CN100482686C - 治疗糖尿病的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用以对需要治疗糖尿病的个体进行治疗的方法和组合物。该方法包括给患者施用一种可以提供一种胃泌激素/缩胆囊素受体配体(如胃泌激素)，以及/或者一种表皮生长因子(EGF)受体配体(如EGF-α)的组合物，其剂量足以有效地促进胰岛前体细胞分化为成熟的胰岛素分泌细胞。该组合物可以全身性施用，或者也可以通过被通过转基因技术补充有胃泌激素/缩胆囊素受体配体基因(如前胃泌激素原肽前体基因)以及/或者EGF受体配体基因(如TGF-α基因)的细胞进行原位表达。该方法还包括给患者移植经过培养的胰岛，在上述的胰岛中，成熟的胰岛素分泌β细胞通过暴露于胃泌激素/缩胆囊素受体配体以及EGF受体配体而得以增殖。

Description

治疗糖尿病的药物组合物

介绍

发明领域

本发明涉及一种通过给需要治疗糖尿病的个体施用一种组合物以进行糖尿病治疗的方法，其中上述的组合物含有一种胃泌激素(gastrin)/胆囊收缩素(CCK)受体配体以及/或者一种EGF受体配体，其可以有效地促进胰岛前体细胞分化为成熟的胰岛素分泌细胞。这一方法的一个示例是给正常的经链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病大鼠以及在遗传上易受感染的糖尿病Zucker大鼠单独或者结合施用胃泌激素和转化生长因子α(TGF-α)。

背景

糖尿病是发生于所有年龄阶层和群体的最普通的内分泌疾病之一。糖尿病不仅临床发病率和死亡率高，其经济费用也很高，仅在美国每年就超过900亿美元，糖尿病的广泛发病率预期到2010年将增加2倍以上。

糖尿病有两种主要的形式：胰岛素依赖型(1型)糖尿病(insulin-dependent diabete smellitus，IDDM)，占所有病例的5-10％；以及非胰岛素依赖型(2型)糖尿病(non-insulin-dependentdiabetes mellitus，NIDDM)，占所有病例的大约90％。2型糖尿病与年龄的增加有关，然而，被诊断患有NIDDM，即所谓的年轻人成熟期发病的糖尿病(maturity onset diabetes of the young，MODY)，的年轻人的数目呈增加趋势。在1型和2型病例中，胰岛素的分泌都减少，要么是因为胰腺中的β-细胞的破坏，要么是因为胰岛素的分泌或产生存在缺陷。在NIDDM中，患者典型地通过实行最优膳食疗法、减肥以及运动来开始治疗。当这些措施无法再提供足够的代谢控制时，开始药物疗法。初始的药物疗法包括磺脲类，它们刺激β-细胞的胰岛素分泌，但也可以包括缩二胍、α-葡萄糖苷酶抑制剂、(thiazolidenediones)以及组合疗法。然而，值得一提的是，2型糖尿病的疾病运作机制的渐进性本质是难以控制的。在所有的通过药物治疗的糖尿病患者中，50％以上的患者在6年内对血糖的控制都很差，不管施用的是什么药物。许多人认为胰岛素治疗是2型糖尿病治疗的最后一个手段，并且有病人拒绝使用胰岛素。

胰岛是从位于胎儿管状胰脏内皮的内胚层干细胞发育而来的，上述内皮还含有发育为外分泌胰腺的多能性干细胞。Teitelman和Lee，发育生物学(Developmental Biology)，121：454-466(1987)；Pictet和Rutter，胚胎内分泌胰脏的发育(Development of theembryonic encocrine pancreas)，于内分泌学(Endocrinology)中，生理学手册(Handbook of Physiology)，R.O.Greep和E.B.Astwood编辑(1972)，美国生理学会(American PhysiologicalSociety)：Washington，D.C.，第25-66页。胰岛的发育在胚胎妊娠期的不连续发育阶段继续进行，上述阶段被戏剧性的过渡屡次打断。初始的阶段是一个分化早期状态，其特征在于多能性干细胞被提交给胰岛细胞谱系，这通过分化初期(protodifferentiated)细胞对胰岛素和高血糖素的表达表现出来。这些分化初期细胞含有一群被提交的胰岛前体细胞，它们仅表达低水平的胰岛特异性基因产物并缺乏成熟胰岛细胞的细胞分化。Pictet和Rutter，见上。在小鼠妊娠的第16天左右，分化初期的胰脏开始一个快速生长和分化的阶段，其特征在于胰岛细胞的细胞分化和胰岛特异性基因表达的几百倍的增加。在组织学上，胰岛的形成(再生)随着增殖的胰岛从胰腺管中萌芽出来(胰岛细胞增殖症)变得明显。在即将出生之前胰岛的生长减缓，胰岛的再生和胰岛细胞增殖症很大程度上变得较不明显。与此同时，胰岛达到最完全分化的状态，其胰岛素基因的表达达到最高水平。因此，与许多器官类似，细胞分化的完成伴随着再生能力的降低；分化后的成熟胰脏不具有发育中的胰脏所具有的同样的再生潜能或者增殖能力。

由于分化初期前体细胞的分化发生于胰脏胚胎发育的晚期，调控胰岛分化的因子可能在这一阶段在胰脏中得以表达。在胰岛发育期间被表达的基因的其中之一编码胃肠肽—胃泌激素。虽然胃泌激素在成年人中充当胃激素，调控酸的分泌，但是在胚胎中胃泌激素表达的主要位点是胰岛。Brand和Fuller，J.Biol.Chem.，263：5341-5347(1988)。胃泌激素在胰岛中的表达是短暂的。它被限制在分化初期胰岛前体细胞形成分化的胰岛的这一阶段。虽然胰脏胃泌激素在胰岛发育中的重要性仍是未知的，一些临床观察提示了胃泌激素在胰岛发育中的一个如下的规则。例如，由胃泌激素表达胰岛细胞肿瘤引起的高胃泌激素血症以及萎缩型胃炎是与胰岛细胞增殖症相关联的，后者与在正在分化的胚胎胰岛中看到的类似。Sacchi等，Virchows ArchivB，48：261276(1985)；以及Heitz等，糖尿病(Diabetes)，26：632-642(1977)。另外，胰脏胃泌激素的不正常持续在一个小儿胰岛细胞增殖症病例的文件中已有记载。Hollande等，肠胃病学(Gastroenterology)，71：251-262(1976)。然而，在上述的观察中均没有建立一个胰岛细胞增殖症和胃泌激素刺激之间的因果关系。

因此，鉴定刺激胰岛细胞再生的因子是有意义的，这些因子在早期IDDM的治疗和NIDDM中β-细胞缺乏的预防中是有价值的。

引用本文中所述的参考文献不应该被解释成是承认此类参考文献是本发明的优先工艺。

相关文献

胎儿胰脏的发育牵涉到三种生长因子，即胃泌激素、转化生长因子α(TGF-α)以及表皮生长因子(EGF)(Brand和Fuller，J.Biol.Chem.263：5341-5347)。过量表达单一的TGF-α或者胃泌激素的转基因小鼠的胰岛细胞的生长并不活跃，然而，表达上述两个转基因的小鼠的胰岛细胞质量显著增加(Wang等，(1993)J.Clin.Invest.92：1349-1356)。Bouwens和Pipeleers(1998)在Diabetoligia41：629-633中报道在正常的成年人的胰脏中萌芽的β-细胞的比例很高，而且发现所有的β-细胞中15％是单个的单元。单个的β-细胞焦点(foci)在成年的(未经刺激的)小鼠的胰脏中通常并没有发现；Wang等(1995)在Diabetologia 38：1405-1411中报道的频率是大约占β-细胞总数的1％。

1型糖尿病患者在实施被囊胰岛移植(encapsulated islettransplantation)之后对胰岛素的非依赖性描述于Soon-Shiong等(1994)Lancet 343：950-51中。同时还参考Sasaki等(1998年6月15日)移植(Transplantation)65(11)：1510-1512；Zhou等(1998年5月)美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)274(5Pt1)：C1356-1362；Soon-Shiong等(1990年6月)Postgrad Med 87(8)：133-134；Kendall等(1996年6月)糖尿病代谢(Diabetes Metab)22(3)：157-163；Sandler等(1997年6月)移植(Transplantation)63(12)：1712-1718；Suzuki等(1998年1月)细胞移植(Cell Transplant)7(1)：47-52；Soon-Shiong等(1993年6月)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90(12)：5843-5847；Soon-Shiong等(1992年11月)移植(Transplantation)54(5)：769-774；Soon-Shiong等(1992年10月)ASAIO J 38(4)：851-854；Benhamou等(1998年6月)糖尿病代谢(Diabetes Metab)24(3)：215-224；Christiansen等(1994年12月)临床内分泌代谢杂志(J Clin Endocrinol Metab)79(6)：1561-1569；Fraga等(1998年4月)移植(Transplantation)65(8)：10601066；Korsgren等(1993)Ups J Med Sci 98(1)：39-52，Newgard等(1997年7月)Diabetologiz 40 Suppl 2：S42-S47.

发明概要

本发明涉及一种通过给需要治疗糖尿病的个体施用一种组合物以进行糖尿病治疗的方法，其中上述的组合物含有一种胃泌激素/胆囊收缩素受体配体，一种EGF受体配体，或者两者的组合，其数量足以使患者的胰岛前体细胞分化为成熟的胰岛素分泌细胞。该组合物可以全身施用或者通过宿主细胞在原位进行表达，上述的宿主细胞含有位于一个表达载体中的核酸构造物，其中的核酸构造物含有一个胃泌激素缩胆囊素受体配体的编码序列或者一个EGF受体配体的编码序列，以及一个在胰岛前体细胞中发挥功能的转录和翻译调控区域。本发明同时还提供了用于对需要治疗糖尿病的患者进行糖尿病治疗的方法和组合物，通过给糖尿病患者移植胰岛细胞以便增加胰岛中胰脏β-细胞的数量，其中上述的胰岛细胞已经在培养基中被暴露于足量的一种胃泌激素/缩胆囊素受体配体和一种EGF受体配体；可选地，胰脏β-细胞的种群可以在培养基中生长一段足以在移植之前扩增β-细胞种群的时间。这些方法和组合物在糖尿病患者的治疗中发挥作用。

附图的简要说明

图1A显示了数目众多的来源于TGF-α转基因胰脏的位于化生管中的胰岛素染色细胞，用免疫过氧化酶染色。图1B显示了大多数的小导管细胞胰岛素染色的程度较低，但是偶然地小导管细胞的胰岛素染色的程度也会与毗邻的胰岛的程度一样高。

图2A图解了嵌合的胰岛素启动子-胃泌激素(insulinpromoter-gastrin，INSGAS)转基因的结构。图2B图解了INSGAS转基因小鼠胰脏提取物的放射免疫化验，显示了高水平的胃泌激素免疫反应性，这超出了胃窦中由内源性小鼠基因表达的胃泌激素的含量。INSGAS转基因小鼠在出生后胃泌激素在胰脏中有高水平的表达。

图3A是一只被用于实施例3中所报告的研究中的INSGAS/TGF-α小鼠的胰脏的组织学图象。INSGAS/TGF-α胰脏有一些小管复合物增加而且细胞间质(interstitial cellularity)稍有增加的区域。此处所示的视野是所用的五只动物中组织学最为异常的。图3B是一只实施例3中的对照小鼠的胰脏组织学图象。图3C是一只被用于实施例3中所报告的研究中的TGF-α小鼠的胰脏组织学图象。这一显示了被用于实施例3中所报告的研究中的TGF-α小鼠胰脏的视野是典型的，它显示了细胞间质和纤维症，同时结合有旺盛小导管化生，这已被Jhappan等，见上，所描述。

图4A是一个图解点＝记数(point＝counting)形态测定数据的直方图，它确证了在第17周，INSGAS/TGF-α小鼠的胰脏的导管质量比TGF-α小鼠的胰脏的小，这是以实施例3中所报道的研究为基础的。图4B是一个图解点＝记数形态测定数据的直方图，它显示了胃泌激素和TGF-α在INSGAS/TGF-α胰脏中的共表达显著地增加了胰岛的质量(与相应的非转基因对照小鼠的胰岛质量作比较)。另外，仅表达TGF-α并不增加胰岛的质量。这些数据是以实施例3中所述的研究为基础的。

图5显示了TGF-α和胃泌激素在由链脲霉素诱导的糖尿病小鼠(用PBS(空心圆)或者TGF-α和胃泌激素结合(空心正方形)进行处理，每日腹膜内施用一次，为期10天)中对葡萄糖容许量的影响。

图6显示了在如实施例7中所述的三组经过治疗的Zucker小鼠以及相应的PBS对照(6只/组)中TGF-α和胃泌激素治疗对β-细胞再生的影响。条1代表瘦的经TGF+胃泌激素处理的，条4代表肥胖的经TGF+胃泌激素处理的，条5代表肥胖的PBS对照，条3代表经TGF+胃泌激素预处理的，条2代表瘦的PBS对照。在被研究的所有的组中，TGF-α和胃泌激素显著地增加了单个β-细胞焦点的相对比例(与经PBS处理的动物相比较)。组4和组5有显著的差别(p<0.0015)，组1和组2也有显著的差别(p<0.0041)。

图7显示了TGF-α和胃泌激素处理对瘦的和肥胖的Zucker大鼠的β-细胞再生的影响。β-细胞的再生是通过β-细胞总数和新生的单个β-细胞焦点的差值记数来定量的，以所记数的β-细胞总数的百分比来表示。在经生长因子组合治疗的瘦的Zucker大鼠中单个β-细胞焦点的百分率为10.5±0.9，而相应的PBS对照组的为3.9±1.1(p＝0.004)(图7A和图B)。在肥胖的Zucker大鼠中，在预先经过治疗的组中单个β-细胞焦点的百分率为8.7±1.3，而相应的对照组的为4.2±1.1(p＝0.0015)(图7C和图D)。图7E是图7C中所示的导管区域(如箭头所示)的400×的一个放大图，它提供了含有胰岛素的细胞从导管表皮细胞中萌芽出来(这是β-细胞再生的特征)的清楚的证据。

优选实施例的详细说明

本发明提供了一种通过给需要治疗糖尿病的个体施用一种组合物以进行糖尿病治疗的方法，其中上述的组合物含有一种胃泌激素/胆囊收缩素受体配体，如胃泌激素，一种EGF受体配体，如TGF-α，或者两者的组合，其数量足以使患者的胰岛前体细胞分化为成熟的胰岛素分泌细胞。当全身性施用该组合物时，通常是将其制备于生理学可接受的载体中进行注射，优选的静脉注射。当在原位表达该组合物时，胰岛前体细胞在体外或者在体内被一种表达载体中的一种或多种核酸表达构造物所转化，上述的表达载体在胰岛前体细胞中表达了所需的一种或多种受体配体。例如，表达构造物包括一个缩胆囊素受体配体的编码序列，如一个前胃泌激素原肽前体编码序列，它在表达之后被加工成胃泌激素，或者一个EGF受体配体如EGF-α的编码序列，以及转录或者翻译调控区域，它们为在胰岛前体细胞中表达作准备。转录调控区可以是构成性或者诱导性的(例如通过增加细胞内葡萄糖的浓度)，例如可以是一个来源于胰岛素基因的转录调控区域。用任何一种适合的表达载体，例如腺病毒表达载体，来进行转化。当转化是在体外进行时，经过转化的细胞被移植到糖尿病患者中，例如使用一种肾胶囊。可选的，在体外用足量的胃泌激素/缩胆囊素受体配体和/或者EGF受体配体对胰岛细胞进行处理以便在移植到糖尿病患者中之前增加胰腺中胰脏β-细胞的数量。如所要求的，在移植之前，在培养基中通过让胰脏β-细胞接触如上的一种或多种受体配体来扩增它们的种群。

本发明比起现有的糖尿病治疗方法具有一些优点。通过提供一种方法来刺激成熟的胰脏再生，不仅使对传统药物治疗(2型)或者胰岛素治疗(1型和2型)的需要较少或者甚至消除，而且正常血糖水平的保持也可能减少糖尿病的一些引起衰老的综合症。糖尿病综合症包括那些影响视网膜、肾、以及神经的小血管的症状(微血管综合症)，以及那些影响那些为心脏、大脑、以及下肢供血的大血管的症状(大血管综合症)。糖尿病微血管综合症是20-74岁年龄段的人新盲的主要病因，而且也是35％的晚期肾病新病例的病因。60％以上的糖尿病受到神经病的影响。糖尿病是美国50％的非外伤切断手术的病因，这主要是由糖尿病大血管疾病造成的，而且糖尿病患者死于冠状动脉疾病的几率是非糖尿病患者的2.5倍。高血糖症被认为发起并加速了糖尿病微血管综合症的发展。使用目前的各种各样的治疗方法无法足够地控制高血糖症，因此就无法预防或者减弱糖尿病综合症的发展。

如此处所用的，术语“胃泌激素/缩胆囊素受体配体”包括那些刺激胃泌激素/缩胆囊素受体的化合物。这种胃泌激素/缩胆囊素受体配体的例子包括各种不同形式的胃泌激素，如胃泌激素34(大胃泌激素)、胃泌激素17(小胃泌激素)、以及胃泌激素8(迷你型胃泌激素)；各种不同形式的缩胆囊素，如缩胆囊素58、缩胆囊素33、缩胆囊素22、缩胆囊素12以及缩胆囊素8；以及以单个的形式或者是与EGF受体配体相组合、可以诱导成熟胰脏中细胞分化形成胰岛素分泌胰岛细胞的其他的胃泌激素/缩胆囊素受体配体。本发明同时还设想了上述配体的活性类似物、片段以及其他的修饰物。此类配体还包括可以增加内源性胃泌激素、缩胆囊素或者类似的活性肽从组织贮存体分泌的化合物。它们的例子有奥美拉唑(omeprazole)，它抑制胃酸的分泌，以及大豆胰蛋白酶抑制剂，它增加缩胆囊素的刺激。

如此处所用的，术语“EGF受体配体”包括那些化合物，当它刺激EGF受体时位于同一或者毗邻组织或者位于同一个体中的胃泌激素/缩胆囊素受体也被刺激，胰岛素生成胰岛细胞的再生被诱导。此类EGF受体配体的例子包括EGF1-53及其片段及活性类似物，包括EGF1-48、EGF1-52、EGF1-49。见，例如美国专利编号5,434,135。其他的例子包括TGF-α受体配体(1-50)及其片段和活性类似物，包括1-48、1-47以及其他的EGF受体配体，如双边条曲菌素(amphiregulin)和痘病毒生长因子以及具有与胃泌激素/缩胆囊素受体配体相同的协同性的其他的EGF受体配体。这包括上述配体的活性类似物、片段以及修饰物。更进一步的背景请参考Carpenter和Wahl，肽生长因子(Peptide Growth Factors)的第四章(由Sporn和Roberts编辑)，Springer Verlag，(1990)。

本发明的一个主要方面是一种通过给需要治疗糖尿病的个体施用一种组合物以进行糖尿病治疗的方法，其中上述的组合物包括一种胃泌激素/胆囊收缩素受体配体以及/或者一种EGF受体配体，其数量足以使患者的胰岛前体细胞分化为成熟的胰岛素分泌细胞。如此分化的细胞是胰脏导管中的残余的潜伏性胰岛前体细胞。一个实施例包括给个体施用，优选的全身性施用，一分化再生数量的胃泌激素/缩胆囊素受体配体和EGF受体配体，优选的是TGF-α，可以单个施用或者结合施用。

另一个实施例包括给哺乳动物的外植的胰脏组织的胰岛前体细胞提供一种胃泌激素/缩胆囊素受体配体以及/或者一种EGF受体配体并将经过如此刺激的胰脏组织重新导入到哺乳动物中。

在另一个实施例中，本发明包括给哺乳动物的外植的胰脏组织的胰岛前体细胞提供一种胃泌激素/缩胆囊素受体配体以及/或者一种EGF受体配体以扩增β-细胞的种群。

在另一个实施例中，胃泌激素/缩胆囊素受体配体刺激是通过表达一个通过转基因方法导入此类前体细胞中的嵌合的胰岛素启动子-胃泌激素融合基因构造物来实现的。在另一个实施例中，EGF受体配体刺激是通过表达一个通过转基因方法导入哺乳动物中的EGF受体配体基因来实现的。EGF基因的序列被提供于美国专利编号5,434,135中。

在另一个实施例中，来源于一个胃泌激素/缩胆囊素受体配体以及一个EGF受体配体的刺激是通过已经被稳定地导入哺乳动物中的(i)一个前胃泌激素原(preprogastrin)肽前体基因和(ii)一个EGF受体配体基因的共表达来实现的。

在另一个方面，本发明涉及一种使哺乳动物胰岛前体细胞分化的方法，通过结合使用一种胃泌激素/缩胆囊素受体配体和一种EGF受体配体来刺激此类细胞。在一个这一方面的优选实施例中，胃泌激素的刺激是通过表达一个被稳定地导入到哺乳动物中的前胃泌激素原肽前体基因来实现的。这一表达受胰岛素启动子的控制。EGF受体配体，例如TGF-α，的刺激是通过表达一个被稳定的导入到哺乳动物中的EGF受体配体基因来实现的。作为上述的更进一步，用一种胃泌激素和一种TGF-α来进行刺激，优选的是通过被导入哺乳动物中的(i)一个前胃泌激素原肽前体基因和(ii)一个EGF受体配体基因的共表达来实现的。能够指导基因转录的合适的启动子包括病毒启动子和细胞启动子。病毒启动子包括近早期(immediate early)巨细胞病毒(CMV)启动子(Boshart等(1985)细胞(Cell)41：521-530)，SV40启动子(Subramani等(1981)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)1：854-864)，以及来源于腺病毒2的主要的晚期启动子(Kaufman和Sharp(1982)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)2：1304-1319)。优选的，胃泌激素/缩胆囊素受体配体基因和EGF受体配体基因的其中之一或两者的表达是受胰岛素启动子控制的。

本发明的另外一个方面是一个核酸构造物。这一构造物包括一个编码一个前胃泌激素原肽前体的序列以及一个胰岛素转录调控序列，它是一个编码前胃泌激素原肽前体的序列的5’端并能够支持这一序列的转录。优选的，胰岛素转录调控序列包括至少一个胰岛素启动子。在一个优选实施例中，编码前胃泌激素原肽前体的核酸序列包括一个多聚核苷酸序列，该序列含有人胃泌激素基因的外显子2和3，可选的还含有内显子1和2。

本发明的另一个实施例是一个表达盒，包括(i)一个编码哺乳动物EGF受体配体的核酸序列，例如TGF-α，以及一个它的转录调控序列；以及(ii)一个编码前胃泌激素原肽前体的核酸序列以及一个它的转录调控序列。优选的，EGF受体配体的转录调控序列是一个强的非组织特异性启动子，如金属硫蛋白启动子。优选的，前胃泌激素原肽前体的转录调控序列是一个胰岛素启动子。在这一实施例的一个优选形式中，编码前胃泌激素原肽前体的核酸序列包括一个多聚核苷酸序列，该序列含有人胃泌激素基因的内显子1和2以及外显子2和3。

本发明的一个方面涉及一个载体，这一载体包括包含有前胃泌激素原肽前体编码序列的表达盒。这一载体可以是一个质粒，如pGeml，或者是一个含有一个包括一个胰岛素启动子的转录调控序列的噬菌体。

本发明的另一个方面涉及一个载体的组合物，包括(1)具有编码哺乳动物EGF受体配体的核酸序列，例如TGF-α，该序列受一个强的非组织特异性启动子，如金属硫蛋白启动子，的控制，以及一个受一个胰岛素启动子控制的前胃泌激素原肽前体编码序列。就这一点而言，每一个载体都可以是一个质粒，如质粒pGeml或者是一个噬菌体。可选的，表达盒或者载体也可以根据适合的组织营养性(tissuetrophism)插入到病毒载体中。病毒载体的例子包括腺病毒、疱疹单纯病毒、腺关联病毒、逆转录酶病毒、慢病毒，等等。见Blomer等(1996)人类分子遗传学(Human Molecular Genetics) 5 Spec.No：1397-404，以及Robbins等(1998)生物工程学趋势(Trends inBiotechnology)16：35-40。腺病毒介导的基因治疗已经被成功地用于短暂地改正囊肿性纤维化患者的鼻上皮氯转运缺点。见Zabner等(1993)细胞(Cell)75：207-216。

本发明的另一个方面是一种非人类哺乳动物或者哺乳动物组织，包括细胞，它能够表达一个被稳定整合的编码前胃泌激素原的基因。这一方面的另一个实施例是一非人类哺乳动物，它能够共表达(i)一个前胃泌激素原肽前体基因；以及/或者(ii)一个已经被稳定的整合到非人类哺乳动物、哺乳动物组织或者细胞中的EGF受体配体，例如一个TGF-α基因。哺乳动物组织或细胞可以是人的组织或细胞。

治疗施用及组合物

施用的模式包括但不局限于穿过真皮、肌肉、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、以及口服途径。化合物可以用任何方便的途径来施用，例如通过灌输或者快速浓注(通过上皮或者皮肤粘膜内层，如口腔粘膜层、直肠和肠粘膜层等，来吸收)，而且可以与其他的生物活性剂一起施用。优选的进行全身性施用。

本发明同时还提供了制药组合物。此类组合物包括一治疗有效量的一种治疗上和制药上可接受的载体或赋形剂。此类载体包括但不局限于盐水、缓冲的盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇、以及它们的组合。制剂应该适合施用的模式。用于本发明中的制药可接受的载体和制剂见于Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Philadelphia，PA，第17版，(1985)，该文献作为参照被结合于本发明中。关于药物递送方法的一个简要的综述请见Langer(1990)科学(Science)249：1527-1533，该文献作为参照被结合于本发明中。

在制备本发明的制药组合物的过程中，可能需要对本发明的组合物进行修饰以改变它们的药物动力学和体内分布特性(biodistribution)。关于药物动力学的一个总体的讨论请参照Remingtons’s Pharmaceutical Sciences(如上)的第37-39章。用于改变药物动力学和体内分布的许多方法是本工艺的一般技术人员所已知的(见，例如，Langer的如上的文献)。此类方法的例子包括将药剂保护在由诸如蛋白、脂质(例如脂质体)、碳水化合物、或者合成聚合体等物质组成的小囊泡中。例如，本发明的药剂可以被结合到脂质体中以便增强它们的药物动力学和体内分布的特性。已有多种用于制备脂质体的方法，如在Szoka等(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467、美国专利编号4,235,871、4,501,728、以及4,837,028中所描述的方法，上述文献作为参照结合于本发明中。各种各样的其他的输送系统也是已知的，可以被用于施用本发明的治疗药剂，例如微粒、微胶囊等等。

如果需要，组合物还可以含有少量的湿润剂、乳化剂，或者pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、药片、药丸、胶囊、缓释制剂、或者粉末。组合物可以被配制为栓剂，带有传统的绑缚物和载体，如三甘油三酯。口服制剂可以包括标准的载体，如制药等级的D-甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁，等等。

在一个优选实施例中，组合物是根据常规的程序进行配制的，配制成例如一种适合人类静脉内施用的制药组合物。典型的，用于静脉内施用的组合物是用无菌等渗的水缓冲液制备的溶液。需要时，组合物还可以包括一种增溶剂以及一种局部麻醉剂以改善注射位点的疼痛。成分通常是以单位剂量的形式分别或者混合提供的，例如，以冻干粉末或者无水浓缩液的形式放置于一个密封的、有刻度的、标示有活性剂质量的容器，例如安培瓶或者小袋(sachette)中。当组合物是用于灌输施用时，可以用一个含有无菌的配药等级的水或者盐水的灌输瓶进行分配。当组合物是用于注射施用时，可以提供一安培瓶的注射用无菌水或者盐水以便在施用之前与成分混合。

本发明的治疗剂可以被配制成中性的或者盐的形式。制药可接受的盐包括那些与自由氨基形成的盐，例如那些来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等等的盐，以及那些与自由羧基形成的盐，例如那些来源于钠、钾铵、钙以及其他二价阳离子、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等的盐。

本发明的治疗剂能够有效治疗特定的紊乱或疾病的量取决于紊乱或疾病的本质，而且可以通过标准的临床技术来确定。在制剂中所用的精确的剂量同时也取决于施用的途径、以及疾病或紊乱的严重程度，并且应该根据从业者的判断和每一个患者的状况来决定。然而，静脉内施用的合适的剂量范围通常是每公斤体重大约20-500微克活性化合物。鼻内施用的合适的剂量范围通常为每公斤体重大约0.01皮克至1毫克之间。有效的剂量可以从来源于体外或者动物模型试验系统的剂量反应曲线向外延伸。栓剂所含有的活性成分通常在体重的0.5％至10％之间；口服制剂优选的含有10％至95％的活性成分。

在本发明的基因治疗方法中，体内的转染是通过在哺乳动物宿主中引入一种治疗性的转录或表达载体来实现的，或者是以裸露DNA的形式(与脂质载体，特别是阳离子脂质载体形成复合物)，或者是被插入到一个病毒载体，例如一个重组腺病毒，中。可以用好几种方法来导入到哺乳动物宿主中，包括以静脉内或者腹腔内注射、气管内、鞘内、肠道外、关节内、鼻内、肌肉、局部、穿越真皮的形式施用于任何粘膜表面、角膜装置等等。特别感兴趣的是将治疗性的表达载体引入到循环的体液中或者引入到身体的孔或者体腔中。因此，静脉内施用和膜内施用是特别感兴趣的，因为载体通过这种施用途径可以被广泛的传播，在引入体孔或体腔时可以使用气溶剂施用方法。可以对准特定的细胞和组织，这取决于施用的途径和施用的位置。例如，沿着血流方向最靠近注射位置的组织不需任何特定的寻靶即可被转染。如果使用脂质载体，可以对它们进行修饰以用位置引导分子引导该复合物到达特定类型的细胞。这样，可以使用针对特定受体或者其他的细胞表面蛋白的抗体或配体，由一个目标细胞与一个特定的表面蛋白相关联。

在施用DNA、重组病毒载体或者脂质载体时可以使用任何生理学可接受的介质，如去离子水、盐、磷酸盐缓冲液、5％右旋糖水溶液等等，如上面针对制药组合物所描述的，这取决于施用的途径。在制剂中也可以包括其他的成分，如缓冲液、稳定剂、杀生物剂等等。这些成分在文献中已经有广泛的范例，在此不作具体描述。应该避免任何可能导致复合物聚集的稀释液或者稀释液的成分，包括高盐、螯合剂，等等。

所用的治疗性载体的量应该是足以在目标组织中进行治疗水平表达的量。治疗水平的表达是足以使血糖降低到正常水平的表达量。另外，所使用的核酸载体的剂量必须足以使转基因在所感染的组织产生所需水平的体内表达。其他的DNA序列，如腺病毒VA基因，可以被包括在施用介质中并被感兴趣的基因共转染。编码腺病毒VA基因产物的基因的存在，如果需要，可以显著增强从这一表达盒转录的mRNA的翻译。

有许多因子可以影响在受转染组织的表达量，从而可以被用于对表达的水平进行修饰以达到特别的目的。当需要高水平表达时，可以对所有的因素进行优化，当需要较少的表达时，可以改变一个或多个参数以获得所需水平的表达。例如，如果高水平的表达将超出治疗的窗口(therapeutic window)，那么可以使用比最优条件差的条件进行表达。

重组基因表达的水平和组织可以如上所述在mRNA水平进行确定，以及/或者在多肽或者蛋白的水平进行确定。基因产物可以通过对其在组织中的生物学活性的测量来定量。例如，蛋白活性可以通过如下方法进行确定：如上所述的免疫测定方法、生物学测定方法(如血糖测定方法)、或者通过使用免疫染色技术来鉴定被转染细胞中的基因产物，如用抗体进行针探，其中上述的抗体特异地识别该基因产物或者存在于表达盒中的一个报告基因的产物。

典型的，治疗盒并没有被整合到患者的基因组中。如果需要，治疗可以特别地进行重复，这取决于所获得的结果。如果进行重复，可以对患者进行监控以确保对治疗没有产生有害的免疫或其他的反应。

本发明还提供了用于在体外扩增胰脏细胞种群的方法。在从合适的捐赠者分离出胰脏之后，细胞被分离出来并在体外生长。所用的细胞是从哺乳动物捐献者的组织样品，包括人尸、猪的胎儿或者另外一种胰脏细胞的合适来源，获得的。如果使用的是人的细胞，可能的话这些细胞与接受者在主要的组织相容性上是匹配的。细胞可以在对分离后的胰脏进行酶解(如用胶原酶)之后用梯度分离来进行纯化。让经过纯化的细胞在含有充足营养物(以让细胞存活)以及足量的含有胃泌激素/缩胆囊素受体配体和EGF受体配体的β-细胞增殖诱导组合物(以便形成胰岛素分泌胰脏细胞)的介质中生长。根据本发明，在刺激之后，胰岛素分泌胰脏细胞可以先在培养基中被直接扩增，然后再被移植到有需要的患者中，或者也可以在经过β-细胞增殖诱导组合物处理之后被直接移植。

移植的方法包括将所获得的胰岛素分泌胰脏β-细胞结合免疫抑制剂，如环孢菌素，移植到有需要的患者中。胰岛素生产细胞也可以在移植之前被囊封于一种半透膜中。这种膜允许胰岛素从囊封的细胞分泌出来，同时也保护这些细胞免受免疫攻击。所要移植的细胞的数目估计为每公斤患者体重10,000至20,000个胰岛素生产β-细胞。如果需要，可能需要重复的移植以保持有效治疗数量的胰岛素分泌细胞。根据本发明，也可以给移植的接受者提供足量的胃泌激素/缩胆囊素受体配体盒EGF受体配体以诱导移植之后的胰岛素分泌细胞的增殖。

糖尿病的治疗效果可以如下进行评估。如果可能的话，对治疗形式的生物学效力和临床效力都进行评估。例如，疾病通过增加的血糖表现出来，因此，治疗的生物学活性可以通过观察到被评估的血糖返回到正常水平来评估。临床效力，即所进行的治疗是否有效地改变了疾病的病程，测量起来更为困难。生物学效力的评估作为临床效力的一个替代终点，涵盖了很长的时间，而临床效力则不是最后的。因此，在，例如，六个月之后测量一个能够指征β-细胞再生的临床终点，可以对这一治疗方法的临床效力给出一个指征。

这些组合物可以被制备成试剂盒供一个或多个步骤使用。用于遗传治疗的试剂盒通常包括治疗性DNA构造物，可以是含有或不含有线粒体寻靶序列肽的裸露DNA、重组病毒载体、或者是与脂质载体形成的复合物。另外，可以将脂质载体制备于单独的容器中，用以与所提供的DNA形成复合物。试剂盒包括一个含有一种有效药剂的组合物，其中的药剂可以是浓缩物(包括冻干组合物)，可以在使用前将它们稀释，或者它们可以被制备成它们使用时的浓度，此时药水瓶中可以包括一个或多个剂量。方便地，在试剂盒中可以将单个剂量制备于无菌的药水瓶中以便内科医生可以直接使用药水瓶，其中药水瓶将含有所需数量和浓度的药剂。当药水瓶含有直接使用的制剂时，通常就不再含有用于该方法的其他药剂了。这种试剂盒可以附带有一个告示，其格式为管理药品和生物学制品生产、使用或者销售的政府部门所规定的，这一告示反映了管理供人施用的(药物)的生产、使用或者销售的部门的批准。

下面的实施例是说明性的，并不具有局限性。

实施例

材料及方法

除了另外注明的以外，下面的材料和方法被用于下面所述的实施例所报告的研究中。

动物：小鼠，FVB和CD株系，得自Taconic Farms，Inc.，Germantown，NY。所用的TGF-α转基因系MT-42从一个金属硫蛋白启动子表达高水平的TGF-α，它被描述于Jhappan等，细胞(Cell)，61：1137-1146(1990)。正常的Wistar和Zucker大鼠被允许正常地随意进食和饮水并在每一研究开始前一周让其适应新的环境。在诱导糖尿病的5至7天后静脉内施用新配制的链脲霉素，剂量为80毫克/公斤体重，将大鼠随机分组供随后的处理。将激素、TGF-α和大鼠胃泌激素配制于无菌的含有0.1％BSA的正常的盐水中。根据针对不同研究的预定的处理方案，每一只动物每日接受一次腹膜内注射，注射单一的TGF-α或者胃泌激素(4.0微克/公斤体重)或者是1∶1(质量比)的组合物(总共8.0微克/公斤)、或者是PBS，为期10天。

INSGAS转基因构造物  将一个含有大鼠胰岛素I基因的-370至+38位核苷的Pvull-Rsal片段(Cordell，B.G.等，细胞(Cell)，18：533-543(1979))连接到pGeml(Promega Corp.，Madison，WI)中。将一个含有人胃泌激素基因(编码前胃泌激素原肽前体)的1.5kb内含子1和2和外显子2和3的4.4kb的BamH1-EcoR1片段分离并亚克隆在pGeml(Promega)中的大鼠胰岛素I片段的下游。这一片段被描述于Wiborg，O.，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，81：1067-1069(1984)，以及Ito，R.等美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，81：4662-4666(1984)。将胰岛素启动子-前胃泌激素原INSGAS转基因构造物剪切为一个4.8kb的Xba1-EcoR1片段。

转基因小鼠的产生和性质确定  如上所制作的片段被如下制备以供微注射。将它用琼脂糖凝胶电泳进行分离、用氯化铯梯度进行纯化、用注射缓冲液(5mM NaCl；0.1mM EDTA；5mM Tris-HCI pH7.4)进行彻底的透析。来源于FVB近亲繁殖的小鼠(Taconic Farms，Inc.，如上)的处于单细胞阶段的受精卵母细胞被用标准的技术进行微注射。见Hogan.B.等，小鼠胚胎的操作：实验室手册(Manipulating themouse embryo：A laboratory manual)，Cold Spring Harbor，NY(1986)。然后根据Hogan等人的步骤将存活的胚胎移植到CD1(Charles River Laboratories，Inc.，Wilmington.MA)养母的输卵管中。转基因的创始鼠(founder mice)通过DNA印迹技术用从鼠个体的尾巴上分离的DNA，以及通过随机引物扩增用32 dCTP标记的人胃泌激素外显子2探针进行鉴定。用类似的方法对F1代和它们的同胞进行鉴定。

将含有来源于CD-1小鼠株系(Jhappan，如上)的MT-TGF-α转基因的纯合的MT-42小鼠与杂合的INSGAS小鼠杂交。在断奶之后，如先前所述的将后代放置在酸化的50mM ZnCl₂上以便诱导金属硫蛋白启动子(Jhappan，如上)。

RNA印迹杂交化验 在进行RNA印迹时，用Cathala等，DNA 2：329-335(1983)所描述的方法从组织中提取总RNA。将20微克的总RNA样品用1％琼脂糖变性凝胶分辨并转移到硝酸纤维上。将RNA印迹与用³²P标记的人胃泌激素的TGF-α RNA探针或外显子2杂交，后两者是不与小鼠内源性胃泌激素mRNA杂交的。

胃泌激素的肽放射免疫测定  将组织提取出来并进行胃泌激素免疫反应性测定，这根据前述的方法来进行，使用抗体2604，它在如Rehfeld，J.F.，Scand.J.Clin.Lab.Invest.30：361-368(1972)中所述的一个胃泌激素放射免疫测定中对具生物学活性的C末端酰胺化的胃泌激素具有特异性。在所有的测定中均使用酪氨酸单碘化的人胃泌激素17示踪物，用合成的人胃泌激素充当标准。

TGF-α的肽放射免疫测定  将组织在液氮中冰冻，用研钵和研杵将其研磨成粉末，然后根据Todaro，G.J.等，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，77：5258-5262(1980)中所述的方法用酸-乙醇进行提取。将提取物用水再生，用考马氏蓝燃料结合测定法(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)来确定蛋白质的浓度。在一个TGF-α放射免疫测定中对来源于胰脏的等分试样进行二重测定，测定其与1251 TGF-α对固相兔抗体的结合竞争，上述的兔抗体是针对大鼠TGF-α的C末端生成的，试剂盒来源于BioTope，Seattle，WA。

血糖  血糖是在过夜禁食之后或者在用葡萄糖氧化酶方法进行的IPGTT之后确定的。

组织胰岛素分析  在每一研究之后将动物处死并取出胰脏。在整个胰脏的分开的具有代表性的位置取出小的活组织并立即用液氮进行快速冷冻以供免疫组织化学、蛋白、以及胰岛素的测定之用。将快速冷冻后的胰脏样品(n＝5)快速解冻，在去离子水中进行超声断裂，取等分试样进行蛋白测定，用酸/乙醇对匀浆液进行提取，然后用RIA来确定胰岛素。

组织学分析  将胰脏取出、称重、在盒子中以类似的取向放置，在Bouin氏溶液中固定并用常规的步骤包埋于石蜡中。

组织的制备和免疫组织化学  将新鲜剪切的胰脏切开，除去脂肪和淋巴结，在Bouin氏固定液中固定，然后用石蜡进行包埋以供切片之用。根据标准的方法将常规的切片用苏木精和曙红染色。将来源于17周龄的MT-TGF-α(MT-42)转基因小鼠的胰脏组织进行进行确定胰岛素的免疫染色以检查TGF-α过度表达对胰岛发育的影响。用免疫过氧化物酶可染色的几内亚猪抗人胰岛素血清(Linco，Eureka，MO)来鉴定在经TGF-α诱导的化生小管中的胰岛素阳性细胞，用一只预先经过免疫的几内亚猪的血清作为对照。在5μ的石蜡切片上，使用一个单克隆的兔抗胃泌激素抗体，用Sternberger的过氧化物酶/抗过氧化物酶方法进行免疫组织化学研究。见Sternberger，L.A.，免疫细胞化学(Immunocytochemistry)，第二版(1979)NY：Wiley.104-170。

计点(Point-Counting)形态测定  胰岛、管道、或者间质细胞的相对体积使用在Weibel，E.R.，Lab Investig.，12：131-155(1963)中所述的计点方法进行量化。在400×的放大倍数下，从切片一个角落的一个随机的点开始，用一个25点的目镜格子对每个新的视野进行记分。通过使用载物台微米计的记号来没有偏见但却全面地选择视野。将被血管、脂肪、管道、淋巴结、或者小叶间空间中途截取的空间减去以得出胰脏的总面积。在每一区域(block)计数了用载物台微米计系统地进行选择的108个视野的至少5000个点，相对的胰岛体积被计算为在胰岛组织中被截取的数目除以在胰脏组织中被截取的数目。绝对的胰岛质量或者胰岛被计算为相对的胰岛体积乘以胰脏的重量。见Lee，H.C.等，内分泌学(Endocrinology)，124：1571-1575(1989)。

统计学分析 使用Student氏针对不成对数据的t检测法对不同方法之间的差异进行显著差异的比较。

实施例1

TGF转基因胰脏中胰岛素生产的测定

免疫过氧化物酶染色显示在TGF-α转基因胰脏的化生管中存在数目众多的胰岛素染色细胞(图1A)，而在非转基因的管中胰岛素染色细胞则实质上不存在(少于6.1％)。在400×的最终放大倍数下可记录到每只动物有至少600个小导管细胞，而观察到的胰岛素阳性细胞在TGF-α转基因小鼠的化生管中的几率则为6.0±0.9％(n＝5)。偶然有导管细胞胰岛素染色的强度与毗邻的胰岛的染色强度一样，但是大多数的染色强度均较弱(图1B)。导管细胞胰岛素染色水平的低下与在发育中胰脏的导管中被报道的分化初期细胞的类似。Pictet，R.和W.J.Rutter，胚胎内分泌胰腺的发育(Development of the embryonicendocrine pancreas)，内分泌学(Endocrinology)，生理学手册(Handbook of Physiology)，R.0.Greep和E.B.Astwood编辑(1972)，美国生理学协会(American Physiological Society)：Washington，D.C.25-66；以及Alpert，S.等，细胞(Cell)，53：295-308(1988)。

然而，尽管在化生管中的胰岛素阳性细胞增多，TGF-α转基因小鼠的胰岛质量并没有增加。用计点形态测定量化的胰岛质量在TGF-α转基因胰脏中为2.14mg±0.84(平均±标准误差，n＝5)，而在非转基因的同窝出生仔畜中为1.93mg±0.46(n＝6)。

因此，单纯的TGF-α的过度表达并不影响这些分化初期的导管细胞转变为完全分化的胰岛。这意味着胰岛的分化需要其他的在TGF-α转基因小鼠的成熟胰脏中所缺少的因子。由于分化初期胰岛前体细胞的分化是在胚胎发育的晚期发生的，调控这一转化的因子很可能在这一阶段在胰岛中被表达。在发育中胰岛中被表达的因子中有胃肠肽—胃泌激素。

实施例2

胰脏胃泌激素从INSGAS转基因的表达

为了检查胃泌激素在调控胰岛分化中的可能作用，创造了一种表达嵌合的胰岛素启动子-胃泌激素(INSGAS)转基因的转基因小鼠，在上述的转基因中，胰岛素启动子指导胃泌激素转基因(图2A)的胰脏特异性的表达。与胃泌激素基因不同的是，胰岛素基因的表达在出生后并没有被关掉。这样，INSGAS转基因导致胃泌激素在成熟的胰脏中持续地进行表达。

INSGAS转基因包括大鼠胰岛素I基因位于5’端的370bp的DNA以及第一个非编码的外显子。Cordell，B.等，细胞(Cell)18：533-543(1979)。它被连接到含有人胃泌激素基因(它编码前胃泌激素原肽前体)1.5kb的内含子1和外显子2和3的BamH1EcoRl片段。Wiborg，0.等，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，81：1067-1069(1984)y；以及Ito等，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，81：4662-4666(1984)。分离一段4.8kb的INSGAS片段并将其微注射到近亲繁殖的FVB，即单细胞小鼠胚胎中。Hogan，B.等，小鼠胚胎的操作：实验室手册(Manipulating themouse embryo：A laboratory manual)，(1986)NY：Cold SpringHarbor。

转基因和非转基因小鼠的胰脏和胃提取物中的胃泌激素的免疫反应性是通过放射免疫测定方法用抗血清2604进行测定的(Rehfeld，J.等，Scand.J.Clin.Lab.Invest.，30：361-368(1972))，上述的抗血清2604对胃泌激素的具有生物学活性的酰胺化C末端具有特异性。

根据用一种胃泌激素单克隆抗体对胰脏组织进行的免疫染色，可观察到INSGAS转基因发生β细胞特异性的胃泌激素表达。

将从八周龄的INSGAS转基因小鼠的不同组织分离的RNA的RNA印迹与人胃泌激素外显子2探针进行杂交。在胰脏中观察到高水平的胃泌激素转基因mRNA，但在任何其他的组织中则没有发现。这一探针对人胃泌激素基因具有特异性；在INSGAS的窦RNA没有发现杂交，而非转基因的FVB小鼠则表达高水平的鼠胃泌激素mRNA。来源于INSGAS转基因小鼠的胰脏提取物的放射免疫测定显示了高水平的胃泌激素免疫反应性，该水平超出了从内源性鼠基因(图2B)表达的胃中庭(gastric atrium)中胃泌激素的含量。在非转基因对照小鼠(图2B)的胰脏提取物中没有检测到胃泌激素的免疫反应性。胃泌激素的放射免疫测定对羧基端酰胺化的前体具特异性，显示胃泌激素肽前体在翻译后被有效地加工为具生物学活性的肽。对一种胃泌激素单克隆抗体的免疫组织化学测定显示了胃泌激素的胰脏β胰岛细胞特异性表达。

虽然INSGAS转基因小鼠在出生后的胰脏中有高水平的表达(图2B)，但是INSGAS转基因小鼠的胰脏组织学与对照是相同的。由计点形态测定法(Weibel，E.R.，Lab Investig.12：131-155(1963))量化的胰岛质量与5-6周龄的INSGAS小鼠(1.78±0.21mg，n＝11)以及相同年龄的非转基因对照(1.74±0.18mg，n＝11)是相同的。因此，单纯的胃泌激素在出生后胰脏中的连续表达并不刺激胰岛细胞的生长。

实施例3

TGF-α和TGF-α/INSGAS胰脏的组织学检查

胃泌激素对胰岛生长的刺激可能需要其他生长因子的刺激来创造一个细胞的应答性的种群。因此，对在TGF-α转基因小鼠中胃泌激素刺激的影响进行了研究，上述的小鼠具有化生管，这些化生管含有与分化初期的胰岛前体类似的胰岛素表达细胞。为了评估胃泌激素和TGF-α的相互作用，饲养了三组具有相同FVB/CDI株系遗传背景的小鼠：非转基因对照、TGF-α单转基因以及INSGAS/TGF-α双转基因。所有的三组小鼠在三周龄时都被放置于50mM的ZnCl₂上。在17周龄时，将动物处死并将胰脏取出以供组织学评估之用。取自TGF-α以及INSGAS/TGF-α小鼠的胰脏总体的形态学外观是类似的：具有弹性、坚固并且紧密，不同于柔软弥散的对照胰脏。当用RNA印迹分析(数据没有给出)和放射免疫测定进行测量时，TGF-α在TGF-α和TGF-α/INSGAS两组中的表达是等同的。胰脏TGF-α免疫反应活性肽的水平在TGF-α和INSGAS/TGF-α小鼠中分别为12.2±1以及18.9±8纳克/毫克蛋白(平均±标准误差)。

制作了来源于所研究的三组小鼠(A：INSGAS/TGF-α；B：FVB/CD1对照；以及C：TGF-α)胰脏的经苏木精染色的石蜡切片的光学显微照相。INSGAS/TGF-α胰脏的一些区域管道复合物增加，间隙细胞质也稍有增加；图3A所示的视野具有在五只动物中观察到的最为异常的形态学；胰脏的大部分与对照是不能区别的(图3B)。在对照中，TGF-α胰脏的视野(图3C)是典型的，它显示了间隙细胞质和纤维症，并结合有如Jhappan等人(见上)所述的红润管化生(florid ductularmetaplasia)。

胰脏胃泌激素与TGF-α协同地相互作用以增加胰岛的质量并抑制由TGF-α过度表达所诱导的管化生。让纯合的MT-TGF-α(MT-42)小鼠与杂合的INSGAS小鼠交配得到的后代或者是TGF-α单转基因，或者是含有INSGAS和TGF-α两个转基因(INSGAS/TGF-α)的双转基因。由于INSGAS是FVB株系而TGF-α是CD1株系，所以让TGF-α纯合子和CD1对照(CON)都与FVB交配以使所有的三组小鼠都具有FVB/CD1株系背景。从第三周开始用50mM ZnCl₂对小鼠进行处理直到在17周龄将其处死。取出胰脏，称重，以类似的取向放置于盒子内，用Bouin氏溶液固定后包埋于石蜡中。取用每只动物的一个随机的切片，用计点形态测定法(Weibel，E.R.，Lab Investig.，12：131-155(1963))来量化导管和胰岛的相对体积。在170×的放大倍数下，组织上的至少2000个点被计数为一个50点格子的截断；计数覆盖整个切片，但不重复。导管或者胰岛的质量是通过将相对体积与动物胰脏的重量相乘来计算的。为了使不同的平均体重标准化，将质量表达为微克/克体重。所示的结果是每组5-6只动物的平均值和标准误差，如Student氏t检验(p<0.05)所确定的。

胃泌激素从INSGAS转基因的表达减少了由TGF-α过度表达所引起的管化生。在第17周，INSGAS/TGF-α小鼠的胰脏组织学(图3A)与对照胰脏(图3B)的相似程度比TGF-α小鼠的(图3C)要高。

这通过对TGF-α和INSGAS/TGF-α转基因小鼠以及FVB/CD1对照中的胰脏导管质量用计点形态测定法(图4A)进行量化而得到证实。在INSGAS胰脏中胃泌激素和TGF-α的共表达同时也显著地增加了胰岛相对于对照(图4D)的质量，然而胰岛的质量在仅有单一的TGF-α或者胃泌激素表达时并没有增加。三组小鼠的血糖浓度并没有显著的差别。

实施例4

TGF-α和胃泌激素对正常小鼠的胰脏胰岛素含量的影响

这一实验被设计用于研究对经TGF-α、胃泌激素、或者TGF-α与胃泌激素相结合处理的非糖尿病动物，相比于对照动物(未经处理)，的胰脏胰岛素含量的影响。将正常的Wistar大鼠分组(n＝5)用于以下四组处理。

组1：TGF-α：将重组人TGF-α再生于无菌的含有0.1％ BSA的盐水，用0.8微克/天的剂量进行腹膜内施用，为期10天。

组2：胃泌激素：将合成的大鼠胃泌激素I溶解在非常稀的氢氧化铵中并再生于无菌的含有0.1％ BSA的盐水中，用0.8微克/天的剂量进行腹膜内施用，为期10天。

组3TGF-α+胃泌激素：将上述制剂的组合以上述的剂量进行腹膜内施用，为期10天。

组4仅用赋形剂对对照动物进行腹膜内施用，为期10天。

在研究阶段(10天)的终了，将所有的动物处死并如下取出胰脏样品：在每只大鼠胰脏的分开的具有代表性的位置上取出五个胰脏的活组织切片检查标本(1-2毫克)并立即速冻于液氮中以供胰岛素含量分析之用。为了胰脏胰岛素含量分析，将速冻的胰脏样品迅速解冻，在蒸馏水中超声断裂并在进行胰岛素放射免疫测定(Green等，(1983)糖尿病(Diabetes)32：685-690)之前取出等分样品用于蛋白质确定和酸/乙醇提取。根据蛋白含量校正胰脏胰岛素的含量并将其表达为微克胰岛素/毫克胰脏蛋白。所有的值都被计算为平均值±SEM，统计学显著性是用Student氏2-样t-检验评估的。

                     表1

用TGF-α和胃泌激素对正常的大鼠进行处理

                        处理胰脏胰岛素含量

                  (微克胰岛素/毫克蛋白)

对照                     20.6±6.0

TGF-α                    30.4±7.4*

胃泌激素                 51.4±14.0**

TGF-α+胃泌激素           60.6±8.7***

    *TGF-α与对照相比，p＝0.34；

   **胃泌激素与对照相比，p＝0.11；

***TGF-α和胃泌激素的组合物与对照相比，p＝0.007.

如上面的表1所示，在经过TGF-α+胃泌激素处理的动物中胰脏胰岛素的含量相比对照动物显著增加(p＝0.007)；比起对照动物，其胰脏胰岛素含量增加大约三倍。这些数据支持了这样一个假说，即：TGF-α和胃泌激素的结合确实增加了功能性胰岛β-细胞的体积。这一增加反映了β-细胞增生(数目增加)，而并非β-细胞肥大(个体β-细胞尺寸的增加)，的总体状况。

实施例5

TGF-α和胃泌激素的结合对糖尿病动物胰脏胰岛素含量的影响

第二个实验被设计用于确定TGF-α和胃泌激素的组合是否可以增加糖尿病动物(经链脲霉素(STZ)处理)中胰脏胰岛素的含量，使其达到可以与正常(未经STZ处理的)动物相比较的水平。

给正常的Wistar大鼠单次静脉内注射剂量为80毫克/公斤体重的STZ。这一剂量的STZ是用以确保让研究动物患上糖尿病但又保留有功能性的、但是减小的β-细胞团块。在施用前将STZ迅速溶解于冰冷的10mM柠檬酸缓冲液中。每日对动物进行监控；持续性的糖尿病通过糖尿来表征，并通过非禁食血糖测定来证实。在糖尿病诱导一周后，将大鼠随机分为如下两组(n＝6)。

组1：TGF-α+胃泌激素：给STZ糖尿病大鼠单次腹膜内注射重组人TGF-α和合成的大鼠胃泌激素1的组合物；两种制剂的施用剂量均为0.8微克/天，为期10天。

组2：对照组：仅给STZ糖尿病大鼠腹膜内注射单纯的赋形物，为期10天。

在研究阶段的终了，将所有的动物处死并将胰脏样品取出，如实施例4中所述进行分析，其结果示于表2。

                            表2

用TGF-α和胃泌激素对链脲霉素大鼠进行处理

处理                         胰脏胰岛素含量

                             (微克胰岛素/毫克蛋白)

对照(仅用STZ)                 6.06±2.1

STZ加TGF-α+胃泌激素           26.7±8.9

STZ对糖尿病的诱导是成功的并产生了适度的但却持续的高血糖症。并没有追求完全的(insulinopenic胰岛素分泌减少的)胰岛素缺失(insulinopaenia)，以便确保研究动物保持有一个功能性的、但减小的β-细胞团块。

如上面的表2中所示，对照的经链脲霉素处理的动物的胰脏胰岛素含量还不到正常大鼠含量(20.6±6.0微克胰岛素/毫克蛋白，见上面的表1)的三分之一，这是由STZ对β-细胞的破坏造成的。在经TGF-α和胃泌激素结合处理的STZ动物中，胰脏胰岛素的含量是仅接受STZ的动物的四倍以上，而且在统计上与正常大鼠的相同。

糖尿病这种疾病的根本性生理学缺陷是β-细胞的不足，其原因在于自身免疫进程导致β-细胞损坏或者是循环中高水平的葡萄糖所造成的慢性刺激导致β-细胞分裂潜能竭尽。后者最终导致β-细胞更新和/或更换的进程在某种程度即告妥协，造成β-细胞总体上的损失并伴随着胰脏中胰岛素含量的减少。上述的结果显示了TGF-α和胃泌激素相结合可以被用于治疗糖尿病，通过刺激成熟β-细胞的产生来使胰脏中胰岛素的含量恢复到非糖尿病的水平。

实施例6

TGF-α和胃泌激素对经STZ诱导的糖尿病动物中IPGTT的影响

给两组经STZ诱导的糖尿病Wistar大鼠(平均体重103克，每组6只)每天分别腹膜内注射TGF-α和胃泌激素的组合或者PBS，为期10天。在第0、6、10天测定所有大鼠的禁食血糖水平。为了确定胰岛素已经分泌并且是功能性的，进行了IPGTT试验。在第10天，在经过过夜禁食之后，进行了腹膜内葡萄糖耐量试验(intraperitonealglucose tolerance test，IPGTT)。从尾静脉获取血样，分别在腹膜内注射葡萄糖(剂量为2克/公斤体重)之前、以及注射的30、60、和120分钟之后进行。如上进行血糖确定。两个研究组在时间0的血糖水平是类似的，但是在腹膜内注射葡萄糖的30、60、以及120分钟之后经TGF-α和胃泌激素处理的大鼠的血糖值比对照大鼠的减少了50％(见图5)。

实施例7

TGF-α和胃泌激素对糖尿病潜伏动物体重增加和胰岛素含量的影响

所获得的Zucker大鼠有30天龄，大约离肥胖发育还有10-15天。在如下的研究中，除了糖尿病潜伏Zucker大鼠(遗传型fa/fa，肥胖和糖尿病常染色体隐性突变)以外，同时也包括了瘦的非糖尿病同窝出生子畜(遗传型+/+)。每天通过确定体重和血糖来监控大鼠的肥胖和糖尿病的发展情况。糖尿病在Zucker大鼠中的发作通常开始于第45-50天并可以通过血糖水平的显著提高(与年龄相当的瘦鼠对照的水平相比较)来确证。

研究包括了如表3中所述的五组(每组5只)大鼠。在第0-10天，用TGF-α和胃泌激素相结合，或者PBS分别对组1和组2(瘦的，非糖尿病的)进行处理。组3、4、和5包括肥胖的、早期糖尿病的Zucker大鼠，其遗传型为fa/fa。组3在糖尿病发作前进行15天(第-15至第0天)的组合预处理并在发作之后再处理10天(第0-10天)。组4在糖尿病发作后用TGF-α和胃泌激素组合处理10天，而组5则在同一时间段用PBS进行处理。在研究的终了处死大鼠并取出胰脏。在整个胰脏的分开的具有代表性的位置取出小的活组织用于上述的蛋白和胰岛素确定。

在研究的各个组中，经过预处理、仅经过处理或者经盐水处理(表3中的组3、4、和5)的肥胖的糖尿病Zucker大鼠的体重并没有显著的区别。有趣的是，即使延长TGF-α和胃泌激素的处理的时间(25天，组3)，体重的增加并不受影响。在误差范围内，所有组别的体重增加是相同的。

将TGF-α+胃泌激素处理对肥胖Zucker大鼠禁食血糖水平的影响与相应的PBS对照进行了比较。首先禁食血糖水平在第15天时显著提高(4.0±0.6相比5.0±0.2)，将这一时间点选定为为期10天的TGF-α+胃泌激素处理或者PBS对照的起始点。TGF-α+胃泌激素处里或者PBS处理并没有显著改变禁食血糖的水平。瘦鼠的禁食血糖值比肥胖大鼠(不管是经生长因子还是经PBS处理)的要低。

表3

 

组别	基因型	症状	预处理±处理(天)	PBS对照	体重增加量(％±标准误差)
						1	+/+	瘦，无糖尿病	无	有	117±2.1
2	+/+	瘦，无糖尿病	0+10	无	119±1.9
						3	fa/fa	肥胖，早期糖尿病	-15+10	无	202±15
4	fa/fa	肥胖，早期糖尿病	0+10	无	119±1.0
						5	fa/fa	肥胖，早期糖尿病	无	有	129±1.3

用TGF-α和胃泌激素对2型糖尿病Zucker大鼠模型进行处理的结果显示，处理组和对照组的血糖水平并没有显著的区别，这可能反映了在延长禁食(18小时)之后出现短暂的低血糖症效应。免疫组织化学研究揭示了在经TGF-α和胃泌激素处理的动物中，胰岛素包含细胞的单个焦点的数目比起对照动物有显著的增加。这些发现证明在经过TGF-α和胃泌激素处理之后，在成熟大鼠的胰脏中单个的β-细胞增加了。有趣的是，这种单个的β-细胞焦点在成年的(未经刺激的)大鼠胰脏中通常并没有被观察到。这些发现支持了TGF-α和胃泌激素在1型和2型糖尿病中的治疗作用，因为治疗是同时针对β-细胞的再生和复制的。

本发明部分基于一些证明在TGF-α诱导的化生管中存在大量胰岛素染色细胞的研究。外分泌腺和内分泌腺基因在化生管细胞中的低水平表达与在胎儿胰脏发育早期所见到的分化初期导管细胞的情形是类似的，这些分化初期胰岛素表达细胞的增殖和分化导致胰岛的形成(再生)。从组织学的角度，这是在胰岛从胰管中萌发出来(胰岛细胞增殖症)的时候出现的。在MT-42TGF-α转基因小鼠中，管化生在刚出生后的阶段并没有观察到，它只是在四周龄才发生。这显示TGF-α的过度表达诱导了胰岛素在管上皮细胞内的表达，而不是延长了在胎儿胰管中发现的胰岛前体的持续。虽然化生管含有大量的胰岛素阳性细胞，但是在TGF-α转基因小鼠中胰岛质量相比对照并没有增加。上面所报告的研究证明了在哺乳动物成熟胰脏的管上皮细胞中，完整的胰岛细胞再生在体内被胃泌激素/缩胆囊素受体配体(如胃泌激素)以及/或者EGF受体配体(如TGF-α)的刺激所重新激活。对TGF-α和胃泌激素在胰脏中的转基因过度表达进行了研究报道，这些研究阐明了胰脏胃泌激素表达在胰岛发育中的作用并显示TGF-α和胃泌激素在调控胰岛发育的过程中都各自发挥着作用。因此，残余的多能性胰管细胞再生性地分化为成熟的胰岛素分泌细胞是一种治疗糖尿病的可行的方法，通过治疗性地结合施用这些因子或者组合物以便给它们在胰脏中的原位表达提供条件。

本发明并不受此处所述的具体实施例的限制。通过参考上述的说明和附图而显而易见的各种修改都归属于本发明的范围之内。

在本文中引用了各种不同的文献，这些文献中所揭露的全部内容都作为参照结合于本发明之中。

Claims (10)

1.一种用于治疗糖尿病的组合物，该组合物由胃泌激素和制药上可接受的载体或赋形剂组成，其中胃泌激素的量足以增加个体中的胰脏胰岛素含量。

2.根据权利要求1的组合物，其中所述胃泌激素选自胃泌激素34、胃泌激素17和胃泌激素8。

3.根据权利要求1的组合物，其中胃泌激素的量与载体或赋型剂相比使个体中的胰脏胰岛素增加两倍以上。

4.根据权利要求2的组合物，其中胃泌激素的量与载体或赋型剂相比使个体中的胰脏胰岛素增加两倍以上。

5.根据权利要求1-4任一项的组合物，其中胃泌激素的量在个体中每千克体重提供20至500微克的剂量范围。

6.由胃泌激素以及药学上可接受的载体或赋形剂构成的组合物用于制备治疗糖尿病的药物的用途。

7.权利要求6的用途，其中所述胃泌激素选自胃泌激素34、胃泌激素17和胃泌激素8。

8.根据权利要求6的用途，其中胃泌激素的量在个体中每千克体重提供20至500微克的剂量范围。

9.根据权利要求7的用途，其中胃泌激素的量在个体中每千克体重提供20至500微克的剂量范围。

10.根据权利要求6-9任一项的用途，其中所述的糖尿病是2型糖尿病。

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