KR20230068444A - 레트 증후군의 치료를 위한 아데노 관련 바이러스 벡터 - Google Patents

레트 증후군의 치료를 위한 아데노 관련 바이러스 벡터 Download PDF

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KR20230068444A
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콜린 오바니온
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사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드
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Abstract

본 개시는 레트 증후군과 같은 mecp2 유전자의 돌연변이와 연관된 질환을 치료하고/하고나 이의 발병을 지연시키기 위한 방법에 사용하기 위한 핵산(AAV 발현 카세트 포함), AAV 벡터, 및 조성물을 제공한다. 또한, 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF) 연관 질환을 치료하고/하거나 이의 발병을 지연시키기 위한 방법이 본원에 제공된다.

Description

레트 증후군의 치료를 위한 아데노 관련 바이러스 벡터
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 8월 19일에 출원된 미국 가출원 제63/067,668호의 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
기술분야
본 개시는 분자 생물학 및 유전자 요법 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 재조합 바이러스 벡터를 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
서열 목록의 통합
본원과 함께 전자적으로 제출된 다음의 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 포맷 사본(STRD_020_01WO_SeqList_ST25.txt, 기록된 날짜: 2021년 8월 19일, 파일 크기: 약 89,555 바이트)
레트(Rett) 증후군은 주로 생후 약 6개월 내지 18개월의 여아와 여성에서 나타나는 유전적 신경학적 장애이다. 8,500명의 여성 중 약 1명에게 영향을 미치는 레트 증후군은 희귀 질환이다. 레트 증후군 환자는 종종 언어 장애, 협응력 감소, 소두증, 반복 운동, 발작, 척추측만증 및 인지 장애를 포함하는 광범위한 증상을 나타낸다. 레트 증후군이 있는 여성의 기대 수명은 40대 중반이지만, 레트 증후군이 있는 남성은 종종 영아기에 사망한다.
레트 증후군은 mecp2 유전자의 돌연변이에 의해 야기되며, 이는 뉴런 기능 결함과 상관된다. 레트 증후군의 많은 경우는 mecp2 유전자의 새로운 돌연변이에 기인한다. 그러나, 소수의 경우, mecp2 돌연변이는 X-연관, 우성의 유전 패턴을 나타낸다. mecp2에서의 돌연변이는 또한 MECP2 복제 증후군 및 PPM-X 증후군과 같은 다른 질환을 유발하며, 자폐 스펙트럼 장애와 관련이 있을 수 있다.
레트 증후군 또는 다른 mecp2-연관 질환에 대한 알려진 치료제는 없다. 레트 증후군 증상은 일반적으로 항경련제, 특수 교육, 물리치료 및 보조기를 사용하여 관리된다. 유전자 요법은 레트 증후군을 치료하는 데 잠재적으로 유용한 방법이다. 그러나, 신경계를 표적으로 하는 유전자 요법은 종종 발현 시 증상을 완화시킬 수 있는 우측 뉴런 표적 유전자의 식별, 조절된 방식으로 이들 유전자의 높은 수준의 발현 촉진, 및 표적화된 방식으로 유전자 요법 작제물의 뉴런에 대한 전달을 포함하는 여러 기술적 장애물에 직면한다. 따라서, 레트 증후군, 및 다른 mecp2 연관 질환을 치료하는 조성물 및 방법에 대한 충족되지 않은 필요성이 존재한다.
본 개시는 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 카세트를 포함하는 핵산을 제공하며, 여기에서 AAV 발현 카세트는 5'에서 3'로: 5' 역위 말단 반복(ITR); 합성, 활성-의존성 프로모터; 레트 증후군-연관 유전자; 및 3' ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 레트-증후군-연관 유전자의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 MECP2-의존성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 뉴런의 즉각적인 초기 유전자의 프로모터로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴런의 즉각적인 초기 유전자는 Arc 유전자, c-fos 유전자, 및 egr-1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 최소 Arc 유전자 프로모터(ArcMin)를 포함한다.
일부 구현예에서, ArcMin은 인간 ArcMin(hArcMin)이다. 일부 구현예에서, hArcMin은 서열번호 12의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 고리형 AMP 반응 요소(CRE), 혈청 반응 요소(SRE), 시냅스 활성 반응 요소(SARE), MEF2 반응 요소, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 시냅스 활성 반응 요소(SARE)를 포함한다. 일부 구현예에서, 시냅스 활성 반응 요소(SARE)는 인간 시냅스 활성 반응 요소(hSARE)이다. 일부 구현예에서, hSARE는 서열번호 11의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 인간 ArcMin(hArcMin) 및 적어도 하나의 hSARE를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 hArcMin 및 하나의 hSARE를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 6의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 hArcMin 및 5개의 hSARE를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 16의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 뉴런 활성 의존성 전사 인자에 결합한다. 일부 구현예에서, 뉴런 활성 의존성 전사 인자는 cAMP-반응성 요소 결합 단백질(CREB), 근세포 인핸서 인자 2(MEF2), 혈청 반응 인자(SRF), 또는 Elk-1이다. 일부 구현예에서, 레트-증후군-연관 유전자는 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF1), 메틸-CpG-결합 단백질 2(MECP2), 헌팅틴 단백질, 헌팅턴-연관 단백질 1, 이소성 호메오박스 2(OTX-2), FXYD 도메인 함유 이온 수송 조절제 1(FXYD1), 뉴렉신-2-알파(NRXN2),또는 단백질 키나아제 C 감마(PRKCG)를 암호화한다. 일부 구현예에서, 레트-증후군-연관 유전자는 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)를 암호화한다. 일부 구현예에서, BDNF는 인간 BDNF이다. 일부 구현예에서, BDNF는 서열번호 7의 핵산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 약 110 내지 약 160 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 3' ITR과 동일한 길이이다. 일부 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 단리되거나 유래된다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 서열번호 1의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' ITR은 서열번호 2의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 카세트는 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF) 짧은(short) 3' UTR, 또는 BDNF 긴(long) 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, BDNF 짧은 3' UTR, 또는 BDNF 긴 3' UTR은 레트-증후군-연관 유전자와 3' ITR 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, AAV 카세트는 BDNF 짧은 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, BDNF 짧은 3' UTR은 서열번호 8의 핵산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 카세트는 BDNF 긴 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, BDNF 긴 3' UTR은 서열번호 10의 핵산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 카세트는 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 시미안 바이러스 40(SV40), rBG, α-글로빈, β-글로빈, 인간 콜라겐, 인간 성장 호르몬(hGH), 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬(hGH) 또는 소 성장 호르몬(bGH) 중 하나 이상의 유전자로부터 단리되거나 유래된 폴리아데닐화 신호이다. 일부 구현예에서, AAV 카세트는 bGH 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 구현예에서, bGH 폴리아데닐화 신호는 서열번호 9의 핵산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 카세트는 적어도 하나의 스터퍼 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 스터퍼 서열은 서열번호 13의 핵산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 코작 서열을 포함하되, 코작 서열은 레트-증후군-연관 유전자의 시작 코돈과 중첩된다. 일부 구현예에서, 코작 서열은 서열번호 14의 핵산 서열, 또는 이에 적어도 90% 동일한 서열; 또는 서열번호 15의 핵산 서열, 또는 이에 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 핵산 서열 서열번호 3, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 서열번호 4 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 또는 서열번호 5 또는 이에 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
본 개시는 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나를 포함하는 플라스미드를 제공한다. 본 개시는 또한 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나 또는 본원에 개시된 플라스미드 중 어느 하나를 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시는 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법을 추가로 제공하며, 방법은 AAV 생산자 세포를 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나, 또는 본원에 개시된 플라스미드 중 어느 하나와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 개시는 본원에 개시된 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 재조합 AAV 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV로부터 선택된 혈청형을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 AAV 벡터는 단일 가닥 AAV(ssAAV)이다. 일부 구현예에서, 재조합 AAV 벡터는 자가-상보성 AAV(scAAV)이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 야생형 AAV 캡시드 단백질과 비교하여, 하나 이상의 치환 또는 돌연변이를 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.
본 개시는 다음을 포함하는 조성물을 제공한다: (a) 본원에 개시된 핵산 중 임의의 하나, 본원에 개시된 플라스미드 중 임의의 하나, 본원에 개시된 세포 중 임의의 하나, 또는 본원에 개시된 재조합 AAV 벡터 중 임의의 하나; 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 담체. 본 개시는 레트-증후군 연관 유전자를 이를 필요로 하는 대상체에서 발현시키는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나, 본원에 개시된 플라스미드 중 어느 하나, 본원에 개시된 세포 중 어느 하나, 또는 본원에 개시된 재조합 AAV 벡터 중 어느 하나, 또는 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 레트 증후군을 갖는다.
본 개시는 대상체에서 레트-증후군의 발병을 치료하거나 지연시키는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나, 본원에 개시된 플라스미드 중 어느 하나, 본원에 개시된 세포 중 어느 하나, 또는 본원에 개시된 재조합 AAV 벡터 중 어느 하나, 또는 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시는 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF)를 이를 필요로 하는 대상체에서 발현시키는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나, 본원에 개시된 플라스미드 중 어느 하나, 본원에 개시된 세포 중 어느 하나, 또는 본원에 개시된 재조합 AAV 벡터 중 어느 하나, 또는 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체는 인지 장애, 또는 스트레스 관련 장애를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 우울증, 강박 장애, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 및 치매, 신경성 식욕부진 및 신경성 폭식증, 정신분열병, 간질, 외상 후 스트레스 장애, 비만, 레트 증후군, 또는 화학 요법 후 인지 장애를 갖는다.
본 개시는 대상체에서 BDNF-연관 질환의 발병을 치료하거나 지연시키는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나, 본원에 개시된 플라스미드 중 어느 하나, 본원에 개시된 세포 중 어느 하나, 또는 본원에 개시된 재조합 AAV 벡터 중 어느 하나, 또는 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, BDNF 연관 질환은 인지 장애 및/또는 스트레스 관련 장애이다. 일부 구현예에서, BDNF-연관 질환은 우울증, 강박 장애, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 및 치매, 신경성 식욕부진, 신경성 폭식증, 정신분열병, 간질, 외상 후 스트레스 장애, 양극성 질환, 레트 증후군, 또는 화학 요법 후 인지 장애이다.
본 개시는 대상체에서 MECP2-연관 질환의 발병을 치료하거나 지연시키는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 개시된 핵산 중 어느 하나, 본원에 개시된 플라스미드 중 어느 하나, 본원에 개시된 세포 중 어느 하나, 또는 본원에 개시된 재조합 AAV 벡터 중 어느 하나, 또는 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, MECP2 연관 질환은 MECP2 복제 증후군, MECP2-관련 중증 신생아 뇌병증, PPM-X 증후군, 또는 레트 증후군이다. 일 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 구현예에서, 핵산, 플라스미드, 세포, 재조합 AAV 벡터, 또는 조성물은 중추신경계 내로의 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자는 대상체의 뉴런에서 발현된다. 일부 구현예에서, 뉴런은 활성 뉴런이다.
이들 및 다른 구현예는 이하에서 설명되는 상세한 설명에서 보다 자세히 설명된다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 제작된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 본 특허 또는 컬러 도면(들)이 있는 특허 출원 공개물의 사본은 해당 기관에 요청 시 및 필요한 수수료의 지불 시 제공된다.
도 1은 hSARE-hArcMin 프로모터(서열번호 6), BDNF 유전자(서열번호 7), BDNF 짧은 3' UTR(서열번호 8) 및 스터퍼 서열(서열번호 13)을 포함하는 AAV 발현 카세트를 도시하며, 이들 모두는 5' ITR(서열번호 1) 및 3' ITR(서열번호 2)의 측면에 위치한다.
도 2는 hSARE-hArcMin 프로모터(서열번호 6), BDNF 유전자(서열번호 7), bGH polyA 신호(서열번호 9) 및 스터퍼 서열(서열번호 13)을 포함하는 AAV 발현 카세트를 도시하며, 이들 모두는 5' ITR(서열번호 1) 및 3' ITR(서열번호 2)의 측면에 위치한다.
도 3은 hSARE-hArcMin 프로모터(서열번호 6), BDNF 유전자(서열번호 7), 및 BDNF 긴 3' UTR(서열번호 10)을 포함하는 AAV 발현 카세트를 도시하며, 이들 모두는 5' ITR(서열번호 1) 및 3' ITR(서열번호 2)의 측면에 위치한다.
도 4는 구성("C") 프로모터, hSyn 또는 활성 의존성("AD") 프로모터, hSARE-hArcMin을 포함하는 리포터 유전자 발현을 위한 AAV 발현 카세트의 개략도를 도시한다. 발현 카세트의 요소는 또한 표 3에 열거되어 있다.
도 5a는 2 μM TTX로 치료한 세포의 형광에 대해, 테트로도독소(TTX)로 치료하지 않은 세포에서의 리포터 단백질 형광을 나타내는 막대 그래프이다. 도 5b는 2 μM TTX로 치료한 세포의 형광에 대해, 150 mM KCl로 치료한 세포에서의 리포터 단백질 형광을 나타내는 막대 그래프이다. 도 5c는 2 μM TTX로 치료한 세포의 형광에 대해, 30 uM 비큐쿨린(BIC)로 치료한 세포에서의 리포터 단백질 형광을 나타내는 막대 그래프이다. 각각의 막대는 X축 상에 표시된 감염 다중도(MOI)에서 표시된 AAV 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 세포의 상대적 형광을 나타낸다.
도 6a는, 표시된 바와 같이, 30 μM의 BIC로 치료하고, 추가로 2 μM의 TX로 치료하거나, TTX로 치료하지 않은 채로 방치된, 표시된 AAV 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 세포에서의 상대적 리포터 유전자 발현을 나타내는 그래프이다. 도 6b는, 표시된 바와 같이, 30 μM의 BIC로 치료하고, 추가로 2 μM의 TX로 치료하거나, TTX로 치료하지 않은 채로 방치된, 활성-의존성(AD) AAV 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 세포에서의 상대적 리포터 유전자 발현을 나타내는 막대 그래프이다.
도 7은 표시된 구성(C) AAV 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 뉴런의 mScarlet 형광(상단 이미지) 및 뉴런 마커, 항-베타 III 튜불린 항체(하단 이미지)로 염색한 것을 보여주는 현미경 이미지를 도시한다.
도 8은 다음을 나타내는 현미경 이미지를 도시한다: "AD-dmScar-bGH" AAV 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 뉴런의, Hoescht DNA 염색, dmScarlet 형광, 항-베타 III 투불린 항체 염색 및 오버레이 이미지. 상단 패널은 2 μM TTX 및 30 μM의 BIC로 치료한 세포의 이미지를 나타내고, 하단 패널은 TTX로 치료하지 않았지만 30 μM의 BIC로 치료한 세포의 이미지를 나타낸다.
도 9a는 서열번호 26의 핵산 서열을 포함하고, 다음의 요소: hSyn 프로모터(서열번호 38), mScarlet 유전자(서열번호 36), BDNF 짧은 3' UTR(서열번호 8) 및 스터퍼 서열(서열번호 13)(이들 모두는 5' ITR(서열번호 1) 및 3' ITR(서열번호 2)의 측면에 위치함)을 포함하는 AAV 발현 카세트를 도시한다. 도 9b는 서열번호 27의 핵산 서열을 포함하고, 다음의 요소: hSyn 프로모터(서열번호 38), mScarlet 유전자(서열번호 36), BDNF 긴 3' UTR(서열번호 10)(이들 모두는 5' ITR(서열번호 1) 및 3' ITR(서열번호 2)의 측면에 위치함)을 포함하는 AAV 발현 카세트를 도시한다. 도 9c는 서열번호 28의 핵산 서열을 포함하고, 다음의 요소: hSyn 프로모터(서열번호 38), mScarlet 유전자(서열번호 36), bGH polyA 신호(서열번호 9) 및 스터퍼 서열(서열번호 13)(이들 모두는 5' ITR(서열번호 1) 및 3' ITR(서열번호 2)의 측면에 위치함)을 포함하는 AAV 발현 카세트를 도시한다.
도 10a는 서열번호 29의 핵산 서열을 포함하고, 다음의 요소: hSyn 프로모터(서열번호 38), dmScarlet 유전자(서열번호 35), BDNF 짧은 3' UTR(서열번호 8) 및 스터퍼 서열(서열번호 13)(이들 모두는 5' ITR(서열번호 1) 및 3' ITR(서열번호 2)의 측면에 위치함)을 포함하는 AAV 발현 카세트를 도시한다. 도 10b는 서열번호 30의 핵산 서열을 포함하고, 다음의 요소: hSyn 프로모터(서열번호 38), dmScarlet 유전자(서열번호 35), BDNF 긴 3' UTR(서열번호 10)(이들 모두는 5' ITR(서열번호 1) 및 3' ITR(서열번호 2)의 측면에 위치함)을 포함하는 AAV 발현 카세트를 도시한다. 도 10c는 서열번호 31의 핵산 서열을 포함하고, 다음의 요소: hSyn 프로모터(서열번호 38), dmScarlet 유전자(서열번호 35), bGH polyA 신호(서열번호 9) 및 스터퍼 서열(서열번호 13)(이들 모두는 5' ITR(서열번호 1) 및 3' ITR(서열번호 2)의 측면에 위치함)을 포함하는 AAV 발현 카세트를 도시한다.
도 11a는 서열번호 32의 핵산 서열을 포함하고, 다음의 요소: hSARE-hArcMin 프로모터(서열번호 6), dmScarlet 유전자(서열번호 35), BDNF 짧은 3' UTR(서열번호 8) 및 스터퍼 서열(서열번호 13)(이들 모두는 5' ITR(서열번호 1) 및 3' ITR(서열번호 2)의 측면에 위치함)을 포함하는 AAV 발현 카세트를 도시한다. 도 11b는 서열번호 33의 핵산 서열을 포함하고, 다음의 요소: hSARE-hArcMin 프로모터(서열번호 6), dmScarlet 유전자(서열번호 35), BDNF 긴 3' UTR(서열번호 10)(이들 모두는 5' ITR(서열번호 1) 및 3' ITR(서열번호 2)의 측면에 위치함)을 포함하는 AAV 발현 카세트를 도시한다. 도 11c는 서열번호 34의 핵산 서열을 포함하고, 다음의 요소: hSARE-hArcMin 프로모터(서열번호 6), dmScarlet 유전자(서열번호 35), bGH polyA 신호(서열번호 9) 및 스터퍼 서열(서열번호 13)(이들 모두는 5' ITR(서열번호 1) 및 3' ITR(서열번호 2)의 측면에 위치함)을 포함하는 AAV 발현 카세트를 도시한다.
도 12는 다음을 나타내는 현미경 이미지를 도시한다: "AD-dmScar-긴UTR" AAV 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 뉴런의, Hoescht DNA 염색, dmScarlet 형광, 항-베타 III 투불린 항체 염색 및 오버레이 이미지. 상단 패널은 2 μM TTX 및 30 μM의 BIC로 치료한 세포의 이미지를 나타내고, 하단 패널은 TTX로 치료하지 않았지만 30 μM의 BIC로 치료한 세포의 이미지를 나타낸다.
레트 증후군은 주로 여아에서 발생하는 희귀한 유전적 신경학적 장애이다. 생후 6개월 내지 18개월 후에서의 명백한 해당 증후군의 증상은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 언어 문제, 조정 문제, 반복적인 동작, 성장 둔화, 보행 문제, 더 작은 머리 크기, 발작, 척추측만증, 인지 장애, 및 수면 문제. 레트 증후군 환자는 이들 증상의 임의의 조합을 나타낼 수 있으며, 각 증상의 중증도는 다양하다.
레트 증후군은 메틸 CpG 결합 단백질 2(MECP2) 단백질을 암호화하는 mecp2 유전자의 유전자 돌연변이에 의해 야기된다. 그 전체가 참조로서 본원에 통합되는 UniProt 수탁 번호 P51608을 참조한다. mecp2 유전자 중 620개가 넘는 돌연변이가 식별되었으며, 이들 중 많은 돌연변이는 단일 염기쌍 삽입 또는 결실이며, 이는 레트 증후군을 갖는 여성에서 확인되었다. MECP2는 신경 세포의 정상적인 기능에 기여하며 성숙한 신경 세포에 높은 수준으로 존재한다. MECP2 도메인의 메틸-CpG 결합(MBD)은 5-메틸 시토신 변형으로 DNA 영역을 인식할 수 있다. mecp2 유전자의 돌연변이는 또한 MECP2 복제 증후군, MECP2-관련 중증 신생아 뇌병증, 및 PPM-X 증후군과 같은 다른 질환을 유발할 수 있다. mecp2 유전자의 돌연변이와 연관된 질환을 치료하기 위해 승인된 치료법은 없다.
본 개시는 레트 증후군과 같은 mecp2 유전자의 돌연변이와 연관된 질환을 치료하고/하고나 이의 발병을 지연시키기 위한 방법에 사용하기 위한 핵산(AAV 발현 카세트 포함), AAV 벡터, 및 조성물을 제공한다. 또한, 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF) 연관 질환을 치료하고/하거나 이의 발병을 지연시키기 위한 방법이 본원에 제공된다.
정의
다음의 용어가 본원의 설명 및 첨부된 청구범위에 사용된다.
단수 형태 "일", "하나" 및 "한"은 문맥상 달리 명시되지 않는 한 복수 형태를 또한 포함하도록 의도된다.
또한, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 길이의 양, 투여량, 시간, 온도 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 때 본원에서 사용되는 용어 "약"은 특정 양의 ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변화를 포괄하는 것을 의미한다.
또한, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 하나 이상의 연관된 열거된 항목의 임의의 및 모든 가능한 조합뿐만 아니라, 대안적인("또는")으로 해석될 경우의 조합의 결여를 지칭하고 이를 포함한다.
용어 "야생형"은 당업자에 의해 이해되는 당업계에서의 용어이며, 돌연변이체 또는 변이체 형태와 구별되는 자연에서 발생하는 유기체, 계통, 유전자, 단백질 또는 특징의 일반적인 형태를 의미한다. 예를 들어, 야생형 단백질은 자연에서 발생하는 단백질의 일반적인 형태이다.
용어 "돌연변이 단백질"은 당업자에 의해 이해되는 당업계에서의 용어이며, 예를 들어, 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실과 같은 아미노산 변형의 존재에 기초하여 단백질의 야생형 형태와 구별되는 단백질을 지칭한다. 용어 "돌연변이 유전자"는 당업자에 의해 이해되는 당업계에서의 용어이며, 예를 들어, 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실과 같은 핵산 변형의 존재에 기초하여 유전자의 야생형 형태와 구별되는 유전자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 돌연변이 유전자는 돌연변이 단백질을 암호화한다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 염기의 서열, 예를 들어 RNA, DNA 또는 DNA-RNA 혼성 서열(자연 발생 및 비-자연 발생 뉴클레오티드 둘 모두를 포함함)이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산은 단일 또는 이중 가닥 DNA 서열이다. 핵산은 1 내지 1,000개, 1,000 내지 10,000개, 10,000 내지 100,000개, 100,000 내지 1백만개 또는 1백만개 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 핵산은 일반적으로 인산디에스테르 결합을 함유할 것이지만, 일부 경우에, 예를 들어, 포스포아미드, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, O-메틸포스포로아미디트 결합, 및 펩티드 핵산 골격 및 결합을 포함하는, 대안적인 골격을 가질 수 있는 핵산 유사체를 함유할 수 있다. 다른 유사체 핵산은 양성 골격, 비-이온성 골격, 및 비-리보오스 골격을 갖는 것들을 포함한다. 하나 이상의 탄소환 당을 함유하는 핵산 또한 핵산의 정의 내에 포함된다. 리보오스-포스페이트 골격의 이러한 변형은 표지의 첨가를 용이하게 하거나, 생리학적 환경에서 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시킬 수 있다. 본 개시의 핵산은 선형일 수 있거나, 원형(예를 들어, 플라스미드)일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 작동가능하게 연결된 핵산의 전사를 유도하는 하나 이상의 핵산 조절 서열을 지칭한다. 프로모터는 TATA 요소와 같은, 전사 시작 부위 근처에 핵산 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 전사 인자에 의해 결합될 수 있는 시스-작용 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
"구성적" 프로모터는 대부분의 환경 및 발달 조건 하에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경 또는 발달 조절 하에 활성인 프로모터이다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예컨대, 프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 여기에서 발현 조절 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 유도한다.
"AAV 발현 카세트"는 재조합 AAV 벡터에 포장되는 핵산이며, 하나 이상의 이식 유전자를 암호화하는 서열을 포함한다. AAV 벡터가 표적 세포와 접촉될 경우, 이식 유전자는 표적 세포에 의해 발현된다.
본원에서 사용되는 용어 "바이러스 벡터", "바이러스의 벡터", 또는 "유전자 전달 벡터"는 핵산 전달 비히클로 기능하고, 비리온 내에 포장된 핵산(예를 들어, AAV 발현 카세트)을 포함하는 바이러스 입자를 지칭한다. 본 개시의 예시적인 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터(AAV), 렌티바이러스 벡터, 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "아데노-연관 바이러스"(AAV)는, 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3(유형 3A 및 3B 포함), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, AAV 유형 12, AAV 유형 13, AAV 유형 rh32.33, AAV 유형 rh8, AAV 유형 rh10, AAV 유형 rh74, AAV 유형 hu.68, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 뱀 AAV, 턱수염 도마뱀 AAV, AAV2i8, AAV2g9, AAV-LK03, AAV7m8, AAV Anc80, AAV PHP.B, 및 현재 알려져 있거나 나중에 발견될 임의의 다른 AAV. 예를 들어, 표 1을 참조한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
용어 "바이러스 생산 세포", "바이러스 생산 세포주" 또는 "바이러스 생산자 세포"는 바이러스 벡터를 생산하는 데 사용되는 세포를 지칭한다. HEK293 및 239T 세포는 통상적인 바이러스 생산 세포주이다. 아래의 표 2는 다양한 바이러스 벡터에 대한 예시적인 바이러스 생산 세포주를 열거한다.
Figure pct00003
"HEK293"은 조직 배양에서 성장시킨 인간 배아 신장 세포로부터 유래된 세포주를 지칭한다. HEK293 세포주는 배양 시 쉽게 성장하며, 바이러스 생산에 통상적으로 사용된다. 본원에서, "HEK293"은 또한 하나 이상의 변이체 HEK293 세포주, 즉 원래의 HEK293 세포주로부터 유래된 하나 이상의 유전자 변경을 추가로 포함하는 세포주를 지칭할 수 있다. 많은 변이체 HEK293 주가 하나 이상의 특정 응용에 대해 개발되고 최적화되었다. 예를 들어, 293T 세포주는 SV40 복제 기점을 함유하는 형질감염된 플라스미드의 에피솜 복제를 가능하게 하는 SV40 큰 T-항원을 함유하여, 원하는 유전자 산물의 발현을 증가시킨다.
"Sf9"는 부모 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포주 IPLB-Sf-21-AE로부터 유래된 클론 단리주인 곤충 세포주를 지칭한다. Sf9 세포는 혈청의 부재 하에 성장될 수 있고, 부착되거나 현탁된 상태로 배양될 수 있다.
"형질감염 시약"은 세포 내로의 핵산의 전달을 향상시키는 조성물을 의미한다. 당업계에서 일반적으로 사용되는 일부 형질감염 시약은 핵산 및 세포 표면에 결합하는 하나 이상의 지질(예를 들어, LipofectamineTM)을 포함한다.
2개 이상의 아미노산 서열 간의 서열 유사성 또는 동일성을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 서열 유사성 또는 동일성은, 로컬 서열 동일성 알고리즘(Smith 및 Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482(1981)), 서열 동일성 정렬 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, J Mol. Biol. 48,443 (1970)), 유사성 검색 방법(Pearson 및 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,2444(1988)), 이들 알고리즘의 전산화된 구현(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), Best Fit 시퀀스 프로그램(Devereux 등, Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984)), 또는 검사를 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
다른 적절한 알고리즘은 Altschul 등(J Mol. Biol. 215, 403-410, (1990)) 및 Karlin 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993))이 기술한 BLAST 알고리즘이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은, Altschul 등(Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996)); http://blast.wustl/edu/blast/ README.html로부터 획득한 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는 선택적으로 기본값으로 설정된 여러 개의 검색 파라미터를 사용한다. 파라미터는 동적 값이고, 관심 서열이 검색되는 특정 서열의 조성 및 특정 데이터베이스의 조성에 따라 프로그램 자체에 의해 설정되지만, 민감도의 증가를 위해 값을 조정하는 것이 가능하다.
또한, Altschul 등((1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402)에 의해 보고된 바와 같이, 추가적인 유용한 알고리즘은 gapped BLAST이다.
본원에서 사용되는 "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화" 또는 "경감"은 상호 교환적으로 사용된다. 이들 용어는 치료적 이익 및/또는 예방적 이익을 포함하지만 이에 한정되지 않는 유익하거나 바람직한 결과를 얻기 위한 접근법을 지칭한다. 치료적 이익은 치료 중인 하나 이상의 질환, 병태 또는 증상의 임의의 치료적으로 관련된 개선을 지칭한다. 예방적 이익을 위해, 조성물은 특정 질환, 병태, 또는 증상이 발생할 위험이 있는 대상체에게 투여되거나, 질환, 병태, 또는 증상이 아직 나타나지 않았더라도 질환의 생리학적 증상 중 하나 이상을 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 포유동물과 같은 척추동물을 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 포유동물은, 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 양, 말, 비인간 영장류(예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 침팬지), 또는 인간일 수 있다. 생체 내에서 수득되거나 시험관 내에서 배양된 대상체의 조직, 세포 또는 이의 유도체 또한 이에 포함된다. 인간 대상체는 성인, 십대, 아동(2세 내지 14세), 영아(1개월 내지 24개월), 또는 신생아(최대 1개월)일 수 있다. 일부 구현예에서, 성인은 약 65세 이상, 또는 약 60세 이상의 노인이다. 일부 구현예에서, 대상체는 임신한 여성 또는 임신하고자 하는 여성이다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은, 예를 들어 유익하거나 원하는 결과를 달성하기에 충분한 제제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 치료 중인 대상체 및 질환 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 용이하게 쉽게 결정될 수 있다. 특정 투여량은, 선택된 특정 제제, 따라야 할 투여 요법, 다른 화합물과의 병용 투여 여부, 투여 시기, 촬영될 조직, 및 그것이 운반되는 물리적 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자 요법"은 비정상적인 유전자를 보상하거나 치료 단백질을 만들기 위해 유전 물질을 세포 내로 도입하는 방법을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이. 뉴런은 뉴런 원형질막의 적어도 일부가 탈분극화될 때 "활성" 뉴런으로 지칭되거나, "뉴런 활성"을 갖는 것으로 지칭된다. 일부 구현예에서, 탈분극화는 전압-관문 Na+ 채널의 개방에 의해 야기된다. 일부 구현예에서, 뉴런 원형질막의 탈분극화는 Ca2+ 이온의 세포 내로의 유입으로 이어지고, 이는 즉각적인 초기 유전자(IEG)의 하류 전사를 유발한다. 생체 내에서, 시냅스-후 뉴런의 형질막의 적어도 일부의 탈분극화는 시냅스-전 뉴런으로부터의 신호에 의해 유발될 수 있다. 시험관 내에서, 탈분극화는 KCl로 뉴런을 치료함으로써 유도될 수 있다. 탈분극화는 또한, 일반적으로 Cl - 또는 K+ 채널을 개방함으로써 탈분극화를 지체시키는 γ-아미노부티르산 A형(GABAA) 수용체와 같은 신호 수용체를 불활성화하기 위해 소분자(예를 들어, 비큐쿨린)를 사용함으로써 시험관 내에서 촉진될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 뉴런은, 뉴런의 원형질막을 가로지르는 이온의 순 유동이 없을 때 "휴지" 뉴런인 것으로 지칭된다. 일부 구현예에서, 휴지 뉴런 원형질막의 어떠한 부분도 탈분극화되지 않는다. 일부 구현예에서, 휴지 뉴런은 약 -70 mV의 휴지기 막 전위를 갖는다.
AAV 발현 카세트
본 개시는 하나 이상의 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 카세트를 포함하는 핵산 서열을 제공한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 5' 역위 말단 반복(ITR), 프로모터, 이식유전자, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, 이식 유전자는 레트 증후군 관련 유전자이다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 코작 서열, 폴리아데닐화 서열, 및/또는 스터퍼 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 3의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 70% 동일한 서열(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 4의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 70% 동일한 서열(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 5의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 70% 동일한 서열(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 포함한다.
(i) 역위 말단 반복
역위 말단 반복 또는 ITR 서열은 AAV 프로바이러스 통합 및 AAV DNA의 비리온 내로의 포장을 매개하는 서열이다. ITR은 다양한 AAV 수명 주기의 활성에 관여한다. 예를 들어, 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 ITR 서열은 형질감염 후 플라스미드로부터의 절제, 벡터 게놈의 복제, 및 숙주 세포 게놈으로부터의 통합 및 구제에서 역할을 한다.
본 개시의 AAV 발현 카세트는 5' ITR 및 3' ITR을 포함할 수 있다. ITR 서열은 약 110 내지 약 160개 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 또는 160개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, ITR 서열은 약 141개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 3' ITR과 동일한 길이이다. 일부 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 3' ITR보다 더 길고, 다른 구현예에서, 3' ITR은 5' ITR보다 더 길다.
ITR은 임의의 AAV, 예를 들어 표 1에 열거된 AAV의 게놈으로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 단리되거나 유래된다. 일부 구현예에서, 5' ITR 및 3'ITR 중 적어도 하나는 AAV 이외의 다른 파보바이러스 종의 구성원으로부터 단리된 야생형 또는 돌연변이된 ITR일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, ITR은 보카바이러스 또는 파보바이러스 B19로부터 단리되거나 유래된 야생형 또는 돌연변이체 ITR일 수 있다.
일부 구현예에서, ITR은 scAAV의 생산을 촉진하기 위한 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, scAAV의 생산을 촉진하기 위한 변형은 ITR로부터의 말단 분해 서열(TRS)의 결실이다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 야생형 ITR이고, 3' ITR은 말단 분해 서열이 결여된 돌연변이된 ITR이다. 일부 구현예에서, 3' ITR은 야생형 ITR이고, 5' ITR은 말단 분해 서열이 결여된 돌연변이된 ITR이다. 일부 구현예에서, 말단 분해 서열은 5' ITR 및 3'ITR 둘 모두에 결여되어 있다. 다른 구현예에서, scAAV의 생산을 촉진하기 위한 변형은 shRNA-형성 서열과 같은 상이한 헤어핀-형성 서열로 ITR을 치환하는 것이다.
일부 구현예에서, 5' ITR은 서열번호 1의 서열, 또는 이에 대해 적어도 70% 동일한 서열(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 3' ITR은 서열번호 2의 서열, 또는 이에 대해 적어도 70% 동일한 서열(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 서열번호 1의 서열을 포함하고, 3' ITR은 서열번호 2의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 하나 이상의 "대리" ITR, 즉 ITR과 동일한 기능을 제공하는 비-ITR 서열을 포함한다. 예를 들어, Xie, J. 등, Mol. Ther., 25(6): 1363-1374(2017)를 참조한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트 내의 ITR은 대리 ITR로 대체된다. 일부 구현예에서, 대리 ITR은 헤어핀 형성 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 대리 ITR은 짧은 헤어핀 (sh)RNA-형성 서열이다.
(ii) 활성 의존성 프로모터
일부 구현예에서, 본원에 기술된 AAV 발현 카세트는 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 합성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 내인성 프로모터 및/또는 내인성 인핸서로부터 유래된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유전자의 개시 코돈의 상류 영역으로부터 유래된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 개시 코돈의 상류의 약 8000 bps 내에서, 예를 들어, 약 10 bps, 50 bps, 100 bps, 500 bps, 1000 bps, 1500 bps, 2000 bps, 2500 bps, 3000 bps, 3500 bps, 4000 bps, 4500 bps, 5000 bps, 5500 bps, 6000 bps, 6500 bps, 7000 bps, 7500 bps, 또는 8000 bps 내에서(이들 사이의 모든 하위 범위 및 값을 포함함), 시작 코돈의 상류의 1염기쌍 (BP) 내에 놓일 수 있다.
임의의 이론에 구속되지 않고, MECP2 기능은 뉴런 기능에 관여하는 표적 유전자의 발현에 기여하는 것으로 여겨진다. MECP2가 돌연변이될 경우, 이들 표적 유전자의 발현이 영향을 받는다. MECP2 독립적 방식으로 이들 표적 유전자의 발현을 복원하는 것은 MECP2 돌연변이와 연관되거나 이에 의해 야기되는 질환의 증상을 완화시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 프로모터는 MECP2-의존성 프로모터이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "MECP2-독립 프로모터"는 MECP2 기능 감소 또는 MECP2 기능 상실에 의해 기능이 손상되지 않는 프로모터를 지칭한다.
임의의 이론에 구속되지 않고, 뉴런 기능에 관여하는 표적 유전자의 구성적 발현은 유해할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터의 기능은 하나 이상의 자극의 존재에 의존한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 활성-의존성 프로모터이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "뉴런 활성-의존성 프로모터"와 상호 교환적으로 사용되는 "활성-의존성 프로모터"의 기능은 뉴런 활성에 의해 유도된다. 일부 구현예에서, 활성-의존성 프로모터는 칼슘 이온의 뉴런 내로의 유입에 의해 유도된다. 일부 구현예에서, 활성-의존성 프로모터는 세포(예컨대, 뉴런)에서 구성적으로 발현될 때 해로운 임의의 표적 유전자의 발현을 유도하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 프로모터는 뉴런의 즉각적인 초기 유전자의 프로모터 및/또는 인헨서로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다. 뉴런의 즉각적인 초기 유전자의 식별에는 제한이 없으며, 당업계에 공지되거나 향후 식별될 임의의 뉴런의 즉각적인 초기 유전자를 지칭할 수 있다. 뉴런의 즉각적인 초기 유전자의 비제한적인 예는 Arc 유전자, c-fos 유전자, 및 egr-1 유전자를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 프로모터는 Arc 유전자, c-fos 유전자, 또는 egr-1 유전자의 프로모터 및/또는 인핸서로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 뉴로트로핀 유전자의 프로모터 및/또는 인핸서로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다. 뉴로트로핀 유전자의 비제한적인 예는 bdnf(뇌 유래 신경영양 인자) 유전자, ngf(신경 성장 인자) 유전자, 뉴로트로핀-3 유전자 및 뉴로트로핀-4 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 하나 이상의 뉴런 활성 의존성 전사 인자에 결합할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "뉴런 활성 의존성 전사 인자"는 뉴런 활성에 반응하여 활성화되는 전사 인자이다. 일부 구현예에서, 뉴런 활성 의존성 전사 인자는 뉴런 활성에 반응하여 유전자 발현을 촉진한다. 일부 구현예에서, 뉴런 활성 의존성 전사 인자는 뉴런 활성에 반응하여 유전자 발현을 억제한다. 일부 구현예에서, 뉴런 활성 의존성 전사 인자는 칼슘-의존성 키나아제 캐스케이드에 의해 활성화된다.
일부 구현예에서, 프로모터는 하나 이상의 뉴런 활성 의존성 전사 인자에 결합할 수 있는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 뉴런 활성 의존성 전사 인자의 비제한적인 예는 cAMP-반응성 요소 결합 단백질(CREB), 근세포 인핸서 인자 2(MEF2), 혈청 반응 인자(SRF), 또는 Elk-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 하나 이상의 뉴런 활성 의존성 전사 인자에 결합할 수 있으며, 예를 들어, 프로모터는 2, 3, 4 또는 5개의 뉴런 활성 의존성 전사 인자에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 2개의 뉴런 활성 의존성 전사 인자에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 3개의 뉴런 활성 의존성 전사 인자에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 다음의 뉴런 활성 의존성 전사 인자에 결합할 수 있다: CREB, MEF2 및 SRF.
일부 구현예에서, 프로모터는 하나 이상의 반응 요소를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "반응 요소"는 자극제의 존재 하에 유전자 발현을 유도하는 데 기여하는 프로모터의 영역이다. 일부 구현예에서, 반응 요소는 프로모터가 자극제의 존재 하에 유전자 발현을 유도하는 데 있어서 중요하다. 자극제의 비제한적인 예는 호르몬; 열 또는 광과 같은 환경 조건; 및 칼슘과 같은 화학 이온을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 칼슘의 존재 하에 유전자 발현을 유도하는 반응 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 뉴런의 즉각적인 초기 유전자의 프로모터에 존재하는 반응 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 Arc 유전자, c-fos 유전자, 및/또는 egr-1 유전자의 프로모터에 존재하는 반응 요소를 포함한다.
일부 구현예에서, 반응 요소는 다음 중 하나 이상을 포함한다: 환형 AMP 반응 요소(CRE), 혈청 반응 요소(SRE), 시냅스 활성 반응 요소(SARE), 및 MEF2 반응 요소(MRE). 일부 구현예에서, 프로모터는 하나 이상의 CRE; 하나 이상의 SRE; 하나 이상의 SRE; 하나 이상의 MRE, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 반응 요소는 하나 이상의 신경 활성 의존성 전사 인자에 결합한다. 일부 구현예에서, CRE는 CREB에 결합한다. 일부 구현예에서, SRE는 SRF에 결합한다. 일부 구현예에서, MRE는 MEF2에 결합한다. 일부 구현예에서, SAE는 CREB, MEF2 및 SRF에 결합한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 1 내지 20개의 SARE, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 SARE를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 1개의 SARE를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 5개의 SARE를 포함한다. 일부 구현예에서, SARE는 마우스 SARE이다. 일부 구현예에서, SARE는 인간 시냅스 활성 반응 요소(hSARE)이다. 일부 구현예에서, hSARE는 서열번호 11의 핵산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, hSARE는 서열번호 11의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 Arc 유전자의 프로모터로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Arc 유전자는 마우스 Arc 유전자이다. 일부 구현예에서, Arc 유전자는 인간 Arc 유전자이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 Arc 유전자의 -300 내지 +300에 걸쳐 있는 핵산 영역, 또는 이의 임의의 하위 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 최소 Arc 유전자 프로모터(ArcMin)를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 ArcMin(hArcMin)은 Arc 유전자의 짧은 상류 서열 및 5' UTR(-276 내지 +208)을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스 ArcMin(mArcMin)은 Arc 유전자의 짧은 상류 서열 및 5' UTR(-222 내지 +198)을 포함한다. 일부 구현예에서, hArcMin은 서열번호 12의 핵산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, hArcMin은 서열번호 12의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 hArcMin 및 적어도 하나의 hSARE를 포함한다. 프로모터에서의 hSARE의 수는 제한되지 않으며, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 hSARE와 같은 1개의 hSARE 내지 20개의 hSARE의 범위에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 hArcMin 및 하나의 hSARE를 포함한다(SARE-ArcMin로 지칭됨). 일부 구현예에서, SARE-ArcMin은 서열번호 6의 핵산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, SARE-ArcMin은 서열번호 6의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 hArcMin 및 5개의 hSARE를 포함한다(E-SARE로 지칭됨). 일부 구현예에서, E-SARE는 서열번호 16의 핵산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, E-SARE는 서열번호 16의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. hArcMin 및 hSARE에 관한 추가의 세부 사항은 Kawashima 둥(Nat Methods 10, 889-895 (2013)), Kawashima 둥(Front Neural Circuits 2014 Apr 23; 8:37) 및 Kawashima 등(PNAS January 6, 2009 106 (1) 316-32)에 제공되며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 프로모터는, Arc 유전자, c-fos 유전자, 또는 egr-1 유전자와 같은, 뉴런의 즉각적인 초기 유전자의 내인성 프로모터보다 높은 유전자 발현 수준을 유도한다. 일부 구현예에서, 프로모터는, Arc 유전자, c-fos 유전자, 또는 egr-1 유전자와 같은, 뉴런의 즉각적인 초기 유전자의 내인성 프로모터보다 적어도 1.5배 높은 유전자 발현 수준을 유도한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 Arc 유전자, c-fos 유전자 또는 egr-1 유전자와 같은 뉴런의 즉각적인 초기 유전자의 내인성 프로모터보다 약 1.5배 내지 약 100배(예를 들어, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 또는 약 100배) 더 높은 유전자 발현 수준을 유도한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 당업계에서 유전자 발현을 위해 통상적으로 사용되는 하나 이상의 프로모터로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 프로모터는, CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥣과 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 루스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, 이수소엽산 환원효소(DHFR) 프로모터, 포스포글리콜 키나아제(PGK) 프로모터로부터 유래된 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, EF-1 알파 프로모터, 또는 EF-1 알파 짧은 프로모터로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 17 내지 20 중 어느 하나로부터 선택되는 서열, 또는 이에 대해 적어도 70% 동일한 서열(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 AAV 발현 카세트는 인핸서를 추가로 포함한다. 인핸서는, 예를 들어 CMV 인핸서일 수 있다. 일부 구현예에서, 인핸서는 서열번호 21의 서열, 또는 이에 대해 적어도 70% 동일한 서열(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 포함한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 다음의 프로모터 중 어느 하나 이상으로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다: HMG-COA 환원효소 프로모터; 스테롤 조절 요소 1(SRE-1); 포스포에놀 피루브산 카르복시 키나아제(PEPCK) 프로모터; 인간 C-반응성 단백질(CRP) 프로모터; 인간 글루코키나아제 프로모터; 콜레스테롤 7-알파 히드로일라아제(CYP-7) 프로모터; 베타-갈락토시다아제 알파-2,6 시알릴전이효소 프로모터; 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP-1) 프로모터; 알돌라아제 B 프로모터; 인간 트랜스페린 프로모터; 콜라겐 I형 프로모터; 전립선 산성 인산분해효소(PAP) 프로모터; 94 (PSP 94) 프로모터의 전립선 분비 단백질; 전립선 특이적 항원 복합체 프로모터; 인간 선상 칼리크레인 유전자 프로모터(hgt-1); 근세포 특이적 인핸서 결합 인자 MEF-2; 근육 크레아틴 키나아제 프로모터; 췌장염 연관 단백질 프로모터(PAP); 엘라스타아제 1 전사 인핸서; 췌장 특이적 아밀라아제 및 엘라스타아제 인핸서 프로모터; 췌장 콜레스테롤 에스테라아제 유전자 프로모터; 우테로글로빈 프로모터; 콜레스테롤 측쇄 절단(SCC) 프로모터; 감마-감마 에놀라아제(뉴런-특이적 에놀라아제, NSE) 프로모터; 신경미세섬유 중쇄(NF-H) 프로모터; 인간 CGL-1/그랜자임 B 프로모터; 말단 데옥시 전이효소(TdT), 람다 5, VpreB, 및 lck (림프구 특이적 티로신 단백질 키나아제 p561ck) 프로모터; 인간 CD2 프로모터 및 이의 3' 전사 인핸서; 인간 NK 및 T 세포 특이적 활성화(NKG5) 프로모터; pp60c-src 티로신 키나아제 프로모터; 기관 특이적 신생항원(OSN), mw 40 kDa (p40) 프로모터; 결장 특이적 항원-P 프로모터; 인간 알파-락트알부민 프로모터; 포스포에홀피루브산 카르복시키나아제(PEPCK) 프로모터, HER2/neu 프로모터, 카세인 프로모터, IgG 프로모터, 융모성 배아 항원 프로모터, 엘라스타아제 프로모터, 포르포빌리노겐 데아미나아제 프로모터, 인슐린 프로모터, 성장 호르몬 인자 프로모터, 티로신 히드록실라아제 프로모터, 알부민 프로모터, 알파태아단백질 프로모터, 아세틸-콜린 수용체 프로모터, 알코올 탈수소효소 프로모터, 알파 또는 베타 글로빈 프로모터, T 세포 수용체 프로모터, 오스테오칼신 프로모터 IL-2 프로모터, IL-2 수용체 프로모터, 웨이(wap) 프로모터, 및 MHC 클래스 II 프로모터.
(iii) 레트 증후군 연관 유전자
본원에서 사용되는, "레트 증후군 연관 유전자"는 레트 증후군을 갖는 대상체에서, 레트 증후군의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 완화시키기 위해 유전자 요법에 의해 표적화될 수 있는 임의의 유전자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자에 의해 암호화된 단백질의 수준은 레트 증후군 대상체에서 감소되거나 검출 불가능해진다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자에 의해 암호화된 단백질의 수준은 레트 증후군의 적어도 하나의 증상의 발생 시 감소한다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자에 의해 암호화된 단백질의 수준은 출생 후 정상적인 발달 및/또는 신경 발달에서 증가한다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자는 정상적인 뉴런 기능에 기여하는 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자는 시냅스 가소성을 촉진 및/또는 유지하는 데 관여하는 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자는 뉴로트로핀이다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자의 돌연변이 또는 레트 증후군 연관 유전자의 기능 상실이 레트 증후군을 갖는 대상체 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자의 돌연변이 또는 레트 증후군 연관 유전자의 기능 상실은 레트 증후군을 야기한다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자의 돌연변이, 또는 특히 전뇌 흥분 뉴런에서의 레트 증후군 연관 유전자의 기능 상실은, mecp2 유전자의 상실과 유사한 증상을 야기한다. 돌연변이의 유형에는 제한이 없으며, 삽입, 결실, 복제 및/또는 치환일 수 있다.
본 개시는 레트 증후군 연관 유전자를 포함하는 AAV 발현 카세트를 제공한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 치료적(예를 들어, 의료 또는 수의학적 용도) 또는 면역원성(예를 들어, 백신) 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 암호화하는 레트 증후군 연관 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 포유류 레트 증후군 연관 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 인간 레트 증후군 연관 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는, 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF1), 메틸-CpG-결합 단백질 2(MECP2), 헌팅틴 단백질, 헌팅턴-연관 단백질 1, 이소성 호메오박스 2(OTX-2), FXYD 도메인 함유 이온 수송 조절제 1(FXYD1), 뉴렉신-2-알파(NRXN2),또는 단백질 키나아제 C 감마(PRKCG)를 암호화하는 레트 증후군 연관 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자이다: KCNA1(칼륨 전압-과문 채널 서브패밀리 A 멤버 1), GABRA1(감마-아미노부티르산 A형 수용체 서브유닛 Alpha1, MAPK1(미토겐-활성화 단백질 키나아제 1), NRXN2(Neurexin 2), RBFOX1(RNA 결합 Fox-1 상동체 1), GNAO1(G 단백질 서브유닛 알파 O1), NCAN(Neurocan), PRKCG(단백질 키나아제 C 감마), KCNJ4(칼륨 내부 정류 채널 서브패밀리 J 멤버 4), CAMK2B(칼슘/칼모둘린 의존성 단백질 키나아제 II 베타), EFNB3(Ephrin B3), GABBR1(감마-아미노부티르산 B형 수용체 서브유닛 1), LY6H(림프구 항원 6 패밀리 멤버 H), KCNA2(칼륨 전압-관문 채널 서브패밀리 A 멤버 2), 및 NEFL(신경필라멘트 경쇄).
일부 구현예에서, 레트-증후군-연관 유전자는 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)를 암호화한다. BDNF는 뉴런의 생존 및 성장, 시냅스 발생, 및 가소성을 지원하는 기능을 하는 뉴로트로핀이다. BDNF 발현은 레트 증후군에서 변경된다. bdnf의 기능 상실은 mecp2의 기능 상실과 유사한 표현형을 야기하며, BDNF 기능은 mecp2 기능의 상실에 영향을 받는다. BDNF 기능에 대한 보다 자세한 내용은, Eduardo E. Benarroch(Neurology 2015년 4월, 84 (16) 1693-1704); Chang 등 (Neuron. 2006; 49(3):341-348); 및 Zhou 등(Neuron 52, 255-269, 2006년 10월 19일)을 참조하며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, BDNF는 인간 BDNF이다. 일부 구현예에서, BDNF는 서열번호 7의 핵산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, BDNF는 서열번호 7의 핵산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열에 의해 암호화된다.
BDNF 내에는 2개의 교번하는 폴리아데닐화 전사 정지 부위가 있으며, 이는 짧은 3' UTR(약 0.35 kb 길이) 또는 긴 3' UTR(약 2.85 kb 길이) 중 어느 하나를 갖는, bdnf mRNA의 2개의 구별되는 집단을 생성한다. 짧은 3' UTR을 갖는 bdnf mRNA 변이체는 뉴런의 세포체에 대부분 국소화되는 반면, 긴 3' UTR을 갖는 bdnf mRNA 변이체는 또한 수지상에 국소화된다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 BDNF 짧은 3' UTR, 또는 BDNF 긴 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, BDNF 짧은 3' UTR 또는 BDNF 긴 3' UTR은 정지 코돈과 3' ITR 사이에 존재한다.
일부 구현예에서, BDNF 짧은 3' UTR은 서열번호 8의 핵산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, BDNF 짧은 3' UTR은 서열번호 8의 핵산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, BDNF 짧은 3' UTR은 서열번호 10의 핵산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, BDNF 긴 3' UTR은 서열번호 10의 핵산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 코작 서열을 포함한다. 코작 서열은 많은 진핵 mRNA 전사체에서 단백질 번역 개시 부위로서 기능하는 핵산 서열이다. 일부 구현예에서, 코작 서열은 시작 코돈과 중첩된다. 일부 구현예에서, 코작 서열은 서열번호 14 또는 서열번호 15의 핵산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 코작 서열은 서열번호 14의 핵산 서열, 또는 이에 적어도 90% 동일한 서열; 또는 서열번호 15의 핵산 서열, 또는 이에 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
(iv) 폴리아데닐화(PolyA) 신호
폴리아데닐화 신호는 거의 모든 포유류 유전자에서 발견되는 뉴클레오티드 서열이며, 유전자 전사체의 3' 말단에 대략 200개의 아데노신 잔기(poly(A) 꼬리)의 스트링의 첨가를 조절한다. poly(A) 꼬리는 mRNA 안정성에 기여하고, poly(A) 꼬리가 결여된 mRNA는 신속하게 분해된다. 또한, poly(A) 꼬리의 존재가 번역의 개시에 영향을 미침으로써 mRNA의 번역가능성에 긍정적으로 기여한다는 증거가 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 AAV 발현 카세트는 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는, 시미안 바이러스 40(SV40),rBG, α-글로빈, β-글로빈, 인간 콜라겐, 인간 성장 호르몬(hGH), 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬(hGH) 및 소 성장 호르몬(bGH)으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 bGH 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 구현예에서, bGH 폴리아데닐화 신호는 서열번호 9의 핵산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, bGH 폴리아데닐화 신호는 서열번호 9의 핵산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호이다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 rBG 폴리아데닐화 신호이다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호 22 또는 서열번호 23의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호 22 또는 서열번호 23의 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
(v) 스터퍼 서열
AAV 벡터는 일반적으로 약 4 kb 내지 약 5.2 kb인, 정의된 크기 범위 또는 이보다 약간 더 큰 크기를 갖는 DNA의 삽입체를 수용한다. 따라서, 더 짧은 서열에 대해, AAV 벡터에 대해 허용 가능한 필요한 길이를 달성하기 위해 삽입 단편에 추가의 핵산을 포함하는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시의 AAV 발현 카세트는 스터퍼 서열을 포함할 수 있다. 스터퍼 서열은, 예를 들어, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1,000, 1,000-1,500, 1,500-2,000, 2,000-2,500, 2,500- 3,000, 3,000-3,500, 3,500-4,000, 4,000-4,500, 또는 4,500-5,000, 또는 이 범위 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는 서열이다. 스터퍼 서열은 임의의 원하는 위치에서 카세트 내에 위치할 수 있으며, 이에 따라 벡터의 기능 또는 활성이 방지되지 않는다. 일부 구현예에서, 스터퍼 서열은 3' UTR의 상류에 위치한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 스터퍼 서열은 BDNF 짧은 3' UTR과 3' ITR 사이, 또는 bGH polyA 신호와 3' ITR 사이에 존재한다.
일부 구현예에서, AAV 카세트는 적어도 하나의 스터퍼 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 스터퍼 서열은 서열번호 13의 핵산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 스터퍼 서열은 서열번호 13의 핵산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
(vi) 인트론 서열
일부 구현예에서, 본 개시의 AAV 발현 카세트는 인트론 서열을 포함할 수 있다. 인트론 서열을 포함시킴으로써, 인트론 서열의 부재 시의 발현과 비교하여 발현을 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 인트론 서열은 혼성 또는 키메라 서열이다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은, SV40, β-글로빈, 닭 베타-액틴, 마우스의 미세 바이러스(MVM), 인자 IX, 및/또는 인간 IgG(중쇄 또는 경쇄) 중 하나 이상의 인트론 서열로부터 단리되거나 유래된다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 키메라이다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 서열번호 24 또는 서열번호 25의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 서열번호 24 또는 서열번호 25의 핵산 서열에 대해 적어도 70%의 동일성(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성, 이 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함함)을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
(vii) 예시적인 AAV 발현 카세트
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 5' 역위 말단 반복(ITR), 프로모터, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 7 (BDNF) 및 서열번호 2 (3' ITR)을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 5' ITR, 프로모터, 이식유전자, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 6 (hSARE-ArcMin), 서열번호 7 (BDNF) 및 서열번호 2 (3' ITR)을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 16 (E-SARE), 서열번호 7 (BDNF) 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 5' ITR, 프로모터, 이식유전자, 폴리아데닐화 서열 및 3' ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 6 (hSARE-ArcMin), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 9 (bGH 폴리아데닐화 서열) 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 16 (E-SARE), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 9 (bGH 폴리아데닐화 서열) 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 5' ITR, 프로모터, 코작 서열, 이식유전자, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 6 (hSARE-ArcMin), 서열번호 14 또는 15 (Kozak 서열), 서열번호 7 (BDNF), 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 16 (E-SARE), 서열번호 14 또는 15 (코작 서열), 서열번호 7 (BDNF), 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 5' ITR, 프로모터, 코작 서열, 이식유전자, 폴리아데닐화 서열 및 3' ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 6 (hSARE-ArcMin), 서열번호 14 또는 15 (Kozak 서열), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 9 (bGH 폴리아데닐화 서열) 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 16 (E-SARE), 서열번호 14 또는 15 (코작 서열), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 9 (bGH 폴리아데닐화 서열) 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 5' ITR, 프로모터, 이식유전자, 3' UTR 및 3' ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 6 (hSARE-ArcMin), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 8 (BDNF 짧은 3'UTR), 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 16 (E-SARE), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 8 (BDNF 짧은 3'UTR), 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 6 (hSARE-ArcMin), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 10 (BDNF 긴 3'UTR), 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 16 (E-SARE), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 10 (BDNF 긴 3'UTR), 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 5' ITR, 프로모터, 이식유전자, 3' UTR, 폴리아데닐화 서열 및 3' ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 6 (hSARE-ArcMin), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 8 또는 10 (BDNF 짧거나 긴 3'UTR), 서열번호 9 (bGH 폴리아데닐화 서열) 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 16 (E-SARE), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 8 또는 10 (BDNF 짧거나 긴 3'UTR), 서열번호 9 (bGH 폴리아데닐화 서열) 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 5' ITR, 프로모터, 코작 서열, 이식유전자, 3' UTR 및 3' ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 6 (hSARE-ArcMin), 서열번호 14 또는 15 (Kozak 서열), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 8 또는 10 (BDNF 짧거나 긴 3'UTR), 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 16 (E-SARE), 서열번호 14 또는 15 (코작 서열), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 8 또는 10 (BDNF 짧거나 긴 3'UTR), 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 5' ITR, 프로모터, 코작 서열, 이식유전자, 3' UTR, 폴리아데닐화 서열 및 3' ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 6 (hSARE-ArcMin), 서열번호 14 또는 15 (Kozak 서열), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 8 또는 10 (BDNF 짧거나 긴 3'UTR), 서열번호 9 (bGH 폴리아데닐화 서열) 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 16 (E-SARE), 서열번호 14 또는 15 (코작 서열), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 8 또는 10 (BDNF 짧거나 긴 3'UTR), 서열번호 9 (bGH 폴리아데닐화 서열) 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 5' ITR, 스터퍼 서열, 프로모터, 코작 서열, 이식유전자, 3' 미번역 영역 (3' UTR), 폴리아데닐화 서열 및 3' ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 13 (스터퍼 서열), 서열번호 6 (hSARE-ArcMin), 서열번호 14 또는 15 (Kozak 서열), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 8 또는 10 (BDNF 짧거나 긴 3'UTR), 서열번호 9 (bGH 폴리아데닐화 서열) 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 13 (스터퍼 서열), 서열번호 16 (E-SARE), 서열번호 14 또는 15 (코작 서열), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 8 또는 10 (BDNF 짧거나 긴 3'UTR), 서열번호 9 (bGH 폴리아데닐화 서열) 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 5' ITR, 프로모터, 코작 서열, 이식유전자, 3' 미번역 영역 (3' UTR), 폴리아데닐화 서열, 스터퍼 서열 및 3' ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 6 (hSARE-ArcMin), 서열번호 14 또는 15 (Kozak 서열), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 8 또는 10 (BDNF 짧거나 긴 3'UTR), 서열번호 9 (bGH 폴리아데닐화 서열) 및 서열번호 13 (스터퍼 서열), 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 1 (5' ITR), 서열번호 13 (스터퍼 서열), 서열번호 16 (E-SARE), 서열번호 14 또는 15 (코작 서열), 서열번호 7 (BDNF), 서열번호 8 또는 10 (BDNF 짧거나 긴 3'UTR), 서열번호 9 (bGH 폴리아데닐화 서열) 및 서열번호 13 (스터퍼 서열), 및 서열번호 2 (3' ITR)를 포함한다.
AAV 생산 방법
본원에 기술된 AAV 발현 카세트는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 배크미드(bacmid))에 혼입될 수 있다. 본 개시는 본원에 기술된 AAV 발현 카세트 중 어느 하나를 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 배크미드)는, 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 단백질 서열을 포함하는, AAV의 생산 중에 사용되는 하나 이상의 유전자 요소를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기술된 AAV 발현 카세트, 및 AAV 발현 카세트를 포함하는 벡터(예를 들어, 플라스미드)를 사용하여 재조합 AAV 벡터를 생산할 수 있다.
본 개시는 AAV 생산자 세포(예를 들어, HEK293 세포)를 본 개시의 AAV 발현 카세트 또는 벡터(예를 들어, 플라스미드)와 접촉시키는 단계를 포함하는 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법을 제공한다. 본 개시는 본원에 개시된 AAV 발현 카세트 또는 벡터 중 어느 하나를 포함하는 세포를 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은, AAV 생산자 세포를, 예를 들어 AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 단백질 서열을 암호화하는 하나 이상의 추가 플라스미드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법은, AAV 생산자 세포(예를 들어, Sf9 세포와 같은 곤충 세포)를 본 개시의 AAV 발현 카세트를 포함하는 적어도 하나의 곤충 세포 호환 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. "곤충 세포 호환 벡터"는, 핵산으로 곤충 세포의 형질전환 또는 형질감염을 용이하게 하는 임의의 (생물학적 또는 화학적) 화합물 또는 제형이다. 일부 구현예에서, 곤충 세포 호환 벡터는 바큘로바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 방법은 AAV가 생산되는 조건 하에서 곤충 세포를 유지하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시는 본원에 개시된 방법 중 어느 하나를 사용하여 생산된 재조합 AAV 벡터를 제공한다. 생산된 재조합 AAV 벡터는 임의의 혈청형, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 생산된 재조합 AAV 벡터는 천연 AAV 캡시드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환 및/또는 결실)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 AAV 벡터는, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV로부터 유래된 변형된 AAV 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 AAV 벡터는 단일 가닥 AAV(ssAAV)이다. 일부 구현예에서, 재조합 AAV 벡터는 자가-상보성 AAV(scAAV)이다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 야생형 AAV 캡시드 단백질과 비교하여, 하나 이상의 치환 또는 돌연변이를 갖는 캡시드 단백질을 포함한다. 본원에 개시된 재조합 AAV 벡터는, 예를 들어 재조합 AAV 벡터를 표적 세포와 접촉시키는 단계에 의해, 이식유전자 서열로 표적 세포를 형질도입하는 데 사용될 수 있다.
발현 및 치료 방법
본 개시는 본원에 개시된 핵산, AAV 발현 카세트, 플라스미트, 세포, 또는 재조합 AAV 벡터 중 어느 하나를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 및/또는 비히클, 예를 들어, 용매, 완충제, 용액, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 비히클은 식염수, 완충 식염수, 덱스트로오스, 물, 글리세롤, 멸균 등장성 수성 완충액, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 비히클은 인산염 완충 식염수, 멸균 식염수, 락토오스, 수크로오스, 인산칼슘, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩 오일, 참기름, 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아린산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 또는 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 소량의 유화제 또는 습윤제, 또는 pH 완충제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 다른 종래의 약학적 성분, 예컨대 보존제, 또는 화학적 안정제, 예컨대 클로로부탄올, 소르브산칼륨, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 파라클로로페놀 또는 알부민을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 항균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 또는 티메로살; 등장제, 예컨대 당류 또는 염화나트륨 및/또는 흡수 지연 제제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시는 본원에 기술된 핵산, AAV 발현 카세트, 플라스미드, 재조합 AAV 벡터, 또는 조성물 중 어느 하나와 세포를 접촉시킴으로써, 세포 내로 레트 증후군 연관 유전자를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 분열 세포, 예컨대 세포 배양에서 배양된 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 비분열 세포이다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자는, 생체 내 유전자 요법을 위해, 예를 들어, 시험관 내에서 레트 증후군 연관 폴리펩티드를 생산하도록, 시험관 내에서 세포에 전달된다.
일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자는 이를 필요로 하는 대상체에게 전달되어, 예를 들어, 면역원성 폴리펩티드 또는 치료 폴리펩티드를 발현시킨다. 이러한 방식으로, 폴리펩티드 또는 기능성 RNA는 대상체의 생체 내에서 생산될 수 있다. 따라서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서 레트 증후군 연관 유전자를 발현시키는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 개시된 핵산, AAV 발현 카세트, 플라스미드, 세포, 재조합 AAV 벡터, 또는 조성물 중 어느 하나의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시는 또한 대상체에서 레트 증후군의 적어도 하나의 증상을 치료하고/하거나 그 발병을 지연시키기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 개시된 핵산, AAV 발현 카세트, 플라스미드, 세포, 재조합 AAV 벡터, 또는 조성물 중 어느 하나의 핵산 중 어느 하나의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 레트 증후군을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 레트 증후군이 발병할 위험이 높다; 예를 들어, 대상체는 mecp2 유전자에 돌연변이를 가진 것으로 확인된 신생아이다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자는 유전자 요법에 의해 표적화되어 그의 발현 및/또는 기능을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자는 유전자 요법에 의해 표적화되어 그의 발현 및/또는 기능을 감소시킨다.
본 개시는 대상체에서 MECP2 연관 질환을 치료하고/하거나 이의 발병을 지연시키는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 개시된 핵산, AAV 발현 카세트, 플라스미드, 세포, 재조합 AAV 벡터, 또는 조성물 중 어느 하나의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는, "MECP2 연관 질환"은 야생형 mecp2 유전자와 비교하여, mecp2 유전자에 대한 유전적 변화(예를 들어, 하나 이상의 결실, 삽입, 복제 및/또는 치환) 및/또는 야생형 MECP2 단백질과 비교하여 MECP2 단백질의 발현 및/또는 활성에 대한 변경과 상관되거나 이에 의해 야기되는 질환이다.
일부 구현예에서, MECP2 연관 질환은 MECP2 복제 증후군, MECP2-관련 중증 신생아 뇌병증, PPM-X 증후군, 또는 레트 증후군이다. MECP2 복제 증후군은 MECP2 유전자의 복제에 의해 야기되며, 지적 장애, 발달 지연 및 발작을 특징으로 한다. MECP2 유전자의 복제는 여분의 MECP2 단백질의 생성 및 단백질 기능의 증가를 야기하여, 비정상적인 신경 기능을 초래한다. MECP2 관련 중증 신생아 뇌병증은 mecp2 유전자의 돌연변이에 의해 야기되며, 이들 돌연변이 중 대부분은 단일 염기쌍 삽입, 결실 또는 치환이다. 이러한 병태는 거의 전적으로 남성에게 영향을 미치며, 작은 머리 크기(소두증), 운동 장애, 호흡 문제 및 발작을 특징으로 한다. mecp2 유전자에서의 돌연변이는 MECP2 단백질의 구조를 변경하거나 생성되는 단백질의 양을 감소시킬 수 있다. PPM-X 증후군은 경증 내지 중증 지적 장애, 양극성 장애, 및 운동 이상의 패턴을 특징으로 하는 질환이다. 모든 PPM-X 증후군 사례의 약 절반은 mecp2 유전자의 8개의 돌연변이 중 하나에 의해 야기된다. 이들 돌연변이는 MECP2 단백질에서의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 야기하거나, mecp2 mRNA에서 조기 정지 신호를 생성한다.
본 개시는 대상체에서 BDNF 연관 질환을 치료하고/하거나 이의 발병을 지연시키는 방법을 추가로 제공하며, 방법은 본원에 개시된 핵산, AAV 발현 카세트, 플라스미드, 세포, 재조합 AAV 벡터, 또는 조성물 중 어느 하나의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 "BDNF 연관 질환"은 bdnf 유전자에 대한 유전적 변화, 및/또는 BDNF 단백질의 발현 및/또는 활성의 변화와 상관되거나 이에 의해 야기되는 질환이다. 일부 구현예에서, BDNF 연관 질환은 인지 장애 및/또는 스트레스 관련 장애이다. 일부 구현예에서, BDNF 연관 질환은 우울증, 강박 장애, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 치매, 신경성 식욕부진, 신경성 폭식증, 정신분열병, 간질, 외상 후 스트레스 장애, 양극성 질환, 레트 증후군, 또는 화학 요법 후 인지 장애이다.
일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자는 대상체의 뉴런에서 발현된다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자의 발현 수준은 신체의 비-신경 세포에서보다 뉴런에서 더 높다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자의 발현은 비-신경 세포에서는 검출되지 않는다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자의 발현 수준은, 해당 신체의 비-신경 세포에서의 발현 수준에 비해, 뉴런에서 적어도 약 1.2배(예를 들어, 약 1.5배, 약 2배, 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 약 5배, 약 5.5배, 약 6배, 약 6.5배, 약 7배, 약 7.5배, 약 8배, 약 8.5배, 약 9배, 약 9.5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배 약 90배, 또는 약 100배, 이들 사이에 있는 모든 값 및 하위범위를 포함함) 높다.
일부 구현예에서, 뉴런은 활성 뉴런이다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자의 발현 수준은 신체의 휴지 뉴런에서보다 활성 뉴런에서 더 높다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자의 발현은 휴지 뉴런에서 검출되지 않는다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자의 발현 수준은, 휴지 뉴런에서의 발현 수준에 비해, 활성 뉴런에서 적어도 약 1.2배(예를 들어, 약 1.5배, 약 2배, 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 약 5배, 약 5.5배, 약 6배, 약 6.5배, 약 7배, 약 7.5배, 약 8배, 약 8.5배, 약 9배, 약 9.5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배 약 90배, 또는 약 100배, 이들 사이에 있는 모든 값 및 하위범위를 포함함) 높다.
일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자는 대상체의 중추신경계(CNS) 뉴런에서 발현된다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자의 발현 수준은, 해당 신체의 비-신경 세포에서의 발현 수준에 비해, CNS 뉴런에서 적어도 약 1.2배(예를 들어, 약 1.5배, 약 2배, 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 약 5배, 약 5.5배, 약 6배, 약 6.5배, 약 7배, 약 7.5배, 약 8배, 약 8.5배, 약 9배, 약 9.5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배 약 90배, 또는 약 100배, 이들 사이에 있는 모든 값 및 하위범위를 포함함) 높다.
일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자의 발현 수준은 해당 신체의 말초 신경계(PNS) 뉴런과 같은 다른 비-CNS 뉴런에서보다 CNS 뉴런에서 더 높다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자의 발현은 PNS 뉴런에서 검출되지 않는다. 일부 구현예에서, 레트 증후군 연관 유전자의 발현 수준은, 해당 신체의 말초 신경계(PNS) 뉴런과 같은 비-CNS 뉴런에서의 발현 수준에 비해, CNS 뉴런에서 적어도 약 1.2배(예를 들어, 약 1.5배, 약 2배, 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 약 5배, 약 5.5배, 약 6배, 약 6.5배, 약 7배, 약 7.5배, 약 8배, 약 8.5배, 약 9배, 약 9.5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배 약 90배, 또는 약 100배, 이들 사이에 있는 모든 값 및 하위범위를 포함함) 높다.
대상체에게 투여될 재조합 AAV 벡터의 투여량은 투여 방식, 치료 및/또는 예방될 질환 또는 병태, 개별 대상체의 병태, 특정 바이러스 벡터 또는 캡시드, 및 전달될 핵산 등에 따라 달라지며, 이는 통상적인 방식으로 결정될 수 있다. 치료 효과를 달성하기 위한 예시적인 투여량은 적어도 약 105 , 약 106, 약 107, 약 108, 약 109, 약 1010 , 약 1011, 약 1012, 약 1013, 약 1014, 약 1015의 형질도입 유닛, 선택적으로 약 108 내지 약 1013 형질도입 유닛의 역가이다.
특정 구현예에서, 다양한 간격, 예를 들어, 매일, 매주, 매월, 매년 등의 기간에 걸쳐 원하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해 1회 이상의 투여(예를 들어, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상 투여)가 사용될 수 있다.
예시적인 투여 모드는 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입(예를 들어, 에어로졸을 통한 흡입), 구강(예를 들어, 설하선), 질, 경막내, 안구내, 경피, 자궁내(또는 난소내), 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 근육내[골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에 대한 투여를 포함함], 피내, 흉막내, 뇌내, 및 관절내), 국소(예를 들어, 피부와 점막 표면 모두, 기도 표면, 및 경피 투여를 포함함), 림프구내 등, 그리고 직접적인 조직 또는 기관 주사(예를 들어, 간, 골격근, 심장 근육, 횡격막 근육 또는 뇌에 대한 주사)를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 중추 신경계 내로의 주사에 의한 것이다. 임의의 주어진 경우에서의 가장 적절한 경로는 치료 및/또는 예방되는 병태의 성질 및 중증도, 및 사용되고 있는 특정 벡터의 성질에 따라 달라질 것이다.
표적 조직에 대한 전달은 또한 바이러스 벡터 및/또는 캡시드를 포함하는 데포(depot)를 전달함으로써 달성될 수 있다. 대표적인 구현예에서, 바이러스 벡터 및/또는 캡시드를 포함하는 데포가 골격, 심장 및/또는 횡격막 근육 조직 내로 이식되거나, 해당 조직이 바이러스 벡터 및/또는 캡시드를 포함하는 막 또는 다른 매트릭스와 접촉할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 핵산, AAV 발현 카세트, 플라스미드, 세포, 재조합 AAV 벡터, 또는 조성물 중 어느 하나의 치료적 유효량을 레트 증후군을 표적화하는 하나 이상의 이차 요법과 병용하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된, 대상체에서 레트 증후군의 적어도 하나의 증상을 치료하고/하고나 이의 발병을 지연시키는 방법은 레트 증후군을 표적화하는 하나 이상의 이차 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이차 요법은 글라티라머 아세테이트의 투여를 포함한다. 글라티라머 아세테이트의 사용에 관한 보다 상세한 내용은 Djukic A 등(Pediatr Neurol. 2016 8월;61:51-7)을 참조하고, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 이차 요법은 다음을 포함한다: 발작을 치료하기 위한 약물의 투여, 역류를 치료하기 위한 약물의 투여, 또는 이의 조합. 일부 구현예에서, 이차 요법은 발작을 치료하기 위한 약물의 투여를 포함한다. 발작을 치료하기 위한 약물의 비제한적인 예는 레비티라세탐, 발프로산, 옥스카르바제핀 및 라모트리긴을 포함한다. 일부 구현예에서, 이차 요법은 역류를 치료하기 위한 약물의 투여를 포함한다. 역류를 치료하기 위한 약물의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: H2 차단제, 예건대 시메티딘, 라니티딘, 니자티딘, 및 파모티딘; 양성자 펌프 억제제, 예컨대 오메프라졸, 에소메프라졸, 란소프라졸, 라베프라졸, 판토프라졸, 및 덱스란소프라졸; 및 운동성 제제, 예컨대 저 투여량 에리트로마이신, 벤즈아미드, 돔페리돈 및 리나크로티드.
본원에서 사용되는 용어, "병용하여 투여되는"은, 환자에 대한 치료의 효과가 특정 시점에 중첩되도록, 대상체가 장애(예를 들어, 레트 증후군)를 앓고 있는 과정 동안 2개(또는 그 이상)의 상이한 치료가 대상체에게 전달되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 특정 구현예에서, 일 치료의 전달은 제2 치료의 전달이 시작될 때 여전히 진행 중이므로, 투여의 측면에서 볼 때 중첩이 존재한다. 이는 본원에서 때때로 "동시" 또는 "공존" 전달로 지칭된다. 다른 구현예에서, 일 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 종료되며, 이는 "순차" 전달로 지칭될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료는 병용 투여로 인해 보다 효과적이다. 예를 들어, 제2 치료는 보다 효과적이다; 예를 들어, 제2 치료의 더 적은 횟수로 동등한 효과가 관찰되거나, 제2 치료는 제2 치료가 제1 치료의 부재 하에 투여되거나, 제1 치료에서 유사한 상황이 관찰되는 경우보다 더 큰 정도로 증상을 감소시킨다. 2개의 치료의 효과는 부분적으로 부가적이거나, 완전히 부가적이거나, 부가적인 것 보다 더 클 수 있다(상승적).
본 명세서에 인용된 모든 논문, 간행물 및 특허는, 각각의 개별 논문, 간행물 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참고로서 포함되는 것으로 표시되고, 간행물이 인용되는 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 본원에 참고로서 포함되는 것과 마찬가지로 본원에 참고로서 포함된다. 그러나, 본원에 인용된 참고문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 공개 및 특허 출원 중 어느 하나에 대한 언급은, 유효한 선행 기술을 구성하거나 세계 어느 국가에서도 일반적인 일반 지식의 일부를 구성한다는 인정 또는 임의의 형태의 제안으로서 이해되어서는 안 된다.
문맥이 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기술된 다양한 특징은 임의의 조합으로 사용될 수 있도록 구체적으로 의도된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
전술한 설명뿐만 아니라 이어지는 실시예는 본 발명의 범위를 예시하는 것으로 의도되며, 이를 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내의 다른 양태, 장점 및 변형은 본 발명이 속하는 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
다음의 실시예는 단지 예시를 위해 본원에 포함되며, 본원의 내용을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: AAV 발현 카세트의 제조
5' ITR(서열번호 1) 및 3' ITR(서열번호 2)이 측면에 위치하는, 활성 의존성 hSARE-hArcMin 프로모터(서열번호 6) 및 BDNF 유전자(서열번호 7)를 포함하는 3개의 AAV 발현 카세트를 표준 클로닝 기술을 사용하여 생성하였다. 3개의 카세트의 개략도를 도시하는 도 1 내지 도 3을 참조한다. 제1 카세트는 BDNF 짧은 3' UTR(서열번호 8) 및 스터퍼 서열(서열번호 13)을 포함한다. 제2 카세트는 bGH polyA 신호(서열번호 9) 및 스터퍼 서열(서열번호 13)을 포함한다. 제3 카세트는 BDNF 긴 3' UTR(서열 번호 10)을 포함한다. 3개의 AAV 발현 카세트는, 각각 서열번호 3(도 1), 서열번호 4(도 2), 및 서열번호 5(도 3)의 핵산 서열을 포함한다.
실시예 2: 포유류 세포에서의 재조합 AAV 벡터의 제조
3개의 AAV 발현 카세트 각각을 포함하는 3개의 플라스미드를 수득하기 위해, 3개의 AAV 발현 카세트 각각을 플라스미드에 혼입시켰다. 3개의 플라스미드 각각은 적절한 형질감염 시약(예를 들어, LipofectamineTM)을 사용하여, Rep 및 Cap 유전자를 암호화하는 Rep/Cap 플라스미드, 및 AAV 생산에 필요한 다양한 헬퍼 서열을 포함하는 헬퍼 플라스미드(E4, E2a 및 VA)와 함께 바이러스 생산 세포(예를 들어, HEK293) 내로 형질감염된다. 37°C에서 소정의 기간 동안 인큐베이션한 후, 배지로부터 AAV 입자를 수집하거나 세포를 용해시켜 AAV 입자를 방출하였다. 이어서, AAV 입자는 정제하고 적정한 후, 나중에 사용하기 위해 -80°C에서 보관될 수 있다.
실시예 3: 곤충 세포에서의 재조합 AAV 벡터의 제조
3개의 AAV 발현 카세트 각각을 포함하는 3개의 바큘로바이러스 벡터를 수득하기 위해, 3개의 AAV 발현 카세트 각각을 바큘로바이러스 벡터에 혼입시켰다. 곤충 세포(예를 들어, Sf9)는 현탁 배양물에서, 3개의 바큘로바이러스 벡터 각각, 및 AAV Rep 및 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 재조합 바큘로바이러스 벡터와 공동 감염된다. 28°C에서 소정의 기간 동안 인큐베이션한 후, 배지로부터 AAV 입자를 수집하거나 세포를 용해시켜 AAV 입자를 방출하였다. 이어서, AAV 입자는 정제하고 적정한 후, 나중에 사용하기 위해 -80°C에서 보관될 수 있다.
실시예 4: hSARE-hArcMin 프로모터는 활성 의존성 리포터 유전자 발현을 유도함
hSARE-hArcMin 프로모터가 뉴런 활성에 의존적인 방식으로 유전자 발현을 유도할 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, 다음 실험을 수행하였다.
뉴런에서 장기 발현을 유도하는 구성 프로모터(hSyn; 서열번호 38의 핵산 서열을 포함하는 인간 시냅신 1 유전자 프로모터) 또는 활성 의존성 프로모터(hSARE-hArcMin, 서열번호 6)를 포함하는 AAV 발현 카세트를 표준 클로닝 기술을 사용하여 생성하였다(표 3 참조). 도 4, 도 9a 내지 9c, 도 10a 내지 10c, 및 도 11a 내지 11c는 이들 카세트의 개략도를 도시한다. 카세트는 다음의 3'UTR 서열 중 하나를 포함한다: BDNF 짧은 3' UTR(서열번호 8), bGH polyA 신호("bGHpA" 또는 "bGH"로 지칭됨, 서열번호 9), 또는 BDNF 긴 3' UTR(서열번호 10). 카세트는 또한 구성 프로모터 또는 활성 의존성 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함한다. 리포터 유전자는 단량체 적색 형광 단백질(mScarlet, 서열번호 36의 핵산 서열에 의해 암호화됨), 또는 mScarlet의 불안정화된 버전(dmScarlet, 핵산 서열 서열번호 35에 의해 암호화됨)을 암호화한다. mScarlet의 불안정화된 버전은 C-말단 PEST 데그론 신호(핵산 서열 서열번호 37에 의해 암호화됨)를 포함하며, 이는 mScarlet과 비교하여, 프로테아좀 분해에 의해 유도되는 보다 빠른 회전율을 촉진한다. 따라서, dmScarlet 형광은 mScarlet 형광보다 더 낮은 정도로 세포에 축적된다.
Figure pct00004
표 3에 열거된 AAV 발현 카세트 1, 2, 3, 7, 8 및 9를 포함하는 재조합 AAV 벡터를 본원에 기술된 바와 같이 제조하였다. 야생형 마우스 일차 뉴런을 이들 재조합 AAV 벡터 각각으로 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 2 μM의 나트륨 채널 억제제, 테트로도독소(TTX)로 밤새 치료하였다. TTX 치료는 뉴런 활성을 억제한다. 그 후, 배지를 완전히 흡입하고 이를 다음 중 어느 하나로 교체하였다: (a) 배지 단독, (b) 배지 + TTX, (c) 배지 + 150 mM KCl, 또는 (d) 배지 + 30 uM 비큐쿨린(BIC). KCl은 뉴런을 탈분극화하며, BIC는 γ-아미노부티르산 A형(GABAA) 수용체의 경쟁 길항제이며 뉴런의 탈억제를 유도한다. 따라서, KCl 또는 BIC로 뉴런을 치료하는 것은 뉴런 활성을 촉진한다. (전술한 치료 (a)에 따른) 배지 단독 내에 배치된 대조군 뉴런은 억제되지도 활성화되지도 않았고, 안정 상태에 있는 반면, (전술한 치료 (b)에 따른) TTX를 함유하는 배지 내에 배치된 뉴런의 활성은 억제되었다. 세포를 37°C에서 2시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 고정시키고, Hoescht 33342로 염색하고, 형광 현미경을 사용하여 영상화하였다.
도 5a는 1로 정규화된 2 μM TTX로 치료된 세포의 형광에 비해, TTX로 치료되지 않은 세포(즉, 뉴런 활성이 촉진되거나 억제되지 않는 세포)에서의 리포터 단백질 형광을 나타낸다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 뉴런 활성이 촉진되거나 억제되지 않을 경우, hSARE-hArcMin 프로모터를 사용하여 dmScarlet 발현을 유도하는 AAV 벡터로 형질도입된 세포의 상대적 형광은 구성 프로모터 hSyn을 사용하여 mScarlet 발현을 유도하는 AAV 벡터로 형질도입된 세포의 상대적 형광과 유사하다.
도 5b는 1로 정규화된 2 μM TTX로 치료된 세포의 형광에 비해, TTX로 치료되지 않았지만 그 대신 150 mM KCl로 치료된(즉, 뉴런 활성이 촉진된 세포)에서의 리포터 단백질 형광을 나타낸다. 도 5c는 1로 정규화된 2 μM TTX로 치료된 세포의 형광에 비해, TTX로 치료되지 않았지만 그 대신 30 uM 비큐쿨린으로 치료된(즉, 뉴런 활성이 촉진된 세포)에서의 리포터 단백질 형광을 나타낸다.
도 5b 및 도 5c에 도시된 바와 같이, KCl 또는 BIC 치료를 사용하여 뉴런 활성이 촉진될 경우, 활성 의존성 프로모터인 hSARE-hArcMin을 사용하여 dmScarlet 발현을 유도하는 AAV 벡터로 형질도입된 세포의 상대적 형광은 구성 프로모터(hSyn)를 사용하여 mScarlet 발현을 유도하는 AAV 벡터로 형질도입된 세포의 상대적 형광보다 높다.
이들 결과는 hSARE-hArcMin 프로모터가 뉴런 활성에 의존하는 방식으로 유전자 발현을 유도할 수 있음을 입증한다. 도 5b 및 도 5c에 도시된 바와 같이, bGH 또는 긴 3'UTR을 포함하는 dmScarlet 작제물은 hSARE-hArcMin 프로모터에 의해 유사하게 발현되었다.
hSARE-hArcMin 프로모터의 활성 의존성 발현은 도 6a 및 6b에 추가로 도시된다. 도 6a에 도시된 바와 같이, 구성 프로모터인 hSyn은 TTX의 존재와 상관없이 높은 수준의 mScarlet 발현을 유도한다. 놀랍게도, 도 6b는, 세포가 TTX로 치료되지 않고 그 대신 뉴런 활성을 촉진하도록 30 uM의 BIC로 치료될 경우, hSARE-hArcMin 프로모터가 높은 수준의 리포터 유전자 발현을 유도한다는 것을 나타낸다. 특히, 도 6b는, 긴 3'UTR과 조합하여 hSARE-hArcMin 프로모터를 포함하는 AAV 발현 작제물은, bGHpA와 조합하여 hSARE-hArcMin 프로모터를 포함하는 AAV 발현 작제물과 비교하여, TTX의 존재 시에 약 5배 더 높은 수준의 dmScarlet 발현을 초래하였음을 나타낸다. 이러한 결과는 hSARE-hArcMin 프로모터의 뉴런 활성 의존성 유도를 추가로 입증한다.
발현된 형광 단백질의 서브세포 국소화 및 수준을 결정하기 위해, 구성 hSyn 프로모터 또는 활성 의존성 hSARE-hArcMin 프로모터 하에 리포터 유전자를 발현하는 뉴런을 현미경을 사용하여 관찰하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, 구성 프로모터 hSyn을 사용하여 mScarlet을 발현하는 세포는 형광이었지만, 해당 형광 수준은 발현 카세트의 3'UTR 영역 또는 폴리아데닐화 신호에 기초하여 다양하였다. 예를 들어, 긴 3'UTR을 포함하는 발현 카세트는 보다 높은 수준의 mScarlet 유전자 발현을 야기하였고, 짧은 3'UTR을 포함하는 발현 카세트의 발현은 이보다 낮았다. 짧은 3'UTR을 포함하는 발현 카세트는 상당히 낮은 수준의 mScarlet 유전자 발현을 야기하였다. 대조적으로, 활성 의존성 hSARE-hArcMin 프로모터 하에서의 리포터 단백질의 발현은 사용된 3'UTR의 유형에 대해 변화가 없었다. 특히, 도 5 및 도 6은 bGHpA 또는 긴 3'UTR과 조합하여 hSARE-hArcMin 프로모터를 포함하는 AAV 발현 작제물이 뉴런 활성의 존재 하에서 유사한 수준의 dmScarlet 발현을 야기하였음을 나타낸다.
또한, 도 7은 구성 프로모터로부터 발현된 mScarlet의 서브세포 국소화가 발현 카세트의 3'UTR 영역 또는 폴리아데닐화 신호에 대해 다양함을 나타낸다. 긴 3'UTR 및 bGHpA를 포함하는 발현 카세트는 세포체 및 신경돌기에서 mScarlet 발현을 야기하였지만, 짧은 3'UTR을 포함하는 발현 카세트는 세포체에서만 mScarlet 발현을 야기하였다.
도 8 및 도 12에 도시된 바와 같이, bGHpA(도 8) 또는 긴 3'UTR(도 12)과 조합하여 hSARE-hArcMin 프로모터를 포함하는 AAV 발현 작제물은 뉴런 활성의 존재 하에서 유사한 수준의 dmScarlet 발현을 야기하였다. 또한, 활성 의존성 hSARE-hArcMin 프로모터를 사용하여 dmScarlet을 발현하는 세포는 뉴런 활성화 시(TTX의 부재 및 BIC의 존재 시) 세포체 및 신경돌기에서 형광 신호를 나타냈다.
요약하면, 전술한 결과는, 합성 hSARE-hArcMin 프로모터가, 억제되거나 휴지인 뉴런과 비교하여, 활성인 뉴런에서 보다 높은 수준의 유전자 발현을 촉진한다는 것을 입증한다. 따라서, 합성 hSARE-hArcMin 프로모터는 본원에 기술된 바와 같은 레트 증후군 연관 유전자와 같은 임의의 표적 유전자의 뉴런 활성 의존성 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다.
실시예 5: BDNF를 포함하는 AAV 발현 카세트의 특성 분석
활성 의존적 프로모터 hSARE-hArcMin을 사용하여 BDNF의 발현이 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는지의 여부를 시험하기 위해, 실시예 2 또는 3에서 생성된 AAV 입자를 레트 증후군과 유사한 증상을 나타내는 mecp2 돌연변이 마우스 내에 주사로 투여하였다. 또한, 신생아 mecp2 돌연변이 마우스에서의 레트 증후군 증상의 발병을 지연시키는 활성 의존성 BDNF 발현의 능력을 시험하였다.
전술한 내용은 본 발명의 예시이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
번호가 매겨진 구현예
다음의 구현예 목록은 단지 예시를 위해 본원에 포함되며, 포괄적이거나 한정적인 것으로 의도되지 않는다. 청구 대상 주제는 명백히 다음의 구현예에 한정되지 않는다.
구현예 1. 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 카세트를 포함하는 핵산으로서, 상기 AAV 발현 카세트는 5'에서 3'로:
5' 역위 말단 반복(ITR);
합성, 활성 의존성 프로모터;
레트 증후군 연관 유전자; 및
3' ITR을 포함하는, 핵산.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 프로모터는 레트-증후군-연관 유전자의 발현을 유도하는, 핵산.
구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 프로모터는 MECP2-의존성 프로모터인, 핵산.
구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 뉴런의 즉각적인 초기 유전자의 프로모터로부터 유래된 핵산 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 5. 구현예 4에 있어서, 신경원성 초기 유전자는 Arc 유전자, c-fos 유전자, 및 egr-1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산.
구현예 6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 최소 Arc 유전자 프로모터(ArcMin)를 포함하는, 핵산.
구현예 7. 구현예 6에 있어서, ArcMin은 인간 ArcMin(hArcMin)인, 핵산.
구현예 8. 구현예 7에 있어서, hArcMin은 서열번호 12의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 9. 구현예 1 내지 8중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 고리형 AMP 반응 요소(CRE), 혈청 반응 요소(SRE), 시냅스 활성 반응 요소(SARE), MEF2 반응 요소, 또는 이들의 조합을 포함하는, 핵산.
구현예 10. 구현예 9에 있어서, 프로모터는 시냅스 활성 반응 요소(SARE)를 포함하는, 핵산.
구현예 11. 구현예 10에 있어서, 시냅스 활성 반응 요소(SARE)는 인간 시냅스 활성 반응 요소(hSARE)인, 핵산.
구현예 12. 구현예 11에 있어서, hSARE는 서열번호 11의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 인간 ArcMin(hArcMin) 및 적어도 하나의 hSARE를 포함하는, 핵산.
구현예 14. 구현예 13에 있어서, 프로모터는 hArcMin 및 하나의 hSARE를 포함하는, 핵산.
구현예 15. 구현예 14에 있어서, 프로모터는 서열번호 6의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 16. 구현예 13에 있어서, 프로모터는 hArcMin 및 5개의 hSARE를 포함하는, 핵산.
구현예 17. 구현예 16에 있어서, 프로모터는 서열번호 16의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 뉴런 활성 의존성 전사 인자에 결합하는, 핵산.
구현예 19. 구현예 18에 있어서, 뉴런 활성 의존성 전사 인자는 cAMP-반응성 요소 결합 단백질(CREB), 근세포 인핸서 인자 2(MEF2), 혈청 반응 인자(SRF), 또는 Elk-1인, 핵산.
구현예 20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 레트-증후군-연관 유전자는 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF1), 메틸-CpG-결합 단백질 2(MECP2), 헌팅틴 단백질, 헌팅턴-연관 단백질 1, 이소성 호메오박스 2(OTX-2), FXYD 도메인 함유 이온 수송 조절제 1(FXYD1), 뉴렉신-2-알파(NRXN2),또는 단백질 키나아제 C 감마(PRKCG)를 암호화하는, 핵산.
구현예 21. 구현예 20에 있어서, 레트-증후군-연관 유전자는 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)를 암호화하는, 핵산.
구현예 22. 구현예 21에 있어서, BDNF는 인간 BDNF인, 핵산.
구현예 23. 구현예 22에 있어서, BDNF는 서열번호 7의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열에 의해 암호화되는, 핵산.
구현예 24. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 약 110개 내지 약 160개 뉴클레오티드 길이인, 핵산.
구현예 25. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 5' ITR은 3' ITR과 동일한 길이를 갖는, 핵산.
구현예 26. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는, 핵산.
구현예 27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 단리되거나 유래되는, 핵산.
구현예 28. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 5' ITR은 서열번호 1의 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 29. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 3' ITR은 서열번호 2의 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 30. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, AAV 카세트는 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF) 짧은 3' UTR, 또는 BDNF 긴 3' UTR을 포함하는, 핵산.
구현예 31. 구현예 30에 있어서, BDNF 짧은 3' UTR, 또는 BDNF 긴 3' UTR은 레트-증후군-연관 유전자와 3' ITR 사이에 위치하는, 핵산.
구현예 32. 구현예 30 또는 31에 있어서, AAV 카세트는 BDNF 짧은 3' UTR을 포함하는, 핵산.
구현예 33. 구현예 32에 있어서, BDNF 짧은 3' UTR은 서열번호 8의 핵산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 34. 구현예 30 또는 31에 있어서, AAV 카세트는 BDNF 긴 3' UTR을 포함하는, 핵산.
구현예 35. 구현예 34에 있어서, BDNF 긴 3' UTR은 서열번호 10의 핵산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 36. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, AAV 카세트는 폴리아데닐화 신호를 포함하는, 핵산.
구현예 37. 구현예 36에 있어서, 폴리아데닐화 신호는 시미안 바이러스 40(SV40), rBG, α-글로빈, β-글로빈, 인간 콜라겐, 인간 성장 호르몬(hGH), 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬(hGH) 또는 소 성장 호르몬(bGH) 중 하나 이상의 유전자로부터 단리되거나 유래된 폴리아데닐화 신호인, 핵산.
구현예 38. 구현예 36에 있어서, AAV 카세트는 bGH 폴리아데닐화 신호를 포함하는, 핵산.
구현예 39. 구현예 38에 있어서, bGH 폴리아데닐화 신호는 서열번호 9의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 40. 구현예 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, AAV 카세트는 적어도 하나의 스터퍼 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 41. 구현예 40에 있어서, 적어도 하나의 스터퍼 서열은 서열번호 13의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 42. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, AAV 발현 카세트는 코작 서열을 포함하되, 코작 서열은 레트-증후군-연관 유전자의 시작 코돈과 중첩되는, 핵산.
구현예 43. 구현예 42에 있어서, 코작 서열은 서열번호 14의 핵산 서열, 또는 이에 적어도 90% 동일한 서열; 또는 서열번호 15의 핵산 서열, 또는 이에 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 44. 구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, AAV 발현 카세트는 핵산 서열 서열번호 3, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 서열번호 4 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 또는 서열번호 5 또는 이에 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 45. 구현예 1 내지 44 중 어느 하나의 핵산을 포함하는, 플라스미드.
구현예 46. 구현예 1 내지 44 중 어느 하나의 핵산 또는 구현예 45의 플라스미드를 포함하는, 세포.
구현예 47. 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 AAV 생산자 세포를 구현예 1 내지 44 중 어느 하나의 핵산 또는 구현예 45의 플라스미드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 48. 구현예 47의 방법에 의해 생산된, 재조합 AAV 벡터.
구현예 49. 구현예 48에 있어서, 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV로부터 선택되는 혈청형을 갖는, 재조합 AVV 벡터.
구현예 50. 구현예 48 또는 구현예 49에 있어서, 재조합 AAV 벡터는 단일 가닥 AAV(ssAAV)인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 51. 구현예 48 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 재조합 AAV 벡터는 자가-상보성 AAV(scAAV)인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 52. 구현예 48 내지 51 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV의 캡시드 단백질을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
구현예 53. 구현예 48 내지 52 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 야생형 AAV 캡시드 단백질과 비교하여, 하나 이상의 치환 또는 돌연변이를 갖는 캡시드 단백질을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
구현예 54. 조성물로서, (a) 구현예 1 내지 44 중 어느 하나의 핵산, 구현예 45의 플라스미드, 구현예 46의 세포, 또는 구현예 48 내지 53 중 어느 하나의 재조합 AAV 벡터; 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 조성물.
구현예 55. 치료를 필요로 하는 대상체에서 레트 증후군 연관 유전자를 발현시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 구현예 1 내지 44 중 어느 하나의 핵산, 구현예 45의 플라스미드, 구현예 46의 세포, 구현예 48 내지 53 중 어느 하나의 재조합 AAV 벡터, 또는 구현예 54의 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 56. 구현예 55에 있어서, 대상체는 레트 증후군을 앓고 있는, 방법.
구현예 57. 대상체에서 레트 증후군을 치료하거나 이의 발병을 지연시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 구현예 1 내지 44 중 어느 하나의 핵산, 구현예 45의 플라스미드, 구현예 46의 세포, 구현예 48 내지 53 중 어느 하나의 재조합 AAV 벡터, 또는 구현예 54의 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 58. 치료를 필요로 하는 대상체에서 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)를 발현시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 구현예 1 내지 44 중 어느 하나의 핵산, 구현예 45의 플라스미드, 구현예 46의 세포, 구현예 48 내지 53 중 어느 하나의 재조합 AAV 벡터, 또는 구현예 54의 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 59. 구현예 58에 있어서, 대상체는 인지 장애, 또는 스트레스 관련 장애를 갖는, 방법.
구현예 60. 구현예 58에 있어서, 대상체는 우울증, 강박 장애, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 및 치매, 신경성 식욕부진 및 신경성 폭식증, 정신분열병, 간질, 외상 후 스트레스 장애, 비만, 레트 증후군, 또는 화학 요법 후 인지 장애를 갖는, 방법.
구현예 61. 대상체에서 BDNF 연관 질환을 치료하거나 이의 발병을 지연시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 구현예 1 내지 44 중 어느 하나의 핵산, 구현예 45의 플라스미드, 구현예 46의 세포, 구현예 48 내지 53 중 어느 하나의 재조합 AAV 벡터, 또는 구현예 54의 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 62. 구현예 61에 있어서, BDNF 연관 질환은 인지 장애 및/또는 스트레스 관련 장애인, 방법.
구현예 63. 구현예 61에 있어서, BDNF 연관 질환은 우울증, 강박 장애, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 및 치매, 신경성 식욕부진, 신경성 폭식증, 정신분열병, 간질, 외상 후 스트레스 장애, 양극성 질환, 레트 증후군, 또는 화학 요법 후 인지 장애인, 방법.
구현예 64. 대상체에서 MECP2 연관 질환을 치료하거나 이의 발병을 지연시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 구현예 1 내지 44 중 어느 하나의 핵산, 구현예 45의 플라스미드, 구현예 46의 세포, 구현예 48 내지 53 중 어느 하나의 재조합 AAV 벡터, 또는 구현예 54의 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 65. 구현예 64에 있어서, MECP2 연관 질환은 MECP2 복제 증후군, MECP2-관련 중증 신생아 뇌병증, PPM-X 증후군, 또는 레트 증후군인, 방법.
구현예 66. 구현예 55 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 인간 대상체인, 방법.
구현예 67. 구현예 55 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 플라스미드, 세포, 재조합 AAV 벡터, 또는 조성물은 중추신경계 내로의 주사에 의해 투여되는, 방법.
구현예 68. 구현예 55 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 레트 증후군 연관 유전자는 대상체의 뉴런에서 발현되는, 방법.
구현예 68에 있어서, 뉴런은 활성 뉴런인, 방법.

Claims (69)

  1. 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 카세트를 포함하는 핵산으로서, 상기 AAV 발현 카세트는 5'에서 3'로:
    5' 역위 말단 반복(ITR);
    합성, 활성 의존성 프로모터;
    레트 증후군 연관 유전자; 및
    3' ITR을 포함하는, 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 프로모터는 레트-증후군-연관 유전자의 발현을 유도하는, 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로모터는 MECP2-의존성 프로모터인, 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 뉴런의 즉각적인 초기 유전자의 프로모터로부터 유래된 핵산 서열을 포함하는, 핵산.
  5. 제4항에 있어서, 신경원성 초기 유전자는 Arc 유전자, c-fos 유전자, 및 egr-1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 최소 Arc 유전자 프로모터(ArcMin)를 포함하는, 핵산.
  7. 제6항에 있어서, ArcMin은 인간 ArcMin(hArcMin)인, 핵산.
  8. 제7항에 있어서, hArcMin은 서열번호 12의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 고리형 AMP 반응 요소(CRE), 혈청 반응 요소(SRE), 시냅스 활성 반응 요소(SARE), MEF2 반응 요소, 또는 이들의 조합을 포함하는, 핵산.
  10. 제9항에 있어서, 프로모터는 시냅스 활성 반응 요소(SARE)를 포함하는, 핵산.
  11. 제10항에 있어서, 시냅스 활성 반응 요소(SARE)는 인간 시냅스 활성 반응 요소(hSARE)인, 핵산.
  12. 제11항에 있어서, hSARE는 서열번호 11의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 인간 ArcMin(hArcMin) 및 적어도 하나의 hSARE를 포함하는, 핵산.
  14. 제13항에 있어서, 프로모터는 hArcMin 및 하나의 hSARE를 포함하는, 핵산.
  15. 제14항에 있어서, 프로모터는 서열번호 6의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
  16. 제13항에 있어서, 프로모터는 hArcMin 및 5개의 hSARE를 포함하는, 핵산.
  17. 제16항에 있어서, 프로모터는 서열번호 16의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 뉴런 활성 의존성 전사 인자에 결합하는, 핵산.
  19. 제18항에 있어서, 뉴런 활성 의존성 전사 인자는 cAMP-반응성 요소 결합 단백질(CREB), 근세포 인핸서 인자 2(MEF2), 혈청 반응 인자(SRF), 또는 Elk-1인, 핵산.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 레트-증후군-연관 유전자는 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF1), 메틸-CpG-결합 단백질 2(MECP2), 헌팅틴 단백질, 헌팅턴-연관 단백질 1, 이소성 호메오박스 2(OTX-2), FXYD 도메인 함유 이온 수송 조절제 1(FXYD1), 뉴렉신-2-알파(NRXN2),또는 단백질 키나아제 C 감마(PRKCG)를 암호화하는, 핵산.
  21. 제20항에 있어서, 레트-증후군-연관 유전자는 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)를 암호화하는, 핵산.
  22. 제21항에 있어서, BDNF는 인간 BDNF인, 핵산.
  23. 제22항에 있어서, BDNF는 서열번호 7의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열에 의해 암호화되는, 핵산.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 약 110개 내지 약 160개 뉴클레오티드 길이인, 핵산.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR은 3' ITR과 동일한 길이를 갖는, 핵산.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는, 핵산.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 단리되거나 유래되는, 핵산.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR은 서열번호 1의 서열을 포함하는, 핵산.
  29. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 3' ITR은 서열번호 2의 서열을 포함하는, 핵산.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 카세트는 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF) 짧은 3' UTR, 또는 BDNF 긴 3' UTR을 포함하는, 핵산.
  31. 제30항에 있어서, BDNF 짧은 3' UTR, 또는 BDNF 긴 3' UTR은 레트-증후군-연관 유전자와 3' ITR 사이에 위치하는, 핵산.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, AAV 카세트는 BDNF 짧은 3' UTR을 포함하는, 핵산.
  33. 제32항에 있어서, BDNF 짧은 3' UTR은 서열번호 8의 핵산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
  34. 제30항 또는 제31항에 있어서, AAV 카세트는 BDNF 긴 3' UTR을 포함하는, 핵산.
  35. 제34항에 있어서, BDNF 긴 3' UTR은 서열번호 10의 핵산 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 카세트는 폴리아데닐화 신호를 포함하는, 핵산.
  37. 제36항에 있어서, 폴리아데닐화 신호는 시미안 바이러스 40(SV40), rBG, α-글로빈, β-글로빈, 인간 콜라겐, 인간 성장 호르몬(hGH), 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬(hGH) 또는 소 성장 호르몬(bGH) 중 하나 이상의 유전자로부터 단리되거나 유래된 폴리아데닐화 신호인, 핵산.
  38. 제36항에 있어서, AAV 카세트는 bGH 폴리아데닐화 신호를 포함하는, 핵산.
  39. 제38항에 있어서, bGH 폴리아데닐화 신호는 서열번호 9의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 카세트는 적어도 하나의 스터퍼 서열을 포함하는, 핵산.
  41. 제40항에 있어서, 적어도 하나의 스터퍼 서열은 서열번호 13의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 발현 카세트는 코작 서열을 포함하되, 코작 서열은 레트-증후군-연관 유전자의 시작 코돈과 중첩되는, 핵산.
  43. 제42항에 있어서, 코작 서열은 서열번호 14의 핵산 서열, 또는 이에 적어도 90% 동일한 서열; 또는 서열번호 15의 핵산 서열, 또는 이에 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 발현 카세트는 핵산 서열 서열번호 3, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 서열번호 4 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 또는 서열번호 5 또는 이에 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는, 플라스미드.
  46. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제45항의 플라스미드를 포함하는, 세포.
  47. 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 AAV 생산자 세포를 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제45항의 플라스미드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제47항의 방법에 의해 생산된, 재조합 AAV 벡터.
  49. 제48항에 있어서, 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV로부터 선택되는 혈청형을 갖는, 재조합 AVV 벡터.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 재조합 AAV 벡터는 단일 가닥 AAV(ssAAV)인, 재조합 AAV 벡터.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 AAV 벡터는 자가-상보성 AAV(scAAV)인, 재조합 AAV 벡터.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV의 캡시드 단백질을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터는 야생형 AAV 캡시드 단백질과 비교하여, 하나 이상의 치환 또는 돌연변이를 갖는 캡시드 단백질을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
  54. 조성물로서, (a) 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 핵산, 제45항의 플라스미드, 제46항의 세포, 또는 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터; 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 조성물.
  55. 치료를 필요로 하는 대상체에서 레트 증후군 연관 유전자를 발현시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 핵산, 제45항의 플라스미드, 제46항의 세포, 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터, 또는 제54항의 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 대상체는 레트 증후군을 앓고 있는, 방법.
  57. 대상체에서 레트 증후군을 치료하거나 이의 발병을 지연시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 핵산, 제45항의 플라스미드, 제46항의 세포, 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터, 또는 제54항의 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  58. 치료를 필요로 하는 대상체에서 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)를 발현시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 핵산, 제45항의 플라스미드, 제46항의 세포, 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터, 또는 제54항의 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 대상체는 인지 장애, 또는 스트레스 관련 장애를 갖는, 방법.
  60. 제58항에 있어서, 대상체는 우울증, 강박 장애, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 및 치매, 신경성 식욕부진 및 신경성 폭식증, 정신분열병, 간질, 외상 후 스트레스 장애, 비만, 레트 증후군, 또는 화학 요법 후 인지 장애를 갖는, 방법.
  61. 대상체에서 BDNF 연관 질환을 치료하거나 이의 발병을 지연시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 핵산, 제45항의 플라스미드, 제46항의 세포, 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터, 또는 제54항의 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, BDNF 연관 질환은 인지 장애 및/또는 스트레스 관련 장애인, 방법.
  63. 제61항에 있어서, BDNF 연관 질환은 우울증, 강박 장애, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 및 치매, 신경성 식욕부진, 신경성 폭식증, 정신분열병, 간질, 외상 후 스트레스 장애, 양극성 질환, 레트 증후군, 또는 화학 요법 후 인지 장애인, 방법.
  64. 대상체에서 MECP2 연관 질환을 치료하거나 이의 발병을 지연시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 핵산, 제45항의 플라스미드, 제46항의 세포, 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터, 또는 제54항의 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, MECP2 연관 질환은 MECP2 복제 증후군, MECP2-관련 중증 신생아 뇌병증, PPM-X 증후군, 또는 레트 증후군인, 방법.
  66. 제55항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간 대상체인, 방법.
  67. 제55항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산, 플라스미드, 세포, 재조합 AAV 벡터, 또는 조성물은 중추신경계 내로의 주사에 의해 투여되는, 방법.
  68. 제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 레트 증후군 연관 유전자는 대상체의 뉴런에서 발현되는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 뉴런은 활성 뉴런인, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2024079658A1 (en) * 2022-10-11 2024-04-18 Meiragtx Uk Ii Limited Bdnf gene therapy
WO2024079665A1 (en) * 2022-10-11 2024-04-18 Meiragtx Uk Ii Limited Nucleic acid regulatory elements for constitutive gene expression and methods of use

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9415121B2 (en) * 2008-12-19 2016-08-16 Nationwide Children's Hospital Delivery of MECP2 polynucleotide using recombinant AAV9
JP5971661B2 (ja) * 2012-09-19 2016-08-17 国立大学法人 東京大学 神経活動依存的プロモータ活性を有するｄｎａ、及びこれを含むベクター
EP3635122A4 (en) * 2017-06-06 2021-03-31 University of Massachusetts SELF-REGULATING AAV VECTORS FOR THE SAFE EXPRESSION OF MECP2 IN RETT SYNDROME

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