JP2023503455A

JP2023503455A - アデノ随伴ウイルスベクター変種

Info

Publication number: JP2023503455A
Application number: JP2022529681A
Authority: JP
Inventors: ビバリーデイビッドソン; ヨンホンチェン; ポールティー．ラナム; シュエユアンリュウ
Original assignee: Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
Current assignee: Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2020-11-20
Publication date: 2023-01-30
Also published as: CN115023242A; CA3159113A1; WO2021102234A1; MX2022006188A; AU2020388404A1; CO2022008507A2; US20230346981A1; KR20220116459A; BR112022009864A2; EP4061427A1; IL293140A; US20240100194A1; EP4061427A4

Abstract

ターゲティングペプチド、および前記ターゲティングペプチドをコードする配列を含むベクターが、本明細書において提供され、前記ターゲティングペプチドは脳内の特定の下部構造に作用物質を送達する。改変されたキャプシドをそれぞれが含むウイルスベクターであって、前記改変されたキャプシドが、前記ウイルスベクターを異なる脳構造にターゲティングさせる少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、前記ウイルスベクターが、本明細書において提供される。TIFF2023503455000034.tif49133

Description

関連出願の参照
本出願は、2019年11月22日付で出願された米国特許仮出願第62/939,315号、および2020年9月29日付で出願された米国特許仮出願第63/084,709号の優先権の恩典を主張するものであり、両出願の内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。

配列表の参照
本出願は、EFS-Webを介してASCII形式で提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。2020年11月19日に作成された前記のASCIIコピーは、CHOPP0038WO_ST25.txtという名称であり、サイズが63.8キロバイトである。

1. 分野
本発明は全体として、医学、ウイルス学、および神経学の分野に関する。より具体的には、本発明は、脳内の異なる構造へのウイルスベクターの送達を標的とするターゲティングペプチドに関する。

2. 関連技術の説明
合理的デザインおよび定向進化を含めて、AAVベクター変種を作製するために、さまざまな戦略が開発されている。合理的デザインアプローチでは、AAVキャプシドの知識を用いて、形質導入効率を増加させるためのキャプシド表面のチロシン変異などの、キャプシドに標的とする変化を加え、形質導入効率または特異性を変化させる。定向進化アプローチは、キャプシド構造に関する知識を必要とせず、ランダム突然変異誘発、キャプシドシャッフリング、またはランダムペプチド挿入によって行われる。これらの戦略では一般的に、インビトロシステムまたはマウスを使用し、これらは細胞に基づく研究またはマウス研究に理想的であるが、臨床への橋渡しを意味するものではない。実際、AAV変種は、異なる脳構造を特異的にも効率的にも標的にすることはない。したがって、異なる霊長類脳構造を標的にすることができるAAV変種が必要とされている。

概要
改変されたキャプシドをそれぞれが含むウイルスベクターであって、改変されたキャプシドが、ウイルスベクターを異なる脳構造にターゲティングさせる少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、ウイルスベクターが、本明細書において提供される。

1つの態様において、ターゲティングペプチドを含む改変されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドタンパク質であって、ターゲティングペプチドが、改変されたAAVキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターを異なる器官または異なる脳構造にターゲティングさせ、3～10アミノ酸長である、改変されたAAVキャプシドタンパク質が提供される。いくつかの局面において、改変されたAAVキャプシドタンパク質は、改変されたAAV1キャプシドタンパク質、改変されたAAV2キャプシドタンパク質、または改変されたAAV9キャプシドタンパク質である。

いくつかの局面において、改変されたAAVキャプシドタンパク質は、AAV1キャプシドタンパク質(SEQ ID NO: 138参照)に由来し、ターゲティングペプチドは、AAV1キャプシドタンパク質の残基590位の後に挿入される。いくつかの局面において、ターゲティングペプチドはリンカー配列に隣接し、ターゲティングペプチドの両側のリンカー配列は、2または3アミノ酸長である。いくつかの局面において、リンカー配列は、ターゲティングペプチドのN末端側のSSAおよびターゲティングペプチドのC末端側のASである。いくつかの局面において、改変されたAAV1キャプシドタンパク質は、SEQ ID NO: 141と少なくとも95%同一の配列を有する。

いくつかの局面において、改変されたAAVキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドタンパク質(SEQ ID NO: 139参照)に由来し、ターゲティングペプチドは、AAV2キャプシドタンパク質の残基587位の後に挿入される。いくつかの局面において、ターゲティングペプチドはリンカー配列に隣接し、ターゲティングペプチドの両側のリンカー配列は、2または3アミノ酸長である。いくつかの局面において、リンカー配列は、ターゲティングペプチドのN末端側のAAA、およびターゲティングペプチドのC末端側のAAである。いくつかの局面において、改変されたAAV2キャプシドタンパク質は、SEQ ID NO: 142と少なくとも95%同一の配列を有する。

いくつかの局面において、改変されたAAVキャプシドタンパク質は、AAV9キャプシドタンパク質(SEQ ID NO: 140参照)に由来し、ターゲティングペプチドは、AAV9キャプシドタンパク質の残基588位の後に挿入される。いくつかの局面において、ターゲティングペプチドはリンカー配列に隣接し、ターゲティングペプチドの両側のリンカー配列は、2または3アミノ酸長である。いくつかの局面において、リンカー配列は、ターゲティングペプチドのN末端側のAAA、およびターゲティングペプチドのC末端側のASである。いくつかの局面において、改変されたAAV9キャプシドタンパク質は、SEQ ID NO: 143と少なくとも95%同一の配列を有する。

いくつかの局面において、標的ペプチドは、最大10アミノ酸長の配列を含み、配列中に、SEQ ID NO: 1～137および144からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの局面において、ターゲティングペプチドは7アミノ酸長である。

いくつかの局面において、異なる脳構造は、脳幹、尾状核、小脳皮質、大脳皮質、上衣、淡蒼球、海馬、髄膜、視神経、被殻、脊髄、黒質、視床下核、または視床である。ある特定の局面において、改変されたAAVキャプシドタンパク質は、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、ターゲティングペプチドは、対応する脳構造を標的にするように表1に列挙されたものから選択される。ある特定の局面において、改変されたAAVキャプシドタンパク質は、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、ターゲティングペプチドは、対応する脳構造を標的にするように表2に列挙されたものから選択される。ある特定の局面において、改変されたAAVキャプシドタンパク質は、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、ターゲティングペプチドは、対応する脳構造を標的にするように表3に列挙されたものから選択される。

いくつかの局面において、異なる器官は、脳、腎臓、心臓、肝臓、性腺、脾臓、または肝臓である。ある特定の局面において、改変されたAAVキャプシドタンパク質は、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、ターゲティングペプチドは、対応する器官を標的にするように表4に列挙されたものから選択される。ある特定の局面において、改変されたAAVキャプシドタンパク質は、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、ターゲティングペプチドは、対応する器官を標的にするように表5に列挙されたものから選択される。ある特定の局面において、改変されたAAVキャプシドタンパク質は、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、ターゲティングペプチドは、対応する器官を標的にするように表6に列挙されたものから選択される。

1つの態様において、本態様のいずれか1つの改変されたキャプシドタンパク質をコードする配列を含む核酸が、本明細書において提供される。

1つの態様において、本態様のいずれか1つの改変されたキャプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)が、本明細書において提供される。いくつかの局面において、rAAVの組み合わせが提供される。例えば、改変されたAAV1キャプシドタンパク質を有するrAAVおよびSEQ ID NO: 21のターゲティングペプチド、改変されたAAV2キャプシドタンパク質を有するrAAVおよびSEQ ID NO: 53のターゲティングペプチド、改変されたAAV2キャプシドタンパク質を有するrAAVおよびSEQ ID NO: 80のターゲティングペプチド、ならびに改変されたAAV9キャプシドタンパク質を有するrAAVおよびSEQ ID NO: 113のターゲティングペプチドの組み合わせが提供される。

1つの態様において、本態様のいずれか1つの改変されたキャプシドタンパク質をコードする核酸を含むウイルスベクターが、本明細書において提供される。いくつかの局面において、ウイルスベクターは、関心対象の核酸をコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの局面において、関心対象の核酸は治療用物質である。いくつかの局面において、治療用物質は酵素またはRNAi分子である。

1つの態様において、本態様のいずれか1つのウイルスベクターを含む細胞が、本明細書において提供される。いくつかの局面において、細胞はヒト細胞などの、哺乳動物細胞である。いくつかの局面において、細胞はインビトロまたはインビボのものである。

1つの態様において、本態様のウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物が、本明細書において提供される。

1つの態様において、本態様のウイルスを対象に投与する段階を含む、対象の異なる脳構造に作用物質を送達するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの局面において、異なる脳構造は、脳幹、尾状核、小脳皮質、大脳皮質、上衣、淡蒼球、海馬、髄膜、視神経、被殻、脊髄、黒質、視床下核、または視床である。ある特定の局面において、改変されたAAV1キャプシドタンパク質を有するrAAVが使用され、ターゲティングペプチドは、対応する脳構造を標的にするように表1に列挙されたものから選択される。ある特定の局面において、改変されたAAV2キャプシドタンパク質を有するrAAVが使用され、ターゲティングペプチドは、対応する脳構造を標的にするように表2に列挙されたものから選択される。ある特定の局面において、改変されたAAV9キャプシドタンパク質を有するrAAVが使用され、ターゲティングペプチドは、対応する脳構造を標的にするように表3に列挙されたものから選択される。さまざまな局面において、rAAVのいずれかの組み合わせが使用される。例えば、改変されたAAV1キャプシドタンパク質を有するrAAVおよびSEQ ID NO: 21のターゲティングペプチド、改変されたAAV2キャプシドタンパク質を有するrAAVおよびSEQ ID NO: 53のターゲティングペプチド、改変されたAAV2キャプシドタンパク質を有するrAAVおよびSEQ ID NO: 80のターゲティングペプチド、ならびに改変されたAAV9キャプシドタンパク質を有するrAAVおよびSEQ ID NO: 113のターゲティングペプチドの組み合わせが使用される。

1つの態様において、本態様のウイルスを対象に投与する段階を含む、対象の異なる器官に作用物質を送達するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの局面において、器官は脳、腎臓、心臓、肝臓、性腺、脾臓、または肝臓である。ある特定の局面において、改変されたAAV1キャプシドタンパク質を有するrAAVが使用され、ターゲティングペプチドは、対応する器官を標的にするように表4に列挙されたものから選択される。ある特定の局面において、改変されたAAV2キャプシドタンパク質を有するrAAVが使用され、ターゲティングペプチドは、対応する器官を標的にするように表5に列挙されたものから選択される。ある特定の局面において、改変されたAAV9キャプシドタンパク質を有するrAAVが使用され、ターゲティングペプチドは、対応する器官を標的にするように表6に列挙されたものから選択される。さまざまな局面において、rAAVのいずれかの組み合わせが使用される。

いくつかの局面において、作用物質は、siRNA、shRNA、miRNA、非コードRNA、lncRNA、治療用タンパク質、またはCRISPRシステムである。いくつかの局面において、投与は中枢神経系に対するものである。いくつかの局面において、投与は、大槽、脳室内空間、上衣、脳室、くも膜下腔、および/または髄腔内空間に対するものである。いくつかの局面において、脳室は、吻側側脳室、および/または尾側側脳室、および/または右側脳室、および/または左側脳室、および/または右吻側側脳室、および/または左吻側側脳室、および/または右尾側側脳室、および/または左尾側側脳室である。

いくつかの局面において、複数のウイルス粒子が投与される。いくつかの局面において、ウイルスは、1キログラムあたりベクターゲノム約1×10⁶～約1×10¹⁸個 (vg/kg)の用量で投与される。いくつかの局面において、ウイルスは、患者1kgあたりvg 約1×10⁷～1×10¹⁷、約1×10⁸～1×10¹⁶、約1×10⁹～1×10¹⁵、約1×10¹⁰～1×10¹⁴、約1×10¹⁰～1×10¹³、約1×10¹⁰～1×10¹³、約1×10¹⁰～1×10¹¹、約1×10¹¹～1×10¹²、約1×10¹²～×10¹³、または約1×10¹³～1×10¹⁴個で投与される。いくつかの局面において、対象はヒトである。

1つの態様において、本態様のウイルスを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における疾患を処置する方法が、本明細書において提供される。いくつかの局面において、疾患は神経変性疾患である。いくつかの局面において、神経変性疾患は、ハンチントン病、ALS、遺伝性痙性片麻痺、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ケネディ病、アルツハイマー病、ポリグルタミンリピート病、またはパーキンソン病である。いくつかの局面において、哺乳動物はヒトである。

本明細書において使用される場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」とは、特定成分がいずれも意図的に、組成物中に製剤化されておらずかつ/または混入物質としてもしくは微量でのみ存在することを意味する。意図的でない組成物の混入から生じる特定成分の合計量は、それゆえに、0.05%よりかなり低く、好ましくは0.01%より低い。最も好ましいのは、そのような特定成分の量を標準的な分析方法で検出することができない組成物である。

本明細書において使用される場合、「1つの(a)」または「1つの(an)」は1つまたは複数を意味しうる。本明細書において特許請求の範囲で用いられる「1つの(a)」または「1つの(an)」という単語は、「含む(comprising)」という単語と一緒に用いられる場合、1つまたは2つ以上を意味しうる。

特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみまたは相互に排他的な選択肢をいうように明示的に示されない限り、「および/または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢のみと「および/または」をいう定義を支持する。本明細書において使用される場合、「別の」は、少なくとも第2のまたはそれ以上を意味しうる。

本出願を通して、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために用いられている装置、方法の固有の誤差変動、研究対象間に存在する変動、または記載値の10%以内である値を含むことを示すために用いられる。

本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示しているが、例示としてのみ与えられていることを理解すべきである。というのは、本発明の趣旨および範囲内のさまざまな変更および改変がこの詳細な説明から当業者には明らかになるからである。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の局面をさらに実証するために提供される。本発明は、本明細書において提示された具体的な態様の詳細な説明と併せて、これらの図面の1つまたは複数を参照することにより、よりよく理解されうる。
AAVペプチドディスプレイライブラリの概略図。インビボスクリーニング戦略の概略図。インプットライブラリ多様性のグラフ表示。ラウンド1 ICV注射の前にAAV1、AAV2、およびAAV9ウイルスベクターのアリコートから測定されたインプットウイルスライブラリの多様性。ラウンドオーバーラウンドバーコード濃縮のグラフ表示。収集された組織ごとにアカゲザル(Rhesus macaque)でのラウンド1およびラウンド2濃縮後に回収された固有のバーコードの総数。DNAおよびRNAのラウンド2値が示されている。図4-1の説明を参照。図4-1の説明を参照。小脳皮質のAAV1血清型におけるバーコードのラウンドオーバーラウンド濃縮の図解。小脳皮質のAAV2血清型におけるバーコードのラウンドオーバーラウンド濃縮の図解。小脳皮質のAAV9血清型におけるバーコードのラウンドオーバーラウンド濃縮の図解。 AAV9 1999の濃縮の図解。AAV9からのバーコード濃縮のヒートマップ描写であり、表示した組織から検出されたバーコードの割合によって細胞が色分けされている。DNAから回収されたバーコードが左側に示されており、RNAから回収されたバーコードが右側に示されている。図6-1の説明を参照。 AAV1からのoプール(opool)バーコード濃縮のヒートマップ描写。 AAV2からのoプールバーコード濃縮のヒートマップ描写。 AAV9からのoプールバーコード濃縮のヒートマップ描写。 AAV9 1999インビボアカゲザル検証。eGFP発現コンストラクトを、CAGプロモーターによって駆動されるAAV9 1999にパッケージングした。AAV9 1999 1.5E13 vgをICV注射によって5歳齢の雌性アカゲザルに送達した。AAV9 1999の形質導入パターンを描いたH&E染色小脳の代表的な画像が示されている。図9A～D。AAV9 1999インビボマウス検証。eGFP発現コンストラクトを、CAGプロモーターによって駆動されるAAV9 1999にパッケージングした。eGFPコンストラクトを含むAAV9 1999およびAAV9キャプシドを、1E10 vgでのICV注射によってC57BL/6 p0マウス仔に送達した。eGFP蛍光シグナルの代表的な画像は、全脳(図9A)、全脳矢状切片(図9B)、S1皮質切片(図9C、左)、海馬切片(図9C、中央)、小脳矢状切片(図9C、右)、および腰髄冠状切片(図9D)である。 AAV混合物のインビボアカゲザル側脳室の蛍光画像。 AAV混合物のインビボアカゲザル第四脳室の蛍光画像。 AAV混合物のインビボアカゲザル髄膜の蛍光画像。 eGFPコンストラクトを含むAAV9 1999キャプシドのマウスへの蝸牛投与後の蝸牛ターンの蛍光画像。 eGFPコンストラクトを含むAAV9 1999キャプシドのマウスへの蝸牛投与後の内有毛細胞の蛍光画像。 eGFPコンストラクトを含むAAV9 1999キャプシドのマウスへの蝸牛投与後のコルチ器および遠位蝸牛軸の蛍光画像。

詳細な説明
改変されたキャプシドをそれぞれが含むウイルスベクターであって、改変されたキャプシドが、ウイルスベクターを異なる脳構造にターゲティングさせる少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、ウイルスベクターが、本明細書において提供される。ある特定の態様において、脳構造は、脳幹、尾状核、小脳皮質、大脳皮質、上衣、淡蒼球、海馬、髄膜、視神経、被殻、脊髄、黒質、視床下核、または視床である。各脳構造に対するターゲティングペプチドを表1～3に提供する。

ある特定の態様において、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)である。ある特定の態様において、AAVはAAV1、AAV2、またはAAV9である。例示的な野生型参照AAV1キャプシドタンパク質配列が、SEQ ID NO: 138に提供される。例示的な野生型参照AAV2キャプシドタンパク質配列が、SEQ ID NO: 139に提供される。例示的な野生型参照AAV9キャプシドタンパク質配列が、SEQ ID NO: 140に提供される。ある特定の局面において、ターゲティングペプチドは、AAV1キャプシドの590位、AAV2キャプシドの587位、またはAAV9キャプシドの588位に挿入される。例示的な改変AAV1キャプシドタンパク質配列がSEQ ID NO: 141に提供されており、これはSSAX₇ASとして590位の後のターゲティングペプチド挿入を示し、ここで、先頭のSSAおよび末尾のASはリンカー配列であり、かつX₇はターゲティングペプチドを表す。例示的な改変AAV2キャプシドタンパク質配列がSEQ ID NO: 142に提供されており、これはAAAX₇AAとして587位の後のターゲティングペプチド挿入を示し、ここで、先頭のAAAおよび末尾のAAはリンカー配列であり、かつX₇はターゲティングペプチドを表す。例示的な改変AAV9キャプシドタンパク質配列がSEQ ID NO: 143に提供されており、これはAAAX₇ASとして588位の後のターゲティングペプチド挿入を示し、ここで、先頭のAAAおよび末尾のASはリンカー配列であり、かつX₇はターゲティングペプチドを表す。

（表１）各脳構造に対するAAV1ターゲティングペプチド

（表２）各脳構造に対するAAV2ターゲティングペプチド

（表３）各脳構造に対するAAV9ターゲティングペプチド

（表４）さまざまな器官に対するAAV1ターゲティングペプチド

（表５）さまざまな器官に対するAAV2ターゲティングペプチド

（表６）さまざまな器官に対するAAV9ターゲティングペプチド

I. アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター
アデノ随伴ウイルス(AAV)はパルボウイルス科（Parvoviridae）の小さな非病原性ウイルスである。現在までに、血清学的に異なる数多くのAAVが同定されており、ヒトまたは霊長類からも12種類超が同定されている。AAVは、複製をヘルパーウイルスに依存する点で、この科の他のメンバーとは異なる。

AAVゲノムは、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく染色体外状態で存在すること、幅広い宿主域を有すること、インビトロおよびインビボで分裂細胞と非分裂細胞のどちらにも形質導入すること、ならびに形質導入された遺伝子の高レベルな発現を維持することができる。AAVウイルス粒子は熱安定性を有し、溶媒、洗浄剤、pH、および温度の変化に対して耐性であり、カラム精製することおよび/またはCsCl勾配もしくは他の手段によって濃縮することができる。AAVゲノムは、プラス鎖またはマイナス鎖の一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)を含む。AAVのおよそ4.7 kbのゲノムは、極性がプラスまたはマイナスである一本鎖DNAの1セグメントからなる。ゲノムの両端は、ヘアピン構造に折り畳まれてウイルスDNA複製の起点として機能することができる短い逆方向末端反復(ITR)である。

AAV「ゲノム」とは、最終的にはパッケージングまたは封入されてAAV粒子を形成する組換え核酸配列をいう。AAV粒子は、多くの場合、AAVキャプシドタンパク質でパッケージングされたAAVゲノムを含む。組換えベクターを構築または製造するために組換えプラスミドが使用される場合、AAVベクターゲノムは、「プラスミド」のうち、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない部分は含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、「プラスミドバックボーン」といわれ、これは、プラスミドの増殖と産生にとって必要なプロセスであるプラスミドのクローニングと増幅にとって重要であるが、それ自体がウイルス粒子にパッケージングまたは封入されることはない。したがってAAVベクター「ゲノム」とは、AAVキャプシドタンパク質によってパッケージングまたは封入される核酸をいう。

AAVビリオン(粒子)は、AAVキャプシドを含む直径がおよそ25 nmの無エンベロープ正二十面体粒子である。AAV粒子は、互いに相互作用してキャプシドを形成する3種類の関連キャプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3で構成された正二十面体対称性を含む。大半のネイティブAAVのゲノムは、2つの読み取り枠(ORF)を含有することが多く、これらは左側ORFおよび右側ORFといわれることもある。右側ORFは、多くの場合、キャプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3をコードする。これらのタンパク質は、多くの場合、それぞれ1:1:10の比で見い出されるが、比は異なる場合もあり、いずれも右手側ORFに由来する。VP1、VP2、およびVP3キャプシドタンパク質は、選択的スプライシングと珍しい開始コドンの使用によって、互いに異なる。欠失解析により、選択的スプライシングを受けるメッセージから翻訳されるVP1の除去または改造は、感染性粒子の収量の低減をもたらすことが示されている。VP3コード領域内の変異は、一本鎖子孫DNAまたは感染性粒子の産生不全をもたらす。ある特定の態様において、AAV粒子のゲノムは、VP1、VP2、およびVP3ポリペプチドのうちの1つ、2つまたは全3つをコードする。

左側ORFは、多くの場合、一本鎖子孫ゲノムの産生に加えて複製および転写の調節に関与する非構造Repタンパク質Rep40、Rep52、Rep68、およびRep78をコードする。Repタンパク質のうちの2つは、ヒト第19染色体のq腕の一領域へのAAVゲノムの優先的包含と関連付けられている。Rep68/78は、DNAヘリカーゼ活性およびRNAヘリカーゼ活性に加えてNTP結合活性を有することが示されている。いくつかのRepタンパク質は、いくつかの潜在的リン酸化部位と共に、核局在化シグナルを有する。ある特定の態様において、AAV (例えばrAAV)のゲノムは、Repタンパク質のうちの一部または全部をコードする。ある特定の態様において、AAV (例えばrAAV)のゲノムはRepタンパク質をコードしない。ある特定の態様において、Repタンパク質のうちの1つまたは複数は、トランスに送達することができるので、ポリペプチドをコードする核酸を含むAAV粒子には含まれない。

AAVゲノムの末端は、ウイルスDNA複製の起点として役立つT字型ヘアピン構造に折り畳まれる潜在能力を有する短い逆方向末端反復(ITR)を含む。したがってAAVのゲノムは、一本鎖ウイルスDNAゲノムに隣接する1つまたは複数(例えば一対)のITR配列を含む。ITR配列は、それぞれ約145塩基の長さを有することが多い。ITR領域内では、ITRの機能にとって中核であると考えられる2つの要素、GAGCリピートモチーフと末端解離部位(terminal resolution site: trs)が記述されている。リピートモチーフは、ITRが線状コンフォメーションまたはヘアピンコンフォメーションのどちらかにあるときに、Repに結合することが示されている。この結合は、部位および鎖特異的に起こるtrsでの開裂のためにRep68/78を位置決めすると考えられる。これら2つの要素は、複製におけるその役割に加えて、ウイルスの包含にとっても中核であると思われる。第19染色体組込座位にはtrsが隣接するRep結合部位が含まれている。これらの要素は、機能的であり、座位特異的な包含にとって必要であることが示されている。

組換えウイルスベクター、例えば組換えレンチウイルスまたは組換えパルボウイルス(例えばAAV)ベクターなどといった、ベクターの修飾語としての「組換え」という用語、ならびに組換え核酸配列または組換えポリペプチドなどといった配列の修飾語としての「組換え」という用語は、その組成物が、自然界では一般に起こらないような形で操作(すなわち工学的に操作)されていることを意味する。AAVベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどの組換えベクターの特定例は、野生型ウイルスゲノムに通常は存在しない核酸配列がウイルスゲノム内に挿入されているものである。組換え核酸配列の一例は、核酸(例えば遺伝子)が、ウイルスゲノム内でその遺伝子が通常伴っている5'領域、3'領域、および/またはイントロン領域と共に、またはそれらを伴わずに、ベクター中にクローニングされた阻害性RNAをコードするものである。「組換え」という用語は、ウイルスベクターなどのベクターおよびポリヌクレオチドなどの配列に関して、本明細書において常に使用されるわけではないが、核酸配列、ポリヌクレオチド、導入遺伝子などを含む「組換え」型は、そのような省略があっても、明らかに包含される。

組換えウイルス「ベクター」は、分子法を使用して、ウイルスから野生型ゲノムの部分を除去して核酸配列などの非ネイティブ核酸で置き換えることにより、ウイルスの野生型ゲノムから導かれる。典型的には、例えばAAVの場合であれば、AAVゲノムの一方または両方の逆方向末端反復(ITR)配列が、組換えAAVベクターにおいて保持される。「組換え」ウイルスベクター(例えばrAAV)は、ウイルスゲノムの部分が、ウイルスゲノム核酸と比較して、トランス活性化因子をコードする核酸または阻害性RNAをコードする核酸または治療用タンパク質をコードする核酸などの非ネイティブ配列で置き換えられている点で、ウイルス(例えばAAV)ゲノムとは区別される。それゆえ、そのような非ネイティブ核酸配列の組入れがそのウイルスベクターを「組換え」ベクターと規定し、AAVの場合であればそれを「rAAVベクター」ということができる。

ある特定の態様において、AAV (例えばrAAV)は2つのITRを含む。ある特定の態様において、AAV (例えばrAAV)は一対のITRを含む。ある特定の態様において、AAV (例えばrAAV)は、少なくとも機能または活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列に隣接する(すなわち核酸配列の5'末端および3'末端にそれぞれ存在する)一対のITRを含む。

AAVベクター（例えばrAAVベクター）はパッケージングされることができ、本明細書においてはそれを、エクスビボ、インビトロまたはインビボでの細胞の感染(形質導入)のための「AAV粒子」という。組換えAAVベクターがAAV粒子中に封入またはパッケージングされる場合は、その粒子を「rAAV粒子」ということもできる。ある特定の態様において、AAV粒子はrAAV粒子である。rAAV粒子は、多くの場合、rAAVベクターまたはその一部分を含む。rAAV粒子は、1つまたは複数のrAAV粒子(例えば複数のAAV粒子)であることができる。rAAV粒子は、典型的には、rAAVベクターゲノムを封入またはパッケージングするタンパク質(例えばキャプシドタンパク質)を含む。rAAVベクターへの言及はrAAV粒子に言及するためにも使用できることに留意されたい。

本明細書における方法または使用には、任意の適切なAAV粒子（例えばrAAV粒子）を使用することができる。rAAV粒子および/またはそこに含まれるゲノムは、AAVの任意の適切な血清型または株に由来することができる。rAAV粒子および/またはそこに含まれるゲノムは、AAVの2つまたはそれ以上の血清型または株に由来することができる。したがってrAAVは、AAVの任意の血清型または株のタンパク質および/もしくは核酸またはそれらの部分を含むことができ、そのAAV粒子は哺乳動物細胞の感染および/または形質導入に適している。AAV血清型の非限定的な例としては、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10およびAAV-2i8が挙げられる。

ある特定の態様において、複数のrAAV粒子は、同じ株もしくは血清型(またはサブグループもしくは変種)の粒子、または同じ株もしくは血清型(またはサブグループもしくは変種)に由来する粒子を含む。ある特定の態様において、複数のrAAV粒子は、2種類またはそれ以上の異なる(例えば異なる血清型および/または異なる株の) rAAV粒子の混合物を含む。

本明細書において使用される場合、「血清型」という用語は、他のAAV血清型とは血清学的に異なるキャプシドを有するAAVをいうために使用される特質である。血清学的特質は、別のAAVと比べてあるAAVに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。そのような交差反応性の相違は、通常、キャプシドタンパク質配列/抗原決定基の相違による(例えばAAV血清型のVP1、VP2および/またはVP3配列の相違による)。キャプシド変種を含むAAV変種が参照AAV血清型または他のAAV血清型と血清学的に異ならない可能性はあっても、それらは、参照血清型または他のAAV血清型と比べて、少なくとも1つのヌクレオチド残基またはアミノ酸残基が異なる。

ある特定の態様において、第1血清型ゲノムに基づくrAAVベクターは、ベクターをパッケージングするキャプシドタンパク質のうちの1つまたは複数の血清型に対応する。例えば、AAVベクターゲノムを構成する1つまたは複数のAAV核酸(例えばITR)の血清型は、rAAV粒子を構成するキャプシドの血清型に対応する。

ある特定の態様において、rAAVベクターゲノムは、ベクターをパッケージングするAAVキャプシドタンパク質のうちの1つまたは複数の血清型に由来するAAV (例えばAAV2)血清型ゲノムに基づくことができる。例えばrAAVベクターゲノムはAAV2由来の核酸(例えばITR)を含むことができ、一方、3つのキャプシドタンパク質のうちの少なくとも1つまたは複数は、異なる血清型、例えばAAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74もしくはAAV-2i8血清型またはそれらの変種に由来する。

ある特定の態様において、参照血清型に関連するrAAV粒子またはそのベクターゲノムは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74またはAAV-2i8粒子のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは部分配列と少なくとも60%またはそれ以上(例えば65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%など)同一である配列を含むかまたはそのような配列からなるポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはそれらの部分配列を有する。特定の態様において、参照血清型に関連するrAAV粒子またはそのベクターゲノムは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74またはAAV-2i8血清型のキャプシドまたはITR配列と少なくとも60%またはそれ以上(例えば65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%など)同一である配列を含むかまたはそのような配列からなるキャプシドまたはITR配列を有する。

ある特定の態様において、本明細書における方法は、rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12、rRh10、rRh74、またはrAAV-2i8粒子の使用、投与、または送達を含む。

ある特定の態様において、本明細書における方法は、rAAV2粒子の使用、投与、または送達を含む。ある特定の態様において、rAAV2粒子はAAV2キャプシドを含む。ある特定の態様において、rAAV2粒子は、ネイティブAAV2粒子または野生型AAV2粒子の対応するキャプシドタンパク質と少なくとも60%、65%、70%、75%、またはそれ以上同一、例えば80%、85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%など、最大100%同一である、1つまたは複数のキャプシドタンパク質(例えばVP1、VP2および/またはVP3)を含む。ある特定の態様において、rAAV2粒子は、ネイティブAAV2粒子または野生型AAV2粒子の対応するキャプシドタンパク質と少なくとも75%またはそれ以上同一、例えば80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%など、最大100%同一である、VP1、VP2およびVP3キャプシドタンパク質を含む。ある特定の態様において、rAAV2粒子はネイティブAAV2粒子または野生型AAV2粒子の変種である。いくつかの局面において、AAV2変種の1つまたは複数のキャプシドタンパク質は、ネイティブAAV2粒子または野生型AAV2粒子のキャプシドタンパク質と比べて、1、2、3、4、5、5～10、10～15、15～20個、またはそれ以上のアミノ酸置換を有する。

ある特定の態様において、rAAV9粒子はAAV9キャプシドを含む。ある特定の態様において、rAAV9粒子は、ネイティブAAV9粒子または野生型AAV9粒子の対応するキャプシドタンパク質と少なくとも60%、65%、70%、75%、またはそれ以上同一、例えば80%、85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%など、最大100%同一である、1つまたは複数のキャプシドタンパク質(例えばVP1、VP2および/またはVP3)を含む。ある特定の態様において、rAAV9粒子は、ネイティブAAV9粒子または野生型AAV9粒子の対応するキャプシドタンパク質と少なくとも75%またはそれ以上同一、例えば80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%など、最大100%同一である、VP1、VP2およびVP3キャプシドタンパク質を含む。ある特定の態様において、rAAV9粒子はネイティブAAV9粒子または野生型AAV9粒子の変種である。いくつかの局面において、AAV9変種の1つまたは複数のキャプシドタンパク質は、ネイティブAAV9粒子または野生型AAV9粒子のキャプシドタンパク質と比べて、1、2、3、4、5、5～10、10～15、15～20個、またはそれ以上のアミノ酸置換を有する。

ある特定の態様において、rAAV粒子は、それらが1つまたは複数の所望のITR機能(例えばDNA複製を可能にするヘアピンを形成する能力、宿主細胞ゲノムへのAAV DNAの包含、および/または所望であればパッケージング)を保持している限り、ネイティブのまたは野生型のAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10またはAAV-2i8の対応するITRと少なくとも75%またはそれ以上同一、例えば80%、85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%など、最大100%同一である、1つまたは2つのITR (例えば一対のITR)を含む。

ある特定の態様において、rAAV2粒子は、それらが1つまたは複数の所望のITR機能(例えばDNA複製を可能にするヘアピンを形成する能力、宿主細胞ゲノムへのAAV DNAの包含、および/または所望であればパッケージング)を保持している限り、ネイティブのまたは野生型のAAV2粒子の対応するITRと少なくとも75%またはそれ以上同一、例えば80%、85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%など、最大100%同一である、1つまたは2つのITR (例えば一対のITR)を含む。

ある特定の態様において、rAAV9粒子は、それらが1つまたは複数の所望のITR機能(例えばDNA複製を可能にするヘアピンを形成する能力、宿主細胞ゲノムへのAAV DNAの包含、および/または所望であればパッケージング)を保持している限り、ネイティブのまたは野生型のAAV2粒子の対応するITRと少なくとも75%またはそれ以上同一、例えば80%、85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%など、最大100%同一である、1つまたは2つのITR (例えば一対のITR)を含む。

rAAV粒子は、任意の適切な数の「GAGC」リピートを有するITRを含むことができる。ある特定の態様において、AAV2粒子のITRは1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個、またはそれ以上の「GAGC」リピートを含む。ある特定の態様において、rAAV2粒子は3つの「GAGC」リピートを含むITRを含む。ある特定の態様において、rAAV2粒子は、4つ未満の「GAGC」リピートを有するITRを含む。ある特定の態様において、rAAV2粒子は、4つより多い「GAGC」リピートを有するITRを含む。ある特定の態様において、rAAV2粒子のITRは、最初の2つの「GAGC」リピートにおける4番目のヌクレオチドがTではなくCであるRep結合部位を含む。

rAAV粒子へのパッケージング/キャプシド化のためにrAAVベクターに組み入れることができるDNAの適切な長さの例は、約5キロベース(kb)またはそれ未満であることができる。特定の態様において、DNAの長さは、約5 kb未満、約4.5 kb未満、約4 kb未満、約3.5 kb未満、約3 kb未満、または約2.5 kb未満である。

RNAiまたはポリペプチドの発現を指令する核酸配列を含むrAAVベクターは、当技術分野において公知の適切な組換え技法を使って作製することができる(例えばSambrook et al.,1989参照)。組換えAAVベクターは、典型的には、形質導入可能なAAV粒子にパッケージングされ、AAVウイルスパッケージングシステムを使って増殖される。形質導入可能なAAV粒子は、哺乳動物細胞に結合して進入し、続いてその核酸カーゴ(例えば異種遺伝子)を細胞の核に送達する能力を有する。したがって、形質導入可能である無傷のrAAV粒子は、哺乳動物細胞に形質導入するように構成される。哺乳動物細胞に形質導入するように構成されたrAAV粒子は、複製可能でないことが多く、自己複製するには追加のタンパク質機構を必要とする。したがって、哺乳動物細胞に形質導入するように構成されたrAAV粒子は、哺乳動物細胞に結合して進入し、その細胞に核酸を送達するように工学的に操作されており、送達される核酸は、多くの場合、rAAVゲノム中の一対のAAV ITRの間に配置されている。

形質導入可能なAAV粒子を産生するための適切な宿主細胞としては、異種rAAVベクターのレシピエントとして使用することができるか、または異種rAAVベクターのレシピエントとして使用されたものである微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられるが、それらに限定されることはない。安定ヒト細胞株HEK293 (例えばAmerican Type Culture Collectionから受託番号ATCC CRL1573の下に容易に入手できる)を使用することができる。ある特定の態様において、アデノウイルス5型DNA断片で形質転換されていてアデノウイルスのE1a遺伝子とE1b遺伝子を発現させる改変ヒト胎児腎臓細胞株(例えばHEK293)が、組換えAAV粒子を作製するために使用される。改変HEK293細胞株は容易にトランスフェクトされ、rAAV粒子を産生するためのとりわけ好都合なプラットフォームになる。哺乳動物細胞に形質導入する能力を有する高力価のAAV粒子を作製する方法は当技術分野において公知である。例えばAAV粒子は、Wright,2008およびWright,2009に記載されているように作ることができる。

ある特定の態様において、AAVヘルパー機能は、AAV発現ベクターのトランスフェクションの前に、またはAAV発現ベクターのトランスフェクションと同時に、AAVヘルパーコンストラクトを宿主細胞にトランスフェクトすることによって、宿主細胞に導入される。このように、場合によっては、産生的AAV形質導入に必要な欠落したAAV機能を補完する目的で、AAVのrep遺伝子および/またはcap遺伝子を少なくとも一過性に発現させるために、AAVヘルパーコンストラクトが使用される。AAVヘルパーコンストラクトは、多くの場合、AAV ITRを欠き、複製することも自分自身をパッケージングすることもできない。これらのコンストラクトは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態をとることができる。Rep発現産物とCap発現産物をどちらもコードするよく使用されるプラスミドpAAV/AdおよびpIM29＋45など、いくつかのAAVヘルパーコンストラクトが記述されている。Rep発現産物および/またはCap発現産物をコードするいくつかの他のベクターも公知である。

「発現ベクター」は、遺伝子または核酸配列を宿主細胞における発現に必要な必須の調節領域と共に含有する特殊なベクターである。発現ベクターは、少なくとも細胞内で増殖するための複製起点と、任意で追加の要素、例えば異種核酸配列、発現制御要素(例えばプロモーター、エンハンサー)、イントロン、ITR、およびポリアデニル化シグナルを含有しうる。

II. 治療用物質
いくつかの態様において、ウイルス遺伝子移入法を使用して、哺乳動物細胞または標的組織に核酸を導入することができる。そのような方法を使用して、阻害性RNA、非コードRNA、および/または治療用タンパク質をコードする核酸を、培養中または宿主生物中の細胞に投与することができる。

A. 阻害性RNA
「RNA干渉(RNAi)」は、siRNAによって開始される配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。RNAi中に、siRNAは標的mRNAの分解を誘導し、その結果、遺伝子発現の配列特異的阻害が起こる。

「阻害性RNA」、「RNAi」、「低分子干渉RNA」または「短鎖干渉RNA」または「siRNA」分子、「短鎖ヘアピンRNA」または「shRNA」分子、または「miRNA」は、関心対象の核酸配列を標的にするヌクレオチドのRNA二重鎖である。本明細書において使用される場合、「siRNA」という用語はshRNAおよびmiRNAの部分集合を包含する一般名である。「RNA二重鎖」とは、RNA分子の2つの領域間の相補的対合によって形成される構造をいう。siRNAの二重鎖部分のヌクレオチド配列は標的となる遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるので、siRNAはその遺伝子を「標的にする」。ある特定の態様において、siRNAはハンチントンをコードする配列を標的にする。いくつかの態様において、siRNAの二重鎖の長さは30塩基対未満である。いくつかの態様において、二重鎖は、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、または10塩基対長であることができる。いくつかの態様において、二重鎖の長さは19～25塩基対長である。ある特定の態様において、二重鎖の長さは19塩基対長または21塩基対長である。siRNAのRNA二重鎖部分はヘアピン構造の一部であることができる。ヘアピン構造は、二重鎖部分に加えて、二重鎖を形成する2つの配列の間に位置するループ部分を含有する。ループの長さはさまざまでありうる。いくつかの態様において、ループは5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチド長である。ある特定の態様において、ループは18ヌクレオチド長である。ヘアピン構造は3'突出部および/または5'突出部も含有することができる。いくつかの態様において、突出部は、0、1、2、3、4、または5ヌクレオチド長の3'突出部および/または5'突出部である。

shRNAは、5'隣接領域、siRNA領域セグメント、ループ領域、3'siRNA領域および3'隣接領域を含有するようにデザインされたステム-ループ構造で構成される。大半のRNAi発現戦略では、強力なpolIII系プロモーターによって駆動される短鎖ヘアピンRNA (shRNA)が用いられてきた。多くのshRNAはインビトロでもインビボでも標的配列の効果的なノックダウンを示すが、標的遺伝子の効果的なノックダウンを示す一部のshRNAは、インビボで毒性を有することも見い出された。

miRNAは、前駆体ステムループ転写産物からプロセッシングされる小さな細胞性RNA (およそ22 nt)である。公知のmiRNAステムループは、関心対象の遺伝子に特異的なRNAi配列を含有するように改変することができる。miRNA分子はshRNA分子より好ましい場合がある。なぜならmiRNAは内因性に発現されるからである。それゆえに、miRNA分子は、dsRNA応答性インターフェロン経路を誘導する可能性が低く、shRNAより効率よくプロセッシングされ、shRNAよりも80%効果的にサイレンシングを行うことが示されている。

最近発見された代替的アプローチは、RNAiベクターとしての人工miRNA (siRNA配列をシャトルするpri-miRNAスキャフォールド)の使用である。人工miRNAの方が、内在性RNAi基質と、より自然に類似し、Pol-II転写(例えばRNAiの組織特異的発現が可能になる)およびポリシストロニック戦略(例えば複数のsiRNA配列の送達が可能になる)にも、より適している。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第10,093,927号を参照されたい。

「shRNA」の転写単位は、不対ヌクレオチドのループでつながれたセンス配列とアンチセンス配列とで構成される。shRNAはエクスポーチン-5によって核から搬出され、細胞質に入るとダイサー(Dicer)によるプロセッシングを受けて、機能的siRNAを生成する。「miRNA」のステム-ループは不対ヌクレオチドのループでつながれたセンス配列とアンチセンス配列とで構成され、これは、典型的には、より大きな一次転写産物(pri-miRNA)の一部として発現され、それがドローシャ-DGCR8複合体によって切り出されてプレmiRNAとして公知の中間体を生成し、次にそれがエクスポーチン-5によって核から搬出され、細胞質に入ると、ダイサーによるプロセッシングを受けて、機能的siRNAを生成する。本明細書において互換的に使用される場合、「人工miRNA」または「人工miRNAシャトルベクター」とは、ドローシャおよびダイサープロセッシングによって切り出される二重鎖ステムループの領域(少なくとも約9～20ヌクレオチド)が、効果的なドローシャプロセッシングに必要なステムループ内の構造要素を保ちつつ、標的遺伝子用のsiRNA配列で置き換えられている一次miRNA転写産物をいう。「人工」という用語は、隣接配列(上流のおよそ35ヌクレオチドおよび下流のおよそ40ヌクレオチド)がsiRNAのマルチクローニング部位内の制限酵素部位に由来するという事実に由来している。本明細書において使用される場合、「miRNA」という用語は、天然のmiRNA配列と、人工的に作製されたmiRNAシャトルベクターを、どちらも包含する。

siRNAは核酸配列によってコードすることができ、その核酸配列はプロモーターも含むことができる。この核酸配列はポリアデニル化シグナルも含むことができる。いくつかの態様において、ポリアデニル化シグナルは合成最小ポリアデニル化シグナルまたは6つのTの配列である。

RNAiのデザインでは、siRNAの性質、サイレンシング効果の永続性および送達システムの選択など、考慮する必要のある因子が、いくつかある。RNAi効果を生じさせるために、生物に導入されるsiRNAは典型的にはエクソン配列(exonic sequence)を含有する。さらにまた、RNAiプロセスは相同性に依存するので、配列は、相同的ではあるが遺伝子特異的ではない配列間の交差干渉の可能性を最小限に抑えつつ遺伝子特異性が最大になるように、注意深く選択されなければならない。好ましくは、siRNAは、siRNAの配列と阻害されるべき遺伝子との間に、80%、85%、90%、95%、または98%より大きい同一性、さらには100%の同一性を呈する。標的遺伝子に対する同一性が約80%未満である配列は有効性がかなり低い。したがって、siRNAと阻害されるべき遺伝子との間の相同性が高いほど、無関係な遺伝子の発現が影響を受ける可能性は低くなる。

加えて、siRNAのサイズも重要な考慮事項である。いくつかの態様において、本発明は、少なくとも約19～25ヌクレオチドを含み、遺伝子発現を調整することができる、siRNA分子に関する。本発明に関して、siRNAは、好ましくは、500、200、100、50、または25ヌクレオチド長未満である。より好ましくは、siRNAは約19ヌクレオチド～約25ヌクレオチド長である。

siRNA標的とは、一般に、ポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチド、または複製、転写もしくは翻訳もしくはポリペプチドの発現にとって重要な他のプロセスを調節するポリヌクレオチド領域を含むポリヌクレオチド、またはポリペプチドをコードする領域とそれに機能的に連結された領域であって発現を調節するものとをどちらも含むポリヌクレオチドを意味する。細胞中で発現する遺伝子はどれでも標的とすることができる。好ましくは、標的遺伝子は、疾患にとって重要な細胞活動の進行、または研究対象として特に関心がある細胞活動の進行に、関与または関連するものである。

B. 非コードRNA
cDNAクローニングプロジェクトおよびゲノムタイリングアレイによって証明されているように、ヒトゲノムの90%超は転写を受けるが、タンパク質をコードしていない。これらの転写産物は、非タンパク質コードRNA (ncRNA)といわれる。リボソームRNA、トランスファーRNA、競合内在性RNA (ceRNA)、低分子核RNA (snRNA)、および低分子核小体RNA (snoRNA)などの、種々のncRNA転写産物が細胞機能に不可欠である。同様に、マイクロRNA (miRNA)、内在性短干渉RNA (siRNA)、PIWI相互作用RNA (piRNA)、および低分子核小体RNA (snoRNA)などの、多数の短いncRNAも、真核細胞において重要な調節的役割を果たすことが知られている。最近の研究では、細胞型特異的な発現を示し、特定の細胞内区画に局在する長鎖ncRNA (lncRNA)転写産物の群が実証されている。lncRNAは、細胞の発達および分化の間に重要な役割を果たすことも知られており、進化の過程で選択されたという見解を支持している。

LncRNAは多くの異なる機能を有するようである。多くの場合、それらはタンパク質の活性または局在を調節する役割を果たすか、または細胞内構造の組織的枠組みとして機能するようである。他の場合、lncRNAは複数の低分子RNAを生じるようにプロセッシングされ、または他のRNAのプロセッシング方法を調整しうる。公的研究コンソーシアムGenCode (バージョン番号27)によって生成されたデータの最新版では、ヒトゲノムにおける16,000種類をわずかに下回るlncRNAをカタログ化し、28,000種類近くの転写産物を生成し; 他のデータベースが含まれている場合、40,000種類を超えるlncRNAが知られている。

興味深いことに、lncRNAは、特定のゲノム遺伝子座における特定の標的タンパク質の発現に影響を与え、タンパク質結合パートナーの活性を調整し、クロマチン修飾複合体をその作用部位に誘導し、転写後プロセッシングされて多数の5'キャップされた低分子RNAを生成しうる。後成的経路が、lncRNAの差次的発現を調節することもできる。

異常に発現されたlncRNAが、正常な生理学的プロセスおよび複数の疾患状態において重要な役割を果たすことを示唆する証拠も増えてきている。lncRNAは、虚血、心臓疾患、アルツハイマー病、乾癬、および脊髄小脳失調症8型を含め、さまざまな疾患において誤調節されている。この誤調節は、乳がん、結腸がん、前立腺がん、肝細胞がんおよび白血病などの、さまざまなタイプのがんにおいても示されている。いくつかのlncRNA、例えばgadd74およびlncRNA-RoR5は、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)、CDK阻害剤およびp53などの細胞周期調節因子を調整し、したがって細胞周期の進行にさらなる柔軟性およびロバスト性を提供する。さらに、一部のlncRNAは、動原体形成に不可欠であり、したがってヒトおよびハエでの有糸分裂中の染色体分離に重要な、セントロメアサテライトRNAなどの有糸分裂プロセスに関連している。別の核lncRNAであるMA-linclは、シスで機能して細胞増殖の調節因子である隣接遺伝子Puraの発現を抑制することにより、M期の出口を調節する。

lncRNAは、拡張された読み取り枠(ORF)を欠く200ヌクレオチド超(例えば、約200～約1200 nt、約2500 nt、またはそれ以上)の転写産物として一般的に定義される群である。「非コードRNA」(ncRNA)という用語は、lncRNAおよび例えば、約30～200 ntなどの、約200 nt未満の短い転写産物を含む。

したがって、いくつかの態様において、例えば関心対象の特定の脳構造への、ncRNAの送達は、異常なRNA発現レベルを修正し、または疾患を引き起こすlncRNAのレベルを調整する。したがって、いくつかの態様において、本発明は、ウイルスゲノムが治療用非コードRNA (ncRNA)をコードするように工学的に操作されている、rAAVを提供する。いくつかの態様において、ncRNAは、長さが約200ヌクレオチド(nt)またはそれ以上の長鎖非コードRNA (lncRNA)である。いくつかの態様において、治療用物質は、長さが約25 ntまたは約30 nt～約200 ntのncRNAである。いくつかの態様において、lncRNAは、長さが約200 nt～約1,200 ntである。いくつかの態様において、lncRNAは、長さが約200 nt～約1,100、約1,000、約900、約800、約700、約600、約500、約400、または約300 ntである。

C. CRISPRシステム
遺伝子編集は生細胞内での標的遺伝子の改変を可能にする技術である。近年、細菌のCRISPR免疫システムを用いるオンデマンド遺伝子編集の実施は、科学者がゲノム編集にアプローチする方法に大きな変革をもたらした。RNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼであるCRISPRシステムのCas9タンパク質は、そのガイドRNA配列を変化させることによって比較的容易に、新しい部位を標的とするように工学的に操作することができる。この発見により、配列特異的遺伝子編集は、機能的に有効になった。

一般に「CRISPRシステム」とは、CRISPR関連(「Cas」)遺伝子の発現またはその活性の方向付けに関与する転写産物および他の要素、例えばCas遺伝子をコードする配列、tracr (トランス活性化CRISPR)配列(例えばtracrRNAまたは活性な部分tracrRNA)、tracr-mate配列(「ダイレクトリピート」および内在性CRISPRシステムの場合はtracrRNAプロセシングを受けた部分ダイレクトリピートを包含する)、ガイド配列(内在性CRISPRシステムの場合は「スペーサー」ともいわれる)ならびに/またはCRISPR遺伝子座からの他の配列および転写産物を、集合的にいう。

CRISPR/CasヌクレアーゼまたはCRISPR/Casヌクレアーゼシステムは、DNAに配列特異的に結合する非コードRNA分子(ガイド) RNAと、ヌクレアーゼ機能性(例えば2つのヌクレアーゼドメイン)を持つCasタンパク質(例えばCas9)とを含むことができる。CRISPRシステムの1つまたは複数の要素は、I型、II型またはIII型CRISPRシステムに由来することができ、例えば内在性CRISPRシステムを含む特定生物、例えば化膿性レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)に由来することができる。

CRISPRシステムは、本明細書において論じられるように、標的部位における二本鎖切断(double stranded break: DSB)と、それに続く分断を誘導することができる。別の態様において、標的部位において一本の鎖にニックを入れるために、「ニッカーゼ」とみなされるCas9変種が使用される。例えば特異性を改良するなどの目的で、ニックが同時に導入された場合に5'突出部が導入されるような形で配列を標的とする一対の異なるgRNAによってそれぞれが方向付けられるニッカーゼのペアを使用することができる。別の態様において、触媒的に不活性なCas9が、遺伝子発現に影響を及ぼすために、転写抑制因子(例えばKRAB)または転写活性化因子などの異種エフェクタドメインに融合される。あるいは、触媒的に不活性なCas9によるCRISPRシステムは、リボソーム結合タンパク質に融合された転写抑制因子または転写活性化因子をさらに含む。

いくつかの局面において、CasヌクレアーゼおよびgRNA (標的配列に特異的なcrRNAと不変のtracrRNAとの融合物を含む)が細胞に導入される。一般に、gRNAの5'末端にある標的部位は、相補的塩基対合を使って、Casヌクレアーゼを標的部位、例えば遺伝子へターゲティングさせる。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列、例えば典型的にはNGGまたはNAGのすぐ5'側というその位置に基づいて選択されうる。この点において、gRNAは、ガイドRNAの最初の20、19、18、17、16、15、14、14、12、11、または10ヌクレオチドを標的DNA配列に対応するように改変することによって、所望の配列を標的にする。一般にCRISPRシステムは、標的配列の部位におけるCRISPR複合体の形成を促進する要素によって特徴付けられる。通例、「標的配列」とは、一般に、ガイド配列がそれに対する相補性を有するようにデザインされる配列をいい、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションが、CRISPR複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こしてCRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補性があるならば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。

標的配列は、DNAポリヌクレオチドまたはRNAポリヌクレオチドなど、任意のポリヌクレオチドを含みうる。標的配列は、細胞の小器官内など、細胞の核内または細胞質内に位置しうる。一般に、標的配列を含む標的となる遺伝子座への組換えのために使用されうる配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」といわれる。いくつかの局面において、外因性鋳型ポリヌクレオチドは編集鋳型といわれうる。いくつかの局面において、組換えは相同組換えである。

通例、内在性CRISPRシステムの場合、CRISPR複合体(標的配列にハイブリダイズして1つまたは複数のCasタンパク質との複合体を形成しているガイド配列を含む)の形成は、標的配列内または標的配列近傍(例えば標的配列から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50塩基対以内、またはそれ以上の塩基対以内)における一方または両方の鎖の開裂をもたらす。野生型tracr配列の全部もしくは一部(例えば、野生型tracr配列のうちの約20、26、32、45、48、54、63、67、85個、もしくはそれ以上のヌクレオチド、または約20、26、32、45、48、54、63、67、85個、もしくはそれ以上を上回るヌクレオチド)を含みうるまたはそれらからなりうるtracr配列も、例えばtracr配列の少なくとも一部分に沿った、ガイド配列に機能的に連結されたtracr mate配列の全部または一部へのハイブリダイゼーションなどによって、CRISPR複合体の一部を形成しうる。tracr配列は、tracr mate配列に対して、ハイブリダイズしてCRISPR複合体の形成に参加するのに十分な相補性、例えば最適にアライメントした場合にtracr mate配列の全長にわたって少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%の配列相補性を有する。

CRISPRシステムの1つまたは複数の要素の発現を駆動する1つまたは複数のベクターを細胞中に導入して、CRISPRシステムのそれら要素の発現が、1つまたは複数の標的部位におけるCRISPR複合体の形成を指令するようにすることができる。構成要素をタンパク質および/またはRNAとして細胞に送達することもできる。例えばCas酵素、tracr-mate配列に連結されたガイド配列、およびtracr配列を、それぞれ別々のベクター上の別々の調節要素に機能的に連結することができる。Cas酵素は、キメラ標的遺伝子ミニ遺伝子としてまたはキメラミニ遺伝子トランス活性化因子にとっての標的遺伝子として本明細書において開示される調節選択的スプライシング事象の制御を受ける標的遺伝子でありうる。gRNAは構成的プロモーターの制御を受けうる。

あるいは、同じ調節要素または異なる調節要素から発現される2つまたはそれ以上の要素を一つのベクター中で組み合わせ、1つまたは複数の追加ベクターが第1ベクター中に含まれていないCRISPRシステムの任意の構成要素を提供してもよい。ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列(「クローニング部位」ともいう)など、1つまたは複数の挿入部位を含みうる。いくつかの態様において、1つまたは複数の挿入部位は、1つまたは複数のベクターの1つまたは複数の配列要素の上流および/または下流に位置する。複数の異なるガイド配列を使用すれば、単一の発現コンストラクトを使って、CRISPR活性を細胞内の対応する複数の標的配列へターゲティングさせうる。

ベクターは、Casタンパク質などのCRISPR酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された調節要素を含みうる。Casタンパク質の非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (Csn1およびCsx12としても公知である)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、それらの相同体、またはそれらの改変型が挙げられる。これらの酵素は公知である。例えば化膿レンサ球菌(S. pyogenes) Cas9タンパク質のアミノ酸配列は、SwissProtデータベースにアクセッション番号Q99ZW2として見い出されうる。

CRISPR酵素はCas9 (例えば化膿レンサ球菌または肺炎球菌(S. pneumonia)由来のもの)であることができる。CRISPR酵素は、標的配列の場所、例えば標的配列内および/または標的配列の相補鎖内において、一方または両方の鎖の開裂を指令することができる。ベクターは、対応する野生型酵素と比較して突然変異型CRISPR酵素が標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を開裂する能力を欠くように変異させたCRISPR酵素をコードすることができる。例えば、化膿レンサ球菌由来のCas9のRuvC I触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換(D10A)は、Cas9を、両方の鎖を開裂するヌクレアーゼからニッカーゼ(一本の鎖を開裂するもの)へと変換する。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼは、ガイド配列と組み合わせて、例えばDNA標的のセンス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれ標的とする2つのガイド配列と組み合わせて、使用しうる。この組み合わせは、両方の鎖にニックを入れて、それらをNHEJまたはHDRの誘導に使用することを可能にする。

いくつかの態様において、CRISPR酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定細胞における発現に関してコドン最適化される。真核細胞は、例えば限定されるわけではないがヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたは非ヒト霊長類を含む哺乳動物などといった特定生物のものであるか、それら特定生物に由来しうる。一般に、コドン最適化とは、関心対象の宿主細胞における発現を強化するために、ネイティブ配列の少なくとも1つのコドンを、ネイティブアミノ酸配列を維持しつつ、当該宿主細胞の遺伝子中でより高頻度にまたは最も高頻度に使用されているコドンで置き換えることによって核酸配列に改変を加えるプロセスをいう。さまざまな種が、特定アミノ酸のある特定のコドンに対して、特定のバイアスを呈する。コドンバイアス(生物間でのコドン使用頻度の相違)は、多くの場合、メッセンジャーRNA (mRNA)の翻訳効率と相関し、そしてそれは、なかんずく、翻訳されるコドンの特性および特定トランスファーRNA (tRNA)分子の使用可能性に依存すると考えられている。ある細胞における選ばれたtRNAの優勢は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度に使用されるコドンの反映である。したがって遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現に適合させることができる。

一般にガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして、標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指令するのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの態様において、ガイド配列とその対応標的配列との間の相補性の程度は、適切なアライメントアルゴリズムを使って最適にアライメントした場合に、約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、もしくはそれ以上であるか、または約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、もしくはそれ以上を上回る。

最適なアライメントは、配列をアライメントするための任意の適切なアルゴリズムを使って決定することができ、そのようなアルゴリズムの非限定的な例としては、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler変換に基づくアルゴリズム(例えばBurrows Wheeler Aligner)、Clustal W、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies)、ELAND(Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ)、SOAP (soap.genomics.org.cnで利用可能)およびMaq (maq.sourceforge.netで利用可能)が挙げられる。

CRISPR酵素は、1つまたは複数の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であってもよい。CRISPR酵素融合タンパク質は、任意の追加タンパク質配列と、任意で、任意の2つのドメイン間にあるリンカー配列とを含みうる。CRISPR酵素に融合されうるタンパク質ドメインの例としては、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および以下の活性のうちの1つまたは複数を有するタンパク質ドメインが挙げられるが、それらに限定されることはない: メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、RNA切断活性および核酸結合活性。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン(His)タグ、V5タグ、FLAGタグ、インフルエンザヘマグルチニン(HA)タグ、Mycタグ、VSV-Gタグ、およびチオレドキシン(Trx)タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、グルタチオン-5-トランスフェラーゼ(GST)、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、および青色蛍光タンパク質(BFP)を含む自家蛍光タンパク質が挙げられるが、それらに限定されることはない。CRISPR酵素は、DNA分子に結合するか他の細胞性分子に結合するタンパク質またはそのようなタンパク質の断片、例えば限定されるわけではないが、マルトース結合タンパク質(MBP)、S-タグ、Lex A DNA結合ドメイン(DBD)融合物、GAL4A DNA結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス(HSV) BP16タンパク質融合物などをコードする遺伝子配列に融合されうる。CRISPR酵素を含む融合タンパク質の一部を形成しうるさらなるドメインは、参照により本明細書に組み入れられるUS 20110059502に記述されている。

D. 治療用タンパク質
いくつかの態様は組換えタンパク質および組換えポリペプチドの発現に関する。いくつかの局面において、血清中安定性を増加させるために、タンパク質またはポリペプチドを改変しうる。したがって、本出願が「改変タンパク質」または「改変ポリペプチド」の機能または活性に言及する場合、それが、例えば無改変のタンパク質またはポリペプチドと比べて付加的な利点を有するタンパク質またはポリペプチドを包含することは、当業者には理解されるであろう。「改変タンパク質」に関する態様は「改変ポリペプチド」についても実施することができ、逆もまたそうであると、特に考えられる。

組換えタンパク質はアミノ酸の欠失および/または置換を保有しうる。したがって、欠失を有するタンパク質、置換を有するタンパク質、および欠失と置換とを有するタンパク質は、改変タンパク質である。いくつかの態様において、これらのタンパク質は、例えば融合タンパク質またはリンカーを有するタンパク質など、挿入または付加されたアミノ酸を、さらに含みうる。「改変欠失タンパク質」は、ネイティブタンパク質の1つまたは複数の残基を欠くが、ネイティブタンパク質の特異性および/または活性は有しうる。「改変欠失タンパク質」は低減した免疫原性または抗原性も有しうる。改変欠失タンパク質の例は、少なくとも1つの抗原領域から、すなわち特定の生物において、例えば改変タンパク質が投与される生物において、抗原性であると決定されたタンパク質の領域から、アミノ酸残基が欠失しているものである。

置換変種または置き換え変種は、典型的には、タンパク質内の1つまたは複数の部位におけるあるアミノ酸と別のアミノ酸との交換を含有し、ポリペプチドの1つまたは複数の性質、特にそのエフェクタ機能および/またはバイオアベイラビリティを調整するようにデザインされうる。置換は保存的置換、すなわちあるアミノ酸が類似する形状および電荷を持つもので置き換えられる置換であってもよいし、そうでなくてもよい。保存的置換は当技術分野において周知であり、これには、例えばアラニンからセリンへの変化、アルギニンからリジンへの変化、アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへの変化、アスパラギン酸からグルタミン酸への変化、システインからセリンへの変化、グルタミンからアスパラギンへの変化、グルタミン酸からアスパラギン酸への変化、グリシンからプロリンへの変化、ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへの変化、イソロイシンからロイシンまたはバリンへの変化、ロイシンからバリンまたはイソロイシンへの変化、リジンからアルギニンへの変化、メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへの変化、フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの変化、セリンからスレオニンへの変化、スレオニンからセリンへの変化、トリプトファンからチロシンへの変化、チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変化、およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化が含まれる。

欠失または置換に加えて、改変タンパク質は残基の挿入を保有しうる。これは、典型的には、ポリペプチドにおける少なくとも1つの残基の付加を伴う。これには、ターゲティングペプチドまたはターゲティングポリペプチドの挿入または単なる単一残基の挿入が含まれうる。融合タンパク質と呼ばれる末端付加については後述する。

「生物学的に機能的な等価物」という用語は、当技術分野においてよく理解されており、本明細書においてもさらに詳述する。したがって、約70%～約80%、または約81%～約90%、さらには約91%～約99%のアミノ酸が、対照ポリペプチドのアミノ酸と同一であるか機能的に等価である配列は、そのタンパク質の生物学的活性が維持されている限り、包含される。組換えタンパク質は、ある特定の局面において、対応するネイティブタンパク質に対する生物学的に機能的な等価物でありうる。

アミノ酸配列および核酸配列が追加残基、例えば追加のN末端アミノ酸もしくはC末端アミノ酸、または5'配列もしくは3'配列を含みうること、そしてそれでもなお、その配列が、タンパク質発現が関係する場合であれば生物学的なタンパク質活性の維持を含む上述の基準を満たす限り、本質的に本明細書において開示する配列の一つにおいて説明するとおりであることも理解されるであろう。末端配列の付加は、例えばコード領域の5'部分または3'部分のどちらかに隣接するさまざまな非コード配列を含むか、または遺伝子内に存在することが公知であるさまざまな内部配列、すなわちイントロンを含みうる核酸配列に、特に当てはまる。

本明細書において使用される場合、タンパク質またはペプチドは一般に、遺伝子から翻訳される約200アミノ酸超、最大で完全長配列までのタンパク質; 約100アミノ酸を超えるポリペプチド; および/または約3～約100アミノ酸のペプチドをいうが、それらに限定されることはない。便宜上、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。

本明細書において使用される場合、「アミノ酸残基」とは、任意の天然アミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または当技術分野において公知である任意のアミノ酸模倣物(mimic)をいう。ある特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基は、アミノ酸残基の配列を中断する非アミノ酸配列を何も持たず、連続的である。別の態様において、配列が1つまたは複数の非アミノ酸部分を含みうる。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基の配列が、1つまたは複数の非アミノ酸部分で中断されていてもよい。

したがって「タンパク質またはペプチド」という用語は、天然タンパク質中に見い出される20種の一般的アミノ酸のうちの少なくとも1つ、または少なくとも1つの修飾アミノ酸もしくは異常アミノ酸を含む、アミノ酸配列を包含する。

本発明のある特定の態様は融合タンパク質に関する。これらの分子は、N末端またはC末端において異種ドメインに連結された治療用タンパク質を有しうる。例えば融合物には、異種宿主におけるタンパク質の組換え発現が可能になるように、他の種からのリーダー配列も使用しうる。他の有用な融合物は、タンパク質の精製が容易になるように、好ましくは切断可能な、血清アルブミンアフィニティータグもしくは6つのヒスチジン残基などといったタンパク質アフィニティータグ、または抗体エピトープなどの免疫学的に活性なドメインの付加を含む。アフィニティータグの非限定的な例としては、ポリヒスチジン、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質(MBP)、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)が挙げられる。

融合タンパク質を作製する方法は当業者には周知である。そのようなタンパク質は、例えば完全な融合タンパク質のデノボ合成によって、または異種ドメインをコードするDNA配列の取り付けと、それに続く無傷の融合タンパク質の発現とによって、産生することができる。

親タンパク質の機能的活性を回復する融合タンパク質の産生は、タンデムにつながれたポリペプチド間に接合されるペプチドリンカーをコードする架橋DNAセグメントで遺伝子をつなぐことによって、容易にすることができる。リンカーは、結果として生じる融合タンパク質の適正な折り畳みを可能とするのに十分な長さのものである。

III. 投与の方法
ウイルスベクターは、いくつかの局面において、患者に直接(インビボ)投与されてもよく、あるいは細胞をインビトロまたはエクスビボで処理するために使用してから、患者に投与することもできる。「ベクター」という用語は、小さな担体核酸分子、プラスミド、ウイルス(例えばAAVベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター)、または核酸の挿入もしくは組入れによって操作することができる他の媒体をいう。ウイルスベクターなどのベクターは、核酸を、細胞によってその核酸内の核酸配列が転写され、それがタンパク質をコードしているのであれば、続いて翻訳されるように、細胞に導入/移入するために使用することができる。

本明細書において記述される方法または使用によって任意の適切な細胞または哺乳動物に投与または処置を行うことができる。典型的には、本明細書において記述される方法を必要とする哺乳動物は、疾患状態と関連する異常タンパク質または異常性タンパク質を有すると、または発現すると疑われる。あるいは、哺乳動物レシピエントは、遺伝子置換療法に適した状態を有しうる。本明細書において使用される場合、「遺伝子置換療法」は、治療用物質をコードする外因性遺伝物質のレシピエントへの投与、および投与された遺伝物質のインサイチューでのその後の発現をいう。したがって、「遺伝子置換療法に適した状態」という語句は、遺伝性疾患(すなわち、1つまたは複数の遺伝子欠損に起因する疾患状態)、後天性病態(すなわち、先天的欠損に起因しない病的状態)、がんおよび予防的プロセス(すなわち、疾患の予防または望ましくない医学的状態の予防)などの状態を包含する。したがって、本明細書において使用される場合、「治療用物質」という用語は、哺乳動物レシピエントに有益な効果を及ぼす、任意の作用物質または材料をいう。したがって、「治療用物質」は、核酸またはタンパク質成分を有する治療用分子および予防用分子の両方を包含する。

哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類(類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカクなど)、家畜(例えばイヌおよびネコ)、農用動物(例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ)および実験動物(例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット)が挙げられる。ある特定の態様において、哺乳動物はヒトである。ある特定の態様において、哺乳動物は非齧歯類哺乳動物(例えばヒト、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌなど)である。ある特定の態様において、非齧歯類哺乳動物はヒトである。哺乳動物は任意の齢または任意の発育段階にあることができる(例えば成人、ティーンエイジャー、小児、乳児または子宮内の哺乳動物)。哺乳動物は雄または雌であることができる。ある特定の態様において、哺乳動物は、例えば疾患状態と関連する異常タンパク質もしくは異常性タンパク質を有するもしくは発現する動物モデル、またはタンパク質の発現が不十分であってそれが疾患の原因となる動物モデルなどといった、動物疾患モデルであることができる。

本明細書において記述される方法または組成物で処置される哺乳動物(対象)には、成人(18歳またはそれ以上)および小児(18歳未満)が含まれる。成人には高齢者が含まれる。代表的な成人は50歳またはそれ以上である。小児の年齢は、1～2歳または2～4歳、4～6歳、6～18歳、8～10歳、10～12歳、12～15歳、および15～18歳の範囲にある。小児には乳児も含まれる。乳児は典型的には1～12月齢の範囲にある。

ある特定の態様において、本方法は、本明細書において説明されるように、複数のウイルス粒子を哺乳動物に投与する段階を含み、神経変性疾患などの疾患状態の1つまたは複数の症状の重症度、頻度、進行または発症の時間を、減少させるか、低減させるか、防止するか、阻害するか、または遅延させる。ある特定の態様において、本方法は、神経変性疾患などの疾患状態の有害な症状を処置するために、複数のウイルス粒子を哺乳動物に投与する段階を含む。ある特定の態様において、本方法は、神経変性疾患などの疾患状態の悪化または進行または逆転および有害な症状を安定化し、遅延させ、または防止するために、複数のウイルス粒子を哺乳動物に投与する段階を含む。

ある特定の態様において、本方法は、本明細書において説明されるように、複数のウイルス粒子を中枢神経系またはその一部分に投与する段階を含み、神経変性疾患などの疾患状態の1つまたは複数の症状の重症度、頻度、進行または発症の時間を減少させるか、低減させるか、防止するか、阻害するか、または少なくとも約5～約10日、約10～約25日、約25～約50日、もしくは約50～約100日は遅延させる。

ある特定の態様において、症状または有害な効果は、初期症状、中期症状もしくは後期症状、行動症状、パーソナリティ症状もしくは言語症状、嚥下、運動、発作、振戦または落ち着きのない症状、失調、および/または記憶、系統立てる能力などの認知症状を含む。

IV. 薬学的組成物
本明細書において使用される場合「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」という用語は、1つまたは複数の投与経路、インビボ送達またはインビボ接触に適した生物学的に許容される組成物、製剤、液状物もしくは固形物、またはそれらの混合物を意味する。「薬学的に許容される」組成物または「生理学的に許容される」組成物は、生物学的にも他の面でも望ましくないことのない材料であり、例えばこの材料は、実質的に望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与されうる。そのような組成物、「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」製剤および組成物は、無菌であることができる。そのような薬学的製剤および薬学的組成物は、例えばウイルス粒子を対象に投与する際に使用されうる。

そのような製剤および組成物は、薬学的投与またはインビボでの接触もしくは送達に適合する、溶媒(水性または非水性)、溶液(水性または非水性)、乳濁液(例えば水中油型または油中水型)、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散媒および懸濁媒、コーティング、等張化および吸収促進または吸収遅延剤を含む。水性および非水性の溶媒、溶液および懸濁液は、懸濁化剤および増粘剤を含みうる。補助的活性化合物(例えば保存剤、抗細菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤)も、製剤および組成物に組み入れることができる。

薬学的組成物は、典型的には、薬学的に許容される賦形剤を含有する。そのような賦形剤は、その組成物を投与される個体に有害な抗体の産生をそれ自体は誘導せず、過度の毒性を伴わずに投与されうる、任意の薬学的作用物質を含む。薬学的に許容される賦形剤としては、ソルビトール、Tween80、ならびに、水、食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が挙げられるが、それらに限定されることはない。そこには、薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩が含まれうる。さらにまた、補助物質、例えば界面活性剤、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質なども、そのような媒体中に存在しうる。

薬学的組成物は、本明細書において記載のまたは当業者に公知の特定の投与経路または送達経路に適合するように製剤化することができる。したがって、薬学的組成物は、さまざまな経路による投与または送達に適した担体、希釈剤または賦形剤を含む。

ウイルス粒子の注射に適した薬学的形態としては、無菌の注射もしくは注入可能な溶液または分散体の即時調製に適応しており、任意でリポソーム中にカプセル化された、無菌の水性溶液または水性分散体を挙げることができる。いずれの場合も、最終的な剤形は無菌の流体であり、製造、使用および貯蔵条件下で安定であるべきである。液状の担体または媒体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど)、植物油、無毒性グリセリルエステル、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または液状分散媒であることができる。適正な流動性は、例えばリポソームの形成によって、分散体の場合は必要とされる粒子サイズの維持によって、または界面活性剤の使用によって、維持することができる。等張化剤、例えば糖類、緩衝剤または塩類(例えば塩化ナトリウム)を含めることができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを、組成物に使用することによって生じさせることができる。

ウイルス粒子の溶液または懸濁液は、任意で、以下の構成要素のうちの1つまたは複数を含むことができる: 無菌希釈剤、例えば注射用水、食塩溶液、例えばリン酸緩衝食塩水(PBS)、人工的CSF、界面活性剤、固定油、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど)、グリセリン、または他の合成溶媒、抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸など; 酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム; キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸; 緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、ならびに張性を適合させるための作用物質、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。

本発明の組成物、方法および使用に適した薬学的製剤、組成物および送達システムは、当技術分野において公知である(例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) 18^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12^th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11^th ed.,Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; およびPoznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315を参照のこと)。

ウイルス粒子およびそれらの組成物は、投与を容易にすると共に投薬量が均一になるように、投薬単位形(dosage unit form)に製剤化されうる。本明細書において使用される場合、投薬単位形とは、処置される個体への単位投薬量として適した物理的に離散した単位をいい、各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された予め決定された分量の活性化合物を必要な薬学的担体と共に含有する。投薬単位形は、所望の効果を生じさせるために必要と考えられるウイルス粒子の数に依存する。必要な量は、単回投与で処方するか、複数の投薬単位で処方することができる。用量は、適切なウイルス粒子濃度になるように調節され、任意で抗炎症剤と組み合わせ、使用のために梱包されうる。

1つの態様において、薬学的組成物は、治療有効量、すなわち問題の疾患状態の症状もしくは有害な効果を低減させるかもしくは改善するのに十分な量、または所望の利益を与えるのに十分な量を提供するのに十分な遺伝物質を含むことになる。

本明細書において使用される場合「単位剤形(unit dosage form)」とは、処置される対象への単位投薬量として適した物理的に離散した単位をいい、各単位は、1回または複数回投与された場合に所望の効果(例えば予防効果または治療効果)を生じると計算された予め決定された分量を、任意で薬学的担体(賦形剤、希釈剤、媒体または充填剤)と共に含有する。単位剤形は、例えば、液状組成物、または冷凍乾燥状態もしくは凍結乾燥状態にある組成物を含みうるアンプルおよびバイアルに入っていてよく、インビボ投与またはインビボ送達の前に、例えば無菌液状担体を加えることができる。個々の単位剤形は、多用量型のキットまたは容器に含めることができる。したがって、例えばウイルス粒子、およびそれらの薬学的組成物は、投与を容易にすると共に投薬量が均一になるように、単一のまたは複数の単位剤形に梱包することができる。

ウイルス粒子を含有する製剤は、通例、有効量を含有し、有効量は当業者によって容易に決定される。ウイルス粒子は、典型的には、組成物の約1%～約95%(w/w)、または適切であればさらに高い範囲にありうる。投与される分量は、処置が考慮されている哺乳動物またはヒト対象の齢、体重および健康状態などの因子に依存する。当業者は用量応答曲線を確立する日常的な試験によって有効投薬量を確立することができる。

V. 定義
「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「導入遺伝子」という用語は、本明細書において、デオキシリボ核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA)ならびにそれらの重合体を含むあらゆる形態の核酸、オリゴヌクレオチドをいうために互換的に使用される。ポリヌクレオチドには、ゲノムDNA、cDNAおよびアンチセンスDNA、ならびにスプライシングされたまたはスプライシングされていないmRNA、rRNA、tRNAおよび阻害性DNAまたは阻害性RNA (RNAi、例えば低分子または短鎖ヘアピン(sh) RNA、マイクロRNA (miRNA)、低分子または短鎖干渉(si) RNA、トランススプライシングRNAまたはアンチセンスRNA)が含まれる。ポリヌクレオチドは、天然の、合成の、および意図的に改変または改造された、ポリヌクレオチド(例えば変種核酸)を含むことができる。ポリヌクレオチドは一本鎖、二本鎖または三重鎖の線状または環状であることができ、任意の適切な長さであることができる。ポリヌクレオチドの議論において、特定ポリヌクレオチドの配列または構造は、本明細書において、5'から3'の方向に配列を記載する慣習にしたがって記述されうる。

ポリペプチドをコードする核酸は、多くの場合、ポリペプチドをコードする読み取り枠を含む。別段の表示がある場合を除き、ある特定核酸配列には、縮重コドン置換も含まれる。

核酸は、読み取り枠に機能的に連結された1つまたは複数の発現制御要素または発現調節要素を含むことができ、それら1つまたは複数の調節要素は、哺乳動物細胞においてその読み取り枠がコードするポリペプチドの転写および翻訳を指令するように構成される。発現制御/調節要素の非限定的な例としては、転写開始配列(例えばプロモーター、エンハンサー、TATAボックスなど)、翻訳開始配列、mRNA安定性配列、ポリA配列、分泌配列などが挙げられる。発現制御/調節配列は任意の適切な生物のゲノムから得ることができる。

「プロモーター」とは、通常はコード配列の上流(5')にあって、RNAポリメラーゼおよび適正な転写に必要な他の因子に認識部位を提供することによってコード配列の発現を指令および/または制御するヌクレオチド配列をいう。pol IIプロモーターは、TATAボックスと、任意で転写開始部位を指定する働きをする他の配列とで構成される短いDNA配列である最小プロモーターを含み、そこに発現を制御するための調節要素が付加される。1型pol IIIプロモーターは、転写開始部位の下流に3つのシス作用性配列要素: a) 5'配列要素(Aブロック); b) 中間配列要素(Iブロック); c) 3'配列要素(Cブロック)を含む。2型pol IIIプロモーターは、転写開始部位の下流に2つの必須のシス作用性配列要素: a) Aボックス(5'配列要素); およびb) Bボックス(3'配列要素)を含む。3型pol IIIプロモーターは、従来のTATAボックス、近位配列要素(PSE)、および遠位配列要素(DSE)などの、転写開始部位の上流にいくつかのシス作用性プロモーター要素を含む。

「エンハンサー」は転写活性を刺激できるDNA配列であり、発現のレベルまたは発現の組織特異性を強化する、プロモーター固有の要素または異種要素であることができる。これはどちらの方向にも作動することができ(5'→3'または3'→5')、プロモーターの上流または下流のどちらに配置されても機能する能力を有する。

プロモーターおよび/またはエンハンサーはその全体がネイティブ遺伝子に由来してもよいし、自然界に見い出される異なる要素に由来する異なる要素で構成されてもよいし、さらには合成DNAセグメントで構成されてもよい。プロモーターまたはエンハンサーは、刺激、生理学的条件または発生的条件に応答して転写開始の有効性を調整/制御する、タンパク質因子の結合に関与するDNA配列を含みうる。

プロモーターの非限定的な例としては、SV40初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)、単純ヘルペスウイルス(HSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、例えばCMV前初期プロモーター領域(CMVIE)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、pol IIプロモーター、pol IIIプロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。加えて、非ウイルス遺伝子由来の配列、例えばマウスメタロチオネイン遺伝子も、ここでは役立つと考えられる。例示的な構成的プロモーターとしては、一定の構成的機能または「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子のプロモーター、および当業者に公知の他の構成的プロモーターが挙げられる: ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、アクチンプロモーター、U6。加えて、多くのウイルスプロモーターが真核細胞では構成的に機能する。それらには、なかんずく、SV40の初期および後期プロモーター、モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長末端反復(LTR)、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターなどがある。加えて、例えば、miR107、miR206、miR208b、miR548f-2、miR569、miR590、miR566、およびmiR128プロモーターなどの、イントロンmiRNAプロモーターに由来する配列も、本明細書における用途が見つかると考えられる(例えば、Monteys et al., 2010を参照のこと)。したがって、上述の構成的プロモーターはいずれも、異種遺伝子挿入断片の転写を制御するために使用することができる。

「導入遺伝子」は、細胞または生物に導入されるまたは導入された核酸配列/ポリヌクレオチドを便宜上いうように本明細書において使用される。導入遺伝子には、任意の核酸、例えば阻害性RNAまたはポリペプチドもしくはタンパク質をコードする遺伝子が包含され、それらは一般的には天然のAAVゲノム配列に対して異種である。

「形質導入」という用語は、ベクター(例えばウイルス粒子)による細胞または宿主生物への核酸配列の導入をいう。したがって、ウイルス粒子による細胞への導入遺伝子の導入は、細胞の「形質導入」ということができる。導入遺伝子は、形質導入された細胞のゲノム核酸に組み込まれても組み込まれなくてもよい。導入された導入遺伝子がレシピエント細胞またはレシピエント生物の核酸(ゲノムDNA)に組み込まれる場合、それはその細胞または生物に安定に維持されることが可能になり、レシピエント細胞またはレシピエント生物の子孫細胞または子孫生物にさらに伝えられまたは受け継がれる。最後に、導入された導入遺伝子はレシピエント細胞またはレシピエント宿主生物において染色体外に存在するか、または一過性にのみ存在する場合もある。それゆえ、「形質導入細胞」とは、形質導入によって導入遺伝子が導入された細胞である。したがって「形質導入」細胞は、導入遺伝子が導入された細胞またはその子孫である。形質導入細胞を増殖させ、導入遺伝子を転写し、コードされている阻害性RNAまたはタンパク質を発現させることができる。遺伝子治療での使用および遺伝子治療の方法の場合、形質導入細胞は哺乳動物中に存在することができる。

誘導性プロモーターの制御を受ける導入遺伝子は誘導剤の存在下でのみ発現するか、誘導剤の存在下ではより強く発現する(例えばメタロチオネインプロモーターの制御を受ける転写はある特定の金属イオンの存在下で著しく増加する)。誘導性プロモーターは、それぞれの誘導因子が結合した場合に転写を刺激する応答性要素(responsive element: RE)を含む。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸およびサイクリックAMPに対するREがある。誘導性の応答を得るために特定のREを含有するプロモーターを選ぶことができ、場合により、REそのものを異なるプロモーターに結合することによって、その組換え遺伝子に誘導性を付与してもよい。したがって、適切なプロモーター(構成的プロモーターか誘導性プロモーターか、強いプロモーターか弱いプロモーターか)を選択することにより、遺伝子改変細胞におけるポリペプチドの存在と発現レベルの両方を制御することが可能である。ポリペプチドをコードする遺伝子が誘導性プロモーターの制御を受ける場合、インサイチューでのポリペプチドの送達は、インサイチューの遺伝子改変細胞を、ポリペプチドの転写を許す条件に暴露することによって、例えば作用物質の転写を制御する誘導性プロモーターの特異的誘導因子を腹腔内注射することによって、トリガーされる。例えば、メタロチオネインプロモーターの制御を受ける遺伝子がコードするポリペプチドの、遺伝子改変細胞によるインサイチュー発現は、遺伝子改変細胞を適切な(すなわち誘導性の)金属イオンを含有する溶液とインサイチューで接触させることによって強化される。

核酸/導入遺伝子は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれた場合に、「機能的に連結」されている。RNAiもしくはポリペプチドをコードする核酸/導入遺伝子またはポリペプチドの発現を指令する核酸は、コードされているポリペプチドの転写を制御するために、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターを含みうる。発現制御要素に機能的に連結された核酸は発現カセットということもできる。

ある特定の態様において、本明細書において記述される方法および使用では、CNS特異的なまたは誘導性のプロモーター、エンハンサーなどが使用される。CNS特異的プロモーターの非限定的な例としては、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、およびニューロン特異的エノラーゼ(NSE)の遺伝子から単離されたものが挙げられる。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素症およびIFNに対するDNA応答性要素が挙げられる。

ある特定の態様において、発現制御要素はCMVエンハンサーを含む。ある特定の態様において、発現制御要素はβアクチンプロモーターを含む。ある特定の態様において、発現制御要素は、ニワトリβアクチンプロモーターを含む。ある特定の態様において、発現制御要素はCMVエンハンサーおよびニワトリβアクチンプロモーターを含む。

本明細書において使用される場合、「改変する」または「変種」という用語およびそれらの文法上の異形は、核酸、ポリペプチドまたはその部分配列が参照配列から逸脱していることを意味する。それゆえに、改変配列および変種配列は、発現量、活性または機能が、参照配列と比べて、実質的に同じことも、大きいことも、小さいこともありうるが、参照配列の活性または機能を少なくとも部分的には保持している。特定タイプの変種は変異型タンパク質であり、これは、例えばミスセンス変異またはナンセンス変異などの突然変異を有する遺伝子によってコードされているタンパク質をいう。

「核酸」変種または「ポリヌクレオチド」変種とは、野生型と比較すると遺伝子が変化している改変配列をいう。配列は、コードされているタンパク質配列を変化させることなく遺伝子改変されうる。あるいは、配列は、変種タンパク質をコードするように遺伝子改変されうる。核酸変種またはポリヌクレオチド変種は、野生型タンパク質配列などの参照配列に対して少なくとも部分的な配列同一性を依然として保持しているタンパク質をコードするようにコドン改変され、かつ変種タンパク質をコードするようにもコドン改変されている組み合わせ配列もいうことができる。例えば、そのような核酸変種の一部のコドンは、それによってコードされているタンパク質のアミノ酸を変化させないように変化し、核酸変種の一部のコドンは変化して、その結果、それがコードするタンパク質のアミノ酸を変化させることになる。

「タンパク質」という用語と「ポリペプチド」という用語は本明細書において互換的に使用される。本明細書において開示される「核酸」または「ポリヌクレオチド」または「導入遺伝子」がコードする「ポリペプチド」には、部分長または完全長のネイティブ配列、ならびに天然の野生型および機能的多型タンパク質、それらの機能的部分配列(断片)、ならびにそれらの配列変種が、そのポリペプチドがある程度の機能または活性を保持している限り、含まれる。したがって、本発明の方法および使用において、核酸配列によってコードされているそのようなポリペプチドは、欠損性である内在性タンパク質、またはその活性、機能もしくは発現が処置される哺乳動物において不十分であり、欠乏しており、もしくは存在しない内在性タンパク質と、同一である必要はない。

改変の非限定的な例としては、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の置換(例えば約1～約3、約3～約5、約5～約10、約10～約15、約15～約20、約20～約25、約25～約30、約30～約40、約40～約50、約50～約100、約100～約150、約150～約200、約200～約250、約250～約500、約500～約750、約750～約1000個、またはそれ以上のヌクレオチドまたは残基)が挙げられる。

アミノ酸改変の例は保存的アミノ酸置換または欠失である。特定の態様において、改変された配列または変種配列は、無改変の配列(例えば野生型配列)の機能または活性の少なくとも一部を保持している。

アミノ酸改変の別の例は、ウイルス粒子のキャプシドタンパク質に導入されるターゲティングペプチドである。組換えウイルスベクターを中枢神経系、例えば異なる脳領域へターゲティングさせるペプチドが同定されている。

そのように改変された組換えウイルスは、あるタイプの組織(例えばCNS組織)に、別のタイプの組織(例えば肝臓組織)よりも優先的に結合しうる。ある特定の態様において、改変されたキャプシドタンパク質を保持する組換えウイルスは、匹敵する無改変キャプシドタンパク質より高いレベルで結合することにより、脳血管上皮組織を「標的にする」ことができる。例えば、改変されたキャプシドタンパク質を有する組換えウイルスは、無改変組換えウイルスよりも50%～100%高いレベルで脳血管上皮組織に結合しうる。

「核酸断片」とは所与の核酸分子の一部分である。大半の生物ではデオキシリボ核酸(DNA)が遺伝物質であり、一方、リボ核酸(RNA)は、DNA内に含有される情報のタンパク質への移動に関与する。開示されるヌクレオチド配列の断片および変種ならびにそれによってコードされるタンパク質または部分長タンパク質も、本発明に包含される。「断片」または「部分」とは、完全長の、または完全長未満の、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはポリペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列を意味する。ある特定の態様において、断片または部分は、生物学的に機能的である(すなわち野生型の活性または機能のうち、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%を保持している)。

ある分子の「変種」は、ネイティブ分子の配列と実質的に類似している配列である。ヌクレオチド配列の場合、変種には、遺伝暗号の縮重ゆえにネイティブタンパク質と同一のアミノ酸配列をコードする配列が包含される。そのような天然の対立遺伝子変種は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびハイブリダイゼーション技法などといった分子生物学の技法を用いて同定することができる。変種ヌクレオチド配列には、合成由来のヌクレオチド配列、例えば指定部位突然変異誘発法を使って作製された、ネイティブタンパク質をコードするもの、ならびにアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするものなども包含される。一般に、本発明のヌクレオチド配列変種は、ネイティブ(内在性)ヌクレオチド配列に対して少なくとも40%、50%、60%、ないし70%、例えば71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、ないし79%、一般的には少なくとも80%、例えば81%～84%、少なくとも85%、例えば86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、ないし98%の配列同一性を有する。ある特定の態様において、変種は生物学的に機能的である(すなわち野生型の活性または機能の5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、または100%を保持している)。

特定の核酸配列の「保存的置換」とは、同一または本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列をいう。遺伝暗号は縮重しているので、任意の所与のポリペプチドは、機能的に同一な多数の核酸によってコードされる。例えばコドンCGT、CGC、CGA、CGG、AGAおよびAGGは、いずれもアミノ酸アルギニンをコードする。したがって、コドンによってアルギニンが指定される位置ではどこでも、コードされるタンパク質を変化させることなく、記述した対応コドンのいずれかに、コドンを変化させることができる。そのような核酸バリエーションは「サイレントバリエーション」であり、これは「保存的に改変されたバリエーション」の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書において記述される核酸配列はいずれも、別段の注記がある場合を除き、考えうるすべてのサイレントバリエーションを表す。核酸中の各コドン(通常は唯一のメチオニンコドンであるATGを除く)を、標準的技法によって機能的に同一な分子が得られるように改変できることは、当業者には分かるであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各「サイレントバリエーション」は、記述された各配列に暗に示されている。

ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、記述のアライメントプログラムの1つを標準的パラメータで使用することで参照配列と比較した場合に、少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、もしくは79%、または少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、もしくは89%、または少なくとも90%、91%、92%、93%、もしくは94%、さらには少なくとも95%、96%、97%、98%、もしくは99%の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。2つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、読み枠の位置などを考慮して、これらの値を適宜適合させうることは、当業者には理解されるであろう。これらの目的の場合、アミノ酸配列の実質的同一性とは、通常、少なくとも70%、少なくとも80%、90%、さらには少なくとも95%の配列同一性を意味する。

ポリペプチドに関して「実質的同一性」という用語は、ポリペプチドが、指定された比較ウィンドウにおいて、参照配列に対して、少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、もしくは79%、または80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、もしくは89%、または少なくとも90%、91%、92%、93%、もしくは94%、さらには95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を持つ配列を含むことを示す。2つのポリペプチド配列が同一であることの目安は、一方のポリペプチドが、他方のポリペプチドに対して生じさせた抗体と免疫学的に反応することである。したがって、例えば2つのポリペプチドの相違が保存的置換だけである場合、1つのポリペプチドはもう一方のポリペプチドと同一である。

「処置する」および「処置」という用語は治療的処置と予防的措置または防止的措置の両方をいい、その目的は、望ましくない生理学的変化または生理学的障害、例えば障害の発生、進行または悪化を、防止するか、阻害するか、低減させるか、または減少させることである。本発明の目的の場合、有益なまたは望ましい臨床結果としては、検出可能であるか検出不可能であるかを問わず、症状の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の症状または有害な効果の安定化(すなわち悪化または進行がないこと)、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および寛解(部分的であるか完全であるかを問わない)が含まれるが、それらに限定されることはない。「処置」は、処置を受けていない場合に予想される生存期間と比較した生存期間の延長も意味することができる。処置を必要とするものとしては、状態または障害を既に有するもの、ならびに素因(例えば遺伝子アッセイによって決定されるもの)を有するものが含まれる。

VI. キット
本発明は、梱包材とその中の1つまたは複数の構成要素とを伴うキットを提供する。キットは、典型的には、そこに含まれる構成要素の記述またはそこに含まれる構成要素のインビトロ、インビボ、もしくはエクスビボでの使用に関する指示を含むラベルまたは添付文書を含む。キットは、そのような構成要素、例えば核酸、組換えベクター、および/またはウイルス粒子のコレクションを含むことができる。

キットとは、キットの1つまたは複数の構成要素を収容する物理的構造をいう。梱包材は、構成要素を無菌的に維持することができ、そのような目的のために一般に使用される材料(例えば紙、ダンボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブなど)製であることができる。

ラベルまたは添付文書は、そこに含まれている1つまたは複数の構成要素の識別情報、投薬量、活性成分の臨床薬理、例えば作用機序、薬物動態および薬力学を含むことができる。ラベルまたは添付文書は、製造者、ロット番号、製造場所および製造日、使用期限を確認する情報を含むことができる。ラベルまたは添付文書は、製造者情報、ロット番号、製造場所および製造日を確認する情報を含むことができる。ラベルまたは添付文書は、キットの構成要素を使用しうる疾患に関する情報を含むことができる。ラベルまたは添付文書は、キットの構成要素のうちの1つまたは複数を、方法、使用または処置プロトコールもしくは治療レジメンにおいて使用するための、臨床家または対象に対する指示を含むことができる。指示は、投薬量、投薬頻度または継続期間、および本明細書において記述の方法、使用、処置プロトコールまたは予防レジメンもしくは治療レジメンのいずれかを実施するための指示を含むことができる。

ラベルまたは添付文書は、構成要素が提供しうる利益、例えば予防的利益または治療的利益に関する情報を含むことができる。ラベルまたは添付文書は、潜在的に有害な副作用、合併症または反応に関する情報、例えば、特定の組成物を使用することが適切ではないと考えられる状況に関する対象または臨床家への警告を含むことができる。有害な副作用または合併症は、対象が当該組成物とは不適合でありうる1種類または複数類の他の医薬を過去に服用していたか今後服用するか現在服用している場合にも、または対象が当該組成物とは不適合であると考えられる別の処置プロトコールもしくは治療レジメンを過去に受けていたか今後受けるか現在受けている場合にも起こりうるので、指示には、そのような不適合に関する情報も含まれうる。

ラベルまたは添付文書は、独立した、または構成要素、キットもしくは梱包材(例えば箱)に添付された、またはキットの構成要素が入っているアンプル、チューブもしくはバイアルに添付された、「印刷物」、例えば紙または厚紙を含む。ラベルまたは添付文書は、コンピュータ可読媒体、例えばバーコード付き印刷ラベル、ディスク、光学ディスク、例えばCD-もしくはDVD-ROM/RAM、DVD、MP3、または電子記憶媒体、例えばRAMおよびROM、またはそれらのハイブリッド、例えば磁気/光学記憶媒体、フラッシュメモリ、ハイブリッドおよびメモリ型カードをさらに含むことができる。

VII. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために提供される。当業者には理解されるように、以下の実施例に開示される技術は、本発明の実践において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を表しており、したがってその実施のための好ましい形態を構成しているとみなすことができる。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された具体的な態様に多くの変更を加えることができ、それでもなお本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果が得られることを理解するであろう。

実施例1－脳実質を標的にするAAV変種の同定
AAV1、AAV2、およびAAV9キャプシドを出発プラットフォームとして用い、高度なバーコード付きAAVライブラリを開発した。それぞれAAV1キャプシドの590位、AAV2キャプシドの587位、およびAAV9キャプシドの588位にランダム配列を挿入することにより、AAV1、AAV2、およびAAV9ペプチドディスプレイライブラリを作製した(図1)。このライブラリは、1×10⁷個の固有クローンの多様性を有していた(図3)。

ライブラリの有用性を試験するため、ベンチグレード(低力価、低純度)のキャプシド改変AAV2を用いてパイロット研究を実施した。AAV2ライブラリを2匹のC57BL/6マウスに動物1匹あたりベクターゲノム8×10¹⁰個で静脈内注射した。72時間後、大脳皮質、小脳、および脊髄を解剖した。注目すべきは、筋肉向性を特定するために、心臓、骨格筋、および横隔膜を別々に採取したことである。ウイルスゲノムDNAを単離し、回収されたランダムオリゴヌクレオチド配列をPCRによって増幅した。脳からのPCR産物をプールして第2ラウンドライブラリを作製し、これを2匹のマウスに動物1匹あたりベクターゲノム4×10¹⁰個で注射した。2回目の注入後、ベクターゲノムを前回同様に回収し、出発ライブラリおよび第1ラウンド組織と共にNexGen配列決定に供した。脳組織での濃縮を示す配列が実際に、脳にAAV2を到達させることができるかどうかを試験するために、個々のヒットをAAV2キャプシドパッケージングプラスミドにクローニングし、eGFPを発現するAAV2を作製した。ベンチグレードのベクターを作製し、AAV2に基づくキャプシド改変ウイルスのベクターゲノム3×10¹⁰個をマウスに注射した。4週間後、これらの低力価変種の場合でさえも、脳内にeGFPの蛍光が見られた。

これらの高度なバーコード付きAAVライブラリを用いて、非ヒト霊長類において異なる霊長類脳構造を標的にすることができるAAV変種を同定した。AAV1、AAV2、およびAAV9ライブラリを、1匹の非ヒト霊長類に脳室内注射によって送達した(図2)。注入から72時間後、脳領域をウイルスDNA単離のために顕微解剖し、PCRによってAAV DNAを増幅した。産物をプールし、第2ラウンドライブラリのパッケージングに使用し、これをさらなるNHPに注入した。脳領域を次いで、注入12日後に顕微解剖した。2ラウンドのパンニング後、ベクターゲノムを回収し、次世代配列決定に供した。具体的には、ラウンド1およびラウンド2の組織から抽出したゲノムDNAをPCR増幅して、ベクターバーコードの位置でIlluminaアンプリコン配列決定ライブラリを作製した。得られたライブラリをプールし、100 bpシングルエンドリードケミストリを用いてIllumina HiSeq 4000の単一レーン上で実行した。このアプローチの有用性を例証するために、いくつかの標的領域: 上衣、髄膜および小脳を例として試験した。一般に、AAVxを上衣、髄膜、および小脳に向ける配列は異なり、さまざまな血清型で異なっていた。

ラウンドオーバーラウンド濃縮グラフ(図4)ならびにヒートマップ(図5および6)を以下の組織: 脳幹、尾状核、小脳皮質(図5)、大脳皮質、上衣、淡蒼球、海馬、髄膜、視神経、被殻、脊髄、黒質、視床下核、および視床について作成した。これらはベースライン時(ラウンド0)の、ならびにアカゲザルによるインビボ継代ラウンド1および2の後の、表示されたバーコードの濃縮を例示している。これらを作成するために、各組織とラウンドの組み合わせのfastq結果ファイルを、DNAレベルで観察された固有のバーコード構成を抽出および定量化するようにデザインされたカスタムPythonスクリプトを用いて処理した。カスタムRスクリプトを使用して、各サンプルに存在するバーコードの割合を計算し、DNAバーコードをアミノ酸バーコードに変換した。表1はAAV1由来ライブラリで処理したサンプルに対応し; 表2はAAV2由来ライブラリで処理した組織を表し; 表3はAAV9由来ライブラリで処理したサンプルに対応している。これらの3つのライブラリから上位のヒットを選び、50 (AAV1)、58 (AAV2)、および30 (AAV9)由来のバーコードを含む検証用ライブラリに組み立てて作製した。この検証用ライブラリを、ICV注射によって追加のアカゲザルに送達した。組織を再び収集および処理して、ディープシークエンシングによるバーコード存在量の回復を容易にした。回収された組織およびインプットウイルスライブラリにおいてバーコード存在量を評価した。各バーコードの濃縮値を、インプットウイルスライブラリ内のそれらの存在量に対して計算した。得られた相対濃縮値は、評価されたさまざまな組織間のベクター性能の強固な指標であり、広範かつ特異的なAAVベクター変種の同定を容易にする(図7A～C)。

同定された細胞型特異性を検証するために、AAV9-1999 (KGGGFHG; SEQ ID NO: 110のターゲティングペプチド配列を有する)をインビボでの検証のために選択した。eGFP発現コンストラクトを、CAGプロモーターによって駆動されるAAV9-1999にパッケージングした。5歳齢の雌性アカゲザルに、左側脳室へのICV注射によってAAV9-1999 1.5E13 vgを投与した。組織学的分析のため注射30日後に脳を収集した。小脳スライスをH&E染色して、AAV9-1999の形質導入パターンを描写した(図8)。蝸牛もこの動物から収集し、驚くべきことに、有毛細胞の強い形質導入を有していた。さらに、eGFPコンストラクトを含むAAV9-1999およびAAV9キャプシドを、半球あたり1E10 vgでICV注射によりC57BL/6 p0マウス仔に送達した。21日後、マウスを灌流した。全マウント脳(図9A)、40 μm全脳矢状切片(図9B)、40 μm S1皮質切片(図9C、左)、40 μm海馬切片(図9C、中央)、40 μm小脳矢状切片(図9C、右)、および40 μm腰髄冠状切片(図9D)をeGFP蛍光シグナルについて画像化した。Bl/6新生児マウス仔に注射されたAAV9-1999は、AAV9の用量を一致させた注射よりも多くの遍在性の発現を示した。

成体アカゲザル1匹に4つの改変AAVの混合物: RGDLQWV (SEQ ID NO: 113) ターゲティングペプチド配列およびmTAGBFP2タグを有するAAV9; mTFP1としてERDRTRG (SEQ ID NO: 21) ターゲティングペプチド配列を有するAAV1; GRGAPGG (SEQ ID NO: 80) ターゲティングペプチド配列およびmNGタグを有するAAV2; ならびにDDPSARR (SEQ ID NO: 53) ターゲティングペプチド配列およびmRuby3タグを有するAAV2を注射した。次のように、ウイルスを等量で直接混合して、それぞれの最終的な全用量を達成した。
AAV9.RGDL mTagBFP2 6.13E12 全vg
AAV1.ERDR mTFP1 1.23E13 全vg
AAV2.GRGA mNG 8.8E12 全vg
AAV2.DDPS mRuby3 1.32E13 全vg

蛍光画像化のために、注射30日後に脳を収集した。側脳室切片(図10A)、第4脳室切片(図10B)、および髄膜切片(図10C)を、mTagBFP2、mTFP2、mNG、およびmRuby3蛍光シグナルについて画像化した。

アカゲザルの蝸牛にAAV9-1999を注入することによって追加の実験を実施した。蝸牛形質導入の結果に基づいて、動物の側脳室にAAV9-1999を投与した。単一動物は、開窓術でその蝸牛窓に直接注射したAAV9-1999 3E11 vgを受けた(図11A～C)。

本明細書において開示され、主張される方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく構成および実施することが可能である。本発明の組成物および方法は好ましい態様に関して記述されているが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記述された方法および方法の段階または段階の順序にさまざまな変形を適用しうることが、当業者には明らかであろう。より具体的には、本明細書において記述された作用物質の代わりに、化学的にも生理学的にも関連するある特定の作用物質を使用することができるが、同じまたは同様の結果が達成されうることは明らかであろう。当業者に明らかな、そのような類似の置換および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念内にあると見なされる。

参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書において記載されたものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する範囲内で、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。

Claims

ターゲティングペプチドを含む改変されたアデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドタンパク質であって、前記ターゲティングペプチドが、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターを異なる器官または異なる脳構造にターゲティングさせ、3～10アミノ酸長である、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、SEQ ID NO: 143と少なくとも95%同一の配列を有する改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110であり、前記異なる脳構造が、脳幹、尾状核、小脳、蝸牛(耳)、皮質、大脳皮質、深部小脳核、上衣、淡蒼球、海馬、髄膜、運動皮質、視神経、前頭前皮質、被殻、脊髄、黒質、視床下核、側頭皮質、視床、または視覚皮質である、請求項1記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
改変されたAAV1キャプシドタンパク質、改変されたAAV2キャプシドタンパク質、または改変されたAAV9キャプシドタンパク質である、請求項1記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質がAAV1キャプシドタンパク質(SEQ ID NO: 138参照)に由来し、前記ターゲティングペプチドが、前記AAV1キャプシドタンパク質の残基590位の後に挿入されている、請求項1記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記ターゲティングペプチドがリンカー配列に隣接し、前記ターゲティングペプチドの両側の前記リンカー配列が2または3アミノ酸長である、請求項4記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記リンカー配列が、前記ターゲティングペプチドのN末端側のSSA、および前記ターゲティングペプチドのC末端側のASである、請求項5記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAV1キャプシドタンパク質が、SEQ ID NO: 141と少なくとも95%同一の配列を有する、請求項6記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質がAAV2キャプシドタンパク質(SEQ ID NO: 139参照)に由来し、前記ターゲティングペプチドが、前記AAV2キャプシドタンパク質の残基587位の後に挿入されている、請求項1記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記ターゲティングペプチドがリンカー配列に隣接し、前記ターゲティングペプチドの両側の前記リンカー配列が2または3アミノ酸長である、請求項8記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記リンカー配列が、前記ターゲティングペプチドのN末端側のAAA、および前記ターゲティングペプチドのC末端側のAAである、請求項9記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAV2キャプシドタンパク質が、SEQ ID NO: 142と少なくとも95%同一の配列を有する、請求項10記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質がAAV9キャプシドタンパク質(SEQ ID NO: 140参照)に由来し、前記ターゲティングペプチドが、前記AAV9キャプシドタンパク質の残基588位の後に挿入されている、請求項1記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記ターゲティングペプチドがリンカー配列に隣接し、前記ターゲティングペプチドの両側の前記リンカー配列が2または3アミノ酸長である、請求項12記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記リンカー配列が、前記ターゲティングペプチドのN末端側のAAA、および前記ターゲティングペプチドのC末端側のASである、請求項13記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAV9キャプシドタンパク質が、SEQ ID NO: 143と少なくとも95%同一の配列を有する、請求項14記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記標的ペプチドが、最大10アミノ酸長の配列を含み、前記配列中に、SEQ ID NO: 1～137または144からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記ターゲティングペプチドが7アミノ酸長である、請求項16記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が、脳幹、尾状核、小脳皮質、大脳皮質、上衣、淡蒼球、海馬、髄膜、視神経、被殻、脊髄、黒質、視床下核、または視床である、請求項1～17のいずれか一項記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が脳幹であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 1～9から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が尾状核であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 1、3、5、7、10～16、25、26、32、および144から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が小脳皮質であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 1、3、4、9、および17～21から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が大脳皮質であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 1、3、5、12、および21～26から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が上衣であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 2～4、7、9、21、22、27、および28から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が淡蒼球であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 3、5、12、14、16、21、22、および29～31から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が海馬であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 1～4、7、および32～34から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が髄膜であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 3、5、7、9、12、21、および35～37から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が視神経であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 2、3、7、14～16、21、31、および38から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が被殻であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 3、4、12、13、21、30、および39～42から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が脊髄であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 2～4、7、9、21、32、33、および43から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が黒質であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 2、3、9、44、および45から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が視床下核であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 2～4、12、16、30、46、および47から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が視床であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 1、2、8、12、21、28、および48～51から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が脳幹であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 52～60から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が尾状核であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 59および61～69から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が小脳皮質であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 56、58、60、および70～75から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が大脳皮質であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 53、58、60、62、63、66、および76～79から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が上衣であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 53、60、62、63、66、74～77、および80から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が淡蒼球であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 60、75、および81～87から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が海馬であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 53、55、58、60、63、76、79、88、および89から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が髄膜であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 58、60、66、73、76、80、および90～93から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が視神経であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 53、54、57、58、60、75、79、87、88、および94から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が被殻であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 55、59、60、61、および95～100から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が脊髄であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 53、58～61、63、77、88、95、および101から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が黒質であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 52、53、57、58、75、76、87、102、および103から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が視床下核であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 57、58、60、75、79、87、88、102、104、および105から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が視床であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 52、55、56、74、85、88、および106～109から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が脳幹であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110～117から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が尾状核であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110、113、115、116、および118～121から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が小脳皮質であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110、111、113、119、および122～125から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が大脳皮質であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110、111、113、114、116、および125～127から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が上衣であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110、111、113、118～120、および128から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が淡蒼球であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110～112、114、119、120、および129から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が海馬であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110、111、113、116、123、125、129、および130から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が髄膜であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110、111、113、114、118、119、122、および131から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が視神経であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110、111、114、115、117、129、および132から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が被殻であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110、112、113、116、123、127、133、および134から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が脊髄であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110、113、119、120、122、123、128、および134から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が黒質であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110～114、117、および129から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が視床下核であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110、111、113、119、120、122、132、および135から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記異なる脳構造が視床であり、前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110、112～114、125、133、136、および137から選択される、請求項18記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 1であり、前記異なる脳構造が脳幹、尾状核、小脳皮質、大脳皮質、海馬、または視床である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 2であり、前記異なる脳構造が脳幹、上衣、海馬、視神経、脊髄、黒質、視床下核、または視床である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 3であり、前記異なる脳構造が、脳幹、尾状核、小脳皮質、大脳皮質、上衣、淡蒼球、海馬、髄膜、視神経、被殻、脊髄、黒質、または視床下核である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 4であり、前記異なる脳構造が脳幹、小脳皮質、上衣、海馬、被殻、脊髄、または視床下核である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 5であり、前記異なる脳構造が脳幹、大脳皮質、淡蒼球、または髄膜である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 6であり、前記異なる脳構造が脳幹である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 7であり、前記異なる脳構造が脳幹、尾状核、上衣、海馬、髄膜、視神経、または脊髄である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 8であり、前記異なる脳構造が脳幹または視床である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 9であり、前記異なる脳構造が脳幹、小脳皮質、上衣、髄膜、脊髄、または黒質である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 10または11であり、前記異なる脳構造が尾状核である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 12であり、前記異なる脳構造が尾状核、大脳皮質、淡蒼球、髄膜、被殻、視床下核、または視床である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 13であり、前記異なる脳構造が尾状核または被殻である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 14であり、前記異なる脳構造が尾状核、淡蒼球、または視神経である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 15であり、前記異なる脳構造が尾状核または視神経である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 16であり、前記異なる脳構造が尾状核、淡蒼球、視神経、または視床下核である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 17～20のいずれか一つであり、前記異なる脳構造が小脳皮質である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 21であり、前記異なる脳構造が、小脳皮質、大脳皮質、上衣、淡蒼球、髄膜、視神経、被殻、脊髄、または視床である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 22であり、前記異なる脳構造が大脳皮質、上衣、または淡蒼球である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 23～26のいずれか一つであり、前記異なる脳構造が大脳皮質である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 27であり、前記異なる脳構造が上衣である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 28であり、前記異なる脳構造が上衣または視床である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 29であり、前記異なる脳構造が淡蒼球である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 30であり、前記異なる脳構造が淡蒼球、被殻、または視床下核である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 31であり、前記異なる脳構造が淡蒼球または視神経である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 32または33であり、前記異なる脳構造が海馬または脊髄である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 34であり、前記異なる脳構造が海馬である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 35～37のいずれか一つであり、前記異なる脳構造が髄膜である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 38であり、前記異なる脳構造が視神経である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 39～42のいずれか一つであり、前記異なる脳構造が被殻である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 43であり、前記異なる脳構造が脊髄である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 44または45であり、前記異なる脳構造が黒質である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 46または47であり、前記異なる脳構造が視床下核である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV1キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 48～51のいずれか一つであり、前記異なる脳構造が視床である、請求項1または7記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 52であり、前記異なる脳構造が脳幹、黒質、または視床である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 53であり、前記異なる脳構造が脳幹、大脳皮質、上衣、海馬、髄膜、視神経、脊髄、または黒質である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 54であり、前記異なる脳構造が脳幹または視神経である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 55であり、前記異なる脳構造が脳幹、海馬、被殻、または視床である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 56であり、前記異なる脳構造が脳幹、小脳皮質、または視床である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 57であり、前記異なる脳構造が脳幹、視神経、黒質、または視床下核である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 58であり、前記異なる脳構造が、脳幹、小脳皮質、大脳皮質、海馬、髄膜、視神経、脊髄、黒質、または視床下核である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 59であり、前記異なる脳構造が脳幹、尾状核、被殻、または脊髄である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 60であり、前記異なる脳構造が、脳幹、小脳皮質、大脳皮質、上衣、淡蒼球、海馬、髄膜、視神経、被殻、脊髄、または視床下核である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 61であり、前記異なる脳構造が尾状核、被殻、または脊髄である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 62であり、前記異なる脳構造が尾状核、大脳皮質、または上衣である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 63であり、前記異なる脳構造が尾状核、大脳皮質、上衣、海馬、または脊髄である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 64、65、および67～69のいずれか一つであり、前記異なる脳構造が尾状核である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 66であり、前記異なる脳構造が尾状核、大脳皮質、上衣、または髄膜である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 70～72のいずれか一つであり、前記異なる脳構造が小脳皮質である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 73であり、前記異なる脳構造が小脳皮質または髄膜である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 74であり、前記異なる脳構造が小脳皮質、上衣、または視床である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 75であり、前記異なる脳構造が小脳皮質、上衣、淡蒼球、視神経、黒質、または視床下核である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 76であり、前記異なる脳構造が大脳皮質、上衣、海馬、髄膜、または黒質である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 77であり、前記異なる脳構造が大脳皮質、上衣、または脊髄である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 78であり、前記異なる脳構造が大脳皮質である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 79であり、前記異なる脳構造が大脳皮質、海馬、視神経、または視床下核である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 80であり、前記異なる脳構造が上衣、海馬、または髄膜である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 81～84および86のいずれか一つであり、前記異なる脳構造が淡蒼球である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 85であり、前記異なる脳構造が淡蒼球または視床である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 87であり、前記異なる脳構造が淡蒼球、視神経、黒質、または視床下核である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 88であり、前記異なる脳構造が海馬、視神経、脊髄、視床下核、または視床である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 89であり、前記異なる脳構造が海馬である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 90～93のいずれか一つであり、前記異なる脳構造が髄膜である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 94であり、前記異なる脳構造が視神経である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 95であり、前記異なる脳構造が被殻または脊髄である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 96～100のいずれか一つであり、前記異なる脳構造が被殻である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 101であり、前記異なる脳構造が脊髄である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 102であり、前記異なる脳構造が黒質または視床下核である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 103であり、前記異なる脳構造が黒質である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 104または105であり、前記異なる脳構造が視床下核である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV2キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 106～109のいずれか一つであり、前記異なる脳構造が視床である、請求項1または11記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 110であり、前記異なる脳構造が、脳幹、尾状核、小脳皮質、大脳皮質、上衣、淡蒼球、海馬、髄膜、視神経、被殻、脊髄、黒質、視床下核、または視床である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 111であり、前記異なる脳構造が、脳幹、小脳皮質、大脳皮質、上衣、淡蒼球、海馬、髄膜、視神経、黒質、または視床下核である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 112であり、前記異なる脳構造が脳幹、淡蒼球、被殻、黒質、または視床である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 113であり、前記異なる脳構造が、脳幹、尾状核、小脳皮質、大脳皮質、上衣、海馬、髄膜、被殻、脊髄、黒質、視床下核、または視床である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 114であり、前記異なる脳構造が脳幹、大脳皮質、淡蒼球、髄膜、視神経、黒質、または視床である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 115であり、前記異なる脳構造が脳幹または尾状核である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 116であり、前記異なる脳構造が脳幹、尾状核、大脳皮質、海馬、視神経、または被殻である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 117であり、前記異なる脳構造が脳幹、視神経、または黒質である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 118であり、前記異なる脳構造が尾状核、上衣、または髄膜である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 119であり、前記異なる脳構造が尾状核、小脳皮質、上衣、淡蒼球、髄膜、脊髄、または視床下核である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 120であり、前記異なる脳構造が尾状核、上衣、淡蒼球、髄膜、脊髄、または視床下核である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 121であり、前記異なる脳構造が尾状核である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 122であり、前記異なる脳構造が小脳皮質、髄膜、脊髄、または視床下核である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 123であり、前記異なる脳構造が小脳皮質、海馬、被殻、または脊髄である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 124であり、前記異なる脳構造が小脳皮質である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 125であり、前記異なる脳構造が小脳皮質、大脳皮質、海馬、または視床である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 126であり、前記異なる脳構造が大脳皮質である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 127であり、前記異なる脳構造が大脳皮質または被殻である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 128であり、前記異なる脳構造が上衣または脊髄である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 129であり、前記異なる脳構造が淡蒼球、海馬、視神経、または黒質である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 130であり、前記異なる脳構造が海馬である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 131であり、前記異なる脳構造が髄膜である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 132であり、前記異なる脳構造が視神経または視床下核である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 133であり、前記異なる脳構造が被殻または視床である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 134であり、前記異なる脳構造が被殻または脊髄である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 135であり、前記異なる脳構造が視床下核である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
前記改変されたAAVキャプシドタンパク質が、改変されたAAV9キャプシドタンパク質であり、前記ターゲティングペプチドがSEQ ID NO: 136または137であり、前記異なる脳構造が視床である、請求項1または15記載の改変されたAAVキャプシドタンパク質。
請求項1～157のいずれか一項記載の改変されたキャプシドタンパク質をコードする配列を含む、核酸。
請求項1～157のいずれか一項記載の改変されたキャプシドタンパク質を含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ウイルス。
請求項1～157のいずれか一項記載の改変されたキャプシドタンパク質をコードする核酸を含む、ウイルスベクター。
関心対象の核酸をコードする核酸配列をさらに含む、請求項160記載のウイルスベクター。
関心対象の前記核酸が治療用物質である、請求項161記載のウイルスベクター。
前記治療用物質が酵素またはRNAi分子である、請求項162記載のウイルスベクター。
請求項160～163のいずれか一項記載のウイルスベクターを含む、細胞。
哺乳動物細胞である、請求項164記載の細胞。
ヒト細胞である、請求項164記載の細胞。
インビトロのものである、請求項164記載の細胞。
インビボのものである、請求項164記載の細胞。
請求項159記載のウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
請求項159記載のウイルスを対象に投与する段階を含む、前記対象の異なる脳構造に作用物質を送達するための方法。
対象の脳幹に作用物質を送達するための方法であり、SEQ ID NO: 1～9から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV1ウイルス、SEQ ID NO: 52～60から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV2ウイルス、またはSEQ ID NO: 110～117から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV9ウイルスを投与する段階を含む、請求項170記載の方法。
対象の尾状核に作用物質を送達するための方法であり、SEQ ID NO: 1、3、7、および10～16から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV1ウイルス、SEQ ID NO: 59 および61～69から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV2ウイルス、またはSEQ ID NO: 110、113、115、116、および118～121から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV9ウイルスを投与する段階を含む、請求項170記載の方法。
対象の小脳皮質に作用物質を送達するための方法であり、SEQ ID NO: 1、3、4、9、および17～21から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV1ウイルス、SEQ ID NO: 56、58、60、および70～75から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV2ウイルス、またはSEQ ID NO: 110、111、113、119、および122～125から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV9ウイルスを投与する段階を含む、請求項170記載の方法。
対象の大脳皮質に作用物質を送達するための方法であり、SEQ ID NO: 1、3、5、12、および21～26から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV1ウイルス、SEQ ID NO: 53、58、60、62、63、66、および76～79から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV2ウイルス、またはSEQ ID NO: 110、111、113、114、116、および125～127から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV9ウイルスを投与する段階を含む、請求項170記載の方法。
対象の上衣に作用物質を送達するための方法であり、SEQ ID NO: 2～4、7、9、21、22、27、および28から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV1ウイルス、SEQ ID NO: 53、60、62、63、66、74～77、および80から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV2ウイルス、またはSEQ ID NO: 110、111、113、118～120、および128から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV9ウイルスを投与する段階を含む、請求項170記載の方法。
対象の淡蒼球に作用物質を送達するための方法であり、SEQ ID NO: 3、5、12、14、16、21、22、および29～31から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV1ウイルス、SEQ ID NO: 60、75、および81～87から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV2ウイルス、またはSEQ ID NO: 110～112、114、119、120、および129から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV9ウイルスを投与する段階を含む、請求項170記載の方法。
対象の海馬に作用物質を送達するための方法であり、SEQ ID NO: 1～4、7、および32～34、および28から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV1ウイルス、SEQ ID NO: 53、55、58、60、63、76、79、80、88、および89から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV2ウイルス、またはSEQ ID NO: 110、111、113、116、123、125、129、および130から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV9ウイルスを投与する段階を含む、請求項170記載の方法。
対象の髄膜に作用物質を送達するための方法であり、SEQ ID NO: 3、5、7、9、12、21、および35～37、および28から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV1ウイルス、SEQ ID NO: 53、58、60、66、73、76、80、および90～93から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV2ウイルス、またはSEQ ID NO: 110、111、113、114、118、119、122、および131から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV9ウイルスを投与する段階を含む、請求項170記載の方法。
対象の視神経に作用物質を送達するための方法であり、SEQ ID NO: 2、3、7、14～16、21、31、および38から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV1ウイルス、SEQ ID NO: 53、54、57、58、60、75、79、87、88、および94から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV2ウイルス、またはSEQ ID NO: 110、111、114、115、117、129、および132から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV9ウイルスを投与する段階を含む、請求項170記載の方法。
対象の被殻に作用物質を送達するための方法であり、SEQ ID NO: 3、4、12、13、21、30、および39～42から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV1ウイルス、SEQ ID NO: 55、59、60、61、および95～100から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV2ウイルス、またはSEQ ID NO: 110、112、113、116、123、127、133、および134から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV9ウイルスを投与する段階を含む、請求項170記載の方法。
対象の脊髄に作用物質を送達するための方法であり、SEQ ID NO: 2～4、7、9、21、32、33、および43から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV1ウイルス、SEQ ID NO: 53、58～61、63、77、88、95、および101から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV2ウイルス、またはSEQ ID NO: 110、113、119、120、122、123、128、および134から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV9ウイルスを投与する段階を含む、請求項170記載の方法。
対象の黒質に作用物質を送達するための方法であり、SEQ ID NO: 2、3、9、44、および45、および28から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV1ウイルス、SEQ ID NO: 52、53、57、58、75、76、87、102、および103から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV2ウイルス、またはSEQ ID NO: 110～114、117、および129から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV9ウイルスを投与する段階を含む、請求項170記載の方法。
対象の視床下核に作用物質を送達するための方法であり、SEQ ID NO: 2～4、12、16、30、46、および47から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV1ウイルス、SEQ ID NO: 57、58、60、75、79、87、88、102、104、および105から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV2ウイルス、またはSEQ ID NO: 110、111、113、119、120、122、132、および135から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV9ウイルスを投与する段階を含む、請求項170記載の方法。
対象の視床に作用物質を送達するための方法であり、SEQ ID NO: 1、2、8、12、21、28、および48～51から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV1ウイルス、SEQ ID NO: 52、55、56、74、85、88、および106～109から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV2ウイルス、またはSEQ ID NO: 110、112～114、125、133、136、および137から選択されるターゲティングペプチドを有する改変されたキャプシドタンパク質を含むAAV9ウイルスを投与する段階を含む、請求項170記載の方法。
前記作用物質が、siRNA、shRNA、miRNA、非コードRNA、lncRNA、治療用タンパク質、またはCRISPRシステムである、請求項170～184のいずれか一項記載の方法。
前記投与が中枢神経系に対するものである、請求項170～184のいずれか一項記載の方法。
前記投与が、大槽、脳室内空間、上衣、脳室、くも膜下腔、蝸牛、および/または髄腔内空間に対するものである、請求項186記載の方法。
前記脳室が、吻側側脳室、および/または尾側側脳室、および/または右側脳室、および/または左側脳室、および/または右吻側側脳室、および/または左吻側側脳室、および/または右尾側側脳室、および/または左尾側側脳室である、請求項187記載の方法。
複数のウイルス粒子が投与される、請求項170～188のいずれか一項記載の方法。
前記ウイルスが、1キログラムあたりベクターゲノム約1×10⁶～約1×10¹⁸個(vg/kg)の用量で投与される、請求項189記載の方法。
前記ウイルスが、患者1kgあたりvg 約1×10⁷～1×10¹⁷、約1×10⁸～1×10¹⁶、約1×10⁹～1×10¹⁵、約1×10¹⁰～1×10¹⁴、約1×10¹⁰～1×10¹³、約1×10¹⁰～1×10¹³、約1×10¹⁰～1×10¹¹、約1×10¹¹～1×10¹²、約1×10¹²～×10¹³、または約1×10¹³～1×10¹⁴個の用量で投与される、請求項189記載の方法。
前記対象がヒトである、請求項170～191のいずれか一項記載の方法。
請求項159記載のウイルスを哺乳動物に投与する段階を含む、前記哺乳動物における疾患を処置する方法。
前記疾患が神経変性疾患である、請求項193記載の方法。
前記神経変性疾患が、ハンチントン病、ALS、遺伝性痙性片麻痺、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ケネディ病、アルツハイマー病、ポリグルタミンリピート病、またはパーキンソン病である、請求項194記載の方法。
前記哺乳動物がヒトである、請求項193記載の方法。