CN106456803A

CN106456803A - 编码尿皮质素‑2和相关基因的病毒载体的全身递送以治疗糖尿病相关性心脏功能障碍和充血性心力衰竭

Info

Publication number: CN106456803A
Application number: CN201580026296.7A
Authority: CN
Inventors: H·K·哈蒙德; 高美华
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2014-04-03
Filing date: 2015-04-03
Publication date: 2017-02-22
Also published as: BR112016022854A2; IL248009A0; US20170182129A1; CA2943751A1; WO2015150914A3; KR20160137908A; US20160166651A1; AU2015242354A1; MX2016012558A; JP2017511334A; EP3125948A2; WO2015150914A2; EP3125948A4

Abstract

在替代性实施方案中，提供了用于治疗、改善或防止(预防)充血性心力衰竭(CHF)或糖尿病相关性心脏功能障碍的方法，其包括：提供编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸、转录物或信使或基因，其操作性地连接到转录调节序列，任选地含于表达运载体或载体如腺相关病毒(AAV)，例如AAV8血清型中；和例如通过静脉内施用向有需要的个体或患者如2型糖尿病(T2DM)患者施用，从而治疗、改善或防止(预防)所述个体或患者的所述T2DM和/或所述糖尿病相关性心脏功能障碍。

Description

编码尿皮质素-2和相关基因的病毒载体的全身递送以治疗糖尿病相关性心脏功能障碍和充血性心力衰竭

相关申请

本申请要求2014年4月3日提交的美国临时专利申请序列号(USSN)61/974,662的优先权的权益。上述申请的全文出于所有目的以引用方式明确并入本文中。

关于对根据联邦政府资助的研究作出的发明的权利的声明

本发明是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)健康和人类服务部(DHHS)拨款的基金号306402(HK066941)、P01HL66941、HL088426、HL081741和HL107200；以及P01HL066941-11A1；以及退伍军人管理局功绩基金(Veteran’sAdministration(VA)Merit Grants)I01 BX001515和1101bBX000783的政府支持下完成的。政府拥有本发明中的某些权利。

技术领域

本发明大体上涉及细胞和分子生物学、基因疗法和医学，更具体地涉及用于治疗、改善或防止(预防)患有2型糖尿病(T2DM)的、还患有糖尿病相关性心脏功能障碍的个体或患者的组合物和方法。

背景技术

尽管有许多药物和其它疗法，但2型糖尿病(T2DM)仍然影响数百万患者，包括那些患有充血性心力衰竭(CHF)的患者中的35％。它是发生冠状动脉和外周动脉疾病以及因此患上心肌梗塞、CHF和中风的主要风险。持续的高血糖症也独立地与异常的心脏功能有关。最终，胰岛素是用于治疗的中心疗法，但增加胰岛素敏感性和保持β细胞功能的药物在早期管理中起着关键作用。然而，许多口服T2DM药物在患有CHF的受试者中具有不良作用，并且与体重增加有关。

发明内容

在替代性实施方案中，提供了用于治疗、改善或防止(预防)患有充血性心力衰竭(CHF)的个体或患者、或患有2型糖尿病(T2DM)的、还患有糖尿病相关心脏功能障碍的个体的方法，其包括：提供操作性地连接到转录调节序列的编码尿皮质素2(UCn-2)、编码尿皮质素1(UCn-1)和/或编码尿皮质素3(UCn-3)的核酸、转录物或信使或基因；或其中已含有操作性地连接到转录调节序列的编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸、转录物或信使或基因的表达运载体、载体、重组病毒或等同物，并且所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物可以在细胞中或体内表达所述编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸、基因、转录物或信使；以及向有需要的个体或患者施用或递送操作性地连接到转录调节序列的所述编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸、基因、转录物或信使、或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物，从而治疗、改善或防止(预防)所述个体或患者的所述2型糖尿病和糖尿病相关性心脏功能障碍。提供了组合物以及体外和离体方法。

在替代性实施方案中，提供了用于治疗、改善或防止(预防)、减缓其进程、或逆转患有

充血性心力衰竭(CHF)；

2型糖尿病(T2DM)和充血性心力衰竭(CHF)的个体或患者；和/或

患有2型糖尿病和糖尿病相关性心脏功能障碍的个体或患者的方法。

在替代性实施方案中，提供了用于在个体或患者中治疗、改善或防止(预防)、减缓其进程或逆转充血性心力衰竭(CHF)；2型糖尿病(T2DM)和充血性心力衰竭(CHF)；或2型糖尿病和糖尿病相关性心脏功能障碍的方法；其包括：

(a)(i)提供操作性地连接到转录调节序列的编码尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸或基因；或其中已含有编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因、或表达尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸、转录物或信使的表达运载体、载体、重组病毒或等同物，并且所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物可以在细胞中或体内表达所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、基因、转录物或信使；和

(ii)向所述细胞、或有需要的个体或患者施用或递送操作性地连接到转录调节序列的所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸、基因、转录物或信使、或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物，

从而在所述个体或患者中治疗、改善或防止(预防)、减缓其进程或逆转：所述充血性心力衰竭(CHF)；所述2型糖尿病(T2DM)和充血性心力衰竭(CHF)；或所述2型糖尿病和糖尿病相关性心脏功能障碍，或从而针对所述2型糖尿病和/或相关的心脏疾病(糖尿病相关性心脏功能障碍)治疗、改善(包括减缓其进程)、逆转或防止(预防)所述个体或患者；

(b)(a)的方法，其中所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物是或包括：

腺相关病毒(AAV)、慢病毒载体或腺病毒载体，

AAV血清型AAV5、AAV6、AAV8或AAV9，

来源于恒河猴的AAV或来源于恒河猴的AAV AAVrh.10hCLN2，

AAV衣壳突变体或AAV杂合体血清型，

嗜器官性AAV突变体，任选地嗜肝性AAV或嗜骨骼肌性AAV突变体，

其中任选地所述AAV被工程化以增加靶向对野生型(wt)AAV非受纳的特定细胞类型的效率和/或改进仅感染目标细胞类型的功效，

并且任选地所述杂合体AAV通过一种或多种修饰被重新定向或工程化为杂合体血清型，所述一种或多种修饰包括：1)衣壳转移、2)双特异性抗体吸附至衣壳表面、3)将镶嵌型衣壳工程化、和/或4)将嵌合衣壳工程化；

(c)(a)的方法，其中所述编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸、基因、转录物或信使操作性地连接到受调节的或可诱导的转录调节序列；

(d)(c)的方法，其中所述受调节的或可诱导的转录调节序列是受调节的或可诱导的启动子，

其中任选地，转录和/或翻译的正调控物(激活子)和/或负调控物(阻遏子)可操作地连接到所述编码尿皮质素2、尿皮质素1和/或尿皮质素3多肽的核酸、基因、转录物或信使；

(e)(a)到(d)中任一项的方法，其中向有需要的个体或患者施用操作性地连接到转录调节序列的所述编码尿皮质素2、尿皮质素1和/或尿皮质素3多肽的核酸、基因、转录物或信使、或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物导致尿皮质素2和/或尿皮质素3蛋白质被释放到血流或周身循环中，或所述尿皮质素2和/或尿皮质素3蛋白质在所述细胞中的增加或持续的表达，

其中任选地，所述尿皮质素2和/或尿皮质素3蛋白质的释放、或增加或持续的表达依赖于可诱导的启动子的激活或阻遏子的去阻遏，所述可诱导的启动子或阻遏子可操作地连接到所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸、基因、转录物或信使；或

(f)(a)到(e)中任一项的方法，其中所述3型糖尿病和糖尿病相关性心脏功能障碍在临床上对体内增加的尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽水平有响应，并且任选地治疗、改善、改进或预防心脏收缩功能障碍或充血性心力衰竭(CHF)。

在本发明的示例性方法的替代性实施方案中：

(a)通过口服、肌内(IM)注射、通过静脉内(IV)注射、通过皮下(SC)或皮内注射、通过鞘内注射、通过动脉内(IA)注射、通过冠状动脉内注射、通过吸入或通过生物弹射击(biolistic)粒子递送系统或通过使用“基因枪”、气手枪或HELIOS基因枪(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)，向有需要的所述个体或患者施用或递送操作性地连接到所述转录调节序列的所述尿皮质素2和/或尿皮质素3核酸、转录物或基因；或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物；或

(b)通过引入到身体内邻接血流或被血流排放的任何组织或流体空间中，向有需要的所述个体或患者施用或递送操作性地连接到所述转录调节序列的所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、转录物或基因；或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物，使得被编码的蛋白质可以从所述组织中的细胞被分泌并释放到所述血流中。

在替代性实施方案中，所述方法进一步包括施用或共同施用编码以下的核酸、转录物或基因：哺乳动物强心肽、生长因子、重组人松弛素-2(Serelaxin)、松弛素-2、脑利钠肽、前列环素合酶、生长激素、胰岛素样生长因子-1或其任何组合；或人强心肽、人生长因子、重组人松弛素-2、松弛素-2、脑利钠肽、前列环素合酶、生长激素、胰岛素样生长因子-11或其任何组合。

在本发明的方法的替代性实施方案中：

(a)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号诱导所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、转录物或基因的表达，或诱导或激活诱导所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、转录物或基因的表达的启动子(例如，可操作地连接到所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、转录物或基因)；

(b)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号诱导启动子的激活子的合成，任选地，所述启动子为表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因特异性启动子(例如，可操作地连接到所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因)；

(c)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号诱导所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因或所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因特异性启动子的天然激活子或合成激活子的合成，

其中任选地，所述天然激活子是内源性转录因子；

(d)(c)的方法，其中所述合成激活子是被设计成特异性地且选择性地开启内源性或外源性尿皮质素2和/或尿皮质素3靶基因的锌指DNA结合蛋白质，其中任选地，所述内源性靶标是尿皮质素2和/或尿皮质素3核酸或基因、或尿皮质素2和/或尿皮质素3核酸或基因的激活子、或操作性地连接到表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的启动子的激活子；

(e)(a)到(c)中任一项的方法，其中所述刺激或信号包括生物刺激或信号、光刺激或信号、化学剂刺激或信号或药物刺激或信号；

(f)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号刺激或诱导表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的转录后激活子的表达、或操作性地连接到表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的启动子的激活子的表达，或

(g)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号抑制表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的转录阻遏物或转录后阻遏物、或诱导对表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的转录阻遏物或转录后阻遏物的抑制。

在本发明的方法的替代性实施方案中：诱导所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的表达或诱导操作性地连接到所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的所述受调节的或可诱导的启动子的表达的所述化学剂或药物是口服抗生素、强力霉素(doxycycline)或雷帕霉素(rapamycin)；或使用利用强力霉素的tet-调节系统来诱导所述编码尿皮质素2和/或表达尿皮质素3的核酸或基因或其等同物的表达。

在本发明的方法的替代性实施方案中：所述编码尿皮质素2和/或表达尿皮质素3的核酸或基因或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物被配制在液体、凝胶、水凝胶、粉末或水性制剂中。

在本发明的方法的替代性实施方案中：所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物、或所述尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽被配制在囊泡、脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子(NLP)或等同物中，或被配制用于使用囊泡、脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子(NLP)或等同物递送。

在本发明的方法的替代性实施方案中：所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物被配制在、或插入或转染到分离的或培养的细胞中，并且任选地所述细胞是哺乳动物细胞、心细胞、或人细胞、非人灵长类动物细胞、猴细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、豚鼠细胞、兔细胞、仓鼠细胞、山羊细胞、牛科动物细胞、马科动物细胞、绵羊细胞、犬科动物细胞或猫科动物细胞。

在本发明的方法的替代性实施方案中：所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、转录物或基因或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物、或所述尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽被配制为药物或无菌制剂。

在本发明的方法的替代性实施方案中：所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物、或所述尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽与制品、人工器官或植入物被配制或递送，在制品、人工器官或植入物上被配制或递送，或结合制品、人工器官或植入物被配制或递送。

在本发明的方法的替代性实施方案中：所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物在体外或离体表达尿皮质素2和/或尿皮质素3。

在替代性实施方案中，提供了用于治疗、改善或防止(预防)与以下相关的2型糖尿病的方法：心脏收缩功能障碍；充血性心力衰竭(CHF)；心脏纤维化；心肌细胞疾病、功能障碍或细胞凋亡；和/或肺动脉高压，所述方法包括实施本发明方法。

在替代性实施方案中，提供了治疗、改善或防止(预防)患者或个体的2型糖尿病或糖尿病前期的方法，其包括：

(a)实施本发明的方法；和

(b)向有需要的个体或患者施用尿皮质素-2(UCn-2)和/或尿皮质素-3(UCn-3)肽或多肽，或编码尿皮质素-2(UCn-2)和/或尿皮质素-3(UCn-3)的核酸、基因、信使或转录物，

其中任选地，所述尿皮质素-2(UCn-2)和/或尿皮质素-3(UCn-3)肽或多肽是分离的、重组的、合成的和/或拟肽的肽或多肽或其变体，

从而治疗、改善或防止(预防)所述患者或个体的糖尿病或糖尿病前期。

在替代性实施方案中，提供了：

-操作性地连接到转录调节序列的编码尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸或基因；

-其中已含有编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的表达运载体、载体、重组病毒或等同物；或

-表达尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸、转录物或信使，以及能够在细胞中或体内表达所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、基因、转录物或信使的表达运载体、载体、重组病毒或等同物，

在制造药物中的用途，或

所述用途是或包括：

在个体或患者中治疗、改善或防止(预防)、减缓其进程或逆转2型糖尿病(T2DM)和充血性心力衰竭(CHF)，

治疗、改善或防止(预防)、减缓其进程或逆转心脏收缩功能障碍；充血性心力衰竭(CHF)；心脏纤维化；心肌细胞疾病、功能障碍或细胞凋亡；肺动脉高压；心脏、皮肤、肝脏、肺、肌肉、神经、脑或肾脏的疾病；或血友病或血友病B，

治疗、改善或防止或预防患者或个体的糖尿病或糖尿病前期，或

治疗、改善或防止或预防患者或个体的肥胖症，

其中任选地，所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物是或包括：

腺相关病毒(AAV)、慢病毒载体或腺病毒载体，

AAV血清型AAV5、AAV6、AAV8或AAV9，

来源于恒河猴的AAV或来源于恒河猴的AAV AAVrh.10hCLN2，

AAV衣壳突变体或AAV杂合体血清型，

嗜器官性AAV，任选地嗜肝性AAV或嗜骨骼肌性AAV，

其中任选地，所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、基因、转录物或信使操作性地连接到受调节的或可诱导的转录调节序列；

其中任选地，所述受调节的或可诱导的转录调节序列是受调节的或可诱导的启动子，

其中任选地，转录和/或翻译的正调控物(激活子)和/或负调控物(阻遏子)可操作地连接到所述编码尿皮质素2/或尿皮质素3多肽的核酸、基因、转录物或信使。

在替代性实施方案中，提供了：

操作性地连接到转录调节序列的编码尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸或基因；

其中已含有编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的表达运载体、载体、重组病毒或等同物；或

表达尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸、转录物或信使，

其中所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物可以在细胞中或体内表达所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、基因、转录物或信使，

用于制造药物，或

用于：

治疗、改善或防止或预防患者或个体的肥胖症，

包括向所述受试者的细胞或有需要的受试者提供和施用或递送：

表达尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸、转录物或信使，以及能够在细胞中或体内表达所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、基因、转录物或信使的表达运载体、载体、重组病毒或等同物；

腺相关病毒(AAV)、慢病毒载体或腺病毒载体，

AAV血清型AAV5、AAV6、AAV8或AAV9，

来源于恒河猴的AAV或来源于恒河猴的AAV AAVrh.10hCLN2，

AAV衣壳突变体或AAV杂合体血清型，

嗜器官性AAV，任选地嗜肝性AAV或嗜骨骼肌性AAV，

在替代性实施方案中，提供了：用于在有需要的受试者或个体中治疗、改善或防止(预防)充血性心力衰竭(CHF)、或充血性心力衰竭(CHF)的症状的方法，其包括：

(a)向有需要的受试者或个体递送编码尿皮质素2多肽的核酸序列，

从而治疗或改善所述有需要的受试者或个体的充血性心力衰竭(CHF)；

(b)(a)的方法，其中所述核酸序列在载体中(例如，包含于其内)；

(c)(b)的方法，其中所述载体是病毒载体；

(d)(c)的方法，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)；

(e)(d)的方法，其中所述AAV是血清型AAV8；

(f)(a)到(e)中任一项的方法，其中所述有需要的受试者或个体患有2型糖尿病(T2DM)；

(g)(a)到(f)中任一项的方法，其中所述核酸序列通过静脉内注射(IV)或经肌内被施用。

附图和下面的说明书中陈述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据说明书和附图并且根据权利要求书将显而易见本发明的其它特征、目标和优点。

本文所引用的所有出版物/公开、专利、专利申请在此出于所有目的均以引用方式明确地并入。

附图说明

图1图解说明证实以下情况的数据：在小鼠中单次静脉内注射AAV8.UCn2导致血浆UCn2水平的15倍增加(其持续了至少7个月¹)以及：a)在两种2型糖尿病小鼠(T2DM)模型中通过增加的胰岛素敏感性使葡萄糖利用正常化(图1A)并且b)增加衰竭心脏的功能(图1B)：图1A图解说明证实以下情况的数据：当正常小鼠接受静脉内5x 10¹¹gc的剂量的AAV8.UCn2、或作为阴性对照的盐水，并且进食标准食物达3周(w)，然后进食高脂肪饮食达8w时：在施用AAV8.UCn2的动物中，在葡萄糖水平(“预防”、“消退”和“葡萄糖耐量测试”)；血浆胰岛素；和稳态模型评估(HOMA-IR)或“胰岛素抵抗”方面获得改进；并且图1B图解说明来自在MI诱导的CHF之后10周(w)的小鼠的数据：在诱导CHF之后5w递送AAV.UCn2(5x10¹¹gc，静脉内)(相对于盐水，“CHF”柱)，施用AAV.UCn2的动物显示如通过心室收缩性评估所测量的左心室(LV)整体收缩性(dP/dt)的改进；如下文的实施例1中所详细论述。

图2示意性地说明用于在T2DM和LV功能障碍的背景下激活UCn2表达之后测量AAV8.UCn2-Reg的功效的方案；如下文的实施例1中所详细论述。

图3说明指示尿皮质素-2的有益心血管作用的表。

图4示意性地说明尿皮质素-2(UCn2)如何与促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)2型受体相互作用。

图5：图5A的上图示意性地说明本发明的示例性的AAV8载体(未受调节的表达载体)的载体图谱，鸡β肌动蛋白(CBA)启动子避免了肝中的甲基化；下图图解说明显示在单次静脉内注射AAV8.CBA.UCn2之后6周(w)血浆UCn2增加了大于15倍，并且肝和LV表达增加的数据；并且，图5B示意性地说明用于优化的调节表达系统的本发明的示例性的AAV8调节的表达载体，这些示例性的AAV8载体编码在四环素调节(图谱A)或雷帕霉素调节(图谱B)下小鼠UCn2的调节表达。

图6图解说明在静脉内UCn2基因转移之后正常小鼠中的LV功能的数据；分离的心脏中增加的收缩和舒张功能证实在所述基因转移之后的自分泌UCn2作用。

图7图解说明在静脉内UCn2基因转移之后正常小鼠中的LV钙(Ca⁺²)处置的数据：图7A图解说明与阴性对照相比在静脉内UCn2基因转移之后的SERC2a水平；图7B示意性地说明显示与阴性对照相比在静脉内UCn2基因转移之后P16受磷蛋白(PLB)水平的增加的免疫印迹法数据；图7C图解说明显示与阴性对照相比在静脉内UCn2基因转移之后随时间以秒计的indo-1比率(indo-1荧光比率)(indo-1是用于精确测量细胞内钙浓度的荧光Ca++指示剂)的数据；图7D图解说明数据显示与阴性对照相比在静脉内UCn2基因转移之后达到Ca²⁺下降的时间(t_1/2，τ)。

图8说明显示在静脉内UCn2基因转移之后在衰竭心脏中的增加的功能的数据；包括左图中的研究方案；和右图，与阴性对照相比在静脉内UCn2基因转移之后增加的LV功能，测量LV dP/dt。

图9说明显示在静脉内UCn2基因转移之后对血糖的作用的数据；包括上图中所用的示例性的AAV8基因转移载体，和下图，空腹血糖和剂量响应葡萄糖，其中在在所述基因转移之后3到4周评估葡萄糖。

图10图解说明对2型糖尿病小鼠(T2DM)中的空腹血糖的作用，显示在进食高脂肪饮食(HFD)的T2DM小鼠中在静脉内UCn2基因转移之后对空腹血糖的作用，其中正常小鼠接受AAV8.UCn2载体(5x 10¹¹gc，静脉内)或作阴性对照的盐水，标准食物达3周，然后HFD饮食达8周；包括葡萄糖水平(“预防”和“消退”)、葡萄糖耐量测试数据、HFD小鼠以及给药前小鼠和给药后小鼠中的血浆胰岛素，以及稳态模型评估(HOMA-IR)。

图11图解说明在静脉内UCn2基因转移之后对2型糖尿病小鼠(T2DM)中的葡萄糖利用的作用，其中db/db小鼠接受AAV8.UCn2载体(5x 10¹¹gc，静脉内)或作为阴性对照的盐水，并且在基因转移之后6周进行研究；其中左图显示葡萄糖水平，并且右图显示曲线下面积(AUC)。

图12图解说明在静脉内UCn2基因转移之后对培养的骨骼肌细胞中的葡萄糖利用的作用，其中添加200nM胰岛素、UCn2肽或两者(I+U)；将细胞孵育60分钟，并测量葡萄糖摄取。

图13图解说明证实在接受静脉内5x 10¹¹gc的剂量的AAV8.UCn2或作为阴性对照的盐水之前和之后(4到8周)小鼠中的葡萄糖利用的数据，各图显示葡萄糖水平(“预防”、“消退”和“葡萄糖耐量测试”)；血浆胰岛素；和稳态模型评估(HOMA-IR)或“胰岛素抵抗”。

图14A示意性地说明示例性的AAV8.CBA.UCn2载体图谱并且图14B示意性地说明用于静脉内施用所述载体的实验方案；如下文的实施例2中所详细描述。

图15图解说明证实体内LV功能的数据：图15A和图15B图解说明来自进行以测量LV压力上升(development)速率(LV+dP/dt；A)和LV压力衰减速率(LV-dP/dt；B)的体内研究的数据。在基因转移之后5周，AAV8.UCn2增加LV+dP/dt和LV-dP/dt；图15C和图15D图解说明显示心率倾向于更高(D)并且UCn2基因转移使LV发展压(developed pressure)增加(C)的数据；如下文的实施例2中所述详细描述。

图16显示来自在静脉内AAV8.UCn2(HF+UCn2)或静脉内盐水之后患有心力衰竭(HF)的小鼠的心肌细胞中的细胞溶质Ca²⁺瞬变：图16A和图16B图解说明来自HF+UCn2小鼠的心肌细胞中释放的基线Ca²⁺(收缩-舒张Ca²⁺)增加(p＝0.0001)，其中图16A是来自各组中一个心脏的代表性Indo-1 Ca²⁺瞬变记录，其显示在UCn2基因转移之后5周从患有心力衰竭的小鼠分离的心肌细胞中增加的峰值Ca²⁺；并且，图16B图解汇总显示来自3小鼠/组的数据；在图16C和图16D中，图解说明在UCn2基因转移之后5周在来自患有心力衰竭的小鼠的心肌细胞中达到Ca²⁺下降的时间(t_1/2，τ)缩短，并且图16C是来自各组中一个心脏的心肌细胞的代表性的归一化Ca²⁺瞬变，并且图16D图解说明显示来自3只小鼠/每组的汇总数据；并且对于图16E，(上图)说明免疫印迹法数据(下图)，指示UCn2基因转移增加来自正常小鼠以及来自患有心力衰竭的小鼠的LV中的SERCA2a蛋白质；如下文的实施例2中所详细描述。

图17说明心肌细胞cAMP-PKA信号转导：从患有心力衰竭(HF)的小鼠以及从已接受AAV8.UCn2(UCn2)的患有HF的小鼠获得LV样品(图17A、图17C、图17D)或心肌细胞(图17B)；图17A图解说明cAMP产生；图17B说明显示PKA活性的免疫印迹；图17C图解说明CamK II表达和磷酸化，其中UCn2基因转移与CamK II的降低的Thr286磷酸化(左图，归一化为GAPDH)有关；图17D图解说明心肌球蛋白轻链激酶，其中UCn2基因转移与增加的心肌球蛋白轻链激酶(cMLCK)蛋白质(左图，归一化为GAPDH)有关；如下文的实施例2中所详细描述。

各图中相同的附图标记指示相同的元件。

具体实施方式

在替代性实施方案中提供了组合物和方法以改进患有2型糖尿病的受试者中的葡萄糖利用和心脏功能，或预防患有2型糖尿病的受试者中的功能障碍性葡萄糖利用和心脏功能的发作或发生。在替代性实施方案中提供了组合物，其包含表达尿皮质素-2(UCn-2)和/或尿皮质素-3(UCn-3)的核酸，如载体，使得能够递送和受控表达尿皮质素-2(UCn-2)和/或尿皮质素-3(UCn-3)，导致所述肽被释放到血流中，其中它可以对患有2型糖尿病的受试者中的葡萄糖利用和心脏功能具有有益作用。在替代性实施方案中提供了靶向患有糖尿病的患有糖尿病相关性心脏功能障碍的患者亚群的组合物和方法。在替代性实施方案中提供了用于治疗患有2型糖尿病和相关心脏功能障碍的患者以在此类患者中恢复血糖正常并改进心脏功能的组合物和方法。在替代性实施方案中提供了使用例如一次静脉内(IV)注射基因疗法载体(例如，腺相关病毒载体8型(AAV8)，其包含编码尿皮质素-2(UCn-2)和/或尿皮质素-3(UCn-3)的核酸)来治疗、改善、逆转或预防2型糖尿病(T2DM)和充血性心力衰竭(CHF)的发作或发生的组合物和方法。

在替代性实施方案中，提供了对T2DM患者(包括那些患有充血性心力衰竭(CHF)的T2DM患者中的35％)实施的方法。在替代性实施方案中，提供了被实施以降低T2DM患者发生冠状动脉和外周动脉疾病、心肌梗塞、CHF和/或中风的风险的方法。在替代性实施方案中，提供了被实施以治疗和/或改善持续的高血糖症的方法，所述持续的高血糖症也独立地与异常的心脏功能有关。在替代性实施方案中，提供了被实施以增加胰岛素敏感性并保持β细胞功能的方法，因此，在替代性实施方案中，本发明在T2DM的早期管理中起着关键作用。

在替代性实施方案中，表达所述基因的表达运载体(例如，载体)可以在诊所就诊期间通过肌内注射(如“注射(shot)”)或通过静脉内注射被递送，从而避免了当需要基因在心脏自身中的表达时所遇到的问题。期望蛋白质在血流中的持续分泌避免了通过输注施用蛋白质的困难和代价，所述施用对于在身体内展现非常短的半衰期的许多蛋白质来说可能特别成问题。在替代性实施方案中，提供了表达尿皮质素-2(UCn-2)和/或尿皮质素-3(UCn-3)的核酸的受控表达，并且能够开启和关闭基因表达容易且有效地提供定制治疗并且保证最佳安全性。

在替代性实施方案中提供了治疗、减缓进程、改善和/或预防糖尿病相关性心脏功能障碍的基因转移组合物和方法。在替代性实施方案中，提供了可以与用于糖尿病的标准医学疗法(通常为3种或更多种药物，包括口服降血糖剂和胰岛素)和/或用于心力衰竭的标准疗法(通常为4种或更多种药物)使用或代替其使用的组合物和方法。在替代性实施方案中，提供了可以与口服降血糖剂使用或代替其使用的组合物和方法，所述口服降血糖剂可能在患有心脏功能障碍的糖尿病受试者中具有不良作用。在替代性实施方案中，实施本发明降低了患者所需药物的数量，从而降低了成本和副作用。在替代性实施方案中，实施本发明可以保持糖尿病中的胰腺β细胞功能，从而阻止对胰岛素的需要。

在示例性的应用中，本发明采用提供尿皮质素-2(UCn-2)和/或尿皮质素-3(UCn-3)肽的受控表达的受调节表达系统。例如，长期病毒表达载体可以在医生的办公室中在全身性静脉(或通过肌内注射)中被注射。4周后，受试者每天一次(或更不频繁)吞咽口服抗生素(例如，强力霉素或雷帕霉素)，这将激活所述基因的表达。所述基因被合成并释放到受试者的血液中，并且随后具有有益于患有糖尿病相关性心脏功能障碍的患者中的葡萄糖利用和心脏功能的有利生理作用。当医生或受试者期望终止治疗时，受试者仅仅停止服用激活性抗生素。

为了证实本发明的实施方案的功效，我们已使用编码尿皮质素-2的AAV载体并且利用静脉内递送向患有CHF的小鼠施用所述载体。结果显示：1)在静脉内递送所述载体之后4-6周，转基因的增加的血清水平；2)对收缩功能(心脏收缩功能)的显著的有利作用；和3)对心脏舒张(舒张功能)的显著的有利作用。在另外的研究中，为了证实本发明的实施方案的功效，我们已在2型糖尿病的啮齿动物模型中证明静脉内递送UCn2的有用性。

在替代性实施方案中，提供了用于编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸或基因的体内表达的表达运载体、载体、重组病毒等以实施本发明的方法。在替代性实施方案中，表达编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸或基因的表达运载体、载体、重组病毒等可以例如在门诊患者在例如诊所就诊期间通过肌内(IM)注射、通过静脉内(IV)注射、通过皮下注射、通过吸入、通过生物弹射击粒子递送系统(例如，被称为的“基因枪”)等被递送。

在替代性实施方案中，这种“外周”递送模式，例如，被IM或IV注射的表达运载体、载体、重组病毒等，可以避免当基因或核酸在器官中(例如在肝、骨骼肌、肺或肾脏细胞或组织中)被直接表达时所遇到的问题。期望的尿皮质素2和/或尿皮质素3蛋白质在血流或全身循环中的持续分泌也避免了通过输注施用蛋白质的困难和代价。

在替代性实施方案中，提供了能够针对定制治疗和保证最佳安全性而容易且有效地开启和关闭编码尿皮质素2或表达尿皮质素3的核酸或基因表达的方法。

在替代性实施方案中，即使与它们的一个或多个作用位点相隔一定距离(例如，解剖学上的远端)而被分泌到血液或全身循环中，由一种或多种编码尿皮质素2和/或表达尿皮质素3的核酸或基因表达的一种或多种尿皮质素2和/或尿皮质素3蛋白质也对组织或器官(例如，心脏、血管、肺、肾脏或其它靶标)具有有益的或有利的作用(例如，治疗作用或预防作用)，例如，在替代性实施方案中，尿皮质素2和/或尿皮质素3蛋白质在肺、肾脏、肝或骨骼肌组织中表达，并且对远端组织(例如，心脏或血管)具有有益的作用。

在示例性的实施方案中，使用编码尿皮质素2和/或表达尿皮质素3的核酸或编码尿皮质素-2的基因，但其它编码尿皮质素2和/或表达尿皮质素3的核酸或基因可以用于实施本发明的方法，包括但不限于例如用于治疗充血性心力衰竭(CHF)或肺动脉高压：尿皮质素-3、脑利钠肽(用于CHF)、前列环素合酶(用于肺动脉高压)、生长激素和/或胰岛素样生长因子-1或其任何组合。

在替代性实施方案中提供了受调节表达系统的应用、以及组合物和方法，从而提供了编码尿皮质素2的基因和/或尿皮质素3型基因的受控表达以治疗心脏病或肺病(例如，充血性心力衰竭(CHF)或肺动脉高压)。

例如，在替代性实施方案中，重组病毒(例如，长期病毒或病毒载体)或载体或表达载体等可以在例如门诊患者在例如医生的办公室中例如在全身性静脉(例如，IV)中或通过肌内(IM)注射、通过吸入或通过生物弹射击粒子递送系统(例如，被称为的“基因枪”)被注射。在替代性实施方案中，数天或数周后(例如，4周后)，向所述个体、患者或受试者施用(例如，吸入、被注射或吞咽)诱导编码尿皮质素2和/或表达尿皮质素3的核酸或基因的表达的化学剂或药物；例如，每天一次(或更加频繁或更不频繁)施用口服抗生素(例如，强力霉素或雷帕霉素)，这将激活所述基因的表达。在替代性实施方案中，在所述核酸或基因的“激活”或诱导表达(例如，通过可诱导启动子)之后，尿皮质素2和/或尿皮质素3蛋白质被合成并释放到受试者的循环中(例如，进入血液中)，且随后具有有益于个体或患者(例如，有益于心脏功能、肾脏功能或肺功能)的有利生理作用，例如，治疗作用或预防作用，这取决于所表达的一种或多种尿皮质素2和/或尿皮质素3蛋白质。当医生或受试者期望终止治疗时，受试者仅仅停止服用激活的化学剂或药物，例如，抗生素。

本发明人已使用编码尿皮质素-2的AAV载体并且利用静脉内递送向小鼠施用所述载体。结果显示：1)在静脉内递送所述载体之后4-6周，转基因的血清水平的17倍增加；2)对收缩功能(心脏收缩功能)的显著的有利作用；和3)对心脏舒张(舒张功能)的显著的有利作用。

在替代性实施方案中，提供了包括以下的应用：治疗和改进患有2型糖尿病受试者中的心脏功能，包括治疗重度低射血分数心力衰竭；治疗肺动脉高压；治疗射血分数正常性心力衰竭；替代需要住院和持续静脉内输注用于治疗糖尿病相关性肺动脉高压和心力衰竭的血管活性肽的现行疗法；和治疗其它病况，其中编码尿皮质素2的基因和/或尿皮质素3型基因的受控表达可以用于促进在身体内于一定距离的有利作用。

生成和操作核酸

在替代性实施方案中，为了实施本发明的示例性方法，提供了编码尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的被分离的核酸或基因、合成的核酸或基因和/或重组的核酸或基因。在替代性实施方案中，为了实施本发明的方法，以重组形式在(例如，被剪接成的)用于体内表达的表达运载体中，例如，在载体或重组病毒中提供编码尿皮质素2和/或表达尿皮质素3的核酸或基因。在其它替代性实施方案中，提供了例如编码可以抑制基因或信使(mRNA)的表达的抑制性核酸(例如，siRNA、微小RNA、反义基因、核酶)的被分离的核酸、合成的核酸和/或重组的核酸，所述基因或信使(mRNA)抑制期望的编码尿皮质素2的基因和/或尿皮质素3基因的表达。

在替代性实施方案中，通过例如克隆和表达cDNA文库、通过PCR扩增信使DNA或基因组DNA等来制备、分离和/或操作本发明的核酸。用于实施本发明的核酸和基因(包括DNA、RNA、iRNA、反义核酸、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或其杂合体)可以从各种来源分离、经遗传工程化、扩增和/或重组表达/生成。从这些核酸生成的重组多肽(例如，用于实施本发明的尿皮质素2和/或尿皮质素3嵌合蛋白质)可以被单个地分离或克隆，并且测试其期望活性。可以使用任何重组表达系统或基因疗法递送运载体，包括例如病毒(例如，AAV构建体或杂合体)、细菌、真菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物的细胞表达系统或表达运载体。

或者，用于实施本发明的核酸可以通过熟知的化学合成技术体外合成，如在例如Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105:661；Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25:3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19:373-380；Blommers(1994)Biochemistry33:7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22:1859；美国专利号4,458,066中所述。

用于操作用于实施本发明的核酸的技术，如例如亚克隆、标记探针(例如，使用Klenow聚合酶的随机引物标记、切口平移、扩增)、测序、杂交等在科学和专利文献中有充分的描述，参见例如Sambrook编辑，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(第2版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory,(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY,Ausubel,ed.John Wiley&Sons,Inc.,New York(1997)；LABORATORY TECHNIQUESIN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY:HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES,Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation,Tijssen编辑，Elsevier,N.Y.(1993)。

获得和操作用于实施本发明的方法的核酸的另一有用手段是从基因组样品中克隆，并且如果期望的话，筛选和再克隆从例如基因组克隆或cDNA克隆分离或扩增的插入物。用于本发明的方法中的核酸的来源包括基因组或cDNA文库，所述文库包含在例如哺乳动物人工染色体(MAC)，参见例如美国专利号5,721,118；6,025,155；人类人工染色体，参见例如Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15:333-335；酵母人工染色体(YAC)；细菌人工染色体(BAC)；P1人工染色体，参见例如Woon(1998)Genomics50:306-316；源于P1的载体(PAC)，参见例如Kern(1997)Biotechniques23:120-124；粘粒、重组病毒、噬菌体或质粒中。

在替代性实施方案中，为了实施本发明的方法，使用编码尿皮质素2的融合蛋白质和/或尿皮质素3融合蛋白质和编码它们的核酸。

在替代性实施方案中，接合或融合到用于实施本发明的蛋白质的异源肽或多肽可以是赋予期望特性如荧光检测、增加的稳定性和/或简化的纯化的N-末端鉴别肽。用于实施本发明的肽和多肽还可以作为融合蛋白质被合成和表达，所述融合蛋白质中连接有一个或多个额外的结构域，例如用于产生免疫原性更强的肽、以便更易于分离重组合成的肽、以便鉴别和分离抗体和表达抗体的B细胞等。促进检测和纯化的结构域包括例如金属螯合肽，如允许在固定的金属上纯化的多组氨酸标签(polyhistidine tract)和组氨酸-色氨酸模块；允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域；和用于FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp,Seattle WA)中的结构域。在纯化结构域与包含基序的肽或多肽之间包含可切割的连接体序列如Xa因子或肠激酶(Invitrogen,San Diego CA)以促进纯化。例如，表达载体可以包括编码表位的核酸序列，该核酸序列连接到六组氨酸残基，之后是硫氧还蛋白和肠激酶切割位点(参见例如Williams(1995)Biochemistry34:1787-1797；Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12:404-414)。组氨酸残基促进检测和纯化，而肠激酶切割位点提供了从融合蛋白的剩余部分纯化表位的手段。关于编码融合蛋白质的载体的技术和融合蛋白质的应用在科学和专利文献中有充分的描述，参见例如Kroll(1993)DNACell.Biol.,12:441-53。

用于实施本发明的核酸或核酸序列可以是寡核苷酸、核苷酸、聚核苷酸；或者是指这些中的任何一种的片段；是指基因组的或合成来源的DNA或RNA，它们可以是单链或双链，并且可以代表有义链或反义链；是指肽核酸(PNA)；或者是指天然或合成来源的任何DNA样或RNA样物质。用于实施本发明的化合物包括“核酸”或“核酸序列”，包括寡核苷酸、核苷酸、聚核苷酸或这些中的任一个的任何片段；并且包括基因组的或合成来源的DNA或RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA、iRNA)，它们可以是单链或双链；并且可以是有义链或反义链、或肽核酸(PNA)、或天然或合成来源的任何DNA样或RNA样物质，包括例如iRNA、核糖核蛋白质(例如，例如，双链iRNA，例如，iRNP)。用于实施本发明的化合物包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，即寡核苷酸。用于实施本发明的化合物包括具有合成骨架的核酸样结构，参见例如Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144:189-197；Strauss-Soukup(1997)Biochemistry36:8692-8698；Samstag(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156。用于实施本发明的化合物包括“寡核苷酸”，其包括可以化学合成的单链聚脱氧核苷酸或两条互补的聚脱氧核苷酸链。用于实施本发明的化合物包括不具有5′磷酸盐的合成寡核苷酸，因此不是在激酶存在下用ATP添加磷酸的情况下，所述合成寡核苷酸将不连接到另一寡核苷酸。合成寡核苷酸可以连接到未被去磷酸化的片段。

在替代性方面，用于实施本发明的化合物包括参与产生尿皮质素2编码和/或尿皮质素3的基因或任何DNA区段；它可以包括在编码区之前和之后的区域(前导区和非转录尾区)以及(适用时)各编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。“可操作地连接”可以指两个或更多个核酸(例如，DNA)区段之间的功能关系。在替代性方面，它可以指转录调节序列与被转录序列的功能关系。例如，如果启动子刺激或调控编码序列在适当的宿主细胞或其它表达系统中的转录，则其可以可操作地连接到该编码序列，如用于实施本发明的核酸。在替代性方面，当启动子转录调控序列可以与被转录序列物理地邻接，即它们可以顺式作用时，则它们可以操作性地连接到所述被转录序列。在替代性方面，转录调节序列如增强子无需物理地邻接被它们增强转录的编码序列或与所述编码序列极为接近地定位。

在替代性方面，本发明包括使用包含用于实施本发明的核苷酸序列的“表达盒”，其能够影响核酸(例如，结构基因或转录物(例如，编码尿皮质素2和/或尿皮质素3蛋白质))在与此类序列相容的宿主中的表达。表达盒可以包括至少一个启动子，该启动子与多肽编码序列或抑制序列可操作地连接；且在一个方面，与其它序列(例如，转录终止信号)可操作地连接。还可以使用在影响表达方面有必要的或有帮助的额外因子，例如，增强子。

在替代性方面，用于实施本发明的表达盒还包括质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸DNA”载体等。在替代性方面，用于实施本发明的“载体”可以包含可以感染、转染、短暂地或永久地转导细胞的核酸。在替代性方面，用于实施本发明的载体可以是裸核酸或与蛋白质或脂质复合的核酸。在替代性方面，用于本发明的载体可以包含病毒或细菌核酸和/或蛋白质和/或膜(例如，细胞膜、病毒脂质包膜等)。在替代性方面，用于实施本发明的载体可以包括但不限于复制子(例如，RNA复制子、噬菌体)，DNA片段可以与该复制子连接并被复制。载体因此包括但不限于RNA、自主自我复制的环状或线性DNA或RNA(例如，质粒、病毒等，参见例如美国专利号5,217,879)，并且可以包括表达质粒和非表达质粒两者。在替代性方面，用于实施本发明的载体可以在细胞有丝分裂期间作为自主结构被细胞稳定地复制，或可以被并入宿主基因组内。

在替代性方面，用于实施本发明的“启动子”包括能够驱动编码序列在细胞(例如哺乳动物细胞，如心脏、肺、肌肉、神经或脑细胞)中转录的所有序列。因此，用于本发明的构建体中的启动子包括参与调节或调控基因转录的时机和/或速率的顺式作用转录控制元件和调节序列。例如，用于实施本发明的启动子可以是顺式作用转录控制元件，包括增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5′和3’非翻译区或内含子序列，它们参与转录的调控。这些顺式作用序列通常与蛋白质或其它生物分子相互作用来实施(打开/关闭、调节、调控等)转录。

在替代性实施方案中，用于实施本发明的“组成型”启动子可以是在多数环境条件和发育状态或细胞分化状态下连续地驱动表达的那些。在替代性实施方案中，用于实施本发明的“诱导型”或“可调节型”启动子可以在环境条件、所施用的化学剂或发育条件的影响下指导本发明的核酸的表达。

基因疗法和基因递送运载体

在替代性实施方案中，本发明的方法包括使用核酸(例如，基因或编码多肽的核酸)递送系统例如作为基因疗法递送运载体来在体外、离体或体内向一个或多个细胞递送编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸或基因、或编码尿皮质素2和/或表达尿皮质素3多肽的核酸、转录物或信使的有效载荷。

在替代性实施方案中，用于实施本发明的方法的表达运载体、载体、重组病毒或等同物是或包括：腺相关病毒(AAV)、慢病毒载体或腺病毒载体；AAV血清型AAV5、AAV6、AAV8或AAV9；来源于恒河猴的AAV或来源于恒河猴的AAV AAVrh.10hCLN2；嗜器官性AAV；和/或AAV衣壳突变体或AAV杂合体血清型。在替代性实施方案中，所述AAV被工程化以增加靶向对野生型(wt)AAV非受纳的特定细胞类型的效率和/或改进仅感染目标细胞类型的功效。在替代性实施方案中，所述杂合体AAV通过一种或多种修饰被重新定向或工程化为杂合体血清型，所述一种或多种修饰包括：1)衣壳转移、2)双特异性抗体吸附至衣壳表面、3)将镶嵌型衣壳工程化、和/或4)将嵌合衣壳工程化。本领域内众所周知如何将腺相关病毒(AAV)衣壳工程化以增加靶向对野生型(wt)病毒非受纳的特定细胞类型的效率和改进仅感染目标细胞类型的功效；参见例如Wu等人，Mol.Ther.2006年9月；14(3):316-27.Epub 2006年7月7日；Choi等人，Curr.Gene Ther.2005年6月；5(3):299-310。

例如，可以使用来源于恒河猴的AAV AAVrh.10hCLN2或其等同物，其中所述来源于恒河猴的AAV可能不被人中任何预先存在的免疫性抑制；参见例如Sondhi等人，Hum GeneTher.Methods.2012年10月；23(5):324-35,Epub 2012年11月6日；Sondhi等人，Hum GeneTher.Methods.2012年10月17日；教导了以对于人可缩放的剂量向大鼠和非人灵长类动物的CNS直接施用AAVrh.10hCLN2具有可接受的安全特征并且介导CNS中的显著的有效载荷表达。

此外，例如，可以使用专门设计用于心脏基因转移(嗜心性AAV)的AAV载体，例如，具有改进的在心肌中的转导效率和特异性的AAVM41突变体，参见例如Yang等人，VirolJ.2013年2月11日；10(1):50。

因为腺相关病毒(AAV)是灵长类动物的常见传染原，且因此健康灵长类动物携带抑制AAV介导的基因转移治疗策略的大的AAV特异性中和抗体(NAb)池，所以本发明的方法包括在治疗之前尤其利用常用的AAV8衣壳组分针对AAV特异性NAb筛选患者候选者，以促进个体化治疗设计并且增强治疗功效；参见例如Sun等人，J.Immunol.Methods.2013年1月31日；387(1-2):114-20,2012年10月11日电子出版。

试剂盒和说明书

提供了包含本发明的组合物和方法的试剂盒，包括其使用说明书，包括包含细胞、表达运载体(例如，重组病毒、载体)等的试剂盒。

例如，在替代性实施方案中，提供了包含用于实施本发明的组合物的试剂盒，例如，所述组合物包含尿皮质素-2(UCn-2)肽或多肽；或编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸、(b)本发明的液体或水性制剂、或(c)本发明的囊泡、脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子。在一个方面，所述试剂盒进一步包含用于实施本发明的任何方法的说明书，所述方法例如用于增加血流中期望的尿皮质素2编码和/或尿皮质素3的水平、或用于防止细胞(例如，心细胞或肺细胞)；或用于治疗、预防或改善糖尿病或糖尿病前期的体外或离体方法。

制剂

在替代性实施方案中，提供了用于体内增加尿皮质素2编码和/或尿皮质素3的水平的组合物和方法。在替代性实施方案中，这些组合物包含被配制用于这些目的的编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸，例如，在缓冲液、盐水溶液、粉末、乳液、囊泡、脂质体、纳米粒子、纳米脂质体粒子(nanolipoparticle)等中配制的表达运载体或编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸。

在替代性实施方案中，提供了方法，其包括施用尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽、或编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸，以治疗、改善或预防糖尿病(包括1型糖尿病和2型糖尿病、或成年发作型糖尿病)或糖尿病前期、或肥胖症或超重；或以刺激体重减轻，或以充当食欲抑制剂。因此，出于相同目的，提供了尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽、或编码UCn-2的核酸的适当的制剂和剂量。

在替代性实施方案中，所述组合物(包括编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸的制剂)可以任何方式被配制并且可以各种浓度和形式被应用，这取决于期望的体外、体内或离体条件，包括期望的体内或离体施用方法等。关于用于体外、体内或离体制剂和施用的技术的细节在科学和专利文献中有充分描述。

用于实施本发明的编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、或尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽的制剂和/或运送体(carrier)在本领域内众所周知。用于实施本发明的制剂和/或运送体可以呈适于体内或离体应用的诸如片剂、丸剂、粉末、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等的形式。

在替代性实施方案中，用于实施本发明的编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸、或尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽可以与水溶液和/或缓冲溶液混合，或作为水性悬浮液和/或缓冲悬浮液，例如，包含悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；和分散剂或润湿剂，如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)、烯基氧化物与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、氧化乙烯与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七氧乙烯鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol))、氧化乙烯与衍生自脂肪酸与己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。可以通过例如使用适当的缓冲剂来调节制剂的渗透性(osmolarity)。

在实施本发明时，本发明的化合物(例如，制剂)可以包含溶解于药学上可接受的运送体中的编码尿皮质素2的核酸或基因、编码尿皮质素1的核酸或基因、或尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽的溶液，例如可以采用的可接受的运载体和溶剂包括水和林格氏溶液(Ringer′s solution)、等渗氯化钠。另外，可以采用无菌的固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯或脂肪酸如油酸。在一个实施方案中，用于实施本发明的溶液和制剂是无菌的并且可以被制造成通常不含不期望的物质。在一个实施方案中，这些溶液和制剂通过常规的熟知灭菌技术灭菌。

用于实施本发明的溶液和制剂可以包含按要求接近生理条件的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。活性剂(例如，编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸或基因)在这些制剂中的浓度可以广泛地变化，并且可以主要基于流体体积、粘度等，根据所选的特定的体内或离体施用模式和期望的结果(例如，增加体内尿皮质素2和/或尿皮质素3表达)来选择。

用于实施本发明的溶液和制剂可以被冻干；例如，提供了包含编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸或基因、或尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽的稳定冻干制剂。在一个方面，通过将包含编码尿皮质素2的核酸或基因、编码尿皮质素1的核酸或基因、或尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽和增量剂(例如，甘露醇、海藻糖、棉子糖和蔗糖或其混合物)的溶液冻干制得该制剂。用于制备稳定的冻干制剂的方法可以包括将约2.5mg/mL蛋白质、约15mg/mL蔗糖、约19mg/mL NaCl和pH大于5.5但小于6.5的柠檬酸钠缓冲液的溶液冻干。参见例如美国专利申请号20040028670。

本发明的组合物和制剂可以通过使用脂质体来递送(还参见下文的论述)。通过使用脂质体，特别是在脂质体表面带有对靶细胞具有特异性或以其它方式优先针对特定组织或器官类型的配体时，可以在体内或离体施加中集中将活性剂递送到靶细胞中。在替代性实施方案中，靶细胞是肝细胞、骨骼肌细胞或肝细胞。

纳米粒子、纳米脂质体粒子和脂质体

本发明还提供包含用于实施本发明方法的化合物(例如，编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素2的核酸)的纳米粒子、纳米脂质体粒子、囊泡和脂质体膜，例如，以在体内或离体将尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽递送到个体细胞、患者细胞或哺乳动物细胞。在替代性实施方案中，这些组合物被设计成靶向特定的分子，包括生物分子，如多肽，包括细胞表面多肽，例如，用于靶向期望的细胞类型，例如，哺乳动物细胞，如骨骼肌细胞或组织、肝细胞、肾细胞、肺细胞、神经细胞等。

提供了包含用于实施本发明的化合物的多层脂质体，例如，如Park等人，美国专利公开号20070082042中所述。多层脂质体可以使用包含角鲨烷、固醇、神经酰胺、中性脂质或中性油、脂肪酸和卵磷脂的油相组分的混合物制备成约200nm到5000nm的粒度，例如，以捕获编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸或基因。

脂质体可以使用例如如Park等人，美国专利公开号20070042031中所述的任何方法制得，包括通过包封活性剂(例如，表达尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽的载体)来产生脂质体的方法，所述方法包括在第一储器中提供水溶液；在第二储器中提供有机脂质溶液，然后在第一混合区中混合所述水溶液与所述有机脂质溶液以产生脂质体溶液，其中所述有机脂质溶液与所述水溶液混合以基本上瞬时地产生包封所述活性剂的脂质体；并且然后立即混合所述脂质体溶液与缓冲溶液以产生稀释的脂质体溶液。

在一个实施方案中，用于实施本发明的脂质体组合物包含被取代的铵和/或聚阴离子，例如，用于将用于实施本发明的复合物(例如，编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸或基因)靶向递送到期望的细胞类型，如例如美国专利公开号20070110798中所述。

本发明还提供包含用于实施本发明的化合物(例如，编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸或基因、或尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽)的纳米粒子，其呈含活性剂的纳米粒子(例如，二级纳米粒子)的形式，如例如美国专利公开号20070077286中所述。在一个实施方案中，提供了包含本发明的脂溶性活性剂或脂溶解的水溶性活性剂的纳米粒子以与二价或三价金属盐作用。

在一个实施方案中，固体脂质悬浮液可以用于配制用于实施本发明的编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸或基因、或尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽和将用于实施本发明的编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸或基因、或尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽递送到体内或离体的哺乳动物细胞，如例如美国专利公开号20050136121中所述。

递送运载体

在替代性实施方案中，任何递送运载体均可以用于实施本发明的方法或组合物，例如，以递送编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸或基因、或尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽以在体内或离体实施本发明的方法。例如，可以使用包含聚阳离子、阳离子型聚合物和/或阳离子型肽(如聚乙烯亚胺衍生物)的递送运载体，例如，如例如美国专利公开号20060083737中所述。

在一个实施方案中，干燥的多肽-表面活性剂复合体被用于配制本发明的组合物，其中表面活性剂通过非共价键与核酸缔合，例如如例如美国专利公开号20040151766中所述。

在一个实施方案中，用于实施本发明的核酸或多肽可以作为聚合水凝胶或水溶性共聚物被施加到细胞，例如，如美国专利号7,413,739中所述；例如，核酸或蛋白质可以通过亲核加成通过强亲核体和共轭不饱和键或共轭不饱和基团之间的反应来聚合，其中每种前体组分包含至少两种强亲核体或至少两个共轭不饱和键或共轭不饱和基团。

在一个实施方案中，使用带有细胞膜渗透性肽缀合物的运载体将核酸或蛋白质施加到细胞，例如，如美国专利号7,306,783；6,589,503中所述。在一个方面，核酸本身缀合到细胞膜渗透性肽。在一个实施方案中，核酸、蛋白质和/或递送运载体缀合到介导转运的肽，例如，如美国专利号5,846,743中所述，该美国专利描述了高度碱性且结合聚磷酸肌醇的介导转运的肽。

在一个实施方案中，电透化被用作主要手段或辅助手段以将编码尿皮质素2和/或编码尿皮质素3的核酸或基因递送到细胞，例如，使用如例如美国专利号7,109,034；6,261,815；5,874,268中所述的任何电穿孔系统进行。

制品、植入物和人工器官

提供了包含本发明细胞(例如，经修饰以表达尿皮质素2编码和/或尿皮质素3肽或多肽的细胞，以实施本发明的方法)的制品以及通过本发明方法制得的细胞的用途，包括例如植入物和人工器官、生物反应器系统、细胞培养系统、细胞培养板、细胞培养器皿、细胞培养管、细胞培养瓶和细胞培养烧瓶，其包含经修饰以表达尿皮质素2和/或尿皮质素3蛋白质的细胞，以实施本发明方法。任何植入物、人工器官、生物反应器系统、细胞培养系统、细胞培养板、器皿(例如，培养皿)、细胞培养管和/或细胞培养烧瓶(例如，滚瓶)都可以被用于实施本发明。

在替代性实施方案中提供了生物反应器、植入物、支架、人工器官或类似装置，其包含经修饰以表达尿皮质素2和/或尿皮质素3蛋白质的细胞，以实施本发明方法；例如，包括如USPN 7,388,042；7,381,418；7,379,765；7,361,332；7,351,423；6,886,568；5,270,192；和美国专利申请公开号20040127987；20080119909(描述耳植入物)；20080118549(描述眼植入物)；20080020015(描述生物活性伤口敷料)；20070254005(描述心脏瓣膜生物假体、血管移植物、半月板植入物)；20070059335；20060128015(描述肝植入物)中所述的植入物。

体内植入细胞

在替代性实施方案中，提供了包括植入或移入细胞(例如，心细胞、肺细胞或肾细胞)的方法，所述细胞包含或表达用于实施本发明的编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因、或尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽；并且在一个方面，本发明的方法包括在血管、组织或器官中离体或体内植入或移入所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因(或表达它们的细胞)、或尿皮质素-2(UCn-2)肽或多肽，或在有需要的个体中植入或移入再程序化的分化细胞。

可以从个体中移出细胞，使用本发明的组合物和/或方法对所述细胞进行处理，并且使用任何已知的技术或方案将其再插入(例如，注入或移入)到组织、器官或该个体中。例如，可以使用微球体再植入(例如，注入或移入)去分化的再程序化细胞或再程序化的分化细胞，例如如美国专利号7,442,389中所述；例如，在一个方面，细胞运送体包括增量剂以及包含这些细胞的自体运送体，所述增量剂包含圆的光滑的聚甲基丙烯酸甲酯微粒(其被预加载在混合和递送系统内)。在另一实施方案中，向组织、器官和/或有需要的个体再施用于生物相容性交联基质中的所述细胞，如例如美国专利申请公开号20050027070中所述。

在另一实施方案中，向组织、器官和/或有需要的个体再施用(例如，注入或移入)于生物相容性非免疫原性涂层内或由生物相容性非免疫原性涂层所防止的本发明的细胞(例如，通过实施本发明方法制得的细胞)，所述涂层例如在合成植入体的表面上，例如如美国专利号6,969,400中所述，该美国专利描述了例如以下方案：其中不能产生cAMP的AC可以缀合到聚乙二醇，该聚乙二醇已被修饰而含有多个亲核基团，如伯氨基或硫醇基。

在一个实施方案中，使用如例如美国专利号7,442,390；5,733,542中所述的移植方法向组织、器官和/或有需要的个体再施用(例如，注入或移入)本发明的细胞(例如，通过实施本发明方法制得的细胞)。

可以使用用于向组织或器官(例如，肺、肾脏、肝、骨骼肌)递送多肽、核酸和/或细胞的任何方法，并且这些方案在本领域内众所周知，例如，如美国专利号(USPN)7,514,401中所述，该美国专利描述了例如使用向心脏原位冠状动脉内(IC)、静脉内(IV)和/或局部递送(心肌注射)多肽、核酸和/或细胞。例如，在替代性实施方案中，气溶胶药物粒子进入肺以及进入血流中、基因疗法、连续输注、重复注射和/或缓释聚合物可以被用于向组织或器官(例如，肺、肾脏、肝、骨骼肌)递送多肽、核酸和/或细胞。在替代性实施方案中，核酸和/或细胞可以通过导管被给予冠状动脉中或通过有限的胸廓切开术进行直接注射被给予左心房或心室心肌中；或通过在心导管插入术期间通过的导管被递送到心肌中；或被递送到心包腔中。

在替代性实施方案中，用于向组织或器官(例如，肺、肾脏、肝脏、骨骼肌)实施本发明的核酸或蛋白质或包含用于实施本发明的核酸的载体(例如，AAV或腺病毒基因疗法载体)、或本发明的囊泡、脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子(NLP)等，例如如USPN 7,501,486中所述。

用于实施本发明的组合物可以与其它治疗剂组合使用，所述其它治疗剂例如血管生成剂、抗血栓剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗心律不齐剂、肿瘤坏死因子抑制剂、内皮素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙拮抗剂、抗生素剂、抗病毒剂和病毒载体。

用于实施本发明的组合物可以用于改善或治疗各种糖尿病相关性心脏病变和心血管疾病中的任何一种，例如，糖尿病相关性心脏病变和心血管疾病，例如，冠状动脉疾病(CAD)；动脉粥样硬化；血栓形成；再狭窄；血管炎，包括自身免疫性血管炎和病毒性血管炎，如结节性多动脉炎、变应性肉芽肿血管炎(Churg-Strass syndrome)、高安动脉炎(Takayasu′s arteritis)、川崎病(Kawasaki Disease)和立克次体血管炎(Rickettsialvasculitis)；动脉粥样硬化性动脉瘤；心肌肥大；先天性心脏疾病(CHD)；缺血性心脏疾病和绞痛；获得性瓣膜疾病/心内膜疾病；原发性心肌病，包括心肌炎；心律不齐；和移植排斥；代谢性心肌病和心肌病变，如充血性心肌病变、肥大性心肌病变或限制性心肌病变；和/或心脏移植。在替代性实施方案中，用于实施本发明的组合物(例如，尿皮质素-2(UCn-2)肽或多肽)被用于治疗、改善或防止(预防)患者或个体的糖尿病或糖尿病前期；或抑制患者或个体中的体重增加、或抑制食欲、或刺激或起始体重减轻；或治疗、改善或防止(预防)患者或个体的糖尿病。

将参考以下实施例来进一步描述本发明；然而，应当理解，本发明并不限于此类实施例。

实施例

实施例1：在正常小鼠中静脉内递送编码尿皮质素-2的AAV8增加心脏功能

本实施例证实本发明的示例性实施方案的有效性。在替代性实施方案中，提供了用于利用一次静脉内(IV)注射编码尿皮质素-2(UCn2)(促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)家族的一种肽)的腺相关病毒载体血清型-8(AAV8)治疗和改善2型糖尿病(T2DM)和糖尿病性心脏病的组合物和方法。在替代性实施方案中，所述载体(AAV8.UCn2)包含受调节的表达盒以使得能够进行受控表达。在替代性实施方案中，在门诊患者就诊期间通过静脉内注射将示例性载体递送到例如臂静脉中。

我们已证实在小鼠中单次静脉内注射AAV8.UCn2导致血浆UCn2水平的15倍增加(其持续了至少7个月¹)以及：a)在两种T2DM模型中通过增加的胰岛素敏感性使葡萄糖利用正常化(图1A)并且b)增加衰竭心脏的功能(图1B)。在替代性实施方案中，本发明的方法包括静脉内注射编码对胰岛素敏感性和心脏功能具有有益的旁分泌作用的肽的载体。

我们在啮齿动物T2DM中的数据表明本发明的UCn2基因转移方法可以：避免对胰岛素的需要；在患有CHF的患者中耐受良好且有益；不需要重复注射；并且与体重减轻有关。

可以具有有益的心脏作用¹的本发明方法可以安全地用于患有CHF的受试者，并且将满足未满足的医疗需要：对患有CHF的T2DM患者的新颖治疗，具有现行药物不共有的特征。

在替代性实施方案中，实施本发明的方法可以避免对胰岛素的需要，因此实施本发明的方法是β细胞保持性的且对患有T2DM的患者有益。

在替代性实施方案中，例如，使用AAV8.UCn2实施本发明的方法将减少而不是增加重量，增加重量是现行T2DM药剂的问题。由于UCn2对心脏功能的有益作用¹，因此它可以被安全地用于治疗患有CHF的T2DM患者，这不同于噻唑烷二酮。

在替代性实施方案中，本发明的疗法将被指示用于患有和未患有CHF的T2DM受试者并且将被用于代替(或补充)口服药剂；并且对于一些患者来说，可以延缓对胰岛素的需要。

在替代性实施方案中，本发明的疗法使用增加胰岛素敏感性的转基因集中于早期T2DM。

在替代性实施方案中，通过静脉内施用载体(例如，AAV8.UCn2)对患有T2DM的受试者实施本发明的疗法；其中未能进行饮食和运动干预并且尚无胰岛素依赖性的个体可以是理想的候选者。另外，本发明的疗法可以增加正常心脏¹和衰竭心脏(图1B)的功能，并且在一些患者中可以改进患有T2DM的受试者中衰竭心脏的功能。

在替代性实施方案中，静脉内(静脉内注射)具有尿皮质素-2的受调节表达的AAV8载体将在T2DM中增加葡萄糖利用和胰岛素敏感性，并且改进心脏功能。如图1A中所图解说明的，当正常小鼠接受静脉内5x 10¹¹gc的剂量的AAV8.UCn2、或作为阴性对照的盐水，并且进食标准食物达3周(w)，然后进食高脂肪饮食达8w时：在施用AAV8.UCn2的动物中，在葡萄糖水平(“预防”、“消退”和“葡萄糖耐量测试”)；血浆胰岛素；和稳态模型评估(HOMA-IR)或“胰岛素抵抗”方面获得改进。

在替代性实施方案中，本发明的疗法包括基因转移，例如，UCn2、UCn1和/或UCn3基因转移，例如，通过静脉内(IV)递送载体(例如，AAV载体，其编码表达UCn2、UCn1和/或UCn3的核酸，例如，UCn2、UCn1和/或UCn3基因或cDNA)进行基因转移。在替代性实施方案中，全身载体递送在具有旁分泌活性的肽的基因转移方面具有优点，因为它对于任何给定的AAV剂量提供了转基因的最高血浆水平。

在替代性实施方案中，使用AAV，因为它们可以使得能够实现比腺病毒更长的转基因表达，并且避免了与反转录病毒有关的插入诱变。在单次注射AAV载体之后数年的大型动物中已显示持续的转基因表达。我们已在小鼠(参见例如图5)和大鼠¹¹中证实这种情形。尽管最近的临床试验已发现一些AAV血清型在肌内注射之后激发免疫应答¹²，但更新一代的AAV载体(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)在灵长类动物中没有类似问题¹³。关于血浆转基因水平，静脉内AAV递送优于肌内，并且AAV9优于AAV5和AAV6¹⁴。预先存在的抗AAV8抗体(19％)在人中不如其它AAV血清型(AAV1、AAV2和AAV6)(50-59％)一样普遍¹⁵。我们的数据指示静脉内AAV8是对于所提出的研究获得持续增加的血浆UCn2水平的最佳载体和递送途径(图1)¹。

尽管在横纹肌中稳健，但巨细胞病毒(CMV)启动子在肝中易于甲基化和灭活¹⁶，并且我们的数据指示较不易于甲基化的启动子更好。实际上，尽管在静脉内载体递送之后，CMV提供了UCn2的持续的2.3倍增加，但使用鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子使血浆UCn2增加>15倍(图1)。在替代性实施方案中，表达UCn2、UCn1和/或UCn3的核酸(例如，UCn2、UCn1和/或UCn3基因或cDNA)操作性地连接到鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。

在替代性实施方案中，表达UCn2、UCn1和/或UCn3的核酸处于“受调节的表达”之下。在替代性实施方案中，由于AAV基因转移所赋予的长期表达的潜力，因此如果发生不利效应，则关闭表达的能力是期望的。在替代性实施方案中，使用受调节的表达，它可以使得能够实现间歇的而不是恒定的转基因递送的灵活性。在替代性实施方案中，使用四环素和雷帕霉素调节系统：它们已在大型动物模型中被测试。

来自高脂肪饮食(HFD)T2DM模型的数据。

UCn2基因转移既预防T2DM，还在T2DM一旦存在时治疗它。将空腹血糖测试和葡萄糖耐量测试两者归一化。胰岛素抵抗的量度(HOMA-IR)减小。图1B：来自MI-诱导的CHF之后10周(w)的小鼠的数据：在诱导CHF之后5w递送AAV.UCn2(5x 10¹¹gc，静脉内)(相对于盐水)。UCn2基因转移增加收缩和舒张LV功能(盲法研究)。

图2.测试在T2DM和LV功能障碍的情况下激活UCn2表达之后20周AAV8.UCn2-Reg(5x 10¹¹gc，静脉内)的功效。我们使用了与异常LV收缩和舒张功能有关的T2DM模型，该模型在Sprague-Dawley大鼠中使用了高脂肪饮食(HFD)加链脲霉素(STZ；腹膜内35mg/kg x 2)⁷。连续超声心动描记术将评估LV大小以及收缩和舒张功能，包括周缘纤维缩短速度(VCF)功能。使用压力容积导管进行15只大鼠/组中的终末研究以评估收缩末期压力容积关系(ESPVR)、壁应力、LV压力上升和衰减速率以及τ。最后，使来自每只动物的11种组织的样品经受生物分布和毒理学研究；AAV需要量：1.5x 10¹⁴gc。

在HFD小鼠(进食高脂肪饮食达10周，然后进食AAV8.UCn2-Reg(5x 10¹¹gc，静脉内)或静脉内盐水(阴性对照)5周的小鼠)中静脉内施用尿皮质素-2使肝的脂肪浸润减少73％，如通过组织学分析所确认。

图5A.上图：未受调节的表达载体的载体图谱。CBA启动子避免了肝中的甲基化，即CMV的问题。下图.在单次静脉内注射AAV8.CBA.UCn2之后6w，血浆UCn2增加>15倍。肝和LV表达增加。心脏表达可能对于自分泌作用是重要的，它可能增大旁分泌作用。另外的数据(未显示)证明在基因转移之后7个月对血浆UCn2和心脏功能的持续且稳定的作用。

图5B说明本发明的示例性的受调节表达载体：对于最佳受调节表达系统。这些示例性的AAV8载体编码小鼠UCn2在四环素调节(图谱A)或雷帕霉素调节(图谱B)下的受调节表达。RSV被用于载体图谱B，因为CBA将不适合Rap。这两种受调节的表达载体将被测试(目的1)并且较好的一种将被选择用于目标2和目标3研究。缩写：ITR，反向末端重复；SVpA，来自SV40病毒基因组的聚腺苷酸(双向性的)；UCn2，尿皮质素-2；TRE，四环素应答元件；rtTA2SM2，反向四环素控制的反式激活子；SV40.en，猿猴病毒40增强子；RSV Prom，劳氏肉瘤病毒启动子；FRB-p6，FRAP(雷帕霉素相互作用蛋白质)一部分，与转录NF-κB亚单位(p65)组合；IRES，内部转录重新进入位点；ZF，锌指HD1DNA结合域；FKBP，FK506结合蛋白质；pA，最小聚腺苷酸化片段；ZBD，锌指HD DNA结合域(8个拷贝)

图13.左：来自T2DM的HFD模型的数据。UCn2基因转移既预防T2DM(Pre)，还在2DM一旦存在时治疗它(Post：在高血糖症存在之后4-8wk进行基因转移)。将空腹血糖测试和葡萄糖耐量测试两者归一化。胰岛素抵抗的量度(HOMA-IR)减小。在db/db小鼠中确认的作用。上：来自MI-诱导的CHF之后10w的小鼠的数据：在CHF之后5w递送AAV.UCn2(5x 10¹¹gc，静脉内)(相对于盐水)，它增加收缩和舒张LV功能(盲法研究)。

实施例2：在小鼠中静脉内递送AAV8编码尿皮质素-2增加衰竭心脏的功能

本实施例证实本发明的示例性的实施方案的有效性，即静脉内递送AAV8.UCn2增加衰竭心脏的功能。总之，心肌梗塞(MI，通过冠状动脉结扎)被用于诱导心力衰竭，这是在MI之后3周通过超声心动描记术评估的。LV射血分数(EF)<25％的小鼠接受AAV8.UCn2(5x10¹¹gc)或盐水的静脉内递送，并且5周后的超声心动描记术显示接受UCn2基因转移的小鼠中增加的LV EF(p＝0.01)。体内生理学研究显示LV压力上升峰值速率的2倍增加(LV+dP/dt；p<0.0001)和LV压力衰减峰值速率的1.6倍增加(LV-dP/dt；p＝0.0007)，指示治疗小鼠中增加的LV收缩和舒张功能。UCn2基因转移与增加的峰值收缩Ca²⁺瞬变幅度和Ca+下降速率以及增加的SERCA2a表达有关。另外，UCn2基因转移降低Cam激酶II的Thr286磷酸化并且增加心肌球蛋白轻链激酶的表达，是将被预期增加衰竭心脏的功能的发现。这些结果证实单次静脉内注射AAV8.UCn2增加衰竭心脏的功能。静脉内注射编码具有有益旁分泌作用的基因的载体以增加心脏功能的简单性是一种有吸引力的临床策略。

方法

AAV8.UCn2载体产生(图14)。通过用载体质粒pRep2/Cap8和pAd-辅助质粒瞬时转染HEK293T细胞来产生无辅助病毒的编码鼠尿皮质素-2(UCn2)的AAV8载体(由鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子驱动)(AAV8.CBA.UCn2；图14)²⁸。从宾夕法尼亚大学载体中心(Universityof Pennsylvania Vector Core)获得质粒pRep2/Cap8。用benzonase处理转染72hr之后制备的细胞溶解产物并且通过25％蔗糖垫层超速离心使病毒固结。将沉淀物再悬浮以供通过阴离子交换柱色谱(Q-Sepharose,GE Health Science)进一步纯化所述病毒并且通过25％蔗糖垫层超速离心浓缩^29,30。随后，将沉淀物再悬浮于10mM Tris-HCl(pH 7.9,1mM MgCl2,3％蔗糖)中。通过实时qPCR利用由纯化病毒制备的病毒基因组DNA确定病毒效价。

心力衰竭模型VA圣地亚哥健康保健系统的动物护理和使用委员会(The AnimalUse and Care Committee of the VASan Diego Healthcare System)批准所述研究。使用231只重26.1±0.2克的10-12周龄雄性C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratories,BarHarbor,ME,USA)。我们使用冠状动脉闭塞来诱导大前壁MI和CHF，如先前所详细描述^31,32。MI大小特意为大，是LV的大约50％，包含LV游离壁的大部分(图14)。因此，该模型与高的初始死亡率有关。在231只经历冠状动脉闭塞的小鼠中，125只(54％)在随机分组(AAV8.UCn2或盐水)之前主要在MI之后的前几天死亡。另外45只小鼠(19％)在MI之后3周未显示足以被随机分组的LV功能障碍。61只小鼠(26％)具有足够低的LV射血分数(EF<25％)并被随机分组，并且这些小鼠中的11只在随机分组之后5周在最后研究之前死亡：4只UCn2(死亡率13％)；7只盐水(死亡率23％)。主要端点是在患有重度心力衰竭的小鼠中相对于盐水静脉内递送AAV8.UCn2之后5周的LV功能(图14)。在不了解组特性的情况下获得数据并分析。

AAV8.UCn2递送在麻醉(1.5％氟烷，经由鼻锥)下，产生小的切口以使颈静脉暴露于静脉内递送的AAV8.UCn2(5x 10¹¹gc，于50μl中)或类似体积的盐水(对照)。

UCn2基因转移对心率和血压的作用

进行这些研究以评估UCn2基因转移对患有心力衰竭的未服镇静剂小鼠中的心率和血液的作用。在MI之后3周确认受损的LV射血分数，并且小鼠接受静脉内AAV8.UCn2(5x10¹¹基因组拷贝，gc)或盐水。在未服镇静剂小鼠中通过尾套法(tail cuff)(VisitechSystems,Apex,NC)测量收缩压和舒张压以及心率。

超声心动描记术。如先前所述³³进行超声心动描记术。在心肌梗塞之后3周进行超声心动描记术以证明降低的LV功能(EF<25％)并记录LV室尺寸。然后在将小鼠随机分组以接受静脉内递送AAV8.UCn2或盐水之后5周重复超声心动描记术评估。

LV收缩和舒张功能。

用戊巴比妥钠(80mg/kg，腹膜内)将小鼠麻醉并且使1.4F电导率微压计导管(SPR839,Millar Instruments,Houston,Texas)经由右颈动脉穿过主动脉瓣并进入LV腔中。如先前所报道⁶，将左心室压以数字方式记录并存储用于处理(IOX1.8Emka Technologies,Christchurch,VA)。随后，获得血液和组织样品。在获取之后，使用LV压力上升的一阶导数(LV+dP/dt)和LV压力下降的一阶导数(LV-dP/dt)来评估LV收缩和舒张功能。在不了解组特性的情况下获得数据并分析。

心肌细胞分离。

如先前所述³³，分离心肌细胞。

Ca ²⁺ 瞬变。如先前所述 ^27,34，在修改的情况下，使用Indo-1测量细胞溶质Ca²⁺瞬变。将心肌细胞平铺到经层粘连蛋白涂覆的玻璃盖片上并且用indo-1/AM(3μM,Calbiochem,LaJolla CA)和分散剂pluronic F-127(0.02mg/ml,Calbiochem,La Jolla CA)加载30min。在加载染料后，将盖片安装在表面灌流室(superfusion chamber)上，冲洗以去除过量的indo-1/AM，并且安装在装配有40x物镜的Nikon Diaphot落射荧光显微镜上，该物镜介接到经由单色仪将激发波长设定为365nm的Photon Technologies测光系统(Birmingham NJ)。通过分别以405nm和485nm为中心的20-nm带通滤波器将荧光发射分离并且引导到两个光电倍增管。比率F405/F485代表[Ca²⁺]i的量度。在这些测量期间，用含有2mM CaCl₂的25mMHEPES(pH 7.3)对心肌细胞进行表面灌流。在0.3Hz下对肌细胞进行场刺激。从6个心脏(3个/组)获得的144个心肌细胞记录Ca²⁺瞬变。每次循环分别从基线indo-1比率和最大indo-1比率推断舒张细胞内Ca²⁺水平和收缩细胞内Ca²⁺水平。由归一化的Ca²⁺瞬变计算舒张衰减时间(τ)。

定量RT-PCR(qRT-PCR)和免疫印迹。

将LV和肝样品收集并且存储在-80℃用于定量RT-PCR和蛋白质印迹法(Westernblotting)。qRT-PCR。使用RNeasy小型试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)分离LV和肝RNA并且如先前所述²⁷在以下条件下进行qRT-PCR：98℃5min；95℃30s，55℃30s和72℃30s，40个循环。将RNA等同物归一化为每个样品中同时确定的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA水平。引物列于下表4中。如先前所述³⁵进行免疫印迹法。使用以下抗体：cMLCK(Abgen/ThermoScientific,San Diego,CA/Waltham MA)；p286CamKII(Santa Cruz,Dallas,TX)；磷酸化-PKA催化亚单位、PKA催化亚单位、肌钙蛋白I和22/23-磷酸化-肌钙蛋白I(CellSignalingTechnology,Danvers MA)；PLB(Thermo Fisher Scientific,Waltham MA)；Ser16和Thr 17-磷酸化-PLB(Badrilla有限公司，Leeds,UK)；SERCA2a(Enzo Life Sciences,Farmingdale NY)。

环AMP和蛋白质激酶A(PKA)活性。

在用异丙肾上腺素(10mM,10min)和NKH477(10mM,10min)刺激之前和之后使透壁LV样品经受cAMP测量并且使用Biotrak酶免疫测定系统(GE Healthcare)测量cAMP，如先前所述³⁶。如先前所述²⁷确定PKA活性。在用异丙肾上腺素(10μM,10min)和NKH477(10μM,10min)刺激之前和之后使心肌细胞经受cAMP测量并且随后在缓冲液A(20mM Tris-HCl(pH7.4)、0.5mM EGTA、0.5mM EDTA和蛋白酶抑制剂混合剂(Invitrogen,CA))中均质化并且离心(14,000×g,5min,4℃)。将上清液与PKA生物素化的肽底物(cAMP-依赖性蛋白质激酶测定系统，Promega,Madison WI)在[γ-³²P]ATP存在下孵育。利用抗生蛋白链菌素基质回收³²P-标记的生物素化的底物，并且确定PKA的比活性。

组织学。将肝样品和未梗塞的LV间隔的透壁切片用福尔马林固定并且用石蜡包埋。将5微米切片封片并用苏木精和伊红以及用马森三色染料(Masson’s trichrome)进行复染。对于LV纤维化的定量评估来说，利用Nikon Eclipse Ti-U显微镜获得短轴中壁LV环的图像。使用NIS-Elements AR 3.10软件(Nikon公司)进行活性LV区域(不包括梗塞区域)中的纤维化程度的盲法分析。对固定且复染的肝样品进行类似的分析方法。

统计学分析。数据表示平均值±SE；使用ANOVA，之后使用邦弗朗尼(Bonferroni)t检验测试组差异的统计学显著性。使用学生t检验(不成对的，双尾)进行组间比较。当p<0.05时，拒绝零假设。

结果

未服镇静剂小鼠中的心率和血压。在UCn2基因转移之后5周，在心率或收缩血压、舒张血压或平均动脉血压中未见组差异(下表1)，尽管心率在未治疗组中倾向于相当高且在已接受UCn2基因转移的小鼠中更接近正常。尿皮质素2表达。在静脉内递送AAV.UCn2(5x10¹¹gc；n＝6)之后5周，相对于内源性UCn2mRNA，UCn2mRNA在肝中增加15,263倍(p<0.0001)并且在LV(p＝0.03)中增加70倍。

超声心动描记术(下表2)。向患有HF的小鼠静脉内递送AAV8.UCn2与增加的射血分数(p＝0.01)有关，并且周缘纤维缩短速度增加，但未达到统计学显著性(p＝0.09)。接受AAV8.UCn2的小鼠还展现LV舒张末期直径(EDD；p<0.001)和LV收缩末期直径(ESD；p＝0.002)的降低。盐水治疗小鼠显示LV EDD的11％增加，而UCn2治疗组显示LV EDD的2％降低。类似地，盐水组显示LV ESD的16％增加，而UCn2组经历6％降低。尽管LV尺寸的这些变化可能似乎小，但因为容积是尺寸的三次函数，所以容积变化是相当大的—对ESD来说计算的增加64％(盐水相对于UCn2)并且对EDD来说增加46％(盐水相对于UCn2)。后壁和间隔壁厚度未显示组差异(下表1)。

LV收缩和舒张功能(图15和下表3)。对LV压力上升的体内评估显示LV压力上升速率(LV+dP/dt；p<0.0001)和LV舒张(LV-dP/dt；p<0.0007)的显著增加(图15和下表3)。平均动脉压没有组差异(表3)。在麻醉下进行的这些研究期间的心率在已接受UCn2基因转移的小鼠中略高，但差异未达到统计学显著性。

细胞溶质Ca²⁺瞬变和相关基因。释放的基线Ca²⁺(收缩-舒张Ca²⁺)在来自已接受UCn2基因转移的心力衰竭小鼠的心肌细胞中增加(p＝0.0001，图16A和16B)。UCn2基因转移还与在UCn2基因转移之后5周来自患有心力衰竭的小鼠的心肌细胞中减少的Ca²⁺下降时间(t_1/2，τ)有关(p＝0.001，图16C和16D)。增加的UCn2与正常LV和衰竭LV中SERCA2a mRNA和蛋白质的增加的表达有关(图16E和16F)。然而，在LV蛋白质表达和受磷蛋白或TnI的磷酸化中未见组差异(数据未显示)。

环AMP和PKA活性。从两组的心脏分离的LV样品和心肌细胞未显示cAMP或PKA活性的差异(图17)。在用异丙肾上腺素或NKH477(一种独立于β-肾上腺素能受体刺激腺苷酸环化酶的水溶性福司柯林(forskolin)类似物)刺激之前和之后评估环AMP产生和PKA活性。未见基线、Iso或NKH477-刺激的cAMP产生(图4A)或PKA活性(图17B)的组差异。PKA家族蛋白质的表达(催化α单位和调节性α和β亚单位和它们的磷酸化)未改变(数据未显示)。

CamKII和cMLCK。为了探求机制以解释通过UCn2基因转移诱发的衰竭心脏的增加的功能，我们测量了钙/钙调蛋白依赖性蛋白质激酶II(CamKII)的LV表达和磷酸化以及心肌球蛋白轻链激酶3(cMLCK)的表达。在UCn2基因转移之后在来自HF小鼠的LV样品中Ser286处的CamKII磷酸化降低(降低47％，p＝0.04；图4C)，尽管总CamKII蛋白质表达未显示组差异。在探求对Ca²⁺的肌丝敏感性的改变时，我们评估了在UCn2基因转移之后的LV心肌球蛋白轻链激酶3(cMLCK)表达，发现1.6倍增加(p<0.04)(图4D)。

尸体剖检(表5)。肝、肺和体重未显示组差异。UCn2基因转移倾向于减少LV重量，并且LV与体重的比率降低(降低发12％，p＝0.01)。

应激、炎症和组织损伤的标记物(下表6)。使用RT-PCR检查LV应激、炎症和组织损伤的若干标记物的表达。HF改变了这些基因中大多数的表达(表6)。增加的UCn2表达不影响与HF有关的改变。然而，在正常小鼠中，增加的UCn2表达与ANF(p＝0.007)、BNP(p＝0.01)、β-MyHC和α-SK-肌动蛋白(p＝0.03)的降低的表达有关。

LV和肝组织学。肝和LV样品的苏木精和伊红染色未显示出组差异的迹象(数据未显示)。马森三色染料染色未揭示肝中纤维化的组差异(p＝0.79)。

讨论

本研究证实单次静脉内注射AAV8.UCn2增加衰竭心脏的功能，从而证实静脉内递送编码具有有益旁分泌作用的肽的长期表达载体以治疗心力衰竭的可行性和有效性。

心脏功能的两种量度确认在将AAV8.UCn2静脉内递送到具有严重功能障碍性左心室的动物之后5周增加的LV功能。超声心动描记术显示LV射血分数的增加以及LV容积的降低(表1)。其次，UCn2基因转移增加了峰值LV+dP/dt，指示增强的LV收缩功能，并且降低了LV-dP/dt，指示增强的LV舒张功能(表3，图15)。

尽管LV EF的绝对改变度仅为8个百分比单位(HF：12±1％；HF+UCn2:20±4％)，但相对增加为67％。小的绝对改变反映了大的梗塞大小—两组中的平均预随机化LV EF≤20％。尽管有此类大的梗塞，但UCn2基因转移减弱了LV室扩张并且增加了EF，而盐水治疗小鼠显示渐进的LV室扩张以及LV EF的进一步恶化。不会期望UCn2基因转移治愈与占几乎整个LV游离壁的此类大面积瘢痕有关的问题。UCn2基因转移的心脏益处将被预期限于LV的活性部分，其在现行模型中，代表了室间隔。这种情况下的射血分数可能低估对LV功能的益处，尤其是因为我们在射血期间观测到梗塞壁的运动障碍。使用峰值LV+dP/dt评估LV收缩功能揭示通过UCn2基因转移所赋予的LV功能的更大的绝对增加—峰值+LV dP/dt的3129mmHg/sec的增加以及峰值-dP/dt的1857mmHg/sec的增加。这些代表峰值+LV dP/dt的2倍增加以及峰值-dP/dt的1.6倍增加。临床心力衰竭中峰值LV+dP/dt的加倍将使LV收缩功能正常化^37,38。

在正常小鼠(27)或患有CHF的小鼠中，处于未服镇静剂状态下的心率和血压不受静脉内递送AAV8.UCn2影响，尽管存在持续的高水平转基因UCn2，如现行研究中所示。类似地，在UCn2和顶压素(stresscopin)(类似于UCn3)的肽输注的临床试验中，心率-血压乘积不变(9-11)。因此，不会预期与UCn2基因转移有关的心脏代谢需求的增加，而是必须进行更直接的代谢研究以肯定地了解这种情形。

本研究集中于在严重受损且衰竭的心脏中静脉内递送AAV8.UCn2的可行性和生理学结果，并且我们发现显著的积极作用。虽然不是本研究的主要焦点，但也对UCn2基因转移诱发有益的生理变化的机制进行了检查。

例如，我们发现UCn2基因转移与以下有关：a)从HF小鼠分离的心肌细胞中增加的峰值收缩Ca²⁺瞬变幅度和增加的Ca+下降速率(图16A-16D)；以及b)增加的SERCA2a表达(图16E和16F)，如我们先前在具有正常心脏的小鼠中所报道²⁷。增加的LV SERCA2a表达提供了LV收缩功能和舒张将被增加的机制，如所观测到的(图15)。SERCA2a使细胞溶质Ca²⁺返回到肌质网。增加量的SERCA2a将被预期产生更快速的细胞溶质Ca²⁺下降，这是我们所发现的(图16C和16D)，并且因此增加LV下降速率(LV-dP/dt)，这也是我们所发现的(图15B)。

另外，我们发现另外两种蛋白质的LV表达的改变，这两种蛋白质可能在所观测到的UCn2基因转移对衰竭LV的功能的有益作用方面具有机制重要性：Ca²⁺/钙调蛋白依赖性激酶II(CaMKII)的降低的Thr286磷酸化以及心肌球蛋白轻链激酶(cMLCK)的增加的LV表达(图4)。CaMKIIThr286磷酸化。我们的数据显示UCn2基因转移与CaMKII的降低的Thr286磷酸化有关(图17C)。CaMKII表达和激活是心脏功能的重要决定因素³⁹。例如，CaMKII的心脏定向表达导致小鼠的心力衰竭⁴⁰。其它已显示小鼠中MI诱导的心力衰竭中增加的CaMKII活性和表达⁴¹。这些发现的临床相关性最近通过证实抑制LV CaMKII增加衰竭的人心脏的功能得以证实⁴²。尽管我们推测CaMKII的降低的Thr286磷酸化可能在所观测到的LV功能的增加方面在机制上是重要的，但我们不能确定增加的UCn2降低Thr286CaMKII磷酸化的途径，这将需要在正在进行的培养的心肌细胞中进行集中研究。心肌球蛋白轻链激酶(cMLCK)。我们发现了与UCn2基因转移有关的增加的cMLCK表达(图17D)。cMLCK对心肌球蛋白轻链2v的磷酸化增加了心肌细胞中的横桥募集速率并且影响了收缩功能^43,44。在MI诱导的心力衰竭的情况下，增加的cMLCK水平与增加的LV功能有关⁴⁵。相比之下，缺失cMLCK降低心脏性能⁴⁶。遗憾的是，没有抗体可用于评估肌球蛋白轻链2v磷酸化，因此在本研究中与UCn2基因转移有关的cMLCK的增加的生物重要性必定仍然是推测的。

UCn2基因转移与峰值LV压力上升速率的加倍(LV+dP/dt；表3和图15)有关。通过评价LV尺寸和功能来支持该发现，所述评价是通过超声心动描记术(表2)、增强的Ca²⁺处置(图3)和被预测增加收缩功能(包括增加的SERCA2a蛋白质表达)(图16和图17)的LV的信号转导变化实现的。由于这些发现的一致性(从分离的心肌细胞反映到体内生理机能)，因此我们较少关注LV中的BNP和ANF mRNA不存在组差异(表6)。可能LA中的血浆水平或BNP/ANF表达会揭示LV mRNA水平未获得的组差异。还有可能的是，尽管LV收缩功能增加，但存在足够持续的心室扩张—由于整个LV游离壁的梗塞—以提供对ANF和BNP表达的不断刺激。

我们未发现肺重量或肝重量的组差异(表5)。与正常小鼠(27)相比，患有心力衰竭的小鼠中的肝重量没有增加，因此尽管发生重度左心室(LV)衰竭，但没有肝充血。这是否是鼠中MI诱导的CHF所特有的是未知的。相对于正常年龄匹配小鼠(27)，肺重量增加了23％，但未显示组差异。我们推测，尽管通过UCn2基因转移使LV收缩功能(峰值+dP/dt)加倍(表3和图15)，但在治疗之后5周可能存在持续的左侧充血。

临床应用。静脉内递送AAV8使得能够转染许多器官并且在肝、骨骼肌和心脏中尤其有效⁴⁸。这些器官，由于它们包含巨大量的组织且因而可以释放丰富的转基因UCn2，因此将使得我们能够降低载体剂量。实际上，低10倍的载体剂量(5x 10¹⁰gc/小鼠或2x 10¹²gc/kg)在增加LV+dP/dt(27)方面仍然有效。在患有血友病B的受试者的临床试验中经静脉内安全且有效地递送了2x 10¹²gc/kg剂量的编码人IX因子的AAV8²。

在将我们的发现转变为临床应用时所应考虑的另一特征是使用受调节的表达系统^5,6^,9，它将使得能够随意开启或关闭UCn2表达。我们已使用四环素和雷帕霉素调节系统设计此类AAV8载体并且正在对这些受调节的表达载体进行临床前研究。

人中的LV Ca²⁺处置不同于小鼠中的LV Ca²⁺处置⁴⁷，但在患有HF的患者中进行UCn2或顶压素(类似于UCn3)的肽输注增加LV功能(9-11)。这是否是通过Ca²⁺处置是未知的，因为尚未在人中进行UCn2肽输注之前和之后的心肌细胞或心肌中评估Ca²⁺瞬变和Ca²⁺处置蛋白质。

最后，既然我们已证实UCn2基因转移增加重度衰竭心脏的功能，那么对于确定该作用持续多久以及它是否降低死亡率将是重要的。计划此类使用具有较好长期存活的不太严重的CHF模型的研究。

这些数据证实单次静脉内注射AAV8.UCn2增加重度衰竭心脏的收缩和舒张功能。全身递送所述载体确保所述转基因在心脏中表达，而且还连续地释放到循环中，从而提供原本会不可能的持续益处。基因转移与静脉内输注旁分泌作用肽相比的的其它优点包括降低基于导管的感染、无需住院和降低成本。

附图说明-实施例2

图14.AAV8.CBA.UCn2图谱和实验方案

A.AAV8.CBA.UCn2载体图谱：ITR，反向末端重复；SVpA，来自SV40病毒基因组的聚腺苷酸；UCn2，尿皮质素-2；CBA，鸡β-肌动蛋白启动子；CMV.en，人巨细胞病毒增强子

B.实验方案。使正常小鼠经受心肌梗塞(MI，通过近端左冠状动脉结扎)以诱导HF，这是在MI之后3周通过超声心动描记术评估的。然后将EF<25％的小鼠随机分组以接受AAV8.UCn2(5x 10¹¹gc，静脉内)或静脉内盐水。5周后使用超声心动描记术来评估LV大小和功能。进行体内生理学研究以评价LV压力上升速率(LV+dP/dt)和LV压力衰减速率(LV-dP/dt)，以评估LV收缩和舒张功能。LV的横截面(中乳头水平)显示梗塞是广泛的，包含大部分的LV游离壁，仅室间隔幸免。在对组治疗不知情的情况下进行数据获取和分析。

图15.体内LV功能

A和B.在AAV8.UCn2(5x 10¹¹gc，静脉内)或盐水(HF)之后5周，进行体内研究以测量LV压力上升速率(LV+dP/dt；A)和LV压力衰减(LV-dP/dt；B)。在基因转移之后5周，AAV8.UCn2增加LV+dP/dt和LV-dP/dt，指示UCn2基因转移增加LV收缩功能。

C和D.心率倾向于更高(D)。UCn2基因转移使LV发展压增加(C)。在不了解组身份的情况下进行研究。

P值来自学生t检验(不成对的，双尾)。数据表示平均值±SE，并且条形中的数字表示组大小。

图16.来自患有心力衰竭(HF)的小鼠的心肌细胞中的细胞溶质Ca ²⁺ 瞬变

在静脉内AAV8.UCn2(HF+UCn2)或静脉内盐水之后5w。A和B.来自HF+UCn2小鼠的心肌细胞中释放的基线Ca²⁺(收缩-舒张Ca²⁺)增加(p＝0.0001)。A.来自每组中一个心脏的代表性Indo-1Ca²⁺瞬变记录显示在UCn2基因转移之后5周从患有心力衰竭的小鼠分离的心肌细胞中增加的峰值Ca²⁺。B.显示来自每组3只小鼠的总结数据。C和D.在UCn2基因转移之后5周，在来自患有心力衰竭的小鼠的心肌细胞中达到Ca²⁺下降的时间(t_1/2，τ)减少。

C.来自每组中一个心脏的心肌细胞的代表性归一化Ca²⁺瞬变。D.显示来自每组3只小鼠的总结数据。对于A和C，每条曲线是来自每组的一个心脏的30个心肌细胞的平均值。对于B和D，来自每组3只动物的总结数据包括对144个个体心肌细胞(86，盐水；60，AAV8.UCn2)的分析。对于B和D，条形表示平均值+SE；条形中的数字表示心肌细胞数；条形上方的数字指示来自学生t检验(不成对的，双尾)的p值。

E.免疫印迹法数据(下图)的总结(上图)指示UCn2基因转移增加来自正常小鼠以及来自患有心力衰竭的小鼠的LV中的SERCA2a蛋白质。受磷蛋白(PLB)和肌钙蛋白I(TnI)的表达和磷酸化不受影响。条形表示平均值+SE；条形中的数字表示组大小；条形上方的数字来自学生t检验(不成对的，双尾，相对于对照)。

图17.心肌细胞cAMP-PKA信号转导。

从患有心力衰竭(HF)的小鼠以及从已接受AAV8.UCn2(UCn2)的患有HF的小鼠)获得LV样品(A、C、D)或心肌细胞(B)。在未刺激的(基线)状态下以及在用异丙肾上腺素(Iso,10μ μM,10min)刺激和在单独的实验中用NKH477(NKH,10μ μM,10min)(一种独立于β-肾上腺素能受体刺激腺苷酸环化酶的水溶性福司柯林类似物)刺激之后评估环AMP和PKA活性。条形中的数字表示组大小。

A.cAMP产生：未见基线、Iso或NKH477-刺激的cAMP产生的组差异。

B.PKA活性：未见基线、Iso或NKH477-刺激的条件的组差异。

C.CamK II表达和磷酸化：UCn2基因转移与CamK II的降低的Thr286磷酸化有关(左图，归一化为GAPDH)。总CamK II不变。

D.心肌球蛋白轻链激酶：UCn2基因转移与增加的心肌球蛋白轻链激酶(cMLCK)蛋白质有关(左图，归一化为GAPDH)。

在所有图中，条形表示平均值+SE；条形中的数字表示组大小；条形上方的数字来自学生t检验(不成对的，双尾，相对于对照组)。

表4.引物

参考文献-实施例1

1.Gao MH,Lai NC,Miyanohara A,Schilling JM,Suarez J,Tang T,Guo T,TangR,Parikh J,Giamouridis D,Dillmann WH,Patel HH,Roth DM,Dalton ND,HammondHK.Intravenous adeno-associated virus serotype 8encoding urocortin-2providessustained augmentation of left ventricular function in mice.24:777-7785,2013

2.Robertson RP.Islet transplantation a decade later and strategiesfor filling a half-full glass.Diabetes 2010；59:1285-1291

3.Callejas D,Mann CJ,Ayuso E,Lage R,Grifoll I,Roca C,Andaluz A,Ruiz-de Gopegui R,Montané J,S,Ferre T,Haurigot V,Zhou S,Ruberte J,MingozziF,High KA,Garcia F,Bosch F.Treatment of diabetes and long-term survival afterinsulin and glucokinase gene therapy.Diabetes 2013；62:1718-1729

4.Gaddy DF,Riedel MJ,Pejawar-Gaddy S,Kieffer TJ,Robbins PD.In vivoexpression of HGF/NK1 and GLP-1 From dsAAV vectors enhances pancreaticβ-cellproliferation and improves pathology in the db/db mouse model ofdiabetes.Diabetes 2010；59:3108-3116

5.Grines CL,Watkins MW,Helmer G,Penny W,Brinker J,Marmur JD,West A,Rade JJ,Marratt P,Hammond HK,Engler RL.Angiogenic gene therapy(AGENT)trial inpatients with stable angina pectoris.Circulation 2002；105:1291-1297

6.AC6 Gene Transfer for CHF,ClinicalTrials.gov NCT00787059

7.Marsh SA,Dell’Italia LJ,Chatham JC.Interaction of diet and diabeteson cardiovascular function in rats.Am J Physiol Heart Circ Physiol 2009；296:H282-H292

8.Lai NC,Tang T,Gao MH,Saito M,Takahashi T,Roth DM,HammondHK.Activation of cardiac adenylyl cyclase expression increases function ofthe failing ischemic heart in mice.J Am Coll Cardiol 2008；51:1490-1497

9.Gao MH,Bayat H,Roth DM,Yao Zhou J,Drumm J,Burhan J,HammondHK.Controlled expression of cardiac-directed adenylylcyclase type VI providesincreased contractile function.Cardiovasc Res 2002；56:197-204

10.Tang T,Hammond HK,Firth A,Yang Y,Gao MH,Yuan JXJ,Lai NC.Adenylylcyclase 6improves calcium uptake and LV function in aged heart.J Am CollCardiol 2011；57:1846-1855

11.Lai NC,Tang T,Gao MH,Saito M,Miyanohara A,Hammond HK.Improvedfunction of the failing rat heart by regulated expression of insulin-likegrowth factor I via intramuscular gene transfer.Hum Gene Ther 2012；23:255-261

12.Gao MH,Lai NC,Miyanohara A,Suarez J,Giamouridis D,TheodoreP.Ciaraldi TP,Schenk S,Hammond HK.Intravenous adeno-associated virus serotype8 encoding urocortin-2 normalizes hyperglycemia in type-2 diabetes mellitusin mice(Submitted)

13.Gao MH,Lai NC,Giamouridis D,Miyanohara A,Suarez J,Parikh J,Hightower S,Guo T,Dillmann WH,Hammond HK.Intravenous AAV8encoding urocortin2increases function of the failing heart in mice(Submitted)

14.Perrin MH,Vale WW.Corticotropin releasing factor receptors andtheir ligand family.Ann N Y Acad Sci.1999；885:312-328.PMID:10816663

15.Davis ME,Pemberton CJ,Yandle TG等人Urocortin 2infusion in humanheart failure.Eur Heart J 2007；28:2589-2597

16.Gheorghiade M,Greene SJ,Ponikowski P,Maggioni AP,Korewicki J,Macarie C,Metra M,Grzybowski J,Bubenek-Turconi SI,Radziszewski W,Olson A,Bueno OF,Ghosh A,Deckelbaum LI,Li LY,Patel AR,Koester A,KonstamMA.Haemodynamic effects,safety,and pharmacokinetics of human stresscopin inheart failure with reduced ejection fraction.Eur J Heart Fail 2013；6:679-689.

17.Nathwani AC,Tuddenham EG,Rangarajan S等人Adenovirus-associatedvirus vector-mediated gene transfer in hemophilia B.N Engl J Med 2011；365:2357-2365

18.Flotte TR,Trapnell BC,Humphries M,Carey B,Calcedo R,Rouhani F,Campbell-Thompson M,Yachnis AT,Sandhaus RA,McElvaney NG,Mueller C,Messina LM,Wilson JM,Brantly M,Knop DR,Ye GJ,Chulay JD.Phase 2clinical trial of arecombinant adeno-associated viral vector expressing alpha1-antitrypsin:interim results.Hum Gene Ther 2011；22:1239-1247.PMCID:PMC3205788

19.Nathwani AC,Rosales C,McIntosh J,Rastegarlari G,Nathwani D,Raj D(and 18others).Long-term safety and efficacy following systemicadministration of a self-complementary AAV vector encoding human FIXpseudotyped with serotype 5and 8capsid proteins.Mol Ther 2011；19:876-885.PMCID:PMC3098629

20.Rivera VM,Gao GP,Grant RL,Schnell MA,Zoltick PW,Rozamus LWClackson T,Wilson JM.Long-term pharmacologically regulated expression oferythropoietin in primates following AAV-mediated gene transfer.Blood 2005；105:1424-1430.PMID:15507527

21.Lai NC,Tang T,Gao MH,Saito M,Miyanohara A,Hammond HK.Improvedfunction of the failing rat heart by regulated expression of insulin-likegrowth factor I via intramuscular gene transfer.Hum Gene Ther 2012；23:255-261.PMID:22017392

22.Mingozzi F,Meulenberg JJ,Hui DJ,Basner-Tschakarjan E,Hasbrouck NC,Edmonson SA,Hutnick NA,Betts MR,Kastelein JJ,Stroes ES,High KA.AAV-1-mediatedgene transfer to skeletal muscle in humans results in dose-dependentactivation of capsid-specific T cells.Blood 2009；114:2077-2086.PMCID:PMC2744569

23.Hildinger M,Auricchio A,Gao G,Wang L,Chirmule N,Wilson JM.Hybridvectors based on adeno-associated virus serotypes 2 and 5 for muscle-directedgene transfer.J Virol 2001；75:6199-6203.PMCID:PMC114336

24.Fang H,Lai NC,Gao MH,Miyanohara A,Roth DM,Tang T,HammondHK.Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods forcardiac gene transfer.Hum Gene Ther Methods 2012；23:234-241.PMID:22966786

25.Boutin S,Monteilhet V,Veron P,Leborgne C,Benveniste O,Montus MF,Masurier C.Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno-associated virus(AAV)types 1,2,5,6,8,and 9 in the healthy population:implications for gene therapy using AAV vectors.Hum Gene Ther 21:704-712,2010

26.Everett RS,Evans HK,Hodges BL,Ding EY,Serra DM,AmalfitanoA.Strain-specific rate of shutdown of CMV enhancer activity in murine liverconfirmed by use of persistent [E1(-),E2b(-)]adenoviral vectors.Virology2004；325:96-105.PMID:15231389

27.Stieger K,Belbellaa B,Le Guiner C,Moullier P,Rolling F.In vivogene regulation using tetracycline-regulatable systems.Adv Drug Deliv Rev2009；61:527-541.PMID:19394373

28.Grines CL,Watkins MW,Helmer G,Penny W,Brinker J,Marmur JD,West A,Rade JJ,Marratt P,Hammond HK,Engler RL.Angiogenic gene therapy(AGENT)trial inpatients with stable angina pectoris.Circulation 2002；105:1291-1297

29.AC6 Gene Transfer for CHF,ClinicalTrials.gov NCT00787059

30.Lai NC,Tang T,Gao MH,Saito M,Takahashi T,Roth DM,HammondHK.Activation of cardiac adenylyl cyclase expression increases function ofthe failing ischemic heart in mice.J Am Coll Cardiol 2008；51:1490-1497

31.Gao MH,Bayat H,Roth DM,Yao Zhou J,Drumm J,Burhan J,HammondHK.Controlled expression of cardiac-directed adenylylcyclase type VI providesincreased contractile function.Cardiovasc Res 2002；56:197-204

32.Tang T,Hammond HK,Firth A,Yang Y,Gao MH,Yuan JXJ,Lai NC.Adenylylcyclase 6improves calcium uptake and LV function in aged heart.J Am CollCardiol 2011；57:1846-1855

33.Lai NC,Tang T,Gao MH,Saito M,Miyanohara A,Hammond HK.Improvedfunction of the failing rat heart by regulated expression of insulin-likegrowth factor I via intramuscular gene transfer.Hum Gene Ther 2012；23:255-261

34.Marsh SA,Dell’Italia LJ,Chatham JC.Interaction of diet anddiabetes on cardiovascular function in rats.Am J Physiol Heart Circ Physiol2009；296:H282-H292

35.Nemoto O,Kawaguchi M,Yaoita H,Miyake K,Maehara K,Maruyama Y.Leftventricular dysfunction and remodeling in streptozotocin-induced diabeticrats.Circ J 2006；70:327-334

36.Robertson RP.Islet transplantation a decade later and strategiesfor filling a half-full glass.Diabetes 2010；59:1285-1291

37.Callejas D,Mann CJ,Ayuso E,Lage R,Grifoll I,Roca C,Andaluz A,Ruiz-de Gopegui R,MontanéJ,S,Ferre T,Haurigot V,Zhou S,Ruberte J,Mingozzi F,High KA,Garcia F,Bosch F.Treatment of diabetes and long-term survival afterinsulin and glucokinase gene therapy.Diabetes 2013；62:1718-1729

Gaddy DF,Riedel MJ,Pejawar-Gaddy S,Kieffer TJ,Robbins PD.In vivoexpression of HGF/NK1and GLP-1.From dsAAV vectors enhances pancreaticβ-cellproliferation and improves pathology in the db/db mouse model ofdiabetes.Diabetes 2010；59:3108-3116

参考文献-实施例2

1.Roger V.L.,Go A.S.,Lloyd-Jones D.M.等人(2012).Heart disease andstroke statistics—2012update:a report from the American HeartAssociation.Circulation 125,e2-e220.

2.Nathwani A.C.,Tuddenham E.G.D.,Rangarajan S.等人(2011).Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophiliaB.N.Engl.J.Med.365,2357-2365.

3.Buchlis G.,Podsakoff G.M.,Radu A.等人(2012).Factor IX expression inskeletal muscle of a severe hemophilia B patient 10years after AAV-mediatedgene transfer.Blood 119,3038-3041.

4.Flotte T.R.,Trapnell B.C.,Humphries M.等人(2011).Phase 2clinicaltrial of a recombinant adeno-associated viral vector expressingα1-antitrypsin:interim results.Hum.Gene Ther.22,1239-1247.

5.Rivera V.M.,Ye X.,Courage N.L.等人(1999).Long-term regulatedexpression of growth hormone in mice after intramuscular genetransfer.Proc.Natl.Acad.Sci.96,8657-8662.

6.Lai N.C.,Tang T.,Gao M.H.等人(2012).Improved function of thefailing rat heart by regulated expression of insulin-like growth factor I viaintramuscular gene transfer.Hum.Gene Ther.23,255-261

7.Mitrovic V.,Seferovic P.M.,Simeunovic D.等人(2006).Haemodynamic andclinical effects of ularitide in decompensated heart failure.Eur.Heart J.27,2823-32.

8.Teerlink J.R.,Cotter G.,Davison B.A.等人(2013).Serelaxin,recombinant human relaxin-2,for treatment of acute heart failure(RELAX-AHF):arandomised,placebo-controlled trial.Lancet 381,29-39.

9.Chan W.Y.,Frampton C.M.,Crozier I.G.等人(2013).Urocortin-2infusionin acute decompensated heart failure:findings from the UNICORN study(urocortin-2in the treatment of acute heart failure as an adjunct overconventional therapy).J.Am.Coll.Cardiol.Heart Fail.；1:433-441.

10.Davis M.E.,Pemberton C.J.,Yandle T.G.(2007).Urocortin 2infusion inhuman heart failure.Eur.Heart J.28,2589-2597.

11.Gheorghiade M.,Greene S.J.,Ponikowski P.等人(2013).Haemodynamiceffects,safety,and pharmacokinetics of human stresscopin in heart failurewith reduced ejection fraction.Eur.J.Heart Fail.15,679-689.

12.Wiley K.E.和Davenport A.P.(2004).CRF2receptors are highlyexpressed in the human cardiovascular system and their cognate ligandsurocortins 2and 3are potent vasodilators.Br.J.Pharmacol.143,508-514.

13.Davidson S.M.和Yellon D.M.(2009).Urocortin:a protective peptidethat targets both the myocardium and vasculature.Pharmacol.Rep.61,172-182.

14.Davidson S_.M.,Rybka A.E.和Townsend P.A.(2009).The powerfulcardioprotective effects of urocortin and the corticotropin releasing hormone(CRH)family.Biochem.Pharmacol.77,141-150.

15.Bale T.L.,Hoshijima M.,Gu Y.等人(2004).The cardiovascularphysiologic actions of urocortin II:acute effects in murine heartfailure.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101,3697-3702.

16.Rademaker M.T.,Charles C.J.,Ellmers L.J.等人(2011).Prolongedurocortin 2administration in experimental heart failure:sustainedhemodynamic,endocrine,and renal effects.Hypertension 57,1136-1144.

17.Rivera V.M.,Gao G.P.,Grant R.L.等人(2005).Long-termpharmacologically regulated expression of erythropoietin in primatesfollowing AAV-mediated gene transfer.Blood 105:1424-1430.

18.Nathwani A.C.,Gray J.T.,McIntosh J.等人(2007).Safe and efficienttransduction of the liver after peripheral vein infusion of self-complementary AAV vector results in stable therapeutic expression of humanFIX in nonhuman primates.Blood.109:1414-1421.

19.Nathwani A.C.,Rosales C.,McIntosh J.等人(2011).Long-term safetyand efficacy following systemic administration of a self-complementary AAVvector encoding human FIX pseudotyped with serotype 5and 8capsidproteins.Mol.Ther.19,876-875.

20.Murrey D.A.,Naughton B.J.,Duncan F.J.等人(2014).Feasibility andsafety of systemic rAAV9-hNAGLU delivery for treating muco-polysaccharidosisIIIB:toxicology,biodistribution,and immunological assessments inprimates.Hum. Gene Ther.Clin.Dev.25,72-84.

21.Mingozzi F,Meulenberg JJ,Hui DJ等人(2009).AAV-1-mediated genetransfer to skeletal muscle in humans results in dose-dependent activation ofcapsid-specific T cells.Blood.114,2077-2086.

22.Manno CS,Pierce GF,Arruda VR等人(2006).Successful transduction ofliver in hemophilia by AAV-Factor IX and limitations imposed by the hostimmune response.Nat.Med.12.342-347.

23.Hildinger M.,Auricchio A.,Gao G.等人(2001).Hybrid vectors based onadeno-associated virus serotypes 2and 5for muscle-directed genetransfer.J.Virol.75,6199-6203.

24.De B.P.,Heguy A.,Hackett N.R.等人(2006).High levels of persistentexpression of α1-antitrypsin mediated by the nonhuman primate serotyperh.10adeno-associated virus despite preexisting immunity to common humanadeno-associated viruses.Mol.Ther.13,67-76.

25.Fang H.,Lai N.C.,Gao M.H.,et al(2102).Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac genetransfer.Hum.Gene Ther.Methods 23,234-241.

26.Boutin S.,Monteilhet V.,Veron P.等人(2010).Prevalence of serum IgGand neutralizing factors against adeno-associated virus(AAV)types 1,2,5,6,8,and 9in the healthy population:implications for gene therapy using AAVvectors.Hum.Gene Ther.21,704-712.

27.Gao M.H.,Lai N.C.,Miyanohara A.等人(2013).Intravenous adeno-associated virus serotype 8encoding urocortin-2provides sustainedaugmentation of left ventricular function in mice.Hum.Gene Ther.24:777-785.

28.Xiao X.,Li J.,Samulski R.J.(1998).Production of high-titerrecombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helperadenovirus.J.Virol.72,2224-2232.

29.Gao G.,Ou G.,Burnham M.S.等人(2000).Purification of recombinantadeno-associated virus vectors by column chromatography and its performancein vivo.Hum.Gene Ther.11,2079-2091.

30.Zolotukhin S.,Potter M.,Zolotukhin I.等人(2002).Production andpurification of serotype 1,2,and 5recombinant adeno-associated viralvectors.Methods 28,158-167.

31.Bayat H.,Swaney J.,Ander A.等人(2002).Progressive heart failureafter myocardial infarction in mice.Basic Res.Cardiol.97,206-213.

32.Lai N.C.,Tang T.,Gao M.H.等人(2008).Activation of cardiac adenylylcyclase expression increases function of the failing ischemic heart inmice.J.Am.Coll.Cardiol.51,1490-1497.

33.Gao M.H.,Lai N.C.,Roth D.M.等人(1999).Adenylylcyclase increasesresponsiveness to catecholamine stimulation in transgenic mice.Circulation99,1618-1622.

34.Suarez J,Scott B,Dillmann WH.(2008)Conditional increase in SERCA2aprotein is able to reverse contractile dysfunction and abnormal calcium fluxin established diabetic cardiomyopathy.Am.J.Physiol.295:R1439-1445.

35.Gao M.H.,Tang T.,Guo T.等人(2008).Adenylyl cyclase type VIincreases Akt activity and phospholamban phosphorylation in cardiacmyocytes.J.Biol.Chem.283,33527-33535.

36.Gao M.H.,Tang T.,Lai N.C.等人(2011).Beneficial effects of adenylylcyclase type 6(AC6)expression persist using a catalytically inactiveAC6mutant.Mol Pharmacol.79,381-388.

37.Bhargava V.,Shabetai R.,R.A.等人(1998).Loss of adrenergiccontrol of the force-frequency relation in heart failure secondary toidiopathic or ischemic cardiomyopathy.Am.J.Cardiol.81,1130-1137.

38.Hare J.M.,Givertz M.M.,Creager M.A.等人(1998).Increasedsensitivity to nitric oxide synthase inhibition in patients with heartfailure:potentiation of beta-adrenergic inotropicresponsiveness.Circulation.97,161-166.

39.Swaminathan P.D.,Purohit A.,Hund T.J.等人(2012).Calmodulin-dependent protein kinase II:linking heart failure and arrhythmias.CircResearch 110,1661-1677.

40.Zhang T.,Maier L.S.,Dalton N.D.等人(2003).The delta C isoform ofCaMKII is activated in cardiac hypertrophy and induces dilated cardiomyopathyand heart failure.Circ.Res.92,912-919.

41.He B.J.,Joiner M.L.,Singh M.V.等人(2011).Oxidation of CaMKIIdetermines the cardiotoxic effects of aldosterone.Nat.Med.17,1610-1618.

42.Sossalla S.,Fluschnik N.,Schotola H.等人(2010).Inhibition ofelevated Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II improves contractilityin human failing myocardium.Circ.Res.107,1150-1161.

43.Seguchi O.,Seguchi O.,Takashima S等人(2007).Acardiac myosin lightchain kinase regulates sarcomere assembly in the vertebrateheart.J.Clin.Invest.117:2812-2824.

44.Chan J.Y.,Takeda M.,Briggs L.E.等人(2008).Identification ofcardiac-specific myosin light chain kinase.Circ.Res.102,571-580.

45.Gu X.,Liu X.,Xu D.等人(2010).Cardiac functional improvement inrats with myocardial infarction by up-regulating cardiac myosin light chainkinase with neuregulin.Cardiovasc.Res.88,334-343.

46.Ding P.,Huang J.,Battiprolu P.K.等人(2010).Cardiac myosin lightchain kinase is necessary for myosin regulatory light chain phosphorylationand cardiac performance in vivo.J.Biol.Chem.285,40819-40829.

47.Bers D.M.(2002).Cardiac excitation-contraction coupling.Nature；415:198-205

48.Wang Z.,Zhu T.等人(2015).Adeno-associated virus serotype8efficiently delivers genes to muscle and heart.Nat.Biotechnol.23,321-328.

已经描述了本发明的多个实施方案。然而，应当理解，可在不脱离本发明的精神和范围的前提下作出各种修改。因此，其它实施方案在所附权利要求书的范围内。

序列表

<110> 加利福尼亚大学董事会

<120> 编码尿皮质素-2和相关基因的病毒载体的全身递送以治疗糖尿病相关性心脏功能障碍和充血性心力衰竭

<130> 0321.119397WO1/ SD2014-237-3PCT

<140> 待指派

<141> 2015-04-03

<150> 61/974,662

<151> 2014-04-03

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成寡核苷酸

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<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 31

cttctgcaac tccgacatcg 20

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 32

cctgtcagca ggtactgg 18

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 33

caaggatatt cagtatgtct acacg 25

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 34

ctggtggtag tgatgattca gg 22

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 35

actcctatcc ccaccttcca 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 36

aagatccgta ggaggccaat 20

Claims

1.一种用于在个体或患者中治疗、改善或防止(预防)、减缓其进程或逆转：充血性心力衰竭(CHF)；2型糖尿病(T2DM)和充血性心力衰竭(CHF)；或2型糖尿病(T2DM)中的糖尿病相关性心脏功能障碍的方法，

所述方法包括：

(a)(i)提供操作性地连接到转录调节序列的编码尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸或基因；或其中已含有编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因、或表达尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸、转录物或信使的表达运载体、载体、重组病毒或等同物，并且所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物能够在细胞中或体内表达所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、基因、转录物或信使；和

从而在所述个体或患者中治疗、改善或防止(预防)所述充血性心力衰竭(CHF)；所述2型糖尿病(T2DM)和充血性心力衰竭(CHF)；或2型糖尿病(T2DM)中的所述糖尿病相关性心脏功能障碍，

腺相关病毒(AAV)、慢病毒载体或腺病毒载体，

AAV血清型AAV5、AAV6、AAV8或AAV9，

来源于恒河猴的AAV或来源于恒河猴的AAV AAVrh.10hCLN2，

AAV衣壳突变体或AAV杂合体血清型，

嗜器官性AAV，任选地嗜肝性AAV或嗜骨骼肌性AAV，

(c)(a)的方法，其中所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、基因、转录物或信使操作性地连接到受调节的或可诱导的转录调节序列；

其中任选地，转录和/或翻译的正调控物(激活子)和/或负调控物(阻遏子)可操作地连接到所述编码尿皮质素2/或尿皮质素3多肽的核酸、基因、转录物或信使；

(e)(a)到(d)中任一项的方法，其中向有需要的个体或患者施用操作性地连接到转录调节序列的所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸、基因、转录物或信使、或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物导致尿皮质素2和/或尿皮质素3蛋白质被释放到血流或周身循环中，或所述尿皮质素2和/或尿皮质素3蛋白质在所述细胞中的增加或持续的表达，

其中任选地，所述尿皮质素2和/或尿皮质素3蛋白质的所述释放、或增加或持续的表达依赖于可诱导的启动子的激活或阻遏子的去阻遏，所述可诱导的启动子或阻遏子可操作地连接到所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸、基因、转录物或信使；或

(f)(a)到(e)中任一项的方法，其中对体内增加的尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽水平有响应的疾病或病况是心脏收缩功能障碍；充血性心力衰竭(CHF)；心脏纤维化；心肌细胞疾病、功能障碍或细胞凋亡；肺动脉高压；心脏、皮肤、肝脏、肺、肌肉、神经、脑或肾脏的疾病；或血友病或血友病B。

2.根据权利要求1所述的方法，其中：

(a)通过口服、肌内(IM)注射、通过静脉内(IV)注射、通过皮下(SC)或皮内注射、通过鞘内注射、通过动脉内(IA)注射、通过冠状动脉内注射、通过吸入、通过气溶胶或通过生物弹射击粒子递送系统或通过使用“基因枪”、气手枪或HELIOS基因枪(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)，向所述有需要的个体或患者施用或递送操作性地连接到所述转录调节序列的所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因；或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物；或

(b)通过引入到身体内邻接血流或被血流排放的任何组织或流体空间中，向所述有需要的个体或患者施用或递送操作性地连接到所述转录调节序列的所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因；或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物，使得被编码的蛋白质可以从所述组织中的细胞被分泌并释放到所述血流中。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中：

(a)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号诱导所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的表达，或诱导或激活诱导所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的表达的启动子(例如，可操作地连接到所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因)；

(c)向所述个体、患者或受试者施用刺激或信号，所述刺激或信号诱导所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的天然激活子或合成激活子的合成或诱导所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因特异性启动子的天然激活子或合成激活子的合成，

其中任选地，所述天然激活子是内源性转录因子；

(d)(c)的方法，其中所述合成激活子是被设计成特异性地且选择性地开启内源性或外源性靶基因的锌指DNA结合蛋白质，其中任选地，所述内源性靶是基因表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因、或表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的激活子、或操作性地连接到表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的启动子的激活子；

4.根据权利要求5所述的方法，其中诱导所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的表达或诱导操作性地连接到所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因的所述受调节的或可诱导的启动子的表达的所述化学剂或药物是口服抗生素、强力霉素或雷帕霉素；或使用利用强力霉素的tet-调节系统来诱导所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因或其等同物的表达。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物被配制在液体中、凝胶中、水凝胶中、粉末中或水性或盐水制剂中。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物被配制在囊泡中、脂质体中、纳米粒子中或纳米脂质粒子(NLP)中。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物被配制在分离的或培养的细胞中，并且任选地所述细胞是哺乳动物细胞、心细胞、或人细胞、非人灵长类动物细胞、猴细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、豚鼠细胞、兔细胞、仓鼠细胞、山羊细胞、牛科动物细胞、马科动物细胞、绵羊细胞、犬科动物细胞或猫科动物细胞。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物被配制为药物或无菌的。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物与制品、人工器官或植入物被配制或递送，在制品、人工器官或植入物上被配制或递送，或结合制品、人工器官或植入物被配制或递送。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述表达尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸或基因或所述表达运载体、载体、重组病毒或等同物在体外或离体表达尿皮质素2和/或尿皮质素3。

11.一种用于针对尿皮质素2和/或尿皮质素3响应性病理、疾病、病痛或病况治疗、改善或防止(预防)个体或患者的方法，其包括实施根据权利要求1-10中任一项所述的方法。

12.一种用于治疗、改善或防止(预防)糖尿病相关性心脏收缩功能障碍；糖尿病相关性充血性心力衰竭(CHF)；糖尿病相关性心脏纤维化；糖尿病相关性心肌细胞疾病、功能障碍或细胞凋亡；糖尿病相关性肺动脉高压的的方法，其包括实施根据权利要求1-11中任一项所述的方法。

13.一种治疗、改善或防止(预防)患者或个体的糖尿病或糖尿病前期的方法，其包括：

(a)实施根据权利要求1-11中任一项所述的方法；或

(b)向有需要的个体或患者施用尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽，或编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、基因、信使或转录物，

其中任选地，所述尿皮质素2和/或尿皮质素3肽或多肽是分离的、重组的、合成的和/或拟肽的肽或多肽或其变体，

从而治疗、改善或防止(预防)所述患者或个体的所述糖尿病或糖尿病前期。

14.一种治疗、改善或防止(预防)患者或个体的肥胖症的方法，其包括：

(a)实施根据权利要求1-11中任一项所述的方法，或

(b)向有需要的个体或患者施用尿皮质素-2(UCn-2)肽或多肽，或编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、基因、信使或转录物，

其中任选地，所述尿皮质素2和/或尿皮质素3的肽或多肽是分离的、重组的、合成的和/或拟肽的肽或多肽或其变体，

从而治疗、改善或防止(预防)所述患者或个体的所述肥胖症。

15.根据权利要求15-14中任一项所述的方法，其中所述尿皮质素2和/或尿皮质素3尿皮质素-2(UCn-2)的肽或多肽被配制在囊泡、脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子(NLP)中或被配制为囊泡、脂质体、纳米粒子或纳米脂质粒子(NLP)，或被配制用于：口服施用、肌内(IM)注射、静脉内(IV)注射、皮下(SC)或皮内注射、鞘内注射、动脉内(IA)注射、冠状动脉内注射、吸入或通过气溶胶施用。

16.-操作性地连接到转录调节序列的编码尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸或基因；

在制造药物中的用途，或

所述用途是或包括：

治疗、改善或防止或预防患者或个体的肥胖症，

腺相关病毒(AAV)、慢病毒载体或腺病毒载体，

AAV血清型AAV5、AAV6、AAV8或AAV9，

来源于恒河猴的AAV或来源于恒河猴的AAV AAVrh.10hCLN2，

AAV衣壳突变体或AAV杂合体血清型，

嗜器官性AAV，任选地嗜肝性AAV或嗜骨骼肌性AAV，

17.操作性地连接到转录调节序列的编码尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸或基因；或

表达尿皮质素2和/或尿皮质素3多肽的核酸、转录物或信使，以及能够在细胞中或体内表达所述编码尿皮质素2和/或尿皮质素3的核酸、基因、转录物或信使的表达运载体、载体、重组病毒或等同物，

用于制造药物，或

用于：

治疗、改善或防止或预防患者或个体的肥胖症，

腺相关病毒(AAV)、慢病毒载体或腺病毒载体，

AAV血清型AAV5、AAV6、AAV8或AAV9，

来源于恒河猴的AAV或来源于恒河猴的AAV AAVrh.10hCLN2，

AAV衣壳突变体或AAV杂合体血清型，

嗜器官性AAV，任选地嗜肝性AAV或嗜骨骼肌性AAV，

18.一种用于在有需要的受试者或个体中治疗、改善或防止(预防)充血性心力衰竭(CHF)、或充血性心力衰竭(CHF)的症状的方法，其包括：

(b)(a)的方法，其中所述核酸序列在载体中(例如，包含于载体内)；

(c)(b)的方法，其中所述载体是病毒载体；

(d)(c)的方法，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)；

(e)(d)的方法，其中所述AAV是血清型AAV8；

(f)(a)到(e)中任一项的方法，其中所述有需要的受试者或个体患有2型糖尿病(T2DM)；或

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述核酸序列在载体中(例如，包含于载体内)。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述载体是病毒载体。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)。

22.根据权利要求22所述的方法，其中所述AAV是血清型AAV8。

23.根据权利要求18所述的方法，其中所述有需要的受试者或个体患有2型糖尿病(T2DM)。

24.根据权利要求18所述的方法，其中所述核酸序列通过静脉内注射(IV)或经肌内被施用。