CN1091469A - Ptp 1d：一种新蛋白质酪氨酸磷酸 - Google Patents

Abstract

一种新的蛋白质酪氨酸磷酸酶被称为PTP 1D 的蛋白质的。PTP 1D蛋白质可以由重组方法生产， 如用编码本文提供的蛋白质的核酸构建体的方法，也 公开了对PTP 1D蛋白质抗原决定基特异体的抗 体。提供了鉴别与PTP 1D结合并抑制或刺激其酶 活性的化合物的方法，含有PTP 1D的药组合物，用 上述组合物治疗与PTP 1D蛋白质有关的疾病的方 法。

Description

本申请是美国申请系列No.07/956，315（1992年10月6日申请，该文献以其全文引入本文作为参考）的部分继续。

本发明，属生物化学和细胞及分子生物学领域，涉及一种新的蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP），称作PTP  1D。包括PTP  1D蛋白质，为其编码的核酸构建体，含有核酸构建体的重组表达载体，含有或表达重组表达载体的细胞，生产和鉴别PTP  1D蛋白质和DNA构建体的方法，PTP  1D蛋白质和糖蛋白特异性的抗体，以及用于筛选能与PTP  1D结合和抑制或刺激PTP  1D蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法。

蛋白质磷酸化是一种调节不同细胞过程的基本机制。大多数的蛋白质磷酸化作用发生在丝氨酸和苏氨酸残基，由于发现许多致癌基因产物和生长因子受体具有内蛋白质酪氨酸激酶（PTKase或PTK）活性，在酪氨酸残基的磷酸化作用则引起人们极大的兴趣。现已确认了蛋白质酪氨酸磷酸化作用在生长因子信号转导，细胞循环增进及肿瘤转化方面的重要性（Hunter等人.，Ann.Rev.Biochem.54：987-930（1985）;Ullrich等人，Cell  61：203-212（1990）;Nurse，Nature  344：503-508（1990）;Cantley等人，Cell  64：281-302（1991））。

蛋白质酪氨酸残基的磷酸化作用是磷酸化和去磷酸化反应竞争的动力学过程。这些过程由PTKs（催化酪氨酸磷酸化）和蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTPases或PTPs）（该酶特异性地使已磷酸化的蛋白质的酪氨酸残基去磷酸化）的相互作用而调节的。因此，由PTK和PTP酶活性的平衡决定细胞内蛋白质酪氨酸磷酸化的净含量（Hunter，T.，Cell  58：1013-1016（1989））。

PTKs是一个大蛋白质家族，包括许多生长因子受体和与丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白质激酶享有共同祖先，但与其不同的潜在致癌基因（Hanks等人，Science  241：42-52（1988））。已将许多PTKs与细胞循环诱导中的起始信号联系起来（Weaver  等人.，Mol.Cell.Biol.11：4415-4422（1991））。

我们目前对PTKs改变基础机制的大部分理解来自有跨膜拓扑结构的受体型PTKs（RPTKs）。认为特异性配体子RPTK细胞外区的结合可诱导低聚合作用，增加酶（激酶）活性及激活信号转导途径（Ullrich等人，同上文）。通过突变或超量表达的激酶活性的失调被认为是细胞转化基础的机制（Hunter等人，1985，同上;Ullrich等人，同上文）。

蛋白质磷酸酶含有至少两个明显不同的族（Hunter，T.1989，同上文）：蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTPs）。PTPs本身是一个族，包括至少两个亚类。第一亚类包括低分子量的，细胞内酶，含一个保守的催化磷酸酶区。该亚类的成员包括：

（1）胎盘PTP  1B（Charbonneau等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  86：5252-5256（1989）;Chernoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87：2735-2789（1989））;

（2）T细胞PTP（Cool等人;Proc.Natl.Acad.Sci.USA  86：5257-5261（1989））;

（3）大鼠脑PTP（Guan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  87：1501-1502（1990））;

（4）神经元磷酸酶（STEP）（Lombroso等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  88：7242-7246（1991））;和

（5）细胞质磷酸酶，含一个与细胞骨架蛋白质同源的区域（Gu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  88：5867-5871（1991）;Yang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  88：5949-5953（1991））。自从纯化，定序并克隆了第一个PTP后，已迅速鉴别了其它可能的PTPs，并且其数量继续稳定增加。PTP族的大量已知成员表明在PTP-RPTK的相互作用中，可能有特异性。从几个来源克隆了编码一种新PTP（称之为PTP  1C）的cDNA（Shen，S-H等人，Nature  352：736-739（1991）;Plutzky，J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  89：1123-（1992）;Yi，T.，等人，Mol.Cell.Biol.12：836-846（1992）;Matthews，R.J.等人，Molec.Cell.Biol.12：2396-（1992））。PTP  1C蛋白质有一个单一的催化区和一对位于N末端的src-同源区，称为SH2，说明PTK活性可能直接由SH2区介导的与一种PTP的相互作用调节。

第二个PTP亚类包括高分子量的，受体关连的PTPs，称为RPTPs。RPTPs由（a）一个细胞内催化区，（b）一个跨膜片段，和（c）一个推测的配体结合细胞外区组成（Gebbink，M.F.等人，FEBS  Lett.290：123-130（1991））。不同RPTPs的推测“细胞外受体”区的结构和大小是不同的，而细胞内催化区是高度保守的。所有PTPs有两个半联的重复的催化磷酸酶同源区，但HPTPO例外，它只有一个（Tsai等人，J.Biol.Chem.266：10534-10543（1991））。

一个RPTP，开始叫做白细胞共同抗原（LCA）（Palph，S.J.，EMBO.J.6：1251-1257（1987）），已被叫作其它名称，包括T200（Trowbridge等人，Eur.J.Immunol.6：557-562（1962）），用于B细胞形式的B220（Coffman等人，Nature  289：681-683（1981）），小鼠异型标记Ly-5（Komuro等人，Immunogenetics  1：452-456（1975）），以及最近的CD45（Cobbold等人，Leucocyte  Typing  Ⅲ，McMichael等人，编，pp.788-803，1987）。LCA分子包括一个在所有白细胞和其造血前身细胞表面表达的高分子量糖蛋白族）Thomas，Ann.Rev.Immunol.7：339-369（1989）），并且在动物物种间有显著的序列同源性（Charbonneau等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  85：7182-7186（1988））。认为CD45在T细胞活化中起关键作用（有关综述，参见：Weiss  A.Ann.Rev.Genet.25：487-510（1991））。因此，在对应于借助T细胞受体的反应中，不能表达CD45的诱变T细胞克隆被功能性地损伤了（Weaver等人，1991，同上）。CD45PTP活性在PP56lck，淋巴细胞-特异的PTK的活化中起作用（Mustelin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  86：6302-6306（1989）;Ostergaard et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8959-8963（1989））。这些发现产生下列假设：T细胞活化作用涉及通过C末端酪氨酸残基去磷酸化而激活PP56^KK的磷酸酶。

另一种RPTP，白细胞共同抗原相关的分子，LAR（Streuli等人，J.Exp.Med.168：1523-1530（1988）开始被鉴定为一种LCA同系物，其中细胞内催化区有两个催化区有两个催化磷酸酶同源区（区Ⅰ和Ⅱ）。但是，仅有区Ⅰ表现出有磷酸酶活性（Streuli等人，EMBO J.9（8）：2399-2407（1990））。化学诱导的LAR突变体（tyr¹³⁷⁹→Phe）是温度敏感型的（Tsai等人，J.Biol.Chem.266（16）：10534-10543（1991））。

鼠RPTP，称为mRPTPμ有一个与LAR有共同结构特点的细胞外区（Gebbink等人，同上文）。克隆了RPTPμ的人同系物，且将该基因定位于人的第18号染色体上。以cDNA克隆的序列为基础，预测了两种果蝇PTPs，称为DLAR和DPTP（Streuli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  86：8698-8702（1989））。编码另一种果蝇RPTP，DPTP99A的cDNA也已被克隆并进行了特征鉴定（Hariharan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：11266-11270（1991））。

其它的RPTPs实施包括RPTP-α，β，γ和ξ（Krueger等人，EMBO  J.9：3241-3252（1990），Sap等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  87：6112-6116（1990），Kaplan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  87：7000-7004（1990），Jirik等人，FEBS  Lett.273：239-242（1990），Mathews等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  87：4444-4448（1990），Ohagi等人，Nucl.Acids  Res.18：7159（1990））。PCT公开WO  92/01050公开了人RPTP-α，β，和γ，以及在这三种RPTPs以及该蛋白质族的其它成员的保守区中发现的结构同源性的性质。鼠RPTP-α的细胞内区与其他PTPs的催化区同源。RPTP-α的142个氨基酸细胞外区（包括信号肽）有高含量的丝氨酸和苏氨酸（32%）和8个可能的N-糖基化位点。已经在真核宿主中生产并表达了编码RPTP-α的cDNA克隆。用针对RPTP-α的多克隆抗体（通过用合成的RPTP-α肽免疫而生产的）检测RPTP-α蛋白质在不同细胞和组织中的自然表达。该抗体检测细胞中的130KDa蛋白质，所述细胞已用编码部分RPTP-α的cDNA克隆转染。

通过用编码两个LCA  PTP区的一个探针筛选肝胚细胞瘤细胞系（HepG2）cDNA文库，发现了另一个RPTP，HEPTP（Jirik等人，FASEB  J.4A：2082，Abstr.2253（1990））。HEPTP基因似乎可在各种人和鼠细胞系及细胞中表达。

在共同申请的，相关美国专利申请系列No.07/923，740（1992，8，5申请，该文献全文引入本文作为参考）中公开了PTPs的PTP  D亚家族。

已鉴别了已知PTPs催化区中的保守氨基酸序列（Krueger等人.，EMBO  J.9：324-3252（1990）;Yi等人，Mol.Cell.Biol.12：836-846（1992），两篇文献均全文引入本文作为参考）。本文将这些氨基酸序列称为“一致序列”。Yi等人排列了LCA，PTPIB，TCPTP，LAR，DLAR，HPTPα，HPTPβ和HPTPγ的催化磷酸酶区序列，鉴别为下列“一致序列”（参见Yi等人，同上文，图2（A）1-2行）：

1.DYINAS/N  [SEQ  ID  NO.1]

2.KCXXYWP  [SEQ  ID  NO.2]

Krueger等人排列了PTPIB，TCPTP，LAR，LCA，HPTPα，HPTPβ，HPTPγ，HPTPε和HPTPξ，DLAR及DPTP的催化磷酸酶区序列，鉴定为下列“一致序列”（参见：Krueger等人，同上文，图7，1-2行）：

1.D/NYINA  S/N  [SEQ  ID  NO.3]

2.KCXXYW  P  [SEQ  ID  NO.2]

在比较PTP  1D，csw（螺旋状的）和PTP  1C序列的内含物时揭示出在含SH2区的磷酸酶中保守序列QGP被改变为QGC

酪氨酸残基的去磷酸化其本身可作为一种重要的细胞调节机制而起作用。因此，用酪氨酸激酶的src族，C末端酪氨酸的去磷酸化激活了激酶活性（Hunter，T.，Cell  49：1-4（1987））。在成熟促进因子（MPF）激酶的有丝分裂活化中，酪氨酸的去磷酸化可能是一个强制步骤（Morla等人，Cell  58：193-203（1989））。

蛋白质酪氨酸激酶和磷酸酶之间的相互作用

在发送信号中所涉及的细胞因子包括仅含scr同源区（称之为SH2和SH3）的多肽底物，或与酶活性结合（Koch，C.A.等人，Science  252：668（1991）;Russell，R.B.等人，FEBSLett.304：15（1992））。例如磷酸脂酶Cγ是基于与RPTK的细胞质相互作用及称RPTK细胞质区磷酸化而被激活的（Margolis，B.等人，Cell  57：1101-1107（1989）;Meisenhelder，J.等人，Cell  57：1109（1989）;Burgess，W.H.等人，Mol.Cell.Biol.10：4470（1990）;Nishibe，S.等人，Science  250：1253（1990））。若认为PTPs是PTKs的调节子，但发送级联信号的磷酸酪氨酸的这些重要组分的激活仍是未知的（Fischer，E.H.等人，Science  253：401（1991）;Pot，D.A.等人，Biochem.Biophys.Acta  1136：35（1992））。

大量PTP族成员（见上文描述）的存在说明，特定PTPs和PTKs之间的相互作用可能是特异性的。上文讨论的PTP  1C分子的结构包括，除一个催化区外，还有一对位于N末端的SH2区。这些SH2区的存在说明PTK活性可能直接由SH2区介导的与PTP的相互作用来调节。

上述观察说明本领域需要了解调节PTP活性的机制。需要进一步分析PTPs之间的结构-功能关系，以便获得对大量重要疾病包括癌和糖尿病中信号转导机制，细胞循环增进和细胞生长，肿瘤转化及基本改变的重要认识。

本发明人在本文描述了鉴别、克隆并定序一种一新的蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）（称为PTP  1D），它在结构上明显不同于以前大量报道的PTPs，与PTP  1C有71%的序列相似性。

因此，本发明提供一种PTP  1D蛋白质，或其功能衍生物，其中，若PTP  1D蛋白质是一种天然产物，则PTP  1D蛋白质基本上没有与其天然相关的其它蛋白质或糖蛋白。

优选地，PTP  1D蛋白质含有与图2所示的氨基酸序列（SEQ  ID  NO：4）有71%或更多相同性的氨基酸序列。更优选的，PTP  1D含有SEQ  ID  NO：4。

可以通过生化纯化方法生产，或可通过化学方法或在原核或真核宿主中的重组方法制备，并提供基本上没有与之天然相关和/或已修饰氨基酸的其它蛋白质的基本纯的PTP  1D蛋白质。

PTP  1D蛋白质的功能衍生物包括一个片段，一个具有添加或取代氨基酸的蛋白质或肽，具有任何结合的缺失，添加，或取代氨基酸的PTP  1D蛋白质，以便PTP  1D蛋白质具有所需的生物活性。

本文也提供一种重组核酸构建体，它含有编码PTP  1D蛋白质，或编码其功能衍生物的核苷酸序列。上述核酸构建体可以是cDNA或基因组DNA分子。它最好是一种表达载体，如质粒。在优选的实施方案中，该核酸构建体编码PTP  1D并含有图2所示的核苷酸序列[SEQ  ID  NO：5]。

同时提供一种分离及纯化的核酸构建体，它含有编码PTP  1D蛋白质的核苷酸序列。最好，该核苷酸序列是SEQ  ID  NO：5。

本发明包括用，或含，上述表达载体或质粒转化或转染的原核及真核宿主细胞。

也提供制备PTP  1D蛋白质的方法，包括：

（a）在培养条件下，培养能表达PTP  1D蛋白质的宿主细胞，

（b）表达PTP  1D蛋白质;和

（c）从培养物中回收PTP  1D蛋白质。

本发明也涉及对PTP  1D蛋白质的抗原决定簇特异性的抗体，包括，多克隆，单克隆，或嵌合抗体。

本发明另外还涉及检测细胞中PTP  1D的存在或测量细胞中其数量的方法，该方法包括：

（a）将细胞或其提取物与对PTP  1D蛋白质的抗原决定簇特异性的抗体接触;和

（b）检测抗体与细胞或其提取物的结合，或测量结合的抗体数量，由此，确定PTP  1D蛋白质的存在或测量其量。

也提供用于检测含核酸的样品中，是否存在编码正常或突变PTP  1D蛋白质的核酸序列的方法，包括：

（a）在杂交条件下，将样品，或其提取物与编码至少部分正常或突变PTP  1D蛋白质的寡核苷酸探针接触;和

（b）检测探针与样品核酸杂交，

由此检测核酸序列的存在。

最好，在步骤（a）前，上述方法包括选择性扩增编码至少部分正常或突变PTP  1D蛋白质的核酸数量这一步骤。

本发明还涉及用于鉴定能与PTP  1D蛋白质结合的化合物的方法，该方法包括：

（a）将PTP  1D蛋白质，或一个其化合物结合的部分，附着到一个固相基质上;

（b）将猜测含该化合物的样品与基质结合的PTP  1D蛋白质，糖蛋白质或其部分接触，以使该化合物结合，并洗涤掉任何未结合的物质;和

（c）检测是否存在与固相基质结合的化合物。

在另一个实施方案中，提供从复合混合物中分离能与PTP  1D蛋白质结合的化合物的方法，该方法包括：

（a）将PTP  1D蛋白质或其化合物结合的部分附着到固相基质上;

（b）将复合混合物与基质结合的PTP  1D蛋白质，糖蛋白或其部分接触，以使化合物结合，并洗涤掉未结合的物质;和

（c）从固相基质上洗脱结合的化合物，由此分离该化合物。

在另一实施方案中，本发明包括一种用于确定一种化合物是否能刺激或抑制PTP  1D的磷酸酪氨酸磷酸酶活性的方法，该方法包括：

（a）将所述化合物与纯化形式，膜制品中的，或全活或固定细胞中的PTP  1D蛋白质，或PTP  1D蛋白质的酶活性片段接触;

（b）将步骤（a）的混合物培养一段时间，使该化合物足以刺激或抑制酶活性;

（c）测量PTP  1D蛋白质，糖蛋白或片段的磷酸酪氨酸磷酸酶活性;

（d）将酶活性与未用该化合物培养的PTP  1D蛋白质、糖蛋白或片段比较，由此确定该化合物是否刺激或抑制该活性。

本发明也涉及用于治疗或防止与不正常PTP  1D蛋白质有关的疾病的药物组合物，该组合物含有PTP  1D蛋白质，或其功能衍生物，及药物学可接受的载体。

在另一实施方案中，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物用于治疗或防止与反常的具有缺陷性酶活性的PTP  1D蛋白质有关的疾病，该组合物含有可有效刺激PTP  1D的磷酸酪氨酸磷酸酶活性数量的化合物及药物学可接受的载体。

也提供一种用于治疗或防止与具有超常酶活性的不正常PTP  1D蛋白质有关的疾病的药物组合物，该组合物含有可有效抑制PTP  1D磷酸酪氨酸磷酸酶活性数量的化合物，以及药物学可接受的载体。

本发明包括用于治疗或防止与主体中不正常PTP  1D蛋白质有关的疾病的方法，包括给该主体施用上述的药物组合物。

图1表示编码部分新PTP的克隆（称之为P158）的序列。表示出了DNA序列[SEQ  ID  NO：6]和推测的氨基酸序列[SEQ  ID  NO：7]。

图2表示PTP  1D完全的cDNA序列[SEQ  ID  NO：5]和推测的氨基酸序列[SEQ  ID  NO：4]。

图3表示图2的序列，上有SH2和PTP区并用框架框出，后面用阴影表示。为了方便在末端密码子TGA（1908-1911）与多聚腺苷酸化信号之间的约4.7Kb未表示。

图4是显示在几种人组织中表达的PTP  1D的印迹。

图5是显示在人乳房癌细胞系中表达的PTP  1D的印迹。

图6是内源表达PTP  1D的人乳房癌细胞系SH-BR-3和T-47-D溶解产物的Western印迹（将7.5%聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维滤膜上）。用通过GST-PTP  1D融合蛋白免疫而制备的兔抗血清探测该印迹。

图7表示在293系的人胚肾成纤维细胞中，PTP  1D和PTP  1C的瞬时超量表达对RPTK酪氨酸磷酸化的影响。用标明的配体将细胞刺激10分钟，溶解，用SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素上，并用单克隆的抗磷酸酪氨酸抗体5E2探测。标明了分子量标记物。

图8表示PTP  1D和PTP  1C与EGF受体相关的PTKs的关系。用50ng/ml  EGF刺激后，用mAb108.1免疫沉淀受体材料。沉淀物在7.5%SDS-PAGE上电泳，转移到硝酸纤维素上，并用抗PTP  1D和PTP  1C的兔抗血清混合物探测（上组）。仅用PTPs转染13和14道的样品。下面一组表示经沉淀的RPTKs的放射自显影分析。标明了分子量标记。

图9显示通过激活的EP-R使PTP  1D磷酸化。将来自仅表达PTP  1D或一起表达PTP  1D和EP-R嵌合体的293细胞转染体的PTP  1D的免疫沉淀物用抗磷酸酪氨酸抗体免疫吸印，表达载体转染的293细胞作为负对照。

图10表示体外测量图9所示细胞溶解物的PTP  1D磷酸酶活性的结果。图中表示了对于每个时间点，用两种平行测量方法测得的代表性实验的数据。免疫沉淀物来自用对照质粒（白条），PTP  1D表达载体（画有交叉阴影线的棒条）或PTP  1D和EP-R表达质粒一起（点画的棒条：-EGF;黑棒条：+EGF）转染的细胞。

下表列出了蛋白质化学家通常使用的及本文所用的氨基酸的单字母缩写。

氨基酸  符号  氨基酸  符号

甘氨酸  G  精氨酸  R

丙氨酸  A  赖氨酸  K

缬氨酸  V  组氨酸  H

亮氨酸  L  苯丙氨酸  F

异亮氨酸  I  酪氨酸  Y

丝氨酸  S  色氨酸  W

苏氨酸  T  脯氨酸  P

半胱氨酸  C  丝氨酸或天冬氨酸  S/N

甲硫氨酸  M  天冬氨酸或天冬酰胺  D/N

天冬氨酸  D  异亮氨酸或缬氨酸  I/V

天冬酰胺  N  未限定  X

谷氨酸  E

谷氨酰胺  Q

本发明人先前鉴定了一个蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTPs）的新亚家族（‘PTP-D亚家族’）。PTP-D家族成员有明显不同于以前报告的PTPs的结构。本发明人现已克隆并定序了另一种PTP，叫做PTP-1D（图2）。

术语“亚家族”用于说明在上述说明的特定氨基酸残基上，结构相关的一组PTPs。

“以前定义的氨基酸一致序列”是指在Krueger等上（同上文），和Yi等人（同上文）描述的已知PTPs的催化磷酸酶区中保守的氨基酸序列。

因此，在优选的实施方案中，本发明涉及有氨基酸序列SEQ  ID  NO：4的PTP  1D蛋白质，或其功能衍生物。

本发明的一个实施方案是天然产生的哺乳动物PTP-1D。另一实施方案含有重组的哺乳动物PTP-1D。还有另一实施方案是化学合成的哺乳动物PTP-1D蛋白质。在固相支持物上合成所需序列多肽并随后将其从支持物上分离的方法是本领域已知的。

优选的本发明PTP-1D蛋白质是来源于人的。

天然产生的PTP-1D蛋白质最好基本没有与之天然相关的其它蛋白质或糖蛋白。“基本没有其它蛋白质或糖蛋白”表示PTP-1D蛋白质已纯化掉至少90%（重量计），如果需要甚至至少99%的与之天然相关的其它蛋白质和糖蛋白，且因此基本没有它们。

含PTP  1D蛋白质的细胞、组织或液体经标准蛋白质纯化技术，例如，使用固定了与蛋白质结合的单克隆抗体（mAb）的免疫吸附柱进行免疫亲和层析可完成上述纯化。

其它有用类型的亲和纯化法利用一种用于PTP的固相底物，该PTP结合催化磷酸酶区，或利用与受体型PTP蛋白的细胞外受体区结合的配体。换种方法，或另外，用标准方法，如硫酸铵沉淀，分子筛层析，和离子交换层析的组合纯化PTP-1D蛋白质。

应理解，可以从各种细胞或组织源中，用生化方法纯化本发明的哺乳动物PTP  1D蛋白质。为了制备天然产生的PTP  1D蛋白质，如脑组织，特别是人源的组织，是优选的。编码PTP-1D的核酸的或蛋白质的优选组织来源是细胞系SK-BR-3，或人乳房癌系，BT-474和T-47-D。

由于可以分离或合成编码PTP  1D蛋白质的基因，所以，如果需要，可以在原核生物或非哺乳动物真核生物中，合成基本没有哺乳动物源的其它蛋白质或糖蛋白的PTP  1D蛋白质。按本发明的设想，在哺乳动物细胞，如转染的COS，NIH-3T3，或CHO细胞中生产的重组PTP  1D蛋白质，例如，要么是天然产生的蛋白质序列，要么是有氨基酸缺失、插入、取代或其组合的修饰的蛋白质序列。若天然产生的PTP  1D蛋白质是用重组方法生产的，则提供基本没有与之天然相关的其它蛋白质和糖蛋白的PTP-1D。

本文也提供PTP-1D蛋白质的功能衍生物。“功能衍生物”是指该蛋白质的“片段”、“变异体”、“类似物”或“化学衍生物”，这些术语定义在下文。按照本发明，允许其应用的功能衍生物保留了至少部分PTP-1D蛋白质的功能，例如与PTP  1D蛋白质特异性抗体的反应活性，PTP酶活性或配体结合活性。

术语“片段”用于说明得自PTP-1D，最好是人PTP-1D的多肽，并且有天然产生的蛋白质序列。可以通过全长蛋白质的蛋白质水解裂解而生产上述片段。最好通过适当修饰编码PTP-1D蛋白质的DNA序列以便在C-末端，N-末端，和天然序列内的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸，而用重组方法得到该片段。

PTP-1D蛋白质的片段可用于筛选作为拮抗剂或兴奋剂（如下文定义）的化合物。应理解，上述片段可保留天然蛋白质的一个或多个特征部分。上述保留的特征的实例包括：（a）PTP催化活性;（b）底物特异性;（c）在完整细胞中与其它分子的相互作用;（d）PTP-1D的调节功能;或（e）与天然蛋白质或其抗原决定簇的特异性抗体结合。

在本发明范围内的另一种功能衍生物是含附加氨基酸的PTP-1D变异体，通过适当修饰DNA编码序列以便在C末端，N末端，及天然序列内的一个或多个位点加入编码一个或多个氨基酸的密码子，而从天然产生的PTP  1D蛋白质得到所述变异体。应理解，有附加氨基酸的上述变异体保留了如上描述的天然PTP  1D的一个或多个特征部分。

优选的变异体是有取代氨基酸的变异体，通过适当修饰或突变DNA编码序列以使在C末端，N末端，以及天然氨基酸序列内的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸，而从天然产生的PTP  1D蛋白质得到所述变异体。应理解，有上述取代氨基酸的变异体保留了如上定义的，天然PTP-1D蛋白质的一个或多个特征部分。

还可以完成任何组合的缺失，插入及取代以得到PTP  1D功能衍生物的最后构建体，条件是最后构建体具有完整PTP  1D蛋白质（如上描述的）至少一种所需的活性或功能。

上述实施例不以任何方式限制本发明要求的范围。

明显地，在编码PTP  1D蛋白质的DNA所进行的修饰或突变必须不会改变阅读框架，并且最好不会产生可产生二级mRNA结构的互补区（参见欧洲专利公开No.EP75，444）。

在遗传水平，通过位点特异性诱变（按由Adelman等，DNA  2：183（1983）举证的）编码所述序列的DNA中的核苷酸，生产修饰的编码序列，此后在原核或真核宿主细胞中表达该重组DNA，从而制备有缺失，插入或取代氨基酸残基的PTP  1D的功能衍生物（见下文）。PTP-1D蛋白质的功能衍生物通常表现出与天然蛋白质性质上相同的生物活性。

在另一实施方案中，用本领域熟知的方法，通过直接化学合成，可以很方便地制备带有氨基酸缺失、插入或取代（或其组合）的PTP-1D蛋白质的功能衍生物。

本发明也包括一种从另一种PTP构建的“嵌合”PTP分子，其中用与PTP-1D同源的序列代替一种或多种特异性的氨基酸序列。上述嵌合分子的一个实施例是含有得自另一个受体型PTP的配体-结合细胞外区的PTP  1D蛋白质，将该细胞外区移植到本发明PTP  1D蛋白部分上。其它嵌合分子包括：

（a）含有本发明PTP-1D蛋白质催化磷酸酶区的另一种PTP。在这种情况下，优选的氨基酸数为220到260之间;

（b）一种PTP  1D蛋白质其中一部分或几部分催化区已被其它PTPs，如PTP-D亚家族的成员，的同源部分取代。

按本文所用，术语“同源序列”的定义是在两种或多种PTPs中，在一级序列位于相似位置的序列，并可表现出序列同源性。应强调“同源序列”并不限于有高度同源性的两个序列。

嵌合分子可用作为说明结构-功能关系以及鉴定与PTP  1D蛋白质相互作用的特定化合物如药物的工具。因此，有用的嵌合分子是其中一个分子的特定部分已经被位于相似位置，但不同的，来自另一个，换句话说同源的，分子的序列所取代的分子。交换部分会常常代表表现出很大不同的分子部分。优选的嵌合分子包括，但不限于，含配体-结合细胞外区的PTP  1D蛋白质，所述细胞外区是表皮生长因子（EGF）受体，成纤维细胞生长因子（FGF）受体等等。遗传工程方法加工的嵌合受体是本领域熟知的（参见如，Riedel.等人，Nature  324：628-670（1986））。

PTP  1D蛋白质或肽的“嵌合衍生物”含有不是蛋白质正常部分的其它嵌合部分。蛋白质或肽的共价修饰物包括在本发明范围内。通过将肽的靶氨基酸残基与有机衍生剂反应，可将上述修饰物导入分子中，所述的有机衍生剂能与选择的侧链或末端残基反应。

半胱氨酸残基通常与α-卤乙酸盐（和相应的胺），如氯乙酸或氯乙酰胺反应，以得到羧甲基或羧酰氨甲基衍生物。半胱氨酸残基也可通过与溴三氟丙酮，α-溴-β（5-咪唑基）丙酸，氯乙酰磷酸，N-烷基马来酰亚胺，3-硝基-2-吡啶基二硫化物，甲基2-吡啶基二硫化物，对氯高汞苯甲酸，2-氯汞基-4-硝基苯酚，或氯-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑反应而衍生。

组氨酰残基可通过在PH5.5-7.0时与焦碳酸二乙酯反应而衍生，因为该试剂相对于半胱氨酰侧链有特异性的。对溴苯甲酰甲基溴也是有用的;该反应最好在PH6.0，0.1M卡可酸钠中反应。

将赖氨酰和氨基末端残基与琥珀或其它羧酸酐反应。用这些试剂衍生有作用或逆转赖氨酰残基的电荷。其它适于衍生含α-氨基残基的试剂包括：亚氨酸酯如methyl  picolinimidate;磷酸吡哆醛;吡哆醛;氯硼氢化物;三硝基苯磺酸;O-甲基异脲;2，4-戊二酮;和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。

精氨酰残基可通过与一种或几种常规试剂反应而修饰，这些试剂包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮，1，2-环己二酮，和茚三酮。由于胍功能基团的高PKa，所以精氨基残基的衍生需要在碱性条件下完成反应。此外，这些试剂可以与赖氨酸基团以及精氨酸的ε-氨基反应。

酪氨酰残基是熟知的修饰靶，可用于通过与芳香重氮化合物或四硝酸甲烷反应导入光谱标记。通常，用N-acetylimidizol和四硝基甲烷分别形成O-乙酰基酪氨酰和3-硝基衍生物。

通过反应碳化二亚胺（R¹-N-C-N-R¹）如1-环己基-3-（2-吗啉基（4-乙基）碳化二亚胺或1-乙基-3-（4-氮鎓-4，4-二甲基戊基）碳化二亚胺选择性地修饰羧基侧基团（天冬氨酰或谷氨酰）。此外，通过与铵离子反应，将天冬氨酰和谷氨酰残基变成天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基。

经常将谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基脱酰氨基变成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。另外，在温和的酸性条件下，将这些残基脱酰氨基。这些残基的两种形式之一均落在本发明范围内。

用双功能试剂衍生可用于将PTP-1D蛋白质或肽交联到水不溶性固体介质或其它大分子载体。通常使用的交联剂包括，例如1，1-双（重氮基乙酰基）-2-苯乙烷，戊二醛，N-羟基丁二酰胺酯，如含4-叠氮基水杨酸的酯，同双功能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺基酯，如3，3′-二硫双（琥珀酰亚胺基丙酸酯），和双功能的马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷。衍生剂如甲基-3-（对-叠氮基苯基）dithiolpropioimcdate产生能在光存在的条件下，形成交联的光可激活的中间产物。将在美国专利Nos.3，969，287;3，691，016;4，195，128;4，247，642;4，229，537和4，330，440中描述的反应性水不可溶性基质如溴化氰激活的碳水化合物和反应底物用于蛋白质固定。

其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟化作用，丝氨酰或苏氨酰残基羟基的磷酸化作用;赖氨酸，精氨酸，和组氨酸侧链α-氨基的甲基化作用（Creighton，T.E.，PROTEINS：STRUCTURE  AND  MOLECULAR  PROPERTIES，W.H.Freeman  &  Co.，San  Francisco，pp.79-86（1983）），N末湍胺的乙酰化作用，以及某些情况下，C末端羧基的酰胺化作用。

上述衍生的部分可改善溶解性，吸附性，生物半衰期等等。该部分另外还有消除或减弱蛋白质任何不期望的副作用等等。能介导上述作用的部分被公开在，例如Remington′s  Pharmaceutical  Sciences，16th  et.，Mack  Publishing  Co.Easton  PA（1980）中。

另一方面，本发明涉及核酸构建体，它含有编码PTP-1D蛋白质，或编码有氨基酸缺失和/或取代的PTP-1D蛋白质的核苷酸序列。最好该核酸构建体含有图2所示的序列。

本发明还涉及以表达载体，如重组表达载体形式的上述核酸，以及含所述表达载体的原核和真核宿主细胞。

也提供用于表达编码PTP  1D蛋白质的核酸的方法。通过在有助于表达编码PTP  1D的上述DNA的条件下，在适宜的营养培养基中培养细胞来生产PTP-1D蛋白质。

本领域专业人员应知道如何使用未充分实验的本发明的核酸构建体和寡核苷酸，鉴定并克隆与本文描述的PTP  1D蛋白质有序列同源性的人或其它种类哺乳动物的其它PTPs。

此外，本发明核酸的操作使得可将特定受体PTP的特定配体结合的细胞外区移植到PTP-1D的部分蛋白质上，得到上述的嵌合蛋白质。

可以将编码PTP-1D蛋白质，编码其功能衍生物，如有氨基酸缺失、插入或取代的变异体，或编码上文描述的嵌合PTP  1D蛋白质的核酸构建体用于基因治疗。导致疾病或失调的不正常或功能障碍的PTP-1D蛋白质可以通过输注或移植所需谱系的已被转染并能表达正常PTP-1D蛋白质的细胞（如造血细胞）而被代替。可替换地，或另外，可将能把嵌合PTP  1D蛋白质和与所需配体结合的受体部分（如EGF）一起表达的细胞用于上述基因治疗。

可通过任何各种方法，如DNA或RNA合成，或更好是通过重组DNA技术生产作为本发明重组DNA分子的核酸构建体，由，例如Wu等人（Prog.Nucl.Acid.Res.Molec.Biol.21：101-141（1978））公开了合成上述分子的技术。由Sambrook等人（MOLECULAR  CLONING：A  LABORATORY  MANUAL，Second  Edition，Cold  Spring  Harbor  Press，Cold  Spring  Harbor，NY（1989））公开了按上述方法构建重组分子的步骤。

最好处理本发明重组DNA分子的3′末端以便其不适于聚合。可通过用化学方法封阻末端，或通过修饰末端碱基以便使其在结构上干扰聚合作用而完成上述处理。在优选的实施方案中，通过固定3′末端，例如通过将其结合到固体支持物（如，玻璃，塑料，乳胶等）上来完成上述处理。该支持物可以是任何形式的，例如片，棒条，球形，卵形等等。上述固定方法是本领域专业人员熟知的。在最优选的实施方案中，将重组DNA分子的3′末端共价结合到固相支持物上。用一个空间区以将探针延伸出固相支持物只要（1）它不在空间上妨碍重组分子的任何功能或特征，和（2）该空间区序列不参与检测中的杂交或聚合反应。一般需将几个，最好大量的上述重组DNA分子固定到支持物上。

用代表部分PTP-1D蛋白质编码序列的寡核苷酸筛选细胞或组织中存在的编码PTP  1D的基团并克隆所述基因。由，例如，Wu等人（同上文）公开了合成所述寡核苷酸的技术。

由于遗传密码是简并的，因此可用一个以上的密码子编码一个特定的氨基酸（Watson，J.D.等人，MOLECULAR  BIOLOGY  OF  THE  GENE，4th  Ed.，Benjamin/Cummings  Publishing  Co.，Menlo  Park，CA（1987））。因此，可鉴定能编码一种或多种氨基酸的一种或多种不同的寡核苷酸。通过考虑不正常碱基配对的关系及在真核细胞中实际使用的特定密码子（以编码特定的氨基酸）的频率来估计特定寡核苷酸事实上构成实际×××-编码序列的可能性。上述“密码子使用原则”（Lathe等人，J.Molec.Biol.183：1-12（1985））的使用，可鉴别含有理论上最可能编码PTP-1D序列的核苷酸序列的一种寡核苷酸或一套寡核苷酸。虽然偶而地，一种氨基酸序列可能仅由一种寡核苷酸编码，但通常，该序列可能由任何一组相似的寡核苷酸编码。而该组所有成员均可编码肽片段，但该组中仅有一种含等于该基因的核苷酸序列。由于该成员甚至在存在该组其它成员的条件下，与DNA杂交，因此，在相同的方法中，可用未分离组的寡核苷酸，其中人们用一种寡核苷酸以克隆编码所需蛋白质的基因。

可以用理论上“最可能”编码PTP  1D片段序列的寡核苷酸或一组寡核苷酸鉴定互补寡核苷酸或一组互补寡核苷酸序列，所述互补序列能与“最可能的”序列或一组序列杂交。可以用含上述互补序列的一种寡核苷酸作为探针以鉴定并分离PTP-1D基因（Sambrook等人，同上文）。

将能编码PTP-1D基因片段（或与所述寡核苷酸或一组寡核苷酸互补）的一种适宜的寡核苷酸，或一组寡核苷酸，鉴定（用上述方法），合成并用本领域熟知的方法与得自能表达PTP  1D基因的细胞的DNA制品，最好是cDNA制品杂交。用本领域专业人员熟知的方法（Belagaje等人，J，Biol.Chem.254：5765-5780（1979）;Maniatis等人，In：MOLECULAR  MECHANISMS  IN  THE  CONTROL  OF  GENE  EXPRESSION，Nierlich等人，eds.Academic  Press  NY，1976;Wu等人，同上文;Khorana，R.G.，Science  203：614-625（1979）），可合成与“最可能的”PTP  1D编码序列互补的单链寡核苷酸分子。可用自动合成仪完成DNA合成。由Sambrook等人（同上文），及Haymes等人（In：NUCLEIC  ACID  HYBRIDIZATION，APPACTICAL  APPROACH，IRL  Press，Washington，DC，1985）公开了核酸杂交技术，上述文献均引入本文作为参考。

如上述描述的技术或与上述相似的技术也能成功地克隆人醛脱氢酶基因（Hsu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  82：3771-3775（1985））、fibronectin基因（Suzuki等人，EMBO  J.4：2519-2524（1985）），人雌激素受体基因（Walter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  82：7889-7893（1985））、组织型血纤维蛋白溶酶原激活子（Pennica等人，Nature  301：214-221（1983））和人产期胎盘碱性磷酸酶互补DNA（Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：8715-8719（1985））。

在另一种克隆PTP-1D基因的方法中，通过将来自能表达PTP  1D的细胞的DNA，最好是cDNA克隆到表达载体中，从而制备表达载体文库。然后从该文库中筛选能表达蛋白质的成员，所述蛋白质与PTP-1D蛋白质特异性的配体，最好是抗体结合，并含有编码与PTP-1D（或其片段）相同氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在该实施方案中，从能够表达PTP-1D蛋白质的细胞中提取并纯化DNA，最好是cDNA。将纯化的DNA切成片段（通过剪切，核酸内切酶消化等等）以得到DNA或cDNA片段库。然后将来自该库的片段克隆到表达载体中，以便得到其成员各含一个特有的克隆DNA或DNA片段的表达载体基因组文库。

“表达载体”是（由于存在适当的转录和/或转译控制序列）表达已被克隆至载体中的DNA（或cDNA）分子，由此生产蛋白质的载体。若将表达载体导入至适当的宿主细胞中，则会发生克隆序列的表达。对于原核表达载体，适当的宿主细胞是任何能表达克隆序列的原核细胞。类似的，对于真核表达载体，适当的宿主细胞是任何能表达克隆序列的真核细胞。重要的是，由于真核DNA可含有间隔序列，并且由于上述序列不能在原核细胞中正确地被加工，所以最好使用来自能表达PTP-1D的细胞的cDNA以便生产原核基因组表达载体文库。由Sambrook等人（同上文）公开了制备cDNA及生产基因组文库的方法。

可将编码本发明PTP  1D蛋白质，其功能衍生物或其嵌合分子的DNA序列根据常规技术与载体DNA重组，所述的常规技术包括用平整末端或交错末端进行连接，限制酶消化以提供适当的末端，经如合适的碱性磷酸酶处理而填平粘性末端以避免不需要的连接，并用适当的连接酶连接。上述操作技术，公开于Sombrook等人（同上文），并是本领域熟知的。

如果核酸构建体含有带转录和转译调节信息的核苷酸序列且所述序列可被“操作连接”成核苷酸编码序列，则说该核酸构建体如DNA“能表达”多肽。“可操作连接”指一种连接，其中，以允许转录（和最终，转译）的所述方式连接调节DNA序列和要表达的DNA序列。基因表达所需的调节区的精确性质可随生物的不同而变化。通常，在原核生物中，需要“启动子区”，它含有启动子（指导RNA转录的开始）和DNA序列（转录时，该序列发出蛋白质合成起始的信号）。启动子是可结合RNA聚合酶并促进“可操作连接”核酸序列转录的双链DNA或RNA序列。上述调节区一般包括涉及转录及转译开始的5′-非编码序列，如TATA盒，帽序列，CAAT序列等等。

如果需要，可保留通过上述方法得到的，编码序列的3′非编码区，作为其转录末端调节序列，如终止和聚腺苷酸化作用。若在表达宿主细胞中，转录终止信号的功能不令人满意，则在那个宿主细胞中的3′功能区可被取代。

如果两个DNA序列间连接的性质不会（1）导致框移突变的引入;（2）干扰启动子区指导编码序列转录的能力，或（3）干扰编码序列被转录的能力，则认为两个DNA序列（如启动子区序列和PTP-1D蛋白质编码序列）是可操作连接的。如果启动子能够影响DNA序列的转录，则可将启动子区与该DNA序列可操作地连接。

特定的RNA聚合酶表现出高度的启动子特异性。对噬菌体T7，T3，和SP-6的RNA聚合酶特别了解，且它们表现出高度的启动子特异性。对各上述RNA聚合酶特异性的启动子序列也指导聚合酶只利用双螺旋DNA模板两条链中的一条。这种链选择性（由启动子序列的方向决定）决定转录方向。

若将两个核酸分子序列以要么使其两个序列均转录到相同的RNA转录本上，要么允许一个RNA转录本从一个序列开始延伸到第二序列中的方式彼此连接，则认为这两个核酸分子序列是“可操作连接的”。因此，若从启动子序列开始的转录本，将产生操作连接的第二序列的RNA转录本，则两个序列，如启动子序列和任何其它“第二”核酸序列都是可操作连接的。为了进行“可操作连接”，不必要将两相序列相互直接相连。

本发明的启动子序列可以是原核的，真核的或病毒的。适宜的启动子是可阻遏的，或者，最好是组成型。适宜原核启动子的实例包括能识别T4（Malik等人，J.Biol.Chem.263：1174-1181（1984）;Rosenberg等人，Gene 59：191-200（1987）;Shinedling等人，J.Molec.Biol.195：471-480（1987）;Hu等人，Gene 42：21-30（1986）），T3，Sp6和T7（Chamberlin等人，Nature 228：227-231（1970）;Bailey等人，Proc.Natl.Acad.Sci（U.S.A.）8024：2814-2818（1983）;Davanlook等人，Proc.Natl.Acad.Sci（U.S.A.）81：2035-2039（1984））聚合酶的启动子;λ噬菌体的P_R和P_L启动子（The Bacteriophage Lambda，Hershey，A.D.Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY（1973）;Lambda Ⅱ，Hendrix，R：W.，Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY（1980））;大肠杆菌的trp，recA，热休克;和LacZ启动子;枯草杆菌的α-淀粉酶（Ulmanen等人，J.Bacteriol.162：176-182（1985））和σ28-特异性启动子（Gilman等人，Gene  32：11-20（1984））;芽孢杆菌噬菌体的启动子（Gryczan，T.J.，In：THE  MOLECULAR  BIOLOGY  OF  THE  BACILLI，Academic  Press，Inc.，NY（1982））;链霉菌属启动子（Ward等人，Mol.Gen.Genet.203：468-478（1986））;λ噬菌体int启动子;pBR322β-内酰胺酶的bla启动子，以及pBR326氯霉素乙酰基转移酶基因的CAT启动子等等。有关原核启动子的综述参见Glick，B.R.（J.Indust.Microbiol.1：277-282（1987））;Cenatiempo，Y.（Biochimie  68：505-516（1986））;Watson等人，同上文;Gottesman，S.（Ann.Rev.Genet.18：415-442）（1984））。

优选的真核启动子包括小鼠金属硫因Ⅰ基的启动子（Hamer等人.，J.Mol.Appl.Gen.1：273-288（1982））;SV40早期启动子（Benoist等人，Nature  290：304-310（1981））;和酵母gal4基因启动子（Johnston等人.，Proc.Natl.Acad.Sci（USA）79：6971-6975（1982）;Silver等人，Proc.Natl.Acad.Sci（USA）81：5951-5955（1984））。所有上述文献均引入本文作为参考。

强启动子是优选的。上述优选启动子的实例是识别T3，SP6和T7聚合酶的启动子，小鼠金属硫因Ⅰ基因的P_L启动子。对于真核表达PTP-1D最优选的启动子是，如在pLSV载体中控制转录的SV40启动子（Livneh等人，（1986）J.Biol.Chem.261：12490-12497）。上述聚合酶识别位点的序列由Watson等人（同上文）作了公开。

另一方面，本发明涉及能特异性地识别PTP  1D蛋白或能特异性识别PTP  1D蛋白质抗原决定基的抗体。

可以将重组表达的或天然产生的PTP  1D蛋白质，和/或该蛋白质的特异性抗体用于诊断与PTP  1D不正常表达或失活有关的疾病或病状的方法。本发明提供评估主体中，正常或突变PTP  1D蛋白质的存在及其含量的方法。在个体中没有，或更典型地，低水平表达的PTP  1D蛋白质，或存在突变体PTP  1D蛋白质，可作为对癌基因转化及发展成癌敏感性的重要预测指标。另外，PTP  1D的超量表达（可能归因于对负调节不敏感的突变受体/酶系统，或归因于体内存在过量的刺激性配体）可作为对糖尿病敏感性的重要预测指标。

可将本发明的抗体用于检测细胞，细胞或组织提取物，或生物体液中，PTP  1D蛋白质的存在，或测量PTP  1D蛋白质的数量或浓度。

术语“抗体”是包括多克隆抗体，单克隆抗体（mAbs），人性化或嵌合抗体，单链抗体，抗-独特型（抗-Id）抗体，以及上述任何的抗原决定基结合片段。

多克隆抗体是从用抗原，如PTP  1D蛋白质，或其抗原功能衍生物免疫的动物血清中衍生的抗体分子的异源种群。

可以用本领域专业人员熟知的方法，得到对特定抗原基本上是同质种群的单克隆抗体（参见，例如，Kohler等人，Nature  256：495-497（1975）和美国专利申请No.4，376，110）。上述抗体可以是包括IgG，IgM，IgE，IgA，IgD的任何免疫球蛋白类和其任何亚类。可以在体外或体内培养生产本发明mAb的杂交瘤。在活体中生产高效价的mAb使其成为目前优选的生产方法。总之，将来自个体杂交瘤的细胞经腹腔内注射给已用姥鲛烷灌注的小鼠以产生含高浓度所需mAb的腹水。可以用本领域专业人员熟知的柱层析法或亲合层析法从上述腹水，或培养上清液中纯化mAb，最好是IgM或IgG同型。

嵌合抗体是一种分子，其中，其不同部分来自不同动物种，例如，具有鼠mAb衍生的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些分子。嵌合抗体和其生产方法是本领域熟知的（Cabilly等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  71：3273-3277（1984）;Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  81：6851-6855（1984）;Boulianne等人，Nature  312：643-646（1984）;Cabilly等人，欧洲专利申请125023（1984，11，14公开）;Neuberger等人，Nature  314：268270（1985）;Taniguchi等人，欧洲专利申请171496（1985，2，19公开）;Morrison等人，欧洲专利申请173494（1986，3，5公开）;Neuberger等人，PCT申请WO86/01533（1986，3，13公开）;Kudo等人，欧洲专利申请184187（1986，6，11公开）;Sahagan等人，J.Immunol.137：1066-1074（1986）;Robinson等人，国际专利申请＃PCT/US86/02269（1987，5，7公开）;Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  84：3439-3443（1987）;Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  84：214-218（1987）;Better等人，Science140：1041-1043（1988））。将这些文献引入本文作为参考。

为了人治疗的目的，通过生产人恒定区嵌合体而将mAb或嵌合抗体人性化，其中，甚至部分可变区，特别是抗原结合区的保守区或骨架区是人源的，且仅有高度可变区是非人的（参见，如UK专利申请GB2188638A）;Harris等人，PCT申请WO  9204381（3/19/1992）;Riechmann等人，Nature  332：323-327（1988））。

在另一实施方案中，抗体是单链抗体，它是通过经氨基酸桥，将F_V区的重和轻链片段连接，产生单连多肽而形成的（Bird，Science 242：423-426（1988）;Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883（1988）;和Ward等人，Nature 334：544-546（1989））。

抗-独特型（抗-Id）抗体是一种识别唯一的抗原决定基的抗体，所述抗原决定基通常与抗体的抗原结合位点有关。可通过用特异于所制备的抗-Id的mAb免疫与该mAb来源于相同品种和独特型（如小鼠品系）的动物，来制备该抗-Id抗体。通过生产针对这些独特型抗原决定族的抗体（抗-Id抗体），被免疫动物将识别并应答免疫接种抗体的独特型抗原决定簇。

也可以用抗-Id抗体作为“免疫原”诱导另一种动物中的免疫反应，生产所谓抗-抗-Id抗体。抗-抗-Id从抗原决定基上可以与诱导抗-Id的原始mAb相同。因此，通过使用抗mAb独特型抗原决定簇的抗体，可以鉴别表达相同特异性抗体的其它克隆。

相应地，可以用产生的抗本发明PTP  1D蛋白质的mAb在适当动物，如BALB/C小鼠中诱导抗-Id抗体。用来自上述免疫小鼠的脾细胞生产分泌抗-Id mAbs的抗-Id杂交瘤。此外，可将抗-Id mAb与载体如匙孔

血蓝蛋白（KLH）结合并用于免疫其它的BALB/C小鼠。这些小鼠的血清将含有抗-抗-Id抗体，所述抗-抗-Id抗体具有PTP 1D抗原决定基特异性的原始mAb的结合特性。抗-Id mAb因此有其自己的独特型抗原决定基，或“独特型抗原决定基”结构上与被评估的抗原决定基，如PTP-1D蛋白质相似。

本文所用的术语“抗体”也包括能结合抗原的完整分子以及其片段，如，Fab和F（ab′）₂。Fab和F（ab′）₂没有完整抗体的Fc片段，能更迅速地从循环中清除，并且与完整抗体相比，有较低的非特异性组织结合性（Wahl等人，J.Nucl.Med 24：316-325（1983））。应懂得，可将在本发明中有用的抗体的Fab和F（ab′）₂及其它片段按照本文公开的用于完整抗体分子的方法检测PTP 1D蛋白质并确定其量。通常可通过用酶蛋白水解裂解如木瓜酶（生产Fab片段）或胃蛋白酶（生产F（ab′）₂片段）生产上述片段。

可将本发明中有用的抗体，或抗体片段用于定量或定性地检测表达PTP  1D蛋白质的细胞的存在。可通过使用与光学显微镜、流式细胞计数，或荧光检测法结合的荧光标记抗体（见下文）的免疫荧光技术完成上述内容。

可将在本发明中有用的抗体（或其片段）在组织学上，如在免疫荧光或免疫电子显微镜中，用于原位检测PTP  1D蛋白质。可以通过从患者中取出组织学样品，并用到本发明的标记抗体上，完成原位检测。最好通过将标记抗体（或片段）涂到生物样品上，使用该抗体。通过使用上述方法，不仅可确定PTP  1D蛋白质的存在，而且可确定其在被检组织中的分布。使用本发明，普通技术人员会很容易理解，可改变任何许多种类的组织学方法（如染色方法）以便达到所述的原位检测。用于PTP  1D蛋白质的所述检测法一般包括在存在能鉴定PTP  1D蛋白质的可检测标记抗体的情况下，保温生物样品，如生物液体，组织提取物，新鲜收集的细胞如淋巴细胞或白细胞，或已在组织培养液中保温的细胞，用本领域熟知的大量技术，检测结合的抗体。

可将生物样品与固相支持物或载体如硝酸纤维素，或能固定细胞，细胞颗粒或可溶蛋白质的其它固相支持物接触。然后用适当的缓冲液洗涤支持物，接着用可检测标记的PTP·1D特异性抗体处理。然后用缓冲液将固相支持物洗涤第二次以除去未结合的抗体。可通过常规方法检测结合在固体支持物上的结合标记量。

“固相支持物或载体”是能结合抗原或抗体的任何支持物。熟知的支持物或载体包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龙，淀粉酶，天然及改性的纤维素，聚丙烯酰胺，辉长岩，磁铁矿。对于本发明的目的，载体的性质要么在某种程度上是可溶要么不可溶。实际上，支持物可以有任何可能的结构构型，只要结合的分子能与抗原或抗体结合。因此，支持物的构型可以是球形的，如珠，柱形的，在检测试管的内表面，棒条的外表面。另外，表面可以是平的如片，检测带状等等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠。本领域专业人员会知道许多适于结合抗体或抗原的其它载体，或通过常规实验可确定它们。

根据熟知的方法，可以确定所给许多抗-PTP  1D抗体的结合活性。通过使用常规实验，本领域专业人员可以确定每个检测分析的操作和最佳检测条件。

将PTP  1D特异性抗体可检测标记的一种方法之一是将所述抗体与酶连接并在酶免疫检测（EIA）中使用（Voller，A，"The  Enzyme  Linked  Immunosorbent  Assay（ELISA）"，Diagnostic  Horizons  2：1-7（1978））（Microbiological  Associates  Quarterly  Publication，Walkersville，MD）;Voller，A.等人，J.Clin.Pathol.31：507-520（1978）;Butter，J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523（1981）;Maggio，E.（ed.，ENZYME  IMMUNOASSAY，CRC  Press，Boca  Raton，FL，1980;Ishikawa，E.等人，（eds.）ENZYME  IMMUNOASSAY，Kgaku  Shoin，Tokyo，1981）。与抗体结合的酶将以上述方式与适当的底物，最好是产色底物反应，以便产生如，通过分光光度测定法，荧光测定法或肉眼观察法可检测的化学部分。用于可检测标记抗体的酶包括（但不限于）苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，δ-5-甾类异构酶，酵母醇脱氢酶，α-磷酸甘油，脱氢酶，磷酸丙糖异构酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，过氧化氢酶，葡糖-6-磷酸脱氢酶，葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。通过使用有关酶的产色底物的比色法，可完成检测。通过将底物的酶反应程度与相似制备的标准物肉眼进行比较，也可未完成检测。

可以用任何各种其它的免疫检测法完成检测。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，使用放射免疫检测法（RIA）（参见，如Weintraub，B.，Principles  of  Radioimmunoassays，SeventhTraining  Course  on  Padioligand  Assay  Techniques，The  Endocrine  Society，March，1986，该文献引入本文作为参考）可检测PTP  1D蛋白质。由于使用γ计数或闪烁计数或放射自显影，所以可以检测放射性同位素。

也可以用荧光化合物标记抗体。若将荧光标记的抗体置于适当波长的光下，由于产生荧光则可检测到其存在。最常使用的荧光标记化合物是异硫氰酸荧光素，碱性蕊香红，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝素，o-苯二醛和荧光胺。

用发射荧光的金属如¹⁵²Eu，或其它镧系金属，将抗体作可检测标记。用金属螯合基因如二亚乙基三胺基五乙酸（DTPA）或乙二胺四乙酸（EDTA），可将这些金属附着到抗体上。

通过将抗体与化学发光化合物结合，也可将抗体作可检测标记。然后，通过检测在化学反应期间产生的发光的存在，确定化学发光标记抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实施是鲁米诺，异鲁米诺，theromatic  acridinium  ester，咪唑，吖啶盐和草酸酯。

另外，也可用生物发光化合物标记本发明的抗体。生物发光物质是在生物系中发现的一种化学发光物质类型，其中，催化蛋白质提高化学发光反应的效率。通过检测发光的存在，确定生物发光蛋白质的存在。用于标记目的的重要生物发光化合物是虫荧光素，虫荧光素酶和水母发光蛋白。

本发明也涉及用于在主体中检测编码PTP  1D蛋白质的核酸构建体，或编码突变PTP  1D蛋白质的核酸构建体的存在的方法，包括：

（a）在杂交条件下，将所述主体的细胞或其提取物与编码至少部分所述正常或突变PTP  1D蛋白质的寡核苷酸探针接触;和（b）检测所述探针与所述细胞核酸的杂交，

由此检测所述核酸构建体的存在。

该方法可在步骤（a）前含有步骤（c），即选择性地扩增编码PTP  1D蛋白质的核酸的数量。最好，用聚合酶链反应（PCR，见下文）完成扩增。

用编码PTP  1D蛋白质各部分（见上文）的寡核苷酸探针检测受试者细胞中有关编码PTP  1D蛋白质的DNA或RNA的存在情况。合成所述探针的技术由，例如，Wu等人（同上）作了公开。优选的探针是针对编码本发明PTP  1D蛋白质的至少四个氨基酸残基，且最好至少五个氨基酸残基的核酸序列的探针（见下文实施例）。可以用所述探针完成定性或定量检测。例如，用Northern分析测量细胞或组织制品中PTP  1D  mRNA的表达。

甚至对于从个体中得到的很少量的DNA，在用选择性扩增技术之后，也可以使用上述方法。早已掌握能扩增纯化核酸片段的重组DNA方法。通常，上述方法包括将核酸片段导入DNA或RNA载体，克隆扩增载体，并回收扩增的核酸片段。由Cohen等人（美国专利No.4，237，224），和Sambrook等人，（同上文）提供了上述方法的实施（所述文献引入本文作为参考）。

称为“聚合酶链反应”（PCR）的体外酶法能够增加所需核酸分子的浓度（Mullis等人，Cold  Spring  Harbor  Symp.Quant.Biol.51：263-273（1986）;Erlich，H.，EP50424，EP84796，EP258017，EP237362;Mullis  K.，EP201184;Mullis等人;U.S4，683，202;Erlich，H.U.S.4，582，788;和Saiki等人，US4，683，194）。

本发明也涉及鉴定化学或生物制品中存在的能与PTP  1D蛋白质结合的化合物的方法，包括：

（a）将PTP  1D蛋白质或其化合物-结合的部分附着到固相基质上;

（b）将化学或生物制品与步骤（a）中生产的固相基质接触，使该化合物结合，并洗涤掉任何未结合的物质;

（c）检测与固相结合的化合物的存在，

由此鉴定该化合物。

上述方法还可包括步骤：

（d）洗脱结合的化合物，由此分离该化合物。

术语“能与PTP  1D蛋白质结合的化合物”指与磷酸酶区催化位点外的PTP  1D相互作用的天然产生或合成生产的分子。（“催化位点”是指最小的，含有磷酸酶催化活性的PTP  1D连接部分。）上述化合物可直接或间接地调节PTP  1D蛋白质的酶活性。上述化合物的实例是（ⅰ）一种天然底物，最初是与PTP  1D蛋白质相互作用并是由PTP  1D蛋白质去磷酸化的细胞内蛋白质;（ⅱ）由其它细胞型产生的天然分子。

PTP  1D蛋白的“化合物-结合部分”是指催化位点外的分子部分。不是催化位点部分的PTP  1D的任何部分都可以是化合物-结合部分。可通过蛋白酶裂解，接着用本领域专业人员熟知的常规纯化方法纯化，从天然产生的或重组表达的PTP  1D蛋白质制备“化合物-结合部位”。另外，用本领域专业人员熟知的重组技术，通过在适当的细胞中仅表达PTP  1D的这些部分，可生产化合物-结合部分。

另一方面，本发明涉及筛选PTP“拮抗剂”（其定义为直接或间接抑制PTP  1D酶活性或活化的分子）的方法。另一方面，本发明涉及筛选PTP“兴奋剂”（其定义为直接或间接提高PTP  1D蛋白质酶活性或活化的分子）的方法。

本发明的PTP  1D蛋白质在有关筛选药物和其它试剂的方法中是有用的，所述药物和其它试剂能激活或抑制磷酸酶活性，并由此影响细胞代谢的主要途径。通过将完整的PTP  1D蛋白质或其片段附着到固相基质上，生产亲合探针，根据这些生物产品或化学试剂的结合活性，可用该亲合探针筛选所述生物产品或化学试剂有关的与PTP-1D相互作用的能力。然后以纯化形式，从亲合探针上洗脱结合的物质。

可将PTP  1D蛋白质，或有氨基酸缺失和/或插入和/或取代但保持磷酸酶活性的其功能衍生物用于检测能增强或抑制磷酸酶活性的化合物。可以在体外系统中检测被测化合物调节磷酸酶活性的能力，其中将检测化合物加到纯化的PTP  1D蛋白质，或有酶活性的其功能衍生物中，并用本领域专业人员熟知的标准酶学方法，测量对酶活性的影响。

可通过有限地蛋白水解处理天然产生的或重组表达的PTP  1D蛋白质，来制备用于筛选的PTP  1D蛋白质的适当片段。另外，可以用重组技术生产PTP  1D的适宜片段。作为一个实例，它不以任何方式限制所要求的本发明的范围，但最好是仅将催化区用于筛选目的。上述催化区（由对于酶活性必需的最小数目氨基酸组成）可用本领域专业人员熟知的重组技术，在适当的宿主（如大肠杆菌）中，单独或作为融合蛋白的一部分而生产出来。

另外，可用活的或固定细胞，或得自活的或固定细胞的膜部分，在整细胞制品中测量一种化合物对PTP活性的作用。该方法可用于筛选直接作用于PTP  1D蛋白质酶部分的化合物。将检测化合物与表达高水平PTP  1D蛋白质的细胞，如转染的COS或NIH-3T3细胞，或与该细胞的膜制品一起培养。然后用本领域熟知的方法（Nonegger，等人，Cell  51：199-209（1987）;Margolis等人，同上文）测量细胞磷酸酪氨酸的数量。将结果与不存在检测化合物时得到的结果，或者不存在或存在已知PTP  1D蛋白质激活剂时得到的结果相比。在上述检测中，可以测量在存在酪氨酸激酶激活剂的情况下，所检测化合物的作用。刺激PTP活性的化合物将会导致磷酸酪氨酸数量的净减少，而抑制PTP活性的化合物将会导致磷酸酪氨酸数量的净增强。

就生长因子受体RPTKs，如表面生长因子受体（EGF-R）和血小板衍生的生长因子受体（PDGF-R）而言，酪氨酸磷酸化作用与细胞生长和癌基因转化相连接。PTP的激活（导致去磷酸化）可作为防止或抑制生长的反调节机制，并且可能作为抗癌的一种内生调节机制。因此，这种受体-酶系统的突变或不调，可能促使其对癌的敏感性。

胰岛素受体也是一种酪氨酸激酶，且在带有胰岛素受体的细胞中，酪氨酸的磷酸化可能与正常生理功能有关。与细胞生长和癌的情况相比，PTP的激活可能会抵消胰岛素的影响。次正常的PTP水平或酶活性可能对除去正常反调节机制起作用。可是，可能更重要的是，希望PTP  1D的超活性或不适当的激活可抑制或完全防止胰岛素对细胞的作用，而导致糖尿病（一种胰岛素-抗性变种）。因此，对糖尿病的敏感性可能与PTP失调有关。

因此，本发明用于鉴别与细胞或组织有关的正常或突变PTP  1D基因，或测量PTP  1D蛋白质数量或活性的方法可作为鉴别对癌症，糖尿病敏感性，或与细胞中磷酸酪氨酸代谢改变有关的其它疾病的方法。

本发明也涉及在药物组合物中使用（用本文描述的方法鉴别的）PTP  1D的拮抗剂或兴奋剂，所述药物组合物用于治疗与PTP  1D的不正常表达有关的疾病或病状。另外，可以用本文描述的药物组合物治疗与具有正常PTP  1D活性，但在信号转导途径中缺失PTP  1D下游一个分子相关的疾病。通常，药物组合物可以是系统或局部注射或输注的形式，也可以是与适当的载体配制在一起用于注射或输注。

本发明也涉及预防或治疗与PTP  1D激活相关的疾病的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用有效剂量的：

（a）PTP  1D蛋白质，或其功能衍生物（按上文描述的）;

（b）PTP  1D抗原决定基特异性的抗体;或

（c）刺激或抑制PTP  1D的PTP酶活性的分子或化合物。

在下文第11部分详细描述了PTP  1D与特定PTKs的相互作用。以这些相互作用为基础，本发明也包括鉴别与PTK相互作用的PTP  1D特异性位点的方法。用本文描述的方法，和本领域熟知的生物化学和分子生物学方法，可以鉴别在这种相互作用中涉及的成分或蛋白质。例如，可以通过位点特异性诱变编码PTP  1D或激酶的DNA来破坏或抑制这两种分子间的相互作用。期望在两者之一或两种蛋白质中，相互作用的主要位点是磷酸化的酪氨酸残基。一旦鉴定了这种位点根据所需的生物效果，本发明提供促进或抑制这种相互作用的方法。因此，这种相互作用的拮抗剂可含有防止PTP  1D和激酶分子间相互作用的肽或其功能衍生物。兴奋剂可促进这种相互作用。

以上文为基础，本发明还提供用于鉴别可阻断PTP  1D和激酶相互作用的化合物，如小分子的检测方法。例如，将共表达PTP  1D和所需酪氨酸激酶（其中两种蛋白质相互作用）的转染细胞，与能抑制这种相互作用的试剂一起保温，并测量对PTP  1D-激酶相互作用的影响。任何大量用于测量这种相互作用和其破坏作用的方法都是可行的，例如，下文第11部分中描述的方法。相似地，用与上述所述的有关潜在拮抗剂相同的方法，本发明提供一种鉴定并检测兴奋剂化合物的检测方法，该化合物可稳定并促进PTP  1D-激酶相互作用，例如，激活磷酸酶酶促活性。

现已一般性地描述了本发明，通过参考下列实施例，将很容易理解相同的内容，这些实施例是以说明的方式提供的，除非特别说明，否则不限制本发明的范围。

6.实施例：用PCR鉴别定义为PTP  1D的新PTP

根据Chirgwin J.M等人（Biochemistry 18：5294-5299（1979））用硫氰酸胍处理溶解细胞系SK-BR-3（ATCC HTB30）人乳腺癌细胞的融合培养物。通过CsCl梯度离心分离全部的RNA。在寡（dt）柱上分离聚（A）⁺RNA（Aviv等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：1408-1412（1972））。用禽类成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶（Boehringer-Mannheim）从5μg多聚（A）⁺RNA合成第一链cDNA。用标准条件（Erlich，H.E.，1989，同上文）使十分之一的cDNA经PCR。将下列引物库用于扩增：

A.意义引物，相当于氨基酸序列D/E/GS/ND/NYINA（SEQ  ID  NO：8），相当于PTP  1B中的残基63-69（CharbonneaU等人，1989，同上文）。

EcoRI

1）GGAATTCGA（GATC）TC（GATC）GA（TC）TA（TC）AT（ACT）AA（TC）GC

[SEQ  ID  NO：9]

2）GGAATTCGA（GATC）A（GA）（TC）GA（TC）TA（TC）AT（ATC）AA（TC）GC

[SEQ  ID  NO：10]

3）GGAATTCGG（GATC）TC（GATC）（GA）A（TC）TA（TC）AT（ATC）AA（TC）GC

[SEQ  ID  NO：11]

B.Antisense  primer，corresponding  to  the  amino  acid  sequence  K  C  A/D  Q/E  Y  W  P[SEQ  ID  NO：12]，

corresponding  to  residues  120-126  in  PTP-1B（Charbonneau  et  al.，supra）

BamHI

4）CGGGATCCGGCCA（AG）TA（TC）T（GC）（GATC）GC（AG）CA（TC）TT

[SEQ  ID  NO：13]

5）CGGGATCCGGCCA（AG）TA（TC）T（GC）（GA）TC（AG）CA（TC）TT

[SEQ  ID  NO：14]

用10μg收集的引物，完成35个PCR循环（于37℃退火2分钟;在72℃延伸1.30分钟;在94℃变性1分钟）。将反应产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。

分离所需大小（-220bp）的片段，用限制酶Eco  R  I和BamHI将其消化，并使用标准技术（Ausubel，F.M.等人，eds.，Current  Protocols，in  Molecular  Biology，John  Wiley  &  Sons，New  York，1988）将其亚克隆到pBluescript载体（Stratagene）中。通过使用Sequenase（United  States  Biochemical，Cleveland，Ohio，USA）的双脱氧链终止法（Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74：5463-5467（1977））将亚克隆的PCR产物定序。

一个被称为P158的克隆被鉴定为是新序列。在图1中表示了该克隆的核苷酸和推测的氨基酸序列。

7.实施例：PTP  1D的cDNA克隆

用通过PCR鉴定的新PTP（标明为PTP 1D）的部分cDNA序列从SK-BR-3细胞中筛选λzAPcDNA文库。用ZAP cDNA盒（Stratagene，Cat.No.200400），用5μg多聚（A）⁺RNA构建这种单方向的文库。

总之，使用Moloney鼠白血病病毒反转录酶，用引物5′-CTCGAG（T）₁₇-3′完成第一链的合成。用RNAse H，DNA聚合酶1，和T4DNA聚合酶在相同的试管中完成第二链的合成。甲基化后，加入EcoRⅠ连接物，在1%琼脂糖凝胶上选择cDNA制品的大小（＞1000bp），并将其插入EcoRⅠ/Xhol预消化的λzAPⅡ臂中。所得的文库有1.8×10⁶个重组噬菌体的复杂性。

在标准过程后（Sambrook等人，同上文），将约1.2×10⁶的独立的噬菌体克隆铺在平板上并转移到硝酸纤维素滤膜上。将滤膜与克隆p158的EcoRI/BamHI DNA片段杂交，所述片段已用50μCi[α³²P]ATP和Random Primed DNA Labeling盒（Boehringer Mannheim，Cat No.1004760）作了放射性标记。按制造商（stratagene）的说明，用体内切割方法，简化阳性噬菌体克隆亚克隆到pBluescript载体中的步骤。通过链终止法（在上文第5部分中描述的）将最长cDNA插入（-6.2kb）的编码部分定序。

该序列在其5′末端有一个1560bp的开放阅读框架。从710位到915的核苷酸序列与上述的PCR克隆相同。另外在PTP区，如新序列中458-464位的HCSAGIGR（相当于PTP 1D序列中的214-220位）发现了其它的保守序列基元。该序列不含有带上游终止密码子的ATG。因此，用³²P-标记的寡核苷酸探针（寡＃218，5′-TTT CTT GTG CGT GAG AGC CTC AGC CAG CCT GGA GAC TTC GTG CTT TCT GTC C-3′）相当于PTP 1C（Shen S-H等人，同上文）的658-709核苷酸，在低严紧度再筛选 SK-BR-3cDNA文库。

发现含1200bp插入片段的克隆与开始鉴定的序列重叠，并131位核苷酸含一个ATG及在85位的含上游终止密码子。

在图2中列出了新克隆的完整的cDNA序列及预测的氨基酸序列。由于与PTP  1C和细胞溶质的PTP  1B有关，因此，称该新基因为PTP  1D。预测的蛋白质链的分子量为约70KDa。

PTP  1D氨基酸序列含有令人惊奇的序列基元。将PTP  1D与其它已知的细胞内PTPs比较，本发明人能够鉴别在不同高度保守的PTP区内的插入区。而PTP  1C序列仅比PTP  1B和TC  PTP长5个氨基酸，PTP  1D含有8个氨基酸的插入（相当于SEQ  ID  NO：4中的第317到324氨基酸）：

PTP  1B：NASLIKMEEAQ  RSYILTQG

TC  PTP：NASLVDIEEAQ  RSYILTQG

PTP  1C：NANYIKNQLLGPDENA  KTYIASQG

PTP  1D：NANIIMPEFETXCNNSKPKKSYIATQG

PTP  1D，csw（corkswrew）和PTP  1C的内涵物在序列比较中表明，在含SH2区的磷酸酶中，保守序列QGP变成QGC。

将在标明的位置，带有3个或更多氨基酸插入的PTPs定义为新PTP亚家族的成员。

8.实施例：通过Northern分析，在人细胞和组织中表达

PTP  1D

8.1  PTP  1D在正常组织中的表达。

分别从下列人组织中分离全部的RNA：肝，骨骼肌，脾，膀胱，十二指肠，卵巢，肾，脑和胃。按上文所述分离多聚（A）⁺RNA，在含2.2M甲醛的琼脂糖凝胶上分离并印在硝酸纤维素滤膜（Schleicher & Schuell）上。每道加5μg多聚（A）⁺。用（相当于1-705核苷酸的PTP 1D序列的）³²P-标记的Eco RI/BglⅡ DNA片段杂交滤膜。按制造商的说明，用Random Primed DNA Labeling Kit（Cat.no.1004760，Boehringer Mannheim，Germany）完成标记。随后，用强化屏在-70℃使滤膜与X-线胶片接触。图4表明PTP  1D在人组织中的表达。

令人吃惊地是，发现PTP  1D能在许多不同组织中表达。最高表达是在脑中，而在骨骼肌、卵巢、和胃中表达较低。肝、十二指肠和肾仅含很低水平的转录本。用RNA从膀胱和脾中没有可检测的信号。

这种表达方式与有关PTP，PTP  1C的方式明显相反。PTP  1C的表达是高度局限的，对于造血组织和细胞尤其明显（Yi等人，同上文）。

8.2  PTP  1D在人乳腺癌细胞系中表达

用上述方法，对来自几种人乳腺癌细胞系的RNA完成Northern印迹分析。随后，用人致癌HER2（从内皮生长因子受体2型）的cDNA片段再探测Northern印迹。已经表明HER2超表达直接与细胞转化和乳癌有关（Slamon，D.J.等人，Science  235：177-182（1987））。在图5中表示PTP  1D和HER2在人乳腺癌细胞系中的表达。

在大部分分析细胞系中本发明的新PTP  1D具有以马HER2协调的方式被过量表达的显著特征。因此，在MCF-7细胞中，两者均以低水平表达，而在BT-474和T-47-D细胞中两种基因均是超量表达的。

9.实施例：检测或测量细胞中的PTP  1D蛋白质

9.1.生产具有PTP  1D特异性的抗体

用适当的限制酶消化被鉴定噬菌体克隆之一的cDNA插入片段以释放一个550bp的片段（相当于图2在PTP  1D序列中，226位到780位核苷酸）。将该DNA片段以框架形式克隆到pGEX-3X谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因融合载体（Pharmacia，Cat.no.27-4803-01）中。

在加3小时0.5mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）过夜培养后，诱导GST融合蛋白的细菌表达。通过在Glutathione  Sepharose  4B（Pharmacia）上分批层析，从超声波处理的细菌溶解产物的上清液中纯化融合蛋白（Smith等人，同上文）。

通过注射在等体积完全弗代佐剂中的GST-PTP  1D融合蛋白（500μg）来免疫兔。用相同的抗原，将兔接种两次。第二次接种后，用内生表达PTP  1D的人乳腺癌细胞系SK-BR-3和T-47-D的溶解产物检测兔血清在免疫沉淀（Westerm印迹）中的抗体反应活性。将样品载在7.5%聚丙烯酰胺凝胶上，并在电泳后，将其转移到硝酸纤维素滤膜（Schleicher  &  Schuell）上。用与上文相同的抗体探测印迹并按制造商的说明（Amersham  International，UK;Cat.no、RPN  2108）用ECL  Western印迹探测系统显色。图6中给出了结果。

发现抗血清来自这两种细胞制品的免疫沉淀蛋白质，包括相当于PTP  1D的在约70KDa的峰。

10.实施例：鉴定刺激或抑制PTP  1D酶活性的分子用标准技术（Ausubel等人，同上文）将含完整PTP  1D的编码区，或其酶活性部分的cDNA插入哺乳动物表达载体pcDNA Ⅰ（Cat.no.V490-20，Invitrogen，San Diego，CA），用由Gorman等人（Virology 171：377-385（1989））描述的293细胞暂时表达系统生产具有酶活性的PTP。用标准技术，将293细胞在用10%（V/V）胎牛血清补充的Dulbecco′s Modified Eagle培养基（Gibco，Life Technologies，Ltd.Paisley，Scotaland）中，于5%CO₂，37℃培养。

因此，将10μg含PTP 1D cDNA的质粒构建体与0.5ml 0.25M CaCl₂和0.5ml ZXBBS[50mM，N，N-双（2-羟乙基）-2氨基乙烷-磺酸（BES），280mM NaCl，1.5mM Na₂HPO₄]混和，并用其按Chen等人（Mol.Cell.Biol.7：2745-2752（1987））所述方法，转染在10cm陪氏培养皿中的1.5×10⁶203细胞。在加入磷酸钙-DNA沉淀后，将细胞在3%CO₂下，于37℃培养24小时，然后用DMEM-FCS洗涤一次，并在新鲜培养基中，5%CO₂下，于37℃再培养24小时。除去培养基，细胞溶解于1.0ml的溶解缓冲液（20mM HEPES PH7.5，150mM NaCl，10%甘油，1.0%Triton X-100，1.5mM MgCl₂，4mM EGTA（Sigma EDZSS），10μg/ml抑肽酶，1mM PMSF）。在4℃将细胞溶解产物以2500×g离心2分离。除去上清液并将100μl等份快速冷冻在液氮中并在-70℃贮存直到使用。

PTP  1D制品也可以是SK-BR-3细胞系（ATCC  HTB30）的溶解产物，也可以从表达PTP  1D的其它细胞系或正常组织中，按上文所述得到这种蛋白质。

用三种不同的底物评估PTP酶活性的潜在抑制剂或刺激剂：（1）磷酸对硝基苯酯（pNP-P，Sigma 104-0）;（2）³²P-标记的Raytide（Oncogene Science Inc.，Manhasset，NY）;或（3）³²P-标记的牛髓磷脂碱性蛋白（MBP）。对发现可降低或增加本发明PTP抗一种或多种这些底物活性的物质作进一步分析。

基本按Tonks，N.K.等人（J.Biol.Chem.263：6731-6737（1988））所述测定PTP  1D对pNP-P的酶活性。使用微滴定板，将10μl上述的293溶解产物与100μlpNP-P（各30和100mM）一起在室温下温育。用Dynatech  M  R500读数器每隔1分钟读一次吸收值。在加入pNP-P前5分钟，将需分析有关刺激或抑制活性的物质加到PTP  1D/293细胞溶解产物中。

基本按Krueger等人（同上文）所述测定PTP 1D对³²P-标记的Raytide^TM的活性。按制造商的说明（Oncogene Science），稍有很小的修改，使用酪氨酸激酶p60^c-arc用³²P标记合成的肽Raytide。总之将2μlp60^c-arc与20μl Raytide（1mg/ml）和108μl激酶缓冲液[50mM HEPES PH7.5含10mM MgCl₂，0.2%（V/V）β-巯基乙醇，30μM ATP和50μCi[γ³²P]ATP]混合。将混合物在37℃温育16小时，然后，加入500μl在20mM NaH₂PO₄和100μl 5mg/ml乙酰化牛血清白蛋白中的20%（W/V）三氯乙酸（TCA），以中止反应。将混合物离心，用20%TCA/20mM NaH₂PO₄将沉淀洗涤3次，最后再溶解在0.2M Tris-Cl pH8.0中。

用与上述Raytide相似的方法（Guan等人，Nature  350：359-362（1991））。标记髓磷脂碱性蛋白（Sigma Chemical Co.）在60μl含下列组分的反应液中标记30μg MBP：50mM HEPES缓冲液pH7.5，10mM MgCl₂，0.067%β-巯基乙醇，0.05mM含150μCi[γ³²P]ATP和4单位p43^v-abl激酶（Oncogene Science）的ATP。将混和物在30℃温育60分钟，并通过将冰冷TCA加到20%的最终浓度来中止反应。在冰上30分钟后，用20%TCA将沉淀洗涤3次并再溶于100μl H₂O。

用Raytide或MBP作酶检测，将5μl浓缩的（10×）PTP缓冲液（25mM HEPES pH7.3，5mM EDTA，10mM二硫苏糖醇）与下列物质混合：（a）5μl³²P-标记的Raytide或MBP（相当于10-20×10⁴cpm）;（b）分别5，10和25μl的PTP-1D/293细胞溶解产物，和（c）加H₂O到50μl的最终体积。在37℃温育30分钟后，中止反应。在Raytide的情况下，通过加入如下的0.75ml酸性炭混和物（Krueger等人，同上文）来中止反应：0.9M HCl，90mM焦磷酸钠，2mM NaH₂PO₄，4%（v/v）Norit A（Sigma）。混和并离心后除去400μl的上清液，测量放射活性。若使用MBP作为底物，则加入20%TCA（最终体积）来中止反应。测量³²P上清液的数量。

在检测开始前5分钟将有待分析其刺激剂或抑制剂活性的物质加入到PTP-D1/293细胞裂解物中。

采用上面方法鉴定能刺激或抑制PTP  1D的PTP活性的分子或试剂。

11.实施例：PTP  1D与蛋白质酪氨酸激酶的相互作用

为了研究在完整细胞PTP  1D的特定功能，检测PTP  1D的底物特异性及其与一组RPTKs的关系并与PTP  1C进行比较。使用在本发明人的实验室中发展的一种系统，该系统可允许多转染基因的共超表达。

11.1RTKases与PTP  1D的共表达

将在巨细胞病毒启动子为基础的载体中PTP 1D cDNA表达构建体与7种RPTKs的表达质粒一起转染到人293胚肾细胞中。在HER2/neu和pl45^c-klt的情况下，使用嵌合受体HER1-2和EK-R，其中各自相应的激酶功能在EGF-R细胞外区的控制下（Lee，J.等人，EMBO J.8：167（1989）;Herbst，R.等人，J.Biol.Chem.266：19908（1991））（图7）。

或者单独用RPTK表达质粒或与人PTP  1D或小鼠PTP  1C表达载体（Gorman，C.M.等人，Virology  171：377（1989）;Lammers  R.等人，J.Biol.Chem  265：16886（1990））一起转染半会合293细胞（人胚肾成纤维细胞;ATCC  CRL1573）。血清饥饿24小时后，用适当的配体将细胞刺激10分钟（图7）并溶解。用SDS-PAGE分离等分的细胞溶解产物，然后将其转移到硝酸纤维素上并用单克隆抗-磷酸酪氨酸抗体5E2探测。用ECL检测系统（Amersham）将印迹显影。标明分子量标记物。

在这些实验中，配体对PDGF-R和EGF-R磷酸化作用明显消失，是归因于在该系统中，这些受体的很高水平的超量表达以及其基础活性的原有活化。令人吃惊地是，在去磷酸活性中，检测到PTP  1D与PTP  1C相比有显著的不同，尽管它们有大约相等的，高表达水平。

PTP  1C的共表达引起胰岛素受体（I-R）和胰岛素类似的生长因子-1受体（IGF-1-R）的超量表达的PDGF-Rα和β亚单位及β亚单位和未加工前体的部分或完全去磷酸化，但对EGF-R和HER1-2磷酸化状态有边际效应。

相反，PTP  1D对任何检测的RPTKs没有明显的作用，除对EK-R嵌合体有弱的去磷酸化活性（图7，14-16泳道）。

11.2  PTP与PTKase和特定相互作用

当检测PTPs与共表达的RPTKs的可能关系时，会出现不同的情况。该结果说明，PTP  1C和PTP  1D与不同的激酶区特异性地相互作用。

为了标准化实验参数，检测有EGF-R细胞外区的三种嵌合RPTKs（HER1-2，EK-R，EP-R）（Seedorf.K.等人，J.Biol.Chem.266：12424（1991））作为EGR-R本身（图8）。

血清饥饿后，用[³⁵S]-L-甲硫氨酸代谢标记过夜，并用50ng/ml EGF刺激10分钟，用单克隆抗体108.1（对EGF-R细胞外区特异性的）免疫沉淀EGF-R和嵌合受体。该方法消除了生长因子或抗体特性方面可能的差别对实验的影响，并可定量地比较结果。粗略地洗涤沉淀，在SDS样品样缓冲液中煮沸，并用7.5%SDS-PAGE分析，转移到硝酸纤维素上后，用抗PTP  1D和PTP  1C产生的兔抗血清混合物，探测印迹。通过用由谷胱甘肽S-转移酶（Pharmacia）和分别的PTP  1D的部分N末端序列（残基28-219）或PTP  1C的部分N末端序列（残基55-302）组成的融合蛋白免疫兔，来得到这些抗血清。

如在图8中所示（上组），PTP  1C仅与HER1-2嵌合体（泳道6）有关。相反，PTP  1D与HER2/neu（HER1-2）和PDGF-Rβ（EP-R）胞质区有很大的关系，且与EGF-R和c-kit（EK-R）有较低的亲和性。值得注意地，分别由EGF-R，HER1-2和EK-R产生的泳道2，5和8中的68KDa  PTP带移到泳道11中较高的近似M说明磷酸化作为与活化的EP-R相互作用的结果。

11.3  PTP  1D的酪氨酸磷酸化和磷酸酶活性的刺激

为了检测PTP  1D是否能作为PDGF-Rβ激酶的底物，用上述的PTP  1D和EP-R转染293细胞，通过抗-PTP  1D抗体免疫沉淀、PAGE和用抗磷酸酪氨酸抗体免疫印迹分析细胞溶解产物，用293细胞转染的载体作负对照。

图9表明清晰的PTP  1D带的配体诱导的酪氨酸磷酸化，该带现迁移至169KDa，也检测到约180KD的较大的酪氨酸磷酸化蛋白质的弱共沉淀，可能是EP-R嵌合体（Seedorf，K.等人，J.Biol.Chem.266：12424（1991））。

特定特异性的细胞信号转导途径涉及顺次的蛋白质-蛋白质相互作用，该作用会导致结构修饰，底物构型的改变，但在某些情况下是酶活性的改变。因此，完成实验以检测通过PDGF-Rβ激酶酪氨酸磷酸化是否影响PTP 1D的催化活性。在TCA中底物沉淀后，通过测量其从32P-多聚（Glu-Tyr）释放磷酸的能力。检测来自共表达EP-R和PTP 1D的293细胞的等份抗PRP 1D免疫沉淀物的磷酸酶活性（Tung，H.Y.L.等人，Anal.Biochem.161：412（1987））。将与Protein A-Sepharose（Pharmacia）结合的免疫复合物与³²P-标记的底物（10，000cpm）一起在37℃温育标记的时间（参见图10）。用1.5体积20%TCA沉淀后，通过Cerenkov计数确定上清液中³²P的释放。图10中表示每个时间点，用两种平行测量法得到的典型实验的数据。在含共表达的EP-R的样品中，增强了免疫沉淀的PTP 1D的基础活性，配体刺激完整的转染细胞，则该活性显著地增加。较高的PTP 1D活性（甚至在没有配体的情况下所见到的）反映了这些条件下（图9）的其磷酸化状态并且是归因于超量表达的EP-R激活的结果。第一次，这些结果清楚地说明通过直接与配体-活化的RPTK相互作用，及通过配体-活化的RPTK的酪氨酸磷酸化，调节PTP催化活性。

11.4.讨论

为了研究PTP靶特异性和活性调节的问题，本发明人研究了本发明新PTP（称为PTP  1D，得自SK-BR-3乳癌细胞）的功能性质。PTP  1D和同源PTP，PTP  1C，与一组七种不同结构亚型的RPTKs的共表达令人惊奇地揭示出带PTPs的两种结构相似的SH2区的不同特性。

PTP  1C对自身磷酸化的EGF-R，HER2/neu，I-R，IGF1-Rα和β，PDGF-R，及SCF-R/c-kit胞质区表现出混杂的活性，导致部分或完全的去磷酸化，PTP  1D在相同的实验中没有活性。这是特别未预料到的，由于两种PTPs均在几种乳癌细胞系中共表达，确定，这些发现强有力地说明，这些PTP  1C和PTP  1D的不同调节功能。

这些结果产生几种可能性：在RPTK的信号下降调节中，PTP  1D可能没有一点作用;另外在检测的激酶中间PTP  1D的特异性RPTK靶可能不存在。此外，由PTP  1C表明的明显缺乏特异性可能（a）由不正常的超量表达（可能引起超活化且明显失去特异性）造成，或（b）反映了对其它因子的需要，所述因子对于限定特异性是必需的，但不存在于293胚成纤维细胞中。

在与RPTK胞质区形成复合物的能力方面，PTP  1D和PTP  1C之间存在明显的不同。因此，若PTP  1C仅与一种含HER2/neu胞质区的嵌合EGF-受体共沉淀时，则PTP  1D表现出与有关所有检测受体亲和性的广谱的相互作用（图8）。该结果与完整转染细胞中，在去磷酸化RPTKs方面PTP  1D的近乎失活相反（图7）。

本发明人对这些结果作如下解释：可能PTP  1D经其SH2序列与活化PDGF-Rβ胞质区中的磷酸酪氨酸残基紧密地相互作用，由此保护它的不发生去磷酸化。这样保护受体不会失活。依次，将PTP  1D酪氨酸磷酸化，激活其催化功能并可能导致正信号调节的活化。这种解释从果蝇csw  PTP的遗传研究中得到支持，该csw  PTP与PTP  1D同源，并从RPTK编码基因，torso的下游起作用，并在果蝇胚的末端结构说明中，明显地与raf同系物和转录因子（tailess和huckebein）合作（Perkins，L.A.等人，Cell  70：225（1992））。

以前的报道已表明，在体外和完整细胞中LAR和CD45PTPs可用作Ser/Thr和酪氨酸激酶的底物（Pot D.A.等人，J.Biol.Chem.266：19688（1991）;Stover，D.R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7704（1991））。此外，在其催化活性的调节中，已暗示了CD45的Ser/Thr磷酸化，由于在用Ca⁺⁺离子载体处理的T淋巴细胞中，CD45磷酸化的程度和其活性均有降低（Ostergaard，H.L.等人，Science 253：1423（1991））。

相反，上文列举的结果说明在完整细胞中由PDGF-Rβ激酶引起的PTP  1D酪氨酸磷酸化的增加与其催化活性成比例增强有关。因此，本发明的发现（1）代表重要的PTP与特异性PTK靶相互作用的第一个实例，和（2）提供有关通过PDGF-R激酶，PTP活性的酪氨酸磷酸化-介导的调节的迹象。

与果蝇中csw/torso基因相似，PTP与PTK的这种相互作用会导致对PDGF信号转导途径的正影响。上述理论发现支持在T细胞受体复合物内发送信号的lck酪氨酸激酶涉及CD45（Mustelin  T.等人，Oncogene  5：809-813（1990）），并且在本发明人实验室的该发现中，发现src族的PTKs可由PTP  1α和PTP  1D诱导的去磷酸化活化（参见，Zheng，X.M.等人，Nature  359：336（1992））。这些发现指出了PDGF-R，src-型PTKs，和PTP  1D之间相互作用的重要性，并开辟了研究作为PDGF-R特异性信号转导途径基础的精确机制的新方法。本发明的发现不仅指明了导致RPTKs产生信号的分子基础，而且提供了PTPs在涉及细胞增殖、包括癌的疾病中的作用的线索。

上文引述的所有文献均引入本文作为参考，无论特定插入与否。

现已全部描述了本发明，本领域专业人员应理解，在未偏离本发明精神及范围和未作详细实验的相同参数、浓度和条件下可完成本发明。

与其具体的实施方案相结合描述了本发明，但应理解，能够进一步对其修改。本申请打算覆盖通常基于本发明原理并包括上述背离本发明公开的任何变异体，用途或改制物，由于它们与本发明有关，在本领域内是已知的或常规实践并可用于在如下权利要求范围内，在前所述的基本特征。

序列目录

（1）一般资料：

（ⅰ）申请人：Ullrich，Axel

Vogel，Wolfgang

（ⅱ）发明题目：PTP  1D：一种新的蛋白质酪氨酸磷酸酶

（ⅲ）序列数：19

（ⅳ）相关地址：

（A）收件人：PENNIE  &  EDMODS

（B）街道：1155  Avenue  of  Americas

（C）城市：New  York

（D）州：New  York

（E）国家：美国

（F）邮政编码：10036

（ⅴ）计算机可读形式：

（A）介质类型：Floppy盘

（B）计算机：IBM  PC  兼容

（C）操作系统：PC-DOD/MS-DOS

（D）软件：Patent  In  Release  ＃1.0，Version  ＃1.25

（ⅵ）目前的申请资料：

（A）申请号：US08/018，129

（B）申请日：16-FEB-1993

（C）分类号：

（ⅷ）代理人/代理资料：

（A）名字：Misrock，S  Leslie

（B）注册号：18，872

（C）参考/DOCKET号：7683-017

（ⅸ）通讯资料：

（A）电话：（212）790-9090

（B）传真：（212）869-8864/9741

（C）电传：6614/PENNIE

（2）SEQ  ID  NO：1的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链型：未知

（D）拓扑结构：未知

（ⅱ）分子类型：肽

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（ⅰ）序列特征：

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（ⅱ）分子类型：肽

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（A）名称/关键词：修饰的位点

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Xaa Tyr Ile Asn Ala Xaa

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（ⅰ）序列特征：

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（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

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（A）名称/关键词：CDS

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（ⅰ）序列特征：

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（A）名称/关键词：CDS

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（ⅱ）分子类型：蛋白质

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（ⅱ）分子类型：肽

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Xaa Xaa Xaa Tyr Ile Asn Ala

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GGAATTCGAN TCNGAYTAYA THAAYGC

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GGAATTCGAN ARYGAYTAYA THAAYGC

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（A）长度：27个碱基对

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（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

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GGAATTCGGN TCNRAYTAYA THAAYGC

（2）SEQ  ID  NO：12的资料：

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（A）长度：7个氨基酸

（B）类型：氨基酸

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（A）名称/关键词：修饰的位点

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/注＝“Xaa＝Ala或Asp”

（ⅸ）特征：

（A）名称/关键词：修饰的位点

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/注＝“Xaa＝Gln或Glu”

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：28个碱基对

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（ⅸ）特征：

（A）名称/关键词：misc-特征

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（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：13：

CGGGATCCGG CCARTAYTSN GCRCAYTT

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：28个碱基对

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CGGGATCCGG CCARTAYTSR TCRCAYTT

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：23个碱基对

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CTCGAGTTTT TTTTTTTTTT TTT

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（ⅰ）序列特征：

（A）长度：52个碱基对

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TTTCTTGTGC GTGAGAGCCT CAGCCAGCCT GGAGACTTCG TGCTTTCTGT CC

（2）SEQ  ID  NO：17的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：19个氨基酸

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（2）SEQ  ID  NO：19的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：24个氨基酸

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（D）拓扑结构：未知

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：19

Claims (28)

1、一种PTP  1D蛋白质，或其功能衍生物，其中，若所述PTP  1D蛋白质是天然产生的，则所述PTP  1D蛋白质基本没有与之天然相关的其它蛋白质或糖蛋白。

2、根据权利要求1的PTP  1D蛋白质，它含有与图2所示的PTP  1D氨基酸序列（SEQ  ID  NO：4）至少有71%序列相同性的氨基酸序列。

3、一种PTP  1D蛋白质，含有图2所示的氨基酸序列（SEQ  ID  NO：4）。

4、一种重组核酸构建体，含有编码PTP  1D蛋白质或编码其功能衍生物的核苷酸序列。

5、根据权利要求4的重组核酸构建体，其中所述核苷酸序列是cDNA序列。

6、根据权利要求4的重组核酸构建体，其中所述核苷酸序列是基因组DNA序列。

7、根据权利要求4的重组核酸构建体，其中所述核苷酸序列编码PTP  1D蛋白质。

8、根据权利要求4的重组核酸构建体，其中所述核苷酸序列是图2中所示的序列（SEQ  ID  NO：5）。

9、根据权利要求4的重组核酸构建体，它是表达载体。

10、根据权利要求9的重组核酸构建体，它是载体。

11、权利要求10的重组核酸构建体，它是质粒。

12、一种分离并纯化的核酸构建体，它含有编码PTP-1D蛋白质的核苷酸序列。

13、根据权利要求12的分离的和纯化的核酸构建体，其中所述核苷酸序列是图2中所示的序列（SEQ  ID  NO：5）。

14、用权利要求14的核酸构建体转化的原核宿主细胞。

15、用根据权利要求14的核酸构建体转化的真核宿主细胞。

16、制备PTP  1D蛋白质的方法，包括：

（a）在培养条件下;培养能表达所述PTP  1D蛋白质的宿主细胞，

（b）表达所述PTP  1D蛋白质;和

（c）从所述培养物中回收所述PTP  1D蛋白质。

17、一种PTP  1D蛋白质特异性的抗体。

18、根据权利要求17的抗体是单克隆的。

19、检测细胞中PTP  1D蛋白质的存在并测量其数量的方法，该方法包括：

（a）将所述细胞或其提取物与PTP  1D蛋白质特异性的抗体接触;和

（b）检测所述抗体与所述细胞或其提取物的结合，或测量结合的抗体量。

由此确定所述PTP  1D蛋白质的存在或测量其数量。

20、一种用于检测含核酸的样品中存在的编码至少部分所述正常或突变PTP  1D蛋白质的核酸序列的方法，包括：

（a）在杂交条件下，将样品或其提取物与编码至少部分所述正常或突变PTP  1D蛋白质的寡核苷酸探针接触;和

（b）测量所述探针与所述样品核酸的杂交，由此检测所述核酸序列的存在。

21、根据权利要求20的方法，在步骤（a）前还含有：

（c）选择性地扩增编码所述至少部分所述正常或突变PTP  1D蛋白质的核酸的数量。

22、一种鉴别能与PTP  1D蛋白质结合的化合物的方法，所述方法包括：

（a）将所述PTP  1D蛋白质，或其化合物-结合的部分附着到固相基质上;

（b）将怀疑其含有所述化合物的混合物与所述基质-结合的PTP  1D蛋白质，糖蛋白或其部分接触，使所述化合物结合，并洗涤掉未结合的物质;和

（c）从所述固相基质上洗脱结合的化合物，由此分离所述化合物。

23、一种从复合混合物中分离能结合PTP  1D蛋白质的化合物的方法，该方法包括：

（a）将所述PTP  1D蛋白质，或其化合物-结合的部分附着到固相基质上;

（b）将复合混合物与基质结合的PTP  ID蛋白质，糖蛋白或其部分接触，以使化合物结合，并洗涤掉未结合的物质;和

（c）从固相基质上洗脱结合的化合物，由此分离该化合物。

24、一种用于确定化合物是否能刺激或抑制PTP  ID的磷酸酪氨酸磷酸酶活性的方法，所述方法包括：

（a）将该化合物与纯化形式的膜制品中或整个活或固定细胞中的PTP  1D蛋白质接触，或与所述PTP  1D蛋白质的酶活性片段接触;

（b）将步骤（a）的所述混合物保温一段间隔使所述化合物足以刺激或抑制所述酶活性;

（c）测量所述PTP  1D蛋白质或片段的磷酸酪氨酸磷酸酶活性;和

（d）将所述酶活性与未与所述化合物保温的所述PTP  1D蛋白质或片段的酶活性进行比较，由此确定所述化合物是否刺激或抑制所述酶活性。

25、用于治疗或防止与不正常PTP  1D蛋白质有关的疾病的药物组合物，所述组合物含有PTP  1D蛋白质，或其功能衍生物，及药物学可接受的载体。

26、一种用于治疗或防止与具有酶活性缺陷的不正常PTP  1D蛋白质有关的疾病的药物组合物，所述组合物含有刺激PTP  1D磷酸酪氨酸磷酸酶活性有效量的化合物，和药物学可接受的载体。

27、一种用于治疗或防止与具有超常酶活性的不正常PTP  1D有关的疾病的药物组合物，所述组合物含有抑制PTP  1D磷酸酪氨酸磷酸酶活性有效量的化合物，和药物学可接受的载体。

28、一种用于治疗或防止主体中与不正常PTP  1D蛋白质有关的疾病的方法，包括给所述主体施用权利要求25，26或27的任何组合物。

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