CN101056539B

CN101056539B - 调节心脏细胞中的磷酸酶活性

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Publication number: CN101056539B
Application number: CN2005800383370A
Authority: CN
Inventors: R·J·哈亚; F·德尔蒙特; E·克拉尼亚斯
Original assignee: General Hospital Corp; University of Cincinnati
Current assignee: General Hospital Corp; University of Cincinnati
Priority date: 2004-09-09
Filing date: 2005-09-08
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2025-09-08
Also published as: AU2005282352B2; EP1791432A2; US20080125385A1; WO2006029319A2; US9114148B2; US11213534B2; EP1791432A4; US20200054652A1; CA2579519A1; JP2008512484A; US20200171059A1; WO2006029319A3; CN101056539A; AU2005282352A1; US20180296578A1

Abstract

心脏细胞中磷酸酶抑制剂的表达可以用于治疗心脏病，例如，心力衰竭。降低磷酸酶活性可以提高β-肾上腺素能反应性。

Description

调节心脏细胞中的磷酸酶活性

相关申请/专利&引入作为参考

本申请享有2004年9月9日申请的U.S.申请系列No.60/608,214的优先权，因此在此将其内容特意引入作为参考。

本文中所引用的每篇申请和专利以及每篇申请和专利中所引用的每篇文件或参考文献(包括在每篇公开专利的起诉过程中；“申请引用的文件”)，对应于和/或享有这些申请和专利中任一优先权的每篇PCT和外国申请或专利，和每篇申请引用文件中引用或参考的每篇文件，在此特意引入作为参考，并可以用于本发明的实施中。一般的说，本文中所引用的文件或参考文献，在权利要求之前的参考文献列表中，或在正文本身中；并且，这些文件或参考文献(“在此引用的参考文献”)中的每一篇，以及每篇在此引用的参考文献中引用的每篇文件或参考文献(包括任何制造商的规范、说明书等)，在此特意引入作为参考。

潜在政府利益的陈述

根据来自国立健康研究院(National Institutes of Health)的拨款号HL64018、HL52318、HL57623、HL26057、DK36569和HL07382-27，美国政府在本发明中可以具有特定的权力。

背景

可逆的蛋白磷酸化表示了介导外部效应分子和胞内事件之间精细串话的关键信号途径一体化的细胞基础。在心脏中，Ca2+循环和收缩性受到蛋白激酶和磷酸酶活性反应各种次级信使信号之间良好平衡的控制。

根据心脏的泵作用，在fight-or-flight情况的过程中，可以将人心脏输出提高近5倍，且这与camp依赖性蛋白激酶(PKA)的β-肾上腺素激活相关。然后PKA磷酸化一组控制舒张-收缩耦合循环的关键调节Ca2+调控蛋白，如受磷蛋白、理阿诺碱受体、L-型通道Ca2+和肌钙蛋白I(Bers，D.M.，2002Nature；415：198-205)。

尽管蛋白激酶及其含磷蛋白底物，已经充分表征了心脏泵作用的基础强化作用，但对逆转提高的心肌收缩性的蛋白激酶的相似研究，没有得到充分的发展。来自常见基因家族的填塞物，主要的Ser/Thr磷酸酶(1型、2A型和2B型(钙调磷酸酶)，是高度同源的蛋白质(40-50％)(Cohen，P.，1990Phosphoprotein Res；24：230-5)，在控制心脏收缩性和肥大中起着关键作用。已经表明蛋白磷酸酶2A催化亚基的超表达降低心肌功能并导致病理性的心肌肥大(Brewis，N.等，2000Am J Physiol Heart Circ Physiol；279：H1307-18；Gergs，U.等，2004J BiolChem.)。此外，钙调磷酸酶，是一种钙依赖性磷酸酶，通过调节NFAT转录因子活性诱导肥大。5令人感兴趣地，这种磷酸酶的抑制在体内和体外阻滞了心肌肥大(Brewis，N.等，2000；Molkentin，J.D.，1998Cell；93：215-28)。

在人和实验性心力衰竭中，与肌质网(SR)相连的1型磷酸酶的活性显著提高，表明这可能是降低功能、扩张型心肌病和早产儿死亡的起作用因素(Huang等，1999 Circ Res；85：848-55；Sande，J.B.，等，2002Cardiovasc Res；53：382-91；Boknik，P.等，2000NaunynSchmiedebergs Arch Pharmacol；362：222-31；Gupta，R.C.等，1997Circulation；96(增补1)：I-361；Neumann，J.1997J MolCell Cardiol；29：265-72；Carr，A.N.等，2002，Mol Cell Biol；22：4124-35)。然而，β-肾上腺素能反应性中磷酸酶抑制的作用在之前是未知的。

发明概述

特别地，发现了心脏细胞中磷酸酶抑制剂的表达可以用来治疗心脏病，例如，心力衰竭。降低磷酸酶活性可以提高β-肾上腺素能反应性。

因此，一方面中，本公开的特征在于一种方法，包括将调节细胞中磷酸酶活性例如1型磷酸酶活性的试剂给予心脏细胞，例如心肌细胞。心脏细胞可以在体外或在体内。例如，心脏细胞可以在患者的心脏中。该方法可以用于治疗患者，例如患有心脏病的患者，例如心力衰竭。通常，患者是哺乳动物，例如，人或非人哺乳动物。

1型磷酸酶包括，但不限于，PP1cα、PP1cβ、PP1cδ和PP1cγ。

一实施方案中，试剂是包括编码抑制磷酸酶活性例如1型磷酸酶活性的蛋白质序列的核酸。可以以有效降低待治疗细胞中磷酸酶活性和/或提高β-肾上腺素能反应性的含量来给药试剂。

另一实施方案中，试剂是提高内源核酸表达的核酸，该内源核酸编码抑制磷酸酶活性的蛋白质。例如，核酸可以包括编码转录因子的序列，例如工程化的转录因子，如嵌合锌指蛋白。再一实施例中，核酸是整合至内源核酸之中或附近的调节序列，例如，整合至编码磷酸酶抑制剂-1(“I-1”)的基因之中或附近，该内源核酸编码抑制磷酸酶活性的蛋白质。

再一实施方案中，试剂是可以提供基因表达的核酸调节剂的核酸。例如，核酸可以是表达这样的核酸调节剂，例如，dsRNA(例如，siRNA)、反义RNA或核酶的核酸。

可以使用病毒颗粒，例如病毒或病毒样颗粒来递送试剂。病毒颗粒可以源自腺相关病毒、腺病毒或慢病毒。

一实施方案中，通过注射引入病毒颗粒，例如，直接注射至心脏中，例如，直接注射至左心室表面。另一实施方案中，将病毒颗粒引入循环系统的内腔中，例如，引入患者心脏的室或内腔中或心脏的血管中。例如，可以打开心包膜并将化合物注射至心脏中，例如，使用注射器和导管。可以将化合物引入主动脉的内腔中例如主动脉根、引入冠状动脉中或引入心脏的内腔中。可以将病毒颗粒引入冠状动脉中。例如，还可以使用顺行性或逆行性阻塞来限制血流以提高在血管中例如在冠状动脉中的停留时间。

一实施方案中，通过经由皮肤的注射来引入病毒颗粒，例如，从股动脉逆行至冠状动脉。再一实施方案中，例如使用斯滕特固定模引入病毒颗粒。例如，将病毒颗粒涂覆于斯滕特固定模上并将该斯滕特固定模插入血管中，如冠状动脉、外周血管或脑动脉。

一实施方案中，引入病毒颗粒包括例如部分或完全限制通过冠状动脉的血流，将病毒递送系统引入冠状动脉的内腔中，并允许心脏泵动，同时血液的冠状静脉流出得到限制。可以例如通过膨胀至少一个、两个或三个血管成形术扩张气囊来进行通过冠状血管血流的限制。限制通过冠状血管的血流可以持续，例如，至少一分钟、两分钟、三分钟或四分钟。例如可以通过血管成形术扩张气囊内腔的顺行性注射来进行病毒颗粒进入冠状动脉的引入。限制的冠状血管可以是：左前降动脉(LAD)、远端回旋支动脉(LCX)、大冠状静脉(GCV)、心中静脉(MCV)或前心室内静脉(AIV)。可以在冠状血管的缺血预处理后进行病毒颗粒的引入，例如，通过限制血流，例如通过膨胀至少一个、两个或三个血管成形术扩张气囊来进行预处理。冠状血管的缺血预处理可以持续至少一分钟、两分钟、三分钟或四分钟。

一实施方案中，引入病毒颗粒包括限制血液流出心脏的主动脉流，例如部分或全部，将病毒递送系统引入循环系统的内腔中并使心脏泵动，例如，对抗封闭的系统(isovolumically)，同时限制血液的主动脉流出。通过将血流改变方向至冠状动脉来进行血流流出心脏的主动脉流的限制。可以通过夹紧例如夹紧肺动脉来完成血液的主动脉流限制。例如可以使用导管或例如直接注射来进行病毒颗粒的引入。可以通过递送至主动脉根来进行病毒颗粒的引入。

一实施方案中，给药的病毒颗粒数量是，例如，至少1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵或1×10¹⁶单位(例如，基因组或斑形成单位)，或，例如，1×10⁹至1×10¹⁸或1×10¹¹至1×10¹⁶之间。

还可以使用病毒颗粒以外的工具来递送试剂，例如，脂质体或其他非病毒递送载体。

另一方面中，公开的特征在于可以进入细胞的病毒颗粒。该颗粒包括编码非病毒蛋白的核酸，例如，降低磷酸酶活性的蛋白或调节心脏活动的蛋白。病毒颗粒可以是病毒或病毒样颗粒。一实施方案中，病毒颗粒源自腺相关病毒。腺相关病毒是血清型1(AAV1)、血清型2(AAV2)、血清型3(AAV3)、血清型4(AAV4)、血清型5(AAV5)、血清型6(AAV6)、血清型7(AAV7)、血清型8(AAV8)或血清型9(AAV9)。例如，病毒颗粒是修饰的腺相关病毒或重建的病毒或病毒样颗粒，例如，可以感染细胞，例如，肌细胞，例如心肌细胞。

另一实施方案中，病毒颗粒源自慢病毒或腺病毒。

调节心脏活动的蛋白实例包括：调节磷酸酶活性的蛋白(例如，1型磷酸酶抑制剂，例如，I-1)或肌质膜Ca²⁺ATPase(SERCA)，例如，SERCA1(例如，1a或1b)、SERCA2(例如，2a或2b)或SERCA3。

公开的特征还在于包括一剂或多剂在此所述的病毒递送系统的制剂。一剂可以包括，例如，病毒递送系统的1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵或1×10¹⁶单位(例如，基因组或斑形成单位)。一实施方案中，一剂中至多为1×10¹⁹单位的病毒递送系统。制剂可以是无细胞制剂，例如，药物制剂，例如，适于引入患者中的制剂。制剂还可以含有低于10、5、1、0.1或0.001％pfu野生型病毒(例如，可以复制且不包括非病毒核酸序列的病毒)。一实施方案中，制剂无野生型病毒。

公开的特征还在于包括降低例如心肌细胞中磷酸酶活性的试剂的斯滕特固定模。例如，可以将试剂涂覆于斯滕特固定模上。例如，试剂可以在病毒颗粒内并将病毒颗粒涂覆于斯滕特固定模的一个或多个表面上，例如，接触血管的表面。“斯滕特固定模”是为了植入体腔内来防止或抑制内腔闭合而构造的医疗装置。可以构造斯滕特固定模来植入例如血管内，如动脉或其他体腔、孔或导管，如尿道。通常斯滕特固定模由生物相容金属或塑料制得。如在此所用的，“涂覆或含有”试剂的斯滕特固定模意思是含有固定在表面或包含在内的试剂的斯滕特固定模，使得允许将试剂从斯滕特固定模释放出来，因此，将试剂递送至斯滕特固定模附近的组织中。

可以通过将斯滕特固定模植入患者受折磨的血管中来治疗患者。血管是例如冠状动脉，还可以是例如外周动脉或脑动脉。

术语“治疗”意思是以有效改善与疾病相关的病症、症状或参数或防止疾病进展的含量、方式和/或模式来给药试剂，至基本上显著的程度或至本领域技术人员可检测的程度。有效量、方式或模式可以根据患者而改变并可以对患者定制。例如，给药方式可以包括通过病毒或病毒样颗粒的递送。通过防止疾病的进展，治疗可以防止受影响的或诊断的患者中或怀疑患有疾病的患者中疾病的恶化，而且治疗可以防止处于疾病风险中或怀疑患有疾病患者的疾病或疾病症状的发作。

如在此所用的，术语“心脏病”指的是削弱其正常功能的心脏的结构或功能异常。例如，心脏病可以是心力衰竭、缺血、心肌梗塞、充血性心力衰竭、心律不齐、移植排斥等。术语包括特征在于收缩异常、Ca²⁺代谢异常的疾病和特征在于心律不齐的疾病。

术语“心力衰竭”指的是多种疾病中的一种，其中心脏适当泵动来满足身体需要的能力具有缺陷。许多情况中，心力衰竭是心肌细胞舒张-收缩耦合的各种步骤中细胞水平的一种或多种异常的结果。一种这样的异常是SR功能缺陷。

如在此所用的，术语“心脏细胞”指的是以下的细胞：(a)存在于患者中心脏的一部分，(b)体外维持心脏的一部分，(c)心脏组织的一部分或(d)从患者心脏分离的细胞。例如，细胞可以是心肌细胞。

如在此所用的，术语“心脏”指的是存在于患者中的心脏或维持于患者体外的心脏。

如在此所用的，术语“心脏组织”指的是源自患者心脏的组织。

如在此所用的，术语“体细胞基因转移”指的是将基因转移至体细胞中，相对于将基因转移至种系中。

如在此所用的，术语“化合物”指的是使用本发明的方法可以有效地递送至患者心脏的化合物。这样的化合物可以包括，例如，基因、药物、抗生素、酶、化学物质、化学物质的混合物或生物大分子。

如在此所用的，术语“限制血流”指的是基本上阻断通过血管的血流，例如，进入远端主动脉及其分支的血流。例如，至少50％流出心脏的血液得到限制，优选75％和更优选80、90或100％流出心脏的血液得到限制。例如可以用夹子阻塞主动脉和肺动脉来限制血流。

“病毒递送系统”指的是可以将包括非病毒序列的核酸引入哺乳动物细胞中的病毒颗粒，例如，病毒或病毒样颗粒。病毒递送系统自身可以或不可以胜任病毒复制。

将结合本发明的详述来进一步地详细描述本发明的这些和其他特征。

附图简述

可以结合附图来理解通过举例给出的以下详述，但不是将本发明限制于所述的特定实施方案，附图在此引入作为参考。现在通过非限制性实施例和参照附图来描述本发明的各种优选特征和实施方案，其中：

图1A和1B呈现了结果，表明磷酸酶抑制剂-1(“I-1”)磷酸化在衰竭的人心脏中显著降低：(A)9个非衰竭供体(D)和10个衰竭(F)心脏匀浆中I-1的蛋白水平(上图)和磷酸化(中间)的代表性免疫印迹。在相同的印迹中测定了钙调蛋白水平(CSQ，下图)并用作内部控制。(B)人心脏中I-1蛋白水平的定量揭示了没有改变。然而，I-1磷酸化在衰竭的人心脏中显著降低。^＊表示P＜0.05vs.非衰竭供体心脏。

图2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G和2H显示了衰竭人心脏的心肌细胞中组成型活性I-1蛋白的表达结果：(A-D)用直光(左图)或荧光(右图)观察表达(上图)β-半乳糖苷酶-GFP(对照)或(下图)I-1_T35D-GFP的分离的衰竭人肌细胞。成功感染的细胞显示出绿色(右图)。(E)Ad.GFP和(F)Ad.I-1_T35D感染的细胞反应最大浓度异丙基肾上腺素的心肌细胞收缩的代表性痕迹。在100nM异丙基肾上腺素下Ad.GFP和Ad.I-1_T35D感染的细胞中(G)细胞收缩和(H)再次伸长的速率定量。^＊表示P＜0.05。值是3-5个人心脏的至少8-12个细胞的平均。

图3A显示了免疫印迹，描绘了表达的活性抑制剂-1蛋白高于内源抑制剂-1水平～25倍，导致1型磷酸酶活性15％的降低。^＊P＜0.05，每组n＝6。图3B以柱状图的形式显示了来自3个月大的I-1^＊和野生型(WT)中心脏收缩性Langendorff体内测定的压力测量值，表明抑制剂-1心脏呈现出显著提高的压力产生速率(±dP/dt)。图3C以柱状图的形式显示了肌细胞收缩速率的测量值。图3D以柱状图的形式显示了钙瞬变幅度的测量值。^＊P＜0.05v.s.WT和#P＜0.05vs.WT+ISO，每组n＞来自6-8个心脏的30个心肌细胞。

图4A显示了免疫印迹(和相同的柱状图定量)，描绘了SERCA2、受磷蛋白(PLN)、集钙蛋白(CSQ)、二氢吡啶受体(DHPR)、肌钙蛋白I(TnI)和理阿诺碱受体(RYR2)的水平。^＊P＜0.05，各自对于WT和TG，n＝至少5个心脏。图4B显示了免疫印迹(和相同的柱状图定量)，描绘了活性抑制剂-1心脏中Ser16和Thr7的受磷蛋白的磷酸化，以及理阿诺碱受体和肌钙蛋白I的磷酸化(mol Pi/mol RyR)。^＊P＜0.05，对于WT和TG，n＝至少5个心脏。图4C在上图中用图描绘了WT vs.活性抑制剂-1心肌细胞中的电流-电压相关性。下图中，图4C用图描绘了I-1^＊OE心肌细胞中(vs.野生型)L-型Ca²⁺通道的钙依赖性钝化动力学。^＊P＜0.05，n＝每组5个心脏和每组至少25个心肌细胞。

图5A以柱状图的形式显示了主动脉缩窄后6周时野生型vs.转基因小鼠的超声波心动描记测定的结果(Vcf_c，左心室末端收缩和末端舒张直径，和h/r速率)。P＜0.05，n＝每组5只小鼠。图5B以柱状图形式显示了野生型vs.转基因小鼠的测重分析的结果。^＊P＜0.05vs.假手术组，WT缩窄和I-1^＊缩窄心脏之间

n＝每组4-5。图5C显示了柱状图，显示了显微镜水平的野生型vs.转基因小鼠的心脏。

图6A在左图中显示了WT缩窄和I-1^＊缩窄心脏的心脏横截面的代表性图像(100X和40x)。在右图中，图6A以柱状图的形式显示了缩窄WT和I-1^＊心肌细胞的横截面积。^＊P＜0.001vs.假手术；WT缩窄和I-1^＊缩窄心脏之间

每组n＞120个心肌细胞。图6B以柱状图的形式显示了MAP-激酶蛋白的定量免疫印迹结果。^＊P＜0.05，每组n＝4只小鼠。图6C以柱状图的形式显示了定量免疫印迹的结果，描绘了肌质网蛋白(SERCA)、集钙蛋白(CSQ)和受磷蛋白(PLN)的水平以及受磷蛋白和理阿诺碱受体的磷酸化水平。^＊P＜0.05，每组n＝4只小鼠。

图7A以柱状图形式显示了假手术的非衰竭心脏、感染GFP(Ad.GFP)的衰竭心脏和感染活性抑制剂-1(Ad.I-1^＊)的衰竭心脏组中心室内压力的测量值。^＊P＜0.05vs.非衰竭假手术的组，每组n＝7-9只小鼠。图7B以柱状图形式显示了等容舒张系数(tau)的测量值。gP＜0.10vs.非衰竭组，每组n＝7-9只大鼠。图7C显示了心脏左心室压力vs.左心室尺寸环(P-V环)，如通过非衰竭心脏、衰竭+GFP心脏和衰竭+活性抑制剂-1心脏中压电晶体所测定的。每组n＝7-9大鼠。图7D以柱状图形式显示了最大的倒电容(E_max)，源自末端收缩压-尺寸相关性。^＊P＜0.05，每组n＝7-9大鼠。

图8A以柱状图形式显示了衰竭vs.非衰竭心脏组中SERCA2、受磷蛋白(PLN)和心脏理阿诺碱受体(RYR2)水平的定量免疫印迹结果。图8B以柱状图形式显示了衰竭vs.非衰竭心脏组中Ser16和Thr17处受磷蛋白以及Ser2809处理阿诺碱受体的磷酸化水平。图8C以柱状图形式显示了衰竭vs.非衰竭心脏组中MAP-激酶激活(p38、ERK和JNK)的水平。^＊P＜0.05vs.NF和#P＜0.05vs.F+GFP，每组n＝4个心脏。

图9A显示了印迹，描绘了抑制剂-1、受磷蛋白和R_GL的PP1共同免疫沉淀的结果。图9B显示了印迹，描绘了将内源的PKA-磷酸化抑制剂-1(10nM至1000nM)加入PP1免疫沉淀的复合物中的结果，如根据蛋白磷酸酶1的受磷蛋白解离所测量的。(n＝3)

图10以柱状图形式显示了衰竭vs.非衰竭心脏组中CaM-激酶活性。

图11A和11B描绘了核酸序列(SEQ ID NO：1)，GenBank登录号No.NM_006741，编码磷酸酶抑制剂-1(“I-1”)蛋白(SEQ ID NO：2)，GenBank登录号No.NP_006732.2。

详述

磷酸酶活性在心力衰竭中得到了提高。降低心肌细胞中的磷酸酶活性(例如，磷酸酶1活性)可以缓解一种或多种与心力衰竭相关的症状。降低的磷酸酶活性与减弱的β-肾上腺素能反应性相关。

一实施方案中，可以通过抑制1型磷酸酶来降低磷酸酶活性。1型磷酸酶包括但不限于PP1cα、PP1cβ、PP1cδ和PP1cγ。参见Sasaki等(1990)Jpn J Cancer Res.81：1272-1280，在此将其内容引入作为参考。磷酸酶抑制剂-1(或“I-1”)蛋白是1型磷酸酶的内源抑制剂。提高I-1水平或活性可以恢复衰竭人心肌细胞中的β-肾上腺反应性。

特定的实施方案中，可以给予组成型活性的I-1蛋白。在此列举的一个这样的构建体需要I-1cDNA的平截来编码头65个氨基酸并引入核苷酸改变来用天冬氨酸(GTC：Asp³⁵)替代PKA磷酸化位点(GGT：Thr³⁵)，形成组成型活性抑制剂。制备组成型活性抑制剂的另一种方法是用谷氨酸替代天冬氨酸来置换苏氨酸35。这些置换也可以在全长抑制剂分子中形成。表达I-1_T35D的衰竭人心肌细胞在基础条件下呈现正常的收缩功能并将它们的β-肾上腺素功能恢复到正常。因此，抑制剂-1的递送完全恢复了功能并翻转了预先存在心力衰竭情况中的重塑。

还可以使用其它磷酸酶抑制剂和I-1的其他变体。这样其他抑制剂的实例包括磷酸酶抑制剂2；冈田酸或caliculin；和nipp1，这是蛋白磷酸酶1的内源核抑制剂。一实施方案中，磷酸酶抑制剂是蛋白磷酸酶1特异性的。

用于降低磷酸酶活性的其他方法包括给予提高磷酸酶抑制剂例如I-1活性的小分子、给予降低1型磷酸酶活性的小分子、给予降低1型磷酸酶活性或表达的核酸，或给予提高磷酸酶抑制剂活性或表达的核酸。

心力衰竭中的磷酸酶活性

以跳动(beat-to-beat)为基础的心肌功能是受到身体交感紧张高度调节的过程。在很短的时间内，心脏可以通过提高心脏输出反应工作量的增加来支持外周代谢组织的需要。这种提高了心脏变力状态的适应性机制很大部分受到心肌β-受体的儿茶酚胺依赖性激活的控制。在受到刺激或激活时提高了收缩强度的心肌细胞上发现了这些受体。在细胞水平，β-受体的刺激(Koch，W.J.等，2000Annu Rev Physiol；62：237-60)导致cAMP水平的提高、cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)的激活和能量代谢涉及的酶以及关键调节蛋白的磷酸化，招募来调节收缩性和提高中风体积。主要的调节含磷蛋白包括受磷蛋白(PLB)、理阿诺碱受体、L-型Ca²⁺通道、肌钙蛋白I和C-蛋白。

PLB是基础心肌收缩性的主要调节剂并且是结合β受体并提高哺乳动物心脏中心脏细胞收缩强度的β-激动剂收缩和松弛作用的关键调节剂(Brittsan，A.G.等，2003 Circ Res；92：769-76)。PLB的磷酸化减轻了SERCA的抑制，其很大程度上刺激了胞质体钙再次螯合至肌质网(SR)中的速率和含量，增强了心肌的舒张。这种提高的钙循环特征与提高的SR钙含量相关，这允许在随后的收缩过程中释放提高的量子钙。总起来说，这些情况导致提高的收缩和舒张功能。

蛋白磷酸化的提高和提高的心脏功能在有效和高度调节的过程中受到蛋白磷酸酶的逆转。两大类丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，称为1型和2型磷酸酶，调节心肌收缩性能(Neumann，J.等，1997J Mol CellCardiol；29(1)：265-72)。蛋白磷酸酶1(“PP1”)占据显著含量的心肌酶活性，并意味着是调节磷酸酶的关键类别。PP1在很大程度上与膜级分以及糖原颗粒相关且在糖原分解和糖原合成中是重要的。通过大的、非催化靶向亚基来锚定这些部位，这用来提高底物利用率和特异性。此外，这种酶通过两种热和酸稳定性蛋白抑制剂-1和-2来调节。在苏氨酸-35通过PKA磷酸化时，磷酸酶抑制剂-1(“I-1”)是主要的生理调节剂和有效的抑制剂(Endo，S.等，1996Biochemistry；35(16)：5220-8)。PP1的抑制，消除了对抗PKA蛋白磷酸化的作用，导致心脏中β-激动剂反应的扩大(Ahmad，Z.J.1989Biol Chem；264：3859-63；Gupta，R.C.等，1996 Circulation；(增补1)：I-361)。

这种通过蛋白激酶和磷酸酶来微调心脏调节蛋白磷酸化在心力衰竭中变得更重要，因为期望通过β-受体的去敏化降低cMAP水平(Koch，Lefkowitz等，2000)将导致PKA的激活，同时蛋白磷酸酶1的水平和活性得到提高。

适用于体细胞基因转移的病毒载体

治疗性核酸，例如，降低磷酸酶活性的核酸或提供表达的核酸调节剂的核酸(例如，dsRNA、反义RNA或核酶)，例如，如在此所述的，可以引入用作基因转移方案一部分的基因构建体中。方法包括患者基因插入病毒载体中，例如源自逆转录病毒(例如，复制缺陷逆转录病毒)、腺病毒(例如，复制缺陷、第一代或容易消化的、第二代腺病毒)、腺相关病毒(例如，1-6型中的任何一种)、慢病毒和单纯疱疹病毒-1的重组载体，或重组细菌或真核质粒。还可以将病毒载体用于直接转染细胞。递送治疗性核酸的病毒颗粒可以由修饰的病毒制得。修饰的病毒可以包括至少一个病毒序列的改变，例如，一个或多个病毒基因的替换、删除或钝化。

示范性的腺病毒载体包括(Ad.RSV.lacZ)，其包括Rous肉瘤病毒启动子和lacZ报告基因，以及(Ad.CMV.lacZ)，其包括巨细胞病毒启动子和lacZ报告基因。参见，例如，USSN10/914,829。可以用编码蛋白或表达的核酸调节剂的序列来替代lacZ序列。例如WO96/13597、WO97/15679、Miya moto等(2000)Proc NatlAcad SciUSA 97(2)：793-8，和Trapnell等，Curr. Opin.Biotchnol.5(6)：617-625，1994中描述了病毒载体的制备和使用方法。

腺相关病毒是非致病性的人细小病毒，能够位点特异性地整合至染色体19中。Fisher等，Nature Medicine 3(3)：306-312，1997。然而，病毒的复制需要辅助病毒，如腺病毒。Fisher等，Nature Medicine3(3)：306-312，1997。可以用非病毒基因来替代AAV编码片段，且修饰的病毒可以用来感染分裂和非分裂的细胞。Xiao等，J. Virol.70(11)：8098-8108，1996；Kaplitt等，Ann.Thorac.Surg.62：1669-1676，1996。示范性的AAV制备和使用方法描述于Fisher等，NatureMedicine 3(3)：306-312，1997；Xiao等，J.Virol.70(11)：8098-8108，1996；Kaplitt等，Ann.Thorac.Surg.62：1669-1676，1996中。

AAV16是特异性的并在心脏中给予快速表达。例如，USSN10/914,829证明了在大型动物的心脏中使用AAV16的基因转移是有效的并可以导致长效的基因表达。

已经产生了用于产生修饰的AAV颗粒的方法。例如，使生长于培养物中的细胞产生修饰的AAV颗粒。从细胞收集颗粒并纯化。AAV颗粒的示例生产方法包括将三个元件递送至生产者细胞中：1)两侧为AAV ITR序列(例如，调节磷酸酶活性的序列)的目标基因，2)AAV rep和cap基因，和3)辅助病毒蛋白(“辅助功能”)。用于递送头两个的常规方案是通过用含有合适重组基因盒的质粒DNA来转染细胞。通常通过用辅助病毒如腺病毒(Ad)感染细胞来提供辅助功能。(Samulski等，1998；Hauswirth等，2000)。

慢病毒是能够感染非分裂细胞的逆转录病毒的亚群。L.Naldini等报道了基于人免疫缺陷病毒(HIV)的慢病毒载体系统，能够将异种基因序列转导至非增殖性Hela细胞和大鼠成纤维细胞中，以及转导至人初级巨噬细胞和最终分化的神经元中。Science 272，263-267(1996)。US6,521,457描述了基于马传染性贫血病毒的慢病毒载体。US6,428,953描述了其他的慢病毒载体和用于生产慢病毒颗粒的方法。

为了产生慢病毒颗粒和其他病毒颗粒，将编码目标试剂(例如，降低磷酸酶活性的试剂)的核酸可操作地连接包装信号。将核酸包装于表达病毒结构蛋白的细胞中。例如，细胞可以包括编码病毒结构蛋白但缺乏包装信号的核酸。

非病毒方法也是可用的。例如，可以递送质粒DNA，例如，使用阳离子脂质体(lipofectin)或衍生的(例如，缀合抗体的)、聚赖氨酸缀合物、gramacidin S、人造病毒包膜或其他这样的胞内载体，以及在体内进行基因构建体的直接注射或CaPO₄沉淀。

已经成功使用腺病毒(Ad)载体将基因转移至心血管组织中，该病毒载体具有通过巨细胞病毒(CMV)或Rous肉瘤病毒(RSV)启动子驱动的强烈的、非组织特异性基因表达盒。涉及用病毒载体转导心脏细胞来递送血管生成因子如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)的临床试验正在进行中。在动物模型体内已经使用了病毒的主动脉内或冠状内注射。在一个研究中，大鼠中Ad-SERCA2a病毒载体的心脏内注射足以诱导钙操作中的生理改善。参见Miyamoto等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：793-98。腺病毒载体也已经用于体内来表达β2肾上腺素受体(β-AR)(参见Maurice等，1999，J.Clin.Invest.104：21-9和Shah等，2001，Circulation.103：1311)。从囊肿性纤维化研究已知的，对于提高的功能不需要组织中所有细胞的转导。例如，缺乏功能性钠通道的上皮层内少如6-10％细胞的野生型钠通道的表达对于正常的钠离子转运就足够了(Johnson等，1992，Nat.Genet 2：21-5)。将这称为旁观者效应。

启动子可以是，例如，平滑肌特异性启动子，如平滑肌α肌动蛋白启动子、SM22a启动子；心脏特异性启动子，如心脏肌球蛋白启动子(例如，心脏肌球蛋白轻链2v启动子)、肌钙蛋白T启动子或BNP启动子。启动子还可以是，例如，病毒启动子，如CMV启动子。组织特异性启动子已经用来提高心肌基因表达的特异性(Rothmann等，1996，Gene Ther.3：919-26)。

在体外使用培养的大鼠新生儿细胞以及在来自体内的系统中使用大鼠乳头状肌肉浸液证明了通过腺相关病毒(AAV)递送载体心肌细胞基因的效率(Maeda等，1998，J.Mol.Cell.Cardiol.30：1341-8)。报道了来自体内的AAV载体转移接着同系心脏移植获得了高效率标记基因表达(Svesson等，1999，Circulation.99：201-5)。

例如，在US公开的申请2002-0032167中描述了获得具有高度一致性的高水平体内cardiotopic基因转移的方法(平均60-70％的心肌细胞)。病毒载体的其他制备和使用方法描述于WO96/13597、WO96/33281、WO97/15679和Trapnell等，1994，Curr.Opin.Biotechnol.5(6)：617-625；Ardehali等，1995，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.109：716-720；Dalesandro等，1996，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.111：416-422；Sawa等，1995，Circ 92，II479-11482；Lee等，1996，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.111，246-252；Yap等，19996，Circ.94，I-53；和Pellegrini等，1998，Tranpsl.Int.11，373-377。

还可以使用非病毒递送载体给药主体多核苷酸。如在此所用的“非病毒递送载体”(在此也称为“非病毒载体”)意思是包括含有裸露的或稠合的多核苷酸(例如，多核苷酸和阳离子化合物(例如，葡聚糖磷酸盐)的制剂))的化学制剂，以及混合佐剂如病毒颗粒的裸露的或稠合的多核苷酸(即，目标多核苷酸没有包含在病毒颗粒内，而是转化制剂由裸露的多核苷酸和病毒颗粒(例如，腺病毒颗粒)构成)(参见，例如，Curiel等，1992Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.6：247-52)。因此，“非病毒递送载体”可以包括由多核苷酸加上病毒颗粒构成的载体，其中病毒颗粒不含有目标多核苷酸。示例“非病毒递送载体”包括细菌质粒、病毒基因组或其部分，其中待递送的多核苷酸不是壳体化的或包含于病毒颗粒内，和包括部分病毒基因组和部分细菌质粒和/或噬菌体的构建体。术语还包括天然和合成的聚合物和共聚物。术语进一步包括基于脂质的载体。

基于脂质的载体包括阳离子脂质体，如Felgner等公开的(U.S.专利No.5,264,618和5,459,127；PNAS 84：7413-7417，1987；Annals N.Y.Acad.Sci.772：126-139，1995)；它们还可以由中性或负电荷磷脂或其包括人造病毒包膜的混合物构成，如Schreier等所公开的(U.S.专利No.5,252,348和5,776,625)。

非病毒递送载体包括基于聚合物的载体。基于聚合物的载体可以包括天然和合成的聚合物和共聚物。例如，聚合物是生物可降解的，或可以从患者容易地消除。天然产生的聚合物包括多肽和多糖。合成的聚合物包括，但不限于，聚赖氨酸和聚乙撑亚胺(PEI；Boussif等，PNAS 92：7297-7301，1995)，该分子还可以作为稠合剂。这些载体可以溶解、分散或悬浮于分散液体如水、乙醇、盐溶液及其混合物中。多种合成聚合物是本领域已知的并可以使用。

基因治疗构建体的药物制剂可以包括基因递送系统和可接受的稀释剂，或可以包括其中包埋基因递送载体的缓释基质。或者，可以从重组细胞例如逆转录载体完整地产生完整的基因递送系统，药物制剂可以包括一种或多种产生基因递送系统的细胞。然而，通常制剂是无细胞的。制剂通常包括没有中断病毒颗粒将核酸递送至细胞中的能力的物质。

待递送的核酸还可以配制成DNA-或RNA-脂质体复合制剂。这样的复合物包括通过阳离子电荷(静电作用)结合基因材料(DNA或RNA)的脂质混合物。可以用于本发明中的阳离子脂质体包括3θ-[N-(N’，N’-二甲基-氨基乙烷)-氨基甲酰]-胆固醇(DC-Chol)、1，2-二(油酰氧-3-三甲基胺基丙烷(DOTAP)(参见，例如，WO98/07408)、赖氨酰磷脂酰乙醇胺(L-PE)、脂多胺如脂精胺、N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十二烷基氧)-1-丙烷溴化铵、二甲基二十八烷基溴化铵(DDAB)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、N(1，2，3-二油酰氧)丙基-N，N，N-三乙铵(DOTMA)、DOSPA、DMRIE、GL-67、GL-89、Lipofectin和Lipofectamine(Thiery等，(1997)Gene Ther.4：226-237；Felgner等，Annals N. Y.Acad.Sci.772：126-139，1995；Eastman等，Hum.Gene Ther.8：765-773，1997)。U.S.专利No.5,858,784中描述的多核苷酸/脂质制剂也可以用于在此所述的方法中。这些脂质中的许多是可购得的，例如，从Boehringer-Mannheim，和Avanti Polar Lipids(Birmingham，Ala.)购得。还包括U.S.专利No.5,264,618、5,223,263和5,459,127中找到的阳离子磷脂。可以使用的其他合适的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、神经鞘磷脂、磷脂酰肌醇等。还包括胆固醇。

病毒递送

还可以通过多种方法中的任何一种将包括多单位病毒递送系统的制剂递送至患者的心脏细胞。

例如，可以全身引入病毒递送系统的药物制剂，例如，通过静脉内注射，且目标细胞中蛋白的特异性转运主要产生于通过基因递送载体、由控制受体基因表达的转录调节序列引起的细胞类型或组织类型表达或其组合提供的转录特异性。其他实施方案中，重组基因的最初递送受到更多限制，进入动物中的引入完全限于局部。例如，可以通过导管(参见U.S.专利5,328,470)或通过定向注射(例如，Chen等，(1994)PNAS 91：3054-3057)来引入基因递送载体。

一种示范性的执行中，将制剂直接注射至心脏组织中。US10/914,829描述了用于直接注射的方案。直接注射或病毒载体进入心肌中的应用可以将转染基因的表达限于心脏中(Gutaman等，1993，Cric.Res.73：1202-7；French等，1994，Circulation.90：2414-24)。

另一种示范性的执行中，将制剂引入一个或多个冠状动脉的腔内。可以限制流出冠状动脉的血液。可以顺行性递送制剂并使之停留在动脉中一至五分钟，例如一至三分钟。

可以通过相似的方法来递送非病毒载体。

示例斯滕特固定模

斯滕特固定模可以涂覆或可以含有降低磷酸酶活性的试剂，如在此所述的试剂。制备用于递送治疗剂的斯滕特固定模(生物可降解和非生物可降解)的方法是公知的(参见，例如，U.S.专利No.5,163,952、5,304,121、6,391,052、6,387,124、6,379,382和6,358,556、6,605,110、6,605,114、6,572,645、6,569,194、6,545,748、6,541,116、6,527,801、6,506,437)。一实施方案中，使用本领域已知的技术将斯滕特固定模涂覆治疗剂，例如，在此所述的试剂，如降低磷酸酶活性的核酸，。

一实施方案中，斯滕特固定模是不锈钢斯滕特固定模或nytinol网状装置。例如，可以在PCI程序过程中(经皮冠状干预)将斯滕特固定模递送至导管上的冠状动脉。斯滕特固定模通过气囊的扩张或通过自身的膨胀递送设计可以在动脉中展开。示例可购得的斯滕特固定模包括Gianturco-Roubin斯滕特固定模(例如，来自CookCardiology)、Multilink、Duet、Tetra、Penta、Zeta斯滕特固定模(例如，来自Guidant)；Nir，Wall斯滕特固定模、Taxus(例如，来自SCIMED/Boston Scintific)、GFX/S系列斯滕特固定模(例如，来自Medtronic/AVE)、velocity和Cypher斯滕特固定模(例如，来自Johnson&Johnson/Cor dis)。

例如，斯滕特固定模可以涂覆介导核酸缩合或压缩的聚合阳离子，例如，如U.S.6,596,699中所述的。可以使用线性聚阳离子如聚-L-赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸等。聚合物可以是同型聚合物，如聚赖氨酸、聚鸟氨酸或聚精氨酸，或可以是杂聚合物，包括由赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸等形成的随机聚合物。更多复合的分子也可以用作聚阳离子，如支链或直链聚氮丙啶等。可以使用各种天然形成的核酸粘合剂中的任何一种，如精胺或亚精胺，并包括在聚阳离子的定义内。可以相似地使用鱼精蛋白，也可以如此使用各种组蛋白中的任何一种。可以相似地使用聚酰胺胺树状大分子，其中末端氨基通过静电方式结合核酸，形成正电荷的缩合物。可以特异性地修饰聚阳离子来提供形成所需缩合物的最佳特征。例如，已经报道了18个残基的重复赖氨酸链接着色氨酸和烷基化半胱氨酸残基形成具有至少等于聚赖氨酸特性的缩合物(McKenzie等，J.Peptide Res.54：311-318(1999))。通常，聚阳离子是正电荷的，并在约pH6至约8具有净正电荷或具有高于约五个的正电荷残基。聚阳离子具有与负电荷的数量相比更高数量的正电荷。聚阳离子包括天然核酸结合蛋白和重组核酸结合蛋白，如氨基酸的同型-或杂-聚合物或结合天然或重组核酸分子中发现的一个或多个核酸序列并形成核酸缩合物的合成化合物。

将治疗剂如核酸涂覆至医疗装置如斯滕特固定模上的其他方法包括用如U.S.5,674,192或6,409,716中所述的可膨胀水凝胶聚合物涂覆医疗装置。水凝胶涂层的特征在于掺入足量核酸的能力，核酸通常是水溶液形式，且是可膨胀的使得施加压力时可以将水溶液有效地挤出涂层，例如，通过膨胀或扩展斯滕特固定模。这种方式的药物给药能够使药物是位点特异性的，使得可以将高浓度的释放限于直接应用至受影响的组织。斯滕特固定模还可以涂覆含有核酸的病毒颗粒。

将治疗剂如核酸结合斯滕特固定模或其他医疗装置的其他方法是本领域已知的，参见例如，U.S.6,024,918、U.S.6,506,408；U.S.5,932,299。

一些实施方案中，在此所述的斯滕特固定模，除了涂覆或含有降低磷酸酶活性的试剂外，还可以涂覆第二种治疗剂。例如，斯滕特固定模还可以含有一种或多种：雷帕霉素、紫杉醇和放线菌素-D、凝血酶抑制剂、抗血栓形成剂、血栓溶解剂、溶栓剂、血管痉挛抑制剂、钙通道阻断剂、血管扩张剂、抗高血压剂、抗微生物剂、抗生素、表面糖蛋白受体的抑制剂、抗血小板剂、抗有丝分裂剂、微管抑制剂、抗分泌剂、肌动蛋白抑制剂、重塑抑制剂、反义核苷酸、抗代谢物、抗增殖性剂、抗癌化疗剂、抗炎甾醇或非甾醇抗炎剂、免疫抑制剂、生长激素拮抗剂、生长因子、多巴胺激动剂、放疗剂、肽、蛋白质、酶、胞外基质成分、自由基清除剂、螯合剂、抗氧化剂、抗聚合酶、抗病毒剂、光能治疗剂和基因治疗剂。

治疗评价

可以通过测定治疗对心脏功能或心肌细胞功能如收缩性相关参数的作用来评价治疗。例如，可以使用上述的方法测量SR Ca²⁺ATPase活性或胞内Ca²⁺浓度。此外，可以使用Strauss等，Am.J.Physiol.，262：1437-45，1992中所述的方法测量心脏或心脏组织的力量输出。

还可以通过对患者的作用来评价治疗，例如，根据治疗领域的技术人员认为与特定治疗相关的参数。例如，在治疗心力衰竭中，示例参数可以与心脏和/或肺功能相关。心脏参数包括脉搏、EKG信号、内径减损、心率、心脏收缩性、心室功能，例如，左心室末端舒张压(LVEDP)、左心室收缩压(LVSP)、Ca²⁺代谢，例如，胞内Ca²⁺浓度或峰或静止Ca²⁺、力量输出、心脏的松弛和压力、力量频率关系、心脏细胞存活或凋亡或离子通道活性，例如，钠钙交换、钠通道活性、钙通道活性、钠钾ATPase泵活性、肌球蛋白重链的活性、肌钙蛋白I、肌钙蛋白C、肌钙蛋白T、原肌球蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白轻链激酶、肌球蛋白轻链1、肌球蛋白轻链2或肌球蛋白轻链3、IGF-1受体、PI3激酶、AKT激酶、钠-钙交换、钙通道(L和T)、集钙蛋白或钙网蛋白。评价可以包括进行血管造影术(例如，定量血管造影术)和/或血管内超声(IVUS)，例如，在治疗之前、之后或之中。

心脏细胞的繁殖

通过使心脏细胞移出黏附合适底物(例如，培养皿)的心脏组织的部分或通过分解组织来获得心脏细胞培养物，例如，通过机械或酶来产生心脏细胞的悬浮液。例如，可以使用胰蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、DNase、链霉蛋白酶、dispase或其各种组合。胰蛋白酶和链霉蛋白酶获得最完整的分解但可能损伤细胞。胶原酶和dispase获得不太完整的分解但有害性较低。分离组织(例如，心脏组织)和分解组织来获得细胞(例如，心脏细胞)的方法描述于FreshneyR.I.，Culture of Animals Cells，A Manual of Basic Technique，第三版，1994。

核酸抑制剂

磷酸酶活性的调节剂可以是核酸，如siRNA、反义RNA、形成三-螺旋的核酸或核酶，其可以降低磷酸酶例如1型磷酸酶的表达。

例如，通过使用双链RNA的基因沉默来改变基因表达(Sharp(1999)Genes and Development 13：139-141)。RNAi，也称为双链RNA干扰(dsRNAi)或小干扰RNA(siRNA)，已经在多种生物体中得到了广泛的证明，包括哺乳动物细胞、线虫C.elegans(Fire，A.等，Nature，391，806-811，1998)。

可以将dsRNA递送至细胞或生物体来对抗磷酸酶。例如，与编码磷酸酶的核酸互补的dsRNA可以沉默磷酸酶例如1型磷酸酶的蛋白表达。dsRNA可以包括与磷酸酶编码片段或非编码片段互补的片段，编码片段例如，5’编码片段、编码磷酸酶核心结构域的片段、3’编码片段，非编码片段例如，5’或3′未翻译片段。例如可以通过转录两个方向的盒(在体外或体内)来产生dsRNA，例如，通过在盒的任一侧包括T7启动子。选择盒中的插入片段使得其包括与磷酸酶编码核酸互补的序列。不需要全长序列，例如，外显子，或19-50个核苷酸或50-200个核苷酸。序列可以来自转录产物的5’一半，例如，ATG的1000、600、400或300个核苷酸内。请参阅，HISCRIBE^TM RNAi转录试剂盒(New England Biolabs，MA)和Fire，A.(1999)TrendsGenet.15，358-363。还可以将dsRNA消化成较小的片段。参见，例如，US专利申请2002-0086365和2003-0084471。

一实施方案中，使用siRNA。siRNA是小的双链RNA(dsRNA)，任选地包括突出物。例如，双链体片段约18至25个核苷酸长，例如，约19、20、21、22、23或24个核苷酸长。通常，siRNA序列与目标m RNA精确互补。

“核酶”是在RNA中的特异性位点分裂的酶RNA分子。可以根据公知的方法来设计特异性分裂编码磷酸酶或磷酸酶例如1型磷酸酶表达需要的核酸的核酶。

人造转录因子

可以工程化人造转录因子，如嵌合锌指蛋白，与编码磷酸酶抑制剂或磷酸酶基因中或附近的序列相互作用，例如，在基因的启动子或增强子中的位点，例如，在mRNA起始位点的1000、700、500或200个核苷酸内，或在基因中染色质可接近位点的50、20、10个核苷酸内。参见，例如，US6,785,613。可以设计人造转录因子以在基因编码磷酸酶抑制剂(例如，I-1)的情况中激活基因的表达，或例如在基因编码磷酸酶的情况中抑制基因的表达。

可以从文库设计或选择人造转录因子。例如，通过体外(例如，使用噬菌体展示，U.S.专利No.6,534,261)或体内选择，或通过基于识别密码子的设计(参见，例如，WO00/42219和U.S.专利No.6,511,808)来制备人造转录因子。参见，例如，Rebar等，(1996)Methods Enzymol 267：129；Greisman和Pabo(1997)Science 275：657；Isalan等，(2001)Nat.Biotechnol 19：656；和Wu等(1995)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 92：344，其中特别是，用于形成各种锌指结构域文库的方法。

任选地，可以将锌指蛋白融合转录调节结构域，例如，融合激活结构域来激活转录或融合抑制结构域来抑制转录。锌指蛋白自身可以通过递送至细胞的异种核酸来编码或蛋白自身可以递送至细胞(参见，例如，U.S.专利No.6,534,261)。包括锌指蛋白编码序列的异种核酸可以可操作地连接诱导型启动子，例如，以能够精细控制细胞中锌指蛋白的水平。

给药

可以通过标准方法将调节磷酸酶活性的试剂例如在此所述的试剂给药于患者。例如，可以通过多种不同途径中的任何一种来给药试剂，包括静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入或摄取)、经皮(局部)和经粘膜。一实施方案中，通过注射来给药试剂，例如，动脉内、肌内或静脉内。

可以将试剂，例如编码磷酸酶抑制剂的核酸、多肽、片段或类似物、调节剂(例如，有机化合物和抗体(在此也称为“活性化合物”)掺入适于给药于患者例如人的药物组合物中。这样的组合物通常包括多肽、核酸分子、调节剂或抗体和药物学上可接受的载体。如在此所用的术语“药物学上可接受的载体”用来包括与药物给药相容的任何溶剂、分散介质、衣料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药物学上活性物质是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则可以在本发明的组合物中使用这样的介质。还可以将辅助活性化合物掺入组合物中。

可以将药物组合物配制成与其打算的给药途径相容。用于非肠道、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下成分：无菌稀释剂，如用于注射的水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或甲基对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节渗透压的试剂，如氯化钠或葡聚糖。可以用酸或碱如盐酸或氢氧化钠来调节pH。可以将非肠道制剂封装于安瓿、可随意处置的注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况中)或分散体和用于无菌溶液或分散体临时制备的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF、Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有的情况中，组合物必须是无菌的并应当流动至存在易于注射性的程度。在制造和存储条件下必须是稳定的并必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的分散介质。例如，可以通过使用衣料如卵磷脂、通过在分散体的情况中维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂获得微生物作用的防止，例如，对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、水杨乙汞等。在许多情况中，组合物中优选包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂例如一硬脂酸铝和明胶来引起可注射组合物的延长吸收。

通过将所需量的活性化合物(例如，在此描述的试剂)掺入含有上述一种或组合配料中的合适溶剂中，按照需要，接着过滤灭菌来制得无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入含有基础分散体介质和所需的来自上述那些的其它配料的无菌载体中来制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从之前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食载体。它们可以封装于明胶胶囊中或压制成片剂。对于口服治疗给药的目的，将活性化合物与赋形剂掺合并以片剂、锭剂或胶囊形式来使用。还可以使用用作漱口水的流体载体来制备口服组合物，其中可以将流体载体中的化合物口服应用，并发出沙沙声，吐出或吞咽。可以作为组合物的一部分包括药物学上相容的结合剂和/或佐剂物质。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有以下成分中的任何一种，或相似性质的化合物：粘合剂，如微晶体纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如藻朊酸、Prinogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、甲基水杨酸酯或橙子香精。

还可以通过经粘膜或经皮方式来全身给药。对于经粘膜或经皮给药，在制剂中使用适于待穿透屏障的渗透剂。通常这样的渗透剂是已知的，例如，用于经粘膜给药包括，去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。通过使用鼻喷雾或栓剂来实现经粘膜给药。对于经皮给药，将活性化合物配制成膏剂、油膏、凝胶或霜剂，如本领域通常已知的。

一实施方案中，将活性化合物与保护化合物对抗从体内快速消除的载体如受控释放制剂一起配制，包括植入物和微胶囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙烯醋酸酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样制剂的方法是本领域技术人员清楚的。也可以从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc商业获得材料。脂质体悬浮剂(包括靶向受病毒抗原的单克隆抗体感染的细胞的脂质体)也可以用作药物学上可接受的载体。可以根据本领域技术人员已知的方法来制备这些，例如，如U.S.专利No.4,522,811中所述的。

可以将药物组合物和给药说明书包括于容器、包装或分配器中。

优选的实施方案中，将药物组合物注射至受影响的血管，例如动脉，或器官，例如，心脏。

小分子试剂

可以通过小分子筛选来鉴定调节磷酸酶活性例如抑制磷酸酶活性的小分子试剂。可以将一种或多种候选物分子接触磷酸酶并评价来测定候选分子是否与磷酸酶相互作用或是否调节磷酸酶的酶活性。可以在体外或体内来实现接触。在体外测试中，例如，可以使用高度纯化的成分，例如，使用具有磷酸酶活性的重组蛋白，例如，至少人磷酸酶的催化片段。可以在体外评价磷酸酶的酶活性。

例如，如所述的(Endo，S.等(1996)Biochemistry 35，5220-5228)在30μl含有50mM Tris-HCl(pH7.4)、1mM DTT、0.5mM MnCl₂、10μM[³²P]磷酸酶和0.5μg/mlPP1的反应混合物中测定蛋白磷酸酶1活性。通过将1μl PP1加入20μl含有剩余测试化合物的测试混合物中来抑制反应。在30℃20分钟后，通过将10μl 50％三氯醋酸加入测试混合物中来终止反应。然后将测试混合物在冰上冷却并离心。将上清液的20μl等分试样点在滤纸上并置于闪烁计数器中来测定释放的[³²P]Pi的量。如所述的在30℃30分钟准备用于PP1测试的[³²P]磷酸酶。将[³²P]磷酸酶在50mM Tris HCl，pH7.4，1mM EDTA，1Mm DTT中渗析并储存于-80℃直至使用(请参阅Huang等，Proc Natl Acad SciUSA.2000年5月23日；97(11)：5824-9)。

在许多测试治疗化合物和天然提取物文库的药物筛选程序中，为了在给定的时间段内最大化所测量的测试化合物的数量，高通量测试是理想的。

可以从使用各种浓度的测试化合物获得的数据产生剂量反应曲线来测定测试化合物的效率。此外，还可以进行对照测试来提供比较的基线。在对照测试中，在测试化合物不存在下孵育心脏细胞。

“化合物”或“测试化合物”可以是任何化合物，例如，大分子(例如，多肽、蛋白复合物或核酸)或小分子(例如，氨基酸、核苷酸、有机或无机化合物)。测试化合物可以具有低于约每摩尔10,000克的化学式量，低于约每摩尔5,000克，低于每摩尔1,000克，或低于约每摩尔500克。测试化合物可以是天然产生的(例如，草药或天然产物)、合成的或两者。大分子的实例是蛋白质、蛋白质复合物和糖蛋白、核酸，例如，DNA、RNA和PNA(肽核酸)。小分子的实例是肽、拟肽(例如，类肽)、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、有机或无机化合物，例如，杂有机化合物或有机金属化合物。测试化合物可以是通过在此所述方法测定的唯一物质。或者，可以连续或同时测试一组测试化合物。

例如，如上所述(例如，基于关于激动剂的信息)或使用多种组合文库方法中的任何一种来获得测试化合物。一些示例文库包括：生物文库；类肽文库(具有肽功能性，且具有能抵抗酶降解但仍然保持生物活性的新的、非肽主链分子的文库(参见，例如，Zuckermann，R.N.等(1994)J.Med.Chem.37：2678-85)；空间上可编址的平行固相或溶液相文库；需要去卷积的合成文库方法；“one-bead-one-化合物”文库方法；和使用亲和性色谱选择的合成文库方法。例如，可以使用这些方法来产生肽、非肽寡聚物或小分子文库化合物(参见，例如，Lam(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。

组合化学文库的制备和筛选是本领域技术人员公知的。这样的组合化学文库包括，但不限于，肽文库(参见，例如，U.S.专利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37：487-493(1991)和Houghton等，Nature 354：84-88(1991))。还可以使用产生化学多样性文库的其他化学物质。这样的化学物质包括但不限于：类肽(例如，PCT公开No.WO91/19735)、编码的肽(例如，PCT公开No.WO93/20242)、随机生物寡聚物(例如，PCT公开No.WO92/00091)、苯并二氮类(例如，U.S.专利No.5,288,514)、diversomers如乙内酰脲、苯丙二氮和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：6909-6913(1993))、vinylogous多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.114：6568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽拟肽(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))、类似有机合成的小化合物文库(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.116.2661(1994))、寡氨基甲酸盐(Cho等，Science261：1303(1993))和/或肽基磷酸盐(Campbell等，J.Org.Chem.59：658(1994))、核酸文库(参见Ausubel，Berger和Sambrook，全部上文)、肽核酸文库(参见，例如，U.S.专利5,539,083)、抗体文库(参见，例如，Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)：309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(参见，例如，Liang等，Science，274：1520-1522(1996)和U.S.专利5,593,853)、小有机分子文库(参见，例如，苯并二氮，Baum C&EN，1月18日，p33(1993)；类异戊二烯，U.S.专利5,569,588；噻唑啉酮和metathiazanone，U.S.专利5,549,974；吡咯烷，U.S.专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，U.S.专利5,506,337；苯并二氮，5,288,514，等)。在现有技术中可以找到分子文库合成方法的其他实例，例如在：DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.90：6909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422；Zuckermann等(1994)J.Med.Chem.37：2678；Cho等(1993)Science 261：1303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；和Gallop等(1994)J.Med. Chem.37：1233。

生物文库可以包括由核酸编码的聚合物。这样编码的聚合物包括多肽和功能核酸(如核酸适配子(DNA、RNA)、双链RNA(例如，RNAi)、核酶等)。可以使用生物文库和非生物文库来产生肽文库。生物文库的另一实例是dsRNA(例如，siRNA)或其前体的文库。还表征了可以加工或转录来产生双链RNA(例如，siRNA)的核酸文库。

可以在现有技术中找到分子文库合成方法的实例，例如在：DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 91：11422；Zuckermann等(1994)J.Med. Chem.37：2678；Cho等(1993)Science 261：1303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.E.d.Engl.33：2059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；和Gallop等(1994)J.Med.Chem.37：1233。

化合物文库可以存在于溶液中(例如，Houghten(1992)Biotechniques 13：412-421)，或在珠子(Lam(1991)Nature 354：82-84)、芯片(Fodor(1993)Nature 364：555-556)、细菌(Lander，U.S.专利No.5,223,409)、孢子(Ladner U.S.专利No.5,223,409)、质粒上(Cull等(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：1865-1869)或在噬菌体上(Scott和Smith(1990)Science 249：386-390；Devlin(1990)J.Mol.Biol.222：301-310；Ladner上文)。在许多情况中，测试化合物文库的高通量筛选方法包括一种或多种测试，例如，测试的组合。可以将来自每个测试的信息存储于数据库中，例如，用来鉴定可以作为最佳化或改进化合物先导的候选化合物，和用来鉴定SARs。

提供以下的实施例来作为本发明的进一步说明，且用来说明但不是限制本发明。

实施例

实施例1.衰竭人心脏中的I-1及其磷酸化

为了检测I-1在衰竭的人心脏中的水平和磷酸化状态，比较了来自九个非衰竭和十个初步诊断为扩张型心肌病(IDC)的衰竭人心脏的活体切片中的I-1水平。为了控制相等负荷的蛋白，将数据标准化至集钙蛋白水平，因为这种SR蛋白的水平在衰竭和非衰竭样品之间是相似的(图1A)。总I-1蛋白在供体和衰竭心脏之间没有差异，但是衰竭心脏中的磷酸化程度显著降低(～60％)(图1B)，表明了I-1得到了显著钝化，因此能够抑制衰竭人心脏中的PP1活性。降低的I-1磷酸化可以反映出由于衰竭心脏与供体心脏相比较(10.9±1.3pmol/mg，n＝10，p＜0.05)降低的cAMP水平(5.8±0.7pmol/mg，n＝9)而引起的削弱的β-肾上腺素信号和降低的PKA激活。

实施例2.通过组成型活性I-1的PP1抑制提高了衰竭人心肌细胞中对B-激动剂的收缩反应

I-1缺乏小鼠心脏显示出降低的收缩参数。此外，在人心力衰竭的一些情况中，PP1活性得到提高。这种提高可以是，至少部分，是由于I-1的钝化或去磷酸化，导致降低的功能。因此，提高I-1的活性在恢复衰竭人心肌细胞中减弱的β-肾上腺素能反应性中是有益的。

将组成型活性I-1蛋白(I-1_T35D)的腺病毒介导的表达用于从人衰竭心脏分离的心肌细胞中(del Monte F等，Circulation.1999；100：2308-11)。I-1_T350构建体的设计需要I-1cDNA的平截来编码头65个氨基酸和使用天冬氨酸(GTC：D)引入核苷酸改变来替代PKA磷酸化位点(GGT：Thr³⁵)，形成组成型活性抑制剂(Endo，S.等，Biochemistry.1996；35：5220-8)。在平行研究中，用编码β-半乳糖酶的腺病毒感染心肌细胞来作为对照。两种构建体还含有编码作为转染标记的绿色荧光蛋白的序列(GFP)(图2B&D)。

用β-gal或I-1_T35D构建体感染的衰竭人心肌细胞在基础条件下呈现出相似的收缩功能。然而，I-1_T35D感染的响应异丙基肾上腺素(100nM)的心肌细胞呈现出与对照相比较显著提高的心肌细胞收缩(图2E&F)、细胞收缩率(图2G)和再次伸长(图2H)和较低的舒张时间常数，tau(τ)(I-1_T35D：0.16±0.05，n＝8vs.GFP：0.37±0.09，n＝10，p＜0.05)。此外，与对照相比较，I-1转染细胞中的钙信号50％衰减的时间(I-1_T35D：0.33±0.06，n＝8vs.GFP：0.52±0.06，sec，n＝10，p＜0.05)和钙信号衰减的τ(I-1_T35D：0.36±0.10，n＝8vs.GFP：0.70±0.09，n＝10，p＜0.05)得到了加速。

因此，抑制磷酸酶的蛋白的表达对于降低PP1活性是有效的，PP1活性是一种报道过的在人心力衰竭中升高的活性。此外，这些结果表明通过I-1_T35D的PP1活性抑制显著提高了衰竭人心脏中的β-肾上腺素能反应性。

实施例3.使用伴随冠状静脉阻塞(CVB)的经皮顺行性冠状内基因转移可以用来将基因递送至心脏组织

测试了不同AAV血清型递送外源基因至心脏的能力。发现AAV6相对于其他AAV具有一些令人惊讶的和出乎意料的特性。AAV6在心脏中给予了最快的基因表达，以及最特异的和有效的表达(数据未显示)。然而，其他AAV可以用于其它应用中，例如，其中心脏组织需要表达的不同过程的应用。

在绵羊和猪模型中进行使用伴随冠状静脉阻塞(CVB)的经皮顺行性冠状内基因转移。将导管插入左前降动脉(LAD)或左升动脉(LCX)并用标准血管重建术气囊闭塞。在LAD和LCX分布中进行一分钟缺血预处理(通过LAD和LCX的阻塞)来允许升高的病毒停留时间。预处理方案后，将导管插入大冠状静脉(GCV)或其分支之一并用标准楔气囊导管暂时闭塞。全面地进行CVB，意味着近端GCV的闭塞，因此闭塞LAD和LCX分布中的静脉排出，或选择性地，在这种情况中，在LAD递送过程中将前心室间静脉(AIV)闭塞，相似地，在LCX递送过程中将心中静脉(MCV)的小孔闭塞。当动脉和静脉气囊扩张时，通过使用携带β-半乳糖苷酶的腺相关病毒(AAV6.β-gal)穿过扩张的血管重建术气囊中心腔的注射来进行经皮顺行性冠状动脉内基因转移(n＝5)。

用AAV6.β-gal基因转移十二周后，从隔膜、前面、左侧、后面和右边的心室壁获得10μm的心肌切片。将这些切片用含有0.5％戊二醛的磷酸盐缓冲溶液(PBS)固定30分钟，然后在含有30％蔗糖的PBS中30分钟。然后将切片在含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-半乳糖吡喃糖苷(X-gal)的溶液中孵育过夜。结果表明了β半乳糖苷酶在整个心肌的大范围转移(数据未显示)。因此，使用全面CVB的5×10¹⁴基因组/ml浓度的AAV6.CMV.β-gal的顺行性转导导致靶向的心肌中显著的基因表达，证明了在大型动物模型中的可行性和安全性。

进一步证实了使用冠状静脉阻塞的基因转移。简单地说，在猪中依赖于AAV6.CMV构建体成功地转移了报告基因和编码SERC2A的基因(数据未显示)。

实施例4.活性抑制剂-1的体内表达提高了心脏功能

为了测定降低的蛋白磷酸酶1活性的长期体内效果，以心肌细胞限制方式表达组成型活性的、平截的抑制剂-1(I-T35D；AA1-65)。选择抑制剂-1的这种形式是因为其特异性地抑制蛋白磷酸酶1，虽然浓度高于天然磷酸化抑制剂(Endo，S.等，Biochemistry.1996；35：5220-8)，且更突出的，其在心力衰竭中保持着活性，其中β-肾上腺素信号轴下调(Bristow，M.R.等，N Engl J.Med. 1982；205-11)。

构建了5.6kb转基因，由a-MHC启动子后面接着小鼠I-T35D(AA1-65)cDNA和猿病毒40多腺苷酸化位点构成，并限制、凝胶纯化，然后微注射至一细胞(one-cell)近交FVB/N胚胎的原核中。根据辛辛那提大学的Institutional Animal Care and Use Committees批准的方案来操纵TG小鼠。

获得具有相似I-T35D表达水平(与WT相比～25倍)的三个转基因系。如之前所描述的(Hoit，B.D.等，Circ.Res.1995；77：632-7)，通过非入侵性超声波心动描记术来测定体内心脏功能。对于每次实验，用2.5％三溴乙醇(10μl/克体重)将小鼠麻醉，在盲条件下测定心脏功能。使用student’s t-测试和ANOVA，接着Neuman-Keuls t-测试来测定组之间的统计学差异。将数据表示为平均±标准误差。对于每次实验，在P值＜0.05建立统计学显著性。在Psism3.0进行统计学分析。

通过M-模式和Doppler超声波心动描记术检测三个系与年龄和性别相适的野生性(WT)。在3个月大时，在活性抑制剂-1转基因心脏中(n＝14)观察到与野生型相比较(n＝5)周径纤维缩短速率的提高(Vcf)(TG：7.91±0.31，vs.WT：6.28±0.54，circ/sec；P＜0.05)，且喷射时间得到了缩短(TG：56.77±1.81，vs.WT：64.0±2.07，msec；P＜0.05)。此外，在6个月大时，心脏功能得到了相似地提高，且寿命研究(19WT和19TG)表明没有突然死亡的迹象，而Kaplan-Meier存活分析(直至2岁)揭示了死亡率没有显著差异。使用转基因系之一(系C)进行了随后的研究。存在心脏蛋白磷酸酶1活性的显著降低(15％)(图3A)，且整体PP1催化亚基蛋白水平或PP2A活性与WT相比较没有补偿性改变(数据未显示)。

在4nM(选择性抑制2A型磷酸酶的浓度)岗田酸和EDTA(0.5mM)、2B型磷酸酶抑制剂的存在下，使用³²P标记的糖原磷酸酶作为底物检测PP1活性(Carr，A.N.等，Mol. CellBiol.2002；22：4124-35；Suzuki，Y.等，Mol.Cell Biol.2001；21：2683-94)。在其中利用不高于15％底物来保证反应的线性的条件下进行测试。

如之前所述的(Sato，Y.等，J.Biol Chem.1998；273：28470-7)使用Langendorff灌注系统来检测体外心脏功能。持续计算心率和心室内压力的最大一阶段导数(±dP/dt)。对于细胞功能，分离钙耐受心肌细胞并将子集装载Fura-2-AM(Zhao，W.等，Cardiovasc Res.2003；57：71-81)。使用加有视频(video-edged)的检测系统测定基础的和异丙基肾上腺素刺激的收缩参数和Ca²⁺瞬变。将细胞在0.5Hz步测。通过Felix计算机软件(Photon Technology International，Lawrenceville，New Jersey，USA)分析数据。

Langendorff灌注的心脏，其表示没有神经激素或血液动力学影响的系统，还表示了提高的固有心脏收缩力。在表达活性抑制剂-1的心脏中，相对于野生型组(图3B)，提高最大左心室压了(23％)且+dP/dt和-dP/dt各自增加了39％和36％。此外，分离的钙耐受性心肌细胞，呈现出提高(56％)的收缩分数(图3C)。在基础条件下，提高了表达活性抑制剂-1的心肌细胞中的+dL/dt和-dL/dt，以及收缩分数的程度(％FS)。此外，在异丙基肾上腺素刺激下(ISO)，提高了+dL/dt和-dL/dt。通过活性抑制剂-1表达还将心肌细胞收缩的速率(-dL/dt)和再次伸长(+dL/dt)提高了超过2倍(图3C)。50％峰和50％舒张的时间也显著降低。此外，用异丙基肾上腺素(100nM)最大限度地刺激心肌细胞时，心肌细胞收缩的速率(-dL/dt)和再次伸长(+d L/dt)持续提高(图3C)。

机械参数的改变反映出相似的钙循环提高。在基础条件下，活性抑制剂-1心肌细胞中的钙瞬变50％衰减(T₅₀)的幅度和时间都得到了提高。在异丙基肾上腺素(100nM)刺激下，也缩短了T₅₀。实际上，钙瞬变的幅度提高了(71％)，反映出提高的SR钙吸收和SR钙装载，Ca²⁺信号50％衰减的时间(T₅₀)降低了(37％)(图3D)，表明提高的SERCA2功能。

值得注意的，甚至在异丙基肾上腺素刺激下，活性抑制剂-1心肌细胞持续呈现缩短的T₅₀，同时钙瞬变的幅度与野生型心肌细胞没有不同，与机械参数一致。这些对提高的基础收缩性和增大的β-肾上腺素能反应性的发现支持抑制剂-1作为分子inotrope的作用。因此，该实施例显示了具有活性抑制剂-1(I-1^＊)的心脏特异性表达的小鼠呈现出心脏1型磷酸酶活性的降低和心脏收缩性的提高。

实施例5.活性抑制剂-1对Ca ²⁺ 操纵蛋白和糖原代谢的作用

如上所述，关键调节磷蛋白如受磷蛋白、理阿诺碱受体、肌钙蛋白I和L-型钙通道的β-肾上腺素受体依赖性蛋白磷酸化构成了控制Ca²⁺循环和心脏收缩性的关键调节机制。因此，在在此所述的转基因模型中研究了这些关键物质的表达(图4A)和磷酸化水平(图4B)。

如之前所述的^11，18，对心脏匀浆进行定量免疫印迹。使用蛋白Gdynabeads(Dynal Biotechnology Incorporated，Lake Success，NY)进行免疫沉淀实验。简而言之，将50μl PP1a抗体(Santa CruzBiotechnology，sc-6104)缀合磁性蛋白质G珠子，如制造商所述的使用0.2M triethanoalamine和20mM二甲基pimedilate。用珠子将500μl心脏匀浆孵育过夜，使用恒定的旋转运动。用PBS加0.1％吐温20洗涤珠子5X。最后，使用0.1M柠檬酸(pH2.8)洗脱结合PP1抗体的蛋白，然后在SDS-PAGE上分离，点渍并探测，如上所述。

首先证明了β-肾上腺素受体密度没有差异，在放射配体结合研究中使用¹²⁵I-iodocyanopindolol(数据未显示)。如之前所述的(McGraw，DW和Liggett，SB，J.Biol.Chem.1997；272：7338-44)进行放射配体结合研究。简而言之，将小鼠心脏在含有5mM Tris、2mMEDTA pH7.4、苯甲脒(5μg/ml)和大豆胰蛋白酶抑制剂(5μg/ml)的缓冲剂中均质。将匀浆在40,000xg 4℃离心10分钟。将所得到的沉淀重悬浮于10体积的均质缓冲剂中并再次离心。将沉淀重悬浮于测定缓冲剂中(75mM Tris，12.5mM MgCl₂、2mM EDTA，pH7.4)，然后将等份试样在250μl的总体积中室温孵育2小时，用～400pM¹²⁵I标记的iodocyanopindolol。在1μM普萘洛尔(propranolol)存在下测定非特异性结合。为了停止反应，加入冷的洗涤缓冲剂(10mM Tris，pH7.4)并通过Whatman GF/C玻璃纤维滤器进行真空过滤。

然而，与野生型心脏相比较(图4B)，在cAMP依赖性(Ser16)和C^a2+-钙调蛋白依赖性(Thr17)蛋白激酶位点都存在受磷蛋白磷酸化水平明显的提高(～1.8倍)。令人感兴趣地，心脏理阿诺碱受体蛋白水平降低～30％(图4A)，但是该通道的相对(mol Pi/mol RyR2)磷酸化不存在差异(图4B)。这种对理阿诺碱受体磷酸化的发现是令人惊讶的，因为蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A都已经显示出和理阿诺碱受体大分子复合物共同免疫沉淀(Marx SO等，Cell. 2000；101：365-76)。

肌钙蛋白I的蛋白或磷酸化水平的检测表明活性抑制剂-1表达心脏中没有改变(图4B)。此外，不存在L-型Ca²⁺通道蛋白水平的改变。分离钙耐受性心肌细胞并将具有清晰横条纹且没有自发收缩的细胞用于L-型Ca²⁺电流的测量。在恒定的电压获得电流记录，并测定细胞电导和Ca²⁺激活(Bodi，I.等，J.Am.Coll. Cardiol.2003；41：1611-22)。电流-电压相关性(I-V)的平均峰Ca²⁺电流(I_Ca)和稳定状态激活在表达活性抑制剂-1和野生型心肌细胞之间是相似的。然而，激活抑制剂-1转基因细胞中的I_Ca激活在比野生型细胞中的快(图4C)，与之前在受磷蛋白敲除小鼠中的观察相似(Masak，H.等，Am.J.Physiol.1997；272：H606-12)。

重要地，研究了糖原代谢，且观察到在表达活性抑制剂-1和野生型心脏之间的糖原合成和糖原磷酸活性没有显著差异。此外，这些心脏中的总体糖原累积不存在差异。因此，心肌中活性抑制剂-1的表达对糖原代谢不具有显著作用，与之前对抑制剂-1消融的发现相一致，其没有改变骨骼肌中的糖原代谢(Scrimgeour，AG等，J.Biol. Chem.1999；274：20949-52)。

实施例6.活性抑制剂-1延迟了压力超负荷中的功能退化和代偿性心脏肥大

为了检测与提高的Ca²⁺循环相关的活性抑制剂-1表达是对抗由血液动力学应力引起的心脏重塑是保护性的假设，我们使转基因小鼠和等基因野生型组接受横向主动脉缩窄，接着在缩窄后6和12周连续超声波心动描记测定(Kiriazis，H.等，Cardiovasc Res.2002；53：372-81)。如之前所述的(Kiriazis，H.等，Cardiovasc Res.2002；53：372-81)，对小鼠进行了横向主动脉缩窄。简而言之，使用27-规格针，使10周大的FVBN雄性野生型和转基因小鼠接受横向动脉缩窄。在缩窄之前和缩窄后的各个时间点进行超声波心动描记术。在终点，测量横主动脉梯度、以及肺、肝、心脏和体重，将心脏组织储存用于随后的组织生理学分析和生化研究。

虽然在这两组之间的横主动脉梯度相似(WT：47.4±2.50；TG：46.75±2.69，m mHg)，活性抑制剂-1小鼠没有呈现出Vcfc下降，和h/r(壁厚度/半径)比例增加(图5A)，表明维持的功能和降低的壁张力或应力，如通过La Place’s定律所测定的。相反，WT经历了～30％的Vcf_c降低以及左心室末端舒张和末端收缩尺寸的显著增加(P＜0.05)，表明心脏舒张的发展(图5A)。

如之前所述的进行压力测量。(del Monte F.，Circulation.2001；104：1424-9)。使用等式：P＝P_oe^-tτ-+P_B计算等容舒张(τ)的时间过程，其中P是左心室等容压，P_o是在峰-dP/dt时的压力，和P_B是剩余压力。对于步测研究，将心外膜导线置于连接刺激器(GrassInstruments，MA)的心房附属部分上。在动物子集中，将多个0.7mm压电晶体(Sonometrics Co.，Canada)在二尖瓣阀门的水平沿着心室的短轴置于左心室的表面上来测量晶体间的距离。通过夹住下腔静脉在不同的负荷条件下产生左心室压-尺寸环。通过系列负荷条件下产生系列压力尺寸环来获得末端收缩压-尺寸相关性并连接单个压力-尺寸环的上左手拐角来产生最大斜率。

在研究的终点(12周)，相对于假对照(图5B)，野生型中心脏对体重的比例提高了78％，活性抑制剂-1小鼠中提高了52％。与活性抑制剂-1缩窄的小鼠相比较(20％)，野生型中肺塞频率也高得多(80％)。将肺塞限定为高于假对照2个标准偏差的肺重量。

心脏在显微水平的进一步检测揭示了缩窄的WT心脏中提高的空隙和血管周围的纤维化(图5C)--在野生型小鼠中具有中度至严重的多焦点和血管周围的纤维化和活性抑制剂-1心脏中的中度至轻度纤维化。因此，实施例6表明了活性抑制剂-1表达保护了接受主动脉缩窄的小鼠免受心脏功能退化和形态退化。如之前所述的(Cohen，P.，Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res.1990；24：230-5)进行了使用H&E、三色、PAS和TRITC标记的麦芽凝集素的心肌细胞横截面积的组织病理学研究(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)。特别地，对于细胞壁的麦芽凝集素标记，测定了每个心脏(n＝每组3个心脏)40个或更多细胞的横截面积(来自多个切片)。麦芽凝集素染色表明了与缩窄的抑制剂-1心脏相比较(n＞来自每组3只小鼠的120个心肌细胞)(图6A)，缩窄WT中的心肌细胞截面面积得到显著提高。已知抑制剂-1的抗增殖性效果，检测了PKC、钙调神经磷酸酶、CREB和MAP-激酶增殖性途径。与WT组相比较，在缩窄的TS中存在p38和ERK1/2激活的显著降低(图6B)。

抑制剂-1的保护效果与受磷蛋白、SERCA和集钙蛋白水平的任何改变不相关，但是Ser16处的受磷蛋白的磷酸化得到了显著提高(图6C)。值得注意的，没有观察到Thr处的受磷蛋白磷酸化或理阿诺碱受体的Ser2809磷酸化的差异。因此，实施例同样显示了活性抑制剂-1表达保护了接受主动脉缩窄的小鼠免受细胞水平的心脏肥大，削弱了MAP-激酶途径的激活并对受磷蛋白磷酸化具有有益效果。

实施例7.活性抑制剂-1表达拯救了过渡成衰竭的压力超负荷肥大的大鼠模型

为了研究通过腺病毒基因转移的活性抑制剂-1的短期表达是否可以提高预先存在的心力衰竭情况中的血液动力学参数，使用了压力超负荷诱导的心肌病的大鼠模型，其在缩窄后22周呈现出提高的左心室舒张尺寸和降低的收缩分数(del Monte F.，Circulation.2001；104：1424-9)。从Charles River Laboratories(Wilmington，MA)获得四周大的Wistar大鼠(70-80g)并如之前所述的进行主动脉窄缩(delMonte F.，Circulation.2001；104：1424-9)。最初将动物随机分成两组：一组30只主动脉缩窄的动物和第二组32只假手术的动物。所有动物在最初的手术中存活。

当观察到左心室收缩分数的降低高于25％时，进行基因转移。将主动脉窄缩的30只动物组再分成15只两组，每组接受Ad.I-1T35D或Ad.GFP。24只假手术的动物组没有接受任何基因转移并以年龄相适的方式进行了研究。I-1T35D组中的一只动物和GFP组中的一只动物在基因转移手术过程中死亡。之前已经描述了腺病毒递送系统(BerriR.等，Circulation.2002；106：1756-9)。在假手术大鼠中，没有进行基因转移。之前的研究已经表明了注射Ad.GFP的假手术大鼠的行为方式与非感染的假手术大鼠相似。使用基于导管方法的活性抑制剂-1或报道基因GFP的腺病毒基因递送诱导了衰竭和非衰竭心脏中整个心室非常均匀的表达模式(Del Monte，F.等，Physiol Genomics.2002；9：49-56)。

产生腺病毒载体(Del Monte，F.等，Circulation.1999；100：2308-11)并在大鼠心力衰竭模型(Beeri R等，Circulation.2002；106：1756-9)中递送(Beeri R等，Circulation.2002；106：1756-9；Del Monte，F.等，Circulation.2001；104：1424-9)。如之前所述的(Beeri R等，Circulation.2002；106：1756-9；Del Monte，F.等，Circulation.2001；104：1424-9)进行压力测量和生化测定(终止时)。

免疫印迹研究也证实了用Ad.I-1^＊感染时活性抑制剂-1的表达和蛋白磷酸酶1活性得到显著降低(60％)(数据未显示)。衰竭对照组中左心室功能降低(图7A)，但是活性抑制剂-1的基因转移显著提高了压力升高的速率(+dP/dt)(图7A)。还通过活性抑制剂-1表达将舒张参数标准化，如通过左心室收缩压的最大下降速率(-dP/dt)的恢复以及通过等容舒张常数τ测量的压力下降的时间过程所示的(图7B)。

为了进一步定义负荷无关方式的心室功能，在动物子集中进行压力-尺寸分析(图7C)。如之前所述的进行压力测量(Del Monte，F.等，Circulation.2001；104：1424-9)。使用等式：P＝P_oe^-tτ+P_B计算等容舒张(τ)的时间过程，其中P是左心室等容压，P_o是在峰-dP/dt时的压力，和P_B是剩余压力。对于步测研究，将心外膜导线置于连接刺激器(Grass Instruments，MA)的心室附属部分上。在动物子集中，将多个0.7mm压电晶体(Sonometrics Co.，Canada)在二尖瓣阀门的水平沿着心室的短轴置于左心室的表面上来测量晶体间的距离。通过夹住下腔静脉在不同的负荷条件下产生左心室压-尺寸环。通过在系列负荷条件下产生系列压力尺寸环来获得末端收缩压-尺寸相关性并连接单个压力-尺寸环的上左手拐角来产生最大斜率。

为了改变负荷条件，在开胸动物中将下腔静脉夹住，因此减小了心室体积。这使得可以计算末端收缩压尺寸相关性，使用不同预负荷条件下的系列测量值(图7C)。与未衰竭的相比较，感染对照病毒(Ad.GFP)的对照衰竭心脏中的末端收缩压尺寸相关性的最大斜率(E_max，或最大倒电容)较低，表明了固有心肌收缩性和收缩储备的降低状态。活性抑制剂-1的表达完全恢复了末端收缩压尺寸相关性对非衰竭水平的斜率(图7D)，表明恢复了心脏面对提高的预负荷提高收缩性的能力。因此，按照上述的结果，活性抑制剂-1的急性腺病毒表达停止了压力超负荷诱导的心力衰竭大鼠模型中的心脏功能障碍和心脏代偿失调的进展。

如之前所述的(Margolis，S.S.，Embo J.2003；22：5734-45)，还使用(Schwinger，R.H.，Circulation.1995；92：3220-8)P-标记的髓磷脂碱性蛋白(BEB目录#1780S)进行了磷酸酶活性的其他测定，使用冈田酸来区分PP1和PP2A活性。测定了心肌匀浆中的糖原合成酶(GS)和糖原磷酸酶(GP)活性(Suzuki，Y.等，Mol.Cell Biol.2001；21：2683-94)。在7.2mM糖原合成酶活性的变构效应因子葡萄糖-6-磷酸盐的存在或不存在下，通过来自UDP[¹⁴C]葡萄糖的[¹⁴C]葡萄糖转移至糖原中来测定GS活性。在2mM糖原磷酸酶的变构激活剂AMP的不存在或存在下，通过测量来自[¹⁴C]葡萄糖-1-磷酸盐的[¹⁴C]葡萄糖引入糖原中来测定糖原磷酸酶活性。

生化特征揭示了衰竭心脏中SERCA2a水平显著降低，与之前的报道相一致(Del Monte，F.等，Circulation.2001；104：1424-9)，且这些水平在对照(Ad.GFP)或活性抑制剂-1基因转移时保持降低。受磷蛋白或理阿诺碱受体的水平没有差异(图8A)。cAMP-依赖性位点丝氨酸16处的受磷蛋白的磷酸化在衰竭心脏中显著降低，但是活性抑制剂-1的腺病毒基因转移与丝氨酸16的磷酸化实质性提高相关(图8B)。令人感兴趣的，感染对照或活性抑制剂-1病毒的衰竭组，呈现出受磷蛋白Thr-17磷酸化的提高(图8B)。

进一步的检测揭示了这些心脏中的CAM-激酶活性显著提高(图10和表1，以下)。

表1

表1：假手术或动脉缩窄后大鼠的超声波心动描记测量

PW：舒张期过程中后期的壁厚度，LVDD：舒张期过程中的左心室直径，

LVSD：收缩期过程中的左心室收缩直径，FS：收缩分数，与相似时间段的假手术相比较^＊P＜0.05，与12周时的值相比较

与非衰竭(NF)对照组相比较，衰竭(F)大鼠心脏中和感染Ad.I-1^＊或Ad.GFP的衰竭大鼠心脏中的CaM-激酶活性提高。令人感兴趣的，所有衰竭组中的理阿诺碱受体丝氨酸2809的磷酸化水平提高。活性抑制剂-1的感染对理阿诺碱受体磷酸化没有差异(图8B)。

活性抑制剂-1基因转移对MAP-激酶激活作用的检测表明了激活的p38-MAP-激酶实质性的降低，ERK或JNK的激活没有改变(图8C)。

实施例8.心脏中抑制剂-1的作用机理

以上发现表明了抑制剂-1表达与提高的受磷蛋白磷酸化相关。因此，抑制剂．1可以在体内选择性地影响蛋白磷酸酶l底物．为了进一步证实这种观察，使用蛋白磷酸酶1(a-isoform)催化亚基的抗体进行了免疫沉淀实验。对于抑制剂-1竞争结合测试，如早先所述的进行免疫沉淀。除去未结合的心脏匀浆后，将珠子洗涤(5x，PBS加0-1％吐温20)，然后用500μl不同终浓度(10nM至1000nM)的纯化并磷酸化的抑制剂。1孵育。然后洗涤珠子(3x)并用0.1 M柠檬酸(pH2.8)洗脱结合的蛋白质。值得注意的，抑制剂-1、靶向蛋白磷酸酶1亚基的SR/糖原(R_GL)(Tang，P.M.等，J.Biol Chem 1991；266：15782-9)和受磷蛋白与蛋白磷酸酶1共同免疫沉淀(图9A)。用递增浓度(10nM至1000nM)的纯化并磷酸化的抑制剂-1孵育这种复合物，揭示了以剂量依赖性方式降低的受磷蛋白结合(图9B)。

其他实施方案在以下权利要求内。

Claims

1.包含下述核酸的腺相关病毒载体在制备用于治疗有心力衰竭受试者的药物中的应用，所述核酸编码由SEQ ID NO：2的1-65位氨基酸组成且位置35为天冬氨酸或谷氨酸的人磷酸酶抑制剂-1组成型活性片段，所述的片段能够组成型抑制磷酸酶的活性，从而改善有心力衰竭的受试者心脏收缩以及使其免受与心脏重塑相关的形态退化，所述的腺相关病毒载体用于在体内直接导入受试者的心脏细胞。

2.权利要求1的应用，其中所述的磷酸酶抑制剂-1蛋白抑制1型磷酸酶。

3.权利要求1或2的应用，其中所述的磷酸酶抑制剂-1蛋白在位置35具有天冬氨酸。

4.权利要求1或2的应用，其中所述的核酸由所述的编码序列和与之可操作连接的启动子组成。

5.权利要求4的应用，其中所述的启动子是组成型启动子。

6.权利要求4的应用，其中所述的启动子在组织的子集中表达，且其中至少一种是心肌。

7.权利要求4的应用，其中所述的启动子是巨细胞病毒启动子或来自心脏特异性基因心脏肌钙蛋白T、肌球蛋白重链或肌球蛋白轻链的启动子。

8.权利要求1的应用，其中所述的腺相关病毒载体是血清型1，血清型2，血清型3，血清型4，血清型5，血清型6，血清型7，血清型8或血清型9的腺相关病毒载体。

9.权利要求1的应用，其中收缩的增加是通过提高的肌细胞收缩(肌细胞长度改变)、提高的肌细胞收缩(-dL/dt)和再次伸长(+dL/dt)的速率、降低的松弛的时间常数tau和加速钙信号衰减来确定的。

10.权利要求1的应用，其中，所述腺相关病毒载体用于以有效提高受磷蛋白的丝氨酸16的磷酸化的量来引入。

11.权利要求1的应用，其中，免受与心脏重塑相关的形态退化是通过检测心脏对体重的比例、梗塞面积、和存在心脏纤维化来确定的，其中如果与对照相比，所述人磷酸酶抑制剂-1导致降低的心脏对身体的重量比、降低的梗塞面积或降低的心脏纤维化，那么保护就存在。

12.权利要求1的应用，其中所述的心力衰竭由缺血、心律不齐、心肌梗塞、异常的心脏收缩性或异常的Ca²⁺代谢引起。

13.权利要求1的应用，其中受试者是人。

14.权利要求1的应用，其中限制通过冠状血管的血流，所述腺相关病毒载体用于引入冠状动脉的腔内。

15.权利要求14的应用，其中，在限制冠状静脉流出的同时允许心脏跳动。

16.权利要求14的应用，其中完全限制通过冠状血管的血流。

17.权利要求14的应用，其中受限制的冠状血管包括：左前降动脉、冠状动脉、远端回旋支动脉、大冠状静脉、心中静脉或前心室内静脉。

18.权利要求14的应用，其中在冠状血管缺血预处理后进行腺相关病毒载体的引入。

19.权利要求1的应用，其中在限制血液流出心脏的动脉流时将腺相关病毒载体注射至心脏中，由此允许所述载体注入并递送至心脏。

20.权利要求1的应用，其中，所述腺相关病毒载体用于通过包括以下步骤的方法注射至心脏中：

限制血液流出心脏的主动脉流，使得血流改变方向至冠状动脉中；

将载体注射至心脏、主动脉或冠状口的腔内，使得载体流入冠状动脉中；

在限制血液的主动脉流出的同时允许心脏跳动；和

恢复血液的流动。

21.权利要求1的应用，其中所述载体用于用导管将其注射至心脏中。

22.权利要求1的应用，其中所述载体用于将其直接注射至心肌中。

23.权利要求1的应用，所述方法还包括评价受试者心脏功能的参数。

24.权利要求23的应用，其中心脏功能的参数是以下的一种或多种：心率、心脏代谢、心脏收缩性、心室功能、Ca²⁺代谢或肌浆网Ca²⁺ATPase活性。

25.腺相关病毒载体，其包含编码下述人磷酸酶抑制剂-1组成型活性片段的核酸，所述的人磷酸酶抑制剂-1组成型活性片段包含SEQ IDNO：2的1-65位氨基酸且位置35为天冬氨酸或谷氨酸，其在心肌细胞中组成型抑制磷酸酶活性。

26.制备包括调节磷酸酶活性的核酸的病毒颗粒的方法，该方法包括：

将包含权利要求25的病毒载体的宿主细胞接触一种或多种提供能够提供颗粒形成所需要病毒基因产物的成分的试剂，所述病毒载体可操作地连接病毒包装信号，和

从宿主细胞周围的介质中收集包装了核酸但不含有可复制病毒的病毒颗粒。

27.权利要求26的方法，其中所述一种或多种试剂由辅助病毒组成。

28.权利要求25的病毒载体，其中所述的腺相关病毒是血清型1，血清型2，血清型3，血清型4，血清型5，血清型6，血清型7，血清型8或血清型9的腺相关病毒。