순응시켰다. 새로이 제조한 스트렙토조토신을 80mg/체중kg의 용량으로 당뇨병 유도후 5 내지 7일간 정맥 투여하였고, 랫트를 무작위로 후속 처리를 위한 군으로 배당하였다. TGF-α 및 랫트 가스트린 호르몬을 0.1% BSA를 함유한 멸균 표준 식염수에 재구성하였다. 상이한 연구에 대하여 미리지정된 처리 계획에 따라, 각 동물에게 TGF-α 또는 가스트린 단독(4.0㎍/체중kg) 또는 1:1(w/w) 조합물(총 8.0㎍/체중kg) 또는 PBS를 10일의 기간 동안 매일 1회 복강내 주사하였다.
INSGAS 이식유전자 작제 .랫트 인슐린 I 유전자의 누클레오티드 -370 내지 +38을 포함하는Pvul1-Rsa1단편(Cordell, B.G.et al., Cell, 18:533-543(1979))을 pGem1(Promega Corp., Madison, WI)으로 연결시켰다. 프리프로가스트린 펩티드 전구물질을 엔코딩하는 인간 가스트린 유전자의 1.5kb 인트론 1 및 2와 엑손 2 및 3을 함유한 4.4kbBamH1-EcoR1 단편을 분리하여 pGem1(Promega)에서 랫트 인슐린 I 단편의 하류에서 서브클로닝시켰다. 상기 단편은 Wiborg, O.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1067-1069(1984) 및 Ito, R.,et al Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81:4662-4666(1984)에 기재되어 있다. 인슐린 포로모터 프리프로가스트린 INSGAS 이식유전자 작제물을 4.8kbXba1-EcoR1 단편으로서 절제하였다.
유전자이식 마우스의 발생 및 특징화 . 상기한 바에 따라 제조된 단편을 하기와 같이 현미주사용으로 제조하였다. 이를 아가로오즈 겔 전기영동에 의해 분리시켰고, CsCl 경사 정제에 의해 정제하였으며, 주사 완충액(5mM NaCl; 01.MM EDTA; 5mM Tris-HCl pH 7.4)에 대하여 광범하게 투석시켰다. 단일 세포 단계에 있는 수정시킨 FVB 동종 마우스의 난모세포(Taconic Farms, Inc.,Supra)를 표준 기술을 사용하여 현미주사하였다[참조: Hogan, B.et al., Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual,Cold Spring Harbor, NY(1986)]. 그 다음에 생존하는 배아를 Hogan et al.의 절차에 따라 CD1(Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) 양모의 난관에 이식하였다. 유전자 이식 창시자 마우스를 개별적인 마우스 꼬리로부터 분리된 DNA, 및 랜덤 프라이밍에 의해 32 dCTP로 표지된 인간 가스트린 엑손 2 프로브를 사용한 라벨링된 DNA 블롯 기술에 의해 확인하였다. F1 마우스 및 이들의 동포를 유사하게 확인하였다.
CD-1 마우스종(Jhappan,supra)으로부터 유도된 MT-TGF-α 이식유전자를 함유한 동형접합성 MT-42 마우스를 이형접합성 INSGAS 마우스와 이종교배시켰다. 이유 이후에, 메탈로티오네인 프로모터를 유도하기 위하여 자손을 상기한 바와 같이 산성화된 50mM ZnCl2위에 놓았다(Jhappan,supra).
노턴 블롯 하이브리드화 검정 . 노턴 분석을 위하여, 총 RNA를 Cathalaet al DNA 2:329-335(1983)의 방법에 의하여 조직으로부터 추출하였다. 20㎍의 총 RNA 샘플을 1% 아가로오즈 변성 겔상에서 분해시키고 니트로셀룰로오스로 옮겼다. RNA 블롯을32P 표지된 TGF-α 리보프로브 또는 내인성 마우스 가스트린 mRNA와 교차-하이브리드화하지 않았던 인간 가스트린의 엑손 2와 하이브리드화시켰다.
가스트린의 펩티드 방사면역검정 . 조직을 추출하여 Rehfeld, J. F.,Scand. J. Clin. Lab. Invest. 30:361-368(1972)에 기재된 바와 같은 가스트린 면역검정에서 생물학적으로 활성인 C 말단 아미드화된 가스트린에 특이적인 항체 2604를 사용하여 미리 기술한 바와 같이 방사면역검정에 의해 가스트린면역활성에 대하여 검정하였다. 티로신 모노요오드화된 인간 가스트린 17 추적자를 모든 검정에서 사용하였고 합성 인간 인슐린 17을 표준으로서 사용하였다.
TGF-α의 펩티드 방사면역검정. 조직을 액체 질소중에서 동결하여 약연 및 막자로 분쇄하여 분말로 하였고, Todaro, G.J.et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77:5258-5262(1980)에 기술된 바에 따라 산-에탄올로 추출시켰다. 추출물을 물과 함께 재구성하였고, Coomassie 블루 염료 결합 검정(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 단백질 농도를 측정하였다. 판크레아타로부터의 분취물을 TGF-α 방사면역검정으로 2회 시험하여, 랫트 TGF-α의 C-말단에 대하여 생성된 고체상 토끼 항체와의 결합에 대하여125I TGF-α와의 경합을 측정하였다 (Biotope, Seattle, WA의 키트).
혈당 . 하룻밤 절식시킨 후 또는 IPGTT 후에 혈당을 글로코오스 산화법에 의해 측정하였다.
조직 인슐린 분석. 각 연구의 종결시에, 동물들을 도살시켰고 췌장을 제거하였다, 면역조직화학, 단백질 및 인슐린 측정을 위하여 췌장 도처의 개별적인 대표 부위로부터 작은 생검물을 취하여, 즉각 액체 질소중에서 스냅 동결시켰다. 스냅 동결된 췌장 샘플(n=5)을 신속하게 해동시켜, 탈염수중에서 초음파로 파괴시키고, 단백질 측정을 위해 분취하여 균질물을 RIA에 의한 인슐린 측정 전에 산/에탄올 추출시켰다.
조직학적 분석 . 판크레아타를 제거하여 칭량하고, 카세트에 유사하게 배향시켰으며, Bouin 용액중에서 고정시키고 종래의 방법에 의해 파라핀에 매립하였다.
조직 프레파레이션 및 면역조직화학 . 새로이 절제시킨 판크레아타를 절개하고, 지방 및 림프절을 제거하여 Bouin 고정제에 고정시킨 다음, 절편화하기 위하여 파라핀에 매립시켰다. 통상적인 절편을 표준법에 따라 헤마톡실린 및 에오신으로 염색시켰다. 섬 발생에 대한 TGF-α 과발현의 효과를 검사하기 위하여 성숙한 17주된 MT-TGF-α(MT-42) 유전자이식 마우스로부터의 췌장 조직을 인슐린에 대하여 면역염색시켰다. 기냐픽 항 인간 인슐린 혈청을 염색하는 면역퍼옥시다제를 사용하여 TGF-α 유도 이형성 세관에서 인슐린 양성 세포를 확인하였고(Linco, Eureka, MO); 전면역(pre-immune) 기냐픽 혈청을 대조로서 사용하였다. 모노클로날 토끼 항가스트린 항체를 사용한 Sternberger의 퍼옥시다제/항퍼옥시다제에 의하여 5μ파라핀 절편에 대하여 면역조직화학을 수행하였다[참조: Sternberger, L. A. Immunocytochemistry, 2ndEd. (1979) NY: Willey, 104-170].
점-계산 형태측정 . 섬, 세관, 또는 간질 세포의 상대적 부피를 Weibel, E.R.Lab Investig., 12:131-155(1963)에서 기술된 점-계산 방법을 사용하여 정량화하였다. 400배 확대하여, 절편의 한 구석에서 무작위의 점으로 시작하여, 모든 다른 영역에 대해서 25점 시각 격자를 사용하여 계산하였다. 단계 마이크로미터의 점을 사용하여 공평하지만, 규칙적인 영역 선택을 이루었다. 혈관, 지방, 관, 림프절, 또는 소엽간 공간에 대한 방해물을 공제하여 총 췌장 면적을 제공하였다. 108 영역(단계 마이크로미터를 사용하여 규칙적으로 선정)에서 최소 5000 점을 각 블록에서 계수하였고, 상대적 섬 부피는 섬 조직에 대한 방해물의 수를 췌장 조직에 대한 수로 나눈 것이다. 절대적인 섬 질량 또는 섬을 상대적 섬 부피를 췌장 중량으로 곱한 것으로 계산하였다[참조: Lee, H. C.,et al, Endocrinology, 124:1571-1575(1989)].
통계적 분석. 평균간의 차이를 짝없는 데이터에 대하여 Student t 검정을 사용하여 유의한 차이에 대하여 비교하였다.
실시예 1
TGF 유전자이식 췌장에서 인슐린 생산에 대한 검정
면역퍼옥시다제 염색은 TGF-α 유전자이식 췌장의 이형성 관에서 많은 인슐린 염색 세포가 나타난 반면(도 1A), 인슐린 염색 세포는 비유전자이식 관에서는 실제로 없었다(6.1% 미만). 400배의 최종 확대도에서 동물당 600개 이상의 세관 세포가 계산된 경우, 인슐린 양성 세포는 TGF-α 유전자이식 췌장의 이형성 관에서 6.0+/-0.9%의 빈도로 나타났다(n=5). 종종 세관 세포는 주변 섬과 동일한 강도의 인슐린 염색으로 염색되었으나, 대부분은 보다 낮은 강도로 염색되었다(도 1B). 세관 세포의 낮은 수준의 인슐린 염색은 췌장을 발생시키는 관에서 보고된 원시분화된 세포의 경우와 유사하다 [참조: Pictet, R and W. J. Rutter,Development of the embryonic endocrine pancreas, in Endocrinology, Handbook of Physiology, ed. R. O. Greep and E.B. Astwood(1972) American Physiology Society:Washington, D.C. 25-66; 및 Alpert, S.et al Cell,53:295-308(1998)].
그러나, 이형성 관에서 인슐린 양성 세포의 증가된 수에도 불구하고, TGF-α 유전자이식 마우스의 섬 질량은 증가하지 않았다.
포인트 카운팅 모포메트릭스(point counting morphometrics)에 의해 정량된 섬(islet) 질량은 TGF-α 유전자이식 췌장에서 2.14㎎ +/- 0.84(평균 +/- se, n=5)인 반면, 비유전자이식 한배 새끼에서는 1.93㎎ +/- 0.46(n=6)이었다.
따라서, TGF-α 과발현이 단독으로 이러한 원분화된(protodifferentiated) 관 세포의 완전히 분화된 섬으로의 전이에 영향을 미치지 않았다. 이는 섬 분화가 TGF-α 유전자이식 마우스의 성숙한 췌장에 없는 다른 인자를 필요로 함을 의미한다. 원분화된 섬 전구체의 분화가 늦은 태아 발생 동안 일어나므로, 이러한 전이를 조절하는 인자가 이 기간동안 섬에서 발현될 것이다. 발생 섬에서 발현되는 다른 인자중에는 위장 펩티드, 가스트린이 있다.
실시예 2
INSGAS 이식 유전자로부터 췌장 가스트린 발현
섬 분화를 조절하는데 있어서 가스트린의 가능한 역할을 조사하기 위해, 인슐린 프로모터가 가스트린 이식 유전자의 췌장 특이적 발현을 유도하는 키메라 인슐린 프로모터-가스트린(INSGAS) 이식 유전자를 발현하는 유전자이식 마우스를 제조하였다(도 2A). 가스트린 유전자와 달리, 인슐린 유전자 발현은 출생후 멈추지 않는다. 따라서, INSGAS 이식 유전자는 성장 췌장에서 가스트린 발현을 지속한다.
INSGAS 이식 유전자는 5' 플랭킹 DNA 및 쥐 인슐린 I 유전자의 제 1 비코딩엑손 370bp를 포함하였다[Cordell, B. et al., Cell 18:533-543 (1979)]. 그것을 가스트린 전구물질 펩티드를 코딩하는 사람 가스트린 유전자의 인트론 1 및 엑손 2 및 3 1.5kb를 함유하는 BamH1-EcoR1 단편에 연결시켰다[Wiborg, O. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1067-1069 (1984) and Ito et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:4662-4666 (1984)]. 4.8kb의 INSGAS 단편을 분리하고, 동종번식의 FVB, 단일세포 마우스 태아에 미량주사하였다[Hogan, B. et al., Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, (1986) NY; Cold Spring Harbor].
유전자이식 및 비유전자이식 마우스로부터의 췌장 및 위 추출물에서의 가스트린 면역반응성을 가스트린의 생활성 아미드화 C-말단에 특이적인 항혈청 2604를 사용한 방사면역분석법에 의해 분석하였다[Rehfeld, J. et al, Scand, J. Clin. Lab. Invest., 30:361-368 (1972)].
INSGAS 이식 유전자로부터 베타 세포 특이적 가스트린 발현을 가스트린 단클론성 항체로 췌장 조직을 면역염색시켜 관찰하였다.
생후 8주된 INSGAS 유전자이식 마우스의 다른 조직으로부터 분리된 RNA의 노던 블롯을 사람 가스트린 엑손 2 프로브와 하이브리드 형성시켰다. 높은 수준의 가스트린 이식 유전자 mRNA가 췌장에서 관찰되었지만, 다른 조직에서는 관찰되지 않았다. 상기 프로브는 사람 가스트린 유전자에 특이적이고; INSGAS의 상악동 (antral) RNA에서는 하이브리드 형성이 관찰되지 않고, 비유전자이식 FVB 마우스는 높은 수준의 쥐 가스트린 mRNA를 발현한다. INSGAS 유전자이식 마우스로부터의 췌장 추출물의 방사면역분석법은 내인성 쥐 유전자로부터 발현된 위 방(atrium)내의가스트린 함량을 초과하는 높은 수준의 가스트린 면역반응성을 나타내었다(도 2B). 어떠한 가스트린 면역반응성도 비유전자이식 대조 마우스의 췌장 추출물에서 검출되지 않았다(도 2B). 가스트린 방사면역분석법은 카르복시 아미드화 전구체에 특이적이고, 이는 가스트린 펩티드 전구체가 생활성 펩티드로 번역후에 효율적으로 처리됨을 나타낸다. 가스트린 단클론성 항체의 면역조직화학은 가스트린의 췌장 베타 섬 세포 특이적 발현을 보여준다.
INSGAS 유전자이식 마우스가 출생 후 췌장에서 높은 가스트린 발현을 가졌을지라도(도 2B), INSGAS 유전자이식 마우스는 대조구와 동일한 췌장 조직학을 가졌다. 포인트 카운팅 모포메트릭스에 의해 정량된 섬 질량[Weibel, E.R., Lab Investig. 12:131-155 (1963)]은 생후 5-6주된 INSGAS 마우스(1.78 +/- 0.21㎎, n=11) 및 동일한 나이의 비유전자이식 대조구(1.74 +/- 0.18㎎, n=11)에서 동일하였다. 따라서, 출생 후 췌장에서 지속된 가스트린 발현은 단독으로 섬 세포 성장을 자극하지 못한다.
실시예 3
TGF-α 및 TGF-α/INSGAS 췌장의 조직학적 검사
가스트린에 의한 섬 성장의 자극은 응답 세포 집단을 생성시키기 위해 다른 성장 인자에 의한 자극을 필요로 할 수 있다. 따라서, 가스트린 자극의 효과를 원분화된 섬 전구체와 유사한 인슐린 발현 세포를 함유하는 이형성 관을 가지는 TGF-α 유전자이식 마우스에서 연구하였다. 가스트린과 TGF-α의 상호작용을 평가하기 위하여, 동등한 FVB/CD1 계통 유전 배경을 가지는 세 그룹의 마우스: 비유전자이식대조구, TGF-α 단일 유전자이식 및 INSGAS/TGF-α 이중 유전자이식 마우스를 길렀다. 생후 3주된 세 그룹의 마우스 모두를 50mM의 ZnCl2에 놓았다. 생후 17주되었을 때, 동물을 희생시키고, 췌장을 조직학 평가를 위해 제거하였다. TGF-α 및 INSGAS/TGF-α 마우스로부터의 췌장은 유사한 전체적인 형태학적 외관을 가졌다: 연하고 퍼진 대조 췌장에 비해 탄력성이 있고 단단하고 치밀. TGF-α 발현은 노던 블롯 분석(데이터 미제시) 및 방사면역분석법에 의해 측정하였을 때, TGF-α 및 INSGAS/TGF-α 그룹에서 동등하였다. 췌장의 TGF-α 면역반응성 펩티드 수준은 TGF-α 및 INSGAS/TGF-α 마우스에서 각각 12.2 +/- 1 및 18.9 +/- 8ng/mg 단백질(평균 +/- SD)이었다.
연구된 세 그룹의 마우스(A: INSGAS/TGF-α; B: FVB/CD1 대조구 및 C: TGF-α)로부터의 췌장의 헤마톡시린 염색된 파라핀 섹션의 광 현미경사진을 만들었다. INSGAS/TGF-α 췌장은 소관(ductular) 복합체가 증가되고 간질성 세포질이 약간 증가된 수개의 영역을 가졌고; 도시된 필드(도 3A)는 다섯 동물에서 보여진 가장 심각하게 비정상적인 형태학을 가졌고; 대부분의 췌장은 대조구와 구별할 수 없었다(도 3B). 반면, TGF-α 췌장의 필드(도 3C)는 통상적이었고, Jhappan et al., 상기 참조에 기재된 개화성(florid) 소관 이형성과 결합된 간질성 세포질 및 섬유형성을 나타냈다.
췌장 가스트린은 TGF-α와 상승적으로 상호작용하여 섬 질량을 증가시키고 TGF-α 과발현에 의해 유도되는 소관 이형성을 억제한다. 동형접합성 MT-TGF-α(MT-42) 마우스(TGF-α)를 이형접합성 INSGAS 마우스와 교배시키면 이형접합성 TGF-α 단일 유전자이식 동물 또는 INSGAS 및 TGF-α 이식유전자 둘다를 포함하는 이중 유전자이식 동물(INSGAS/TGF-α)인 자손이 발생하였다. INSGAS는 FVB 계통이고 TGF-α는 CD1 계통이었기 때문에, TGF-α 동형접합체 및 CD1 대조구(CON)을 둘다 FVB와 교배시켜 세 그룹의 마우스 모두에 대해 FVB/CD1 계통 배경을 생산하였다. 마우스를 3주에서 생후 17주 후에 희생시킬 때까지 50mM의 ZnCl2로 처리하였다. 췌장을 제거하고, 무게를 재고, 카세트에서 유사하게 배향시키고, 부인(Bouin) 용액에서 고정시키고, 파라핀에 묻었다. 각 동물로부터의 하나의 임의의 섹션을 사용하여 포인트 카운팅 모포메트릭스에 의해 소관 및 섬의 상대 부피를 정량하였다[Weibel, E.R., Lab Investig., 12:131-155 (1963)]. 조직에서 최소한 200개의 포인트가 170배 확대에서 50 포인트 격자의 인터셉트로서 계수되었고; 전체 섹션은 중복없이 커버되었다. 소관 또는 섬의 질량을 상대 부피 및 동물의 췌장 질량을 곱하여 계산하였다. 다른 평균 체중을 정규화하기 위하여, 질량을 ㎍/g 체중으로서 표시하였다. 결과는 스튜던트의 t 테스트에 의해 측정하였을 때, 각 그룹에서 5-6 동물에 대해 평균 및 표준 오차이다(p < 0.05).
INSGAS 이식 유전자로부터 가스트린의 발현은 TGF-α 과발현에 의해 유발되는 소관 이형성을 감소시켰다. 출생 후 17주에서, INSGAS/TGF-α 마우스의 췌장 조직학(도 3A)은 TGF-α 마우스의 것(도 3C) 보다 대조 췌장의 것(도 3B)과 유사하였다.
이를 포인트 카운팅 모포메트릭스에 의해 TGF-α 및 INSGAS/TGF-α 유전자이식 마우스 및 FVB/CD1 대조구에서 췌장 소관 질량을 정량화함으로써 확인하였다(도4A). INSGAS/TGF-α 췌장에서 가스트린 및 TGF-α의 공발현은 또한 대조구에 비해 섬 질량을 현저히 증가시킨 반면(도 4B), 섬 질량은 TGF-α 또는 가스트린 이식 유전자의 단독 발현에 의해 증가되지 않았다. 혈중 글루코스 농도는 세 그룹의 마우스에서 현저히 다르지 않았다.
실시예 4
정상 쥐의 췌장 인슐린 함량에 대한 TGF-α 및 가스트린의 영향
이 실험은 TGF-α, 가스트린 또는 TGF-α와 가스트린의 배합물로 처리된 비당뇨병 동물의 췌장 인슐린 함량에 대한 영향을 대조 동물(비처리)과 비교하여 연구하기 위해 고안되었다. 정상 위스터(Wistar) 쥐의 그룹(n=5)을 하기 네 개의 처리 그룹중 하나에 지정하였다.
그룹 I: TGF-α: 재조합 사람 TGF-α를 0.1%의 BSA를 함유하는 멸균 식염수에 재구성시키고, 10일동안 0.8㎍/일의 양으로 복강내 투여하였다.
그룹 II: 가스트린: 합성 쥐 가스트린 I을 매우 묽은 수산화암모늄에 용해시키고, 0.1%의 BSA를 함유하는 멸균 식염수에 재구성시켰다. 그것을 10일동안 0.8㎍/일의 양으로 복강내 투여하였다.
그룹 III: TGF-α + 가스트린: 상기 제제의 배합물을 10일동안 상기 양으로 복강내 투여하였다.
그룹 IV: 대조 동물에 부형제만을 10일동안 복강내 투여하였다.
연구 기간의 종료시점(10일)에서, 모든 동물을 희생시키고, 췌장 샘플을 다음과 같이 취하였다: 췌장 조직의 5개 생검 표본(1-2㎎)을 각각의 쥐 췌장에서 분리된 대표적인 부위로부터 취하고, 즉시 인슐린 함량을 분석하기 위해 액체 질소에서 스냅 냉동시켰다. 췌장 인슐린 함량을 분석하기 위해, 스냅 냉동된 췌장 샘플을 신속하게 해동시키고, 증류수에서 초음파처리하여 파괴하고, 분액을 단백질 측정을 위해 취하고, 인슐린 방사면역분석법 이전에 산/에탄올 추출하였다[Green et al., (1983) Diabetes 32:685-690]. 췌장 인슐린 함량치를 단백질 함량에 따라 보정하고, 최종적으로 ㎍ 인슐린/㎎ 췌장 단백질로 표시하였다. 모든 값을 평균 +/- SEM으로 계산하고 통계적 의미는 스튜던트의 2 샘플 t 테스트를 사용하여 평가하였다.
표 1
정상 쥐의 TGF-α 및 가스트린에 의한 처리
처리 췌장 인슐린 함량
(㎍ 인슐린/㎎ 단백질)
대조구 20.6 +/- 6.0
TGF-α 30.4 +/- 7.4*
가스트린 51.4 +/- 14.0**
TGF-α + 가스트린 60.6 +/- 8.7***
* TGF-α 대 대조구, p=0.34;
** 가스트린 대 대조구; p=0.11;
*** TGF-α 및 가스트린의 배합물, p=0.007.
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 췌장 인슐린 함량은 대조 동물과 비교하여TGF-α+가스트린 처리된 동물에서 현저하게 증가하였고(p = 0.007); 대조 동물과 비교하여 췌장 인슐린 함량은 약 3배 증가하였다. 이들 데이터는 TGF-α와 가스트린의 조합이 작용성 소도 β-세포 용적을 증가시킨다는 가설을 뒷받침한다. 이러한증가는 β-세포 비대(각각의 β-세포의 크기 증가)가 아닌 β-세포 과형성(갯수의 증가)의 포괄적 상태를 반영한다.
실시예 5
당뇨병 동물에서의 췌장 인슐린 함량에 대한 TGF-α와 가스트린의 조합의 효과
TGF-α와 가스트린의 조합이 당뇨병 동물(스트렙토조토신(STZ) 처리된)에서의 췌장 인슐린 함량을 정상(STZ 처리되지 않은) 동물에서의 수준에 필적하는 수준으로 증가시킬 수 있는 지를 결정하기 위해 제 2 실험을 고안하였다.
정상 위스타(Wistar) 래트에 STZ를 체중 1Kg 당 80mg의 용량으로 1회 정맥 주사하였다. 이러한 용량의 STZ는 실험 동물이 당뇨병에 걸리지만 작용성 β-세포량이 감소됨을 보장하고자 한 것이다. STZ는 투여 직전에 빙온의 10mM 시트르산 완충액에 용해시켰다. 동물을 매일 모니터하였는데; 지속적 당뇨병은 당뇨에 의해 나타나며, 비절식시의(non-fasting) 혈액 글루코오스 결정에 의해 확인되었다. 당뇨병 유도시킨 지 1주 후, 래트를 다음과 같은 두 그룹(n = 6)으로 나누었다.
그룹 I: TGF-α + 가스트린: STZ 당뇨병 래트를 재조합 사람 TGF-α와 합성 래트 가스트린 1의 조합물로 1회 복강내 주사 처리시켰으며; 두 제제를 10일간 0.8㎍/일의 용량으로 투여하였다.
그룹 II: 대조군: STZ 당뇨병 래트를 10일간 비히클만을 복강내 주사시켰다.
실험 기간의 종료 후, 모든 동물을 치사시키고, 췌장 샘플을 취하고, 실시예 4에 기술된 바와 같이 분석하였고, 결과를 표 2에 나타내었다.
표 2
TGF-α와 가스트린을 사용한 스트렙토조토신 래트의 처리
| 처리 | 췌장 인슐린 함량(㎍ 인슐린/ mg 단백질) |
| 대조군 (STZ 단독) | 6.06+/-2.1 |
| STZ 및 TGF-α + 가스트린 | 26.7+/-8.9 |
STZ에 의한 당뇨병의 유도는 성공적이었고, 고혈당증을 보통이지만 지속적으로 생성시켰다. 실험 동물이 작용성이지만 감소된 β-세포량을 보유함을 보장할 정도의 완전한 인슐리노패니아(insulinopaenia)는 없었다.
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 대조 스트렙토조토신 처리된 동물의 췌장 인슐린 함량은 STZ에 의한 β-세포의 파괴의 결과로써 정상 래트의 1/3 미만이었다 (단백질 1mg 당 20.6±6.0mg 인슐린, 상기 표 1 참조). TGF-α와 가스트린의 조합물로 처리된 STZ 동물의 경우, 췌장 인슐린 함량은 STZ만이 투여된 동물의 4배가 넘었고, 통계적으로는 정상 래트의 함량과 동일하였다.
진성 당뇨병은 근원적인 생리적 결함이 자체 면역 작용으로 인한 β-세포의 파괴 또는 글루코오스의 높은 순환 수준으로부터의 만성적 자극으로 인한 β-세포 분열 능력의 고갈의 결과로써의 β-세포의 결핍인 질병이다. 후자의 원인은 궁극적으로 β-세포의 재생 및/또는 대체가 β-세포가 전체적 손실되어 그에 따라 췌장의 인슐린 함량의 감소될 정도로 손상되는 경우에 질환을 유발시킨다. 상기 결과는 TGF-α와 가스트린의 조합물이, 췌장의 인슐린 함량을 비당뇨병 상태의 수준으로 회복시키기 위해 성숙한 β-세포의 생성을 자극시킴으로써 당뇨병을 치료하는데 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 6
STZ 유도된 당뇨병 동물에서의 IPGTT에 대한 TGF-α와 가스트린의 효과
STZ 유도된 당뇨병 위스타 래트의 두 그룹(평균 체중 103g)(그룹 당 n = 6)을 TGF-α와 가스트린 또는 PBS의 조합물을 매일 복강내 주입시키면서 10일간 처리시켰다. 절식시의 혈액 글루코오스를 0, 6 및 10일째에 모든 래트에 대해 결정하였다. 이러한 인슐린이 분비되고 작용성임을 입증하기 위해, IPGTT 시험을 수행하였다. 10일째에, 복강내 글루코오스 부하 테스트(IPGTT)를 밤새 절식시키면서 수행하였다. 체중 1kg 당 2g의 용량으로 복강내 글루코오스 주입시키기 전 및 주입시킨 지 30, 60 및 120분 후에, 혈액 샘플을 꼬리 정맥으로부터 취하였다. 혈액 글루코오스 결정을 상기한 바와 같이 수행하였다. 혈액 글루코오스 수준은 0시간째에는 두 실험 그룹에서 유사하였지만, TFGα와 가스트린 처리된 래트는 복강내 글루코오스 로딩 후 30, 60 및 120분째의 대조 래트와 비교하여 혈액 글루코오스 값이 50% 감소되었다 (도 5 참조).
실시예 7
체중 증가 및 당뇨병 기운이 있는 동물의 인슐린 함량에 대한 TGF-α 및 가스트린의 효과
비만이 일어나기 약 10 내지 15일 전인 30일령의 죽커(Zucker) 래트를 구하였다. 당뇨병 기운이 있는 죽커 래트(유전자형 fa/fa, 비만 및 당뇨에 대해 상염색체 열성 변이)이외에, 야윈 당뇨병이 없는 한배 새끼의 래트(유전자형 +/+)를 하기 기술되는 바와 같이 연구에 포함시켰다. 래트의 체중 및 혈액 글루코오스를 측정하므로써 매일 비만 및 당뇨병의 전개에 대해 모니터링하였다. 죽커 래트의 당뇨병 발병은 보통 45 내지 50 사이에 시작되었고, 동일 일령의 매칭되는 야윈 대조군에서의 수준과 비교하여 혈액 글루코오스 수준이 상당히 증가한 것으로 확인되었다.
이 연구에는 표 3에 기술된 바와 같이 각각 5마리로 된 래트의 5개 그룹을 포함하였다. 그룹 1 및 2(야위고, 당뇨병이 없는)를 0 내지 10일 동안 TGF-α와 가스트린 조합물 또는 PBS로 각각 처리하였다. 그룹 3, 4 및 5에는 비만의 초기 당뇨병이 있는 죽커 래트(유전자형 fa/fa)가 포함되었다. 그룹 3은 당뇨병이 발병하기 전 15일(-15일 내지 0일) 동안 조합물로 사전 처리하자, 추가 10일 동안(0 내지 10일) 당뇨병의 후발병이 계속되었다. 그룹 4는 당뇨병이 발병한 후 10일 동안 TGF-α와 가스트린 조합물로 처리하고, 그룹 5는 동일 기간 동안 PBS로 처리하였다. 연구 종료시에, 래트를 희생시켜 췌장을 분리하였다. 상기 기술된 바와 같이 단백질 및 인슐린 측정을 위해 분리된 대표적인 부위로부터 작은 생체검사물질을 취하였다.
사전 처리, 처리 또는 염수 처리된(표 3에서 그룹 3, 4 및 5) 비만의 당뇨병이 있는 죽커 래트의 체중 증가는 이들 그룹간에는 상당한 차이를 나타내지 않았다. TGF-α + 가스트린으로 오랫동안 처리(25일, 그룹 3)한 경우에도 정상 체중증가에 대한 효과가 없다는 것은 흥미롭다. 오차 한계내에서, 체중 증가는 모든 그룹에서 동일하였다.
비만 죽커 래트의 혈액 글루코오스 단식에 대한 TGF-α + 가스트린 처리의 효과를 상응하는 PBS 대조군과 비교하였다. 단식 혈액 글루코오스가 먼저 15일까지 상당히 증가하였고(4.0±0.6 대 5.0±0.2), 이 시점을 TGF-α + 가스트린 또는 PBS 대조군으로의 10 처리 기간을 위한 출발 시점으로서 선택하였다. 단식 혈액 글루코오스 수준은 TGF-α + 가스트린 처리에 의해 또는 PBS에 의해 상당히 변경되지 않았다. 단식 혈액 글루코오스 값은, 성장 인자 또는 PBS로 처리되거나 그렇지 않던 간에 비만 동물과 비교하여 야윈 동물에게서 보다 낮았다.
표 3
| 그룹 | 유전자형 | 상태 | 사전 처리±처리(일) | PBS 대조군 | 체중 증가 (%±SE) |
| 1 | +/+ | 야윈상태, 비당뇨병 | 없음 | 예 | 117±2.1 |
| 2 | +/+ | 야윈상태, 비당뇨병 | 0+10 | 아니오 | 119±1.9 |
| 3 | fa/fa | 비만, 초기 당뇨병 | -15+10 | 아니오 | 202±1.5 |
| 4 | fa/fa | 비만, 초기 당뇨병 | 0+10 | 아니오 | 119±1.0 |
| 5 | fa/fa | 비만, 초기 당뇨병 | 없음 | 예 | 129±1.3 |
타입 2의 주케르(Zucker) 쥐 모델에서, TGF-α 및 가스트린의 처치 결과 처리군과 대조군 사이에 혈당의 수준이 크게 차이나지 않았으며, 이는 단식 기간의 연장(18시간)에 따른 순간적인 히포글리세믹(hypoglycemic) 효과를 반영하는 것으로 보인다. 강기 면역조직화학적 연구는 TGF-α 및 가스트린 처리시킨 동물에서, 인슐린함유 세포의 포커싱의 수가 현저히 증가함을 보여주었다. 이러한 발견은 TGF-α 및 가스트린 처리 후에, 성인 쥐의 판크레아중 단일 β-세포의 증가를 입증했다. 흥미롭게도, 이러한 단일 β-세포 포커싱이 성인(자극시키지 않은) 쥐의 판크레아중에 일반적으로 관찰되는 것은 아니다. 이러한 발견은 치료가 β-세포 네오지네시스 및 복제 양자 모두에 대해 표적화되었기 때문에, TGF-α 및 가스트린의 타입 1 및 타입 2 당뇨병에서의 치료적 역할을 지지한다.
본 발명은 TGF-α 유도된 메타플라스틱 덕툴(ductules)중의 많은 인슐린 스테이닝 세포를 밝혀낸 연구에 일부 기초한다. 메타플라스틱 덕트 세포에서 낮은 수준의 외분비선 및 내분비선 유전자 발현은 태아의 판크레아성 진화의 초기 단계에서 볼 수 있는 프로토디퍼렌시에이션된 덕트 세포의 것과 유사하다. 랑게르한스섬(네오지네시스)의 형성은 이러한 초기분화된 인슐린 발현 세포의 증식 및 분화의 결과이다. 조직학적으로, 랑게르한스섬이 판크레아성 덕트로부터 버드로 나타남에 따라 분명해진다(네시디오블스토시스). MT-42 TGF-α 유전자전이 마우스중에, 덕트설 메타플라시아가 출생 직후에는 보이지 않으나, 4주령된 경우에만 관찰되었다. 이는 TGF-α 과발현이 태아 판크레아성 덕트에서 발견되는 랑게르한스섬 선구체(precursor)의 지속성의 연장 보다는 덕트 상피 세포중 인슐린의 발현을 유도함을 제시한다. 비록 메타플라스틱 덕툴이 많은 인슐린 양성 세포를 함유하지만, 상기 TGF-α 유전자 전이 마우스의 랑게르한스섬 질량은 대조군을 넘지 않았다. 보고된 상기 연구는 랑게르르한스섬 세포의 네오지네시스의 완성이 포유동물의 체내에서 가스트린/CCK 수용체 리간드 예를 들어, 가스트린, 및/또는 EGF 수용체 리간드 예를 들어, TGF-α와 함께 자극시킴에 의해 성인 판트레아스의 덕트 상피세포에서 재활성화됨을 입증했다. 랑게르한스섬 진화에서 판크레아성 가스트린 발현의 역할을 밝히고, TGF-α 및 가스트린이 각각 랑게르한스섬 진화에서 역할을 수행함을 보여주는, 판크레아에서의 TGF-α 및 가스트린의 과발현에 대한 연구가 보고되었다. 따라서, 잔류하는 다작용성 판크레아성 덕트 세포의 성숙한 인슐린 분비 세포로의 재생산성 분화가 당뇨병 멜리터스의 하나의 치유 방법이며, 이는 판크레아 내의 투여된 위치에서 발현하는 상기 인자 또는 조성물의 치료적 투여에 의한다.
본 발명의 방법은 본원에 기술된 특정 구체예에 의해 제한되는 것은 아니다. 본원의 기술내용으로부터 명백한 변형 및 수반하는 특징이 본 발명의 청구범위내에 포함된다.
본원에서 많은 문헌이 이용되었으며, 이들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
본 발명은 성숙한 인슐린 분비 세포로의 췌장 도세포 전구체 세포들의 분화를 효과적으로 촉진시키는 가스트린/CCK 수용체 리간드 및/또는 EGF 수용체 리간드를 포함하는 조성물을 개인에게 투여함으로써 이들을 필요로 하는 개인에게서 당뇨병을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법을 가스트린의 투여 및 생장 인자 알파(TGF-α) 단독으로 또는 정상적인 스트렙토조토신(STZ)과 함께 유도된 당뇨병 및 유전학적으로 전처리된 당뇨병을 가진 주케르(Zucker) 래트를 형질전환시킴으로써 예증하였다.
Claims (18)
- 가스트린/CCK 수용체 리간드 및 EGF 수용체 리간드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 리간드를 포함하는 조성물을, 췌장 섬(islet) 전구체 세포를 성숙한 인슐린 분비 세포로 분화시키는데 유효량으로 환자에게 투여함을 포함하는, 환자의 당뇨병을 치료하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 하나 이상의 수용체 리간드가 EGF1-53, EGF1-48, 또는 이의 EGF1-47 또는 EGF1-49 동종체로 구성된 군으로부터 선택된 EGF1 수용체 리간드임을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, EGF1-53, EGF1-48, 또는 이의 EGF1-47 또는 EGF1-49 동종체가 인간 EGF1-53, EGF1-48, 또는 이의 EGF1-47 또는 EGF1-49 동종체임을 특징으로 하는 방법.
- 이식에 앞서 가스트린/CCK 수용체 리간드 및 상피 성장 인자 수용체 리간드로 구성된 군으로부터 선택된 리간드를 랑게르한스섬의 성숙한 인슐린 분비 베타 세포의 증식을 유도시키기에 충분한 양으로 제공한, 배양시킨 췌장 섬을 환자에게 이식함을 포함하는,성숙한 인슐린 분비 베타 세포를 필요로하는 당뇨병 환자에게, 성숙한 인슐린 분비 베타 세포를 제공하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 당뇨병이 타입 2 당뇨병임을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 가스트린/CCK 수용체 리간드가 가스트린임을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상피 성장 수용체 리간드가 EGF1-53, EGF1-48, 또는 이의 EGF1-47 또는 EGF1-49 동종체로 구성된 군으로부터 선택된 TGF-α 또는 EGF임을 특징으로 하는 방법.
- 췌장 베타 세포의 증식을 유도하기에 충분한 양의 가스트린/CCK 수용체 리간드 및 상피 성장 인자 수용체 리간드를 췌장 베타 세포에 제공하여, 췌장 베타 세포 수의 증가가 수득됨을 포함하는, 췌장 베타 세포의 수를 증가시키는 방법.
- 췌장 베타 세포의 증식을 유도시키기에 충분한 양의 가스트린 수용체 작용제 및 상피 성장 인자 수용체 작용제를 췌장 섬에 제공하는, 췌장 β 세포의 배양 방법.
- 프로테이네이셔스 가스트린/CCK 수용체 리간드 및 프로테이네이셔스 EGF 수용체 리간드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 수용체 리간드를 포함하는 조성물을, 성숙한 인슐린 분비 세포에 대한 췌장 섬 전구체 세포의 분화에 효과적인 양으로 환자에 전신적으로 투여함을 포함하는 당뇨병 치료방법.
- 제 10항에 있어서, 프로테이네이셔스 가스트린/CCK 수용체 리간드가 가스트린임을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 포로테이네이셔스 EGF 수용체 리간드가 TGF-α임을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 당뇨병이 타입 2 당뇨병임을 특징으로 하는 방법.
- 가스트린/CCK 수용체 리간드 및 EGF 수용체 리간드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 수용체 리간드를 포함하는 조성물을, 성숙한 인슐린 분비 랑게르한스섬 세포에 대한 췌장 섬 전구체 세포의 분화에 효과적인 양으로 피검자에 전신적으로 투여함을 포함하는 췌장 섬 세포 네오지네시스를 자극하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 피검자임을 특징으로하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 가스트린/CCK 리간드 및 EGF 수용체 리간드 양자 모두가투여됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 16항에 있어서, 가스트린/CCK 수용체 리간드 및 EGF 수용체 리간드가 프로테이니셔스 수용체 리간드임을 특징으로 하는 방법.
- 가스트린/CCK 수용체 리간드 및 EGF 수용체 리간드제공하는 조성물을, 성숙한 인슐린 분비 섬 세포에 대한 췌장 섬 전구체 세포의 분화에 효과적인 양으로 피검자에 투여함을 포함하는 당뇨병의 치료 방법.
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