JP2023542614A - レット症候群の治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents

Abstract

本開示は、レット症候群などのｍｅｃｐ２遺伝子の変異と関連する疾患を治療する、および／または疾患の発症を遅延させる方法における使用のための、核酸（ＡＡＶ発現カセットを含む）、ＡＡＶベクター、および組成物を提供する。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）関連疾患を治療する、および／または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）関連疾患の発症を遅延させるための方法がまた、本明細書において提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年８月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０６７，６６８号の優先権を主張するものであり、その内容は、その全体が、参照により本明細書に組み込れる。

本開示は、分子生物学および遺伝子療法の分野に関する。より具体的には、本開示は、組換えウイルスベクターを作製するための組成物および方法に関する。

配列表の組み込み
ここで電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。配列表（ＳＴＲＤ＿０２０＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０２１年８月１９日、ファイルサイズ：約８９，５５５バイト）のコンピューター可読形式コピー。

レット症候群は、約６ヶ月～１８ヶ月齢で、主に少女および女性に現れる遺伝性神経疾患である。８，５００人に約１人の女性が罹患し、レット症候群は希少疾患である。レット症候群の患者は、言語障害、協調の低下、小頭症、反復運動、発作、脊柱側弯症、および認知障害を含む広範な症状を呈することが多い。レット症候群の女性の平均余命は、４０歳代半ばである一方、レット症候群の男性は、幼児期に死亡することが多い。

レット症候群は、ｍｅｃｐ２遺伝子の変異によって引き起こされ、ニューロン機能の欠損と相関する。レット症候群の多くの症例は、ｍｅｃｐ２遺伝子の新しい変異から生じる。しかしながら、少数の症例では、ｍｅｃｐ２変異は、Ｘ連鎖性優性遺伝パターンを示す。ｍｅｃｐ２の変異はまた、ＭＥＣＰ２重複症候群およびＰＰＭ－Ｘ症候群などの他の疾患も引き起こし、自閉症スペクトラム障害と関連し得る。

レット症候群、または他のｍｅｃｐ２関連疾患に対する公知の治療は存在しない。レット症候群の症状は、典型的には、抗痙攣薬、特殊教育、理学療法、および装具を使用して管理される。遺伝子療法は、レット症候群を治療するのための有用な方法である可能性がある。しかしながら、神経系を標的とする遺伝子療法は、発現時に症状を緩和する正しい神経標的遺伝子の同定、制御された様式での高レベルのこれらの遺伝子の発現の促進、およびニューロンに標的化された様式での遺伝子療法構築物の送達を含む、いくつかの技術的ハードルに直面することが多い。したがって、レット症候群および他のｍｅｃｐ２関連疾患を治療する組成物および方法についての満たされていないニーズがある。

本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットを含む核酸を提供し、ＡＡＶ発現カセットは、５’から３’の方向に、５’末端逆位配列（ＩＴＲ）、合成活性依存性プロモーター、レット症候群関連遺伝子、および３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、レット症候群関連遺伝子の発現をもたらす。一部の実施形態では、プロモーターは、ＭＥＣＰ２独立性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ニューロンの即時型遺伝子のプロモーターに由来する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ニューロンの即時型遺伝子は、Ａｒｃ遺伝子、ｃ－ｆｏｓ遺伝子、およびｅｇｒ－１遺伝子からなる群から選択される。一部の実施形態では、プロモーターは、最小のＡｒｃ遺伝子プロモーター（ＡｒｃＭｉｎ）を含む。

一部の実施形態では、ＡｒｃＭｉｎは、ヒトＡｒｃＭｉｎ（ｈＡｒｃＭｉｎ）である。一部の実施形態では、ｈＡｒｃＭｉｎは、配列番号１２の核酸配列、または配列番号１２の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ）、シナプス活性応答エレメント（ＳＡＲＥ）、ＭＥＦ２応答エレメント、またはその組み合わせを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、シナプス活性応答エレメント（ＳＡＲＥ）を含む。一部の実施形態では、シナプス活性応答エレメント（ＳＡＲＥ）は、ヒトシナプス活性応答エレメント（ｈＳＡＲＥ）である。一部の実施形態では、ｈＳＡＲＥは、配列番号１１の核酸配列、または配列番号１１の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトＡｒｃＭｉｎ（ｈＡｒｃＭｉｎ）および少なくとも一つのｈＳＡＲＥを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ｈＡｒｃＭｉｎおよび一つのｈＳＡＲＥを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号６の核酸配列、または配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ｈＡｒｃＭｉｎおよび五つのｈＳＡＲＥを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号１６の核酸配列、または配列番号１６の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。

一部の実施形態では、プロモーターは、ニューロンの活性依存性転写因子に結合する。一部の実施形態では、ニューロンの活性依存性転写因子は、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）、筋細胞エンハンサー因子２（ＭＥＦ２）、血清応答因子（ＳＲＦ）、またはＥｌｋ－１である。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）、ハンチンチンタンパク質、ハンチントン関連タンパク質１、オルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ－２）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子１（ＦＸＹＤ１）、ニューレキシン－２－アルファ（ＮＲＸＮ２）、またはタンパク質キナーゼＣガンマ（ＰＲＫＣＧ）をコードする。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードする。一部の実施形態では、ＢＤＮＦは、ヒトＢＤＮＦである。一部の実施形態では、ＢＤＮＦは、配列番号７の核酸配列、または配列番号７の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列によりコードされる。

一部の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの少なくとも一つは、約１１０～約１６０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲと同じ長さである。一部の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは異なる長さを有する。一部の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの少なくとも一つは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶまたはウシＡＡＶのゲノムから単離されるか、またはもたらされる。一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号１の配列を含む。一部の実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号２の配列を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶカセットは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ショート３’ＵＴＲ、またはＢＤＮＦロング３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲ、またはＢＤＮＦロング３’ＵＴＲは、レット症候群関連遺伝子と３’ＩＴＲの間に位置する。一部の実施形態では、ＡＡＶカセットは、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲは、配列番号８の核酸配列、または配列番号８の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカセットは、ＢＤＮＦロング３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＢＤＮＦロング３’ＵＴＲは、配列番号１０の核酸配列、または配列番号１０の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶカセットは、ポリアデニル化シグナルを含む。一部の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、以下の遺伝子：サルウイルス４０（ＳＶ４０）、ｒＢＧ、α－グロビン、β－グロビン、ヒトコラーゲン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ポリオーマウイルス、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）の一つまたは複数から単離されるか、またはもたらされるポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態では、ＡＡＶカセットは、ｂＧＨポリアデニル化シグナルを含む。一部の実施形態では、ｂＧＨポリアデニル化シグナルは、配列番号９の核酸配列、または配列番号９の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶカセットは、少なくとも一つのスタッファー配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも一つのスタッファー配列は、配列番号１３の核酸配列、または配列番号１３の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、コザック配列を含み、コザック配列は、レット症候群関連遺伝子の開始コドンと重複する。一部の実施形態では、コザック配列は、配列番号１４の核酸配列、もしくは配列番号１４の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列、または配列番号１５の核酸配列、もしくは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号３の核酸配列、もしくは配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列、配列番号４の配列もしくは配列番号４の配列と少なくとも９０％同一の配列、または配列番号５の配列もしくは配列番号５の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。

本開示は、本明細書に開示される核酸のいずれか一つを含むプラスミドを提供する。本開示はまた、本明細書に開示される核酸のいずれか一つまたは本明細書に開示されるプラスミドのいずれか一つを含む細胞を提供する。本開示は、組み換えＡＡＶベクターを産生する方法をさらに提供し、方法は、ＡＡＶ産生細胞を、本明細書に開示される核酸のいずれか一つ、または本明細書に開示されるプラスミドのいずれか一つと接触させることを含む。本開示は、本明細書に開示される組み換えＡＡＶベクターを産生する方法のいずれか一つにより産生される組み換えＡＡＶベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶおよびウシＡＡＶから選択される血清型のものである。一部の実施形態では、組み換えＡＡＶベクターは、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である。一部の実施形態では、組み換えＡＡＶベクターは、自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶまたはウシＡＡＶのカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、一個または複数の置換または変異を有するカプシドタンパク質を含む。

本開示は、（ａ）本明細書に開示される核酸のいずれか一つ、本明細書に開示されるプラスミドのいずれか一つ、本明細書に開示される細胞のいずれか一つ、または本明細書に開示される組み換えＡＡＶベクターのいずれか一つおよび（ｂ）医薬的に許容可能な担体を含む、組成物を提供する。本開示は、それを必要とする対象においてレット症候群関連遺伝子を発現させる方法を提供し、対象に、治療上有効量の本明細書に開示される核酸のいずれか一つ、本明細書に開示されるプラスミドのいずれか一つ、本明細書に開示される細胞のいずれか一つ、または本明細書に開示される組み換えＡＡＶベクターのいずれか一つ、または本明細書に開示される組成物のいずれか一つを投与することを含む。一部の実施形態では、対象は、レット症候群を有する。

本開示は、対象に、治療上有効量の本明細書に開示される核酸のいずれか一つ、本明細書に開示されるプラスミドのいずれか一つ、本明細書に開示される細胞のいずれか一つ、または本明細書に開示される組み換えＡＡＶベクターのいずれか一つ、または本明細書に開示される組成物のいずれか一つを投与することを含む、対象におけるレット症候群を治療するか、またはレット症候群の発症を遅延させる方法を提供する。本開示は、対象に、治療上有効量の本明細書に開示される核酸のいずれか一つ、本明細書に開示されるプラスミドのいずれか一つ、本明細書に開示される細胞のいずれか一つ、または本明細書に開示される組み換えＡＡＶベクターのいずれか一つ、または本明細書に開示される組成物のいずれか一つを投与することを含む、それを必要とする対象において脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を発現させる方法を提供する。

一部の実施形態では、対象は、認知障害、またはストレス関連障害を有する。一部の実施形態では、対象は、うつ病、強迫障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、ならびに認知症、神経性無食欲症および神経性過食症、統合失調症、てんかん、外傷後ストレス障害、肥満、レット症候群、または化学療法後認知障害を有する。

本開示は、対象に、治療上有効量の本明細書に開示される核酸のいずれか一つ、本明細書に開示されるプラスミドのいずれか一つ、本明細書に開示される細胞のいずれか一つ、または本明細書に開示される組み換えＡＡＶベクターのいずれか一つ、または本明細書に開示される組成物のいずれか一つを投与することを含む、対象におけるＢＤＮＦ関連疾患を治療するか、またはＢＤＮＦ関連疾患の発症を遅延させる方法を提供する。一部の実施形態では、ＢＤＮＦ関連疾患は、認知障害、および／またはストレス関連障害である。一部の実施形態では、ＢＤＮＦ関連疾患は、うつ病、強迫障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、および認知症、神経性無食欲症、神経性過食症、統合失調症、てんかん、外傷後ストレス障害、双極性疾患、レット症候群、大うつ病性障害、または化学療法後認知障害である。

本開示は、対象に、治療上有効量の本明細書に開示される核酸のいずれか一つ、本明細書に開示されるプラスミドのいずれか一つ、本明細書に開示される細胞のいずれか一つ、または本明細書に開示される組み換えＡＡＶベクターのいずれか一つ、または本明細書に開示される組成物のいずれか一つを投与することを含む、対象におけるＭＥＣＰ２関連疾患を治療するか、またはＭＥＣＰ２関連疾患の発症を遅延させる方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＥＣＰ２関連疾患は、ＭＥＣＰ２重複症候群、ＭＥＣＰ２関連重症新生児脳症、ＰＰＭ－Ｘ症候群、またはレット症候群である。一部の実施形態では、対象は、ヒト対象である。一部の実施形態では、核酸、プラスミド、細胞、組み換えＡＡＶベクター、または組成物は、中枢神経系への注射により投与される。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子は、対象のニューロンで発現される。一部の実施形態では、ニューロンは、活性ニューロンである。

これらおよび他の実施形態は、以下に記載される詳細な説明でより詳細に扱われる。

本特許または出願ファイルには、カラーによる少なくとも一つの図面が含まれる。カラー図面を伴うこの特許または特許出願公報の複写は、請求および必要な料金の支払いに応じて、特許庁により提供される。

図１は、ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーター（配列番号６）、ＢＤＮＦ遺伝子（配列番号７）、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲ（配列番号８）およびスタッファー配列（配列番号１３）を含み、それら全てが、５’ＩＴＲ（配列番号１）および３’ＩＴＲ（配列番号２）に隣接している、ＡＡＶ発現カセットを示す。

図２は、ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーター（配列番号６）、ＢＤＮＦ遺伝子（配列番号７）、ｂＧＨポリＡシグナル（配列番号９）およびスタッファー配列（配列番号１３）、それら全てが、５’ＩＴＲ（配列番号１）および３’ＩＴＲ（配列番号２）に隣接している、ＡＡＶ発現カセットを示す。

図３は、ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーター（配列番号６）、ＢＤＮＦ遺伝子（配列番号７）、およびＢＤＮＦロング３’ＵＴＲ（配列番号１０）を含み、それら全てが、５’ＩＴＲ（配列番号１）および３’ＩＴＲ（配列番号２）に隣接している、ＡＡＶ発現カセットを示す。

図４は、恒常的（「Ｃ」）プロモーター、ｈＳｙｎまたは活性依存性（「ＡＤ」）プロモーター、ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎを含むレポーター遺伝子発現用のＡＡＶ発現カセットの略図を示す。発現カセットのエレメントもまた、表３に列挙される。

図５Ａは、２μＭ ＴＴＸで処理された細胞の蛍光と比べて、テトロドトキシン（ＴＴＸ）で処理されていない細胞におけるレポータータンパク質蛍光を示す棒グラフである。 図５Ｂは、２μＭ ＴＴＸで処理された細胞の蛍光と比べて、１５０ｍＭ ＫＣｌで処理された細胞におけるレポータータンパク質蛍光を示す棒グラフである。 図５Ｃは、２μＭ ＴＴＸで処理された細胞の蛍光と比べて、３０ｕＭビククリン（ＢＩＣ）で処理された細胞におけるレポータータンパク質蛍光を示す棒グラフである。棒のそれぞれは、Ｘ軸上に示される感染多重度（ＭＯＩ）で、示されたＡＡＶ発現カセットを含むＡＡＶベクターで形質導入された細胞の相対的蛍光を示す。

図６Ａは、示されたＡＡＶ発現カセットを含むＡＡＶベクターで形質導入され、示された通り、３０μＭ ＢＩＣで処理され、２μＭ ＴＴＸでさらに処理されたか、またはＴＴＸで未処理のままのいずれかである、細胞における相対的レポーター遺伝子発現を示すグラフである。 図６Ｂは、活性依存性（ＡＤ）ＡＡＶ発現カセットを含むＡＡＶベクターで形質導入され、示された通り、３０μＭ ＢＩＣで処理され、２μＭ ＴＴＸでさらに処理されたか、またはＴＴＸで未処理のままのいずれかである、細胞における相対的レポーター遺伝子発現を示すグラフである、

図７は、示された恒常的（Ｃ）ＡＡＶ発現カセットを含むＡＡＶベクターで形質導入されたニューロンのｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光（上側画像）およびニューロンマーカーである抗ベータＩＩＩチューブリン抗体（下側画像）を用いた染色を示す顕微鏡画像を示す。

図８は、「ＡＤ－ｄｍＳｃａｒ－ｂＧＨ」ＡＡＶ発現カセットを含むＡＡＶベクターで形質導入されたニューロンの、ヘキストＤＮＡ染色、ｄｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光、抗ベータＩＩＩチューブリン抗体染色を示す顕微鏡画像およびオーバーレイ画像を示す。上側のパネルは、２μＭ ＴＴＸおよび３０μＭ ＢＩＣで処理された細胞の画像を示し、下側のパネルは、ＴＴＸで処理されなかったが、３０μＭ ＢＩＣで処理された細胞の画像を示す。

図９Ａは、配列番号２６の核酸配列を含み、以下のエレメント：ｈＳｙｎプロモーター（配列番号３８）、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子（配列番号３６）、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲ（配列番号８）およびスタッファー配列（配列番号１３）を含み、その全てが、５’ＩＴＲ（配列番号１）および３’ＩＴＲ（配列番号２）に隣接している、ＡＡＶ発現カセットを示す。 図９Ｂは、配列番号２７の核酸配列を含み、以下のエレメント：ｈＳｙｎプロモーター（配列番号３８）、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子（配列番号３６）、およびＢＤＮＦロング３’ＵＴＲ（配列番号１０）を含み、その全てが、５’ＩＴＲ（配列番号１）および３’ＩＴＲ（配列番号２）に隣接している、ＡＡＶ発現カセットを示す。 図９Ｃは、配列番号２８の核酸配列を含み、以下のエレメント：ｈＳｙｎプロモーター（配列番号３８）、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子（配列番号３６）、ｂＧＨポリＡシグナル（配列番号９）およびスタッファー配列（配列番号１３）を含み、その全てが、５’ＩＴＲ（配列番号１）および３’ＩＴＲ（配列番号２）に隣接している、ＡＡＶ発現カセットを示す。

図１０Ａは、配列番号２９の核酸配列を含み、以下のエレメント：ｈＳｙｎプロモーター（配列番号３８）、ｄｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子（配列番号３５）、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲ（配列番号８）およびスタッファー配列（配列番号１３）を含み、その全てが、５’ＩＴＲ（配列番号１）および３’ＩＴＲ（配列番号２）に隣接している、ＡＡＶ発現カセットを示す。 図１０Ｂは、配列番号３０の核酸配列を含み、以下のエレメント：ｈＳｙｎプロモーター（配列番号３８）、ｄｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子（配列番号３５）、およびＢＤＮＦロング３’ＵＴＲ（配列番号１０）を含み、その全てが、５’ＩＴＲ（配列番号１）および３’ＩＴＲ（配列番号２）に隣接している、ＡＡＶ発現カセットを示す。 図１０Ｃは、配列番号３１の核酸配列を含み、以下のエレメント：ｈＳｙｎプロモーター（配列番号３８）、ｄｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子（配列番号３５）、ｂＧＨポリＡシグナル（配列番号９）およびスタッファー配列（配列番号１３）を含み、その全てが、５’ＩＴＲ（配列番号１）および３’ＩＴＲ（配列番号２）に隣接している、ＡＡＶ発現カセットを含む。

図１１Ａは、配列番号３２の核酸配列を含み、以下のエレメント：ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーター（配列番号６）、ｄｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子（配列番号３５）、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲ（配列番号８）およびスタッファー配列（配列番号１３）を含み、その全てが、５’ＩＴＲ（配列番号１）および３’ＩＴＲ（配列番号２）に隣接している、ＡＡＶ発現カセットを示す。 図１１Ｂは、配列番号３３の核酸配列を含み、以下のエレメント：ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーター（配列番号６）、ｄｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子（配列番号３５）、およびＢＤＮＦロング３’ＵＴＲ（配列番号１０）を含み、その全てが、５’ＩＴＲ（配列番号１）および３’ＩＴＲ（配列番号２）に隣接している、ＡＡＶ発現カセットを示す。 図１１Ｃは、配列番号３４の核酸配列を含み、以下のエレメント：ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーター（配列番号６）、ｄｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子（配列番号３５）、ｂＧＨポリＡシグナル（配列番号９）およびスタッファー配列（配列番号１３）を含み、その全てが、５’ＩＴＲ（配列番号１）および３’ＩＴＲ（配列番号２）に隣接している、ＡＡＶ発現カセットを示す。

図１２は、「ＡＤ－ｄｍＳｃａｒ－ｌｏｎｇＵＴＲ」ＡＡＶ発現カセットを含むＡＡＶベクターで形質導入されたニューロンの、ヘキストＤＮＡ染色、ｄｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光、抗ベータＩＩＩチューブリン抗体染色を示す顕微鏡画像およびオーバーレイ画像を示す。上側のパネルは、２μＭ ＴＴＸおよび３０μＭ ＢＩＣで処理された細胞の画像を示し、下側のパネルは、ＴＴＸで処理されなかったが、３０μＭ ＢＩＣで処理された細胞の画像を示す。

レット症候群は、主に少女で発生する希少な遺伝性神経疾患である。６ヶ月～１８ヶ月齢後に明らかな、症候群の症状としては、以下の、言語の問題、協調の問題、反復運動、ゆっくりとした成長、歩行の問題、小さめの頭部サイズ、発作、脊柱側弯症、認知障害、および睡眠の問題の一つまたは複数が挙げられ得る。レット症候群の患者は、これらの症状の任意の組み合わせを呈することがあり、それぞれの症状の重症度は様々である。

レット症候群は、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）タンパク質をコードする、ｍｅｃｐ２遺伝子の遺伝子変異によって引き起こされる。全体が、参照により本明細書に組み込まれる、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ５１６０８を参照のこと。ｍｅｃｐ２遺伝子には６２０を超える変異があり、その多くは、単一塩基対の挿入または欠失であり、これは、レット症候群の女性において同定された。ＭＥＣＰ２は、神経細胞の正常な機能に寄与し、成熟神経細胞において高レベルで存在する。ＭＥＣＰ２ドメインのメチル－ＣｐＧ結合（ＭＢＤ）は、５－メチルシトシン修飾を有するＤＮＡ領域を認識することができる。ｍｅｃｐ２遺伝子の変異は、ＭＥＣＰ２重複症候群、ＭＥＣＰ２関連重症新生児脳症、およびＰＰＭ－Ｘ症候群などの他の疾患も引き起こし得る。ｍｅｃｐ２遺伝子の変異に関連する疾患のいずれかを治療するための承認された治療法は存在しない。

本開示は、レット症候群などのｍｅｃｐ２遺伝子の変異と関連する疾患を治療する、および／または疾患の発症を遅延させる方法における使用のための、核酸（ＡＡＶ発現カセットを含む）、ＡＡＶベクター、および組成物を提供する。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）関連疾患を治療する、および／または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）関連疾患の発症を遅延させるための方法がまた、本明細書において提供される。

定義
以下の用語が、本明細書の記載および添付の特許請求の範囲で使用される。

単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別段明確に示さない限り、複数形も含むことが意図される。

さらに、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さ、用量、時間、温度の量などの測定可能な値を指すとき、本明細書で使用される用語「約」は、特定される量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらには±０．１％の変動を包含することを意味する。

また本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された項目のうちの一つまたは複数のうちのいずれかおよびすべての可能な組み合わせ、ならびに代替（または）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、包含する。

用語「野生型」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、変異体またはバリアント形態と区別される、天然で生じる生物、株、遺伝子、タンパク質、または特徴の典型的な形態を意味する。例えば、野生型タンパク質は、天然で生じるため、そのタンパク質の典型的な形態である。

用語「変異タンパク質」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、例えば、アミノ酸置換、挿入および／または欠失などのアミノ酸修飾の存在に基づき、タンパク質の野生型形態と区別されるタンパク質を指す。用語「変異遺伝子」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、例えば、核酸置換、挿入および／または欠失などの核酸修飾の存在に基づき、遺伝子の野生型形態と区別される遺伝子を指す。一部の実施形態では、変異遺伝子は、変異タンパク質をコードする。

「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）である。一部の実施形態では、本開示の核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ配列のいずれかである。核酸は、１～１，０００、１，０００～１０，０００、１０，０００～１００，０００、１００，０００～１００万、または１００万ヌクレオチド超の長さであってもよい。核酸は、一般的に、ホスホジエステル結合を含有するが、ある場合では、例えば、ホスホラミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ－メチルホスホロアミダイト結合、ならびにペプチド核酸骨格および結合を含む、代替の骨格を有し得る核酸アナログが含まれる。他のアナログ核酸には、正の骨格、非イオン性骨格、および非リボース骨格を有するものが含まれる。一つまたは複数の炭素環式糖を含有する核酸も、核酸の定義内に含まれる。リボース－リン酸骨格のこれらの修飾は、標識の付加を容易にするか、または生理学的環境においてこのような分子の安定性および半減期を増加させることができる。本開示の核酸は、線状であってもよく、または環状であってもよい（例えば、プラスミド）。

本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、作動可能に連結された核酸の転写を指示する、一つまたは複数の核酸調節配列を指す。プロモーターは、ＴＡＴＡエレメントなどの、転写開始部位近くに核酸配列を含んでもよい。プロモーターはまた、転写因子によって結合され得るシス作用性ポリヌクレオチド配列を含んでもよい。

「恒常的」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生制御下で活性であるプロモーターである。用語「作動可能に連結された」は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、または転写因子結合部位のアレイ）と第二の核酸配列の間の機能的結合を指し、発現調節配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を指示する。

「ＡＡＶ発現カセット」は、組み換えＡＡＶベクターにパッケージングされる核酸であり、一つまたは複数の導入遺伝子をコードする配列を含む。ＡＡＶベクターが標的細胞と接触されるとき、導入遺伝子は、標的細胞によって発現される。

本明細書で使用される場合、用語「ウイルスベクター」、「ウイルスベクター」、「遺伝子送達ベクター」は、核酸送達ビヒクルとして機能するウイルス粒子を指し、ビリオン内にパッケージングされた核酸（例えば、ＡＡＶ発現カセット）を含む。本開示の例示的なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）としては、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａおよび３Ｂ型）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ＡＡＶｒｈ３２．３３型、ＡＡＶｒｈ８型、ＡＡＶｒｈ１０型、ＡＡＶｒｈ７４型、ＡＡＶｈｕ．６８型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、アゴヒゲトカゲＡＡＶ、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ、および現在知られているか、または後に発見される任意の他のＡＡＶが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、表１を参照されたい。

用語「ウイルス産生細胞」、「ウイルス産生細胞株」、「ウイルス産生細胞」は、ウイルスベクターを産生するために使用される細胞を指す。ＨＥＫ２９３および２３９Ｔ細胞は、一般的なウイルス産生細胞株である。以下の表２は、様々なウイルスベクターの例示的なウイルス産生細胞株を列挙する。

「ＨＥＫ２９３」は、組織培養で成長させたヒト胚性腎細胞から元々誘導された細胞株を指す。ＨＥＫ２９３細胞株は、培養で容易に成長し、ウイルス産生に一般的に使用される。本明細書で使用される場合、「ＨＥＫ２９３」はまた、一つまたは複数のバリアントＨＥＫ２９３細胞株、すなわち、一つまたは複数の遺伝子変更をさらに含む、元々のＨＥＫ２９３細胞株に由来する細胞株を指してもよい。多くのバリアントＨＥＫ２９３株は、一つまたは複数の特定の用途のため開発され、最適化されている。例えば、２９３Ｔ細胞株は、ＳＶ４０複製起源を含有するトランスフェクトされたプラスミドのエピソーム複製を可能にするＳＶ４０ラージＴ抗原を含有し、これにより、所望の遺伝子産物の発現の増加をもたらす。

「Ｓｆ９」は、親スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株ＩＰＬＢ－Ｓｆ－２１－ＡＥに由来するクローン性単離株である昆虫細胞株を指す。Ｓｆ９細胞は、血清の不存在下で増殖することができ、付着または懸濁液中で培養することができる。

「トランスフェクション試薬」は、細胞への核酸の伝達を強化する組成物を意味する。当該技術分野で一般的に使用されるいくつかのトランスフェクション試薬は、核酸および細胞表面（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標））に結合する一つまたは複数の脂質を含む。

二つ以上のアミノ酸配列間の配列類似性または同一性を決定する方法は、当該技術分野で公知である。配列類似性または同一性は、非限定的に、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２，４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３（１９７０）の配列同一性アライメント、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４（１９８８）の類似性についての検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューター化インプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２，３８７－３９５（１９８４）により記載される Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、または精査を含む、当該技術分野で公知の標準的技術を使用して決定されてもよい。

別の適当なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０，（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，５８７３－５７８７（１９９３）に記載される、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６，４６０－４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得られたＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、デフォルト値に任意選択的に設定される、いくつかの検索パラメータを使用する。パラメータは動的な値であり、対象配列が検索される特定の配列の構成および特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが、値は、感度を増加させるように調整されてもよい。

さらに、さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９－３４０２によって報告されるギャップＢＬＡＳＴである。

本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」または「緩和すること」または「回復させること」は、互換的に使用される。これらの用語は、非限定的に、治療利益および／または予防利益を含むが、有益または望ましい結果を得るためのアプローチを指す。治療利益は、治療下の一つまたは複数の疾患、状態、または症状における任意の治療上関連する改善またはそれに対する作用を指す。疾患、状態、または症状が、まだ顕在化していない可能性があるが、予防利益のため、組成物は、特定の疾患、状態、もしくは症状を発症するリスクがある対象、または疾患の生理学的症状の一つまたは複数を報告している対象に投与されてもよい。

用語「対象」、「個人」および「患者」は、哺乳類などの、脊椎動物を指すために、本明細書において互換的に使用される。哺乳類は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジー）、またはヒトであってもよい。ｉｎ ｖｉｖｏで得られるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される、対象の組織、細胞、またはその派生物はまた、包含される。ヒト対象は、成人、十代、小児（２～１４歳）、幼児（１ヶ月～２４ヶ月）、または新生児（１ヶ月まで）であり得る。一部の実施形態では、成人は、約６５歳以上、または約６０歳以上の高齢者である。一部の実施形態では、対象は、妊娠している女性または妊娠する意図のある女性である。

用語「有効量」または「治療上有効量」は、結果を達成するのに、例えば、有益または望ましい結果をもたらすのに十分な薬剤の量を指す。治療上有効量は、治療されている対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式などの一つまたは複数に依存して変動してもよく、当業者が容易に決定することができる。特定の用量は、選択された特定の薬剤、従うべき投与レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、撮像されるべき組織、およびそれが輸送される物理的送達システムのうちの一つまたは複数に依存して変動してもよい。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子療法」は、異常な遺伝子を補償するために、または治療用タンパク質を作製するために、細胞に遺伝物質を導入するプロセスを指す。

本明細書で使用される場合、ニューロンは、ニューロンの細胞膜の少なくとも一部が脱分極されたとき、「活性」ニューロンであるか、または「ニューロンの活性」を有すると言われる。一部の実施形態では、脱分極は、電圧ゲートＮａ^＋チャネルの開放によって引き起こされる。一部の実施形態では、ニューロンの細胞膜の脱分極は、Ｃａ^２＋イオンの細胞内への流入をもたらし、即時型遺伝子（ＩＥＧ）の下流転写を誘発する。シナプス後ニューロンの細胞膜の少なくとも一部のｉｎ ｖｉｖｏでの脱分極が、シナプス前ニューロンからのシグナルによって誘発されてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの脱分極は、ニューロンをＫＣｌで処置することによって誘導されてもよい。脱分極はまた、小分子（例えば、ビククリン）を使用して、例えば、Ｃｌ^－またはＫ^＋チャネルを開くことによって脱分極を通常減速する、γ－アミノ酪酸Ａ型（ＧＡＢＡＡ）受容体などの、シグナル受容体を不活性化することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで促進されてもよい。

本明細書で使用される場合、ニューロンは、ニューロンの細胞膜を超えた正味のイオン流がないとき、「静止」ニューロンであると言われる。一部の実施形態では、静止ニューロン細胞膜の部分で脱分極されるものはない。一部の実施形態では、静止ニューロンは、約－７０ｍＶの静止膜電位を有する。

ＡＡＶ発現カセット
本開示は、一つまたは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットを含む核酸配列を提供する。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’末端逆位配列（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、および３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、レット症候群関連遺伝子である。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、コザック配列、ポリアデニル化配列、および／またはスタッファー配列を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号３の核酸配列、または配列番号３の核酸配列と少なくとも７０％同一（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは１００％同一）の配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号４の核酸配列、または配列番号４の核酸配列と少なくとも７０％同一（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは１００％同一）の配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号５の核酸配列、または配列番号５の核酸配列と少なくとも７０％同一（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは１００％同一）の配列を含む。

（ｉ）末端逆位配列
末端逆位配列またはＩＴＲ配列は、ＡＡＶプロウイルス組込みおよびＡＡＶ ＤＮＡのビリオンへのパッケージングを仲介する配列である。ＩＴＲは、ＡＡＶライフサイクルにおける様々な活動に関与する。例えば、ヘアピン構造を形成し得るＩＴＲ配列は、トランスフェクション後のプラスミドからの除去、ベクターゲノムの複製、および宿主細胞ゲノムからの組込みおよび救済において役割を果たす。

本開示のＡＡＶ発現カセットは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含んでもよい。ＩＴＲ配列は、約１１０～約１６０ヌクレオチド長、例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９または１６０ヌクレオチド長であってもよい。一部の実施形態では、ＩＴＲ配列は、約１４１ヌクレオチド長であってもよい。一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲと同じ長さである。一部の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは異なる長さを有する。一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲよりも長く、他の実施形態では、３’ＩＴＲは、５’ＩＴＲよりも長い。

ＩＴＲは、任意のＡＡＶ、例えば、表１に列挙されたＡＡＶのゲノムから単離されるか、またはもたらされてもよい。一部の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの少なくとも一つは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶまたはウシＡＡＶのゲノムから単離されるか、またはもたらされる。一部の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの少なくとも一つは、ＡＡＶの他に、別のパルボウイルス種のメンバーからもたらされた単離された野生型または変異型ＩＴＲであってもよい。例えば、一部の実施形態では、ＩＴＲは、ボカウイルスまたはパルボウイルスＢ１９から単離されるか、またはもたらされた野生型または変異型ＩＴＲであってもよい。

一部の実施形態では、ＩＴＲは、ｓｃＡＡＶの産生を促進するための修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｃＡＡＶの産生を促進するための修飾は、ＩＴＲからの末端分離度配列（ＴＲＳ）の欠失である。一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり、３’ＩＴＲは、末端分離度配列を欠く変異型ＩＴＲである。一部の実施形態では、３’ＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり、５’ＩＴＲは、末端分離度配列を欠く変異型ＩＴＲである。一部の実施形態では、末端分離度配列は、５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの両方に存在しない。他の実施形態では、ｓｃＡＡＶの産生を促進するための修飾は、ｓｈＲＮＡ形成配列などの、異なるヘアピン形成配列でのＩＴＲの置換である。

一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号１の核酸配列、または配列番号１の核酸配列と少なくとも７０％同一（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは１００％同一）の配列を含む。一部の実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号２の核酸配列、または配列番号２の核酸配列と少なくとも７０％同一（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは１００％同一）の配列を含む。一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号１の配列を含み、３’ＩＴＲは、配列番号２の配列を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、一つまたは複数の「代理」ＩＴＲ、すなわち、ＩＴＲと同じ機能を果たす非ＩＴＲ配列を含む。例えば、Ｘｉｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２５（６）：１３６３－１３７４（２０１７）を参照のこと。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセット中のＩＴＲは、代理ＩＴＲによって置き換えられる。一部の実施形態では、代理ＩＴＲは、ヘアピン形成配列を含む。一部の実施形態では、代理ＩＴＲは、短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ形成配列である。

（ｉｉ）活性依存性プロモーター
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶ発現カセットは、プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、合成プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、内在性プロモーターおよび／または内在性エンハンサーに由来する核酸配列を含んでもよい。一部の実施形態では、プロモーターは、遺伝子の開始コドンの上流の領域に由来する核酸配列を含んでもよい。核酸配列は、開始コドンの上流１塩基対（ｂｐ）以内～約８０００ｂｐ以内にあってもよく、例えば、その間にある全ての部分範囲および値を含む、開始コドンの上流約１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐ、１５００ｂｐ、２０００ｂｐ、２５００ｂｐ、３０００ｂｐ、３５００ｂｐ、４０００ｂｐ、４５００ｂｐ、５０００ｂｐ、５５００ｂｐ、６０００ｂｐ、６５００ｂｐ、７０００ｂｐ、７５００ｂｐ、または８０００ｂｐ以内にあってもよい。

いかなる理論によっても結び付けられるものではないが、ＭＥＣＰ２機能は、ニューロン機能に関与する標的遺伝子の発現に寄与すると考えられる。これらの標的遺伝子の発現は、ＭＥＣＰ２が変異されたとき、影響される。これらの標的遺伝子の発現をＭＥＣＰ２独立性様式で回復させることにより、ＭＥＣＰ２変異と関連する、またはＭＥＣＰ２変異によって引き起こされる疾患の症状を緩和し得る。したがって、一部の実施形態では、プロモーターは、ＭＥＣＰ２独立性プロモーターである。本明細書で使用される場合、「ＭＥＣＰ２独立性プロモーター」は、機能が、ＭＥＣＰ２機能の低減、またはＭＥＣＰ２機能の喪失によって損なわれないプロモーターを指す。

いかなる理論によっても結び付けられるものではないが、ニューロン機能に関与する標的遺伝子の恒常的発現が有害であると考えられる。したがって、一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターの機能は、一回または複数の刺激の存在に依存する。一部の実施形態では、プロモーターは、活性依存性プロモーターである。本明細書で使用される場合、「ニューロン活性依存性プロモーター」と互換的に使用される、「活性依存性プロモーター」の機能は、ニューロン活性により誘導される。一部の実施形態では、活性依存性プロモーターは、カルシウムイオンのニューロンへの流入により誘導される。一部の実施形態では、活性依存性プロモーターを使用して、細胞（例えば、ニューロン）において恒常的に発現されたとき、有害である、任意の標的遺伝子の発現をもたらす。

一部の実施形態では、プロモーターは、ニューロンの即時型遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサーに由来する核酸配列を含む。ニューロンの即時型遺伝子の同一性は、限定されず、当該技術分野で公知であるか、または将来同定される、任意のニューロンの即時型遺伝子を指し得る。ニューロンの即時型遺伝子の非限定的な例としては、Ａｒｃ遺伝子、ｃ－ｆｏｓ遺伝子、およびｅｇｒ－１遺伝子が挙げられる。したがって、一部の実施形態では、プロモーターは、Ａｒｃ遺伝子、ｃ－ｆｏｓ遺伝子、またはｅｇｒ－１遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサーに由来する核酸配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ニューロトロフィン遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサーに由来する核酸配列を含む。ニューロトロフィン遺伝子の非限定的な例としては、ｂｄｎｆ（脳由来神経栄養因子）遺伝子、ｎｇｆ（神経成長因子）遺伝子、ニューロトロフィン－３遺伝子およびニューロトロフィン－４遺伝子が挙げられる。

一部の実施形態では、プロモーターは、一つまたは複数のニューロン活性依存性転写因子に結合することができる。本明細書で使用される場合、「ニューロンの活性依存性転写因子」は、ニューロンの活性に応答して活性化される転写因子である。一部の実施形態では、ニューロン活性依存性転写因子は、ニューロンの活性に応答して、遺伝子発現を促進する。一部の実施形態では、ニューロン活性依存性転写因子は、ニューロンの活性に応答して、遺伝子発現を抑制する。一部の実施形態では、ニューロン活性依存性転写因子は、カルシウム依存性キナーゼカスケードにより活性化される。

一部の実施形態では、プロモーターは、一つまたは複数のニューロン活性依存性転写因子に結合することができる一つまたは複数の核酸配列を含む。ニューロン活性依存性転写因子の非限定的な例としては、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）、筋細胞エンハンサー因子２（ＭＥＦ２）、血清応答因子（ＳＲＦ）、またはＥｌｋ－１が挙げられる。一部の実施形態では、プロモーターは、一つより多くのニューロン活性依存性転写因子に結合する能力があり、例えば、プロモーターは、２、３、４、または５つのニューロン活性依存性転写因子に結合する能力がある。一部の実施形態では、プロモーターは、二つのニューロン活性依存性転写因子に結合することができる。一部の実施形態では、プロモーターは、三つのニューロン活性依存性転写因子に結合することができる。一部の実施形態では、プロモーターは、以下のニューロン活性依存性転写因子：ＣＲＥＢ、ＭＥＦ２およびＳＲＦに結合する能力がある。

一部の実施形態では、プロモーターは、一つまたは複数の応答エレメントを含む。本明細書で使用される場合、「応答エレメント」は、刺激物の存在下で遺伝子発現をもたらすのに寄与するプロモーターの領域である。一部の実施形態では、応答エレメントは、プロモーターが刺激物の存在下で遺伝子発現をもたらすのに重要である。刺激物の非限定的な例としては、ホルモン、熱または光などの環境的合図、およびカルシウムなどの化学イオンが挙げられる。一部の実施形態では、プロモーターは、カルシウムの存在下で遺伝子発現をもたらす応答エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ニューロンの即時型遺伝子のプロモーターに存在する応答エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、Ａｒｃ遺伝子、ｃ－ｆｏｓ遺伝子、および／またはｅｇｒ－１遺伝子のプロモーターに存在する応答エレメントを含む。

一部の実施形態では、応答エレメントは、以下の：環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ）、シナプス活性応答エレメント（ＳＡＲＥ）、およびＭＥＦ２応答エレメント（ＭＲＥ）のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、一つもしくは複数のＣＲＥ、一つもしくは複数のＳＲＥ、一つもしくは複数のＳＡＲＥ、一つもしくは複数のＭＲＥ、またはその任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、応答エレメントは、一つまたは複数のニューロン活性依存性転写因子に結合する。一部の実施形態では、ＣＲＥは、ＣＲＥＢに結合する。一部の実施形態では、ＳＲＥは、ＳＲＦに結合する。一部の実施形態では、ＭＲＥは、ＭＥＦ２に結合する。一部の実施形態では、ＳＡＲＥは、ＣＲＥＢ、ＭＥＦ２およびＳＲＦに結合する。

一部の実施形態では、プロモーターは、１～２０個のＳＡＲＥ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＳＡＲＥを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、１つのＳＡＲＥを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、５つのＳＡＲＥを含む。一部の実施形態では、ＳＡＲＥは、マウスＳＡＲＥである。一部の実施形態では、ＳＡＲＥは、ヒトシナプス活性応答エレメント（ｈＳＡＲＥ）である。一部の実施形態では、ｈＳＡＲＥは、配列番号１１の核酸配列と、少なくとも７０％の同一性（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性）を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ｈＳＡＲＥは、配列番号１１の核酸配列、または配列番号１１の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。

一部の実施形態では、プロモーターは、Ａｒｃ遺伝子のプロモーターに由来する核酸配列を含む。一部の実施形態では、Ａｒｃ遺伝子は、マウスＡｒｃ遺伝子である。一部の実施形態では、Ａｒｃ遺伝子は、ヒトＡｒｃ遺伝子である。一部の実施形態では、プロモーターは、Ａｒｃ遺伝子の核酸－３００～＋３００にわたる領域、またはその任意のサブ領域を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、最小のＡｒｃ遺伝子プロモーター（ＡｒｃＭｉｎ）を含む。一部の実施形態では、ヒトＡｒｃＭｉｎ（ｈＡｒｃＭｉｎ）は、Ａｒｃ遺伝子の短い上流配列および５’ＵＴＲ（－２７６～＋２０８）を含む。一部の実施形態では、マウスＡｒｃＭｉｎ（ｍＡｒｃＭｉｎ）は、Ａｒｃ遺伝子の短い上流配列および５’ＵＴＲ（－２２２～＋１９８）を含む。一部の実施形態では、ｈＡｒｃＭｉｎは、配列番号１２の核酸配列と、少なくとも７０％の同一性（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性）を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ｈＡｒｃＭｉｎは、配列番号１２の核酸配列、または配列番号１２の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。

一部の実施形態では、プロモーターは、ｈＡｒｃＭｉｎおよび少なくとも一つのｈＳＡＲＥを含む。プロモーター中のｈＳＡＲＥの数は制限されず、１つのｈＳＡＲＥ～２０のｈＳＡＲＥ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のｈＳＡＲＥの範囲にあってもよい。一部の実施形態では、プロモーターは、ｈＡｒｃＭｉｎおよび一つのｈＳＡＲＥ（ＳＡＲＥ－ＡｒｃＭｉｎと呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、ＳＡＲＥ－ＡｒｃＭｉｎは、配列番号６の核酸配列と、少なくとも７０％の同一性（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性）を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＳＡＲＥ－ＡｒｃＭｉｎは、配列番号６の核酸配列、または配列番号６の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ｈＡｒｃＭｉｎおよび５つのｈＳＡＲＥ（Ｅ－ＳＡＲＥと呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、Ｅ－ＳＡＲＥは、配列番号１６の核酸配列と、少なくとも７０％の同一性（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性）を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｅ－ＳＡＲＥは、配列番号１６の核酸配列、または配列番号１６の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。ｈＡｒｃＭｉｎおよびｈＳＡＲＥに関するさらなる詳細は、Ｋａｗａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，８８９－８９５（２０１３）、Ｋａｗａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ ２０１４ Ａｐｒ ２３；８：３７、およびＫａｗａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｊａｎｕａｒｙ ６，２００９ １０６（１）３１６－３２において提供され、それらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、プロモーターは、Ａｒｃ遺伝子、ｃ－ｆｏｓ遺伝子、またはｅｇｒ－１遺伝子などのニューロンの即時型遺伝子の内在性プロモーターよりも高い遺伝子発現レベルを誘導する。一部の実施形態では、プロモーターは、Ａｒｃ遺伝子、ｃ－ｆｏｓ遺伝子、またはｅｇｒ－１遺伝子などのニューロンの即時型遺伝子の内在性プロモーターよりも少なくとも１．５倍高い遺伝子発現レベルを誘導する。一部の実施形態では、プロモーターは、Ａｒｃ遺伝子、ｃ－ｆｏｓ遺伝子、またはｅｇｒ－１遺伝子などの、ニューロンの即時型遺伝子の内在性プロモーターより約１．５倍～約１００倍（例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、または約１００倍）高い遺伝子発現レベルを誘導する。

一部の実施形態では、プロモーターは、遺伝子発現のため、当該技術分野で一般的に使用される一つまたは複数のプロモーターに由来する核酸配列を含む。例えば、一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーター、およびホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターに由来する核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、またはＥＦ－１アルファショートプロモーターに由来する核酸配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号１７～２０、または配列番号１７～２０と少なくとも７０％同一（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、配列番号１７～２０と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは１００％同一）の配列から選択される配列のいずれか一つを含む。

一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶ発現カセットは、エンハンサーをさらに含む。エンハンサーは、例えば、ＣＭＶエンハンサーであってもよい。一部の実施形態では、エンハンサーは、配列番号２１の配列、または配列番号２１の配列と少なくとも７０％同一（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは１００％同一）の配列を含む。

一部の実施形態では、プロモーターは、以下のプロモーター：ＨＭＧ－ＣＯＡ還元酵素プロモーター；ステロール制御エレメント１（ＳＲＥ－１）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター；ヒトＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）プロモーター；ヒトグルコキナーゼプロモーター；コレステロール７－アルファヒドラーゼ（ＣＹＰ－７）プロモーター；ベータ－ガラクトシダーゼアルファ－２，６シアリルトランスフェラーゼプロモーター；インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ－１）プロモーター；アルドラーゼＢプロモーター；ヒトトランスフェリンプロモーター；コラーゲンＩ型プロモーター；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）プロモーター；前立腺分泌タンパク質の９４（ＰＳＰ９４）プロモーター；前立腺特異的抗原複合体プロモーター；ヒト腺カリクレイン遺伝子プロモーター（ｈｇｔ－１）；筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２；筋クレアチンキナーゼプロモーター；膵炎関連タンパク質プロモーター（ＰＡＰ）；エラスターゼ１転写エンハンサー；膵臓特異的アミラーゼおよびエラスターゼエンハンサープロモーター；膵コレステロールエステラーゼ遺伝子プロモーター；ウテログロビンプロモーター；コレステロール側鎖切断（ＳＣＣ）プロモーター；ガンマ－ガンマエノラーゼ（ニューロン特異的エノラーゼ、ＮＳＥ）プロモーター；ニューロフィラメント重鎖（ＮＦ－Ｈ）プロモーター；ヒトＣＧＬ－１／グランザイムＢプロモーター；末端デオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ラムダ５、ＶｐｒｅＢ、およびｌｃｋ（リンパ球特異的チロシンタンパク質キナーゼｐ５６１ｃｋ）プロモーター；ヒトＣＤ２プロモーターおよびその３’転写エンハンサー；ヒトＮＫおよびＴ細胞特異的活性化（ＮＫＧ５）プロモーター；ｐｐ６０ｃ－ｓｒｃチロシンキナーゼプロモーター；器官特異的ネオアンチゲン（ＯＳＮ）、ｍｗ ４０ｋＤａ（ｐ４０）プロモーター；結腸特異的抗原Ｐプロモーター；ヒトアルファ－ラクトアルブミンプロモーター；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、ＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーター、カゼインプロモーター、ＩｇＧプロモーター、絨毛性胚抗原プロモーター、エラスターゼプロモーター、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素プロモーター、インスリンプロモーター、成長ホルモン因子プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、アルブミンプロモーター、アルファフェトプロテインプロモーター、アセチル－コリン受容体プロモーター、アルコール脱水素酵素プロモーター、アルファまたはベータグロビンプロモーター、Ｔ細胞受容体プロモーター、オステオカルシンプロモーター、ＩＬ－２プロモーター、ＩＬ－２受容体プロモーター、ｗｈｅｙ（ｗａｐ）プロモーター、ならびにＭＨＣクラスＩＩプロモーターのいずれか一つまたは複数に由来する核酸配列をさらに含む。

（ｉｉｉ）レット症候群関連遺伝子
本明細書で使用される場合、「レット症候群関連遺伝子」は、レット症候群の少なくとも一つの徴候または症状を緩和するための遺伝子療法により標的化され得る、レット症候群を有する対象における任意の遺伝子を指す。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルは、レット症候群を有する対象において低減されるか、または検出不能である。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルは、レット症候群の少なくとも一つの症状の発症時に減少する。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルは、正常な出生後発生および／またはニューロン発生において増加する。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子は、正常なニューロン機能に寄与するタンパク質をコードする。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子は、シナプス可塑性の促進および／または維持に関与するタンパク質をコードする。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子は、ニューロトロフィンである。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子の変異、またはレット症候群関連遺伝子の機能の喪失は、レット症候群を有する対象に存在する。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子の変異、またはレット症候群関連遺伝子の機能の喪失は、レット症候群を引き起こす。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子の変異、レット症候群関連遺伝子の機能の喪失、特に、前脳刺激ニューロンにおけるレット症候群関連遺伝子の変異、レット症候群関連遺伝子の機能の喪失は、ｍｅｃｐ２遺伝子の喪失と同様の症状を引き起こす。変異の種類は限定されず、挿入、欠失、重複および／または置換であってもよい。

本開示は、レット症候群関連遺伝子を含むＡＡＶ発現カセットを提供する。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、治療用（例えば、医薬もしくは獣医使用用）または免疫原性（例えば、ワクチン用）ポリペプチドを含むタンパク質をコードするレット症候群関連遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、哺乳類レット症候群関連遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、ヒトレット症候群関連遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）、ハンチンチンタンパク質、ハンチントン関連タンパク質１、オルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ－２）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子１（ＦＸＹＤ１）、ニューレキシン－２－アルファ（ＮＲＸＮ２）、またはタンパク質キナーゼＣガンマ（ＰＲＫＣＧ）をコードするレット症候群関連遺伝子を含む。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子は、ＫＣＮＡ１（カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー１）、ＧＡＢＲＡ１（ガンマ－アミノ酪酸Ａ型受容体サブユニットアルファ１）、ＭＡＰＫ１（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１）、ＮＲＸＮ２（ニューレキシン２）、ＲＢＦＯＸ１（ＲＮＡ結合Ｆｏｘ－１相同体１）、ＧＮＡＯ１（Ｇタンパク質サブユニットアルファＯ１）、ＮＣＡＮ（ニューロカン）、ＰＲＫＣＧ（タンパク質キナーゼＣガンマ）、ＫＣＮＪ４（カリウム内向き整流性チャネルＪメンバー４）、ＣＡＭＫ２Ｂ（カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩベータ）、ＥＦＮＢ３（エフリンＢ３）、ＧＡＢＢＲ１（ガンマ－アミノ酪酸Ｂ型受容体サブユニット１）、ＬＹ６Ｈ（リンパ球抗原６ファミリーメンバーＨ）、ＫＣＮＡ２（カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー２）、およびＮＥＦＬ（ニューロフィラメント軽鎖）からなる群から選択される遺伝子である。

一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードする。ＢＤＮＦは、ニューロンの生存および成長、シナプスの発生、ならびに可塑性のサポートにおいて機能するニューロトロフィンである。ＢＤＮＦ発現は、レット症候群において変化する。ｂｄｎｆの機能の喪失は、ｍｅｃｐ２の機能の喪失と類似の表現型をもたらし、ＢＤＮＦ機能は、ｍｅｃｐ２機能の喪失の際に影響される。ＢＤＮＦ機能に関する詳細は、Ｅｄｕａｒｄｏ Ｅ．Ｂｅｎａｒｒｏｃｈ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ Ａｐｒ ２０１５，８４（１６）１６９３－１７０４；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ．２００６；４９（３）：３４１－３４８；およびＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ５２，２５５－２６９，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９，２００６において提供され、それらのそれぞれが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＢＤＮＦは、ヒトＢＤＮＦである。一部の実施形態では、ＢＤＮＦは、配列番号７の核酸配列と、少なくとも７０％の同一性（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性）を有する核酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＢＤＮＦは、配列番号７の核酸配列、または配列番号７の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列によりコードされる。

ＢＤＮＦには、短い３’ＵＴＲ（約０．３５ｋｂ長）、または長い３’ＵＴＲ（約２．８５ｋｂ長）のいずれかを有する、ｂｄｎｆ ｍＲＮＡの二つの異なる集団を生成する、二つの代替ポリアデニル化転写停止部位が存在する。短い３’ＵＴＲを有するｂｄｎｆ ｍＲＮＡバリアントは、主にニューロンの細胞体に局在するが、長い３’ＵＴＲを有するｂｄｎｆ ｍＲＮＡバリアントは、樹状突起にも局在する。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲ、またはＢＤＮＦロング３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲ、またはＢＤＮＦロング３’ＵＴＲは、停止コドンと３’ＩＴＲの間に存在する。

一部の実施形態では、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲは、配列番号８の核酸配列と、少なくとも７０％の同一性（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性）を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲは、配列番号８の核酸配列、または配列番号８の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態では、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲは、配列番号１０の核酸配列と、少なくとも７０％の同一性（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性）を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＢＤＮＦロング３’ＵＴＲは、配列番号１０の核酸配列、または配列番号１０の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、コザック配列を含む。コザック配列は、多くの真核生物ｍＲＮＡ転写物においてタンパク質翻訳開始部位として機能する核酸配列である。一部の実施形態では、コザック配列は、開始コドンと重複する。一部の実施形態では、コザック配列は、配列番号１４または配列番号１５の核酸配列と、少なくとも７０％の同一性（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性）を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、コザック配列は、配列番号１４の核酸配列、もしくは配列番号１４の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列、または配列番号１５の核酸配列、もしくは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。

（ｉｖ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル
ポリアデニル化シグナルは、ほぼすべての哺乳類遺伝子に見られるヌクレオチド配列であり、約２００個のアデノシン残基（ポリ（Ａ）テール）のストリングの遺伝子転写物の３’末端への添加を調節する。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡ安定性に寄与し、ポリ（Ａ）テールを欠くｍＲＮＡは、急速に分解される。また、ポリ（Ａ）テールの存在が、翻訳の開始に影響を与えることによってｍＲＮＡの翻訳可能性にプラスに寄与するという証拠もある。

一部の実施形態では、本開示のＡＡＶ発現カセットは、ポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、ｒＢＧ、α－グロビン、β－グロビン、ヒトコラーゲン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ポリオーマウイルス、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）およびウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）のポリアデニル化シグナルから選択されてもよい。

一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、ｂＧＨポリアデニル化シグナルを含む。一部の実施形態では、ｂＧＨポリアデニル化シグナルは、配列番号９の核酸配列と、少なくとも７０％の同一性（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性）を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ｂＧＨポリアデニル化シグナルは、配列番号９の核酸配列、または配列番号９の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。

一部の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、ｒＢＧポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、配列番号２２または配列番号２３の配列を含む。一部の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、配列番号２２または配列番号２３の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。

（ｖ）スタッファー配列
ＡＡＶベクターは、一般的に、約４ｋｂ～約５．２ｋｂ、またはわずかにそれより大きい、定義されたサイズ範囲を有するＤＮＡの挿入物を典型的には受け入れる。したがって、より短い配列については、ＡＡＶベクターに許容可能な必要な長さを達成するために、挿入断片内にさらなる核酸を含むことが必要であり得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡＡＶ発現カセットは、スタッファー配列を含んでもよい。スタッファー配列は、例えば、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～１，０００、１，０００～１，５００、１，５００～２，０００、２，０００～２，５００、２，５００～３，０００、３，０００～３，５００、３，５００～４，０００、４，０００～４，５００、もしくは４，５００～５，０００、またはそれより長いヌクレオチド長の配列であってもよい。スタッファー配列は、ベクターの機能または活性を妨げないように、任意の所定の位置のカセット内に位置することができる。一部の実施形態では、スタッファー配列は、３’ＵＴＲの上流に位置する。例えば、一部の実施形態では、スタッファー配列は、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲと３’ＩＴＲの間、またはｂＧＨポリＡシグナルと３’ＩＴＲの間に存在する。

一部の実施形態では、ＡＡＶカセットは、少なくとも一つのスタッファー配列を含む。一部の実施形態では、スタッファー配列は、配列番号１３の核酸配列と、少なくとも７０％の同一性（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性）を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、スタッファー配列は、配列番号１３の核酸配列、または配列番号１３の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。

（ｖｉ）イントロン配列
一部の実施形態では、本開示のＡＡＶ発現カセットは、イントロン配列を含んでもよい。イントロン配列の包含は、イントロン配列の不存在下での発現と比較して、発現を増強し得る。

一部の実施形態では、イントロン配列は、ハイブリッド配列またはキメラ配列である。一部の実施形態では、イントロン配列は、ＳＶ４０、β－グロビン、ニワトリベータ－アクチン、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、第ＩＸ因子、および／またはヒトＩｇＧ（重鎖もしくは軽鎖）の一つまたは複数のイントロン配列から単離されるか、またはもたらされる。一部の実施形態では、イントロン配列は、キメラである。一部の実施形態では、イントロン配列は、配列番号２４または配列番号２５の配列を含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、配列番号２４または配列番号２５の核酸配列と、少なくとも７０％の同一性（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性）を有する核酸配列を含む。

（ｖｉｉ）例示的なＡＡＶ発現カセット
一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’末端逆位配列（ＩＴＲ）、導入遺伝子、および３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号７（ＢＤＮＦ）および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’ＩＴＲ、プロモーター、導入遺伝子、および３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号６（ｈＳＡＲＥ－ＡｒｃＭｉｎ）、配列番号７（ＢＤＮＦ）および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号１６（Ｅ－ＳＡＲＥ）、配列番号７（ＢＤＮＦ）および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’ＩＴＲ、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化配列および３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号６（ｈＳＡＲＥ－ＡｒｃＭｉｎ）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号９（ｂＧＨポリアデニル化配列）および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号１６（Ｅ－ＳＡＲＥ）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号９（ｂＧＨポリアデニル化配列）および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’ＩＴＲ、プロモーター、コザック配列、導入遺伝子、および３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号６（ｈＳＡＲＥ－ＡｒｃＭｉｎ）、配列番号１４または１５（コザック配列）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号１６（Ｅ－ＳＡＲＥ）、配列番号１４または１５（コザック配列）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’ＩＴＲ、プロモーター、コザック配列、導入遺伝子、ポリアデニル化配列および３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号６（ｈＳＡＲＥ－ＡｒｃＭｉｎ）、配列番号１４または１５（コザック配列）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号９（ｂＧＨポリアデニル化配列）および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号１６（Ｅ－ＳＡＲＥ）、配列番号１４または１５（コザック配列）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号９（ｂＧＨポリアデニル化配列）および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’ＩＴＲ、プロモーター、導入遺伝子、３’ＵＴＲおよび３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号６（ｈＳＡＲＥ－ＡｒｃＭｉｎ）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号８（ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲ）、および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号１６（Ｅ－ＳＡＲＥ）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号８（ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲ）、および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号６（ｈＳＡＲＥ－ＡｒｃＭｉｎ）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号１０（ＢＤＮＦロング３’ＵＴＲ）、および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号１６（Ｅ－ＳＡＲＥ）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号１０（ＢＤＮＦロング３’ＵＴＲ）、および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’ＩＴＲ、プロモーター、導入遺伝子、３’ＵＴＲ、ポリアデニル化配列および３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号６（ｈＳＡＲＥ－ＡｒｃＭｉｎ）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号８または１０（ＢＤＮＦショートもしくはロング３’ＵＴＲ）、配列番号９（ｂＧＨポリアデニル化配列）および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号１６（Ｅ－ＳＡＲＥ）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号８または１０（ＢＤＮＦショートもしくはロング３’ＵＴＲ）、配列番号９（ｂＧＨポリアデニル化配列）および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’ＩＴＲ、プロモーター、コザック配列、導入遺伝子、３’ＵＴＲおよび３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号６（ｈＳＡＲＥ－ＡｒｃＭｉｎ）、配列番号１４または１５（コザック配列）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号８または１０（ＢＤＮＦショートもしくはロング３’ＵＴＲ）、および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号１６（Ｅ－ＳＡＲＥ）、配列番号１４または１５（コザック配列）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号８または１０（ＢＤＮＦショートもしくはロング３’ＵＴＲ）、および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’ＩＴＲ、プロモーター、コザック配列、導入遺伝子、３’ＵＴＲ、ポリアデニル化配列および３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号６（ｈＳＡＲＥ－ＡｒｃＭｉｎ）、配列番号１４または１５（コザック配列）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号８または１０（ＢＤＮＦショートもしくはロング３’ＵＴＲ）、配列番号９（ｂＧＨポリアデニル化配列）および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号１６（Ｅ－ＳＡＲＥ）、配列番号１４または１５（コザック配列）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号８または１０（ＢＤＮＦショートもしくはロング３’ＵＴＲ）、配列番号９（ｂＧＨポリアデニル化配列）および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’ＩＴＲ、スタッファー配列、プロモーター、コザック配列、導入遺伝子、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、ポリアデニル化配列および３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号１３（スタッファー配列）、配列番号６（ｈＳＡＲＥ－ＡｒｃＭｉｎ）、配列番号１４または１５（コザック配列）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号８または１０（ＢＤＮＦショートもしくはロング３’ＵＴＲ）、配列番号９（ｂＧＨポリアデニル化配列）および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号１３（スタッファー配列）、配列番号１６（Ｅ－ＳＡＲＥ）、配列番号１４または１５（コザック配列）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号８または１０（ＢＤＮＦショートもしくはロング３’ＵＴＲ）、配列番号９（ｂＧＨポリアデニル化配列）および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。

一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’ＩＴＲ、プロモーター、コザック配列、導入遺伝子、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、ポリアデニル化配列、スタッファー配列および３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号６（ｈＳＡＲＥ－ＡｒｃＭｉｎ）、配列番号１４または１５（コザック配列）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号８または１０（ＢＤＮＦショートもしくはロング３’ＵＴＲ）、配列番号９（ｂＧＨポリアデニル化配列）、配列番号１３（スタッファー配列）、および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、配列番号１（５’ＩＴＲ）、配列番号１３（スタッファー配列）、配列番号１６（Ｅ－ＳＡＲＥ）、配列番号１４または１５（コザック配列）、配列番号７（ＢＤＮＦ）、配列番号８または１０（ＢＤＮＦショートもしくはロング３’ＵＴＲ）、配列番号９（ｂＧＨポリアデニル化配列）、配列番号１３（スタッファー配列）、および配列番号２（３’ＩＴＲ）を含む。

ＡＡＶ産生方法
本明細書に記載されるＡＡＶ発現カセットは、標準的な分子生物学技術を使用して、ベクター（例えば、プラスミドまたはバクミド）に取り込まれてもよい。本開示は、本明細書に記載されるＡＡＶ発現カセットのうちのいずれか一つを含むベクターを提供する。ベクター（例えば、プラスミドまたはバクミド）は、例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルスタンパク質配列を含む、ＡＡＶの産生中に使用される一つまたは複数の遺伝子エレメントをさらに含んでもよい。

本明細書に記載される、ＡＡＶ発現カセット、およびＡＡＶ発現カセットを含むベクター（例えば、プラスミド）を使用して、組み換えＡＡＶベクターを産生してもよい。

本開示は、ＡＡＶ産生細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）を本開示のＡＡＶ発現カセット、またはベクター（例えば、プラスミド）を接触させることを含む、組み換えＡＡＶベクターを産生する方法を提供する。本開示は、本明細書に開示されるＡＡＶ発現カセット、またはベクターのいずれか一つを含む細胞をさらに提供する。一部の実施形態では、方法は、ＡＡＶ産生細胞を、例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルスタンパク質配列をコードする、一つまたは複数のさらなるプラスミドを接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、組み換えＡＡＶベクターを産生する方法は、ＡＡＶ産生細胞（例えば、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞）を、本開示のＡＡＶ発現カセットを含む少なくとも一つの昆虫細胞適合ベクターと接触させることを含む。「昆虫細胞適合ベクター」は、核酸を用いた昆虫細胞の形質転換またはトランスフェクションを促進する、任意の化合物または製剤（生物学的もしくは化学的）である。一部の実施形態では、昆虫細胞適合ベクターは、バキュロウイルスベクターである。一部の実施形態では、方法は、ＡＡＶが産生されるような条件下で、昆虫細胞を維持することをさらに含む。

本開示は、本明細書に開示される方法のいずれか一つを使用して産生される組み換えＡＡＶベクターを提供する。産生される組み換えＡＡＶベクターは、任意の血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶまたはウシＡＡＶのものであってもよい。一部の実施形態では、産生される組み換えＡＡＶベクターは、天然のＡＡＶカプシドと比較して、一つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、置換および／または欠失）を含んでもよい。例えば、組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶおよびウシＡＡＶに由来する修飾されたＡＡＶベクターであってもよい。一部の実施形態では、組み換えＡＡＶベクターは、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である。一部の実施形態では、組み換えＡＡＶベクターは、自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶまたはウシＡＡＶのカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、一個または複数の置換または変異を有するカプシドタンパク質を含む。本明細書に開示される組み換えＡＡＶベクターを使用して、例えば、組み換えＡＡＶベクターを標的細胞と接触させることによって、導入遺伝子配列を用いて標的細胞を形質導入してもよい。

発現および治療方法
本開示は、本明細書に開示される核酸、ＡＡＶ発現カセット、プラスミド、細胞、または組み換えＡＡＶベクターのいずれか一つを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、少なくとも一つの医薬的に許容可能な担体、賦形剤、ならびに／またはビヒクル、例えば、溶媒、バッファー、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を含む。一部の実施形態では、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、および／またはビヒクルは、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、無菌の等調水性バッファー、およびその組み合わせを含んでもよい。一部の実施形態では、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、および／またはビヒクルは、リン酸緩衝食塩水、無菌の食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）または適当なその混合物を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、少量の乳化剤もしくは湿潤剤、またはｐＨ緩衝剤をさらに含む。

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、保存剤、またはクロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノールもしくはアルブミンなどの化学安定剤などの他の従来の医薬成分をさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸もしくはチメロサールなどの抗菌剤および抗真菌剤、糖もしくは塩化ナトリウムなどの等張剤、および／またはモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤をさらに含んでもよい。

本開示は、細胞を、本明細書に開示される核酸、ＡＡＶ発現カセット、プラスミド、組み換えＡＡＶベクター、または組成物のいずれか一つと接触させることによって、レット症候群関連遺伝子を細胞に送達させる方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、細胞培養中の培養細胞などの、分裂細胞である。一部の実施形態では、細胞は、非分裂細胞である。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に送達して、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法のため、レット症候群関連ポリペプチドを産生する。

一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子を、それを必要とする対象に送達して、例えば、免疫原性ポリペプチドまたは治療用ポリペプチドを発現させる。この様に、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡは、対象においてｉｎ ｖｉｖｏで産生することができる。したがって、本開示は、対象に、治療上有効量の、本明細書に開示される核酸、ＡＡＶ発現カセット、プラスミド、細胞、組み換えＡＡＶベクター、または組成物のいずれか一つを投与することを含む、それを必要とする対象においてレット症候群関連遺伝子を発現させる方法を提供する。本開示はまた、対象におけるレット症候群の少なくとも一つの症状を治療するため、および／またはレット症候群の少なくとも一つの症状の発症を遅延させるための方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、対象に、治療上有効量の、本明細書に開示される核酸、ＡＡＶ発現カセット、プラスミド、細胞、組み換えＡＡＶベクター、または組成物のいずれか一つを投与することを含む。一部の実施形態では、対象は、レット症候群を有する。一部の実施形態では、対象は、レット症候群を発症する高いリスクを有し、例えば、対象は、ｍｅｃｐ２遺伝子の変異を有すると同定されている新生児である。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子を、遺伝子療法により標的化して、その発現および／または機能を増加させる。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子を、遺伝子療法により標的化して、その発現および／または機能を減少する。

本開示は、対象に、治療上有効量の、本明細書に開示される核酸、ＡＡＶ発現カセット、プラスミド、細胞、組み換えＡＡＶベクター、または組成物のいずれか一つを投与することを含む、対象におけるＭＥＣＰ２関連疾患を治療する、および／またはＭＥＣＰ２関連疾患の発症を遅延させる方法を提供する。本明細書で使用される場合、「ＭＥＣＰ２関連疾患」は、野生型ｍｅｃｐ２遺伝子と比較して、ｍｅｃｐ２遺伝子に対する遺伝子変化（例えば、一つまたは複数の欠失、挿入、重複および／もしくは置換）、ならびに／または野生型ＭＥＣＰ２タンパク質と比較して、ＭＥＣＰ２タンパク質の発現および／もしくは活性に対する変更と相関するか、あるいは引き起こされる疾患である。

一部の実施形態では、ＭＥＣＰ２関連疾患は、ＭＥＣＰ２重複症候群、ＭＥＣＰ２関連重症新生児脳症、ＰＰＭ－Ｘ症候群、またはレット症候群である。ＭＥＣＰ２重複症候群は、ＭＥＣＰ２遺伝子の重複により引き起こされ、知的障害、発達の遅延、および発作により特徴付けられる。ＭＥＣＰ２遺伝子の重複は、過剰なＭＥＣＰ２タンパク質の産生、およびタンパク質機能の増加をもたらし、これにより、異常なニューロン機能をもたらす。ＭＥＣＰ２関連重症新生児脳症は、ｍｅｃｐ２遺伝子の変異により引き起こされ、その大部分は、単一塩基対の挿入、欠失または置換である。この状態は、ほぼ男性のみに影響し、小さい頭部サイズ（小頭症）、運動障害、呼吸の問題、および発作により特徴付けられる。ｍｅｃｐ２遺伝子の変異は、ＭＥＣＰ２タンパク質の構造を変更するか、または産生されるタンパク質の量を低減することができる。ＰＰＭ－Ｘ症候群は、軽度から重度の知的障害、双極性障害、および運動異常のパターンにより特徴付けられる疾患である。ＰＰＭ－Ｘ症候群の全症例の約半数は、ｍｅｃｐ２遺伝子の八つの変異のうちの一つによって引き起こされる。これらの変異は、ＭＥＣＰ２タンパク質中のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換を引き起こすか、またはｍｅｃｐ２ ｍＲＮＡ中に未成熟停止シグナルを生成する。

本開示は、対象に、治療上有効量の、本明細書に開示される核酸、ＡＡＶ発現カセット、プラスミド、細胞、組み換えＡＡＶベクター、または組成物のいずれか一つを投与することを含む、対象におけるＢＤＮＦ関連疾患を治療する、および／またはＢＤＮＦ関連疾患の発症を遅延させる方法をさらに提供する。本明細書で使用される場合、「ＢＤＮＦ関連疾患」は、ｂｄｎｆ遺伝子に対する遺伝子変化、ならびに／またはＢＤＮＦタンパク質の発現および／もしくは活性に対する変化と相関するか、または引き起こされる疾患である。一部の実施形態では、ＢＤＮＦ関連疾患は、認知障害、および／またはストレス関連障害である。一部の実施形態では、ＢＤＮＦ関連疾患は、うつ病、強迫障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、認知症、神経性無食欲症、神経性過食症、統合失調症、てんかん、外傷後ストレス障害、双極性疾患、レット症候群、大うつ病性障害、または化学療法後認知障害である。

一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子は、対象のニューロンで発現される。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子の発現レベルは、身体の非ニューロン細胞よりもニューロンで高い。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子の発現は、非ニューロン細胞において検出不能である。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子の発現レベルは、身体の非ニューロン細胞と比べて、少なくとも約１．２倍（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、または約１００倍）、ニューロンにおいて高い。

一部の実施形態では、ニューロンは、活性ニューロンである。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子の発現レベルは、身体の静止ニューロンより活性ニューロンにおいて高い。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子の発現は、静止ニューロンにおいて検出不能である。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子の発現レベルは、静止ニューロンと比べて、少なくとも約１．２倍（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、または約１００倍）、活性ニューロンにおいて高い。

一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンにおいて発現される。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子の発現レベルは、身体の非ニューロン細胞と比べて、少なくとも約１．２倍（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、または約１００倍）、ＣＮＳニューロンにおいて高い。

一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子の発現レベルは、身体の抹消神経系（ＰＮＳ）ニューロンなどの、他の非ＣＮＳニューロンよりＣＮＳニューロンにおいて高い。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子の発現は、ＰＮＳニューロンにおいて検出不能である。一部の実施形態では、レット症候群関連遺伝子の発現レベルは、身体の抹消神経系（ＰＮＳ）ニューロンなどの、他の非ＣＮＳニューロンと比べて、少なくとも約１．２倍（例えば、その間に存在するすべての値および部分範囲を含む、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、または約１００倍）、ＣＮＳニューロンにおいて高い。

対象に投与されるべき組み換えＡＡＶベクターの投薬量は、投与方法、治療および／または予防されるべき疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクターもしくはカプシド、ならびに送達されるべき核酸などに依存し、慣習的様式で決定することができる。治療効果を達成するための例示的な投薬量は、少なくとも約１０^５、約１０^６、約１０^７、約１０^８、約１０^９、約１０^１０、約１０^１１、約１０^１２、約１０^１３、約１０^１４、約１０^１５形質導入単位、任意選択で、約１０^８～約１０^１３形質導入単位の力価である。

特定の実施形態では、複数回の投与（例えば、二、三、四回以上の投与）を利用して、様々な間隔、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年などの期間にわたり、所望のレベルの遺伝子発現を達成してもよい。

例示的な投与方法には、経口、直腸、経粘膜的、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介して）、口腔（例えば、舌下）、膣、くも膜下腔内、眼内、経皮、子宮内（または胚内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内〔骨格筋、横隔膜および／または心筋への投与〕、皮内、胸膜内、脳内、ならびに関節内を含む）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚表面と粘膜表面の両方への、および経皮投与）、リンパ内など、ならびに直接の組織または臓器注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋もしくは脳）が挙げられる。一部の実施形態では、投与は、中枢神経系への注射によるものである。任意の所与の症例において最も適当な経路は、治療されている状態および／または予防されている状態の性質および重症度、ならびに使用されている特定のベクターの性質に依存する。

標的組織への送達はまた、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドを含むデポーを送達することによっても達成することができる。代表的な実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むデポーは、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋組織に移植されるか、または組織を、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むフィルムまたは他の基材と接触させることができる。

一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、対象に、治療上有効量の、本明細書に開示される核酸、ＡＡＶ発現カセット、プラスミド、細胞、組み換えＡＡＶベクター、または組成物のいずれか一つを、レット症候群を標的とする一つまたは複数の二次療法と組み合わせて投与することを含んでもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される、対象におけるレット症候群の少なくとも一つの症状を治療する、および／または症状の発症を遅延させる方法は、レット症候群を治療する一つまたは複数の二次療法を投与することをさらに含んでもよい。一部の実施形態では、二次療法は、酢酸グラチラマーの投与を含む。酢酸グラチラマーの使用に関するさらなる詳細は、Ｄｊｕｋｉｃ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１６ Ａｕｇ；６１：５１－７参照されたく、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、二次療法は、発作を治療するための薬物の投与、逆流を治療するための薬物の投与、またはその組み合わせを含む。一部の実施形態では、二次療法は、発作を治療するための薬物の投与を含む。発作を治療するための薬物の非限定的な例としては、レベチラセタム、バルプロ酸、オクスカルバゼピン、およびラモトリギンが挙げられる。一部の実施形態では、二次療法は、逆流を治療するための薬物の投与を含む。逆流を治療するための薬物の非限定的な例としては、シメチジン、ラニチジン、ニザチジン、およびファモチジンなどのＨ２ブロッカー、オメプラゾール、エソメプラゾール、ランソプラゾール、ラベプラゾール、パントプラゾール、およびデキランソプラゾールなどのプロトンポンプ阻害剤、ならびに低用量エリスロマイシン、ベンズアミド、ドンペリドン、およびリナクロチドなどの運動剤が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「組み合わせて」投与されるという用語は、患者に対する治療の作用がある時点で重複するように、二つ（以上）の異なる治療が、障害（例えば、レット症候群）に伴う対象の苦痛の経過中に、対象に送達されることを意味すると理解される。ある特定の実施形態では、一つの治療の送達は、第二の送達が開始するときに、依然として生じ、その結果、投与の点で重複がある。これは、ときに、本明細書において「同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」または「同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）」送達として言及される。他の実施形態では、一方の治療の送達が、他方の治療の送達が始まる前に終わり、これは、「連続的」送達と呼ばれ得る。

一部の実施形態では、併用投与のため、治療はより有効である。例えば、第二の治療は、より有効であり、例えば、均等な作用が、より少ない第二の治療で見られるか、または第二の治療は、第二の治療が、第一の治療の不存在下で投与されるか、もしくは類似の状況が、第一の治療で見られる場合に見られるものより、より大きな程度まで症状を低減する。二つの治療の作用は、部分的に相加、全体的に相加、または相加より大きく（相乗）てもよい。

本明細書において引用される全ての論文、刊行物および特許は、それぞれの個々の論文、刊行物または特許が、参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用され、刊行物が引用されるものと関連して、方法および／または材料を開示し、記載するために、参照により本明細書に援用される。しかしながら、本明細書に引用される任意の参考文献、記事、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、世界のどの国においても、それらが有効な先行技術を構成するか、または共通の一般知識の一部を形成するという承認またはいかなる形態の提案として受け取られるものではなく、またそうされるべきではない。

文脈が別段示さない限り、本明細書に記載される様々な特徴を、任意の組み合わせで使用することができることが具体的に意図される。

別段定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示の属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

上記の説明ならびに以下の実施例は、本発明の範囲を例示することを意図しており、限定するものではないことは、理解されるべきである。本発明の範囲内の他の態様、利点および改変は、本発明が関連する分野の当業者には明らかであろう。

以下の実施例は、例示のみを目的として本明細書に含まれるが、限定することを意図するものではない。

実施例１：ＡＡＶ発現カセットの調製
５’ＩＴＲ（配列番号１）および３’ＩＴＲ（配列番号２）に隣接する、活性依存性ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーター（配列番号６）およびＢＤＮＦ遺伝子（配列番号７）を含む三つのＡＡＶ発現カセットを、標準的なクローニング技術を使用して作製した。三つのカセットの略図を示す図１～３を参照のこと。第一のカセットは、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲ（配列番号８）およびスタッファー配列（配列番号１３）を含む。第二のカセットは、ｂＧＨポリＡシグナル（配列番号９）およびスタッファー配列（配列番号１３）を含む。第三のカセットは、ＢＤＮＦロング３’ＵＴＲ（配列番号１０）を含む。三つのＡＡＶ発現カセットは、それぞれ、配列番号３（図１）、配列番号４（図２）、および配列番号５（図３）の核酸配列を含む。

実施例２：哺乳類細胞における組み換えＡＡＶベクターの調製
三つのＡＡＶ発現カセットのそれぞれをプラスミドに組み込んで、三つのＡＡＶ発現カセットのそれぞれを含む三つのプラスミドを得る。三つのプラスミドのそれぞれを、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子をコードするＲｅｐ／Ｃａｐプラスミド、およびＡＡＶ産生（Ｅ４、Ｅ２ａおよびＶＡ）に必要な様々なヘルパー配列を含むヘルパープラスミドとともに、適切なトランスフェクション試薬（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標））を使用して、ウイルス産生細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）にトランスフェクトする。予め決めた時間、３７℃でインキュベーション後、ＡＡＶ粒子を、培地から回収し、細胞を溶解して、ＡＡＶ粒子を放出させる。次いで、ＡＡＶ粒子を精製し、力価を決定し、後に使用するため、－８０℃で保存してもよい。

実施例３：昆虫細胞における組み換えＡＡＶベクターの調製
三つのＡＡＶ発現カセットのそれぞれを、バキュロウイルスベクターに組み込んで、三つのＡＡＶ発現カセットのそれぞれを含む三つのバキュロウイルスベクターを得る。昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）に、三つのバキュロウイルスベクターのそれぞれ、ならびにＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする配列を含む少なくとも一つのさらなる組み換えバキュロウイルスベクターを、懸濁培養において同時感染させる。予め決めた時間、２８℃でインキュベーション後、ＡＡＶ粒子を、培地から回収し、細胞を溶解して、ＡＡＶ粒子を放出させる。次いで、ＡＡＶ粒子を精製し、力価を決定し、後に使用するため、－８０℃で保存してもよい。

実施例４：ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターは、活性依存性レポーター遺伝子発現をもたらす
ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターが、ニューロンの活性に依存した様式で遺伝子発現をもたらすことができるかどうかを検証するために、以下の実験を行った。

ニューロン（ｈＳｙｎ；配列番号３８の核酸配列を含む、ヒトシナプシン１遺伝子プロモーター）における長期発現をもたらす恒常的プロモーターまたは活性依存性プロモーター（ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎ、配列番号６）を含むＡＡＶ発現カセットを、標準的なクローニング技術を使用して作製した（表３を参照）。図４、９Ａ～９Ｃ、１０Ａ～１０Ｃ、および１１Ａ～１１Ｃは、三つのカセットの略図を示す。カセットは、以下の３’ＵＴＲ配列：ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲ（配列番号８）、ｂＧＨポリＡシグナル（「ｂＧＨｐＡ」もしくは「ｂＧＨ」として言及する、配列番号９）、またはＢＤＮＦロング３’ＵＴＲ（配列番号１０）の一つを含む。カセットはまた、恒常的または活性依存性プロモーターに作動可能に連結したレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子は、単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＳｃａｒｌｅｔ、配列番号３６の核酸配列がコードする）、またはｍＳｃａｒｌｅｔの不安定化バージョン（ｄｍＳｃａｒｌｅｔ、配列番号３５の核酸配列がコードする）のいずれかをコードする。ｍＳｃａｒｌｅｔの不安定化バージョンは、ｍＳｃａｒｌｅｔと比較して、プロテアソーム分解がもたらすより速いターンオーバーを促進する、Ｃ末端ＰＥＳＴデグロンシグナル（配列番号３７の核酸配列がコードする）を含む。したがって、ｄｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光は、ｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光より低い程度に、細胞内で蓄積する。

表３に列挙したＡＡＶ発現カセット１、２、３、７、８、および９を含む組み換えＡＡＶベクターを、本明細書に記載した通り調製した。野生型マウス一次ニューロンを、これらの組み換えＡＡＶベクターのそれぞれで形質導入した。形質導入した細胞を、２μＭナトリウムチャンネル阻害剤であるテトロドトキシン（ＴＴＸ）で一晩処理した。ＴＴＸを用いた処理は、ニューロンの活性を阻害する。その後、培地を完全に吸引し、以下：（ａ）培地のみ、（ｂ）培地＋ＴＴＸ、（ｃ）培地＋１５０ｍＭ ＫＣｌ、または（ｄ）培地＋３０μＭビククリン（ＢＩＣ）のいずれか一つで置き換えた。ＫＣｌが、ニューロンを脱分極する一方、ＢＩＣは、γ－アミノ酪酸Ａ型（ＧＡＢＡＡ）受容体の競合的アンタゴニストであり、ニューロンの脱抑制を誘導する。したがって、ＫＣｌまたはＢＩＣのいずれかでニューロンを処理することは、ニューロンの活性を促進する。培地単独（上記の処理（ａ）に従って）にある対照ニューロンを、阻害も活性化もせず、静止している一方、ＴＴＸを含有する培地（上記の処理（ｂ）に従って）にあるニューロンの活性を阻害する。細胞を、３７℃で２時間さらにインキュベートした。次いで、細胞を固定し、ヘキスト３３３４２で染色し、蛍光顕微鏡を使用して撮像した。

図５Ａは、１に対して標準化した、２μＭ ＴＴＸで処理した細胞の蛍光と比べて、ＴＴＸで処理していない細胞（すなわち、ニューロンの活性が促進も阻害もされていない細胞）におけるレポータータンパク質蛍光を示す。図５Ａに示す通り、ニューロンの活性が、促進も阻害もされないとき、ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターを使用してｄｍＳｃａｒｌｅｔ発現をもたらすＡＡＶベクターで形質導入した細胞の相対的蛍光は、恒常的プロモーターｈＳｙｎを使用してｍＳｃａｒｌｅｔ発現をもたらすＡＡＶベクターで形質導入した細胞の相対的蛍光と同等である。

図５Ｂは、１に対して標準化した、２μＭ ＴＴＸで処理した細胞の蛍光と比べて、ＴＴＸで処理していないが、代わりに１５０ｍＭ ＫＣｌで処理した細胞（すなわち、ニューロンの活性が促進されている細胞）におけるレポータータンパク質蛍光を示す。図５Ｃは、１に対して標準化した、２μＭ ＴＴＸで処理した細胞の蛍光と比べて、ＴＴＸで処理していないが、代わりに３０μＭビククリン（ＢＩＣ）で処理した細胞（すなわち、ニューロンの活性が促進されている細胞）におけるレポータータンパク質蛍光を示す。

図５Ｂおよび５Ｃに示す通り、ニューロンの活性が、ＫＣｌまたはＢＩＣ処理を使用して促進されるとき、活性依存性プロモーターであるｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎを使用してｄｍＳｃａｒｌｅｔ発現をもたらすＡＡＶベクターで形質導入した細胞の相対的蛍光は、恒常的プロモーター（ｈＳｙｎ）を使用してｍＳｃａｒｌｅｔ発現をもたらすＡＡＶベクターで形質導入した細胞の相対的蛍光より高い。

これらの結果は、ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターが、ニューロンの活性に依存した様式で遺伝子発現をもたらすことができることを示す。さらに、図５Ｂおよび５Ｃに示す通り、ｂＧＨまたはロング３’ＵＴＲを含むｄｍＳｃａｒｌｅｔ構築物は、ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターにより同様に発現した。

ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターの活性依存性発現を、図６Ａ～Ｂによりさらに説明する。図６Ａに示す通り、恒常的プロモーターであるｈＳｙｎは、ＴＴＸの存在に関わらず、高レベルのｍＳｃａｒｌｅｔ発現をもたらす。際立ったことに、図６Ｂは、細胞が、ＴＴＸで処理されていないが、代わりに、３０μＭ ＢＩＣで処理して、ニューロンの活性を促進したとき、ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターが、高レベルのレポーター遺伝子発現をもたらすことを示す。特に、図６Ｂは、ロング３’ＵＴＲと組み合わせてｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターを含むＡＡＶ発現構築物が、ｂＧＨｐＡと組み合わせてｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターを含むＡＡＶ発現構築物と比較して、ＴＴＸの存在下で約５倍高いレベルのｄｍＳｃａｒｌｅｔ発現をもたらしたことを示す。これらの結果は、ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターのニューロン活性依存性誘導をさらに示す。

発現した蛍光タンパク質の細胞内局在およびレベルを決定するために、恒常的ｈＳｙｎプロモーターまたは活性依存性ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーター下でレポーター遺伝子を発現するニューロンを、顕微鏡を使用して観察した。

図７に示す通り、恒常的プロモーターであるｈＳｙｎを使用してｍＳｃａｒｌｅｔを発現している細胞は、蛍光性であったが、蛍光のレベルは、発現カセットの３’ＵＴＲ領域またはポリアデニル化シグナルに基づき変動した。例えば、ロング３’ＵＴＲを含む発現カセットは、より高いレベルのｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子発現をもたらし、ショート３’ＵＴＲを含む発現カセットが続いた。ショート３’ＵＴＲを含む発現カセットは、かなり低いレベルのｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子発現をもたらした。対照的に、活性依存性ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーター下でのレポータータンパク質の発現は、使用した３’ＵＴＲの種類に基づき変動しない。特に、図５および６は、ｂＧＨｐＡまたはロング３’ＵＴＲと組み合わせてｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターを含むＡＡＶ発現構築物が、ニューロンの活性の存在下で、同様のレベルのｄｍＳｃａｒｌｅｔ発現をもたらしたことを示す。

さらに、図７は、恒常的プロモーターから発現したｍＳｃａｒｌｅｔの細胞内局在は、発現カセットの３’ＵＴＲ領域またはポリアデニル化シグナルに基づき変動することを示す。ロング３’ＵＴＲおよびｂＧＨｐＡを含む発現カセットが、細胞体および神経突起におけるｍＳｃａｒｌｅｔ発現をもたらした一方、ショート３’ＵＴＲを含む発現カセットは、細胞体においてのみｍＳｃａｒｌｅｔ発現をもたらした。

図８および１２に示す通り、ｂＧＨｐＡ（図８）またはロング３’ＵＴＲ（図１２）と組み合わせてｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターを含むＡＡＶ発現構築物が、ニューロンの活性の存在下で、同様のレベルのｄｍＳｃａｒｌｅｔ発現をもたらしたことを示す。さらに、活性依存性ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターを使用してｄｍＳｃａｒｌｅｔを発現している細胞は、ニューロン活性化（ＴＴＸの不存在およびＢＩＣの存在下）の際の細胞体および神経突起における蛍光シグナルを示した。

要約すると、上述の結果は、合成ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターが、阻害または静止しているニューロンと比較して、活性であるニューロンにおいてより高いレベルの遺伝子発現を促進することを示す。したがって、合成ｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎプロモーターを使用して、本明細書に記載されるレット症候群関連遺伝子などの任意の標的遺伝子のニューロン活性依存性発現をもたらし得る。

実施例５：ＢＤＮＦを含むＡＡＶ発現カセットの特徴付け
実施例２または３で作製したＡＡＶ粒子を、レット症候群と類似した症状を呈する、ｍｅｃｐ２変異マウスへの注射により投与して、活性依存性プロモーターであるｈＳＡＲＥ－ｈＡｒｃＭｉｎを使用したＢＤＮＦの発現が、一つまたは複数の症状の重症度を減少させるかどうかを試験する。新生児ｍｅｃｐ２変異マウスにおけるレット症候群症状の発症を遅延させる活性依存性ＢＤＮＦ発現の能力も試験する。

前述は、本発明の説明であり、その限定と解釈されるべきではない。

番号付けされた実施形態
以下の実施形態のリストは、例示のみを目的として本明細書に含まれ、包括的または限定することを意図するものではない。請求される主題は、明確に、以下の実施形態に限定されない。
実施形態１．
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットを含む核酸であって、ＡＡＶ発現カセットが、５’から３’の方向に、
５’末端逆位配列（ＩＴＲ）；
合成活性依存性プロモーター；
レット症候群関連遺伝子；および
３’ＩＴＲを含む、核酸。
実施形態２．
プロモーターが、レット症候群関連遺伝子の発現をもたらす、実施形態１の核酸。
実施形態３．
プロモーターが、ＭＥＣＰ２独立性プロモーターである、実施形態１または２の核酸。
実施形態４．
プロモーターが、ニューロンの即時型遺伝子のプロモーターに由来する核酸配列を含む、実施形態１～３のいずれか一つの核酸。
実施形態５．
ニューロンの即時型遺伝子が、Ａｒｃ遺伝子、ｃ－ｆｏｓ遺伝子、およびｅｇｒ－１遺伝子からなる群から選択される、実施形態４の核酸。
実施形態６．
プロモーターが、最小のＡｒｃ遺伝子プロモーター（ＡｒｃＭｉｎ）を含む、実施形態１～５のいずれか一つの核酸。
実施形態７．
ＡｒｃＭｉｎが、ヒトＡｒｃＭｉｎ（ｈＡｒｃＭｉｎ）である、実施形態６の核酸。
実施形態８．
ｈＡｒｃＭｉｎは、配列番号１２の核酸配列、または配列番号１２の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態７の核酸。
実施形態９．
プロモーターが、環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ）、シナプス活性応答エレメント（ＳＡＲＥ）、ＭＥＦ２応答エレメント、またはその組み合わせを含む、実施形態１～８のいずれか一つの核酸。
実施形態１０．
プロモーターが、シナプス活性応答エレメント（ＳＡＲＥ）を含む、実施形態９の核酸。
実施形態１１．
シナプス活性応答エレメント（ＳＡＲＥ）が、ヒトシナプス活性応答エレメント（ｈＳＡＲＥ）である、実施形態１０の核酸。
実施形態１２．
ｈＳＡＲＥが、配列番号１１の核酸配列、または配列番号１１の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態１１の核酸。
実施形態１３．
プロモーターが、ヒトＡｒｃＭｉｎ（ｈＡｒｃＭｉｎ）および少なくとも一つのｈＳＡＲＥを含む、実施形態１～１２のいずれか一つの核酸。
実施形態１４．
プロモーターが、ｈＡｒｃＭｉｎおよび一つのｈＳＡＲＥを含む、実施形態１３の核酸。
実施形態１５．
プロモーターが、配列番号６の核酸配列、または配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態１４の核酸。
実施形態１６．
プロモーターが、ｈＡｒｃＭｉｎおよび五つのｈＳＡＲＥを含む、実施形態１３の核酸。
実施形態１７．
プロモーターが、配列番号１６の核酸配列、または配列番号１６の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態１６の核酸。
実施形態１８．
プロモーターが、ニューロンの活性依存性転写因子に結合する、実施形態１～１７のいずれか一つの核酸。
実施形態１９．
ニューロンの活性依存性転写因子が、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）、筋細胞エンハンサー因子２（ＭＥＦ２）、血清応答因子（ＳＲＦ）、またはＥｌｋ－１である、実施形態１８の核酸。
実施形態２０．
レット症候群関連遺伝子が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）、ハンチンチンタンパク質、ハンチントン関連タンパク質１、オルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ－２）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子１（ＦＸＹＤ１）、ニューレキシン－２－アルファ（ＮＲＸＮ２）、またはタンパク質キナーゼＣガンマ（ＰＲＫＣＧ）をコードする、実施形態１～１９のいずれか一つの核酸。
実施形態２１．
レット症候群関連遺伝子が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードする、実施形態２０の核酸。
実施形態２２．
ＢＤＮＦが、ヒトＢＤＮＦである、実施形態２１の核酸。
実施形態２３．
ＢＤＮＦが、配列番号７の核酸配列、または配列番号７の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列によりコードされる、実施形態２２の核酸。
実施形態２４．
５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの少なくとも一つが、約１１０～約１６０ヌクレオチド長である、実施形態１～２３のいずれか一つの核酸。
実施形態２５．
５’ＩＴＲが、３’ＩＴＲと同じ長さである、実施形態１～２４のいずれか一つの核酸。
実施形態２６．
５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲが、異なる長さを有する、実施形態１～２４のいずれか一つの核酸。
実施形態２７．
５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの少なくとも一つが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶまたはウシＡＡＶのゲノムから単離されるか、またはもたらされる、実施形態１～２６のいずれか一つの核酸。
実施形態２８．
５’ＩＴＲが、配列番号１の配列を含む、実施形態１～２３のいずれか一つの核酸。
実施形態２９．
３’ＩＴＲが、配列番号２の配列を含む、実施形態１～２３のいずれか一つの核酸。
実施形態３０．
ＡＡＶカセットが、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ショート３’ＵＴＲ、またはＢＤＮＦロング３’ＵＴＲを含む、実施形態１～２９のいずれか一つの核酸。
実施形態３１．
ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲ、またはＢＤＮＦロング３’ＵＴＲが、レット症候群関連遺伝子と３’ＩＴＲの間に位置する、実施形態３０の核酸。
実施形態３２．
ＡＡＶカセットが、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲを含む、実施形態３０または実施形態３１の核酸。
実施形態３３．
ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲが、配列番号８の核酸配列、または配列番号８の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態３２の核酸。
実施形態３４．
ＡＡＶカセットが、ＢＤＮＦロング３’ＵＴＲを含む、実施形態３０または実施形態３１の核酸。
実施形態３５．
ＢＤＮＦロング３’ＵＴＲが、配列番号１０の核酸配列、または配列番号１０の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態３４の核酸。
実施形態３６．
ＡＡＶカセットが、ポリアデニル化シグナルを含む、実施形態１～３５のいずれか一つの核酸。
実施形態３７．
ポリアデニル化シグナルが、以下の遺伝子：サルウイルス４０（ＳＶ４０）、ｒＢＧ、α－グロビン、β－グロビン、ヒトコラーゲン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ポリオーマウイルス、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）の一つまたは複数から単離されるか、またはもたらされるポリアデニル化シグナルである、実施形態３６の核酸。
実施形態３８．
ＡＡＶカセットが、ｂＧＨポリアデニル化シグナルを含む、実施形態３６の核酸。
実施形態３９．
ｂＧＨポリアデニル化シグナルが、配列番号９の核酸配列、または配列番号９の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態３８の核酸。
実施形態４０．
ＡＡＶカセットが、少なくとも一つのスタッファー配列を含む、実施形態１～３９のいずれか一つの核酸。
実施形態４１．
少なくとも一つのスタッファー配列が、配列番号１３の核酸配列、または配列番号１３の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態４０の核酸。
実施形態４２．
ＡＡＶ発現カセットが、コザック配列を含み、コザック配列が、レット症候群関連遺伝子の開始コドンと重複する、実施形態１～４１のいずれか一つの核酸。
実施形態４３．
コザック配列が、配列番号１４の核酸配列、もしくは配列番号１４の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列、または配列番号１５の核酸配列、もしくは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態４２の核酸。
実施形態４４．
ＡＡＶ発現カセットが、配列番号３の核酸配列、もしくは配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列、配列番号４の配列もしくは配列番号４の配列と少なくとも９０％同一の配列、または配列番号５の配列もしくは配列番号５の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態１～４３のいずれか一つの核酸。
実施形態４５．
実施形態１～４４のいずれか一つの核酸を含む、プラスミド。
実施形態４６．
実施形態１～４４のいずれか一つの核酸または実施形態４５のプラスミドを含む、細胞。
実施形態４７．
組み換えＡＡＶベクターを産生する方法であって、ＡＡＶ産生細胞を、実施形態１～４４のいずれか一つの核酸、または実施形態４５のプラスミドを接触させることを含む、方法。
実施形態４８．
実施形態４７の方法により産生される、組み換えＡＡＶベクター。
実施形態４９．
ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶおよびウシＡＡＶから選択される血清型のものである、実施形態４８の組み換えＡＡＶベクター。
実施形態５０．
組み換えＡＡＶベクターが、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である、実施形態４８または実施形態４９の組み換えＡＡＶベクター。
実施形態５１．
組み換えＡＡＶベクターが、自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、実施形態４８～５０のいずれか一つの組み換えＡＡＶベクター。
実施形態５２．
ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶまたはウシＡＡＶのカプシドタンパク質を含む、実施形態４８～５１のいずれか一つの組み換えＡＡＶベクター。
実施形態５３．
ＡＡＶベクターが、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、１個または複数の置換または変異を有するカプシドタンパク質を含む、実施形態４８～５２のいずれか一つの組み換えＡＡＶベクター。
実施形態５４．
（ａ）実施形態１～４４のいずれか一つの核酸、実施形態４５のプラスミド、実施形態４６の細胞、または実施形態４８～５３のいずれか一つの組み換えＡＡＶベクター、ならびに（ｂ）医薬的に許容可能な担体を含む、組成物。
実施形態５５．
対象に、治療上有効量の、実施形態１～４４のいずれか一つの核酸、実施形態４５のプラスミド、実施形態４６の細胞、実施形態４８～５３のいずれか一つの組み換えＡＡＶベクター、または実施形態５４の組成物を投与することを含む、それを必要とする対象においてレット症候群関連遺伝子を発現させる方法。
実施形態５６．
対象が、レット症候群を有する、実施形態５５の方法。
実施形態５７．
対象に、治療上有効量の、実施形態１～４４のいずれか一つの核酸、実施形態４５のプラスミド、実施形態４６の細胞、実施形態４８～５３のいずれか一つの組み換えＡＡＶベクター、または実施形態５４の組成物を投与することを含む、対象におけるレット症候群を治療するか、またはレット症候群の発症を遅延させる方法。
実施形態５８．
対象に、治療上有効量の、実施形態１～４４のいずれか一つの核酸、実施形態４５のプラスミド、実施形態４６の細胞、実施形態４８～５３のいずれか一つの組み換えＡＡＶベクター、または実施形態５４の組成物を投与することを含む、それを必要とする対象において脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を発現させる方法。
実施形態５９．
対象が、認知障害、またはストレス関連障害を有する、実施形態５８の方法。
実施形態６０．
対象が、うつ病、強迫障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、ならびに認知症、神経性無食欲症および神経性過食症、統合失調症、てんかん、外傷後ストレス障害、肥満、レット症候群、または化学療法後認知障害を有する、実施形態５８の方法。
実施形態６１．
対象に、治療上有効量の、実施形態１～４４のいずれか一つの核酸、実施形態４５のプラスミド、実施形態４６の細胞、実施形態４８～５３のいずれか一つの組み換えＡＡＶベクター、または実施形態５４の組成物を投与することを含む、対象におけるＢＤＮＦ関連疾患を治療するか、またはＢＤＮＦ関連疾患の発症を遅延させる方法。
実施形態６２．
ＢＤＮＦ関連疾患が、認知障害、および／またはストレス関連障害である、実施形態６１の方法。
実施形態６３．
ＢＤＮＦ関連疾患が、うつ病、強迫障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、および認知症、神経性無食欲症、神経性過食症、統合失調症、てんかん、外傷後ストレス障害、双極性疾患、レット症候群、大うつ病性障害、または化学療法後認知障害である、実施形態６１の方法。
実施形態６４．
対象に、治療上有効量の実施形態１～４４のいずれか一つの核酸、実施形態４５のプラスミド、実施形態４６の細胞、実施形態４８～５３のいずれか一つの組み換えＡＡＶベクター、または実施形態５４の組成物を投与することを含む、対象におけるＭＥＣＰ２関連疾患を治療するか、またはＭＥＣＰ２関連疾患の発症を遅延させる方法。
実施形態６５．
ＭＥＣＰ２関連疾患が、ＭＥＣＰ２重複症候群、ＭＥＣＰ２関連重症新生児脳症、ＰＰＭ－Ｘ症候群、またはレット症候群である、実施形態６４の方法。
実施形態６６．
対象が、ヒト対象である、実施形態５５～６５のいずれか一つの方法。
実施形態６７．
核酸、プラスミド、細胞、組み換えＡＡＶベクター、または組成物が、中枢神経系への注射により投与される、実施形態５５～６６のいずれか一つの方法。
実施形態６８．
レット症候群関連遺伝子が、対象のニューロンにおいて発現される、実施形態５５～６７のいずれか一つの方法。
実施形態６９．
ニューロンが、活性ニューロンである、実施形態６８の方法。

Claims (69)

1. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットを含む核酸であって、前記ＡＡＶ発現カセットが、５’から３’の方向に、
   ５’末端逆位配列（ＩＴＲ）；
   合成活性依存性プロモーター；
   レット症候群関連遺伝子；および
   ３’ＩＴＲを含む、核酸。
2. 前記プロモーターが、前記レット症候群関連遺伝子の発現をもたらす、請求項１に記載の核酸。
3. 前記プロモーターが、ＭＥＣＰ２独立性プロモーターである、請求項１または２に記載の核酸。
4. 前記プロモーターが、ニューロンの即時型遺伝子のプロモーターに由来する核酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の記載の核酸。
5. 前記ニューロンの即時型遺伝子が、Ａｒｃ遺伝子、ｃ－ｆｏｓ遺伝子、およびｅｇｒ－１遺伝子からなる群から選択される、請求項４に記載の核酸。
6. 前記プロモーターが、最小のＡｒｃ遺伝子プロモーター（ＡｒｃＭｉｎ）を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸。
7. 前記ＡｒｃＭｉｎが、ヒトＡｒｃＭｉｎ（ｈＡｒｃＭｉｎ）である、請求項６に記載の核酸。
8. 前記ｈＡｒｃＭｉｎが、配列番号１２の核酸配列、または配列番号１２の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項７に記載の核酸。
9. 前記プロモーターが、環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ）、シナプス活性応答エレメント（ＳＡＲＥ）、ＭＥＦ２応答エレメント、またはその組み合わせを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸。
10. 前記プロモーターが、シナプス活性応答エレメント（ＳＡＲＥ）を含む、請求項９に記載の核酸。
11. 前記シナプス活性応答エレメント（ＳＡＲＥ）が、ヒトシナプス活性応答エレメント（ｈＳＡＲＥ）である、請求項１０に記載の核酸。
12. 前記ｈＳＡＲＥが、配列番号１１の核酸配列、または配列番号１１の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１１に記載の核酸。
13. 前記プロモーターが、ヒトＡｒｃＭｉｎ（ｈＡｒｃＭｉｎ）および少なくとも一つのｈＳＡＲＥを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸。
14. 前記プロモーターが、ｈＡｒｃＭｉｎおよび一つのｈＳＡＲＥを含む、請求項１３に記載の核酸。
15. 前記プロモーターが、配列番号６の核酸配列、または配列番号６の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１４に記載の核酸。
16. 前記プロモーターが、ｈＡｒｃＭｉｎおよび五つのｈＳＡＲＥを含む、請求項１３に記載の核酸。
17. 前記プロモーターが、配列番号１６の核酸配列、または配列番号１６の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１６に記載の核酸。
18. 前記プロモーターが、ニューロンの活性依存性転写因子に結合する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の核酸。
19. 前記ニューロンの活性依存性転写因子が、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）、筋細胞エンハンサー因子２（ＭＥＦ２）、血清応答因子（ＳＲＦ）、またはＥｌｋ－１である、請求項１８に記載の核酸。
20. 前記レット症候群関連遺伝子が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）、ハンチンチンタンパク質、ハンチントン関連タンパク質１、オルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ－２）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子１（ＦＸＹＤ１）、ニューレキシン－２－アルファ（ＮＲＸＮ２）、またはタンパク質キナーゼＣガンマ（ＰＲＫＣＧ）をコードする、請求項１～１９のいずれか一項に記載の核酸。
21. 前記レット症候群関連遺伝子が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードする、請求項２０に記載の核酸。
22. 前記ＢＤＮＦが、ヒトＢＤＮＦである、請求項２１に記載の核酸。
23. 前記ＢＤＮＦが、配列番号７の核酸配列、または配列番号７の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列によりコードされる、請求項２２に記載の核酸。
24. 前記５’ＩＴＲおよび前記３’ＩＴＲの少なくとも一つが、約１１０～約１６０ヌクレオチド長である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の核酸。
25. 前記５’ＩＴＲが、前記３’ＩＴＲと同じ長さである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の核酸。
26. 前記５’ＩＴＲおよび前記３’ＩＴＲが、異なる長さを有する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の核酸。
27. 前記５’ＩＴＲおよび前記３’ＩＴＲの少なくとも一つが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶまたはウシＡＡＶのゲノムから単離されるか、またはもたらされる、請求項１～２６のいずれか一項に記載の核酸。
28. 前記５’ＩＴＲが、配列番号１の配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の核酸。
29. 前記３’ＩＴＲが、配列番号２の配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の核酸。
30. 前記ＡＡＶカセットが、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ショート３’ＵＴＲ、またはＢＤＮＦロング３’ＵＴＲを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の核酸。
31. 前記ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲ、または前記ＢＤＮＦロング３’ＵＴＲが、前記レット症候群関連遺伝子と前記３’ＩＴＲの間に位置する、請求項３０に記載の核酸。
32. 前記ＡＡＶカセットが、ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲを含む、請求項３０または請求項３１に記載の核酸。
33. 前記ＢＤＮＦショート３’ＵＴＲが、配列番号８の核酸配列、または配列番号８の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３２に記載の核酸。
34. 前記ＡＡＶカセットが、ＢＤＮＦロング３’ＵＴＲを含む、請求項３０または請求項３１に記載の核酸。
35. 前記ＢＤＮＦロング３’ＵＴＲが、配列番号１０の核酸配列、または配列番号１０の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３４に記載の核酸。
36. 前記ＡＡＶカセットが、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の核酸。
37. 前記ポリアデニル化シグナルが、以下の遺伝子：サルウイルス４０（ＳＶ４０）、ｒＢＧ、α－グロビン、β－グロビン、ヒトコラーゲン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ポリオーマウイルス、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）の一つまたは複数から単離されるか、またはもたらされるポリアデニル化シグナルである、請求項３６に記載の核酸。
38. 前記ＡＡＶカセットが、ｂＧＨポリアデニル化シグナルを含む、請求項３６に記載の核酸。
39. 前記ｂＧＨポリアデニル化シグナルが、配列番号９の核酸配列、または配列番号９の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３８に記載の核酸。
40. 前記ＡＡＶカセットが、少なくとも一つのスタッファー配列を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の核酸。
41. 前記少なくとも一つのスタッファー配列が、配列番号１３の核酸配列、または配列番号１３の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項４０に記載の核酸。
42. 前記ＡＡＶ発現カセットが、コザック配列を含み、前記コザック配列が、前記レット症候群関連遺伝子の開始コドンと重複する、請求項１～４１のいずれか一項に記載の核酸。
43. 前記コザック配列が、配列番号１４の核酸配列、もしくは配列番号１４の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列、または配列番号１５の核酸配列、もしくは配列番号１５の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項４２に記載の核酸。
44. 前記ＡＡＶ発現カセットが、配列番号３の核酸配列、もしくは配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列、配列番号４の核酸配列もしくは配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列、または配列番号５の核酸配列もしくは配列番号５の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の核酸。
45. 請求項１～４４のいずれか一項に記載の核酸を含む、プラスミド。
46. 請求項１～４４のいずれか一項に記載の核酸または請求項４５に記載のプラスミドを含む、細胞。
47. 組み換えＡＡＶベクターを産生する方法であって、ＡＡＶ産生細胞を、請求項１～４４のいずれか一項に記載の核酸または請求項４５に記載のプラスミドと接触させることを含む、方法。
48. 請求項４７に記載の方法により産生される、組み換えＡＡＶベクター。
49. 前記ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶおよびウシＡＡＶから選択される血清型のものである、請求項４８に記載の組み換えＡＡＶベクター。
50. 前記組み換えＡＡＶベクターが、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である、請求項４８または請求項４９に記載の組み換えＡＡＶベクター。
51. 前記組み換えＡＡＶベクターが、自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶベクター。
52. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶまたはウシＡＡＶのカプシドタンパク質を含む、請求項４８～５１のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶベクター。
53. 前記ＡＡＶベクターが、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、一個または複数の置換または変異を有するカプシドタンパク質を含む、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶベクター。
54. （ａ）請求項１～４４のいずれか一項に記載の核酸、請求項４５に記載のプラスミド、請求項４６に記載の細胞、または請求項４８～５３のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶベクター、および（ｂ）医薬的に許容可能な担体を含む、組成物。
55. それを必要とする対象においてレット症候群関連遺伝子を発現させる方法であって、前記対象に、治療上有効量の請求項１～４４のいずれか一項に記載の核酸、請求項４５に記載のプラスミド、請求項４６に記載の細胞、請求項４８～５３のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶベクター、または請求項５４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
56. 前記対象が、レット症候群を有する、請求項５５に記載の方法。
57. 対象におけるレット症候群を治療するか、またはレット症候群の発症を遅延させる方法であって、前記対象に、治療上有効量の請求項１～４４のいずれか一項に記載の核酸、請求項４５に記載のプラスミド、請求項４６に記載の細胞、請求項４８～５３のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶベクター、または請求項５４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
58. それを必要とする対象において脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を発現させる方法であって、前記対象に、治療上有効量の請求項１～４４のいずれか一項に記載の核酸、請求項４５に記載のプラスミド、請求項４６に記載の細胞、請求項４８～５３のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶベクター、または請求項５４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
59. 前記対象が、認知障害、またはストレス関連障害を有する、請求項５８に記載の方法。
60. 前記対象が、うつ病、強迫障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、ならびに認知症、神経性無食欲症および神経性過食症、統合失調症、てんかん、外傷後ストレス障害、肥満、レット症候群、または化学療法後認知障害を有する、請求項５８に記載の方法。
61. 対象におけるＢＤＮＦ関連疾患を治療するか、またはＢＤＮＦ関連疾患の発症を遅延させる方法であって、前記対象に、治療上有効量の請求項１～４４のいずれか一項に記載の核酸、請求項４５に記載のプラスミド、請求項４６に記載の細胞、請求項４８～５３のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶベクター、または請求項５４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
62. 前記ＢＤＮＦ関連疾患が、認知障害、および／またはストレス関連障害である、請求項６１に記載の方法。
63. 前記ＢＤＮＦ関連疾患が、うつ病、強迫障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、および認知症、神経性無食欲症、神経性過食症、統合失調症、てんかん、外傷後ストレス障害、双極性疾患、レット症候群、大うつ病性障害、または化学療法後認知障害である、請求項６１に記載の方法。
64. 対象におけるＭＥＣＰ２関連疾患を治療するか、またはＭＥＣＰ２関連疾患の発症を遅延させる方法であって、前記対象に、治療上有効量の請求項１～４４のいずれか一項に記載の核酸、請求項４５に記載のプラスミド、請求項４６に記載の細胞、請求項４８～５３のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶベクター、または請求項５４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
65. 前記ＭＥＣＰ２関連疾患が、ＭＥＣＰ２重複症候群、ＭＥＣＰ２関連重症新生児脳症、ＰＰＭ－Ｘ症候群、またはレット症候群である、請求項６４に記載の方法。
66. 前記対象が、ヒト対象である、請求項５５～６５のいずれか一項に記載の方法。
67. 前記核酸、前記プラスミド、前記細胞、前記組み換えＡＡＶベクター、または組成物が、中枢神経系への注射により投与される、請求項５５～６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 前記レット症候群関連遺伝子が、前記対象のニューロンにおいて発現される、請求項５５～６７のいずれか一項に記載の方法。
69. 前記ニューロンが、活性ニューロンである、請求項６８に記載の方法。