JP2022545378A - ＳＣＡ１の治療のための、導入遺伝子およびイントロン由来ｍｉＲＮＡを組み合わせた治療法 - Google Patents

Abstract

治療用タンパク質(例えばアタキシン-1様)の発現カセットと治療用抑制性RNA(例えば、アタキシン-1 mRNAを標的とするmiRNA)の発現カセットの両方を含む核酸が、本明細書において提供される。場合によっては、該治療用抑制性RNAの発現カセットは、該治療用タンパク質の発現カセットのイントロン内に存在する。該核酸を用いて脊髄小脳を治療する方法もまた提供される。TIFF2022545378000006.tif29169

Description

関連出願の参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる2019年8月15日に出願された米国特許仮出願第62/887,209号の優先権恩典を主張する。

配列表の参照
本出願は、EFS-Webを介してASCII形式で提出されたものであり、そっくりそのまま参照により本明細書に組み入れられる、配列表を含む。2020年8月12日に作成された前記ASCIIコピーは、CHOPP0036WO_ST25.txtと名付けられ、サイズは46.4キロバイトである。

1 分野
本開示は、全体として、分子生物学および医学の分野に関する。より具体的には、本開示は、治療用タンパク質および治療用抑制性RNAの両方を発現する核酸を疾患の治療において使用する方法に加えて、そのような核酸に関する。

2 関連技術の説明
脊髄小脳失調症1型(SCA1)は、9つのポリグルタミン(polyQ)伸長病のうちの1つであり、小脳および脳幹における小脳失調およびニューロン変性を特徴とする。これは、アタキシン-1タンパク質をコードするATXN1遺伝子における不安定なCAG伸長によって引き起こされる(Banfi et al., 1994; Orr et al., 1993)。アタキシン-1は、遍在的に発現され、小脳のプルキンエ細胞に多く認められる(Servadio et al., 1995)。患者の小脳組織の剖検後解析により、罹患したプルキンエ細胞および脳幹ニューロンだけでなく、大脳の罹患していないニューロンにおいても、アタキシン-1陽性核封入体が確認された(Currier et al., 1972, Jackson et al., 1977)。

罹患していないヒトでは、ATXN1には6～42個のCAGリピートがあり、ヒスチジンをコードするコドンであるCATが1～3個、ところどころに存在している。SCA1患者では、ATXN1におけるCAGリピート伸長は、39リピートを超えるまでに伸長して、アタキシン1タンパク質中に伸長したポリグルタミン(polyQ)ストレッチを生じさせる。疾患を引き起こすこの変異は、毒性の機能獲得メカニズムを介して作用し、その発現を抑制すると、疾患の進行が停止されるだけでなく疾患表現型も元に戻ると予想されている(Keiser et al., 2014; Keiser et al., 2013; Keiser et al., 2016; Oz et al., 2014; Oz et al., 2011; Xia et al., 2004; Zu et al., 2004)。しかし、現在のところ、この疾患に有効な治療戦略は存在しない。

概要
1つの態様において、ヒトアタキシン-1様(hAtxn1L)をコードする第1の発現カセットと、ヒトアタキシン-1 mRNAを標的とする抑制性RNAをコードする第2の発現カセットとを含む核酸分子が、本明細書において提供される。いくつかの局面において、ヒトアタキシン-1 mRNAを標的とする抑制性RNAをコードする第2の発現カセットは、ヒトアタキシン-1様(hAtxn1L)をコードする第1の発現カセットのイントロン内に存在する。いくつかの局面において、イントロンの5'末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド1364～1425と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である配列を有する、hATXN1Lの非コードエキソン2が隣接している。いくつかの局面において、イントロンの5'末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド1364～1425と同一の配列を有する、hATXN1Lの非コードエキソン2が隣接している。いくつかの局面において、イントロンの3’末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド2434～2550と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である配列を有する、hATXN1Lの非コードエキソン3が隣接している。いくつかの局面において、イントロンの3’末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド2434～2550と同一の配列を有する、hATXN1Lの非コードエキソン3が隣接している。

いくつかの局面において、抑制性RNAは、siRNA、shRNA、またはmiRNAである。いくつかの局面において、抑制性RNAは、miRNAである。いくつかの局面において、miRNAは、SEQ ID NO: 1の配列を含む。いくつかの局面において、miRNAは、SEQ ID NO: 1に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む。いくつかの局面において、miRNAには、ヒトmiRNAのフランキング配列が隣接していてよい。いくつかの局面において、miRNAには、miR30のフランキング配列が隣接していてよい。いくつかの局面において、miRNAの5’末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド1937～1970に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するmiR30 5’フランキング配列が隣接していてよい。いくつかの局面において、miRNAの5’末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド1937～1970と同一のmiR30 5’フランキング配列が隣接していてよい。いくつかの局面において、miRNAの3’’末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド2057～2098に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するmiR30 3’フランキング配列が隣接していてよい。いくつかの局面において、miRNAの3’末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド2057～2098と同一のmiR30 3’フランキング配列が隣接していてよい。

いくつかの局面において、抑制性RNAをコードする第2の発現カセットは、抑制性RNAコード配列に機能的に連結されているプロモーターを含む。いくつかの局面において、プロモーターは、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである。いくつかの局面において、プロモーターは、pol IIIプロモーターまたはU6プロモーターである。いくつかの局面において、プロモーターは、脳で発現されるmiRNAのためのプロモーターである。いくつかの局面において、プロモーターはmiR128プロモーターである。いくつかの局面において、プロモーターは、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド1754～1931の配列と少なくとも90％、95％、97％、98％、または99％同一である配列を有する。いくつかの局面において、プロモーターは、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド1754～1931の配列と同一の配列を有する。

ヒトアタキシン-1 mRNAを標的とする抑制性RNAをコードする第2の発現カセットが、ヒトアタキシン-1様(hAtxn1L)をコードする第1の発現カセットのイントロン内に存在する局面において、抑制性RNAは、プロモーターに機能的に連結されていなくてもよい。

いくつかの局面において、hAtxn1Lをコードする第1の発現カセットは、hAtxn1Lコード配列に機能的に連結されているプロモーターを含む。いくつかの局面において、プロモーターは、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである。いくつかの局面において、プロモーターは、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド194～1356の配列と少なくとも90％、95％、97％、98％、または99％同一である配列を有する。いくつかの局面において、プロモーターは、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド194～1356の配列と同一の配列を有する。

いくつかの局面において、第1の発現カセットおよび/または第2の発現カセットは、エンハンサーエレメントを含む。いくつかの局面において、第1の発現カセットおよび/または第2の発現カセットは、イントロン、フィラーポリヌクレオチド配列、ポリAシグナル、またはそれらの組合せを含む。

1つの態様において、本発明の態様のいずれか1つに記載の核酸を含む細胞が、本明細書において提供される。

1つの態様において、AAVカプシドタンパク質および本発明の態様のいずれか1つに記載の核酸分子を含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターが、本明細書において提供される。いくつかの局面において、AAVベクターは、AAVカプシドタンパク質を含むAAV粒子を含み、かつ第1の発現カセットおよび/または第2の発現カセットが、一対のAAV末端逆位配列(ITR)の間に挿入されている。いくつかの局面において、AAVカプシドタンパク質は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10、およびAAV-2i8のVP1、VP2、および/もしくはVP3カプシドタンパク質、または、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-Rh10、もしくはAAV-2i8のVP1、VP2、および/もしくはVP3カプシドタンパク質に対して70％もしくはそれより高い同一性を有するカプシドタンパク質からなる群に由来するか、またはそれより選択される。いくつかの局面において、一対のAAV ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10、もしくはAAV-2i8のITR、または、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-Rh10、もしくはAAV-2i8のITR配列に対して70％もしくはそれより高い同一性を有するITRに由来するか、それを含むか、またはそれからなる。

1つの態様において、その必要がある患者において脊髄小脳失調症(SCA)1型を治療する方法が、本明細書において提供され、該方法は、ヒトアタキシン-1様(hAtxn1L)をコードする第1の発現カセットおよびヒトアタキシン-1 mRNAを標的とする抑制性RNAをコードする第2の発現カセットを、患者に投与する段階を含む。いくつかの局面において、ヒトアタキシン-1様(hAtxn1L)をコードする第1の発現カセットおよびヒトアタキシン-1 mRNAを標的とする抑制性RNAをコードする第2の発現カセットは、両方とも、同じ核酸分子上に存在する。いくつかの局面において、ヒトアタキシン-1 mRNAを標的とする抑制性RNAをコードする第2の発現カセットは、ヒトアタキシン-1様(hAtxn1L)をコードする第1の発現カセットのイントロン内に存在する。いくつかの局面において、イントロンの5’末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド1364～1425と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である配列を有する、hATXN1Lの非コードエキソン2が隣接している。いくつかの局面において、イントロンの5’末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド1364～1425と同一の配列を有する、hATXN1Lの非コードエキソン2が隣接している。いくつかの局面において、イントロンの3’末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド2434～2550と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である配列を有する、hATXN1Lの非コードエキソン3が隣接している。いくつかの局面において、イントロンの3’末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド2434～2550と同一の配列を有する、hATXN1Lの非コードエキソン3が隣接している。

いくつかの局面において、抑制性RNAは、siRNA、shRNA、またはmiRNAである。いくつかの局面において、抑制性RNAは、miRNAである。いくつかの局面において、miRNAは、SEQ ID NO: 1の配列を含む。いくつかの局面において、miRNAは、SEQ ID NO: 1に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有する配列を含む。いくつかの局面において、miRNAには、ヒトmiRNAのフランキング配列が隣接していてよい。いくつかの局面において、miRNAには、miR30のフランキング配列が隣接していてよい。いくつかの局面において、miRNAの5’末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド1937～1970に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するmiR30 5’フランキング配列が隣接していてよい。いくつかの局面において、miRNAの5’末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド1937～1970と同一のmiR30 5’フランキング配列が隣接していてよい。いくつかの局面において、miRNAの3’’末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド2057～2098に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するmiR30 3’フランキング配列が隣接していてよい。いくつかの局面において、miRNAの3’末端には、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド2057～2098と同一のmiR30 3’フランキング配列が隣接していてよい。いくつかの局面において、抑制性RNAは、ヒトアタキシン-1の発現を減少させる。

いくつかの局面において、抑制性RNAをコードする第2の発現カセットは、抑制性RNAコード配列に機能的に連結されているプロモーターを含む。いくつかの局面において、プロモーターは、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである。いくつかの局面において、プロモーターは、pol IIIプロモーターまたはU6プロモーターである。いくつかの局面において、プロモーターは、脳で発現されるmiRNAのためのプロモーターである。いくつかの局面において、プロモーターはmiR128プロモーターである。いくつかの局面において、プロモーターは、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド1754～1931の配列と少なくとも90％、95％、97％、98％、または99％同一である配列を有する。いくつかの局面において、プロモーターは、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド1754～1931の配列と同一の配列を有する。

ヒトアタキシン-1 mRNAを標的とする抑制性RNAをコードする第2の発現カセットが、ヒトアタキシン-1様(hAtxn1L)をコードする第1の発現カセットのイントロン内に存在する局面において、抑制性RNAは、プロモーターに機能的に連結されていなくてもよい。

いくつかの局面において、hAtxn1Lをコードする第1の発現カセットは、hAtxn1Lコード配列に機能的に連結されているプロモーターを含む。いくつかの局面において、プロモーターは、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである。いくつかの局面において、プロモーターは、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド194～1356の配列と少なくとも90％、95％、97％、98％、または99％同一である配列を有する。いくつかの局面において、プロモーターは、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド194～1356の配列と同一の配列を有する。

いくつかの局面において、第1の発現カセットおよび/または第2の発現カセットは、エンハンサーエレメントを含む。いくつかの局面において、第1の発現カセットおよび/または第2の発現カセットは、イントロン、フィラーポリヌクレオチド配列、ポリAシグナル、またはそれらの組合せを含む。

いくつかの局面において、方法は、アタキシン-1の発現を低減させる。いくつかの局面において、方法は、小脳、深部小脳核、脳幹、および/または視床において、Atxn1 mRNAのレベルを少なくとも10％低下させる。いくつかの局面において、方法は、小脳、深部小脳核、脳幹、および/または視床において、Atxn1 mRNAのレベルを少なくとも10％～50％低下させる。

いくつかの局面において、第1の発現カセットおよび/または第2の発現カセットは、ウイルスベクター中に含まれる。いくつかの局面において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターより選択される。いくつかの局面において、AAVベクターは、AAVカプシドタンパク質を含むAAV粒子を含み、かつ第1の発現カセットおよび/または第2の発現カセットが、一対のAAV末端逆位配列(ITR)の間に挿入されている。いくつかの局面において、AAVカプシドタンパク質は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10、およびAAV-2i8のVP1、VP2、および/もしくはVP3カプシドタンパク質、または、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-Rh10、もしくはAAV-2i8のVP1、VP2、および/もしくはVP3カプシドタンパク質に対して70％もしくはそれより高い同一性を有するカプシドタンパク質からなる群に由来するか、またはそれより選択される。いくつかの局面において、一対のAAV ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10、もしくはAAV-2i8のITR、または、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-Rh10、もしくはAAV-2i8のITR配列に対して70％もしくはそれより高い同一性を有するITRに由来するか、それを含むか、またはそれからなる。

いくつかの局面において、複数のウイルスベクターが投与される。いくつかの局面において、ウイルスベクターは、約1×10⁶～約1×10¹⁸個のベクターゲノム/キログラム(vg/kg)の用量で投与される。いくつかの局面において、ウイルスベクターは、約1×10⁷～1×10¹⁷、約1×10⁸～1×10¹⁶、約1×10⁹～1×10¹⁵、約1×10¹⁰～1×10¹⁴、約1×10¹⁰～1×10¹³、約1×10¹⁰～1×10¹³、約1×10¹⁰～1×10¹¹、約1×10¹¹～1×10¹²、約1×10¹²～×10¹³、または約1×10¹³～1×10¹⁴vg/kg患者体重の用量で投与される。いくつかの局面において、ウイルスベクターは、1×10⁶～1×10¹⁶vg/mlを約0.5～4mlという用量で投与される。

いくつかの局面において、方法は、複数の空のウイルスカプシドを投与する段階をさらに含む。いくつかの局面において、空のウイルスカプシドは、患者に投与されるウイルス粒子とともに製剤化される。いくつかの局面において、空のウイルスカプシドは、ウイルスベクター粒子または空のウイルスカプシドが1.0～100倍過剰な状態で投与されるかまたは製剤化される。いくつかの局面において、空のウイルスカプシドは、空のウイルスカプシドに対してウイルスベクター粒子が1.0～100倍過剰な状態で投与されるかまたは製剤化される。いくつかの局面において、空のウイルスカプシドは、ウイルスベクター粒子に対して空のウイルスカプシドが約1.0～100倍過剰な状態で投与されるかまたは製剤化される。

いくつかの局面において、投与は、中枢神経系に対するものである。いくつかの局面において、投与は、脳に対するものである。いくつかの局面において、投与は、大槽、脳室内空間、上衣、脳室、くも膜下腔、および/または髄腔内空間に対するものである。いくつかの局面において、脳室は、吻側の側脳室、および/または尾側の側脳室、および/または右側脳室、および/または左側脳室、および/または吻側の右側脳室、および/または吻側の左側脳室、および/または尾側の右側脳室、および/または尾側の左側脳室である。いくつかの局面において、投与する段階は、脳室内注射および/または実質内注射を含む。いくつかの局面において、上衣細胞、軟膜細胞、内皮細胞、脳室細胞、髄膜細胞、グリア細胞、および/またはニューロンは、抑制性RNAおよび/またはヒトアタキシン-1様タンパク質を発現する。

いくつかの局面において、投与は、脳内の単一の部位におけるものである。いくつかの局面において、投与は、脳内の1～5個の部位におけるものである。

いくつかの局面において、方法は、脊髄小脳失調症(SCA)1型の有害症状を軽減する。いくつかの局面において、有害症状は、初期もしくは後期の症状;行動、人格、もしくは言語の症状;運動機能の症状;および/または認知症状を含む。いくつかの局面において、方法は、患者の記憶欠損、記憶障害、または認知機能を向上させるか、改善するか、維持するか、修復するか、またはレスキューする。いくつかの局面において、方法は、協調運動障害、緩慢な動作、または体のこわばりの悪化を改善または抑制または軽減または予防する。いくつかの局面において、方法は、けいれんまたは落着きのない動作の悪化を改善または抑制または軽減または予防する。いくつかの局面において、方法は、うつ状態または易刺激性の悪化を改善または抑制または軽減または予防する。いくつかの局面において、方法は、物を落とすこと、転倒、体の平衡を失うこと、発話困難、または嚥下困難の悪化を改善または抑制または軽減または予防する。いくつかの局面において、方法は、段取りする能力の悪化を改善または抑制または軽減または予防する。いくつかの局面において、方法は、運動失調または低下した反射能力の悪化を改善または抑制または軽減または予防する。いくつかの局面において、方法は、発作もしくは振戦発作または振戦の悪化を改善または抑制または軽減または予防する。

いくつかの局面において、患者はヒトである。

いくつかの局面において、方法は、1種類または複数種類の免疫抑制剤を投与する段階をさらに含む。いくつかの局面において、免疫抑制剤は、発現カセットの投与より前にまたは発現カセットの投与と同時に投与される。いくつかの局面において、免疫抑制剤は、抗炎症剤である。

本明細書において使用される場合、指定された構成要素の観点から「本質的に含まない」とは、指定された構成要素のうちの少しも、意図的に組成物中に配合されていないか、かつ/または混入物としてもしくは極微量でのみ存在することを意味するために、本明細書において使用される。したがって、意図的でない任意の組成物汚染に起因する、指定された構成要素の総量は、0.05％をかなり下回り、好ましくは0.01％未満である。指定された構成要素を標準的解析方法によってまったく検出することができない組成物が、最も好ましい。

本明細書の明細書部分において使用される場合、「1つの(a)」または「1つの(an)」は、1つまたは複数を意味してよい。本明細書の特許請求の範囲において使用されるように、単語「含む」とともに使用される場合、単語「1つの(a)」または「1つの(an)」は、1つまたは1つより多くを意味してよい。

特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替案のみを指すと明示的に記載されている場合および代替案が相互排他的である場合を除いて、「および/または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替案のみおよび「および/または」を指す定義を支持する。本明細書において使用される場合、「別の」は、少なくとも2つ目または3つ目以降を意味してよい。

本出願の全体を通して、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために使用される装置、方法に固有の誤差変動値、研究対象間に存在する差異、または提示された値との差が10％以内である値を含むことを示すため用いられる。

本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになると考えられる。しかし、本発明の精神および範囲を越えない様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者には明らかになると考えられるため、詳細な説明および個々の実施例は、本発明の好ましい態様を示すものの、例証として与えられるにすぎないことを理解すべきである。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに具体的に説明するために含まれる。本明細書において提示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つまたは複数を参照することにより、本発明をより良く理解することができる。
hATXN1Lイントロン2からのmiR128の発現。図1Aは、EF1αプロモーターの制御下のhATXN1L;イントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にあるhATXN1L; miR128を含むイントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にあるhATXN1L;およびmiR128プロモーターとともにmiR128を含むイントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にあるhATXN1Lについての構築物の図を示す。 hATXN1Lイントロン2からのmiR128の発現。図1Bは、HEK293細胞に一過性にトランスフェクトされた場合の構築物のスプライシングを示す。 hATXN1Lイントロン2からのmiR128の発現。図1Cは、構築物からの、成熟miRNAとしてのmiR128発現を示す。 hATXN1Lイントロン2からのmiR128の発現。図1Dは、構築物からのhATXN1Lの発現を示す。 hATXN1Lイントロン2からのmiS1の発現。図2Aは、EF1αプロモーターの制御下のhATXN1L;イントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にあるhATXN1L;miS1を含むイントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にあるhATXN1L;miR128プロモーターとともにmiS1を含むイントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にあるhATXN1L;およびEF1αプロモーターの直接的な制御下にあるmiS1についての構築物の図を示す。 hATXN1Lイントロン2からのmiS1の発現。図2Bは、構築物からのmiS1発現を示す。 hATXN1Lイントロン2からのmiS1の発現。図2Cは、構築物からのhATXN1L発現を示す。 hATXN1Lイントロン2からのmiS1の発現。図2Dは、構築物によるトランスフェクション後のhATXN1レベルを示す。 図3A～B。構築物の図。図3Aは、対照ベクターとしての、2つの末端逆位配列(ITR)間のEF1αプロモーター駆動型ヒトアタキシン-1様を示す。図3Bは、マウスU6プロモーター駆動型miRNA、すなわちmiS1、続いて、EF1αプロモーター駆動型ヒトアタキシン-1様を示す。対照のガイドウイルスも試験される。 B05 SCA1マウス投与試験の試験デザイン。 図5A～C。ロータロッド解析。図5Aは、4日間にわたる、12週齢でのベースラインのロータロッド成績を示す。凡例については図5Bを参照されたい。図5Bは、20週齢(注射後8週目)時点でのロータロッド成績を示す。図5Cは、各実験群について、12週時点と比べた20週時点のロータロッド成績の差を示す。*p<0.05;**p<0.005;***p<0.001。これは、二元配置ANOVAと、それに続くダネットの多重比較事後解析に基づいた。 図6A～C。処置されたB05マウスおよび未処置の野生型同腹仔から得た全小脳抽出物のqRT-PCR解析。図6Aは、miS1レベルについてのqRT-PCRを示す。図6Bは、ヒトATXN1 mRNAレベルについてのqRT-PCRを示す。図6Cは、ヒトATXN1L mRNAレベルについてのqRT-PCRを示す。試料は、注射後8週目に20週齢マウスから得た。***p<0.001;****p<0.0001。これは、生理食塩水と比較し、一元配置ANOVAと、それに続くダネットの多重比較事後解析に基づいた。 図7A～B。転写の調節不全を評価するための、処置されたB05マウスおよび未処置の野生型同腹仔から得た全小脳抽出物のqRT-PCR解析。図7Aは、マウスVegfa mRNAレベルについてのqRT-PCRを示す。図7Bは、マウスGrm1 mRNAレベルについてのqRT-PCRを示す。試料は、注射後8週目に20週齢マウスから得た。****p<0.0001。これは、野生型と比較し、一元配置ANOVAと、それに続くダネットの多重比較事後解析に基づいた。 図8A～B。神経膠症を評価するための、処置されたB05マウスおよび未処置の野生型同腹仔から得た全小脳抽出物のqRT-PCR解析。図8Aは、マウスGfap mRNAレベルについてのqRT-PCRを示す。図8Bは、マウスIba1 mRNAレベルについてのqRT-PCRを示す。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001。これは、生理食塩水と比較し、一元配置ANOVAと、それに続くダネットの多重比較事後解析に基づいた。 マウスのカピキュアレベルを評価するための、処置されたB05マウスおよび未処置の野生型同腹仔から得た全小脳抽出物のqRT-PCR解析。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001。これは、生理食塩水と比較し、一元配置ANOVAと、それに続くダネットの多重比較事後解析に基づいた。 図10A～F。インビボでの導入遺伝子のプロセシングおよび有効性を評価するための、処置されたB05マウスおよび未処置の野生型同腹仔から得た全小脳抽出物のqRT-PCR解析。図10Aは、miS1発現についてのqRT-PCRを示す。図10Bは、ヒトATXN1 mRNAレベルについてのqRT-PCRを示す。図10Cは、ヒトATXN1L mRNAレベルについてのqRT-PCRを示す。図10Dは、ヒトATXN1L mRNAレベルと比較したmiS1発現を示す。図10Eは、マウスGfap mRNAレベルについてのqRT-PCRを示す。図10Fは、マウスIba1 mRNAレベルについてのqRT-PCRを示す。注射なしの場合と比較して、*p<0.05。いずれの群もn=4～6。

詳細な説明
SCA1発病の背景にある細胞メカニズムおよび分子メカニズムをもっと明確にするためには、動物研究が極めて重要であった(Bowman et al., 2007; Cvetanovic et al., 2007; Lai et al., 2011; Lam et al., 2006; Lambrechts & Carmeliet, 2006; Lim et al., 2008; Morrison, 2009; Orr, 2012; Rodriguez-Lebron et al., 2013; Serra et al., 2004; Serra et al., 2006; Tsuda et al., 2005; Zoghbi & Orr, 2009)。この機能獲得疾患は、疾患対立遺伝子の発現を低減するためのアプローチの恩恵を受ける。例えば、ドキシサイクリン誘導性のトランスジェニックマウスSCA1モデルから、持続的発現後12週目に変異タンパク質産生を抑制すると病状および行動の障害が有意に改善することが実証された(Zu et al., 2004)。

RNA干渉(RNAi)は、遺伝子サイレンシングを実現する天然に存在するプロセスであり、SCA1などの優性疾患の治療法として現在研究されている。アタキシン-1 mRNAを対立遺伝子非特異的にサイレンシングすることによるRNAi療法は、症状を示すSCA1マウスに治療的利益をもたらす(あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられるKeiser et al., 2013)。さらに、アタキシン-1を標的とするミクロRNA(miRNA)(miS1)をコードするアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを、症状を示すSCA1トランスジェニックマウスの小脳に12週齢時に送達すると、20週齢になるまでに神経病理学的表現型および運動表現型が用量依存的に元に戻った(あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書にそれぞれ組み入れられる、Keiser et al., 2016;米国特許出願公開第2018/0169269号;米国特許出願公開第2019/0071671号)。しかし、最高レベルの用量で処置した結果、qPCRによればヒトアタキシン-1がほぼ完全に消失したが、運動表現型も神経症状も改善しなかった。さらに、最高レベルの用量群は、毒性を伴った。最高レベルの用量群の毒性の原因は、i)ウイルスカプシドが多すぎること、ii)miS1の高発現が原因で、細胞中の内因性RNAi経路が阻害されること、またはiii)これらの2つの因子の組合せであると推測された。SCA1マウスモデルでは、2種類のmiRNAが、調節異常になっている: miR-124aが減少し、miR150が増加している。以前に行われたRNAi用量1×10⁹での研究では、miR150レベルおよびその標的の回復が示された(Adlakha & Saini, 2014; Rodriguez-Lebron et al. , 2013)。最高レベルの用量のAAV.miS1(2.6×10¹⁰vgおよび8×10¹⁰vg)を与えられたマウスは、miR-124aおよびmiR-150の発現低下を示したことから、内因性RNAiの仕組みが飽和状態にあることが示唆された。最後に、最高レベルの用量群に似たレベルで空のカプシドのみを注射されたマウスでは、ミクログリアおよびアストログリアの活性化が強まっていた。まとめると、これらの研究から、人工miRNA発現のレベルだけでなく、ウイルス量を減少させようとする試みも調査すべきであることが裏付けられている。RNAiのプロモーターを変更することは、これを実現するための1つの方法であるが(Boudreau et al., 2009)、治療濃度域をさらに広くするための方法が必要とされている。

RNAi方法の代替手段として、AAV送達によってヒトアタキシン-1様を外因的に過剰発現させたところ、RNAiによるアタキシン-1のノックダウンと同程度まで、B05トランスジェニックSCA1マウスにおいて、疾患表現型が予防され、神経保護効果が実証された(Keiser et al., 2013)。アタキシン-1様トランスジェニック対立遺伝子の遺伝子過剰発現を通じて疾患を調節することにより、SCA1ノックインマウス(154Q)の疾患表現型が改善することも実証されている(Bowman et al., 2007)。ATXN1L過剰発現に基づく治療法のメカニズムは、アタキシン-1様、アタキシン-1、およびポリグルタミンが伸長した変異アタキシン-1のどれもが、AXHドメインを介してカピキュアと相互作用することである(Lam et al., 2006; Lim et al., 2008)。興味深いことに、ATXN1Lは、ポリグルタミン領域を有していないが、インビトロで過剰発現された場合には、変異アタキシン-1とカピキュアとの、疾患を誘導する相互作用と効果的に競合することができる(Bowman et al., 2007)。

疾患タンパク質(例えば、毒性の変異アタキシン-1)の発現を抑制するための遺伝子サイレンシング配列(例えばmiRNA)と疾患保護効果をもたらすタンパク質(例えばアタキシン-1様)の過剰発現との両方の発現を実現する単一構築物が、本明細書において提供される。このような構築物を用いて、組み合わせられた治療的利益を低用量で実現し、それによって、多量のウイルス送達の必要性および付随する毒性を低減させる方法もまた、提供される。

本明細書において提供される1つの構築物は、miR128を含むイントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にある、hATXN1Lであり、これはSEQ ID NO: 4で提供される。本明細書において提供される1つの構築物は、miR128プロモーターとともにmiR128を含むイントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にある、hATXN1Lであり、これはSEQ ID NO: 5で提供される。本明細書において提供される1つの構築物は、miS1を含むイントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にある、hATXN1Lであり、これはSEQ ID NO: 6で提供される。本明細書において提供される1つの構築物は、miR128プロモーターとともにmiS1を含むイントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にある、hATXN1Lであり、これはSEQ ID NO: 7で提供される。

I 抑制性RNA
「RNA干渉(RNAi)」は、siRNAによって開始される、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。RNAiの際、siRNAは標的mRNAの分解を誘導し、その結果、遺伝子発現を配列特異的に阻害する。

「抑制性RNA」、「RNAi」、「低分子干渉RNA」もしくは「短鎖干渉RNA」もしくは「siRNA」分子、「ショートヘアピンRNA」もしくは「shRNA」分子、または「miRNA」は、関心対象の核酸配列を標的とする、ヌクレオチドのRNA二重鎖である。本明細書において使用される場合、用語「siRNA」は、shRNAおよびmiRNAといった部分集団を包含する一般用語である。「RNA二重鎖」は、RNA分子の2つの領域の相補的対合によって形成される構造体を意味する。siRNAは、ある遺伝子を「標的として」おり、これは、siRNAの二重鎖部分のヌクレオチド配列が、標的とされる該遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であることによる。特定の態様において、siRNAは、ハンチンチンをコードする配列を標的とする。いくつかの態様において、siRNAの二重鎖の長さは、30塩基対未満である。いくつかの態様において、二重鎖は、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、または10塩基対長であることができる。いくつかの態様において、二重鎖の長さは、19～25塩基対長である。特定の態様において、二重鎖の長さは、19または21塩基対長である。siRNAのRNA二重鎖部分は、ヘアピン構造の一部分であることができる。二重鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二重鎖を形成する2つの配列の間に位置するループ部分を含んでもよい。ループの長さは様々であってよい。いくつかの態様において、ループは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチド長である。特定の態様において、ループは、18ヌクレオチド長である。ヘアピン構造はまた、3′オーバーハング部分および/または5′オーバーハング部分も含むことができる。いくつかの態様において、オーバーハングは、0、1、2、3、4、または5ヌクレオチド長の3'オーバーハングおよび/または5'オーバーハングである。

shRNAは、5′フランキング領域、siRNA領域セグメント、ループ領域、3′siRNA領域、および3′フランキング領域を含むように設計されているステムループ構造から構成される。ほとんどのRNAi発現戦略は、polIIIベースの強力なプロモーターによって駆動されるショートヘアピンRNA(shRNA)を利用してきた。多くのshRNAが、インビトロおよびインビボでの標的配列の効果的なノックダウンを示したが、標的遺伝子の効果的なノックダウンを示すいくつかのshRNAは、インビボで毒性を有することも判明した。

miRNAは、ステムループ転写物前駆体からプロセシングされる、小さな細胞RNA(約22nt)である。公知のmiRNAステムループを、関心対象の遺伝子に特異的なRNAi配列を含むように改変することができる。miRNAは内因的に発現されるため、miRNA分子の方がshRNA分子より好ましい場合がある。したがって、miRNA分子は、dsRNA応答性のインターフェロン経路を誘導する見込みは低く、shRNAよりも効率的にプロセシングされ、かつshRNAよりも80％効果的にサイレンシングすることが示されている。

最近発見された代替えのアプローチは、人工miRNA(siRNA配列間を行き来するプリmiRNAスキャフォルド)をRNAiベクターとして使用するものである。人工miRNAは、内因性RNAi基質にさらに自然に似ており、(例えば、RNAiの組織特異的発現を可能にする)Pol-II転写および(例えば、複数のsiRNA配列の送達を可能にする)ポリシストロニック戦略に、よりなじみやすい。参照により組み入れられる米国特許第10,093,927号を参照されたい。

「shRNA」の転写単位は、対になっていないヌクレオチドのループによって連結されているセンス配列およびアンチセンス配列から構成されている。shRNAは、エクスポーチン-5によって核から搬出され、いったん細胞質に入ると、ダイサーによってプロセシングされて機能的siRNAを生じる。「miRNA」ステムループは、対になっていないヌクレオチドのループによって連結されているセンス配列およびアンチセンス配列から構成されており、典型的には、より大きな一次転写物(プリmiRNA)の一部として発現される。プリmiRNAがドローシャ-DGCR8複合体によって切断されて、プレmiRNAとして公知の中間体が生じ、続いて、プレmiRNAがエクスポーチン-5によって核から搬出され、いったん細胞質に入ると、ダイサーによってプロセシングされて機能的siRNAを生じる。本明細書において同義的に使用される「人工miRNA」または「人工miRNAシャトルベクター」とは、ドローシャおよびダイサーによるプロセシングによって切り出される二重鎖ステムループ中の一領域(少なくとも約9～20ヌクレオチド)が、標的遺伝子に対するsiRNA配列で置換されているが、有効なドローシャプロセシングに必要な構造エレメントをステムループ内に保持している、一次miRNA転写物を意味する。用語「人工」は、フランキング配列(約35ヌクレオチド上流および約40ヌクレオチド下流)が、siRNAのマルチクローニング部位内の制限酵素部位から生じることに起因する。本明細書において使用される場合、用語「miRNA」は、天然に存在するmiRNA配列と人工的に作製されるmiRNAシャトルベクターの両方を包含する。

siRNAは、ある核酸配列によってコードされてよく、該核酸配列は、プロモーターも含んでよい。この核酸配列はまた、ポリアデニル化シグナルも含んでよい。いくつかの態様において、ポリアデニル化シグナルは、合成の最小ポリアデニル化シグナルまたは6個のTからなる配列である。

RNAiの設計にあたって、考慮に入れる必要がある因子がいくつかあり、例えば、siRNAの性質、サイレンシング効果の持続性、および送達系の選択である。RNAi効果をもたらすために、生物に導入されるsiRNAは、典型的にはエキソン配列を含む。さらに、RNAiプロセスは相同性に依存し、したがって、遺伝子特異性を最大化しつつ、相同であるが遺伝子特異的ではない配列間の交差干渉が起こる可能性を最小化するように、慎重に配列を選択しなければならない。好ましくは、siRNAは、siRNAの配列と阻害しようとする遺伝子との間に、80％より高い、85％、90％、95％、98％、またはさらには100％の同一性を示す。標的遺伝子に対する同一性が約80％より低い配列は、有効性が実質的に低い。したがって、siRNAと阻害しようとする遺伝子との相同性が高いほど、無関係な遺伝子の発現が影響を受ける可能性は低くなる。

さらに、siRNAのサイズも、考慮すべき重要な事柄である。いくつかの態様において、本発明は、少なくとも約19～25ヌクレオチドを含み、かつ遺伝子発現を調整する能力を有するsiRNA分子に関する。本発明において、siRNAの長さは、好ましくは、500、200、100、50、または25ヌクレオチドより短い。より好ましくは、siRNAの長さは、約19ヌクレオチド～約25ヌクレオチドである。

通常、siRNA標的とは、あるポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチド、あるいは複製、転写、もしくは翻訳、または該ポリペプチドの発現にとって重要な他のプロセスを調節するポリヌクレオチド領域、あるいはポリペプチドをコードする領域とそれに機能的に連結されて発現を調節する領域との両方を含むポリヌクレオチドを意味する。細胞内で発現される任意の遺伝子を、標的とすることができる。好ましくは、標的遺伝子は、疾患にとって重要であるかもしくは研究対象として特に関心の対象である細胞活動の進行に、関与しているかまたは関連している遺伝子である。

II 投与方法
任意の適切な細胞または哺乳動物は、本明細書において説明される方法もしくは使用によって投与されるか、または処置されてよい。典型的には、哺乳動物は、本明細書において説明される方法を必要としており、疾患状態に関連している正常ではないもしくは異常なタンパク質を有するか、または発現すると推測される。

哺乳動物の非限定的な例には、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、およびマカクなど)、ペット(例えば、イヌおよびネコ)、農場動物(例えば、ウマ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ)、ならびに実験動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット)が含まれる。特定の態様において、哺乳動物はヒトである。特定の態様において、哺乳動物は、げっ歯動物ではない哺乳動物(例えば、ヒト、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、またはイヌなど)である。特定の態様において、げっ歯動物ではない哺乳動物は、ヒトである。哺乳動物は、任意の年齢または任意の発達段階(例えば、成人、十代の若者、子供、幼児、または子宮内の哺乳動物)であってよい。哺乳動物は、雄または雌であることができる。特定の態様において、哺乳動物は、動物疾患モデル、例えば、疾患状態に関連している正常ではないもしくは異常なタンパク質を有するか、または発現する動物モデル、あるいはあるタンパク質の発現が不十分であり、それが原因で疾患状態を引き起こす動物モデルであることができる。

本明細書において説明される方法または組成物によって処置される哺乳動物(対象)には、成人(18歳またはそれより年上)および子供(18歳未満)が含まれる。成人には高齢者が含まれる。代表的な成人は、50歳またはそれより年上である。子供の年齢は、1～2歳、または2～4歳、4～6歳、6～18歳、8～10歳、10～12歳、12～15歳、および15～18歳の範囲に渡る。子供には、乳児も含まれる。乳児の年齢は、典型的には1～12ヶ月の範囲である。

特定の態様において、方法は、本明細書において説明するように哺乳動物に複数のウイルス粒子またはナノ粒子を投与する段階を含み、その際、神経変性疾患などの疾患状態についての1種類または複数種類の症状の重症度、頻度、進行、または発症時期が、低下するか、低減されるか、予防されるか、抑制されるか、または遅らされる。特定の態様において、方法は、神経変性疾患などの疾患状態の有害症状を処置するために哺乳動物に複数のウイルス粒子またはナノ粒子を投与する段階を含む。特定の態様において、方法は、神経変性疾患などの疾患状態を安定させるか、その悪化もしくは進行を遅らせるもしくは防ぐか、またはその有害症状を改善するために、哺乳動物に複数のウイルス粒子またはナノ粒子を投与する段階を含む。

特定の態様において、方法は、本明細書において説明するように哺乳動物の中枢神経系またはその一部分に複数のウイルス粒子またはナノ粒子を投与する段階を含み、神経変性疾患などの疾患状態についての1種類または複数種類の症状の重症度、頻度、進行、または発症時期が、低下するか、低減されるか、予防されるか、抑制されるか、または少なくとも約5～約10、約10～約25、約25～約50、もしくは約50～約100日、遅らされる。

特定の態様において、症状または有害作用は、初期、中期、もしくは後期の症状;行動、人格、もしくは言語の症状;嚥下、運動、痙攣、振戦、もしくはそわそわする症状;運動失調;および/または認知症状、例えば記憶力、段取りする能力を含む。

いくつかの態様において、ウイルスを用いる遺伝子移入法およびウイルスを用いない遺伝子移入法を使用して、哺乳動物細胞または標的組織に核酸を導入することができる。このような方法を用いて、培養中の細胞または宿主生物中の細胞に、抑制性RNAおよび/または治療用タンパク質をコードする核酸を投与することができる。非ウイルスベクター送達系には、DNAプラスミド、RNA(例えば、本明細書において説明されるベクターの転写物)、裸の核酸、およびリポソームのような送達ビヒクルと複合体を形成した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系には、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは統合されたゲノムのいずれかを有する、DNAウイルスおよびRNAウイルスが含まれる。遺伝子療法手順の概要については、Anderson, 1992; Nabel & Feigner, 1993; Mitani & Caskey, 1993; Dillon, 1993; Miller, 1992; Van Brunt, 1988; Vigne, 1995; Kremer & Perricaudet, 1995; Haddada et al., 1995;およびYu et al., 1994を参照されたい。

ウイルスを用いない核酸送達の方法には、エキソソーム、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロゾーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質と核酸との結合体、裸DNA、人工ウイルス粒子、および作用物質によって強化されたDNA取込みが含まれる。リポフェクションは、（例えば、米国特許第5,049,386号、同第4,946,787号、および同第4,897,355号）において説明されており、リポフェクション試薬は市販されている(例えば、Transfectam(商標)およびLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性脂質および中性脂質には、Feigner、WO 91117424、WO 91116024のものが含まれる。送達は、細胞(例えば、インビトロ投与もしくはエクスビボ投与)または標的組織(例えばインビボ投与)に対してでよい。

いくつかの態様において、送達は、核酸を送達するためのRNAウイルスベースの系またはDNAウイルスベースの系の使用を介する。いくつかの局面において、ウイルスベクターは、患者に直接投与されてもよく(インビトロ)、またはウイルスベクターは、インビトロもしくはエクスビボで細胞を処置するために使用され、次いで患者に投与され得る。いくつかの態様において、ウイルスベースの系には、遺伝子移入のための、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルスのベクターが含まれる。

用語「ベクター」は、小型のキャリヤー核酸分子、プラスミド、ウイルス(例えば、AAVベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター)、または核酸の挿入もしくは組入れによって操作できる他の運搬体を意味する。ウイルスベクターのようなベクターを用いて、核酸配列を細胞に導入/移入することができ、その結果、ベクター中の核酸配列が転写され、タンパク質をコードする場合には、続いて細胞によって翻訳される。

「発現ベクター」は、宿主細胞での発現に必要とされる必要な調節領域を有する遺伝子または核酸配列を含む、特殊なベクターである。発現ベクターは、細胞内で増殖するための少なくとも1つの複製起点、ならびに任意で付加的なエレメント、例えば、異種核酸配列、発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー)、イントロン、ITR、およびポリアデニル化シグナルを含んでよい。

ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む1つもしくは複数の核酸エレメントに由来するか、またはそれをベースとする。例示的なウイルスベクターには、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターが含まれる。

用語「組換え」は、組換えウイルス、例えば、レンチウイルスまたはパルボウイルス(例えばAAV)ベクターなどのベクターの修飾語として、ならびに組換え核酸配列および組換えポリペプチドなど配列の修飾語として、それらの組成物が、通常は自然界に存在しない様式で操られている(すなわち操作されている)ことを意味する。組換えベクターの具体例、例えば、AAVベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターは、野生型ウイルスゲノム中に普通は存在しない核酸配列がウイルスゲノム内に挿入されているものである。組換え核酸配列の一例は、遺伝子がウイルスゲノム内では伴っていることが普通である5'領域、3'領域、および/またはイントロン領域の有無に関わらず、ある核酸(例えば遺伝子)が、ベクター中にクローニングされる抑制性RNAをコードするものである。用語「組換え」は、ウイルスベクターなどのベクターおよびポリヌクレオチドなどの配列に関して本明細書において常に使用されるとは限らないが、核酸配列、ポリヌクレオチド、導入遺伝子などを含む「組換え」型は、任意のそのような省略にもかかわらず、明確に含まれる。

組換えウイルス「ベクター」は、分子的方法を用いてウイルスから野生型ゲノムを除去し、かつ非天然の核酸、例えば核酸配列で置換することにより、AAV、レトロウイルス、またはレンチウイルスなどのウイルスの野生型ゲノムから導き出される。典型的には、例えばAAVの場合、AAVゲノムの一方または両方の末端逆位配列(ITR)が、組換えAAVベクター中で保持されている。「組換え」ウイルスベクター(例えばrAAV)は、ウイルス(例えばAAV)ゲノムと区別される。これは、ウイルスゲノムの全部または一部が、ウイルスゲノム核酸に対して非天然の配列、例えば、トランス活性化因子をコードする核酸もしくは抑制性RNAをコードする核酸または治療用タンパク質をコードする核酸で置換されているからである。したがって、このような非天然核酸配列の組入れによって、ウイルスベクターは「組換え」ベクターと定義され、AAVの場合は「rAAVベクター」と呼ぶことができる。

A アデノ随伴ウイルス
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、パルボウイルス科の小型非病原性ウイルスである。これまで、血清学的に異なる多数のAAVが同定されており、十数種を超えるAAVが、ヒトまたは霊長類から単離されている。AAVは、複製の際にヘルパーウイルスに頼る点が、この科の他のメンバーとは異なる。

AAVゲノムは、宿主細胞ゲノムと一体化せずに染色体外の状態で存在し;広宿主域を有し;インビトロおよびインビボで分裂細胞と非分裂細胞の両方に形質導入し、かつ形質導入遺伝子の高レベルの発現を維持することができる。AAVウイルス粒子は、熱安定性であり;溶媒、界面活性剤、pH変化、および温度に耐性であり;かつカラム精製し、かつ/またはCsCl勾配もしくは他の手段を用いて濃縮することができる。AAVゲノムは、ポジティブセンスまたはネガティブセンスいずれかの、一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)を含む。AAVの約5kbのゲノムは、プラスの方向性またはマイナスの方向性のいずれかを有する一本鎖DNAの1つのセグメントからなる。このゲノムの両端は、折り畳まってヘアピン構造になりウイルスDNA複製の起点の役割を果たすことができる、短い末端逆位配列(ITR)である。

AAV「ゲノム」とは、最終的にパッケージングされるかまたは封入されてAAV粒子を形成する組換え核酸配列を意味する。AAV粒子は、AAVカプシドタンパク質によってパッケージングされたAAVゲノムをしばしば含む。組換えプラスミドを用いて組換えベクターが構築または製造される場合、AAVベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない、「プラスミド」の部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、「プラスミドバックボーン」と呼ばれ、これは、増殖および組換えウイルス生産に必要なプロセスである、プラスミドのクローニングおよび増幅にとって重要であるが、それ自体はウイルス粒子中にパッケージングも封入もされない。したがって、AAVベクター「ゲノム」とは、AAVカプシドタンパク質によってパッケージングされるかまたは封入される核酸を意味する。

AAVビリオン(粒子)は、エンベロープを持たない、直径約25nmの二十面体粒子である。AAV粒子は、関連がある3種類のカプシドタンパク質、すなわちVP1、VP2、およびVP3から構成される二十面体の対称物を含み、これらのカプシドタンパク質は、共に相互作用してカプシドを形成する。右のORFは、カプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3をコードすることが多い。これらのタンパク質は、それぞれ1:1:10の比で存在することが多いが、異なる比で存在してもよく、かついずれも、右側のORFに由来する。VP1、VP2、およびVP3カプシドタンパク質は、選択的スプライシングおよび独特な開始コドンの使用により、互いに異なる。欠失解析により、選択的にスプライシングされたメッセージから翻訳されるVP1を除去または変更すると、感染性粒子の生産量が減ることが示されている。VP3コード領域内で変異が起こると、任意の一本鎖子孫DNAまたは感染性粒子が生産しなくなる。

AAV粒子は、AAVカプシドを含むウイルス粒子である。特定の態様において、AAV粒子のゲノムは、VP1、VP2、およびVP3ポリペプチドの1つ、2つ、またはすべてをコードする。

大半の天然AAVのゲノムは、左ORFおよび右ORFと呼ばれることがある2つのオープンリーディングフレーム(ORF)をしばしば含む。左ORFは、多くの場合、非構造的Repタンパク質、すなわちRep40、Rep52、Rep68、およびRep78をコードし、これら非構造的Repタンパク質は、一本鎖子孫ゲノムの生産に加えて、複製および転写の調節に関与している。Repタンパク質のうちの2種類は、ヒト染色体19のqアームの一領域へのAAVゲノムの優先的組込みに関連付けられている。Rep68/78は、NTP結合活性ならびにDNAヘリカーゼ活性およびRNAヘリカーゼ活性を有していることが示されている。いくつかのRepタンパク質は、核移行シグナルならびにいくつかの潜在的なリン酸化部位を有する。特定の態様において、AAV(例えばrAAV)のゲノムは、Repタンパク質のうちのいくつかまたはすべてをコードする。特定の態様において、AAV(例えばrAAV)のゲノムは、Repタンパク質をコードしない。特定の態様において、Repタンパク質のうちの1種類または複数種類は、トランスに送達されることが可能であり、したがって、ポリペプチドをコードする核酸を含むAAV粒子に含まれない。

AAVゲノムの両端は、折り畳まって、ウイルスDNA複製の起点の役割を果たすT字形ヘアピン構造になる能力を有する、短い末端逆位配列(ITR)を含む。したがって、AAVのゲノムは、一本鎖のウイルスDNAゲノムに隣接する1つまたは複数の(例えば、一対の)ITR配列を含む。ITR配列は、多くの場合、それぞれ約145塩基の長さを有する。ITR領域内の2つのエレメント、すなわちGAGC繰り返しモチーフおよび末端分解部位(trs)が説明されており、これらがITRの機能の中核を成していると考えられている。繰り返しモチーフは、ITRが直線形状またはヘアピン形状のいずれかである場合にRepに結合することが示されている。この結合が、部位特異的かつ鎖特異的な様式で起こる、trsにおける切断のためにRep68/78を配置すると考えられる。複製におけるこれらの役割に加えて、これら2種類のエレメントは、ウイルス組込みの中核も成していると思われる。染色体19の組込み座位内に、隣接したtrsを有するRep結合部位が含まれている。これらのエレメントは、機能的であり、座位特異的組込みのために必要であることが示されている。

特定の態様において、AAV(例えばrAAV)は、2つのITRを含む。特定の態様において、AAV(例えばrAAV)は、一対のITRを含む。特定の態様において、AAV(例えばrAAV)は、機能または活性を有するポリペプチドを少なくともコードする核酸配列に隣接する(すなわち、それぞれ5'末端および3'末端に存在する)一対のITRを含む。

AAVベクター(例えばrAAVベクター)は、パッケージングされてよく、その後にエクスビボ、インビトロ、またはインビボで細胞を感染(形質導入)させるための「AAV粒子」と本明細書において呼ばれる。組換えAAVベクターがAAV粒子中に封入またはパッケージングされている場合、この粒子を「rAAV粒子」と呼ぶこともできる。特定の態様において、AAV粒子は、rAAV粒子である。rAAV粒子は、rAAVベクターまたはその一部分をしばしば含む。rAAV粒子は、1つまたは複数のrAAV粒子(例えば、複数のAAV粒子)であることができる。rAAV粒子は、rAAVベクターゲノムを封入またはパッケージングするタンパク質(例えばカプシドタンパク質)を典型的には含む。rAAVベクターへの言及は、rAAV粒子に言及するためにも使用できることに留意されたい。

任意の適切なAAV粒子(例えばrAAV粒子)を、本明細書の方法または使用のために用いることができる。rAAV粒子および/またはそれに含まれるゲノムは、任意の適切な血清型または株のAAVに由来してよい。rAAV粒子および/またはそれに含まれるゲノムは、2種類またはそれより多い血清型または株のAAVに由来してよい。したがって、rAAVは、AAV粒子が哺乳動物細胞の感染および/または形質導入に適している、任意の血清型または株のAAVのタンパク質および/もしくは核酸またはそれらの一部分を含むことができる。AAV血清型の非限定的な例には、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10、およびAAV-2i8が含まれる。

特定の態様において、複数のrAAV粒子は、同じ株または血清型(またはサブグループもしくはバリアント)の粒子を含むか、あるいはそれに由来する。特定の態様において、複数のrAAV粒子は、(例えば、互いに異なる血清型および/または株の)2種類またはそれより多くの種類の異なるrAAV粒子の混合物を含む。

本明細書において使用される場合、用語「血清型」は、他のAAV血清型と血清学的に異なるカプシドを有するAAVに言及するために使用される特質である。血清学的特殊性は、別のAAVと比べた際に、あるAAVに対して抗体間の交差反応性がないことに基づいて判定される。このような交差反応性の差は、通常、カプシドタンパク質配列/抗原決定基の違いに起因する(例えば、AAV血清型のVP1、VP2、および/またはVP3配列の違いに起因する)。カプシドバリアントを含むAAVバリアントが、参照AAV血清型とも他のAAV血清型とも血清学的に異ならない場合がある可能性はあるものの、それらAAVバリアントは、参照AAV血清型または他のAAV血清型と比べて少なくとも1個のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が異なる。

特定の態様において、rAAV粒子は、ある種の血清型を除外する。1つの態様において、rAAV粒子はAAV4粒子ではない。特定の態様において、rAAV粒子は、AAV4と抗原的または免疫学的に異なる。明瞭な違いは、標準的な方法によって判定することができる。例えば、ELISAおよびウェスタンブロットを用いて、あるウイルス粒子がAAV4と抗原的または免疫学的に異なるかどうかを判定することができる。さらに、特定の態様において、rAAV2粒子は、AAV4とは異なる組織向性を保持している。

特定の態様において、第1の血清型ゲノムをベースとするrAAVベクターは、ベクターをパッケージングするカプシドタンパク質のうちの1つまたは複数の血清型に対応する。例えば、AAVベクターゲノムを構成する1種類または複数種類のAAV核酸(例えばITR)の血清型は、rAAV粒子を構成するカプシドの血清型に対応する。

特定の態様において、rAAVベクターゲノムは、ベクターをパッケージングするAAVカプシドタンパク質のうちの1つまたは複数の血清型とは異なるAAV(例えばAAV2)血清型ゲノムをベースとすることができる。例えば、rAAVベクターゲノムは、AAV2に由来する核酸(例えばITR)を含むことができ、その一方で、3種類のカプシドタンパク質のうちの少なくとも1種類または複数種類は、異なる血清型、例えば、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、もしくはAAV-2i8の血清型またはそのバリアントに由来する。

特定の態様において、参照血清型に関係するrAAV粒子またはそのベクターゲノムは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、もしくはAAV-2i8の粒子のポリヌクレオチド、ポリペプチド、もしくは部分配列と少なくとも60％もしくは60％超(例えば、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％など)同一である配列を含むかまたはそれからなる、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または部分配列を有する。具体的な態様において、参照血清型に関係するrAAV粒子またはそのベクターゲノムは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、もしくはAAV-2i8の血清型のカプシドもしくはITR配列と少なくとも60％もしくは60％超(例えば、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％など)同一である配列を含むかまたはそれからなる、カプシドまたはITR配列を有する。

特定の態様において、本明細書の方法は、rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12、rRh10、rRh74、またはrAAV-2i8の粒子の使用、投与、または送達を含む。

特定の態様において、本明細書の方法は、rAAV2粒子の使用、投与、または送達を含む。特定の態様において、rAAV2粒子は、AAV2カプシドを含む。特定の態様において、rAAV2粒子は、天然または野生型のAAV2粒子の対応するカプシドタンパク質と少なくとも60％、65％、70％、75％、またはそれ以上同一、例えば、80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％など、最高で100％同一である1種類または複数種類のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、および/またはVP3)を含む。特定の態様において、rAAV2粒子は、天然または野生型のAAV2粒子の対応するカプシドタンパク質と少なくとも75％または75％超同一、例えば、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％など、最高で100％同一であるVP1、VP2、およびVP3カプシドタンパク質を含む。特定の態様において、rAAV2粒子は、天然または野生型のAAV2粒子のバリアントである。いくつかの局面において、AAV2バリアントの1種類または複数種類のカプシドタンパク質は、天然または野生型のAAV2粒子のカプシドタンパク質と比べて1個、2個、3個、4個、5個、5～10個、10～15個、15～20個、またはそれより多いアミノ酸置換を有する。

特定の態様において、rAAV9粒子は、AAV9カプシドを含む。特定の態様において、rAAV9粒子は、天然または野生型のAAV9粒子の対応するカプシドタンパク質と少なくとも60％、65％、70％、75％、またはそれ以上同一、例えば、80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％など、最高で100％同一である1種類または複数種類のカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2、および/またはVP3)を含む。特定の態様において、rAAV9粒子は、天然または野生型のAAV9粒子の対応するカプシドタンパク質と少なくとも75％または75％超同一、例えば、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％など、最高で100％同一であるVP1、VP2、およびVP3カプシドタンパク質を含む。特定の態様において、rAAV9粒子は、天然または野生型のAAV9粒子のバリアントである。いくつかの局面において、AAV9バリアントの1種類または複数種類のカプシドタンパク質は、天然または野生型のAAV9粒子のカプシドタンパク質と比べて1個、2個、3個、4個、5個、5～10個、10～15個、15～20個、またはそれより多いアミノ酸置換を有する。

特定の態様において、rAAV粒子は、天然または野生型のAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10、またはAAV-2i8の対応するITRと少なくとも75％または75％超同一、例えば、80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％など、最高で100％同一である1つまたは2つのITR(例えば、一対のITR)を、それらITRが1つまたは複数の望ましいITR機能(例えばヘアピンを形成する能力、これにより、DNA複製;宿主細胞ゲノム中へのAAV DNAの組込み;および/または所望の場合はパッケージングが可能になる)を保持する限り、含む。

特定の態様において、rAAV2粒子は、天然または野生型のAAV2粒子の対応するITRと少なくとも75％または75％超同一、例えば、80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％など、最高で100％同一である1つまたは2つのITR(例えば、一対のITR)を、それらITRが1つまたは複数の望ましいITR機能(例えばヘアピンを形成する能力、これにより、DNA複製;宿主細胞ゲノム中へのAAV DNAの組込み;および/または所望の場合はパッケージングが可能になる)を保持する限り、含む。

特定の態様において、rAAV9粒子は、天然または野生型のAAV2粒子の対応するITRと少なくとも75％または75％超同一、例えば、80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％など、最高で100％同一である1つまたは2つのITR(例えば、一対のITR)を、それらITRが1つまたは複数の望ましいITR機能(例えばヘアピンを形成する能力、これにより、DNA複製;宿主細胞ゲノム中へのAAV DNAの組込み;および/または所望の場合はパッケージングが可能になる)を保持する限り、含む。

rAAV粒子は、任意の適切な数の「GAGC」リピートを有するITRを含むことができる。特定の態様において、AAV2粒子のITRは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個、またはそれより多くの「GAGC」リピートを含む。特定の態様において、rAAV2粒子は、3個の「GAGC」リピートを含むITRを含む。特定の態様において、rAAV2粒子は、4個より少ない「GAGC」リピートを有するITRを含む。特定の態様において、rAAV2粒子は、4個より多い「GAGC」リピートを有するITRを含む。特定の態様において、rAAV2粒子のITRは、1番目と2番目の「GAGC」リピートの第4のヌクレオチドがTではなくCであるRep結合部位を含む。

rAAV粒子中へのパッケージング/封入のためにrAAVベクターに組み入れられ得るDNAの適切な長さの例は、約5キロベース(kb)であるか、またはそれより短くてよい。特定の態様において、DNAの長さは、約5kb未満、約4.5kb未満、約4kb未満、約3.5kb未満、約3kb未満、または約2.5kb未満である。

RNAiまたはポリペプチドの発現を指示する核酸配列を含むrAAVベクターは、当技術分野において公知の適切な組換え技術を用いて作製することができる(例えば、Sambrook et al., 1989を参照されたい)。組換えAAVベクターは、典型的には、形質導入能力を有するAAV粒子中にパッケージングされ、AAVウイルスパッケージング系を用いて増殖させられる。形質導入能力を有するAAV粒子は、哺乳動物細胞に結合し、その中に入り、続いて、その細胞の核に核酸カーゴ(例えば異種遺伝子)を送達することができる。したがって、形質導入能力を有する完全なrAAV粒子は、哺乳動物細胞に形質導入するように構成されている。哺乳動物細胞に形質導入するように構成されているrAAV粒子は、複製能力を有していないことがしばしばあり、自己複製するためには追加のタンパク質機構を必要とする。したがって、哺乳動物細胞に形質導入するように構成されているrAAV粒子は、哺乳動物細胞に結合し、その中に入り、かつ該細胞に核酸を送達するように操作されており、その際、送達するための該核酸は、rAAVゲノム中の一対のAAV ITRの間にしばしば配置されている。

形質導入能力を有するAAV粒子を生産するために適する宿主細胞には、異種rAAVベクターの受け手として使用され得るまたは使用されてきた、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が含まれるが、それらに限定されるわけではない。安定なヒト細胞株であるHEK293(例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションからアクセッション番号ATCC CRL1573を用いて容易に入手可能)に由来する細胞を使用することができる。特定の態様において、アデノウイルス5型DNA断片を用いて形質転換され、アデノウイルスE1a遺伝子およびE1b遺伝子を発現する、改変されたヒト胎児腎臓細胞株(例えばHEK293)が、組換えAAV粒子を作製するために使用される。改変HEK293細胞株は容易にトランスフェクトされ、rAAV粒子を生産するための特に簡便なプラットフォームになる。哺乳動物細胞に形質導入する能力を有する高力価AAV粒子を作製する方法は、当技術分野において公知である。例えば、AAV粒子は、Wright, 2008およびWright, 2009で説明されているようにして作ることができる。

特定の態様において、AAV発現ベクターのトランスフェクションの前または同時のいずれかに、AAVヘルパー構築物を用いて宿主細胞をトランスフェクトすることにより、AAVヘルパー機能が宿主細胞に導入される。このように、AAVヘルパー構築物は、生産的なAAV形質導入に必要な欠けているAAV機能を補完するために、AAVのrepおよび/またはcap遺伝子の少なくとも一過性の発現を実現する目的で使用されることがある。AAVヘルパー構築物は、AAV ITRをしばしば欠き、それ自身を複製することもパッケージングすることもできない。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態であることができる。いくつかのAAVヘルパー構築物、例えば、Rep発現産物およびCap発現産物の両方をコードする一般に使用されるプラスミドpAAV/AdおよびpIM29+45などが、説明されている。Rep発現産物および/またはCap発現産物をコードするいくつかの他のベクターが公知である。

B レトロウイルス
本明細書の方法、組成物、および使用において送達される作用物質として使用するためのウイルスベクターには、レトロウイルスベクターが含まれる(例えば、Miller (1992) Nature, 357:455-460を参照されたい)。レトロウイルスベクターは、広範なげっ歯動物、霊長類、およびヒトの体細胞中に、再配列されていない単一のコピー遺伝子を送達する能力を有するため、細胞中に核酸を送達するために非常に適している。レトロウイルスベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。他のウイルスベクターとは異なり、レトロウイルスベクターは、分裂中の細胞のみに感染する。

レトロウイルスは、RNAウイルスであり、したがってウイルスゲノムはRNAである。宿主細胞がレトロウイルスに感染すると、ゲノムRNAは、感染細胞の染色体DNAに非常に効率的に組み込まれるDNA中間体に逆転写される。組み込まれたこのDNA中間体は、プロウイルスと呼ばれる。プロウイルスの転写および感染性ウイルスのアセンブリは、適切なヘルパーウイルスの存在下で、または混入ヘルパーウイルスの同時生産を伴わない封入を可能にする適切な配列を含む細胞株において、起こる。封入用の配列が、適切なベクターを用いる同時トランスフェクションによって提供される場合は、組換えレトロウイルスの生産のためにヘルパーウイルスは必要とされない。

レトロウイルスゲノムおよびプロウイルスのDNAは、3種類の遺伝子、すなわちgag、pol、およびenvを有し、これらは2つの末端反復配列(LTR)の配列にはさまれている。gag遺伝子は、内部の構造(マトリックス、カプシド、およびヌクレオカプシド)タンパク質をコードし、env遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。pol遺伝子は、ウイルスRNAを二本鎖DNAへと転写するRNA指向性DNAポリメラーゼ逆転写酵素、逆転写酵素によって生じるDNAを宿主の染色体DNA中に組み込むインテグラーゼ、ならびにコードされるgag遺伝子およびpol遺伝子をプロセシングする役割を果たすプロテアーゼが含まれる生産物をコードする。5′LTRおよび3′LTRは、ビリオンRNAの転写およびポリアデニル化を促進する働きをする。LTRは、ウイルス複製に必要な他のすべてのシス作用性配列を含む。

レトロウイルスベクターは、Coffin et al., Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997)によって説明されている。レトロウイルスの例は、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)またはマウス幹細胞ウイルス (MSCV)である。レトロウイルスベクターは、複製可能型または複製欠損型であることができる。典型的には、レトロウイルスベクターは、ビリオンの複製およびパッケージングをさらに繰り返すのに必要な遺伝子のコード領域が欠失しているかまたは他の遺伝子で置換されている、複製欠損型である。その結果として、これらのウイルスは、最初の標的細胞にひとたび感染すると、典型的な溶解経路を継続することができない。このようなレトロウイルスベクターおよびこのようなウイルスの生産に必要な媒介物(例えばパッケージング細胞株)は、市販されている(例えば、Clontechから入手可能な、カタログ番号634401、631503、631501などのレトロウイルスベクターおよび系など(Clontech, Mountain View, Calif.)を参照されたい)。

このようなレトロウイルスベクターは、複製に必要とされるウイルス遺伝子を、送達しようとする核酸分子で置換することにより、送達される作用物質として生産することができる。結果として生じるゲノムは、各末端にLTRを含み、その間に1つまたは複数の所望の遺伝子を有する。レトロウイルスを生産する方法は、当業者に公知である(例えば、国際公開PCT出願WO1995/026411を参照されたい)。レトロウイルスベクターは、1つまたは複数のヘルパープラスミドを含むパッケージング細胞株において生産することができる。パッケージング細胞株は、カプシド生産およびベクターのビリオン成熟化に必要とされるウイルスタンパク質を提供する(例えば、gag遺伝子、pol遺伝子、およびenv遺伝子)。典型的には、ベクタープラスミド間で組換えが起こることができないように、少なくとも2種類の個別のヘルパープラスミド(gag遺伝子およびpol遺伝子、ならびにenv遺伝子を別々に含む)が使用される。例えば、レトロウイルスベクターは、リン酸カルシウムを介したトランスフェクションのようなトランスフェクションの標準的方法を用いて、パッケージング細胞株中に移入することができる。パッケージング細胞株は、当業者に周知であり、市販されている。例示的なパッケージング細胞株は、GP2-293パッケージング細胞株(カタログ番号631505、631507、631512、Clontech)である。ビリオン生産物にとって十分な時間の経過後、ウイルスが回収される。所望の場合は、回収されたウイルスを用いて、例えば、異なる宿主親和性を有するウイルスを生産するために、第2のパッケージング細胞株を感染させることができる。最終結果は、関心対象の核酸を含むが他の構造遺伝子は欠いており、したがって宿主細胞中で新しいウイルスは形成できない、複製不能組換えレトロウイルスである。

遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を例示している参照文献には、Clowes et al., (1994) J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem et al., (1994) Blood 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg (1993) Human Gene Therapy 4:129-141; Grossman and Wilson (1993) Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114; Sheridan (2011) Nature Biotechnology, 29:121; Cassani et al. (2009) Blood, 114:3546-3556が含まれる。

C レンチウイルス
レンチウイルスは、共通のレトロウイルス遺伝子gag、pol、およびenvに加えて、調節機能または構造的機能を有する他の遺伝子を含む、複雑なレトロウイルスである。複雑性が高いことによって、潜伏感染の過程において見られるように、ウイルスが自身の生活環を調節することが可能になる。レンチウイルスのいくつかの例には、ヒト免疫不全ウイルスであるHIV-1、HIV-2、およびサル免疫不全ウイルスSIVが含まれる。レンチウイルスベクターは、HIV病原性遺伝子を複数回弱毒化することによって作製されており、例えば、遺伝子env、vif、vpr、vpu、およびnefを欠失させて、ベクターを生物学的に安全にしている。レンチウイルスベクターは当技術分野において周知である(例えば、米国特許第6,013,516号および同第5,994,136号を参照されたい)。

組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞への感染能力を有し、インビボおよびエクスビボ両方での核酸配列の遺伝子移入および発現に使用することができる。例えば、パッケージング機能、すなわちgag、pol、およびenv、ならびにrevおよびtatを有する2つまたはそれより多いベクターによって適切な宿主細胞がトランスフェクトされる、非分裂細胞への感染能力を有する組換えレンチウイルスが、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,994,136号で説明されている。

レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスのDNAは、レトロウイルス中に見出される3種類の遺伝子、すなわちgag、pol、およびenvを有し、これらは2つの末端反復配列(LTR)の配列にはさまれている。gag遺伝子は、内部の構造(マトリックス、カプシド、およびヌクレオカプシド)タンパク質をコードし;pol遺伝子は、RNA指向性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)、プロテアーゼ、およびインテグラーゼをコードし;かつenv遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。5'LTRおよび3'LTRは、ビリオンRNAの転写およびポリアデニル化を促進する働きをする。LTRは、ウイルス複製に必要な他のすべてのシス作用性配列を含む。レンチウイルスは、vif、vpr、tat、rev、vpu、nef、およびvpxを含む、付加的な遺伝子を有する。

5'LTRに隣接して、ゲノムの逆転写に必要な配列(tRNAプライマー結合部位)および粒子中へのウイルスRNAの効率的カプシド封入のための配列(Psi部位)がある。カプシド封入(または感染性ビリオン中へのレトロウイルスRNAのパッケージング)に必要な配列がウイルスゲノムから欠けている場合、cis欠陥によってゲノムRNAのカプシド封入が妨げられる。しかし、結果として生じる変異体は、すべてのビリオンタンパク質の合成を指示する能力は引き続き有している。

D 他のウイルスベクター
遺伝子送達のためのウイルスベクターの開発および有用性は、絶えず向上し、発展している。ポックスウイルスのような他のウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルス(Gnant et al., 1999; Gnant et al., 1999)、アルファウイルス、例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス(Lundstrom, 1999)、レオウイルス(Coffey et al., 1998)、およびインフルエンザ A ウイルス(Neumann et al., 1999)が、本開示において使用するために企図され、これらは、標的系の不可欠な特性に基づいて選択されてよい。

E キメラウイルスベクター
キメラウイルスベクターまたはハイブリッドウイルスベクターが、治療的遺伝子送達において使用するために開発されており、本開示において使用するために企図される。キメラポックスウイルス/レトロウイルスベクター(Holzer et al., 1999)、アデノウイルス/レトロウイルスベクター(Feng et al., 1997; Bilbao et al., 1997; Caplen et al., 2000)、およびアデノウイルス/アデノ随伴ウイルスベクター(Fisher et al., 1996;米国特許第5,871,982号)が、説明されている。これらの「キメラ」ウイルス遺伝子移入系は、2つまたはそれより多い親ウイルス種の好ましい特徴を活用することができる。例えば、Wilsonらは、アデノウイルスの一部分、すなわちAAVの5'および3'のITR配列、ならびに選択された導入遺伝子を含む、後述するような(参照により本明細書に具体的に組み入れられる米国特許第5,871,983号)キメラベクター構築物を提供する。

III 薬学的組成物
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」は、1つもしくは複数の投与経路、インビボの送達、または接触に適している、生物学的に許容される組成物、製剤、液体もしくは固体、またはそれらの混合物を意味する。「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」組成物は、生物学的に望ましくないものでも他の点でも望ましくないものでもない物質であり、例えば、該物質は、望ましくない生物学的作用を実質的に引き起こすことなく、対象に投与され得る。このような組成物、すなわち「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」製剤および組成物は、無菌であることができる。このような薬学的な製剤および組成物は、例えば、ウイルス粒子またはナノ粒子を対象に投与する際に使用され得る。

このような製剤および組成物には、薬学的投与またはインビボの接触もしくは送達と相性が良い、溶剤(水性または非水性)、液剤(水性または非水性)、乳剤(例えば、水中油または油中水)、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、分散媒および懸濁媒、被覆剤、等張化剤、および吸収促進剤または吸収遅延剤が含まれる。水性および非水性の溶剤、液剤、および懸濁剤は、懸濁化剤および増粘剤を含んでよい。補助的な活性化合物(例えば、保存剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、および抗真菌剤)もまた、製剤および組成物に組み込まれてよい。

典型的には、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。このような賦形剤には、組成物を与えられる個体にとって害を及ぼす抗体の産生をそれ自体は誘導せず、かつ過度の毒性を伴わずに投与され得る任意の薬学的物質が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、ソルビトール、Tween80、ならびに水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。薬学的に許容される塩がそれらの中に含まれてよく、例えば、鉱酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩など;ならびに有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、および安息香酸塩などが含まれてよい。さらに、界面活性剤、湿潤剤または乳化剤、およびpH緩衝物質などの補助物質も、このようなビヒクル中に存在してよい。

薬学的組成物は、本明細書において説明するかまたは当業者に公知である、投与または送達の特定の経路に適合するように製剤化することができる。したがって、薬学的組成物は、様々な経路による投与または送達に適した担体、希釈剤、または賦形剤を含む。

ウイルス粒子またはナノ粒子の注射または注入に適した薬学的形態には、任意でリポソーム中に封入された、滅菌済みの注射可能または注入可能な液剤または分散液剤を用時調製するのに適するように変更された、滅菌済みの水性の液剤または分散液剤が含まれ得る。すべての場合において、最終形態は、無菌の液体であり、かつ製造、使用、および貯蔵の条件下で安定であるべきである。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、多価アルコール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど)、植物油、無毒性グリセリルエステル、およびそれらの適切な混合物を含む、溶媒または液状分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散液剤の場合は必要とされる粒度の維持によって、または界面活性剤の使用によって、維持することができる。等張化剤、例えば、糖、緩衝剤、または塩(例えば塩化ナトリウム)が含まれ得る。注射用組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中で使用することによって実現することができる。

ウイルス粒子またはナノ粒子の液剤または懸濁剤は、次の構成要素のうちの1つまたは複数を任意で含むことができる:注射用水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの生理食塩水、人工CSF、界面活性剤、不揮発性油、多価アルコール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど)、グリセリン、または他の合成溶媒などの無菌希釈剤;パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびアスコルビン酸などの抗菌剤および抗真菌剤、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝剤;ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースなど張性を調整するための作用物質。

本発明の組成物、方法、および使用のために適した薬学的製剤、組成物、および送達系は、当技術分野において公知である(例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) 18^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12^th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11^th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD;およびPoznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315を参照されたい)。

ウイルス粒子およびそれらの組成物は、投与を容易にし、かつ投与量を均一にするために、単位剤形で製剤化されてよい。本明細書において使用される単位剤形とは、処置しようとする個体に対する単位投与量として適した物理的に個別の単位を意味し、各単位は、必要な薬学的担体と共同して所望の治療効果をもたらすように算出された所定の量の活性化合物を含む。単位剤形は、所望の効果をもたらすために必要と考えられるウイルス粒子またはナノ粒子の数によって決まる。必要な量は、単一用量として製剤化されてよく、または複数の投与単位として製剤化されてもよい。用量は、抗炎症剤と任意で組み合わせて、適切なウイルス粒子またはナノ粒子濃度に調整され、使用するために容器に入れられてよい。

1つの態様において、薬学的組成物は、治療的有効量、すなわち、問題の疾患状態の症状もしくは有害作用を軽減もしくは改善するのに十分な量、または所望の恩恵を与えるのに十分な量を提供するのに十分な遺伝物質を含む。

本明細書において使用される「単位剤形」とは、処置しようとする対象に対する単位投与量として適した物理的に個別の単位を意味し、各単位は、薬学的担体(賦形剤、希釈剤、ビヒクル、または充填剤)と任意で組み合わされて所定の量を含み、この量は、1つまたは複数の用量で投与された場合に、所望の効果(例えば、予防効果または治療効果)をもたらすように算出されている。単位剤形は、例えば、アンプルおよびバイアルに入れられてよく、アンプルおよびバイアルは、液状組成物、またはフリーズドライ状態もしくは凍結乾燥状態の組成物を含んでよく;例えば、無菌の液体担体をインビボの投与または送達の前に加えることができる。個々の単位剤形は、多回投与用のキットまたは容器に含まれてよい。したがって、例えば、ウイルス粒子、ナノ粒子、およびその薬学的組成物は、投与を容易にし、かつ投与量を均一にするために、単一または複数の単位剤形として容器に入れられてよい。

典型的には、ウイルス粒子またはナノ粒子を含む製剤は、有効量を含み、該有効量は、当業者によって容易に決定される。典型的には、ウイルス粒子またはナノ粒子は、組成物の約1％～約95％(w/w)の範囲、または適切な場合にはさらに多くの量に及んでよい。投与される量は、処置が検討される哺乳動物またはヒト対象の年齢、体重、および身体状態などの因子に応じて変わる。有効投与量は、用量応答曲線を定める慣例の試験を通じて、当業者が確定することができる。

IV 定義
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「導入遺伝子」は、本明細書において同義的に使用されて、デオキシリボ核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA)ならびにそのポリマーを含む、核酸、オリゴヌクレオチドのすべての形態を意味する。ポリヌクレオチドには、ゲノムDNA、cDNA、およびアンチセンスDNA、ならびにスプライシングされたまたはスプライシングされていないmRNA、rRNA、tRNA、および抑制性のDNAもしくはRNA(RNAi、例えば、低分子もしくはショートヘアピン(sh)RNA、ミクロRNA(miRNA)、低分子もしくは短鎖干渉(si)RNA、トランス-スプライシングRNA、またはアンチセンスRNA)が含まれる。ポリヌクレオチドには、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、および故意に改変されるかまたは変更されたポリヌクレオチド(例えばバリアント核酸)が含まれ得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖、二重鎖、または三重鎖で、直線状または環状であってよく、かつ任意の適切な長さのものであってよい。ポリヌクレオチドを考察する際、特定のポリヌクレオチドの配列または構造は、5'から3'方向に配列を提供するという慣例に従って本明細書において記載されてよい。

あるポリペプチドをコードする核酸は、該ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームをしばしば含む。別段の定めが無い限り、個々の核酸配列は、縮重コドン置換も含む。

核酸は、オープンリーディングフレームに機能的に連結された1つまたは複数の発現制御または調節エレメントを含むことができ、該1つまたは複数の調節エレメントは、哺乳動物細胞において、オープンリーディングフレームにコードされるポリペプチドの転写および翻訳を指示するように構成されている。発現制御/調節エレメントの非限定的な例には、転写開始配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、およびTATAボックスなど)、翻訳開始配列、mRNA安定性配列、ポリA配列、および分泌配列などが含まれる。発現制御/調節エレメントは、任意の適切な生物のゲノムから得ることができる。

「プロモーター」は、通常はコード配列の上流(5')にあるヌクレオチド配列を意味し、これは、RNAポリメラーゼおよび適切な転写のために必要とされる他の因子に対する認識を提供することにより、該コード配列の発現を指示および/または制御する。pol IIプロモーターは、TATAボックスから構成される短いDNA配列であるミニマルプロモーター、および任意で、転写開始部位を指定する働きをし、発現制御のために調節エレメントがそれに付加される他の配列を含む。1型pol IIIプロモーターは、転写開始部位の下流に次の3つのシス作用性配列エレメントを含む:a)5'配列エレメント(Aブロック);b)中間配列エレメント(Iブロック);c)3'配列エレメント(Cブロック)。2型pol IIIプロモーターは、転写開始部位の下流に次の2つの不可欠なシス作用性配列エレメントを含む:a)Aボックス(5'配列エレメント);およびb)Bボックス(3'配列エレメント)。3型pol IIIプロモーターは、転写開始部位の上流にいくつかのシス作用性プロモーターエレメント、例えば、従来のTATAボックス、近位配列エレメント(PSE)、および遠位配列エレメント(DSE)を含む。

「エンハンサー」は、転写活性を刺激することができるDNA配列であり、プロモーターに固有のエレメントまたは発現のレベルもしくは組織特異性を高める異種エレメントであってよい。エンハンサーは、いずれの方向(5'から3'へ、または3'から5'へ)にも作動することができ、かつプロモーターの上流もしくは下流のいずれかに配置された場合にさえ機能する能力を有し得る。

プロモーターおよび/またはエンハンサーは、全体が天然遺伝子に由来してもよく、もしくは天然に存在する様々なエレメントに由来する様々なエレメントから構成されてもよく、またはさらに、合成DNAセグメントから構成されてもよい。プロモーターまたはエンハンサーは、刺激、生理学的条件、または発生条件に応答して転写開始の有効性を調整/制御するタンパク質因子の結合に関与しているDNA配列を含んでよい。

プロモーターの非限定的な例には、SV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター;アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP);単純ヘルペスウイルス(HSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、例えばCMV最初期プロモーター領域(CMVIE)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、pol IIプロモーター、pol IIIプロモーター、合成プロモーター、およびハイブリッドプロモーターなどが含まれる。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス性遺伝子に由来する配列もまた、本明細書において使用される。例示的な構成的プロモーターには、ある種の構成的または「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子のためのプロモーターが含まれる:ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、アクチンプロモーター、U6、および当業者に公知である他の構成的プロモーター。さらに、多くのウイルスプロモーターが、真核細胞において構成的に機能する。これらには、数多くある中でも、SV40の初期プロモーターおよび後期プロモーター;モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの末端反復配列(LTR);ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。さらに、イントロンのmiRNAプロモーターに由来する配列、例えば、miR107、miR206、miR208b、miR548f-2、miR569、miR590、miR566、およびmiR128プロモーターもまた、本明細書において使用される(例えば、Monteys et al., 2010を参照されたい)。したがって、上記に参照した構成的プロモーターのいずれも、異種遺伝子挿入物の転写を制御するために使用することができる。

「導入遺伝子」は、細胞または生物に導入することが意図されるかまたは導入された核酸配列/ポリヌクレオチドを便宜的に指すために本明細書において使用される。導入遺伝子には、抑制性RNAまたはポリペプチドもしくはタンパク質をコードする遺伝子などの任意の核酸が含まれ、通常、天然に存在するAAVゲノム配列に対して異種である。

用語「形質導入する」とは、ベクター(例えばウイルス粒子)を用いる、細胞または宿主生物への核酸配列の導入を意味する。したがって、ウイルス粒子による細胞中への導入遺伝子の導入は、細胞の「形質導入」と呼ぶことができる。導入遺伝子は、形質導入される細胞のゲノム核酸に組み込まれても組み込まれなくてもよい。導入された導入遺伝子が、受け手の細胞または生物の核酸(ゲノムDNA)に組み込まれる場合には、該導入遺伝子は、該細胞または生物において安定に維持され、さらに、該受け手の細胞または生物の子孫細胞または子孫生物に送り伝えられるかまたは受け継がれることが可能である。最終的に、導入された導入遺伝子は、受け手の細胞もしくは宿主細胞の染色体外に、またはただ一過性に、存在し得る。したがって、「形質導入された細胞」は、形質導入によって導入遺伝子が導入された細胞である。したがって、「形質導入された」細胞は、導入遺伝子が導入された細胞、または導入遺伝子が導入されているその子孫である。形質導入された細胞は、増殖させ、導入遺伝子を転写させ、コードされた抑制性RNAまたはタンパク質を発現させることができる。遺伝子療法の使用および方法の場合、形質導入された細胞は、哺乳動物中に存在することができる。

誘導性プロモーターの制御下にある導入遺伝子は、誘導物質の存在下でのみ発現されるか、または誘導物質の存在下の方が多く発現される(例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下での転写は、ある種の金属イオンの存在下で大きく増大する)。誘導性プロモーターは、誘導因子に結合されると転写を刺激する応答エレメント(RE)を含む。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸、および環状AMPに対するREが存在する。誘導可能な応答を得るために、特定のREを含むプロモーターを選択することができ、場合によっては、REそれ自体が、別のプロモーターに結合し、それによって、組換え遺伝子に誘導能を与えることもある。したがって、適切なプロモーター(構成的なものに対して誘導性のもの;強いものに対して弱いもの)を選択することにより、遺伝子改変細胞におけるポリペプチドの存在および発現レベルの両方を制御することが可能である。ポリペプチドをコードする遺伝子が誘導性プロモーターの制御下にある場合には、インサイチューでのポリペプチドの送達は、ポリペプチドの転写を可能にするための条件に遺伝子改変細胞をインサイチューで曝露することによって、例えば、作用物質の転写を制御する誘導性プロモーターの特異的インデューサーを腹腔内注射することによって、誘発される。例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下にある遺伝子にコードされるポリペプチドの、遺伝子改変細胞によるインサイチュー発現は、遺伝子改変細胞を適切な(すなわち、誘導性の)金属イオンを含む溶液とインサイチューで接触させることにより、促進される。

核酸/導入遺伝子は、別の核酸配列と機能的に関係するように配置されている場合、「機能的に連結され」ている。RNAiもしくはポリペプチドをコードする核酸/導入遺伝子、またはポリペプチドの発現を指示する核酸は、コードされるポリペプチドの転写を制御するための誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含んでよい。発現制御エレメントに機能的に連結された核酸は、発現カセットと呼ぶこともできる。

特定の態様において、CNS特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターおよびエンハンサーなどが、本明細書において説明される方法および使用において使われる。CNS特異的プロモーターの非限定的な例には、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、および神経特異エノラーゼ(NSE)に由来する遺伝子から単離されたものが含まれる。誘導性プロモーターの非限定的な例には、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素、およびIFNに対するDNA応答エレメントが含まれる。

特定の態様において、発現制御エレメントはCMVエンハンサーを含む。特定の態様において、発現制御エレメントはβアクチンプロモーターを含む。特定の態様において、発現制御エレメントは、ニワトリβアクチンプロモーターを含む。特定の態様において、発現制御エレメントは、CMVエンハンサーおよびニワトリβアクチンプロモーターを含む。

本明細書において使用される場合、用語「改変する」または「バリアント」およびそれらの文法的変形は、ある核酸、ポリペプチド、またはその部分配列が、参照配列から変化して異なることを意味する。したがって、改変配列およびバリアント配列は、参照配列と比べて実質的に同じ程度、高い程度、または低い程度の発現、活性、または機能を有するが、該参照配列の活性または機能の一部を少なくとも保持し得る。特定のタイプのバリアントは、変異タンパク質であり、これは、変異、例えば、ミスセンス変異またはナンセンス変異を有する遺伝子にコードされるタンパク質を指す。

「核酸」または「ポリヌクレオチド」バリアントとは、野生型と比べて遺伝子改変された改変配列を指す。この配列は、コードされるタンパク質配列を変更することなく、遺伝子改変されてよい。あるいは、配列は、バリアントタンパク質をコードするように遺伝子改変されてもよい。核酸またはポリヌクレオチドのバリアントはまた、野生型タンパク質配列などの参照配列に対する少なくとも部分的な配列同一性を引き続き保持しているタンパク質をコードするようにコドン改変されており、かつまたバリアントタンパク質をコードするようにコドン改変されている、組合せ配列を指すこともできる。例えば、そのような核酸バリアントの一部のコドンは、変更されても、それにコードされるタンパク質のアミノ酸は変化せず、かつ該核酸バリアントの一部のコドンは、変更されると、その結果、それにコードされるタンパク質のアミノ酸が変化する。

用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において同義的に使用される。本明細書において開示される「核酸」もしくは「ポリヌクレオチド」または「導入遺伝子」にコードされる「ポリペプチド」には、天然に存在する野生型および機能的な多型タンパク質と同様に、部分的または完全長の天然配列、その機能的部分配列(断片)、およびその配列バリアントが、ある程度の機能または活性をポリペプチドが保持している限り、含まれる。したがって、本発明の方法および使用において、核酸配列にコードされるこのようなポリペプチドは、処置される哺乳動物において欠損しているか、またはその活性、機能、もしくは発現が不十分であるか、不完全であるか、もしくは存在しない、内因性タンパク質と同一である必要はない。

改変の非限定的な例には、1つまたは複数のヌクレオチド置換またはアミノ酸置換(例えば、約1～約3個、約3～約5個、約5～約10個、約10～約15個、約15～約20個、約20～約25個、約25～約30個、約30～約40個、約40～約50個、約50～約100個、約100～約150個、約150～約200個、約200～約250個、約250～約500個、約500～約750個、約750～約1000個、またはそれより多いヌクレオチドまたは残基)が含まれる。

アミノ酸改変の例は、保存的なアミノ酸置換または欠失である。特定の態様において、改変配列またはバリアント配列は、未改変配列(例えば野生型配列)の機能または活性についての少なくとも一部分を保持している。

アミノ酸改変の別の例は、ウイルス粒子のカプシドタンパク質に導入されるターゲティングペプチドである。組換えウイルスベクターまたはナノ粒子を中枢神経系、例えば血管内皮細胞に導くペプチドが同定されている。したがって、例えば、脳血管を裏打ちする内皮細胞を、改変した組換えウイルス粒子またはナノ粒子の標的とすることができる。

そのように改変された組換えウイルスは、あるタイプの組織(例えばCNS組織)に、別のタイプの組織(例えば肝臓組織)よりも優先的に結合し得る。特定の態様において、改変カプシドタンパク質を有する組換えウイルスは、同等の未改変カプシドタンパク質よりも高いレベルで結合することにより、脳血管上皮組織を「標的とし」得る。例えば、改変カプシドタンパク質を有する組換えウイルスは、未改変組換えウイルスよりも50％～100％高いレベルで、脳血管上皮組織に結合し得る。

「核酸断片」とは、所与の核酸分子の一部分である。大多数の生物においてデオキシリボ核酸(DNA)が遺伝物質であり、リボ核酸(RNA)は、DNA内に含まれる情報をタンパク質に転換することに関与している。開示されるヌクレオチド配列およびそれにコードされるタンパク質または部分長タンパク質の断片およびバリアントもまた、本発明に包含される。「断片」または「部分」とは、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはポリペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列について、完全長または完全長より短いものを意味する。特定の態様において、断片または部分は、生物学的に機能的である(すなわち、野生型の活性または機能の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、または100％を保持している)。

分子の「バリアント」とは、天然分子の配列と実質的に類似している配列である。ヌクレオチド配列の場合、バリアントには、遺伝コードの縮重が原因で、天然タンパク質の同一のアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。これらのような、天然に存在する対立遺伝子バリアントは、分子生物学技術を用いて、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 技術およびハイブリダイゼーション技術を用いて同定することができる。バリアントヌクレオチド配列には、例えば部位特異的変異誘発を用いて作製される、天然タンパク質をコードするもの、およびアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするものなど、合成に由来するヌクレオチド配列も含まれる。通常、本発明のヌクレオチド配列バリアントは、天然(内因性)ヌクレオチド配列に対して少なくとも40％、50％、60％、70％まで、例えば、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％まで、通常、少なくとも80％、例えば、81％～84％、少なくとも85％、例えば、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％までの配列同一性を有すると考えられる。特定の態様において、バリアントは、生物学的に機能的である(すなわち、野生型の活性または機能の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、または100％を保持している)。

特定の核酸配列の「保存的変種」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を意味する。遺伝コードには縮重があるため、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のポリペプチドをコードする。例えば、コドンCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、およびAGGはすべて、アミノ酸アルギニンをコードする。したがって、あるコドンによってアルギニンが指定されているすべての位置において、そのコドンを、コードされるタンパク質を変更することなく、記載した対応するコドンのうちのいずれかに変更することができる。このような核酸変種は、「保存的に改変された変種」の1種である、「サイレント変種」である。あるポリペプチドをコードする本明細書において説明する核酸配列はすべて、別段の注記の無い限り、存在し得るすべてのサイレント変種も説明する。当業者は、核酸中の各コドン(通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるATG以外)を標準的技術によって改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを認識すると考えられる。したがって、あるポリペプチドをコードする核酸の各「サイレント変種」は、説明した各配列に潜在的に含まれる。

ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、あるポリヌクレオチドが、説明されるアライメントプログラムのうちの1つを標準パラメーターを用いて使用して参照配列と比較すると、少なくとも70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、もしくは79％、または少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、もしくは89％、または少なくとも90％、91％、92％、93％、もしくは94％、またはさらに少なくとも95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。コドン縮重、アミノ酸類似性、およびリーディングフレームの位置決めなどを考慮に入れることにより、2つのヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の対応する同一性を明らかにできるように、これらの値を適切に調整できることが、当業者には認識されよう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的な同一性とは、通常、少なくとも70％、少なくとも80％、90％、またはさらに少なくとも95％の配列同一性を意味する。

ポリペプチドに関する文脈での用語「実質的同一性」は、あるポリペプチドが、参照配列の指定された比較ウィンドウに対して少なくとも70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、もしくは79％、または80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、もしくは89％、または少なくとも90％、91％、92％、93％、もしくは94％、またはさらに、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有する配列を含むことを示す。2つのポリペプチド配列が同一であると示すことは、一方のポリペプチドが、他方のポリペプチドに対して産生される抗体と免疫学的に反応するということである。したがって、例えば、2つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、一方のポリペプチドは、他方のポリペプチドと同一である。

用語「治療する(treat)」および「治療(treatment)」は、治療的処置と予防的処置または防止的処置との両方を意味し、これらの目的は、望まれない生理学的な変化または障害、例えば、障害の発達、進行、または悪化を防ぐか、抑制するか、低減するか、または減少させることである。本発明の目的に関して、有益な臨床結果または所望の臨床結果には、検出可能であるか検出不可能であるかを問わず、症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の症状または有害作用の安定化(すなわち、悪化も進行もしないこと)、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または緩和、および寛解(部分的であるか全体的であるかを問わない)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存と比べて長い生存を意味してもよい。治療を必要とする者には、病態または障害を既に有する者、ならびに罹患しやすい者(例えば、遺伝子検査によって判定される)が含まれる。

用語「含む(comprising)」、「有する」、「含む(including)」、および「含む(containing)」は、別段の注記の無い限り、非限定的な用語(すなわち、「含むが、それだけには限らない」を意味する)として解釈されるべきである。

本明細書において説明される方法および使用はすべて、本明細書において別段の定めが無い限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書において提供される任意およびすべての例、または例示的な言い回し(例えば、「などの」または「例えば」)の使用は、本発明をよりうまく明らかにすることを意図するにすぎず、別段の主張が無い限り、本発明の範囲に限定をもたらさない。本明細書中のいかなる言い回しも、本発明の実践に必須である特許請求されていない任意の要素を示すものとして解釈されるべきではない。

本明細書において開示される特徴はすべて、任意の組合せで組み合わされてよい。本明細書で開示される各特徴は、同じ、等価な、または同様の目的を果たす代替えの特徴によって置き換えられてよい。したがって、明示的に別段の記載が無い限り、開示される特徴(例えば、改変された核酸、ベクター、プラスミド、組換えベクター配列、ベクターゲノム、またはウイルス粒子)は、等価または同様の特徴を有する部類の例である。

本明細書において使用される場合、文脈において特に指示が無い限り、形式「1つの(a)」、「および(and)」、および「その(the)」は、単数形および複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「1つの核酸」への言及は、複数のそのような核酸を含み、「1つのベクター」への言及は、複数のそのようなベクターを含み、かつ「1つのウイルス」または「AAV粒子もしくはrAAV粒子」への言及は、複数のそのようなビリオン/AAV粒子またはrAAV粒子を含む。

用語「約」は、本明細書において使用される場合、基準値の(プラスまたはマイナス)10％以内の値を指す。

本明細書において値の範囲を列挙することは、その範囲に含まれる別々の各値に個別に言及することを簡略化した方法として使うためのものにすぎず、本明細書において別段の定めが無い限り、個々の各値は、本明細書に個別に引用されるかのように、明細書中に組み入れられる。

したがって、数値または数値の範囲はどれも、文脈において特に指示が無い限り、そのような範囲内の整数、および該値または範囲内の該整数の端数を含む。したがって、例示として、80％または80％超の同一性への言及は、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％など、ならびに81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％など、82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％などを含み、以降同様である。

より多い(大きな)と共にまたはより小さいと共に整数に言及することは、それぞれ、基準数より大きいまたは小さい任意の数を含む。したがって、例えば、100より小さいという言及は、99、98、97などから減少して数字1までのすべてを含み; 10より小さいという言及は、9、8、7などから減少して数字1までのすべてを含む。

本明細書において使用される場合、数値または範囲はどれも、文脈において特に指示が無い限り、値の端数およびそのような範囲内の整数、ならびにそのような範囲内の整数の端数を含む。したがって、例示として、数値範囲への言及、例えば、1～10は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ならびに1.1、1.2、1.3、1.4、1.5などを含み、以降同様である。したがって、範囲1～50への言及は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20などから、50を含めて50まで、ならびに1.1、1.2、1.3、1.4、1.5など、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5などを含み、以降同様である。

一連の範囲への言及は、そのひと続きに含まれる互いに異なる範囲の境界値を組み合わせた範囲が含まれる。したがって、例示として、例えば、1～10、10～20、20～30、30～40、40～50、50～60、60～75、75～100、100～150、150～200、200～250、250～300、300～400、400～500、500～750、750～1,000、1,000～1,500、1,500～2,000、2,000～2,500、2,500～3,000、3,000～3,500、3,500～4,000、4,000～4,500、4,500～5,000、5,500～6,000、6,000～7,000、7,000～8,000、または8,000～9,000といった一連の範囲への言及は、10～20、10～50、30～50、50～100、100～300、100～1,000、1,000～3,000、2,000～4,000、4,000～6,000などの範囲を含む。

V キット
本発明は、包装資材およびその中の1つまたは複数の構成要素を含むキットを提供する。キットは、典型的には、構成要素の説明書を含むラベルもしくは包装挿入物、またはその中の構成要素をインビトロ、インビボ、もしくはエクスビボで使用するための取扱説明書を含む。キットは、このような構成成分、例えば、核酸、組換えベクター、ウイルス粒子、スプライシング調節分子、および任意で第2の活性物質、例えば、別の化合物、作用物質、薬物、または組成物を集めたものを含むことができる。

キットとは、該キットの1つまたは複数の構成要素を収容する物理的構造物を指す。包装資材は、構成要素を無菌的に維持することができ、そのような目的のために通常使用される材料で作ることができる(例えば、紙、波形の繊維、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブなど)。

ラベルまたは挿入物は、その中の1つまたは複数の構成要素、投与の量、活性成分の作用メカニズム、薬物動態学、および薬力学を含む臨床薬理学について明らかにする情報を含むことができる。ラベルまたは挿入物は、製造業者、ロット番号、製造場所および製造日、使用期限を明らかにする情報を含むことができる。ラベルまたは挿入物は、製造業者の情報、ロット番号、製造場所および製造日を明らかにする情報を含むことができる。ラベルまたは挿入物は、キットの構成要素の使用対象となり得る疾患についての情報を含むことができる。ラベルまたは挿入物は、臨床医または対象が方法、使用、または治療プロトコールもしくは治療レジメンにおいてキット構成要素のうちの1つまたは複数を使用するための説明書を含むことができる。説明書は、本明細書において説明される方法、使用、治療プロトコール、または予防レジメンもしくは治療レジメンのいずれかを実践するための、投薬の量、頻度または期間、および指示を含むことができる。

ラベルまたは挿入物は、構成要素がもたらし得る任意の利益、例えば予防的利益または治療的利益についての情報を含むことができる。ラベルまたは挿入物は、起こり得る有害な副作用、面倒な問題、または反応についての情報、例えば、特定の組成物を使用することが適切ではないと思われる状況に関しての、対象または臨床医への警告を含むことができる。有害な副作用または面倒な問題はまた、その組成物と相性が悪い可能性がある1種類もしくは複数種類の他の医用薬剤を対象が有しているか、摂取する予定であるか、もしくは現在摂取している場合、またはその組成物と相性が悪いと思われる別の治療プロトコールもしくは治療レジメンを対象が有しているか、受ける予定であるか、もしくは現在受けている場合にも起こる可能性があり、したがって、説明書は、このような相性の悪さに関する情報を含んでよい。

ラベルまたは挿入物は、「印刷物」、例えば紙または厚紙を含み、あるいは、単独であるかまたは構成要素、キット、もしくは梱包資材(例えば箱)に貼られているか、またはキット構成要素を含むアンプル、チューブ、もしくはバイアルに付けられている。ラベルまたは挿入物は、コンピューターで読み取り可能な媒体、例えば、バーコード印刷されたラベル、ディスク、光ディスク、例としてCD-ROM/RAMもしくはDVD-ROM/RAM、DVD、MP3、または電気的記憶媒体、例えば、RAMおよびROMまたはこれらの混成物、例として磁気/光記憶媒体、FLASHメモリー、ハイブリッド、およびメモリー型カードをさらに含むことができる。

VI 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施に際して良く機能する、本発明者らによって発見された技術を代表するものであり、したがって、本発明の実施のために好ましい態様に相当するとみなせることが当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、開示される個々の態様において多くの変更を加えることができ、かつ本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をなお得られることを、本開示に照らして理解すべきである。

実施例1 hATXN1LおよびmiS1の組合せ発現
miS1およびATXN1Lの両方を発現する単一ベクターを送達すると、いずれか一方による単独処置よりも低用量で治療的有効性が実現する。低用量の送達により、これらの治療法を患者に適用する際の安全域が広くなる。このことを示すために、miS1(5’-UCGAUCUUCAGGUCGUUGCUU-3’; SEQ ID NO: 1)およびATXN1Lを発現するバイシストロン性ベクターを作製し、症状を示すSCA1マウスにおいて、確立された方法を用いて、投与試験を行った。評価項目には、ロータロッド解析ならびに剖検後の組織についての神経病理学的検査およびトランスクリプトミクスが含まれる(図4)。

投与試験では、未処置のトランスジェニックマウスまたは野生型同腹仔と比較することにより、B05トランスジェニックマウス(Burright et al., 1995)におけるAAV.miS1.ATXN1LまたはAAV.ATXN1Lのみ(図3A～Bにおいて示す構築物)の有効性を調べた。B05トランスジェニックマウスへの定位手術によりAAV.miS1.ATXN1LまたはAAV.ATXN1Lの用量を漸増させて(表1)両側投与する前に、11週齢でのロータロッドによって動物を検査した(図4)。8×10⁹vgの量で送達されたAAV.miS1が有効であり忍容性が良好であることが、以前の投与試験(Keiser et al., 2016)において示されていた。さらに、8×10⁹vgの量で送達されるAAV1.アタキシン-1様を用いた以前の研究では、行動徴候が予防された(Keiser et al., 2013)。

（表１）AAV.miS1.Atxn1L試験デザイン

ロータロッド解析では、加速させたロータロッド装置において、処置群を知らされていない試験官がマウスを試験した。マウスをロータロッドに4分間慣らし、次いで、1日3回の試験に(各試験間に少なくとも30分休む)4日連続して供した。各試験において、5分間かけて4rpmから40rpmに加速し、その後、速度を40rpmで維持した。落下までの時間(またはマウスが、走ることなく、しがみついて2回連続して回転したかどうか)を、試験ごとに各マウスについて記録した。500秒の時点で試験を止め、その時点で棒の上に残っているマウスは500秒として採点した。二元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後解析を用いて、有意差を評価した。

図5Aに示したように、12週齢時点(すなわち、処置の実施前)では、B05トランスジェニックマウスは野生型マウスよりも統計学的に有意に早い時点に棒から落ちた。図5Bで見られるように、20週齢時点(すなわち、処置の実施後8週目)では、対照で処置したトランスジェニックマウスは、約100秒後にロータロッド装置上に留まることができなかった。AAV.miS1.HAtxn1LまたはAAV.HAtxn1Lで処置したB05マウスのうち、8×10⁷vgのAAV.miS1.HAtxn1Lで処置したマウスだけが、野生型マウスよりも統計学的に有意に早い時点に棒から落ち続けた。残りの処置マウスは、それらの野生型同腹仔と統計学的な差がなかった。さらに、図5Cで見られるように、各群の成績を、20週と12週の落下までの時間の差として解析した場合、対照で処置したトランスジェニックマウスの成績だけが、野生型マウスより統計学的に悪く、対照で処置したトランスジェニックマウスの成績だけが、時間とともに悪くなった。したがって、AAV.miS1.HAtxn1LまたはAAV.HAtxn1Lのいずれかによる処置は、B05マウスにおいてそれ以上のロータロッド障害が起こることを防ぐ。さらに、図5Cに提示されるデータのさらなる解析では、投与量8×10⁹vgでのAAV.miS1.HAtxn1LまたはAAV.HAtxn1Lのいずれかによる処置により、前の時点のロータロッド障害が改善したことも示されている。

図6Aに示したように、小脳全体の溶解物の解析により、AAV.miS1.HAtxn1Lの投与量の漸増に伴って用量依存的にmiS1発現が増大することが確認された。さらに、図6Bは、miS1発現がAtxn1 mRNAのノックダウンに用量依存的に相関することを示す。図6Cに示したように、Atxn1L mRNAレベルは、AAV.miS1.HAtxn1LまたはAAV.HAtxn1Lのいずれかの投与量の漸増に伴って用量依存的に上昇した。

図7Aおよび7Bに示すように、Vegfaおよび代謝型グルタミン酸受容体1型(Grm1)からの転写物、すなわちB05モデルにおいて下方調節されている2種類の転写物の評価により、AAV.miS1.HAtxn1LまたはAAV.HAtxn1Lのいずれかで処置したマウスは野生型マウスと有意に異ならないレベルでVegfaおよびGrm1を発現することが確認された。したがって、AAV.miS1.HAtxn1LまたはAAV.HAtxn1Lのいずれかによる処置は、症状を示すB05マウスにおける転写調節不全をレスキューする。

図8Aおよび8Bに示すように、AAV.miS1.HAtxn1LまたはAAV.HAtxn1Lのいずれかによる処置は、B05トランスジェニックマウスの神経膠症をレスキューする。生理食塩水で処置したB05マウスの方が、AAV.miS1.HAtxn1LまたはAAV.HAtxn1Lのいずれかで処置したB05マウスよりも高レベルのGfap mRNAを示した(図8A)。同様に、8×10⁹vgの用量のAAV.HAtxn1Lで処置したマウスおよび8×10⁷vgの用量のAAV.miS1.HAtxn1Lで処置したマウス以外は、生理食塩水で処置したB05マウスの方が、AAV.miS1.HAtxn1LまたはAAV.HAtxn1Lのいずれかで処置したB05マウスよりも高レベルのIba1 mRNAを示した(図8B)。

図9に示すように、AAV.miS1.HAtxn1LまたはAAV.HAtxn1Lのいずれかによる処置は、B05マウスの正常なカピキュアmRNAレベルには影響を与えない。

実施例2 hATXN1Lイントロン2からのmiR128発現
miR128は、天然に存在するイントロンmiRNAである。近接した上流のイントロン配列(約200bp)は、pol IIIに基づくmiR128発現を駆動するのに十分である(Monteys et al., 2010)。改変された(すなわち長さを短くした)hATXN1Lイントロン2から成熟miR128がプロセシングされ得るかどうかを調べるために、次のように構築物を作製した:(1)EF1αプロモーターの制御下のhATXN1L(SEQ ID NO :2);(2)イントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にあるhATXN1L(SEQ ID NO :3);(3)miR128を含むイントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にあるhATXN1L(SEQ ID NO :4);および(4)miR128プロモーターとともにmiR128を含むイントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にあるhATXN1L(SEQ ID NO :5)(図1Aを参照されたい)。HEK293細胞に一過性トランスフェクトされると、改変されたイントロンは適宜スプライシングされ(図1B)、miR128プロモーターが有る場合も無い場合も、miR128は効率的に成熟miRNAにプロセシングされた(図1C)。hATXN1L発現も同様に評価され、イントロンのみの存在によって増強されることが判明した(図1D)。しかし、miR128単独またはプロモーターと組み合わせられたmiR128のいずれかがイントロン中に存在する場合、hATXN1L発現の低減が認められた(図1D)ことから、スプライシング前にmiRNAがいくらかプロセシングされて、ポリA尾部の除去による転写物分解が起こり得ることが示唆された。

実施例3 hATXN1Lイントロン2からのmiS1発現
改変されたhATXN1Lイントロン2からのmiR128プロセシングの立証に続いて、hATXN1を標的とするmiRNA、すなわちmiS1が、同じ改変イントロンからプロセシングされ得るかどうかを調べるために、構築物を作製した。このために、次のように構築物を作製した:(1)EF1αプロモーターの制御下のhATXN1L(SEQ ID NO: 2);(2)イントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にあるhATXN1L(SEQ ID NO: 3);(3)miS1を含むイントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にあるhATXN1L(SEQ ID NO: 6);(4)miR128プロモーターとともにmiS1を含むイントロンを有し、かつEF1αプロモーターの制御下にあるhATXN1L(SEQ ID NO: 7);および(5)EF1αプロモーターの直接的な制御下にあるmiS1(SEQ ID NO: 8)(図2Aを参照されたい)。miR128の結果と一致して、hATXN1L導入遺伝子にイントロンを組み入れることにより、hATXN1L発現が有意に増大し(図2C)、miR128プロモーターが有る場合も無い場合も、miS1は効果的に成熟miRNAにプロセシングされた(図2B)。miR128プロモーターを上流に配置した場合に成熟miS1の増加は認められなかったが、miR128はHEK293細胞では高発現されないため、このことは脳での機能を示していない可能性がある。したがって、miR128プロモーターの存在により、脳におけるmiS1の発現がさらに高まり得ることが予想される。細胞の一部だけがトランスフェクトされる、この一過性トランスフェクションアッセイ法を用いた場合、miS1の発現がhATXN1発現を低減させる効果はわずかであった(図2D)。非分裂細胞へのAAV遺伝子移入によりmiS1が安定に発現されると、十分なサイレンシングがもたらされることが予想される。

実施例4 hATXN1Lイントロン2からのmiS1のインビボでのプロセシングおよび有効性
インビボでの導入遺伝子のプロセシングおよび有効性を調べるために、miS1イントロンまたはmiR128プロモーター+miS1をAAV2/1として調製し、6週齢のB05マウスの深部小脳核(DCN)中に漸増用量で注射した(2×10⁸vg/マウス、2×10⁹vg/マウス、および2×10¹⁰vg/マウス)。注射後3週目に小脳半球を採取した。ウイルス用量の増加は、miS1発現の増大(図10A)およびインビボの標的hATXN1転写物の相伴う減少(図10B)と相関関係があった。hATXN1L転写物レベルもまた、用量増加とともに上昇した(図10C)。miRNAの上流にイントロンmiR128 RNA pol IIIプロモーターセグメントを含めると、いずれの用量でもhATXN1Lと比べてmiS1発現が増大したが、高い方の2種類の用量でのみ、有意性に達した(図10D)。最後に、いずれかのウイルスで処置したB05マウスは、いずれの用量でも、星状膠細胞のマーカーであるGFAP発現の有意な増大を示したが(図10E)、ミクログリアのマーカーであるIbaI発現は、一番高い用量でのみ、有意に増大した(図10F)。これらの結果から、組合せ療法の導入遺伝子のインビボでの効率的なプロセシングが実証され、後に続く長期研究の際には低用量でウイルス投与することが支持される。

本明細書において開示および特許請求する方法はすべて、本発明の開示に照らして、過度に実験をすることなく作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を、好ましい態様の観点から説明してきたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書において説明する方法、および方法の段階または段階の順序に変更を加えてよいことは、当業者には明らかであろう。より具体的には、本明細書において説明する作用物質の代わりに、化学的にも生理学的にも関係している特定の作用物質を用いてよく、その際、同じまたは同様の結果が達成されるであろうことも明らかである。当業者に明らかなこのような同様の代用および修正はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内にあるとみなされる。

参照文献
以下の参照文献は、本明細書において説明されたものを補足する例示的な手順の詳細またはその他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。

Claims (83)

1. ヒトアタキシン-1様(hAtxn1L)をコードする第1の発現カセットと、ヒトアタキシン-1 mRNAを標的とする抑制性RNAをコードする第2の発現カセットとを含む、核酸分子。
2. ヒトアタキシン-1 mRNAを標的とする抑制性RNAをコードする前記第2の発現カセットが、ヒトアタキシン-1様(hAtxn1L)をコードする前記第1の発現カセットのイントロン内に存在する、請求項1記載の核酸分子。
3. 前記抑制性RNAがsiRNA、shRNA、またはmiRNAである、請求項1または2記載の核酸分子。
4. 前記抑制性RNAがmiRNAである、請求項3記載の核酸分子。
5. 前記miRNAがSEQ ID NO: 1の配列を含む、請求項4記載の核酸分子。
6. 前記miRNAが、SEQ ID NO: 1に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、請求項4記載の核酸分子。
7. 前記抑制性RNAをコードする前記第2の発現カセットが、抑制性RNAコード配列に機能的に連結されているプロモーターを含む、請求項1～6のいずれか一項記載の核酸分子。
8. 前記プロモーターが、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである、請求項7記載の核酸分子。
9. 前記プロモーターがpol IIIプロモーターまたはU6プロモーターである、請求項7記載の核酸分子。
10. 前記プロモーターが、脳で発現されるmiRNAのためのプロモーターである、請求項7記載の核酸分子。
11. 前記プロモーターがmiR128プロモーターである、請求項7記載の核酸分子。
12. 前記プロモーターが、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド1754～1931の配列と少なくとも90％同一である配列を有する、請求項7記載の核酸分子。
13. 前記抑制性RNAがプロモーターに機能的に連結されていない、請求項2記載の核酸分子。
14. hAtxn1Lをコードする前記第1の発現カセットが、hAtxn1Lコード配列に機能的に連結されているプロモーターを含む、請求項1～13のいずれか一項記載の核酸分子。
15. 前記プロモーターが、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである、請求項14記載の核酸分子。
16. 前記プロモーターが、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド194～1356の配列と少なくとも90％同一である配列を有する、請求項14記載の核酸分子。
17. 前記第1の発現カセットおよび/または第2の発現カセットがエンハンサーエレメントを含む、請求項1～16のいずれか一項記載の核酸分子。
18. 前記第1の発現カセットおよび/または第2の発現カセットが、イントロン、フィラーポリヌクレオチド配列、ポリAシグナル、またはそれらの組合せを含む、請求項1～17のいずれか一項記載の核酸分子。
19. 核酸が、SEQ ID NO: 6またはSEQ ID NO: 7の配列と少なくとも90％同一である配列を含む、請求項1～18のいずれか一項記載の核酸分子。
20. 請求項1～19のいずれか一項記載の核酸分子を含む細胞。
21. AAVカプシドタンパク質と請求項1～19のいずれか一項記載の核酸分子とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター。
22. 前記AAVベクターが、AAVカプシドタンパク質を含むAAV粒子を含み、かつ前記第1の発現カセットおよび/または第2の発現カセットが、一対のAAV末端逆位配列(ITR)の間に挿入されている、請求項21記載のrAAV。
23. 前記AAVカプシドタンパク質が、
    AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10、およびAAV-2i8のVP1、VP2、および/もしくはVP3カプシドタンパク質、または、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-Rh10、もしくはAAV-2i8のVP1、VP2、および/もしくはVP3カプシドタンパク質に対して70％もしくはそれより高い同一性を有するカプシドタンパク質
    からなる群に由来するかまたはそれより選択される、請求項22記載のrAAV。
24. 前記一対のAAV ITRが、
    AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10、もしくはAAV-2i8のITR、または、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-Rh10、もしくはAAV-2i8のITR配列に対して70％もしくはそれより高い同一性を有するITR
    に由来するか、それを含むか、またはそれからなる、請求項22記載のrAAV。
25. その必要がある患者において脊髄小脳失調症(SCA)1型を治療する方法であって、ヒトアタキシン-1様(hAtxn1L)をコードする第1の発現カセットおよびヒトアタキシン-1 mRNAを標的とする抑制性RNAをコードする第2の発現カセットを、該患者に投与する段階を含む、該方法。
26. ヒトアタキシン-1様(hAtxn1L)をコードする前記第1の発現カセットおよびヒトアタキシン-1 mRNAを標的とする抑制性RNAをコードする前記第2の発現カセットが両方とも、同じ核酸分子上に存在する、請求項25記載の方法。
27. ヒトアタキシン-1 mRNAを標的とする抑制性RNAをコードする前記第2の発現カセットが、ヒトアタキシン-1様(hAtxn1L)をコードする前記第1の発現カセットのイントロン内に存在する、請求項25または26記載の方法。
28. 前記抑制性RNAがsiRNA、shRNA、またはmiRNAである、請求項25～27のいずれか一項記載の方法。
29. 前記抑制性RNAがmiRNAである、請求項28記載の方法。
30. 前記miRNAがSEQ ID NO: 1の配列を含む、請求項29記載の方法。
31. 前記miRNAが、SEQ ID NO: 1に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、請求項29記載の方法。
32. 前記抑制性RNAがヒトアタキシン-1の発現を減少させる、請求項25～31のいずれか一項記載の方法。
33. 前記抑制性RNAをコードする前記第2の発現カセットが、抑制性RNAコード配列に機能的に連結されているプロモーターを含む、請求項25～32のいずれか一項記載の方法。
34. 前記プロモーターが、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである、請求項33記載の方法。
35. 前記プロモーターがpol IIIプロモーターまたはU6プロモーターである、請求項33記載の方法。
36. 前記プロモーターがmiR128プロモーターである、請求項33記載の方法。
37. 前記プロモーターが、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド1754～1931の配列と少なくとも90％同一である配列を有する、請求項33記載の方法。
38. 前記抑制性RNAがプロモーターに機能的に連結されていない、請求項27記載の方法。
39. hAtxn1Lをコードする前記第1の発現カセットが、hAtxn1Lコード配列に機能的に連結されているプロモーターを含む、請求項25～38のいずれか一項記載の方法。
40. 前記プロモーターが、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである、請求項39記載の方法。
41. 前記プロモーターが、SEQ ID NO: 7のヌクレオチド194～1356の配列と少なくとも90％同一である配列を有する、請求項39記載の方法。
42. 前記第1の発現カセットおよび/または第2の発現カセットがエンハンサーエレメントを含む、請求項25～40のいずれか一項記載の方法。
43. 前記第1の発現カセットおよび/または第2の発現カセットが、イントロン、フィラーポリヌクレオチド配列、ポリAシグナル、またはそれらの組合せを含む、請求項25～42のいずれか一項記載の方法。
44. 前記第1の発現カセットおよび第2の発現カセットが一緒になって、SEQ ID NO: 6またはSEQ ID NO: 7の配列と少なくとも90％同一である配列を含む、請求項25～43のいずれか一項記載の方法。
45. アタキシン-1の発現を低減させる、請求項25～44のいずれか一項記載の方法。
46. 小脳、深部小脳核、脳幹、および/または視床において、Atxn1 mRNAのレベルを少なくとも10％低下させる、請求項25～44のいずれか一項記載の方法。
47. 小脳、深部小脳核、脳幹、および/または視床において、Atxn1 mRNAのレベルを少なくとも10％～50％低下させる、請求項25～44のいずれか一項記載の方法。
48. 前記第1の発現カセットおよび/または第2の発現カセットがウイルスベクター中に含まれる、請求項25～47のいずれか一項記載の方法。
49. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターより選択される、請求項48記載の方法。
50. 前記AAVベクターが、AAVカプシドタンパク質を含むAAV粒子を含み、かつ前記第1の発現カセットおよび/または第2の発現カセットが、一対のAAV末端逆位配列(ITR)の間に挿入されている、請求項49記載の方法。
51. 前記AAVカプシドタンパク質が、
    AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10、およびAAV-2i8のVP1、VP2、および/もしくはVP3カプシドタンパク質、または、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-Rh10、もしくはAAV-2i8のVP1、VP2、および/もしくはVP3カプシドタンパク質に対して70％もしくはそれより高い同一性を有するカプシドタンパク質
    からなる群に由来するかまたはそれより選択される、請求項50記載の方法。
52. 前記一対のAAV ITRが、
    AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10、もしくはAAV-2i8のITR、または、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-Rh10、もしくはAAV-2i8のITR配列に対して70％もしくはそれより高い同一性を有するITR
    に由来するか、それを含むか、またはそれからなる、請求項50記載の方法。
53. 複数の前記ウイルスベクターが投与される、請求項48～52のいずれか一項記載の方法。
54. 前記ウイルスベクターが、約1×10⁶～約1×10¹⁸個のベクターゲノム/キログラム(vg/kg)の用量で投与される、請求項53記載の方法。
55. 前記ウイルスベクターが、約1×10⁷～1×10¹⁷、約1×10⁸～1×10¹⁶、約1×10⁹～1×10¹⁵、約1×10¹⁰～1×10¹⁴、約1×10¹⁰～1×10¹³、約1×10¹⁰～1×10¹³、約1×10¹⁰～1×10¹¹、約1×10¹¹～1×10¹²、約1×10¹²～×10¹³、または約1×10¹³～1×10¹⁴vg/kg患者体重の用量で投与される、請求項53記載の方法。
56. 前記ウイルスベクターが、1×10⁶～1×10¹⁶vg/mlを約0.5～4mlという用量で投与される、請求項53記載の方法。
57. 複数の空のウイルスカプシドを投与する段階をさらに含む、請求項48～56のいずれか一項記載の方法。
58. 前記空のウイルスカプシドが、前記患者に投与されるウイルス粒子とともに製剤化される、請求項57記載の方法。
59. ウイルスベクター粒子または空のウイルスカプシドが1.0～100倍過剰な状態で、前記空のウイルスカプシドが投与されるかまたは製剤化される、請求項57または58記載の方法。
60. 空のウイルスカプシドに対してウイルスベクター粒子が1.0～100倍過剰な状態で、前記空のウイルスカプシドが投与されるかまたは製剤化される、請求項57または58記載の方法。
61. ウイルスベクター粒子に対して空のウイルスカプシドが約1.0～100倍過剰な状態で、前記空のウイルスカプシドが投与されるかまたは製剤化される、請求項57または58記載の方法。
62. 前記投与が中枢神経系に対するものである、請求項25～61のいずれか一項記載の方法。
63. 前記投与が脳に対するものである、請求項25～62のいずれか一項記載の方法。
64. 前記投与が、大槽、脳室内空間、上衣、脳室、くも膜下腔、および/または髄腔内空間に対するものである、請求項25～63のいずれか一項記載の方法。
65. 前記脳室が、吻側の側脳室、および/または尾側の側脳室、および/または右側脳室、および/または左側脳室、および/または吻側の右側脳室、および/または吻側の左側脳室、および/または尾側の右側脳室、および/または尾側の左側脳室である、請求項64記載の方法。
66. 前記投与する段階が脳室内注射および/または実質内注射を含む、請求項25～63のいずれか一項記載の方法。
67. 上衣細胞、軟膜細胞、内皮細胞、脳室細胞、髄膜細胞、グリア細胞、および/またはニューロンが、前記抑制性RNAおよび/またはヒトアタキシン-1様タンパク質を発現する、請求項25～66のいずれか一項記載の方法。
68. 前記投与が、脳内の単一の部位におけるものである、請求項25～66のいずれか一項記載の方法。
69. 前記投与が、脳内の1～5個の部位におけるものである、請求項25～66のいずれか一項記載の方法。
70. 脊髄小脳失調症(SCA)1型の有害症状を軽減する、請求項25～69のいずれか一項記載の方法。
71. 前記有害症状が、初期または後期の症状;行動、人格、もしくは言語の症状;運動機能の症状;および/または認知症状を含む、請求項70記載の方法。
72. 前記患者の記憶欠損、記憶障害、または認知機能を向上させるか、改善するか、維持するか、修復するか、またはレスキューする、請求項25～71のいずれか一項記載の方法。
73. 協調運動障害、緩慢な動作、または体のこわばりの悪化を改善または抑制または軽減または予防する、請求項25～72のいずれか一項記載の方法。
74. けいれんまたは落着きのない動作の悪化を改善または抑制または軽減または予防する、請求項25～73のいずれか一項記載の方法。
75. うつ状態または易刺激性の悪化を改善または抑制または軽減または予防する、請求項25～74のいずれか一項記載の方法。
76. 物を落とすこと、転倒、体の平衡を失うこと、発話困難、または嚥下困難の悪化を改善または抑制または軽減または予防する、請求項25～75のいずれか一項記載の方法。
77. 段取りする能力の悪化を改善または抑制または軽減または予防する、請求項25～76のいずれか一項記載の方法。
78. 運動失調または低下した反射能力の悪化を改善または抑制または軽減または予防する、請求項25～77のいずれか一項記載の方法。
79. 発作もしくは振戦発作または振戦の悪化を改善または抑制または軽減または予防する、請求項25～78のいずれか一項記載の方法。
80. 前記患者がヒトである、請求項25～79のいずれか一項記載の方法。
81. 1種類または複数種類の免疫抑制剤を投与する段階をさらに含む、請求項25～80のいずれか一項記載の方法。
82. 前記免疫抑制剤が、前記発現カセットの投与より前にまたは前記発現カセットの投与と同時に投与される、請求項81記載の方法。
83. 前記免疫抑制剤が抗炎症剤である、請求項81記載の方法。

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