JP2020519629A - ムコ多糖症ｉｉｉａ型（ｍｐｓ ｉｉｉａ）を処置するための、スルファミダーゼ（ｓｇｓｈ）バリアント、ベクター、組成物並びに方法及び使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）及びＳＧＳＨバリアントに関する。ＳＧＳＨ及びＳＧＳＨバリアントは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子によって、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達され、脳脊髄液（ＣＳＦ）に接触するＣＮＳ細胞に形質導入することができる。ＳＧＳＨ及びＳＧＳＨバリアント投与の標的哺乳動物は、ＳＧＳＨの発現又は機能が欠乏又は欠損した哺乳動物を含む。【選択図】 図１３

Description

[導入]
[0002]ムコ多糖症ＩＩＩＡ型（ＭＰＳ ＩＩＩＡ）は、スルファミダーゼの欠乏によって引き起こされるリソソーム蓄積症である。スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）の変異によって引き起こされるＭＰＳ ＩＩＩＡは、社会能力の喪失並びに攻撃的行動、活動亢進、及び睡眠障害を伴う進行性の神経変性を特徴とする。身体的特徴は、軽度及び可変的であることが多い。リソソーム蓄積症の脳病理を修正するため、本発明者らのグループと他の研究者らは、欠如している酵素をコードする遺伝子の脳への導入に成功した。この遺伝子治療方法の基礎は、リソソーム酵素の効率的な分泌にある。酵素が遺伝子修正細胞から効果的に分泌された後、近くの細胞によって取り込まれ、クロスコレクションをもたらす可能性がある。

[0003]本明細書に開示したように、改変スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）は分泌及び取り込みが改善され、ＭＰＳ ＩＩＩＡ処置により高い治療効果をもたらす。ＳＧＳＨの５つの異なるマンノース−６−リン酸化（Ｍ６Ｐ）部位の変異の効果が評価された。分泌の効率は変動的であり、改変は形質導入又はトランスフェクトした細胞からの分泌に影響した。１つの特定のＭ６Ｐ部位の改変、Ｎ２６４Ｑは、ＳＧＳＨ分泌のレベルの上昇をもたらした。

[0004]さらなる研究は、ＳＧＳＨ Ｍ６Ｐ部位の改変がいくつかのさらなる有益な特質を与えることを示した。第１に、改変は酵素分泌を増加させただけでなく、細胞での酵素蓄積も減少させ、蓄積があった場合、二次的なリソソーム機能障害を与える可能性があった。第２に、このＳＧＳＨバリアントは、細胞で正確にプロセシングされ、リソソームで活性型に成熟した。第３に、驚くべきことにこのＳＧＳＨバリアントは、おそらく正常な、非改変ＳＧＳＨに使用されるものと異なる受容体を使用することによって、細胞によってより効率的に取り込まれるようである。結果として、この改変ＳＧＳＨは、ＭＰＳ ＩＩＩＡ患者の遺伝子治療又は酵素置換治療において野生型ＳＧＳＨよりも優れていると期待される。本明細書で開示したＭＰＳ ＩＩＩＡ動物モデル研究において、この改変ＳＧＳＨは、おそらく特質、又はより多くの特質のために、ＭＰＳ ＩＩＩＡ動物における認知効果及び／又は認知障害の低減の提供に関して野生型ＳＧＳＨより優れていた。

[0005]本発明により、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）を哺乳動物の中枢神経系に送達する方法を提供する。一実施形態では、方法は、哺乳動物において細胞が、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）バリアントを発現及び分泌するように、哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に接触する細胞に形質導入するのに効果的なスルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）バリアントをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）に投与するステップを含む。

[0006]本発明により、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）の発現又は機能の欠乏又は欠損によって引き起こされる哺乳動物の疾患を処置する方法を提供する。一実施形態では、方法は、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）に接触する細胞に形質導入するのに効果的な形で、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）バリアントをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を、哺乳動物のＣＮＳに投与するステップを含み、疾患を処置するために細胞がスルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）バリアントを発現及び分泌する。

[0007]本発明により、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）を哺乳動物の中枢神経系に送達する方法を提供する。一実施形態では、方法は、哺乳動物において細胞が、ＳＧＳＨバリアントを発現及び分泌するように、脳実質細胞又は哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に接触する細胞に形質導入するのに効果的な形で、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）バリアントをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を、哺乳動物の脳実質組織、クモ膜下腔、及び／又は髄腔内に投与するステップを含む。

[0008]本発明により、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）の発現又は機能の欠乏又は欠損によって引き起こされる哺乳動物の疾患を処置する方法を提供する。一実施形態では、方法は、脳実質細胞又は哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に接触する細胞に形質導入するのに効果的な形で、一対のＡＡＶ逆位末端反復配列の間に挿入されたスルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）バリアントをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を、哺乳動物の脳実質組織、クモ膜下腔、及び／又は髄腔内に投与するステップを含み、疾患を処置するために、細胞がＳＧＳＨバリアントを発現及び分泌する。

[0009]本発明の方法では、投与及び送達は、脳室に対してであってもよい。本発明の方法では、ｒＡＡＶ粒子の投与又は送達は、哺乳動物の脳室、クモ膜下腔、及び／又は随腔内に対してであってもよい。本発明の方法では、投与又は送達は、側脳室に対してであってもよい。本発明の方法では、投与又は送達は、脳室上皮細胞、軟膜細胞、内皮細胞、脳室細胞、髄膜細胞、グリア細胞及び／又はニューロンに対してであってもよい。

[0010]本発明の方法では、ｒＡＡＶが投与又は送達される細胞は、前記哺乳動物のＣＮＳにＳＧＳＨバリアントを分泌する。本発明の方法では、ｒＡＡＶが投与又は送達される細胞は、前記哺乳動物のＣＳＦにＳＧＳＨバリアントを分泌する。

[0011]本発明の方法では、脳室上皮細胞、軟膜、内皮、脳室、髄膜、グリア細胞及び／若しくはニューロンは、ＳＧＳＨバリアントを発現し、並びに／又は脳室上皮、軟膜、内皮、脳室、髄膜細胞、グリア細胞及び／若しくはニューロンはＣＳＦにＳＧＳＨバリアントを分泌する。

[0012]本発明の方法では、ｒＡＡＶ粒子又は粒子は、一対のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間にスルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）バリアントをコードする核酸が挿入されたＡＡＶカプシドタンパク質及びベクターゲノムを含む。

[0013]本発明の方法では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ｒｈ７４、ＡＡＶ−ｒｈ１０及びＡＡＶ−２ｉ８ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドタンパク質、又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ｒｈ７４、ＡＡＶ−Ｒｈ１０若しくはＡＡＶ−２ｉ８ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシド配列と７０％若しくはそれ以上の同一性を有するカプシド配列に由来する、又はからなる群から選択されてもよい。

[0014]本発明の方法では、ＡＡＶ ＩＴＲの対の１つ又は複数は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ｒｈ７４、ＡＡＶ−ｒｈ１０若しくはＡＡＶ−２ｉ８ ＩＴＲ、又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ｒｈ７４、ＡＡＶ−Ｒｈ１０若しくはＡＡＶ−２ｉ８ ＩＴＲ配列と７０％若しくはそれ以上の同一性を有するＩＴＲに由来する、を含む又はからなってもよい。

[0015]本発明の方法では、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）バリアントをコードする核酸は、核酸の発現をモジュレートする発現調節エレメントをさらに含む。ある特定の実施形態では、発現調節エレメントはプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、発現調節エレメントはエンハンサーエレメントを含む。

[0016]特定の実施形態では、発現調節エレメントは、ＣＭＶエンハンサー、チキンベータアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター及び／又は配列番号２に示されるＣＭＶエンハンサーと８０％若しくはそれ以上の同一性を有する配列及び／又は配列番号３に示されるＣＡＧプロモーターと８０％若しくはそれ以上の同一性を有する配列を含む。

[0017]本発明の方法では、核酸は、イントロン、フィラーポリヌクレオチド配列及び／若しくはポリＡシグナルのうちの１つ若しくは複数、又はそれらの組合せをさらに含んでもよい。

[0018]ある特定の実施形態では、複数のｒＡＡＶ粒子が対象に投与又は送達される。

[0019]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は約１×１０^６〜約１×１０^１８ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。

[0020]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物１キログラムあたり約１×１０^７〜１×１０^１７、約１×１０^８〜１×１０^１６、約１×１０^９〜１×１０^１５、約１×１０^１０〜１×１０^１４、約１×１０^１０〜１×１０^１３、約１×１０^１０〜１×１０^１３、約１×１０^１０〜１×１０^１１、約１×１０^１１〜１×１０^１２、約１×１０^１２〜１×１０^１３、又は約１×１０^１３〜１×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与される。

[0021]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、１×１０^６〜１×１０^１６ｖｇ／ｍｌの約０．５〜４ｍｌの用量で投与される。

[0022]ある特定の実施形態では、本発明の方法は、複数のＡＡＶ空カプシドを投与するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、投与のためのＡＡＶ空カプシドと共に製剤化される。

[0023]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ空カプシドは、１．０〜１００倍過剰量のｒＡＡＶベクター粒子と共に投与される、又は製剤化される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ空カプシドは、ｒＡＡＶ粒子に対して約１．０〜１００倍過剰量のＡＡＶ空カプシドと共に投与される、又は製剤化される。

[0024]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ空カプシドと共に製剤化されたｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物への投与又は送達に適している。

[0025]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ空カプシドは、哺乳動物への投与又は送達用に製剤化されている。

[0026]ある特定の実施形態では、投与又は送達は、脳室内注射及び／又は実質組織内注射を含む。

[0027]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、脳の単一箇所に注射される。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、脳の１〜５箇所に注射される。

[0028]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、吻側側脳室；及び／又は尾側側脳室；及び／又は右側脳室；及び／又は左側脳室；及び／又は右吻側側脳室；及び／又は左吻側側脳室；及び／又は右尾側側脳室；及び／又は左尾側側脳室に投与される。

[0029]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の大槽、脳室内腔、脳室、クモ膜下腔、髄腔内、及び／又は脳室上皮のいずれかに単回又は多回用量で投与される。

[0030]ある特定の実施形態では、方法は、ＣＮＳに対してＳＧＳＨバリアントの発現又はＳＧＳＨの機能の増加をもたらす。ある特定の実施形態では、方法は、正常なＳＧＳＨの発現の約５〜５０％の間までＳＧＳＨバリアントの発現を増加させる。ある特定の実施形態では、方法は、正常なＳＧＳＨの発現の５０％より高くまでＳＧＳＨバリアントの発現を増加させる。

[0031]ある特定の実施形態では、方法は、前記哺乳動物における内在性ＳＧＳＨの欠損又は欠乏による認知障害又は欠損を阻害、減少、又は低減する。

[0032]ある特定の実施形態では、方法は、前記哺乳動物における内在性ＳＧＳＨの欠損又は欠乏による認知機能喪失又は空間学習喪失を増加、改善、保存、回復、又は救出する。

[0033]ある特定の実施形態では、方法は、哺乳動物の記憶障害又は欠損を増加、改善、保存、回復、又は救出する。

[0034]ある特定の実施形態では、方法は、ニューロンの機能又は生存を増加、保存、回復、又は救出する。

[0035]ある特定の実施形態では、方法は、皮質ニューロンの機能又は生存を増加、保存、回復、又は救出する。

[0036]ある特定の実施形態では、方法は、皮質運動ニューロンの機能又は生存を増加、保存、回復、又は救出する。

[0037]ある特定の実施形態では、方法は、ニューロンの変性又は死を阻害、減少、又は防止する。

[0038]ある特定の実施形態では、方法は、皮質ニューロンの変性又は死を阻害、減少、又は防止する。

[0039]ある特定の実施形態では、方法は、皮質運動ニューロンの変性又は死を阻害、減少、又は防止する。

[0040]ある特定の実施形態では、方法は、ＳＧＳＨ欠損又は欠乏の症状又は有害作用を改善、低減、又は減少する。

[0041]ある特定の実施形態では、方法は、ＳＧＳＨ欠損又は欠乏の症状又は有害作用を安定化、その悪化を防止する、又は好転させる。

[0042]ある特定の実施形態では、症状又は有害作用は、初期若しくは後期の症状；行動、人格、若しくは言語症状；運動機能症状；及び／又は認知症状である。

[0043]ある特定の実施形態では、方法により、形質導入細胞によるＳＧＳＨバリアントの分泌が、配列番号１として示される非バリアントＳＧＳＨの分泌と比較して高くなる。

[0044]ある特定の実施形態では、方法により、非形質導入細胞によるＳＧＳＨバリアントの取り込みが、配列番号１として示される非バリアントＳＧＳＨの取り込みと比較して高くなる。

[0045]ある特定の実施形態では、方法は、細胞における二次酵素（例えば、ベータグルクロニダーゼ）の産生又は蓄積を阻害又は減少する。

[0046]哺乳動物を含む発明の対象。一実施形態では、哺乳動物は非げっ歯類哺乳動物である。別の実施形態では、哺乳動物は霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、又はイヌである。別の実施形態では、哺乳動物は霊長類である。

[0047]別の実施形態では、霊長類はヒトである。一態様では、ヒトは小児である。特定の態様では、小児は約１歳〜約８歳である。

[0048]発明の対象は、内在性ＳＧＳＨの発現又は機能の喪失又は低減を示す哺乳動物、例えば霊長類及びヒトを含む。

[0049]発明の対象は、喪失又は低減したＳＧＳＨの発現又は機能に関して、ホモ接合体（Ｓｇｓｈ^−／−）又はヘテロ接合体（Ｓｇｓｈ^＋／−）である、哺乳動物、例えば霊長類及びヒトを含む。

[0050]発明の方法は、ＳＧＳＨの発現又は機能の欠乏又は欠損によって又はそれと関連して引き起こされた任意の疾患又は障害の処置を含む。

[0051]ある特定の実施形態では、方法は、１つ又は複数の免疫抑制剤を投与するステップを含む。特定の実施形態では、免疫抑制剤は、前記ｒＡＡＶ粒子の投与又は送達の前、又はそれと同時に投与される。

[0052]ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は抗炎症剤である。

[0053]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは哺乳動物である。特定の態様では、ＳＧＳＨバリアントは霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、又はイヌＳＧＳＨである。

[0054]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントはヒトである。

[0055]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントの形質導入細胞による分泌は、配列番号１として示される非バリアントＳＧＳＨと比較して高くなることを示す。

[0056]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントの細胞による取り込みは、配列番号１として示される非バリアントＳＧＳＨの取り込みと比較して増加することを示す。

[0057]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントの細胞による取り込みは、マンノース−６−リン酸受容体を必要としない。

[0058]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは、ＣＮＳにおける非形質導入細胞に分配される。

[0059]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは、脳脊髄液（ＣＳＦ）によって非形質導入ＣＮＳ細胞に分配される。

[0060]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは、形質導入細胞と離れて位置する非形質導入ＣＮＳ細胞に分配される。

[0061]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨは、前記ＣＮＳ細胞によって取り込まれる。

[0062]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは配列番号１と少なくとも９０％同一である。

[0063]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは配列番号１のバリアントを含む。

[0064]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは、２６４位にアミノ酸置換を有する配列番号１と少なくとも９０％同一である。

[0065]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは、２６４位にアスパラギン（Ｎ）からグルタミン（Ｑ）への置換を有する配列番号１と少なくとも９０％同一である。

[0066]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは、２６４位にアミノ酸置換を有する配列番号１を含む。

[0067]ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは、２６４位にアスパラギン（Ｎ）からグルタミン（Ｑ）への置換を有する配列番号１を含む。

ＬＳＤ治療のためのＡＡＶ送達手法を示す図である。脳実質組織及び脳脊髄液（ＣＳＦ）への注射。いくつかの血清型に関しては、下にある神経細胞へのＣＳＦ分布のための脳室上皮の有効な形質導入。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリソソーム酵素の分泌を評価するステップを示す図である。 天然のＳＧＳＨは十分に分泌されないことを示す図である。 ＳＧＳＨ Ｍ６Ｐの改変のリストを示す図である。 ＳＧＳＨのＭ６Ｐ部位の改変が分泌を改善することを示す図である。 ＳＧＳＨｖ４の特性（培地）を示す図である。 ＳＧＳＨｖ４の特性（細胞ライセート）を示す図である。 細胞ライセートにおけるＳＧＳＨの発現を示す図である。 ＳＧＳＨの発現の定量を示す図である。 勾配遠心分離後に単離されたＦ１、Ｆ２、Ｆ３及びＦ４画分におけるＳＧＳＨ及びＳＧＳＨｖ４タンパク質レベルを示す、（４回の生物学的な複製の）代表的なウェスタンブロットを示す図である。ＬＡＭＰ１、Ｂｉｐ、及びＧｒａｓｐ６５が使用され、それぞれリソソーム、ＥＲ、及びゴルジマーカーの富化を同定した。アスタリスク（^＊）は、非グリコシル化ＳＧＳＨを示し、矢印はグリコシル化ＳＧＳＨを示す；ＰＮＦは、核除去画分（post-nuclear fraction）。 ＳＧＳＨｖ４がＭ６ＰＲ非依存的に取り込まれることを示す図である。 ＳＧＳＨｖ４が取り込み後完全にプロセシングされることを示す図である（ＳＧＳＨ免疫組織学）。 ＳＧＳＨｖ４が取り込み後完全にプロセシングされることを示す図である（ＳＧＳＨ発現）。 ＭＰＳＩＩＩＡマウスにおけるＳＧＳＨｖ４遺伝子治療及びＡＡＶ４がマウス脳室上皮を標的化することを示す図である。 ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４が、モリス水迷路による疾患の読み出しに影響することを示す図である：アクイジションフェーズ。 ＳＧＳＨｖ４が、認知障害を改善することを示す図である（標的象限にいる時間）。 ＳＧＳＨｖ４が、認知障害を改善することを示す図である（標的象限で移動した距離）。 ＣＳＦにおけるＳＧＳＨ活性を示す図である。 脳におけるＳＧＳＨ活性を示す図である。 ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４が、ＣＳＦにおいてβ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕ）活性により二次酵素に影響することを示す図である。 脳におけるβ−ｇｌｕ活性を示す図である。 注射部位の対側で回収された組織からの実質組織におけるＧＡＧの定量を示す図である：海馬（ＨＰＣ）、線条体（Ｓｔｒ）、後頭皮質（ＯｃｃＣｘ）、及び小脳（Ｃｂ）。ｎ＝４〜６。データは、平均±ＳＤを示す。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１，^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ後、Ｔｕｋｅｙのポストホックテスト。 注射部位の片側半球から収集した切片におけるＧＦＡＰの免疫反応性によって測定したグリアのアストロサイト増加を示す図である。代表的な顕微鏡写真は、皮質（Ｃｘ）及び線条体（Ｓｔｒ）由来である；群あたりｎ＝３のマウス、３つの切片／マウス。スケールバー、１００μｍ。挿入画は、単離したＧＦＡＰ免疫反応性グリアを示す。 皮層（Ｃ）及び線条体（Ｄ）において、ＧＦＡＰ免疫反応性が陽性な総面積の画分の閾値画像解析測定を示す図である。データは、平均±ＳＥＭ、３匹のマウス／群、及び３つの切片／マウスを示す。各切片に関して、指定した皮層の３個の無作為の分野（１００μｍ×１００μｍ）及び線条体の１２個の無作為の分野（１００μｍ×１００μｍ）で解析が行われた。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１，^＊＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック検定。 皮層（Ｃ）及び線条体（Ｄ）において、ＧＦＡＰ免疫反応性が陽性な総面積の画分の閾値画像解析測定を示す図である。データは、平均±ＳＥＭ、３匹のマウス／群、及び３つの切片／マウスを示す。各切片に関して、指定した皮層の３個の無作為の分野（１００μｍ×１００μｍ）及び線条体の１２個の無作為の分野（１００μｍ×１００μｍ）で解析が行われた。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１，^＊＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック検定。

[0092]本明細書は、本明細書に記載の方法を必要とする、ＳＧＳＨの活性又は発現の増加により恩恵を受けるであろう哺乳動物、例えば、内在性ＳＧＳＨの発現又は機能の喪失又は低減を示す対象に投与するための方法及び使用を提供する。したがって、一実施形態では、哺乳動物において正常なＳＧＳＨと比較してＳＧＳＨの活性又は発現は低減し、又はＳＧＳＨは存在しない。特定の実施形態では、ＳＧＳＨを必要とする哺乳動物はＭＰＳ ＩＩＩＡを有する又は有するリスクがある。

[0093]ある特定の実施形態では、本明細書は、ＳＧＳＨの活性又は発現の欠乏又は欠損によって引き起こされる哺乳動物の疾患を、中枢神経系の組織又は体液に直接、ベクター、例えばＳＧＳＨの活性、任意選択で、ベクター形質導入細胞による野生型の分泌よりも高い分泌及び／又は非形質導入細胞による野生型ＳＧＳＨの取り込みよりも高い取り込みを示すＳＧＳＨバリアントを有するタンパク質の発現を導くｒＡＡＶ粒子（本明細書ではｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子と呼ばれる）を投与することによって処置する方法を提供する。本明細書は、動物モデルの脳及び／又は脊髄へのｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ送達／投与が、脳／ＣＮＳの様々な領域におけるＳＧＳＨの発現、形質導入細胞からのＳＧＳＨの分泌、及びＳＧＳＨの広範な分布、並びに細胞による取り込みを提供するのに効果的であることを示すデータを開示する。

[0094]さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法又は使用が使用され、ＳＧＳＨ欠乏の１つ又は複数の症状の数、重症度、頻度、進行度、又は発症を処置、防止、阻害、低減、減少、又は遅延する。

[0095]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は脳に投与される。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は前記哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与される。

[0096]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は脳室系に投与される。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は脳室に投与される。

[0097]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は脳実質組織、クモ膜下腔、及び／又は髄腔内に投与される。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は前記哺乳動物の大槽、脳室内腔、クモ膜下腔、髄腔内、及び／又は脳室上皮に投与される。

[0098]さらに別の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は吻側側脳室に投与され；及び／又は尾側側脳室に投与され；及び／又は右側脳室に投与され；及び／又は左側脳室に投与され；及び／又は右吻側側脳室に投与され；及び／又は左吻側側脳室に投与され；及び／又は右尾側側脳室に投与され；及び／又は左尾側側脳室に投与される。

[0099]さらに追加の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、前記哺乳動物の脳室上皮細胞などのＣＮＳ細胞にＡＡＶ粒子が接触及び形質導入するように投与される。そのような形質導入したＣＮＳ細胞（例えば脳室上皮細胞）はコードされたＳＧＳＨを発現し、ＳＧＳＨは細胞により分泌される。特定の実施形態では、ＳＧＳＨはＣＳＦ、及び／又は脳（例えば、線条体、視床、髄質、小脳、後頭皮質、前頭皮質、及び／又は前頭前野皮質、脊髄）、及び／又はＣＮＳで発現される。特定の実施形態では、ＳＧＳＨはＣＳＦ、脳（例えば、線条体、視床、髄質、小脳、後頭皮質、前頭皮質、及び／又は前頭前野皮質、脊髄）、及び／又はＣＮＳに分泌される。特定の実施形態では、ＳＧＳＨはＣＳＦ、脳（例えば、線条体、視床、髄質、小脳、後頭皮質、前頭皮質、及び／又は前頭前野皮質、脊髄）、及び／又はＣＮＳに分泌され、非形質導入ＣＮＳ細胞によって取り込まれる。

[0100]任意の好適な哺乳動物は、本明細書に記載の方法又は使用によって処置され得る。典型的には、哺乳動物は本明細書に記載の方法を必要としており、ＳＧＳＨの活性若しくは発現を欠乏若しくは欠損していると疑われる、又はしている。

[0101]哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オラウータン、サル、マカクなど）、飼育動物（例えば、イヌ及びネコ）、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、及び実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）が挙げられる。ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。ある特定の実施形態では、哺乳動物は非げっ歯類哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌなど）である。ある特定の実施形態では、非げっ歯類哺乳動物はヒトである。哺乳動物は、任意の年齢又は任意の発生段階であってもよい（例えば、大人、１０代、小児、乳児、又は子宮内の哺乳動物）。哺乳動物は、雄又は雌であってもよい。ある特定の実施形態では、哺乳動物は動物疾患モデル、例えば、ＳＧＳＨの発現又は機能の欠乏又は欠損の研究に使用される動物モデルであってもよい。

[0102]本明細書に記載の方法又は組成物によって処置した哺乳動物（対象）は大人（１８歳又はそれ以上）及び小児（１８歳より小さい）を含む。小児の年齢は、１〜２歳、又は２〜４、４〜６、６〜１８、８〜１０、１０〜１２、１２〜１５及び１５〜１８歳の範囲である。小児はまた、乳児も含む。乳児は、典型的には１〜１２カ月齢の範囲である。

[0103]ある特定の実施形態では、哺乳動物は、喪失又は低減したＳＧＳＨの発現又は機能に関して、ホモ接合体（Ｓｇｓｈ^−／−）である。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、喪失又は低減したＳＧＳＨの発現又は機能に関して、ヘテロ接合体（Ｓｇｓｈ^＋／−）である。

[0104]アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科の小型非病原性ウイルスである。現在までに、多くの血清学的に異なるＡＡＶが同定されており、ヒト又は霊長類から１ダースより多くが単離されている。ＡＡＶは、複製のヘルパーウイルスへの依存によってこの科の他のメンバーと異なる。

[0105]ＡＡＶゲノムは、宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれ；広宿主域を有し；分裂細胞と非分裂細胞の両方にｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで形質導入し、形質導入した遺伝子の高レベルの発現を維持することが示されている。ＡＡＶウイルス粒子は、熱安定性であり、溶媒、界面活性剤、ｐＨの変化、温度に耐性であり、ＣｓＣｌ勾配又は他の方法によってカラム精製及び／又は濃縮され得る。ＡＡＶゲノムは、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、プラス鎖又はマイナス鎖のいずれかを含む。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶは遺伝子座に特異的な形で、例えば第１９染色体のｑ腕に組み込まれ得る。ＡＡＶのおよそ５ｋｂのゲノムは、プラス又はマイナス極性のいずれかの一本鎖ＤＮＡの１つのセグメントからなる。ゲノムの末端は、ヘアピン構造に折りたたまれ、ウイルスＤＮＡ複製起点として働くことができる短い逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）である。

[0106]ＡＡＶ「ゲノム」は、最終的にパッケージング又はカプセル化されＡＡＶ粒子を形成する、組換え核酸配列を指す。ＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質とパッケージングされたＡＡＶゲノムを含むことが多い。組換えプラスミドを使用して組換えベクターを構築又は製造する場合、ベクターゲノムは組換えプラスミドのベクターゲノム配列に相当しない「プラスミド」の部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は「プラスミド骨格」と呼ばれ、プラスミドのクローニング及び増幅、増殖及び組換えウイルス産生に必要なプロセスに重要であるが、それ自体はウイルス（例えばＡＡＶ）粒子にパッケージング又はカプセル化されない。したがって、ベクター「ゲノム」は、ウイルスタンパク質によってパッケージング又はカプセル化される核酸を指し、ＡＡＶの場合にはカプシド又はカプシドタンパク質である。

[0107]ＡＡＶビリオン（粒子）は、直径およそ２５ｎｍの非エンベロープ、二十面体粒子である。ＡＡＶ粒子は互いに作用してカプシドを形成する、３つの関連カプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３から構成される二十面体対称を含む。右のＯＲＦがカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードすることが多い。これらのタンパク質は、それぞれ１：１：１０の比で見出されることが多いが、様々な比であってもよく、全て右側ＯＲＦ由来である。ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質は、選択的スプライシング及び独特の開始コドンの使用によって互いに異なる。欠失解析により、選択的にスプライシングされたメッセージから翻訳されるＶＰ１の除去又は変更は、感染性粒子の産生の低減をもたらすことが示されている。ＶＰ３コード領域内の変異は、任意の一本鎖子孫ＤＮＡ又は感染性粒子の産生の失敗をもたらす。

[0108]ＡＡＶ粒子はＡＡＶカプシドを含むウイルス粒子である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子のゲノムは、１つ、２つ、又は全てのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３ポリペプチドをコードする。

[0109]最も天然のＡＡＶのゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有することが多く、左のＯＲＦ及び右のＯＲＦと呼ばれることがある。左のＯＲＦは、一本鎖子孫ゲノムの産生に加えて複製及び転写の制御に関与する、非構造Ｒｅｐタンパク質、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８、及びＲｅｐ７８をコードすることが多い。２つのＲｅｐタンパク質は、ヒト第１９染色体のｑ腕の領域へのＡＡＶゲノムの優先的な組込みと関連している。Ｒｅｐ６８／７８は、ＮＴＰ結合活性並びにＤＮＡ及びＲＮＡヘリカーゼ活性を有することが示されている。いくつかのＲｅｐタンパク質は、核局在シグナル並びにいくつかの潜在的なリン酸化部位を有する。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ）のゲノムはいくつか又は全てのＲｅｐタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ）のゲノムはＲｅｐタンパク質をコードしない。ある特定の実施形態では、１つ又は複数のＲｅｐタンパク質はトランスで送達することができ、したがって、ポリペプチドをコードする核酸を含むＡＡＶ粒子に含まれない。

[0110]ＡＡＶゲノムの末端は、ウイルスＤＮＡ複製起点として働くＴ型ヘアピン構造へと折りたたむ能力を有する短い逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。したがって、ＡＡＶのゲノムは、一本鎖ウイルスＤＮＡゲノムに隣接する１つ又は複数の（例えば一対の）ＩＴＲ配列を含む。ＩＴＲ配列はそれぞれ約１４５塩基の長さを有することが多い。ＩＴＲ領域内に、ＩＴＲ、ＧＡＧＣ反復配列モチーフ及び末端分離部位（ｔｒｓ）の機能に中心的であると考えられる２つのエレメントが記載されている。反復配列モチーフは、ＩＴＲが線状又はヘアピン構造のいずれかである場合にＲｅｐに結合することが示されている。この結合は、切断のためＲｅｐ６８／７８をｔｒｓに配置し、部位及び鎖特異的な形で起こると考えられる。複製におけるそれらの役割に加えて、これらの２つのエレメントはウイルスの組込みに中心的であると考えられる。第１９染色体内に含有される組込み遺伝子座は、ｔｒｓと隣接するＲｅｐ結合部位である。これらのエレメントは遺伝子座特異的組込みに機能性及び必要であることが示されている。

[0111]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ）は２つのＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ）は一対のＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ）は、ＳＧＳＨの機能又は活性を有するポリペプチドを少なくともコードするポリヌクレオチドに隣接する（すなわち、各５’及び３’末端）一対のＩＴＲを含む。

[0112]用語「ベクター」は、核酸の挿入又は組込みによって操作され得る小さい担体核酸分子、プラスミド、ウイルス（例えばＡＡＶベクター）、又は他のビヒクルを指す。ポリヌクレオチドが細胞によって転写及び続いて翻訳されるように、ＡＡＶベクターなどのベクターを使用してポリヌクレオチドを細胞に導入／移送することができる。

[0113]「発現ベクター」は、宿主細胞での発現に必要な必須の制御領域を有する遺伝子又は核酸配列を含有する特殊なベクターである。ベクターの核酸配列は通常、細胞での増殖のための少なくとも１つの複製起点、及び異種ポリヌクレオチド配列、発現調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、ＩＴＲ（複数可）、ポリアデニル化シグナルなど任意選択でさらなるエレメントを含有する。

[0114]ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む１つ又は複数の核酸エレメントに由来する又は基づく。特定のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。

[0115]本明細書に開示したように、ベクター形質導入細胞によって発現される場合、野生型ＳＧＳＨよりも高い分泌を示すＳＧＳＨバリアントをコードする核酸配列を含むベクター（例えば、ＡＡＶ）を提供する。本明細書に開示したように、非形質導入細胞による野生型ＳＧＳＨ（例えば、配列番号１）よりも高い取り込みを示すＳＧＳＨバリアントをコードする核酸配列を含むベクター（例えば、ＡＡＶ）も提供する。本明細書は、ベクター形質導入細胞によって発現される場合、野生型ＳＧＳＨ（例えば、配列番号１）よりも高い分泌を示すＳＧＳＨバリアント、及び非形質導入細胞による野生型ＳＧＳＨ（例えば、配列番号１）よりも高い取り込みを示すＳＧＳＨバリアントをコードする核酸配列を含むベクター（例えば、ＡＡＶ）も提供する。

[0116]用語「組換え」は、組換えウイルス、例えばレンチウイルス又はパルボウイルス（例えばＡＡＶ）ベクターなどのベクターの修飾物、並びに組換えポリヌクレオチド及びポリペプチドなどの配列の修飾物として、組成物が天然では通常起こらない様式で操作されている（すなわち、工学的に操作された）ことを意味する。ＡＡＶベクターなどの組換えベクターの特定の例は、野生型ウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノムに通常存在しないポリヌクレオチドがウイルスゲノム内に挿入される場合である。組換えポリヌクレオチドの例は、５’、３’及び／若しくはイントロン領域あり又はなしで、ＳＧＳＨポリペプチドをコードする核酸（例えば遺伝子）がベクターにクローニングされる場合であり、遺伝子は通常ウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノムと関連する。用語「組換え」は、本明細書において常にウイルス及びＡＡＶベクターなどのベクター、並びにポリヌクレオチドなどの配列に関して使用されるわけではないが、ポリヌクレオチド、核酸、導入遺伝子等を含む「組換え」形態は、そのような省略にかかわらず明示的に含まれる。

[0117]組換えウイルス「ベクター」又は組換え「ＡＡＶベクター」は、ウイルス（例えばＡＡＶ）から野生型ゲノムを除去する分子的な方法の使用、及びＳＧＳＨコード核酸配列などの非天然核酸との置き換えによって、ＡＡＶなどのウイルスの野生型ゲノムに由来する。典型的には、ＡＡＶに関して、ＡＡＶゲノムの一方又は両方の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）配列がｒＡＡＶベクターに保持される。ＳＧＳＨコード核酸配列などのウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノムの核酸に関して、ウイルスゲノムの全て又は一部が非天然の配列と置き換えられているため、「組換え」ウイルスベクター（例えばｒＡＡＶ）はウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノムと区別される。したがって、非天然配列の組込みは、ウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を「組換え」ベクターと定義し、ＡＡＶの場合には「ｒＡＡＶベクター」と呼ばれ得る。

[0118]ＡＡＶベクター（例えばｒＡＡＶベクター）はパッケージングされてもよく、本明細書において、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで、細胞へのその後の感染（形質導入）のための「ＡＡＶ粒子」と呼ばれる。組換えＡＡＶベクターがＡＡＶ粒子にカプセル化又はパッケージングされる場合、粒子は「ｒＡＡＶ粒子」とも呼ばれ得る。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ粒子である。ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクター又はその部分を含むことが多い。ｒＡＡＶ粒子は１つ又は複数のｒＡＡＶ粒子（例えば複数のＡＡＶ粒子）であってもよい。ｒＡＡＶ粒子は、典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムをカプセル化又はパッケージングするタンパク質を含む（例えばカプシドタンパク質）。ｒＡＡＶベクターへの言及は、ｒＡＡＶ粒子の言及にも使用され得ることに留意されたい。

[0119]任意の好適なＡＡＶ粒子（例えばｒＡＡＶ粒子）は、本明細書の方法又は使用に使用され得る。ｒＡＡＶ粒子、及び／又はｒＡＡＶ粒子に含まれるゲノムは、任意の好適なＡＡＶの血清型又は株に由来し得る。ｒＡＡＶ粒子、及び／又はｒＡＡＶ粒子に含まれるゲノムは、２つ又はそれ以上のＡＡＶの血清型又は株に由来し得る。したがって、ｒＡＡＶは、任意のＡＡＶの血清型又は株のタンパク質及び／若しくは核酸、又はその部分を含むことができ、ＡＡＶ粒子は、哺乳動物細胞の感染及び／若しくは形質導入に好適である。ＡＡＶ血清型の非限定的な例としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ｒｈ７４、ＡＡＶ−ｒｈ１０、又はＡＡＶ−２ｉ８が挙げられる。

[0120]ある特定の実施形態では、複数のｒＡＡＶ粒子は、同じ株若しくは血清型（又はサブグループ若しくはバリアント）の、又は、それに由来する粒子を含む。ある特定の実施形態では、複数のｒＡＡＶ粒子は、２つ又はそれ以上の異なるｒＡＡＶ粒子の（例えば異なる血清型及び／又は株の）混合物を含む。

[0121]本明細書で使用する場合、用語「血清型」は、他のＡＡＶの血清型とは血清学的に異なるカプシドを有するＡＡＶを指すために使用される区別である。血清学的な区別性は、別のＡＡＶと比較した場合に、１つのＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。そのような交差反応性の違いは、通常カプシドタンパク質配列／抗原決定基の違いによる（例えばＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３の配列の違いによる）。カプシドバリアントを含むＡＡＶバリアントが、参照のＡＡＶ又は他のＡＡＶの血清型と血清学的に異なることはない可能性にもかかわらず、それらは、参照又は他のＡＡＶ血清型と比較して少なくとも１つのヌクレオチド又はアミノ酸残基が異なる。

[0122]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子はある特定の血清型を除外する。一実施形態では、ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ４粒子ではない。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は抗原的に又は免疫学的にＡＡＶ４と異なる。違いは標準的な方法で決定され得る。例えば、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットを使用して、ウイルス粒子が抗原的に又は免疫学的にＡＡＶ４と異なるかどうか決定され得る。さらに、ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子はＡＡＶ４と異なる組織向性を保持する。

[0123]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ベクターをパッケージングする１つ又は複数のカプシドタンパク質の血清型に相当する第１の血清型ゲノムに基づく。例えば、ＡＡＶベクターゲノムを含む１つ又は複数のＡＡＶ核酸（例えばＩＴＲ）の血清型は、ｒＡＡＶ粒子を含むカプシドの血清型に相当する。

[0124]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターをパッケージングする１つ又は複数のＡＡＶカプシドタンパク質の血清型と異なるＡＡＶ（例えばＡＡＶ２）血清型ゲノムに基づいてもよい。例えば、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ２由来核酸（例えばＩＴＲ）を含み得るが、３つのカプシドタンパク質のうちの少なくとも１つ又は複数が異なる血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、若しくはＡＡＶ−２ｉ８血清型又はそのバリアントに由来する。

[0125]ある特定の実施形態では、参照血清型に関連するｒＡＡＶ粒子又はそのベクターゲノムは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ−２ｉ８粒子のポリヌクレオチド、ポリペプチド、又はサブ配列と少なくとも６０％又はそれ以上（例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％等）同一の配列を含む、又はそれからなるポリヌクレオチド、ポリペプチド、又はそのサブ配列を有する。特定の実施形態では、参照血清型に関連するｒＡＡＶ粒子又はそのベクターゲノムは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ−２ｉ８血清型のカプシド又はＩＴＲ配列と少なくとも６０％又はそれ以上（例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％等）同一の配列を含む、又はそれからなるカプシド又はＩＴＲ配列を有する。

[0126]ある特定の実施形態では、本明細書の方法は、ｒＡＡＶ９粒子の使用、投与、又は送達を含む。ある特定の実施形態では、本明細書の方法は、ｒＡＡＶ２粒子の使用、投与、又は送達を含む。

[0127]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ９粒子はＡＡＶ９カプシドを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ９粒子は、天然又は野生型ＡＡＶ９粒子の相当するカプシドタンパク質と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％又はそれ以上同一であり、例えば８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％等、１００％まで同一である１つ又は複数のカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）を含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ９粒子は、天然又は野生型ＡＡＶ９粒子の相当するカプシドタンパク質と少なくとも７５％又はそれ以上同一であり、例えば８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％等、１００％まで同一であるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ９粒子は天然又は野生型ＡＡＶ９粒子のバリアントである。いくつかの態様では、ＡＡＶ９バリアントの１つ又は複数のカプシドタンパク質は、天然又は野生型ＡＡＶ９粒子のカプシドタンパク質（複数可）と比較して１、２、３、４、５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０又はそれ以上のアミノ酸置換を有する。

[0128]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子はＡＡＶ２カプシドを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は、天然又は野生型ＡＡＶ２粒子の相当するカプシドタンパク質と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％又はそれ以上同一であり、例えば８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％等、１００％まで同一である１つ又は複数のカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）を含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は、天然又は野生型ＡＡＶ２粒子の相当するカプシドタンパク質と少なくとも７５％又はそれ以上同一であり、例えば８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％等、１００％まで同一であるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は天然又は野生型ＡＡＶ２粒子のバリアントである。いくつかの態様では、ＡＡＶ２バリアントの１つ又は複数のカプシドタンパク質は、天然又は野生型ＡＡＶ２粒子のカプシドタンパク質（複数可）と比較して１、２、３、４、５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０又はそれ以上のアミノ酸置換を有する。

[0129]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、それらが１つ又は複数の所望のＩＴＲ機能（例えば、所望であれば、ＤＮＡ複製を可能にするヘアピンを形成する能力；ＡＡＶ ＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組込み；及び／又はパッケージング）を保持する限り、天然又は野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ｒｈ７４、ＡＡＶ−ｒｈ１０、又はＡＡＶ−２ｉ８の相当するＩＴＲと少なくとも７５％又はそれ以上同一であり、例えば８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％等、１００％まで同一である１つ又は２つのＩＴＲ（例えば一対のＩＴＲ）を含む。

[0130]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ９粒子は、それらが１つ又は複数の所望のＩＴＲ機能（例えば、所望であれば、ＤＮＡ複製を可能にするヘアピンを形成する能力；ＡＡＶ ＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組込み；及び／又はパッケージング）を保持する限り、天然又は野生型ＡＡＶ２粒子の相当するＩＴＲと少なくとも７５％又はそれ以上同一であり、例えば８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％等、１００％まで同一である１つ又は２つのＩＴＲ（例えば一対のＩＴＲ）を含む。

[0131]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は、それらが１つ又は複数の所望のＩＴＲ機能（例えば、所望であれば、ＤＮＡ複製を可能にするヘアピンを形成する能力；ＡＡＶ ＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組込み；及び／又はパッケージング）を保持する限り、天然又は野生型ＡＡＶ２粒子の相当するＩＴＲと少なくとも７５％又はそれ以上同一であり、例えば８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％等、１００％まで同一である１つ又は２つのＩＴＲ（例えば一対のＩＴＲ）を含む。

[0132]ｒＡＡＶ粒子は、任意の好適な数の「ＧＡＧＣ」反復配列を有するＩＴＲを含み得る。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ２粒子のＩＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０又はそれ以上の「ＧＡＧＣ」反復配列を含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は３つの「ＧＡＧＣ」反復配列を含むＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は４つより少ない「ＧＡＧＣ」反復配列を有するＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子は、４つより多い「ＧＡＧＣ」反復配列を有するＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２粒子のＩＴＲは、最初の２つの「ＧＡＧＣ」反復配列の４番目のヌクレオチドがＴではなくＣであるＲｅｐ結合部位を含む。

[0133]ｒＡＡＶ粒子へのパッケージング／カプセル化のためのｒＡＡＶベクターに組み込まれ得るＤＮＡの例示的な好適な長さは、約５キロベース（ｋｂ）又はそれ以下であり得る。特定の実施形態では、ＤＮＡの長さは約５ｋｂより小さい、約４．５ｋｂより小さい、約４ｋｂより小さい、約３．５ｋｂより小さい、約３ｋｂより小さい、又は約２．５ｋｂより小さい。

[0134]ポリペプチドの発現を導くポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶベクターは、当技術分野で公知の好適な組換え技術を使用して生成され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年参照）。組換えＡＡＶベクターは、典型的には、形質導入可能なＡＡＶ粒子にパッケージングされ、ＡＡＶウイルスパッケージングシステムを使用して増殖する。形質導入可能なＡＡＶ粒子は、哺乳動物細胞に結合及び侵入し、続いて核酸積荷（例えば、異種遺伝子）を細胞の核に送達することができる。したがって、形質導入可能な完全なｒＡＡＶ粒子を構成し、哺乳動物細胞に形質導入する。哺乳動物細胞に形質導入するように構成されたｒＡＡＶ粒子は、複製可能ではないことが多く、自己複製のためにはさらなるタンパク質機構が必要である。したがって、哺乳動物細胞に形質導入するように構成されるｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物細胞に結合及び侵入し、細胞に核酸を送達するように工学的に操作され、送達のための核酸はｒＡＡＶゲノムの一対のＡＡＶ ＩＴＲの間に位置することが多い。

[0135]形質導入可能なＡＡＶ粒子を産生するための好適な宿主細胞としては、限定はされないが、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞が挙げられ、異種ｒＡＡＶベクターの受容体として使用され得る、又は使用されている。安定なヒト細胞株由来の細胞、ＨＥＫ２９３（例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関から受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３で容易に入手可能）が使用され得る。ある特定の実施形態では、アデノウイルス５型のＤＮＡ断片によって形質転換され、アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子を発現する、改変ヒト胚腎臓細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３）が使用され、組換えＡＡＶ粒子が生成される。改変ＨＥＫ２９３細胞株は、容易にトランスフェクトされ、ｒＡＡＶ粒子を産生する特に便利なプラットフォームを提供する。哺乳動物細胞に形質導入することができる高力価のＡＡＶ粒子を生成する方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＡＡＶ粒子はＷｒｉｇｈｔ、２００８年及びＷｒｉｇｈｔ、２００９年に示されるように製造され得る。

[0136]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションより前、又はそれと同時にＡＡＶヘルパー構築物を宿主細胞にトランスフェクトすることによって宿主細胞にＡＡＶのヘルパー機能が導入される。したがって、ＡＡＶヘルパー構築物が時々使用され、ＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の少なくとも一過的な発現を提供し、生産的なＡＡＶの形質導入に必要なＡＡＶ機能の欠如を補足する。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲを欠くことが多く、それ自体では複製もパッケージングもできない。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、又はビリオンの形態であってもよい。ＲｅｐとＣａｐ両方の発現産物をコードする一般的に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐＩＭ２９＋４５などのいくつかのＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。Ｒｅｐ及び／又はＣａｐの発現産物をコードするいくつかの他のベクターが公知である。

[0137]本明細書で使用される「導入遺伝子」は、細胞又は生物に導入しようとする又は導入されている核酸／ポリヌクレオチドを便利に指す。導入遺伝子は、ポリペプチド又はタンパク質（例えばＳＧＳＨ）をコードする遺伝子などの任意の核酸を含み、一般には天然に生じるＡＡＶゲノム配列に関して異種性である。

[0138]用語「形質導入する」は、ベクター（例えばＡＡＶ粒子）による細胞又は宿主生物への核酸の導入を指す。したがって、ｒＡＡＶ粒子による細胞へのＳＧＳＨ導入遺伝子の導入は、細胞の「形質導入」と呼ばれ得る。導入遺伝子は形質導入細胞のゲノム核酸に組み込まれても組み込まれなくてもよい。導入した導入遺伝子が受容細胞又は生物の核酸（ゲノムＤＮＡ）に組み込まれる場合、導入遺伝子はその細胞又は生物で安定に維持され、受容細胞又は生物の子孫細胞又は子孫生物にさらに受け継がれる又は遺伝する。最終的に、導入した導入遺伝子は受容細胞又は宿主生物に、染色体外に、又は一過性にのみ存在し得る。したがって、「形質導入細胞」は、形質導入によって導入遺伝子が導入されている細胞である。したがって、「形質導入した」細胞は、導入遺伝子が導入されている細胞又はその子孫である。形質導入細胞は増殖することができ、導入遺伝子が転写され、コードタンパク質が発現される。遺伝子治療用の使用及び方法のため、形質導入細胞は哺乳動物由来であり得る。

[0139]非形質導入細胞は、ＡＡＶベクターが導入されていないものを指す。形質導入細胞によるＳＧＳＨ分泌は、非形質導入細胞によって取り込まれ、それらの細胞に利点をもたらし得る。したがって、形質導入細胞によるＳＧＳＨ分泌及びその後の脳脊髄液又は血管系によるＣＮＳの他の領域への送達（分布）は、今度は非形質導入細胞によって取り込まれるＳＧＳＨを提供できる。

[0140]本明細書で使用する場合、用語、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）タンパク質又はポリペプチドは、バリアント、例えば１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は付加／挿入を有するＳＧＳＨを含む。特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは、１つ又は複数の置換、欠失、及び／又は付加／挿入を有する配列番号１である。さらに特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは、１〜５個のアミノ酸置換を有する配列番号１である。より特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは、２６４位にアミノ酸置換、例えばアスパラギン（Ｎ）からグルタミン（Ｑ）への置換を有する配列番号１である。

[0141]ＳＧＳＨ活性を有するＳＧＳＨポリペプチドは、好適なアッセイを使用して、配列番号１のヒト野生型ＳＧＳＨの活性又は機能の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは約１００％、又はそれ以上を示すＳＧＳＨタンパク質又はそのバリアントを指す。ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは、配列番号１のヒトＳＧＳＨの分泌よりも形質導入細胞からの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は約１００％高い分泌を示すＳＧＳＨタンパク質を指す。ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは、配列番号１のヒトＳＧＳＨの取り込みよりも細胞による少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は約１００％高い取り込みを示すＳＧＳＨタンパク質を指す。

[0142]ＳＧＳＨは、少なくとも部分的な若しくは全ての、又はより高いＳＧＳＨ活性を保持するＳＧＳＨポリペプチドのバリアント形態を含み得る。ＳＧＳＨ及びそのバリアントは、任意の好適な生物から（例えば、哺乳動物から、ヒトから、非ヒト哺乳動物から、例えば、イヌ、ブタ、ウシなどから）得ることができる。ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨバリアントは、配列番号１に示されるＳＧＳＨタンパク質と少なくとも６０％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％同一性、少なくとも９７％同一性、少なくとも９８％同一性、又は９９％同一性を有する。

[0143]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質及びＳＧＳＨをコードする導入遺伝子／核酸を含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶカプシドタンパク質並びにＳＧＳＨポリペプチドの発現及び／又は分泌を導く核酸を含む。代表的なヒトＳＧＳＨアミノ酸配列を配列番号１に示す。

[0144]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質及びＳＧＳＨポリペプチドをコードする導入遺伝子／核酸を含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質並びにＳＧＳＨポリペプチドの発現及び／又は分泌を導く導入遺伝子／核酸を含む。ある特定の実施形態では、投与される核酸はＳＧＳＨをコードする。ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨポリペプチドは、配列番号１に示されるタンパク質と少なくとも６０％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％同一性、少なくとも９７％同一性、少なくとも９８％同一性、又は９９％同一性を有する。

[0145]ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子を哺乳動物に投与又は送達するステップ、及び任意選択で１つ又は複数の免疫抑制剤を哺乳動物に投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子を哺乳動物に投与又は送達するステップ、及び任意選択で２、３、４つ又はそれ以上の免疫抑制剤を哺乳動物に投与するステップを含む。

[0146]ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は抗炎症剤である。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤はミコフェノール酸、又はその誘導体である。そのようなミコフェノール酸誘導体の例は、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）である。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤はシクロスポリン、又はその誘導体である。

[0147]ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は、哺乳動物へのｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子の投与前、投与中、及び／又は投与後に投与される。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は、哺乳動物へのｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子の投与と同時に投与される。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は、哺乳動物へのｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子の投与後に投与される。

[0148]ｒＡＡＶ粒子及び／又は免疫抑制剤は、特定の投与経路に好適な任意の好適な配合で製剤化され得る。様々な薬学的に許容される製剤が市販されており、医師によって入手可能である。

[0149]ｒＡＡＶ粒子は任意の好適な経路により投与され得る。ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子を哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）に投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、中枢神経系は、脳、脊髄、及び脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む。ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子を哺乳動物の脳又は脊髄又はＣＳＦに投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は脳又は脊髄の一部に投与される。

[0150]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、脳実質組織、クモ膜下腔、及び／又は髄腔内に投与される。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、前記哺乳動物の大槽、脳室内腔、脳室、クモ膜下腔、及び／又は脳室上皮のうちの１つ又は複数に投与される。

[0151]さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、脳室系に投与される。さらに別の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、１つ又は複数の吻側側脳室；及び／又は尾側側脳室；及び／又は右側脳室；及び／又は左側脳室；及び／又は右吻側側脳室；及び／又は左吻側側脳室；及び／又は右尾側側脳室；及び／又は左尾側側脳室に投与される。

[0152]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、例えば細胞をｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子と接触させることによって、哺乳動物のＣＳＦに接触する１つ又は複数の細胞に投与される。ＣＳＦに接触する細胞の非限定的な例としては、脳室上皮細胞、軟膜の細胞、内皮細胞、及び／又は髄膜細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は脳室上皮細胞に投与される。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、例えば脳室上皮細胞をｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子と接触させることによって、脳室上皮細胞に送達される。

[0153]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は局所的に投与／送達される。「局所送達」は、哺乳動物内の標的部位への直接的な送達を指す（例えば、組織又は体液に直接的に）。例えば、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、器官、組織又は具体的な解剖学的な場所へ直接注射によって局所的に送達され得る。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は脳、脊髄、又はその組織若しくは体液へ直接注射によって送達又は投与される（例えば脳室上皮細胞、軟膜の細胞、内皮細胞、及び／又は髄膜細胞などのＣＳＦ）。例えば、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、直接注射によって、ＣＳＦ、大槽、脳室内腔、脳室、クモ膜下腔、及び／又は髄腔内；及び／又は脳室上皮；及び／又は吻側側脳室；及び／又は尾側側脳室；及び／又は右側脳室；及び／又は左側脳室；及び／又は右吻側側脳室；及び／又は左吻側側脳室；及び／又は右尾側側脳室；及び／又は左尾側側脳室に直接送達され得る。

[0154]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、脳又は脊髄の組織若しくは体液への直接注射によって、脳又は脊髄の組織、体液若しくは細胞に送達される。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、定位的注射によって脳又は脊髄の組織若しくは体液に送達される。

[0155]ある特定の実施形態では、１つ又は複数のｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、脳、脊髄、若しくはその部分、又はその組織若しくは体液（例えば脳室上皮細胞などのＣＳＦ）への直接注入により送達又は投与される。特定の態様では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、脳室上皮細胞、軟膜の細胞、内皮細胞、及び／又は髄膜細胞に形質導入する。

[0156]ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ｒＡＡＶ粒子を構成して哺乳動物の脳又は脊髄細胞に形質導入し、哺乳動物の脳又は脊髄においてＳＧＳＨ活性を有するポリペプチドの発現を導く、ｒＡＡＶ粒子を哺乳動物の脳又は脊髄、若しくはその一部に投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨが投与部位に遠位の中枢神経組織（例えば脳、例えば線条体、視床、髄質、小脳、後頭皮質、前頭前野皮質）において発現及び／又は検出される。ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨは、中枢神経組織（例えば脳、例えば線条体、視床、髄質、小脳、後頭皮質、及び／又は前頭前野皮質）に広く存在し又は検出され、投与部位から離れた及び任意選択で、他の（例えば非形質導入）細胞によって取り込まれる中枢神経組織（例えば脳、例えば線条体、視床、髄質、小脳、後頭皮質、及び／又は前頭前野皮質）に渡る分布を示している。

[0157]有効量のｒＡＡＶ粒子、例えばｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、経験的に決定され得る。投与は、１つ又は複数の用量で、処置の過程に渡って連続的又は断続的に行われ得る。有効な用量の投与は、当業者によって決定され得、ＡＡＶ血清型、ウイルス力価、及び処置される哺乳動物の体重、状態及び種によって異なり得る。単回及び多回投与（例えば１〜５回又はそれ以上）が、処置する医師によって選択される用量レベル、標的、及びタイミングで行われ得る。例えば、十分な酵素活性を維持するために必要な場合、多回用量が投与され得る。

[0158]ある特定の実施形態では、複数のｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子が投与される。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、約１〜約５ｍｌ中約１×１０^５〜約１×１０^１８ｖｇ／ｍｌの用量で；１×１０^７〜約１×１０^１６ｖｇ／ｍｌの約１〜約３ｍｌの用量で；又は１×１０^８〜約１×１０^１５ｖｇ／ｍｌの約１〜約２ｍｌの用量で投与される。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、処置される哺乳動物の体重あたり約１×１０^８〜約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。

[0159]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、約１×１０^６〜約１×１０^１８ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、１×１０^７〜１×１０^１６ｖｇ／ｍｌの約０．１〜５ｍｌ、１×１０^５〜１×１０^１６ｖｇ／ｍｌの約０．５〜５ｍｌ、１×１０^５〜１×１０^１６ｖｇ／ｍｌの約１〜５ｍｌ、１×１０^７〜１×１０^１４ｖｇ／ｍｌの約１〜３ｍｌの用量で、又は１×１０^８〜１×１０^１３ｖｇ／ｍｌの約１〜２ｍｌの用量で投与され得る。

[0160]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、処置される哺乳動物の体重あたり約１×１０^８ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^８ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^９ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^９ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、又は約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。

[0161]本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」又は「生理学的に許容される」は、投与、ｉｎ ｖｉｖｏ送達又は接触のうちの１つ又は複数の経路に好適である、生物学的に許容される組成物、製剤、液体若しくは固体、又はそれらの混合物を意味する。「薬学的に許容される」又は「生理学的に許容される」組成物は、生物学的に又はその他の点で望ましくない材料ではなく、例えば、材料は実質的に望ましくない生物学的な効果を起こさずに対象に投与され得る。そのような組成物、「薬学的に許容される」及び「生理学的に許容される」製剤並びに組成物は無菌であり得る。そのような医薬製剤及び組成物は、例えば、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子を対象に投与するステップに使用され得る。

[0162]そのような製剤及び組成物としては、溶剤（水性又は非水性）、溶液剤（水性又は非水性）、エマルション（例えば水中油型又は油中水型）、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、分散及び懸濁培地、コーティング剤、等張及び吸収促進剤又は遅延剤が挙げられ、薬学的な投与又はｉｎ ｖｉｖｏ接触若しくは送達に適応する。水性及び非水性溶剤、溶液剤、及び懸濁剤としては、懸濁化剤及び増粘剤が挙げられ得る。補足的な活性化合物（例えば、保存剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、及び抗真菌剤）も、製剤及び組成物に組み込まれ得る。

[0163]医薬組成物は、典型的には薬学的に許容される賦形剤を含有する。そのような賦形剤は、組成物を受ける個人に有害な抗体の産生をそれ自体では誘導しない任意の医薬剤を含み、過度の毒性なく投与され得る。薬学的に許容される賦形剤としては、限定はされないが、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ８０、並びに水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体が挙げられる。例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩など、薬学的に許容される塩が含まれ得る。さらに、界面活性剤、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのようなビヒクルに存在し得る。

[0164]医薬組成物は、本明細書に示されるように、又は当業者に公知のように、特定の投与又は送達の経路に適応するように製剤化され得る。したがって、医薬組成物は、様々な経路による投与又は送達に好適な担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。

[0165]ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子などのｒＡＡＶ粒子の注射又は注入に好適な医薬剤形は、無菌注射可能若しくは注入可能な溶液又は分散液の即時調製に適し、任意選択でリポソームにカプセル化される無菌水溶液又は分散液を含み得る。全ての場合において、最終形態は無菌液体であり、製造、使用、及び保存の条件下で安定であるべきである。液体担体又はビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びそれらの好適な混合物を含む溶媒又は液体分散培地であり得る。例えば、リポソームの形成によって、分散剤の場合に必要な粒径の維持によって、又は界面活性剤の使用によって適当な流動性が維持され得る。等張剤、例えば糖、緩衝剤又は塩（例えば塩化ナトリウム）が含まれ得る。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する薬剤の組成物、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンでの使用によってもたらされ得る。

[0166]ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子の溶液又は懸濁液は、以下の構成成分のうちの１つ又は複数を任意選択で含み得る；注射用水などの無菌希釈液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの生理食塩水溶液、人工的なＣＳＦ、界面活性剤、固定油、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、グリセリン、又は他の合成溶媒；パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸などの抗菌剤及び抗真菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸、又はリン酸などの緩衝剤並びに塩化ナトリウム又はデキストロースなどの浸透圧の調整剤。

[0167]本発明の組成物、方法及び使用に適切な医薬製剤、組成物及び送達系は、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３年）２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０年）１８版、Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１９９６年）１２版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ、ＮＪ；Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（１９９３年）、Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、Ｐａ．；Ａｎｓｅｌ ａｎｄ Ｓｔｏｋｌｏｓａ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１年）１１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ；及びＰｏｚｎａｎｓｋｙら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９８０年）、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ編、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．、２５３〜３１５頁参照）。

[0168]ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子などのｒＡＡＶ粒子、及びそれらの組成物は、容易な投与及び均一な投与量のために単位剤形に製剤化され得る。本明細書で使用する場合、単位剤形は、処置される個体のための均一の投与量として適した物理的に別個の単位を指す；必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように算出された既定量の活性化合物を含有する各単位。単位剤形は、所望の効果（複数可）をもたらすのに必要だと考えられるｒＡＡＶ粒子（例えば、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子）の量による。必要な量は、単回用量で製剤化され得、又は多回投与量単位で製剤化され得る。用量は好適なｒＡＡＶ粒子濃度に調整され、任意選択で抗炎症剤と組み合わされ、使用のためにパッケージングされ得る。

[0169]一実施形態では、医薬組成物は十分な遺伝物質（ｒＡＡＶ粒子）を含み、治療有効量、すなわち問題の疾患状態の症状若しくは有害作用を低減若しくは改善するのに十分な量又は所望の利点を与えるのに十分な量を提供する。

[0170]本明細書で使用する場合、「単位剤形」は、処置される対象のための均一の投与量として適した物理的に別個な単位を指す；任意選択で、１つ又は複数の用量で投与される場合、所望の効果（例えば予防又は治療効果）をもたらすように算出される医薬担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクル又は充填剤）と関連して、既定量を含有する各単位。単位剤形は、例えば、アンプル及びバイアル内であり、液体組成物、又はフリーズドライ若しくは凍結乾燥状態の組成物；例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与又は送達の前に添加され得る無菌液体担体を含み得る。個々の単位剤形は、複数用量キット又は容器に含まれ得る。したがって、例えば、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子、及びその医薬組成物は、容易な投与及び均一な投与量のため、単一又は複数の単位剤形にパッケージングされ得る。

[0171]ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子を含有する製剤は、典型的には、有効量を含有し、有効量は当業者によって容易に決定される。ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、典型的には、約１％〜約９５％（ｗ／ｗ）の範囲の組成物であり、好適であればより高くもあり得る。投与される量は、処置を検討される哺乳動物又はヒト対象の年齢、体重及び健康状態などの因子による。用量応答曲線を確立する日常の試験を通して、有効投与量は当業者によって確立され得る。

[0172]ある特定の実施形態では、方法は、本明細書に示されるように複数のｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子を哺乳動物に投与するステップを含み、ＳＧＳＨの発現又は機能の欠乏又は欠損（例えばＭＰＳＩＩＩＡ）の１つ又は複数の症状の重症度、頻度、進行度、又は発症時間が減少、低減、予防、阻害、又は遅延される。ある特定の実施形態では、方法は、哺乳動物に複数のｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子を投与し、ＭＰＩＩＩＡの症状又は有害作用を処置するステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、哺乳動物に複数のｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子を投与し、ＭＰＳＩＩＩＡの症状又は有害作用を安定化、悪化、すなわち進行を遅延若しくは防止する、又は好転させるステップを含む。

[0173]ある特定の実施形態では、方法は、本明細書に示されるように複数のｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子を哺乳動物の中枢神経系、又はその部分に投与するステップを含み、ＳＧＳＨの発現又は機能の欠乏又は欠損（例えばＭＰＳＩＩＩＡ）の１つ又は複数の症状の重症度、頻度、進行度、又は発症時間が減少、低減、予防、阻害、又は少なくとも約５〜約１０、約１０〜約２５、約２５〜約５０、若しくは約５０〜約１００日間遅延される。

[0174]ある特定の実施形態では、症状又は有害作用は初期若しくは後期の症状；行動、人格、若しくは言語症状；睡眠障害；及び／又は認知症状を含む。

[0175]本明細書の方法及び使用によって処置可能なＭＰＳＩＩＩＡの初期の症状／有害作用の例は、言語障害及び行動問題の進行又は悪化を改善又は減速又は予防することを含む。ＭＰＳＩＩＩＡの他の症状は、不穏状態、攻撃的若しくは破壊的行動、又は不安の低減又は修正を含む。いくつかの例では、症状は、自閉症スペクトラム障害、社会的相互作用及びコミュニケーションの困難を特徴とする状態を含む。ＭＰＳＩＩＩＡの他の症状は、睡眠障害を含む。ＭＰＳＩＩＩＡが進行すると、さらなる症状は、知的能力及び／又は発達の阻害、喪失又は悪化、並びに発達退行又は以前に習得した技術の喪失を含む。ＭＰＳＩＩＩＡの後期では、人々は発作及び運動障害を発症し得る。本発明の方法及び使用は、ＭＰＳＩＩＩＡのいずれかの又は全ての前述の症状を処置若しくは改善、又は重症度若しくは頻度を低減することを目的とするものを含む。

[0176]用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」及び「導入遺伝子」は本明細書で交換可能に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）並びにそれらのポリマーを含む、核酸、オリゴヌクレオチドの全ての形態を指す。ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、並びにスプライス又は非スプライスｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及び抑制ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば小さい若しくは短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小さい若しくは短い干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドは、天然に生じる、合成、及び意図的に改変又は変更されたポリヌクレオチド（例えば、バリアント核酸）を含み得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖、線状又は環状であってもよく、任意の好適な長さであってもよい。ポリヌクレオチドの議論において、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’方向で配列を提供する決まりに従って本明細書に記載され得る。

[0177]ポリペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むことが多い。他に示さない限り、特定の核酸配列は縮重したコドン置換も含む。

[0178]核酸は、オープンリーディングフレームに作動可能に連結した１つ又は複数の発現調節又は制御エレメントを含み得、１つ又は複数の制御エレメントは、哺乳動物細胞においてオープンリーディングフレームによってコードされたポリペプチドの転写及び翻訳を導くように構成される。発現調節／制御エレメントの非限定的な例としては、転写開始配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ＴＡＴＡボックスなど）、翻訳開始配列、ｍＲＮＡ安定性配列、ポリＡ配列、分泌配列などが挙げられる。発現調節／制御エレメントは任意の好適な生物のゲノムから得ることができる。

[0179]「プロモーター」は、ヌクレオチド配列、通常コード配列の上流（５’）を指し、ＲＮＡポリメラーゼの認識及び正確な転写に必要な他の因子を提供することによってコード配列の発現を導く及び／又は調節する。「プロモーター」は、ＴＡＴＡボックス、及び任意選択で転写開始の部位を特定するために働く他の配列から構成される短いＤＮＡ配列である最小のプロモーターを含み、発現の調節のために制御エレメントが添加される。

[0180]「エンハンサー」は転写活性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、発現のレベル又は組織特異性を増強するプロモーターの先天的エレメント又は異種エレメントであり得る。いずれの方向（５’−＞３’又は３’−＞５’）でも操作することができ、プロモーターの上流又は下流のいずれかに位置する場合であっても機能することが可能であり得る。

[0181]プロモーター及び／又はエンハンサーは、その全体が天然の遺伝子から導出する、又は天然で見出された異なるエレメントに由来する異なるエレメントから構成され、又は合成ＤＮＡセグメントから構成されもし得る。プロモーター又はエンハンサーは、刺激、生理学的又は発生的条件に応答する転写開始の有効性をモジュレート／調節するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を含み得る。

[0182]非限定的な例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子由来の配列も、本明細書での使用が見出される。例示的な構成プロモーターとしては、ある特定の構成又は「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子のプロモーターが挙げられる：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、アクチンプロモーター、及び当業者に公知の他の構成プロモーター。さらに、多くのウイルスプロモーターが真核細胞内で構成的に機能する。これらは、他にも多くある中で、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター；モロニー白血病ウイルス及び他のレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）；並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターを含む。したがって、上で参照した構成プロモーターのいずれかを使用して、異種遺伝子インサートの転写を調節できる。

[0183]誘導性プロモーターの調節下の導入遺伝子は、誘導剤の存在下でのみ又は多くは発現される（例えば、メタロチオネインプロモーターの調節下での転写は、ある特定の金属イオンの存在下で大幅に増加する）。誘導性プロモーターは、それらの誘導因子が結合される場合に転写を刺激する応答エレメント（ＲＥ）を含む。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸、及びサイクリックＡＭＰのＲＥがある。特定のＲＥを含有するプロモーターは、誘導応答を得るために選択され得、いくつかの場合では、ＲＥ自体が異なるプロモーターに結合し、それにより誘導能を組換え遺伝子に付与することができる。したがって、好適なプロモーターを選択することにより（構成的対誘導性；強い対弱い）、遺伝子改変細胞におけるポリペプチドの発現の存在とレベルの両方を調節することが可能である。ポリペプチドをコードする遺伝子が、誘導性プロモーターの調節下にある場合、ｉｎ ｓｉｔｕでのポリペプチドの送達は、ｉｎ ｓｉｔｕで遺伝子改変細胞をポリペプチドの転写が可能な条件に曝露することによって、例えば、薬剤の転写を調節する誘導性プロモーターの特異的な誘導物質の腹腔内注射によって引き起こされる。例えば、メタロチオネインプロモーターの調節下で遺伝子によってコードされたポリペプチドの遺伝子改変細胞によるｉｎ ｓｉｔｕ発現は、遺伝子改変細胞をｉｎ ｓｉｔｕで適切な（すなわち、誘導性）金属イオンを含有する溶液と接触させることによって増強される。

[0184]核酸／導入遺伝子は、別の核酸配列と機能性の関係に置かれた場合、「作動可能に連結される」。ポリペプチドをコードする核酸／導入遺伝子、又はＳＧＳＨポリペプチドの発現を導く核酸（例えばＳＧＳＨ活性を有するポリペプチド）は、コードされたポリペプチドの転写を調節する誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターを含み得る。

[0185]ある特定の実施形態では、ＣＮＳ特異的又は誘導性プロモーター、エンハンサーなどは、本明細書に記載の方法及び使用に用いられる。ＣＮＳ特異的プロモーターの非限定的な例としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、及びニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）由来の遺伝子から単離したものが挙げられる。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素及びＩＦＮのＤＮＡ応答エレメントが挙げられる。

[0186]ある特定の実施形態では、発現調節エレメントはＣＭＶエンハンサーを含む。ある特定の実施形態では、発現調節エレメントはベータアクチンプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、発現調節エレメントはチキンベータアクチンプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、発現調節エレメントは、ＣＭＶエンハンサー及びチキンベータアクチンプロモーターを含む。

[0187]本明細書で使用する場合、用語「改変する」又は「バリアント」及びそれらの文法的バリエーションは、核酸、ポリペプチド、又はそれらのサブ配列が参照配列から外れることを意味する。したがって、改変及びバリアント配列は、参照配列と実質的に同じ、より高い若しくはより低い発現、活性、又は機能を有するが、参照配列の部分的な活性又は機能は少なくとも保持し得る。バリアントの特定の型は、変異タンパク質であり、変異、例えばＳＧＳＨのミスセンス又はナンセンス変異を有する遺伝子によってコードされたタンパク質を指す。

[0188]「核酸」又は「ポリヌクレオチド」バリアントは、野生型と比較して遺伝的に変更された改変配列を指す。配列は、コードされたタンパク質配列を変更することなく遺伝的に改変され得る。或いは、配列はバリアントタンパク質、例えばバリアントＳＧＳＨタンパク質をコードするように遺伝的に改変され得る。核酸又はポリヌクレオチドバリアントは、野生型タンパク質配列などの参照配列と少なくとも部分的な配列同一性を依然として保持するタンパク質をコードするようにコドン改変された、及びバリアントタンパク質をコードするようにコドン改変された組合せ配列も指すことができる。例えば、そのような核酸バリアントのいくつかのコドンは、それらによってコードされるＳＧＳＨタンパク質のアミノ酸を変更することなく変えられ、核酸バリアントのいくつかのコドンは、今度はそれらによってコードされるＳＧＳＨタンパク質のアミノ酸を変えて変えられる。

[0189]用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書において交換可能に使用される。本明細書に開示される「核酸」又は「ポリヌクレオチド」又は「導入遺伝子」によってコードされる「ポリペプチド」は、ポリペプチドがある程度のＳＧＳＨ活性を保持する限り、天然に生じる野生型及びその機能性多型タンパク質、機能性サブ配列（断片）、並びにその配列バリアントと同様に、部分又は全長の天然のＳＧＳＨ配列を含む。したがって、本発明の方法及び使用において、核酸配列によってコードされたそのようなポリペプチドは、欠陥があり、又はその活性、機能、若しくは発現が不十分であり、処置した哺乳動物で欠損又は不在の内在性ＳＧＳＨタンパク質と同一である必要はない。

[0190]改変の非限定的な例としては、１つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸置換が挙げられる（例えば、約１〜約３、約３〜約５、約５〜約１０、約１０〜約１５、約１５〜約２０、約２０〜約２５、約２５〜約３０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜約１５０、約１５０〜約２００、約２００〜約２５０、約２５０〜約５００、約５００〜約７５０、約７５０〜約１０００又はそれ以上のヌクレオチド又は残基）。

[0191]アミノ酸改変の例は、保存的なアミノ酸置換又は欠失である。特定の実施形態では、改変又はバリアント配列（例えばＳＧＳＨ）は、非改変配列（例えば野生型ＳＧＳＨ）の少なくとも一部の機能又は活性を保持する。さらに特定の実施形態では、改変又はバリアント配列（例えばＳＧＳＨ）は、非改変配列（例えば野生型ＳＧＳＨ）と比較して、細胞による分泌の改善を示す。さらに別の特定の実施形態では、改変又はバリアント配列（例えばＳＧＳＨ）は、非改変配列（例えば野生型ＳＧＳＨ）の取り込みと比較して、細胞による取り込みの改善を示す。

[0192]アミノ酸改変の別の例は、ＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質に導入される標的化ペプチドである。ｒＡＡＶベクターを、血管内皮細胞など、中枢神経系に標的化するペプチドが同定されている。したがって、例えば、脳の血管に沿う内皮細胞は、改変されたｒＡＡＶ粒子によって標的化され得る。そのようなペプチドを含むように改変されたカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子は、本明細書に示されるようにＳＧＳＨを中枢神経系（例えば、脳、脊髄等）に導入するために使用され得る。

[0193]そのように改変されたｒＡＡＶは、別の型の組織（例えば肝臓組織）よりも１つの型の組織（例えばＣＮＳ組織）に優先的に結合できる。ある特定の実施形態では、改変カプシドタンパク質を有するｒＡＡＶは、相当する非改変カプシドタンパク質よりも高いレベルで結合することによって脳血管内皮組織を「標的化」し得る。例えば、改変カプシドタンパク質を有するｒＡＡＶは、非改変ｒＡＡＶよりも５０％〜１００％高いレベルで脳血管内皮組織に結合し得る。

[0194]「核酸断片」は、所与の核酸分子の一部分である。大多数の生物のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は遺伝物質であるが、リボ核酸（ＲＮＡ）はＤＮＡに含有される情報のタンパク質への移行に関与する。開示されたヌクレオチド配列及びそれらにコードされるタンパク質又は部分長のタンパク質の断片及びバリアントも本発明に包含される。「断片」又は「部分」は、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又はポリペプチド若しくはタンパク質のアミノ酸配列の全長又は全長未満を意味する。ある特定の実施形態では、断片又は部分は生物学的に機能性である（すなわち、野生型ＳＧＳＨの活性又は機能の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％を保持する）。

[0195]分子の「バリアント」は、天然の分子の配列と実質的に類似の配列である。ヌクレオチド配列に関して、バリアントは、遺伝コードの縮重のため、天然のタンパク質の同一のアミノ酸配列をコードするそれらの配列を含む。これらのような天然に生じる対立遺伝子バリアントは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーション技術のように、分子生物学的技術を使用して同定され得る。バリアントヌクレオチド配列は、例えば、部位特異的変異誘発を使用して生成された天然のタンパク質をコードするもの、並びにアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするものなど、合成的に導出されたヌクレオチド配列も含む。通常、本発明のヌクレオチド配列バリアントは、天然の（内在性の）ヌクレオチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、〜７０％、例えば７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、〜７９％、通常少なくとも８０％、例えば８１％〜８４％、少なくとも８５％、例えば８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、〜９８％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、バリアントは生物学的に機能性である（すなわち、野生型ＳＧＳＨの活性又は機能の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％を保持する）。

[0196]特定の核酸配列の「保存バリエーション」は、同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多くの機能的に同一の核酸が任意の所与のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ及びＡＧＧは全て、アミノ酸アルギニンをコードする。したがって、アルギニンがコドンによって特定される全ての位置で、コドンは、コードされるタンパク質を変更することなく記載した相当するコドンのいずれかに変更され得る。そのような核酸バリエーションは、「保存的に改変されたバリエーション」の一種である「サイレントバリエーション」である。ポリペプチドをコードする本明細書に記載の全ての核酸配列は、特に記載する場合以外は、全ての可能なサイレントバリエーションも記載する。当業者は、核酸の各コドンは（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＴＧは除く）、標準的な技術によって機能的に同一の分子を産生するように改変され得ることを理解するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各「サイレントバリエーション」は、各記載の配列に潜在している。

[0197]ポリヌクレオチド配列の用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーターを使用して記載したアライメントプログラムの１つを使用して参照配列と比較して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、若しくは７９％、又は少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、若しくは８９％、又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、若しくは９４％、又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、これらの値が、適切に調整され、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置などを考慮に入れて、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の相当する同一性を決定し得ることを理解するであろう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的同一性は通常、少なくとも７０％、少なくとも８０％、９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を意味する。

[0198]ポリペプチドの文脈において、用語「実質的同一性」は、ポリペプチドが、特定の比較ウインドウで参照配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、若しくは７９％、又は８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、若しくは８９％、又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、若しくは９４％、又は９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の、配列同一性を有する配列を含むことを示す。２つのポリペプチド配列が実質的に同一であるという指標は、１つのポリペプチドが第２のポリペプチドに対して生じる抗体と免疫学的に反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的な置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは第２のポリペプチドと実質的に同一である。

[0199]本発明は、パッケージング材料及び１つ又は複数の構成要素を含むキットを提供する。キットは、典型的には、構成要素の記載又は構成要素のｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｉｎ ｖｉｖｏ，若しくはｅｘ ｖｉｖｏでの使用の説明書を含む、ラベル又は添付文書を含む。キットは、そのような構成要素のコレクション、例えば、核酸、組換えベクター、ｒＡＡＶ−ＳＧＳＨ粒子、及び任意選択で第２の活性な、例えば別の化合物、薬剤、薬物又は組成物を含有し得る。

[0200]キットは、キットの１つ又は複数の構成要素を収容する物理的構造を指す。パッケージング材料は構成要素を無菌的に維持でき、そのような目的のために一般的に使用される材料で製造され得る（例えば、紙、波形繊維、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブ等）。

[0201]ラベル又は添付文書は、１つ又は複数の構成要素、用量、作用機序、薬物動態及び薬力学を含む活性成分（複数可）の臨床薬理学を同定する情報を含み得る。ラベル又は添付文書は、製造会社、ロット番号、製造場所及び日付、使用期限を同定する情報を含み得る。ラベル又は添付文書は、製造会社情報、ロット番号、製造場所及び日付を同定する情報を含み得る。ラベル又は添付文書は、キットの構成要素が使用され得る疾患の情報を含み得る。ラベル又は添付文書は、方法、使用、又は処置プロトコール若しくは治療レジメンにおける、キット構成要素の１つ又は複数を使用するための医師又は対象への説明書を含み得る。説明書は、投与量、頻度又は期間、及び本明細書に記載の方法、使用、処置プロトコール又は予防若しくは治療レジメンのいずれかを実施するための説明書を含み得る。

[0202]ラベル又は添付文書は、予防又は治療効果など、構成要素が提供し得る任意の利点についての情報を含み得る。ラベル又は添付文書は、特定の組成物を使用することが適切ではないであろう場面に関して、対象又は医師に警告するなど、有害な副作用の可能性、合併症又は反応についての情報を含み得る。有害な副作用又は合併症は、対象が組成物と配合禁忌であり得る１つ又は複数の他の医薬品を摂取していた、摂取することになっている、若しくは現在摂取している、又は対象が組成物と配合禁忌であろう別の処置プロトコール若しくは治療レジメンを受けていた、受けることになっている、若しくは現在受けている場合にも生じ、したがって、説明書はそのような配合禁忌に関する情報を含み得る。

[0203]ラベル又は添付文書は、例えば、紙若しくはボール紙、又は構成要素、キット、若しくは梱包材（例えば箱）と別に若しくはそれに添付される、又はキットの構成要素を含有するアンプル、チューブ、若しくはバイアルに添付される「印刷物」を含む。ラベル又は添付文書は、バーコード印刷したラベルなどのコンピュータ読み取り可能な媒体、ディスク、ＣＤ−、若しくはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭなどの光ディスク、ＤＶＤ、ＭＰ３、又はＲＡＭ及びＲＯＭなどの電子保存媒体、又は磁気／光保存媒体、ＦＬＡＳＨメモリー、ハイブリッド及びメモリー型カードなどのこれらのハイブリッドをさらに含み得る。

[0204]本明細書で使用する用語「約」は、参照値の１０％以内（プラス又はマイナス）である値を指す。

[0205]用語「処置する」及び「処置」は、治療処置及び予防的又は防止的措置の両方を指し、対象は疾患の発生、進行、又は悪化など、不要な生理学的変化又は障害を予防、阻害、低減又は減少される。本発明の目的のための、有益な又は所望の臨床結果としては、限定はされないが、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の症状又は有害作用の安定化（すなわち、悪化又は進行なし）、疾患の進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は寛解、及び鎮静（部分的又は全体的のいずれか）、検出可能か検出可能ではないかが挙げられる。「処置」は、処置を受けない場合に予想される生存と比較して生存を延長することも意味し得る。処置を必要とする対象は、既に状態又は障害にある対象並びに罹患しやすい対象（例えば、遺伝的アッセイによって決定されるように）、例えば喪失若しくは低減したＳＧＳＨの発現若しくは機能に関してホモ接合体（Ｓｇｓｈ^−／−）である、又は喪失若しくは低減したＳＧＳＨの発現若しくは機能に関してヘテロ接合体（Ｓｇｓｈ^＋／−）であることが同定された対象などを含む。

[0206]用語「含む（comprising）」「有する（having）」「含む（including）」及び「含有する（containing）」は、特に記載しない限り、制約がない用語（すなわち、「含むが限定されない」を意味する）と解釈される。

[0207]本明細書に記載の全ての方法及び使用は、本明細書に他に示さない、又は文脈によりはっきりと否定しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。任意の及び全ての例、又は本明細書に記載する例示的な言語（例えば、「など（such as）」又は「例えば（for example）」）の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図し、他に請求しない限り、本発明の範囲を制限しない。本明細書の言語は、任意の非請求エレメントが本発明の実施に必須であると示していると解釈されるべきではない。

[0208]本明細書に開示した全ての特徴は、任意の組合せで組み合わされ得る。本明細書に開示した各特徴は、同じ、等価な、又は類似の目的を果たす代わりの特徴によって置き換えられ得る。したがって、明示的に特に記載しない限り、開示した特徴（例えば、改変核酸、ベクター、プラスミド、組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）配列、ベクターゲノム、又はｒＡＡＶ粒子）は、等価な又は類似の特徴の種類の例である。

[0209]本明細書で使用する場合、形態「１つの（a）」「及び（and）」及び「その（the）」は、文脈が他にはっきりと示さない限り、単数及び複数の参照を含む。したがって、例えば、「核酸（a nucleic acid）」という言及は、複数のそのような核酸を含み、「ベクター（avector）」という言及は複数のそのようなベクターを含み、「ウイルス（a virus）」又は「ＡＡＶ又はｒＡＡＶ粒子（AAV or rAAV particle）」という言及は複数のそのようなビリオン／ＡＡＶ又はｒＡＡＶ粒子を含む。

[0210]本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書で他に示さない限り、範囲内にあるそれぞれ別々の値を個別に指す、簡単な方法として役に立つことを単に意図し、個別に本明細書に引用されたようにそれぞれ別々の値が本明細書に組み込まれる。

[0211]したがって、全ての数値又は数値範囲は、文脈が他にはっきりと示さない限り、そのような範囲内の整数及び範囲内の値又は整数の分数を含む。したがって、例示のため、８０％又はそれ以上の同一性という言及は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％等、並びに８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％等、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％等を含む。

[0212]より多い（より大きい）又はより少ないを伴う整数の言及は、それぞれ参照数より多い又はより少ない任意の数を含む。したがって、例えば、１００より少ないという言及は、９９、９８、９７等、１番に至るまでの全てを含む；及び１０より少ないという言及は、９、８、７等、１番に至るまでの全てを含む。

[0213]本明細書で使用する場合、全ての数値又は数値範囲は、文脈が他にはっきりと示さない限り、そのような範囲内の値及び整数の分数、並びにそのような範囲内の整数の分数を含む。したがって、例示のため、１〜１０などの数値範囲の言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等を含む。したがって、１〜５０の範囲という言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等、最大５０を含み、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５等を含む。

[0214]一連の範囲の言及は、一連の範囲内の異なる範囲の境界の値を合わせる範囲を含む。したがって、例示のため、例えば１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１，０００、１，０００〜１，５００、１，５００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００、３，０００〜３，５００、３，５００〜４，０００、４，０００〜４，５００、４，５００〜５，０００、５，５００〜６，０００、６，０００〜７，０００、７，０００〜８，０００、又は８，０００〜９，０００の一連の範囲の言及は、１０〜２０、１０〜５０、３０〜５０、５０〜１００、１００〜３００、１００〜１，０００、１，０００〜３，０００、２，０００〜４，０００、４，０００〜６，０００等の範囲を含む。

[0215]本発明は、通常肯定的な言語を使用して本明細書に開示され、多くの実施形態及び態様を記載する。本発明は、物質若しくは材料、方法ステップ及び条件、プロトコール、又は手順など、全体又は一部で特定の主題が除外される実施形態も特に含む。例えば、本発明のある特定の実施形態又は態様では、材料及び／又は方法ステップが除外される。したがって、本発明は通常、本発明が含まないものに関しては本明細書に示されないが、本発明において明確に除外されない態様は、本明細書に開示される。

[0216]本発明のいくつかの実施形態が記載されている。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者は、本発明の様々な変更及び改変を行い、様々な用途及び条件に適用することができる。したがって、以下の実施例は、例示を目的とするが、請求した本発明の範囲を制限しない。

実施例１
材料及び方法
リソソーム酵素及び関連バリアント発現ベクターの構築
[0217]ヒトＳＧＳＨ、ＴＰＰ１及びβ−ｇｌｕ遺伝子は、ヒトｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅され、ＡＡＶ骨格プラスミドにクローニングされた。ＳＧＳＨバリアントは、オーバーラップＰＣＲによって構築された。

リソーム酵素活性アッセイ
[0218]リソソーム酵素活性アッセイは、蛍光基質によって測定された。ＳＧＳＨ活性は、２段階プロトコールによって測定された（例えば、Ｋａｒｐｏｖａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ １９：２７８〜２８５頁（１９９６年）参照）。簡単に言うと、第１のステップは、３７℃で１７時間、２０μｌの４−メチルウンベリフェリル（ＭＵ）−αＧＩｃＮｓ基質（２９ｍＭバルビタール／酢酸緩衝液中５ｍＭ、ｐＨ６．５）との１０μｌの試料のインキュベーションを含んだ。第２のステップは、３７℃で２４時間、１０μｌのα−グルコシダーゼ（０．２％ ＢＳＡ中１０Ｕ／ｍｌ）との試料のインキュベーションを継続した。反応は、２００μｌのストップ緩衝液（０．０２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５００ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ１０．７）の添加によって終了された。４−ＭＵは標準として使用された。蛍光は励起３９０ｎｍ及び発光４６０ｎｍで測定された。

[0219]ＴＰＰ１活性は、以前に記載された方法の改変によってアッセイされた（例えば、Ｔｉａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１：６５５９〜６５７２頁（２００６年）；Ｋａｔｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７：３１３ｒａ１８０（２０１５年）参照）。簡単に言うと、１０μｌの試料は、３７℃で、９０μｌのＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ７−アミド−４−メチルクマリン基質（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中２５０μＭ、ｐＨ４．０、Ｓｉｇｍａ）とインキュベートされた。精製した組換えＴＰＰ１が標準として使用された（ニュージャージー州立大学のＰ．Ｌｏｂｅｌからのギフト）。プレートは、４６０ｎｍ発光フィルターで読み取られた。

[0220]β−ｇｌｕ活性は、基質として４−ＭＵ−β−Ｄ−グルクロニド（１００ｍＭ 酢酸緩衝液中１０ｍＭ、ｐＨ４．８、Ｓｇｉｍａ）とアッセイされた（例えば、Ｌｉｕら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２５：９３２１〜９３２７頁（２００５年）参照）。ストップ緩衝液（０．０２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５００ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ１０．７）が添加され、３７℃で１時間のインキュベーション後に反応は終了された。４−ＭＵは標準として使用された。蛍光は励起３９０ｎｍ及び発光４６０ｎｍで測定された。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリソソーム酵素分泌研究
[0221]低継代のＨＥＫ２９３細胞は、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で維持された。トランスフェクションの２４時間前、４×１０^４個の細胞が９６ウェルプレートの培地１００μｌに播種された。細胞は、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１００ｎｇのプラスミドによってトランスフェクトされた。トランスフェクションの設定時間後（異なる実験に基づき２４時間、４８時間、又は７２時間）、１００μｌの馴化培地が回収された。細胞は、１００μｌのライセート緩衝液（コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル、Ｒｏｃｈｅを含む通常の生理食塩水中０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）の添加によって収集された。可溶性のリソソーム酵素は、氷上で２回、２秒間の超音波処理によって細胞から放出された。不溶性の材料は、４℃で１５分間、２１×１０^３ｇでの遠心分離によって除去された。馴化培地又は細胞ライセートからの１０μｌの試料が酵素活性アッセイのために使用された。同じ試料はまた、ウェスタンブロット解析にも使用された。

ウェスタンブロット
[0222]細胞ライセート又は培地からの２０μｌの試料が、４〜１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードされ、０．４５μｍ ＰＶＤＦ膜に移された。一次抗体はマウス抗ＳＧＳＨ １：２０００（Ｓｈｉｒｅからのギフト）；二次抗体はＨＲＰ標識ヤギ抗マウス、１：２０，０００（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。ブロットは、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して現像され、画像のためにフィルムに曝露された。タンパク質定量は、ケミドック（ＣｈｅｍｉＤｏｃ）（商標）Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して行われた。

ＳＧＳＨ酵素取り込み研究
[0223]ヒトＭＰＳ ＩＩＩＡ線維芽細胞は、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で維持された。１×１０^５個の細胞が２４ウェルプレートに播種された。２４時間後、細胞が９０％コンフルエントに達すると、培地は、ｗｔＳＧＳＨ又はＳＧＳＨｖ４プラスミドによって、及びＭ６Ｐ（最終濃度１０ｍＭ）の非存在又は存在下でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞由来の、１００ｎｍｏｌ／１７時間／ｍｌのＳＧＳＨ活性を含有する３００μｌの馴化培地に交換された。６時間のインキュベーション後、馴化培地は除去され、細胞は、Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋を含む５００μｌのＨＢＳＳで３回洗浄された。細胞は、活性アッセイ又はウェスタンブロットのために回収及びプロセシングされた。同じ細胞は、免疫組織学のためにもプロセシングされた。

免疫蛍光顕微鏡
[0224]細胞は、Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋を含む５００μｌのＨＢＳＳで３回洗浄され、室温で１０分間、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定され、ブロッキングされ、室温で１時間、透過処理された（ＰＢＳ中１０％ヤギ血清及び０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）。細胞は、４℃で終夜、２％ヤギ血清を含有するＰＢＳ中マウス抗ＳＧＳＨ一次抗体（１：２００）と、次いで室温で１時間、Ａｌｅｘａコンジュゲート二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） １：２０００とインキュベートされた。細胞は、Ｆｌｕｏｅｏ−Ｇｅｌ封入剤（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってカバースリップされ、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって解析された。

動物、ＡＡＶベクター投与及び組織収集
[0225]Ｓｇｓｈ遺伝子座に自然発生的な変異を持つＢ６．Ｃｇ−Ｓｇｓｈ^{ｍｐｓ３ａ}／ＰｓｔＪ株のＭＰＳ ＩＩＩＡマウスは、ジャクソン研究所から購入され（例えば、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １１：９９〜１０３頁（２００１年）；Ｂｈａｕｍｉｋら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：１３８９〜１３９６頁（１９９９年）参照）、動物施設で維持され、認可されたＩＡＣＵＣプロトコールに従った。ｗｔＳＧＳＨ又はＳＧＳＨｖ４酵素をコードするＡＡＶ４ベクターは、ＨＥＫ２９３細胞での三重トランスフェクション及びＣｓＣｌ精製によって産生された。８週齢のＭＰＳ ＩＩＩＡマウス疾患（Ｓｇｓｈ^−／−）又はヘテロ接合体（Ｓｇｓｈ^＋／−）マウスは、イソフルランによって麻酔された。ＡＡＶベクター（５×１０^１０ｇｐ）は、側脳室に定位的に注射された（Ａ／Ｐ −２．１８−ｍｍ、Ｍ／Ｌ −２．９ｍｍ、Ｄ／Ｖ −３．５ｍｍ）。マウスは行動試験が完了した後、屠殺された。ＣＳＦは、解剖顕微鏡下で大槽を通るガラスキャピラリーによって収集された。ＣＳＦ収集後、マウスは冷ＰＢＳによって灌流され、脳領域が回収された。脳組織は、酵素活性アッセイのために２００μｌの氷冷ホモジナイゼーション緩衝液（コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル、Ｒｏｃｈｅを含む通常の生理食塩水中０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中でホモジナイズされた。

モリス水迷路
[0226]モリス水迷路は、以前に記載されたように実施された（例えば、Ｖｏｒｈｅｅｓ，Ｃ．Ｖ．＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｔ． Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １：８４８〜８５８頁（２００６年）参照）。簡単に言うと、直径１００ｃｍのプールは３／４まで水で満たされ、酸化チタン（ＩＶ）（Ｓｉｇｍａ）によって濁らせた。プールは、任意に象限に分けられた。透明なプラットフォームは、１つの象限（標的象限と名付けた）において水の表面の０．５ｃｍ下に置かれた。マウスは、アクイジションフェーズの５日間調べた。それらは、アクイジションフェーズ中の各日に４回の試験を与えられた。各試験では、マウスは壁に向かって水に放された。それらは、プラットフォームにたどり着くのに６０秒かかり、プラットフォームに１５秒滞在した。これが達成されなかった場合、それらはプラットフォームに誘導された。各試験において、プラットフォームを見つけ出までのレイテンシーが記録された。プローブ試験は６日目に実施された。プラットフォームは除去され、開始位置は標的の場所と反対の象限であった。試験の長さは６０秒であった。標的象限で費やした時間及び移動した距離が記録された。データは、Ａｎｙ−ｍａｚｅ行動トラッキングソフトウェア（ＡＮＹ−ｍａｚｅ）によって解析された。

実施例２
天然のＳＧＳＨは比較的分泌されない
[0227]トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）及びβ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕ）によるＳＧＳＨの分泌能を比較するため、ＨＥＫ２９３細胞は、組換えタンパク質コード配列以外は同一の発現プラスミドによってトランスフェクトされた（図２）。７２時間後、収集した培地及び細胞ライセート中のリソソーム酵素活性が解析された。図３に示したように、細胞ライセートと比較して２０％より少ないＳＧＳＨ活性が培地中で検出されたが、ＴＰＰ−１又はβ−ｇｌｕ発現細胞では、それぞれおよそ５０％及び７５〜８０％が分泌された。この発見は、ウェスタンブロットによるタンパク質の総レベルを評価する場合に反映された（図３）。

バリアントＳＧＳＨは、分泌及び取り込みの改善を示す
[0228]リソソーム酵素のマンノース又はＭ６Ｐの翻訳後修飾は、Ｎ結合オリゴ糖側鎖で起こる。ＳＧＳＨは、アミノ酸位置４１、１４２、１５１、２６４、及び４１３にＡｓｎ残基を許容するグリカンを有する、５つの潜在的なＮ−グリコシル化コンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を有する。５つのＳＧＳＨ酵素バリアントは、示したようにＡｓｎからＧｌｎに逐次的に置換されて（図４Ａ）構築され、それらの分泌及び取り込み特性が評価された。

[0229]ほとんどのＳＧＳＨバリアントは、野生型タンパク質と区別できず、１つのバリアントは酵素活性を喪失し（ＳＧＳＨｖ３）（図４Ｂ）、１つのバリアント、ＳＧＳＨｖ４は培地中でおよそ２倍のＳＧＳＨ活性のレベルを示した。さらに、ＳＧＳＨｖ４発現細胞は、細胞においてより低いレベルのＳＧＳＨ活性を示し；野生型がトランスフェクトされた細胞の約６０％であった。これらのデータは、ＳＧＳＨｖ４が分泌を改善し、同時にトランスフェクトされた細胞内でさらなるＳＧＳＨの過負荷を低減することを示す（図４Ｂ）。

[0230]ＨＥＫ２９３細胞は、野生型又はＳＧＳＨｖ４を発現するプラスミドによってトランスフェクトされ、培地及び細胞ライセート中の酵素活性及びタンパク質レベルは、２４、４８、及び７２時間後にモニターされ、時間的に酵素分泌をモニターした。ＳＧＳＨｖ４バリアント発現プラスミドによってトランスフェクトされた細胞は、野生型酵素を発現するプラスミドによってトランスフェクトされたものよりも全ての時間でより効率的にＳＧＳＨを分泌した。２４時間までは、ＳＧＳＨｖ４−トランスフェクト細胞の培地では野生型ＳＧＳＨ発現ベクターによってトランスフェクトされた細胞と比較してほぼ４倍の酵素があった（図５Ａ）。逆に、ＳＧＳＨ活性の細胞レベルは、全ての時点で、野生型ＳＧＳＨ発現細胞に対してＳＧＳＨｖ４発現細胞で低かった（図５Ｂ）。細胞ライセートのウェスタンブロットは、同様にＳＧＳＨｖ４発現細胞における前駆体ＳＧＳＨのレベルの低減も示し（図６Ａ、６Ｂ）、より多くの前駆体が、（野生型ＳＧＳＨ発現ベクターによって生じるように）保持及び成熟酵素にプロセシングされるよりも分泌されるという考えを支持した。前駆体と成熟形態の両方でのＳＧＳＨｖ４のより低い分子量は、おそらくＭ６Ｐ部位の喪失の結果としてリン酸化レベルの低下による。

ＳＧＳＨｖ４取り込みはＭ６ＰＲ非依存的である
[0231]遺伝子治療によるクロスコレクションの基本原理は、過剰発現する（形質導入された）細胞から酵素が効果的に分泌され、また、分泌された酵素は非形質導入細胞によってエンドサイトーシス（取り込み）されることを必要とする。そのため、ＭＰＳ ＩＩＩＡ患者の線維芽細胞における野生型及びＳＧＳＨｖ４の取り込みが解析された。野生型ＳＧＳＨ又はＳＧＳＨｖ４を発現するＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地が、６時間患者の線維芽細胞にアプライされ、次いで細胞は収集され、細胞ライセートにおける活性が評価された。驚くべきことに、ＳＧＳＨｖ４発現産物、Ｎ２６４Ｑは、野生型ＳＧＳＨと比較して患者の線維芽細胞によってより効果的に取り込まれ、ＳＧＳＨ Ｎ２６４Ｑの入力の＞６０％が細胞に入り、対して野生型ＳＧＳＨでは＜４０％であった（図７）。さらに、１０ｍＭ Ｍ６Ｐの存在下では、野生型ＳＧＳＨの取り込みはブロックされたが、Ｎ２６４Ｑはされなかった（図７）。重要なことに、野生型とＮ２６４Ｑ ＳＧＳＨの両方は成熟酵素にプロセシングされ、いったん内部移行され、リソソーム送達を支持する（図８Ａ、８Ｂ）。

ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４はｉｎ ｖｉｖｏでの治療特性を改善する
[0232]ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＧＳＨｖ４をＳＧＳＨと比較するため、ＭＰＳ ＩＩＩＡモデルマウスは、同じ用量で異なる導入遺伝子（ＡＡＶ．ＳＧＳＨ及びＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４）をコードするＡＡＶ４ベクターによって脳室内に注射された；マウスにおいて、ＡＡＶ４はもっぱら上衣細胞を標的化する（図９）（Ｄａｖｉｄｓｏｎら ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７：３４２８〜３４３２頁（２０００年）；Ｌｉｕら Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：９３２１〜９３２７頁（２００５年））。マウスは、隠れたプラットフォームを見つけ出すレイテンシーによって評価された空間学習により、行動遂行に関してモリス水迷路を使用して解析された（図１０）。ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４処置ＭＰＳ ＩＩＩＡマウスでは、５日目のレイテンシーは正常、ヘテロ接合体の同腹仔と等価であり、両群は未処置の疾患マウスよりも著しく良く遂行した。反対に、ＡＡＶ．ＳＧＳＨ処置マウスは、未処置の疾患マウスに類似していた（図１０）。ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４によって処置されたＭＰＳ ＩＩＩＡマウスはまた、標的象限で費やした時間及び移動した距離を評価する場合、それらのヘテロ接合体の同腹仔と類似して遂行したが、ＡＡＶ．ＳＧＳＨによって処置されたＭＰＳ ＩＩＩＡマウスは未処置の疾患マウスと類似して行動した（図１１Ａ、１１Ｂ）。データは、ＡＡＶ．ＳＧＳＨではなくＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４の脳室内注射が、ＭＰＳ ＩＩＩＡマウスの空間学習及び記憶障害を修正するのに十分であることを示す。

ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４処置によるＳＧＳＨ活性の上昇及び二次リソソーム酵素レベルの改善
[0233]ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４処置マウスのＣＳＦにおけるＳＧＳＨ活性は、ヘテロ接合体レベルの８０％に達し、ＡＡＶ４．ＳＧＳＨ処置マウスのおよそ２倍であった（図１２）。拡散の程度を評価するため、海馬、線条体、後頭皮質、及び小脳由来の試料は、解剖され、酵素活性を評価された。未処置のＭＰＳ ＩＩＩＡ組織は、約１〜４％のヘテロ接合体レベルを有する。ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４又はＡＡＶ．ＳＧＳＨによって処置されたＭＰＳ ＩＩＩＡマウスは、未処置のＭＰＳ ＩＩＩＡマウスと比較してＳＧＳＨ活性が増加したが、ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４処置マウスからの脳領域は、ＡＡＶ．ＳＧＳＨ処置マウスからの組織のおよそ２倍であった。ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４処置マウスにおけるＳＧＳＨ活性は、海馬、線条体、後脳皮質、及び小脳におけるヘテロ接合体レベルの、それぞれ３５％、１４．５％、１６％及び１４％であった（図１３）。

[0234]ＭＰＳ ＩＩＩＡマウスの脳においてβ−ｇｌｕ活性の著しい上昇があり、ＳＧＳＨ欠乏に副次的である（例えば、Ｂｈａｕｍｉｋら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：１３８９〜１３９６頁（１９９９年）参照）。ＭＰＳ ＩＩＩＡマウスのＣＳＦにおけるβ−ｇｌｕ活性は、ヘテロ接合体レベルの１６０％であり、ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４遺伝子移行後、ヘテロ接合体レベルの１２０％まで減少し、それに対してＡＡＶ．ＳＧＳＨ処置後のヘテロ接合体レベルは１４７％であった（図１４）。脳実質組織では、ＭＰＳ ＩＩＩＡマウスのβ−ｇｌｕ活性はヘテロ接合体マウスのものよりも著しく高く、海馬、線条体、後脳皮質、及び小脳におけるヘテロ接合体レベルの、それぞれ１８５％、２４２％、２３７％及び１９０％であった。ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４は、β−ｇｌｕ活性レベルを海馬及び線条体におけるヘテロ接合体レベルの１２０％及び１６６％に減少させ、それはＡＡＶ．ＳＧＳＨ処置マウスからの組織ライセートに見出されるものより著しく低かった（ヘテロ接合体レベルに対して、海馬では１６３％、線条体では２０７％）。ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４処置ＭＰＳ ＩＩＩＡマウスの後脳皮質及び小脳におけるβ−ｇｌｕ活性は、未処置のＭＰＳ ＩＩＩＡマウスと比較して減少され、ＡＡＶ．ＳＧＳＨ処置マウスよりも低かったが、互いに統計的に有意な差はなかった（図１５）。

実施例３
[0235]ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４は、ＭＰＳ ＩＩＩＡマウスの神経病理を緩和する。マウス（８週齢）は、ＡＡＶ．ＳＧＳＨ又はＡＡＶ．ＨＳＮｖ４を側脳室に注射された。動物は、１４週間後に屠殺され、神経病理学的な読み出しへの影響の解析のため組織が回収された。データは、図１６Ａ〜１６Ｄに示される。

実施例４
[0236]天然のＳＧＳＨは、十分に分泌されない。反対に、データは、改変ＳＧＳＨｖ４が細胞による分泌及び細胞取り込みの増加を示したことを示す。ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４はまた、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＮＳにおいて酵素レベルの上昇、及び実質組織における浸透の改善をもたらした。ＡＡＶ．ＳＧＳＨｖ４は、ＭＰＳ ＩＩＩＡマウスモデルにおいて行動障害の修正に関して非改変ＡＡＶ．ＳＧＳＨよりも優れていた。したがって、本明細書で例示したバリアントＳＧＳＨは１つ又は複数の以下の特性：細胞分泌の増強、ＣＮＳにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの体内分布の改善を示し、バイスタンダー細胞の取り込み及びクロスコレクションの改善を示した。さらに、ベータ−グルクロニダーゼ、別の可溶性リソソームヒドラーゼのリン酸化レベルはＳＧＳＨｖ４によって変更された。

[0237]例示的な野生型又は非改変／非バリアントＳＧＳＨが以下の配列番号１として示される：
10 20 30 40 50
MSCPVPACCA LLLVLGLCRA RPRNALLLLA DDGGFESGAYNNSAIATPHL
60 70 80 90 100
DALARRSLLF RNAFTSVSSC SPSRASLLTG LPQHQNGMYGLHQDVHHFNS
110 120 130 140 150
FDKVRSLPLL LSQAGVRTGI IGKKHVGPET VYPFDFAYTEENGSVLQVGR
160 170 180 190 200
NITRIKLLVR KFLQTQDDRP FFLYVAFHDP HRCGHSQPQYGTFCEKFGNG
210 220 230 240 250
ESGMGRIPDW TPQAYDPLDV LVPYFVPNTP AARADLAAQYTTVGRMDQGV
260 270 280 290 300
GLVLQELRDA GVLNDTLVIF TSDNGIPFPS GRTNLYWPGTAEPLLVSSPE
310 320 330 340 350
HPKRWGQVSE AYVSLLDLTP TILDWFSIPY PSYAIFGSKTIHLTGRSLLP
360 370 380 390 400
ALEAEPLWAT VFGSQSHHEV TMSYPMRSVQ HRHFRLVHNLNFKMPFPIDQ
410 420 430 440 450
DFYVSPTFQD LLNRTTAGQP TGWYKDLRHY YYRARWELYDRSRDPHETQN
460 470 480 490 500
LATDPRFAQL LEMLRDQLAK WQWETHDPWV CAPDGVLEEKLSPQCQPLHN
EL

以下の配列番号２に示される例示的なＣＭＶエンハンサー：
ｇｃｇｔｔａｃａｔａａｃｔｔａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｃｃａａｃｇａｃｃｃｃｃｇｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔａａｔｇａｃｇｔａｔｇｔｔｃｃｃａｔａｇｔａａｃｇｃｃａａｔａｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔｇｇａｇｔａｔｔｔａｃｇｇｔａａａｃｔｇｃｃｃａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｇｔｇｔａｔｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔａｃｇｃｃｃｃｃｔａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃａｔｔａｔｇｃｃｃａｇｔａｃａｔｇａｃｃｔｔａｔｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｔａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃｔａｃｇｔａｔｔａｇｔｃａｔｃｇｃｔａｔｔａｃｃａｔｇｇ

以下の配列番号３に示される例示的なＣＡＧプロモーター：

ＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＡＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＴＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡ

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［関連出願情報］
[0001]本特許出願は、２０１７年５月１２日に出願された米国特許出願第６２／５０５，４２３号の利点及び優先権を主張する。上記出願の全内容は、全文、表、及び図面を含み、参照により本明細書に明確に組み込まれる。

Claims (83)

1. スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）を哺乳動物の中枢神経系に送達する方法であって、前記哺乳動物において細胞が、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）バリアントを発現及び分泌するように、前記哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に接触する前記細胞に形質導入するのに効果的な、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）バリアントをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を、前記哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）に投与するステップを含む、方法。
2. スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）の発現又は機能の欠乏又は欠損によって引き起こされる哺乳動物の疾患を処置する方法であって、前記哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）に接触する細胞に形質導入するのに効果的な形で、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）バリアントをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を前記哺乳動物のＣＮＳに投与するステップを含み、前記疾患を処置するために前記細胞が前記スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）バリアントを発現及び分泌する、方法。
3. スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）を哺乳動物の中枢神経系に送達する方法であって、前記哺乳動物において細胞が、ＳＧＳＨバリアントを発現及び分泌するように、脳実質細胞又は前記哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に接触する細胞に形質導入するのに効果的な形で、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）バリアントをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を、前記哺乳動物の脳実質組織、クモ膜下腔、及び／又は髄腔内に投与するステップを含む、方法。
4. スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）の発現又は機能の欠乏又は欠損によって引き起こされる哺乳動物の疾患を処置する方法であって、脳実質細胞又は前記哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に接触する細胞に形質導入するのに効果的な形で、一対のＡＡＶ逆位末端反復配列の間に挿入されたスルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）バリアントをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を、前記哺乳動物の脳実質組織、クモ膜下腔、及び／又は髄腔内に投与するステップを含み、前記疾患を処置するために前記細胞が前記ＳＧＳＨバリアントを発現及び分泌する、方法。
5. 前記投与が脳室に対してである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶカプシドタンパク質を含み、前記核酸が一対のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に挿入される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ｒｈ７４、ＡＡＶ−ｒｈ１０及びＡＡＶ−２ｉ８ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドタンパク質、又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ｒｈ７４、ＡＡＶ−Ｒｈ１０若しくはＡＡＶ−２ｉ８ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシド配列と７０％若しくはそれ以上の同一性を有するカプシド配列からなる群に由来するか、又は当該群から選択される、請求項６に記載の方法。
8. ＩＴＲの対の１つ又は複数が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ｒｈ７４、ＡＡＶ−ｒｈ１０若しくはＡＡＶ−２ｉ８ ＩＴＲ、又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ｒｈ７４、ＡＡＶ−Ｒｈ１０若しくはＡＡＶ−２ｉ８ ＩＴＲ配列と７０％若しくはそれ以上の同一性を有するＩＴＲに由来するか、これを含むか、又はこれからなる、請求項６に記載の方法。
9. 前記核酸が発現調節エレメントをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記発現調節エレメントがプロモーターを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記発現調節エレメントがエンハンサーエレメントを含む、請求項９に記載の方法。
12. 前記発現調節エレメントが、ＣＭＶエンハンサー、チキンベータアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター及び／又は配列番号２に示されるＣＭＶエンハンサーと８０％若しくはそれ以上の同一性を有する配列及び／又は配列番号３に示されるＣＡＧプロモーターと８０％若しくはそれ以上の同一性を有する配列を含む、請求項９に記載の方法。
13. 前記核酸が、イントロン、フィラーポリヌクレオチド配列及び／若しくはポリＡシグナルのうちの１つ又は複数、又はそれらの組合せをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 複数のｒＡＡＶ粒子が投与される、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記ｒＡＡＶ粒子が約１×１０^６〜約１×１０^１８ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ｒＡＡＶ粒子が、前記哺乳動物１キログラムあたり約１×１０^７〜１×１０^１７、約１×１０^８〜１×１０^１６、約１×１０^９〜１×１０^１５、約１×１０^１０〜１×１０^１４、約１×１０^１０〜１×１０^１３、約１×１０^１０〜１×１０^１３、約１×１０^１０〜１×１０^１１、約１×１０^１１〜１×１０^１２、約１×１０^１２〜１×１０^１３、又は約１×１０^１３〜１×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与される、請求項１４に記載の方法。
17. 前記ｒＡＡＶ粒子が１×１０^６〜１×１０^１６ｖｇ／ｍｌの約０．５〜４ｍｌの用量で投与される、請求項１４に記載の方法。
18. 複数のＡＡＶ空カプシドを投与するステップをさらに含む、請求項６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記空ＡＡＶカプシドが、前記哺乳動物に投与されるｒＡＡＶ粒子と共に製剤化されている、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ＡＡＶ空カプシドが、１．０〜１００倍過剰量のｒＡＡＶベクター粒子と共に投与されるか、又は製剤化されている、請求項１８又は１９に記載の方法。
21. 前記ＡＡＶ空カプシドが、ｒＡＡＶ粒子に対して約１．０〜１００倍過剰量のＡＡＶ空カプシドと共に投与されるか、又は製剤化されている、請求項１８又は１９に記載の方法。
22. 前記送達又は投与が、脳室内注射及び／又は実質組織内注射を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記ｒＡＡＶ粒子を、前記哺乳動物の脳実質組織、クモ膜下腔、及び／又は髄腔内に投与又は送達するステップを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記脳室が側脳室を含む、請求項５又は２３に記載の方法。
25. 前記細胞が、脳室上皮、軟膜、内皮、脳室、髄膜、グリア細胞及び／又はニューロンを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記細胞が、前記ＳＧＳＨバリアントを前記哺乳動物のＣＮＳに分泌する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記細胞が、前記ＳＧＳＨバリアントを前記哺乳動物のＣＳＦに分泌する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記脳室上皮、軟膜、内皮、脳室、髄膜、グリア細胞及び／若しくはニューロンが、前記ＳＧＳＨバリアントを発現し、並びに／又は前記脳室上皮、軟膜、内皮、脳室、髄膜細胞、グリア細胞、及び／若しくはニューロンが、前記ＳＧＳＨバリアントを前記ＣＳＦに分泌する、請求項２７に記載の方法。
29. 前記ＣＮＳに対してＳＧＳＨバリアントの発現又はＳＧＳＨ機能の増加をもたらす、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記ｒＡＡＶ粒子が脳の単一箇所に注射される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記ｒＡＡＶ粒子が、脳の１〜５箇所に注射される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記ｒＡＡＶ粒子が、吻側側脳室；及び／又は尾側側脳室；及び／又は右側脳室；及び／又は左側脳室；及び／又は右吻側側脳室；及び／又は左吻側側脳室；及び／又は右尾側側脳室；及び／又は左尾側側脳室に投与される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記ｒＡＡＶ粒子が、前記哺乳動物の大槽脳室内腔、脳室、クモ膜下腔、髄腔内、又は脳室上皮のいずれかに単回又は多回用量で投与される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 正常なＳＧＳＨの発現の約５〜５０％の間までＳＧＳＨバリアントの発現を増加させる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 記載なし。
36. 記載なし。
37. 記載なし。
38. 記載なし。
39. 正常なＳＧＳＨの発現の５０％より高くまでＳＧＳＨバリアントの発現を増加させる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記哺乳動物における内在性ＳＧＳＨの欠損又は欠乏による認知障害又は欠損を阻害、減少、又は低減する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記哺乳動物における内在性ＳＧＳＨの欠損又は欠乏による認知機能喪失又は空間学習喪失を増加、改善、保存、回復、又は救出する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記哺乳動物の記憶障害又は欠損を増加、改善、保存、回復、又は救出する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 形質導入細胞によるＳＧＳＨバリアントの分泌が、配列番号１として示される非バリアントＳＧＳＨの分泌と比較して高くなる、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 非形質導入細胞によるＳＧＳＨバリアントの取り込みが、配列番号１として示される非バリアントＳＧＳＨの取り込みと比較して高くなる、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
45. 細胞における二次酵素の産生又は蓄積を阻害又は減少する、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記二次酵素が、ベータグルクロニダーゼである、請求項４５に記載の方法。
47. ニューロンの機能又は生存を増加、保存、回復、又は救出する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 皮質ニューロンの機能又は生存を増加、保存、回復、又は救出する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
49. 皮質運動ニューロンの機能又は生存を増加、保存、回復、又は救出する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
50. ニューロンの変性又は死を阻害、減少、又は防止する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
51. 皮質ニューロンの変性又は死を阻害、減少、又は防止する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
52. 皮質運動ニューロンの変性又は死を阻害、減少、又は防止する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
53. ＳＧＳＨ欠損又は欠乏の症状又は有害作用を改善、低減、又は減少する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
54. ＳＧＳＨ欠損又は欠乏の症状又は有害作用を安定化させる、その悪化を防止する、又は好転させる、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
55. 前記症状又は有害作用が、初期若しくは後期の症状；行動、人格若しくは言語症状；運動機能症状；及び／又は認知症状を含む、請求項５３又は５４に記載の方法。
56. 前記哺乳動物が非げっ歯類哺乳動物である、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
57. 前記非げっ歯類哺乳動物が霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、又はイヌである、請求項５６に記載の方法。
58. 前記非げっ歯類哺乳動物が霊長類である、請求項５６に記載の方法。
59. 前記霊長類がヒトである、請求項５７に記載の方法。
60. 前記ヒトが小児である、請求項５９に記載の方法。
61. 前記小児が約１歳〜約８歳である、請求項６０に記載の方法。
62. 前記哺乳動物、霊長類、又はヒトが内在性ＳＧＳＨの発現又は機能の喪失又は低減を示す、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
63. 前記哺乳動物、霊長類、又はヒトが、喪失又は低減したＳＧＳＨの発現又は機能に関して、ホモ接合体（Ｓｇｓｈ^−／−）又はヘテロ接合体（Ｓｇｓｈ^＋／−）である、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
64. 前記疾患がＳＧＳＨの発現又は機能の欠乏又は欠損によって引き起こされる、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
65. １つ又は複数の免疫抑制剤を投与するステップをさらに含む、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
66. 前記免疫抑制剤が前記ベクターの投与又は送達の前又はそれと同時に投与される、請求項６５に記載の方法。
67. 前記免疫抑制剤が抗炎症剤である、請求項６５に記載の方法。
68. 前記ＳＧＳＨバリアントが哺乳動物である、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
69. 前記ＳＧＳＨバリアントが、霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、又はイヌＳＧＳＨである、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
70. 前記ＳＧＳＨバリアントがヒトである、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
71. 前記ＳＧＳＨバリアントの形質導入細胞による分泌が、配列番号１として示される非バリアントＳＧＳＨと比較して高くなることを示す、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の方法。
72. 前記ＳＧＳＨバリアントの細胞による取り込みが、配列番号１として示される非バリアントＳＧＳＨの取り込みと比較して増加することを示す、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
73. 前記ＳＧＳＨバリアントの細胞による取り込みが、マンノース−６−リン酸受容体を必要としない、請求項７２に記載の方法。
74. 前記ＳＧＳＨバリアントが、ＣＮＳにおける非形質導入細胞に分配される、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
75. 前記ＳＧＳＨバリアントが、脳脊髄液（ＣＳＦ）によって非形質導入ＣＮＳ細胞に分配される、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
76. 前記ＳＧＳＨバリアントが、前記形質導入細胞と離れて位置する非形質導入ＣＮＳ細胞に分配される、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
77. 前記ＳＧＳＨが、前記ＣＮＳ細胞によって取り込まれる、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
78. 前記ＳＧＳＨバリアントが、配列番号１と少なくとも９０％同一である、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
79. 前記ＳＧＳＨバリアントが、配列番号１のバリアントを含む、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
80. 前記ＳＧＳＨバリアントが、２６４位にアミノ酸置換を有する配列番号１と少なくとも９０％同一である、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
81. 前記ＳＧＳＨバリアントが、２６４位にアスパラギン（Ｎ）からグルタミン（Ｑ）への置換を有する配列番号１と少なくとも９０％同一である、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
82. 前記ＳＧＳＨバリアントが、２６４位にアミノ酸置換を有する配列番号１を含む、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
83. 前記ＳＧＳＨバリアントが、２６４位にアスパラギン（Ｎ）からグルタミン（Ｑ）への置換を有する配列番号１を含む、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。