CN1795205A - Spex组合物和使用方法 - Google Patents

Spex组合物和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1795205A
CN1795205A CNA2004800146309A CN200480014630A CN1795205A CN 1795205 A CN1795205 A CN 1795205A CN A2004800146309 A CNA2004800146309 A CN A2004800146309A CN 200480014630 A CN200480014630 A CN 200480014630A CN 1795205 A CN1795205 A CN 1795205A
Authority
CN
China
Prior art keywords
spex
leu
ser
polypeptide
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2004800146309A
Other languages
English (en)
Inventor
J·凯
B·威尔金森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Scripps Research Institute
Original Assignee
Novartis AG
Scripps Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis AG, Scripps Research Institute filed Critical Novartis AG
Publication of CN1795205A publication Critical patent/CN1795205A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供了鉴定为在脾组织表达并与淋巴细胞活性和免疫应答相关的新的多肽和其它因子。这些化合物在本文称作SPEX化合物。提供的SPEX多肽和多核苷酸的人和鼠的同系物，其中包括鼠的两个等位基因。本发明还提供编码多肽的多核苷酸和其互补的核酸序列。本发明还提供了与SPEX多肽和多核苷酸相关的免疫原、表达载体和抗体。本发明公开了抗SPEX抗体在调节淋巴细胞活性和调节免疫应答中的用途。

Description

Spex组合物和使用方法
技术领域
本发明涉及细胞通讯和信号转导领域。具体而言，本发明提供了与淋巴细胞发育、增殖和细胞谱系定型有关的新的多肽和多核苷酸，还提供免疫原、抗体、载体、宿主细胞和其它组合物，并且提供了将它们用于包括调节淋巴细胞活化和免疫应答的方法。
背景技术
已知某些细胞表面蛋白质在调节免疫应答中起着关键的作用，包括通过细胞使细胞接触和作为可溶介质的受体。对额外的免疫调节蛋白质的鉴定和特征描述以及调节淋巴细胞发育和活性的方法对于研发针对状态包括自身免疫、癌症、移植排斥和炎症在内的多种疾病的靶向疗法仍然是重要的。
下面的多核苷酸列于National Library of Medicine(NLM)，RockvillePike，Bethesda，MD 20894的National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)维护的GenBank数据库中：表达序列标签AA184189和AA177302和细菌人工染色体(BAC)pBeloBAC11(Incyte Genomics，Palo Alto，CA)、PBeloBAC.26056(Incyte)和PBeloBAC.26057(Incyte)。
发明内容
本发明部分地提供了编码在本文称作SPEX的细胞表面蛋白质的新的基因。名称“SPEX”是短语“脾表达”中每个词前两个字母的缩写，这指示着在脾组织中检测到高水平的SPEX表达。在一些实施方案中，基本全长的SPEX多肽的特征是作为在淋巴细胞上表达的信号转导的受体并且能够调节淋巴细胞的增殖、分化、发育和/或细胞谱系定型。在优选的实施方案中，SPEX包含免疫应答的负调节物。在一个实例中，SPEX受体的活化抑制了淋巴细胞的代谢或者抑制了免疫应答。在另一个实例中，对SPEX受体的拮抗作用增强了淋巴细胞的代谢或者延长了免疫应答。本文的一些实施方案提供了能够与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体和用于拮抗SPEX受体的方法，由此刺激淋巴细胞表达SPEX受体。
在一个实施方案中，本发明提供了包含多结构域多肽的SPEX多肽，其中多结构域包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。细胞外结构域优选包括SPEX免疫球蛋白(Ig)样结构域。跨膜结构域优选将SPEX多肽锚定在脂双层中，优选地是细胞的细胞质膜，也可以是脂质体。SPEX细胞内结构域优选地包括一个或多个并更优选3个基于酪氨酸的结构域。
部分地基于所公开的结构域的结构，一个实施方案提供了包含免疫球蛋白超家族的I型细胞表面信号转导磷蛋白的SPEX多肽。
免疫球蛋白超家族是包括许多参与分子识别和粘附的细胞表面蛋白质的多基因家族。Ig样结构域具有保守的核心结构。通过序列分析，本发明人鉴定了SPEX受体分子细胞外部分的Ig样结构域。优选的SPEX多肽的实例包括具有人SPEX(hSPEX)的SEQ ID NO：3、鼠SPEX(mSPEX)的SEQ ID NO：45或mSPEX另一等位基因(在本文称作mSPEXb)的SEQID NO：88所列出序列的Ig样结构域。在一个实施方案中，SPEX Ig样结构域特异结合树突细胞(例如通过SPEX多肽与树突细胞上的受体/配体特异结合)。
磷蛋白是另一个多基因家族。磷蛋白家族包括许多涉及分子识别和/或信号转导的细胞表面蛋白质。磷蛋白一般包括整合分子识别、磷酸化、去磷酸化和信号转导的信号结构域。一些SPEX多肽包含一个或多个基于酪氨酸的结构域。在优选的实施方案中，SPEX基于酪氨酸的结构域包括分子识别、磷酸化、去磷酸化和/或信号转导活性。例如，在一个实施方案中，包含基于酪氨酸结构域的SPEX多肽包括能够被磷酸化和去磷酸化的一个酪氨酸残基。优选的SPEX基于酪氨酸结构域的实例包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11。
部分的基于SPEX多肽中鉴定的Ig样和磷蛋白结构和/或本文公开的数据，一些实施方案提供SPEX受体调节淋巴细胞功能。一些实施方案提供了调节包含SPEX受体的淋巴细胞代谢的方法，其中所述方法包括调节SPEX受体的活性。一个实施方案提供了调节包含SPEX受体的淋巴细胞增殖的方法，其中所述方法包括将淋巴细胞与能与SPEX受体的细胞外结构域起免疫反应的抗SPEX抗体接触。优选提高淋巴细胞的增殖或者增殖率。
在一些实施方案中预期在包含SPEX多肽的淋巴细胞中刺激SPEX活性将抑制淋巴细胞的增殖(例如淋巴细胞所包含的SPEX受体的配体的结合)。
除了包含基本全长SPEX氨基酸序列的分离多肽之外，其多种结构域可用于产生调节SPEX活性的分子的方法。例如，SPEX细胞外结构域可用于产生抗体，该抗体反过来可用于调节SPEX活性和淋巴细胞的代谢；并且SPEX细胞内结构域可用于鉴定结合配偶体，该结合配偶体反过来可用于调节SPEX磷酸化活性和淋巴细胞代谢。
本发明的一个实施方案提供了包含编码SPEX多肽的核酸序列的SPEX多核苷酸或核酸序列的互补序列。还有的实施方案提供了用于鉴定SPEX多肽的核酸、用于扩增SPEX多核苷酸的核酸和与载体序列有效连接的SPEX多核苷酸。SPEX多核苷酸可用于例如体外和体内产生SPEX多肽的方法。优选的表达SPEX多核苷酸的细胞包括淋巴细胞，包括B细胞和T细胞。
一个实施方案提供了包含编码SPEX多肽的核酸或核酸(SPEX多核苷酸)的互补序列的SPEX载体，其中核酸有效地与载体序列连接。优选载体序列调节SPEX多核苷酸的代谢，并且最优选载体序列调节SPEX多核苷酸的表达。
一个实施方案提供了包含与异源序列有效连接的SPEX序列的SPEX融合序列。一些有用的异源序列的实例包括(但不限于)检测标签、可溶性增强因子和生物活性因子。
一个实施方案提供了包含SPEX多肽或SPEX多核苷酸的SPEX变体序列，其中SPEX序列包括本文所公开的修饰或变异。优选SPEX变体序列包括非修饰SPEX序列的结构和/或功能特性(即活性)。
一个实施方案提供了SPEX突变序列(多肽或编码多核苷酸)。优选的实施方案提供了包含在基于酪氨酸的结构域具有突变(例如替代、缺失、截短)的SPEX氨基酸序列的多肽，更优选是在基于酪氨酸的结构域的酪氨酸氨基酸残基进行突变。优选基于酪氨酸的结构域中的突变抑制SPEX信号转导。
另一个实施方案提供了包含SPEX载体的宿主细胞(SPEX宿主细胞)。SPEX宿主细胞可用于例如产生SPEX多肽的方法。在另一个实例中，SPEX宿主细胞可用于淋巴细胞代谢的研究和其调节，包括通过调节SPEX活化和/或抑制的调节。
一个实施方案提供了能够与本发明SPEX多肽免疫反应的分离的抗体或其片段。在一个实施方案中，抗SPEX抗体调节表达SPEX多肽的免疫细胞的活性。在优选的实施方案中，抗SPEX抗体抑制表达SPEX多肽的哺乳动物细胞的增殖和/或分化，所述细胞优选是淋巴细胞并且最优选是T细胞、B细胞和/或抗原呈递细胞(APC)。
一个实施方案提供了筛选候选分子以鉴定SPEX结合配偶体的方法，包括将候选分子与SPEX多肽相接触；确定候选分子与SPEX多肽是否形成结合复合物，其中结合复合物的形成表明候选分子是SPEX结合配偶体；并继续筛选步骤直到鉴定出SPEX结合配偶体。优选的候选结合配偶体分子包括小分子有机化合物和多肽。用于筛选测定法的优选靶包括(但不限于)SPEX多肽和更加优选的SPEX细胞外结构域、SPEX细胞内结构域、SPEX Ig样结构域或SPEX基于酪氨酸的结构域。一个实施方案假设SPEX多肽或SPEX结构域的拮抗剂能活化包含SPEX受体的淋巴细胞。另一个实施方案提供了SPEX多肽或SPEX结构域的激动剂抑制包含SPEX受体的淋巴细胞的活化。
一个实施方案提供了从含有SPEX多肽的生物样品中纯化SPEX多肽的方法，包括将生物样品与结合抗SPEX抗体的亲和基质接触以形成包括SPEX多肽和附着到基质的抗SPEX抗体的免疫复合物；将生物样品的剩余物与基质分开；从抗SPEX抗体分离SPEX多肽；并且收集SPEX多肽。
一个实施方案提供了调节表达SPEX受体多肽的淋巴细胞代谢(优选调节增殖)的方法，包括将表达SPEX受体多肽的淋巴细胞与能够与SPEX受体多肽细胞外结构域起免疫反应的抗SPEX抗体接触，由此调节淋巴细胞的代谢。优选的淋巴细胞包括B淋巴细胞和T淋巴细胞。
附图说明
图1提供了具有细胞外、跨膜(用交叉排线画出阴影)和细胞内结构域(如所标记)的基本上全长小鼠和人SPEX多肽(分别为mSPEX和hSPEX)的示意图。每一细胞外结构域包括免疫球蛋白(Ig)样结构域(水平线画出阴影)和任选地具有可裂解的信号序列(虚线区域)，其中箭头指向裂解位点。在翻译后加工过程中信号序列被剪切掉以产生成熟的SPEX多肽。每一细胞内结构域包括三个基于酪氨酸的基序(垂直线画出阴影)。反过来，每个基于酪氨酸的结构域包括酪氨酸残基(Y是酪氨酸的单字母密码)。所给出的实施方案描述了酪氨酸可以任选地进行磷酸化(带圆圈的P)。显示了SPEX多肽在生物膜中的相对位置。带斑点的区域表示每个多肽中确定的功能结构域之间的部分。
图2A提供了表明所选hSPEX多肽与各所选多肽各序列标识符之对应的实施方案的示意图。
图2B提供了表明所选hSPEX多核苷酸与各所选多核苷酸各序列标识符之对应的实施方案的示意图。
图2C提供了表明所选mSPEX多肽与各所选多肽各序列标识符之对应的实施方案的示意图。
图2D提供了表明所选mSPEX多核苷酸与各所选多核苷酸各序列标识符之对应的实施方案的示意图。
图3提供说明单克隆抗体PK18抑制T细胞的活化的4幅图(1-4系列)。从B10.BR和BALB.K小鼠中纯化LN T细胞并培养于用抗CD3和大鼠Ig(空心符号)或抗CD3和PK18(实心符号)的混合物包被的96孔板中。数据表示为三次培养物平均的3H-TdR(氚标记的胸苷)(+/-标准差)掺入减去单独T细胞培养物中的掺入的每分钟计数(cpm)(小于1500cpm)。3H-TdR向T细胞DNA的掺入与T细胞增殖和T细胞活化两者均相关。
SPEX
本发明人鉴定了部分的信使RNA(mRNA)，通过用用于模仿体内胸腺细胞发育过程的药理激活剂刺激胸腺细胞(即因刺激而增殖和/或分化的胸腺细胞，见实施例1)，信使RNA的表达显著增加。在本文将本发明的mRNA称作“SPEX mRNA”。发明者还鉴定了对应于SPEX mRNA或由SPEX mRNA编码的基因、cDNA和多肽。因此，在本文将本发明的SPEX多核苷酸和其SPEX表达产物称作例如SPEX基因、SPEX cDNA、SPEXmRNA、SPEX反义核酸和SPEX多肽。
本发明公开了SPEX由T细胞和B细胞表达；B细胞上的表达一般高于T细胞上的表达；在T细胞中CD4或者CD8T细胞的活化导致SPEX表达的下调；在B细胞中B细胞的活化导致SPEX表达的下调；SPEX由CD4和CD8T细胞、表达γδTCR(T细胞受体)的T细胞和CD25+CD4+调节T细胞表达；在胸腺从双阳性向单阳性过渡中诱导了SPEX；在骨髓中的祖B细胞向前B细胞过渡中，SPEX上调了，然后在非成熟和成熟B细胞发育阶段进一步上调；SPEX在成熟的骨髓来源树突细胞中表达；在非成熟的骨髓来源树突细胞中SPEX表达从低至缺乏；在NK(天然杀伤)细胞中SPEX表达从低至缺乏；并且SPEX在脾中的抗原呈递细胞(包括巨噬细胞和树突细胞)上表达。
部分地，本发明还提供了组合物，例如SPEX多肽和SPEX多核苷酸(包括SPEX表达载体)、与SPEX多肽起免疫反应的抗体、免疫原和SPEX宿主细胞。本发明还提供了使用SPEX组合物用于例如鉴定SPEX蛋白质结合配偶体；从天然或重组来源中分离SPEX；调节淋巴细胞代谢；和/或作为标记或分离标签区分、鉴定和/或纯化表达SPEX的淋巴细胞的方法。
纯化的定义
如本文所使用，术语“分离的”和“纯化的”可以互换使用并且指特定的目的化合物从其它污染物中分离出来，以至于是不含(即纯的)或基本上不含包括毒素物质(例如内毒素)在内的杂质(任选的忽略溶质、赋形剂、稳定剂、缓冲液、盐、可药用载体，以及其它非必然污染物质)。因此，优选本发明的多肽、多核苷酸、免疫原、变体、突变体、融合物(多肽或多核苷酸融合物)、载体、宿主细胞、抗体等是纯化的形式。
如本文所使用，当本发明纯化化合物与另一种纯化化合物或物质混合或组合时，认为所得的组合物是“纯化的”组合物(即具有所定义的组分)。
按照本发明，本领域技术人员可以使用蛋白质分离和纯化的标准技术纯化本发明的多肽(包括其片段)。纯化的多肽通常在非还原聚丙烯酰胺凝胶上具有单一主带，遭遇的变化有限。例如，在电泳凝胶上间隔很近的多条带(例如双带或三条带)常常是由于存在具有特定氨基酸序列多肽翻译后修饰(或其它)变体的混合总体(例如，多肽群体的一部分是磷酸化的或者其它修饰的而群体的另一部分不包括修饰)。另外，等位基因的多肽基因产物可能在氨基酸序列上不同(例如由于遗传突变)。本发明多肽基因产物在电泳中可差异迁移，一般导致出现对应于在具有正常完备染色体基因座的细胞中发现的两个等位基因的两条带。还可以预期额外的条带(例如由于磷酸化状态和/或翻译后蛋白质修饰(例如糖基化)的不同)。根据本发明和本领域众所周知的一般多肽测序技术(例如测序(肽或核酸)或质谱分析)可以检测凝胶条带以确定SPEX多肽的内容。
需要的话，此种混合多肽群体可以(例如基于电荷、大小、亲和力或本领域已知的其它方法)进一步纯化成均一的(例如由此提供纯化多肽)。同样，可以对群体进行处理以向群体中的多肽添加修饰或从中去除修饰(例如通过激酶可以加入磷酸化或者使用磷酸酶去除磷酸化，通过糖苷酶去除糖基化或者通过糖基转移酶加入糖基化)。可通过例如氨基酸序列分析和/或质谱分析测定多肽的纯度。
按照本发明，本领域技术人员可以使用核酸分离和纯化的标准技术纯化本发明的多核苷酸。例如使用标准的核酸制备技术从蛋白质、脂和其它化合物中取出核酸。可以使用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳富集特异目的条带将核酸序列混合群体分拆。使用序列特异的探针可以鉴定和/或纯化核酸。序列特异探针可附着在基质上用于通过亲和层析方便地分离目的多核苷酸。通过挑选包含单一多核苷酸克隆的单一菌落然后用标准技术从宿主细胞中分离目的核酸可以使用克隆技术纯化多核苷酸。
按照本发明，本领域技术人员可以使用标准技术纯化本发明抗体。一些方法包括通过抗原结合基质(例如SPEX多肽结合基质)的亲和纯化或通过A蛋白基质的一般抗体纯化。
根据本发明，本领域技术人员可以使用标准技术纯化本发明的宿主细胞。一些方法包括稀释平板分离技术，其中该技术可以包括或不包括宿主细胞包含的选择标记基因的使用。
在一些实施方案中，包含纯化多肽、多核苷酸、抗体、宿主细胞或本发明其他化合物的组合物可以进一步包括缓冲液、水、盐、可药用载体、佐剂、融合物、标记、标签、标志物、稳定剂、白蛋白等和/或蛋白质修饰(例如磷酸化或糖基化)。本发明纯化化合物还可以包括一种或多种此种试剂或者与此种试剂一同包装，并且如本文所使用，仍然认为是“纯化的”(即这些试剂不是必然的污染物)。优选地是本发明组合物是纯化的和无菌的组合物。例如，可以通过在无菌条件下将本发明纯化和无菌化合物与一种或多种无菌缓冲液、调节剂、载体、填充剂、结合剂或稳定剂相混合和/或通过在SPEX化合物和试剂混合后将组合物灭菌来制造无菌组合物。
优选本发明纯化和/或无菌多肽、多核苷酸、抗体或组合物基本上不含内毒素或其它致热原和当施用于人或其它动物时能够诱导产生副反应的不利刺激素。本发明多肽、多核苷酸、抗体或组合物可以以干燥的形式提供(例如低压冻干)，此形式可以包含需要的盐、稳定剂等。优选在能够维持无菌和纯度的容器中、器皿或小瓶中提供干燥形式的实施方安，并且任选地在施用于人或其它动物之前，适于用重构剂(见上文)重构。SPEX化合物可以以试剂盒第一个容器提供，与其一起包装的是在第二个容器中的重构剂。
SPEX受体
如本文所使用，“基本上全长SPEX多肽”可以称为“SPEX受体”。优选“SPEX受体”具有本文公开的活性，其中活性包括(但不限于)调节淋巴细胞代谢(例如活化、钝化或增殖)、细胞粘附、(细胞质结构域的)磷酸化、去磷酸化。优选的SPEX受体包括Ig样结构域、跨膜结构域和基于酪氨酸的结构域(优选细胞内结构域)。高度优选的SPEX受体包括(但不限于)SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：63。另外，SPEX受体包括(但不限于)SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：61。此外备选的SPEX受体包含有效连接到SPEX跨膜结构域和SPEX细胞内结构域的SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86。
多肽
本发明的一些实施方案提供了鼠、人(优选)或其它哺乳动物来源的SPEX多肽。人SPEX(hSPEX)多肽的实例包含SEQ ID NO：20列出的氨基酸序列。鼠SPEX(mSPEX)多肽的实例包含SEQ ID NO：62列出的氨基酸序列。一个实施方案提供了鼠SPEX的等位基因，在本文称作mSPEXb。mSPEXb多肽的代表性序列包含SEQ ID NO：86列出的氨基酸序列。
如本文所使用，术语“SPEX多肽”指包括基本全长SPEX多肽，以及如本文所描述的包含其结构域、片段、区段、融合物、突变体和/或变体的氨基酸序列(任选地，基本由它们所组成)。优选地是以纯化形式存在的本发明的多肽。
包括SPEX免疫球蛋白样结构域的多肽
本发明的一个实施方案提供了所含氨基酸序列包含SPEX免疫球蛋白(Ig)样结构域的多肽。在一些实施方案中，SPEX Ig样结构域是SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：88所列出的。
在一个实施方案中，优选的SPEX Ig样结构域包括二级和/或三级结构，例如Ig折叠或β夹层。在另一个实施方案中，当SPEX Ig样结构域从正常包含SPEX Ig样结构域的多肽序列中分离出来或与其分开时，SPEXIg样结构域维持二级和/或三级结构，例如Ig折叠或β夹层。
SPEX Ig样结构域可用于例如制造特异结合SPEX并调节信号转导、淋巴细胞活化、淋巴细胞发育或免疫应答的抗体。在另一个实例中，SPEXIg样结构域，任选是SPEX细胞外结构域，可用于调节淋巴细胞功能、调节免疫应答或筛选SPEX结合蛋白质。在另一个实例中，SPEX Ig样结构域可用于鉴定淋巴细胞和/或SPEX活性的激动剂和拮抗剂的过程。
包含SPEX Ig样结构域的多肽的一些实施方案通过下面表1中序列标示符列出。在包含多个不必连续的氨基酸序列的实施方案中，优选地是将序列有效地连接起来(例如通过肽键或通过氨基酸序列接头)。
表1
包含Ig样结构域的多肽的一些实施方案
 多肽包含：(结构域或SEQ ID NO)  任选地还包含(结构域或SEQ ID NO)  任选地不包括(结构域或SEQ ID NO)
 SPEX Ig样结构域  跨膜结构域
 3  5
 SPEX Ig样结构域  基于酪氨酸的结构域
 3  7，9或11
 3  7，9，11，16或17  5
 3  跨膜结构域或5  7，9或11
 12或13  跨膜结构域或5  5
 12，13，14或15  16或17
  19或20   1
  21
  45   47
  45   7，9或11
  45   7，9，11，58或59   5
  45   跨膜结构域或47   7，9或11
  54或55   跨膜结构域或47   47
  54，55，56或57   58或59
  61或62   43
  63
  88   跨膜结构域
  88   基于酪氨酸的结构域
  85或86   跨膜结构域
  85或86   跨膜结构域   基于酪氨酸的结构域
  85，86或88   跨膜结构域
85，86或88   跨膜结构域和基于酪氨酸的结构域
85，86或88   跨膜结构域和7，9和/或11
一些实施方案提供了包含上面表1所确定的氨基酸序列的多肽(备选地，基本上由其组成)。
确定目的多肽是否包含Ig样结构域的方法包含使用RPS-BLAST检索并且输入目的氨基酸序列作为检索查询。如果多肽包含Ig样结构域结构，则检索程序指出Ig样结构域的位置和序列以及与其它多肽的Ig样结构域的比对。优选的检索参数是：检索数据库：全部；期望值0.01，过滤：低复杂性；检索模式：多重采样数1-通过(multiple hits 1-pass)。ConservedDomain Database和Search Service v1.54工具由Computational BiologyBranch，National Center for Biotechnology Information(NCBI)，NationalLibrary of Medicine(NLM)，Rockville Pike，Bethesda，MD 20894提供。候选多肽与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：45的比较(例如通过序列比对)可用于确定候选多肽是否是本文所公开的SPEX多肽、片段或变体是有用的。
包括SPEX基于酪氨酸的结构域的多肽
本发明的另一方面提供了包含SPEX氨基酸序列的基于酪氨酸的结构域多肽。在一个实施方案中，基于酪氨酸的结构域包含SEQ ID NO：7、SEQID NO：9或SEQ ID NO：11。基于酪氨酸结构域包含酪氨酸残基。优选基于酪氨酸的结构域包含磷酸化位点。还优选SPEX基于酪氨酸的结构域能够被磷酸化和去磷酸化。
SPEX基于酪氨酸结构域可用于例如鉴定SPEX信号活性或淋巴细胞活化的调节物的过程。例如，预期特异结合到SPEX多肽细胞内结构域的SPEX结合配偶体(优选结合基于酪氨酸的结构域基序或其附近)将干扰并由此抑制基于酪氨酸的结构域的磷酸化和/或去磷酸化。预计这能调节SPEX活性，因为基于酪氨酸的结构域的磷酸化/去磷酸化被认为提供了SPEX信号转导的途径。因此，一个实施方案提供了调节淋巴细胞代谢(另选为SPEX信号转导)的方法，包括将编码SPEX结合配偶体的载体施用于淋巴细胞，其中结合配偶体结合到SPEX多肽细胞内结构域，优选是基于酪氨酸的结构域。结合配偶体载体在淋巴细胞中表达多肽，其中多肽特异结合SPEX多肽并且调节淋巴细胞代谢和/或SPEX信号转导。
在下面的表2提供了包含一个或多个SPEX基于酪氨酸结构域的多肽的一些实施方案。表2还提供了备选的实施方案，其中多肽包含一个或多个SPEX基于酪氨酸的结构域(左列)，但是不包含另外的SPEX序列或结构域(右列)。
表2
SPEX多肽的一些实施方案
 多肽包含：SEQ ID NO：   任选地，多肽不包含SEQ ID NO：
 7   1，2，3，4，5，12，13，14或15
 9   1，2，3，4，5，12，13，14或15
 11   1，2，3，4，5，12，13，14或15
 7和9   1，2，3，4，5，12，13，14或15
 7和11   1，2，3，4，5，12，13，14或15
 9和11   1，2，3，4，5，12，13，14或15
 7，9和11   1，2，3，4，5，12，13，14或15
 16   1，2，3，4，5，12，13，14或15
 17   1，2，3，4，5，12，13，14或15
 18   1，2，3，4，13或14
 49   43，44，45，46，47，54，55，56或57
 51   43，44，45，46，47，54，55，56或57
 53   43，44，45，46，47，54，55，56或57
 49和51   43，44，45，46，47，54，55，56或57
 49和53   43，44，45，46，47，54，55，56或57
 51和53   43，44，45，46，47，54，55，56或57
 49，51和53   43，44，45，46，47，54，55，56或57
 58   43，44，45，46，47，54，55，56或57
 59   43，44，45，46，47，54，55，56或57
 60   43，44，45，46，54或55
一些实施方案提供了包含上面表2所确定氨基酸序列的多肽(备选地，基本由其所组成)。
免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)是本领域已知的在一些免疫细胞信号蛋白质(特别是免疫细胞膜受体)中包含的基序。ITIM参与调节免疫应答、细胞增殖、克隆扩充、细胞因子的产生、细胞粘附和其它生物活性。一种ITIM以IXYXXL(SEQ ID NO：93)表示，其中“X”代表任何氨基酸。
本发明的一个实施方案提供了包含序列IVYASL(SEQ ID NO：94)的ITIM。在一个实施方案中，包含GIVYASLNH(SEQ ID NO：9)的基于酪氨酸的结构域包括在SEQ ID NO：94中所列出的ITIM。另一个实施方案提供了包含IVYASL(SEQ ID NO：94)的SPEX多肽。
信号淋巴细胞活化分子(signaling lymphocyte activation molecule)(SLAM)相关衔接蛋白质(SAP)是本领域已知的在一些免疫细胞信号蛋白质中包含的另一基序。SAP基序参与调节免疫应答、细胞增殖、克隆扩充、细胞因子的产生、细胞粘附和其它生物活性。在另一个实例中，SAP多肽SH2D1A是本领域已知的通过SLAM抑制信号转导以致淋巴细胞(例如T细胞和天然杀伤细胞)的增殖不再是不受抑制的。位于Xq25的SAP基因的缺陷与X-连锁淋巴组织增生疾病(见例如Buckley，R.(2000)NEJM343：1313-1324和Sayos J.等，(1998)Nature 395：462-469；每篇文献在本文引入为参考)。
本发明的一个实施方案提供了包含序列TEYASI(SEQ ID NO：96)的SAP结合位点。在一个实施方案中，包含EAPTEYASICVRS(SEQ ID NO：11)的基于酪氨酸的结构域包含SEQ ID NO：96中所列出的SAP。另一个实施方案提供了包含TEYASI(SEQ ID NO：96)的SPEX多肽。
SPEX细胞外结构域
本发明的一个实施方案提供了包含SPEX细胞外结构域或其片段的多肽。在一些实施方案中，细胞外结构域包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQID NO：85、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：88。在一个实施方案中，细胞外结构域还包含跨膜结构域(例如SEQ ID NO：5或SEQID NO：47)。备选地可以使用本领域已知的其它膜锚定序列。已知多种跨膜序列将多肽锚定在细胞膜、细胞壁、细胞器、小泡、脂质体、脂膜筏等。本领域技术人员可以使用跨膜序列结合、锚定本发明多肽或者将本发明多肽与上述的一种基于脂类的结构(优选细胞的质膜)有效连接。
SPEX细胞内结构域
本发明的一个实施方案提供了包含SPEX细胞内结构域或其片段的多肽。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59。在一些实施方案中，细胞内结构域还包含跨膜结构域(例如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：47)。通常，如果需要的话可以使用其它膜锚定序列。
免疫原
本发明的一些实施方案提供了SPEX免疫原。如本文所使用，“SPEX免疫原”是能够引起免疫反应的SPEX多肽或其片段。在一个实施方案中，SPEX多肽或其片段可用于制造能够与SPEX多肽或其片段免疫反应的抗体(见上文)。SPEX免疫原还可用于诊断性和实验性测定法或试剂盒。例如，一些诊断法和试剂盒中提供了可作为淋巴细胞发育阶段标记物、胸腺细胞发育的DP至SP阶段MAPK信号途径活化标记物、细胞类型(表达SPEX的细胞在上面进行了讨论)标记物、或者用于基于至少部分SPEX表达的细胞类型纯化和/或分选的标记物或标签的组合物和方法。
通常，SPEX多肽包括能够引起免疫反应的六个或更多个连续的氨基酸残基。一般地，在SPEX多肽中增加氨基酸残基的数量会增强对肽的免疫应答。因此，一些实施方案中提供了包含SPEX多肽的6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸的SPEX免疫原(按顺序优选性增加)。备选地，SPEX免疫原包含SPEX多肽的6-9、10-19、20-29、30-39或40-50个连续的氨基酸。
在一些优选的实施方案中，SPEX免疫原包含SPEX多肽结构域，例如外部结构域、跨膜结构域、细胞内结构域、Ig样结构域、基于酪氨酸的结构域或信号序列。在表1和表2中公开的每一个SPEX多肽可用作SPEX免疫原。
在优选的实施方案中，SPEX免疫原是纯化的。例如，当使用肽酶(例如tyrpsin和胰凝乳蛋白酶)或多肽裂解试剂(例如哌啶)将片段从较长的SPEX多肽释放出来时优选从较长的SPEX多肽纯化SPEX免疫原。用于制造SPEX免疫原的一种方法包括固相多肽合成，其中的一般技术是本领域众所周知的。另一个方法包含SPEX免疫原的细胞表达和纯化。
纯化的SPEX免疫原可以与任何载体组合或连接和/或与本领域已知的佐剂相混合。由此所产生的SPEX免疫原组合物在本文仍称作SPEX免疫原。关于纯化的SPEX免疫原，没必要把佐剂或载体看作污染物。此种载体和佐剂对于增强免疫应答是有用的。免疫原性增强剂和它们与多肽的组合在本领域是众所周知的。例如弗氏完全佐剂、载体颗粒，例如匙孔槭血蓝蛋白(KLH)或胶体金属(例如胶体金)。
变体
本文的一些实施方案提供了包含与SPEX参照多肽具有95％或更高序列同一性的氨基酸序列的多肽(在本文称作SPEX多肽变体)。如本文所使用，“SPEX参照多肽”是表1或表2序列标识符所列出的多肽。优选本发明SPEX变体多肽包含纯化的SPEX变体多肽。通常，SPEX变体多肽与SPEX多肽序列同一性越高，则变体多肽越是优选的。因此，一些实施方案提供了，包含与SPEX多肽具有96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列优选性依次增加的多肽。当与SPEX参照多肽相比，本文SPEX变体多肽包括至少一个氨基酸替代、修饰、添加、缺失、缺口和/或插入。优选的变体保留SPEX参照多肽基本的生物活性；因此，通常在多数可使用SPEX参照多肽的实施方案中也可使用SPEX变体多肽。然而，SPEX变体多肽在本文通常考虑为SPEX参照多肽的备选实施方案。
通过LabVelocity(LabVelocity，Inc.，San Francisco，CA)使用JELLYFISH 1.5版本软件用以下参数确定本发明的序列比对和同一性百分数：ktuple大小(1)，top diagonals数目(5)，窗口大小(5)，缺口罚分(3)，得分方法(百分数)，权矩阵(Gonnet)，开口罚分(10)，缺口延长罚分(0.2)，残基特异性缺口罚分(是)，亲水性缺口罚分(是)，缺口分开距离(8)，延迟同一性百分数(30.0)，输出次序(排列的)。意味着人工合成修饰氨基酸残基(例如非天然存在的氨基酸)的任何或全部替代、缺失、插入、添加、缺口和内含物将包含在两个序列的同一性百分数的计算中。例如，在一条序列中别异亮氨酸替代异亮氨酸或其它氨基酸残基时会降低比对时序列之间的同一性百分数。在序列中包含D-氨基酸，其中负体是L-氨基酸时也会降低序列间的同一性百分数。
关于包含SEQ ID NO：3(备选地，SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：88)的SPEX变体多肽，优选多肽包含Ig-样结构域结构。例如一个实施方案提供了包含与SEQ ID NO：3(备选地，SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：88)有着95％或更高同一性并且包含免疫球蛋白样结构域结构的氨基酸序列的变体多肽。
按照本发明公开内容，在多肽中产生替代、缺失、插入、添加、修饰残基、缺口等的方法在本领域是常规的方法，并且可以应用到本发明多肽和变体。一种方法包括从编码此种变化的多核苷酸(例如使用定点诱变以修饰多核苷酸)表达的多肽，优选地包括所表达多肽的纯化。产生变体多肽的优选方法包括SPEX变体多肽的从头合成，其中在合成中造成所需的改变。
在一些实施方案中，优选地是氨基酸替代是保守氨基酸替代。通常，在野生型序列中用具有相似特征侧链的氨基酸对特定氨基酸的替代对所得保守替代的变体多肽的结构和功能具有降低的影响。因此，一些实施方案提供了包括十个或更少氨基酸变化(备选地，不多于10个氨基酸变化)的保守修饰的SPEX多肽，其中氨基酸变化是保守的替代、添加或缺失(优选保守氨基酸替代)。优选地是少于10个氨基酸变化。因此，保守修饰的SPEX多肽包括9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、1个保守氨基酸变化(按顺序优选性增加)。一些高度优选的保守修饰SPEX变体包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：88。
优选地，包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11的SPEX多肽分别在SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11中具有不多于一个保守氨基酸替代(备选地为插入或缺失)。
如本文所使用，可以将天然存在的氨基酸按照它们的侧链特性分成用于保守替代的下列的几组：脂肪族侧链(G、A、V、L、I)；具有第二个氨基基团的脂肪族侧链(P)；芳香族侧链(F、Y、W)；含硫侧链(C和M，其中蛋氨酸是多肽第一个氨基酸除外)；脂肪族羟基侧链(S、T)；碱性侧链(K、R、H)；酸性侧链(D、E、N、Q)。例如，缬氨酸可以保守替换非变体(或野生型)多肽(SPEX参照多肽)中的丙氨酸。另外，丙酸酸可以保守替代非变体多肽中存在的缬氨酸。在另一个实例中，脯氨酸没有保守替代。虽然半胱氨酸和蛋氨酸属于含硫氨基酸的一组，优选在SPEX Ig样结构域变体多肽不替代(或缺失)半胱氨酸和蛋氨酸残基。还优选包含SPEX免疫球蛋白样结构域的变体多肽在Ig样结构域中具有完全的野生型半胱氨酸残基以维持二硫键构成和/或结构域的结构构象。
SPEX突变体多肽
一些实施方案提供了包括突变(包括替代、缺失、截短)的SPEX多肽，其中突变抑制了SPEX信号转导和/或调节淋巴细胞代谢。该SPEX多肽在本文称作“SPEX突变体多肽”。SPEX突变体多肽不同于SPEX多肽变体，例如因为具有低活性的突变体是优选地，而具有相当活性的变体是优选的。此处“低活性”优选地是与参照SPEX多肽相比为20％或更低的活性(优选地是10％或更低并且更加优选地是5％或更低的活性)。优选SPEX突变体多肽优纯化的。
高度优选的SPEX突变体多肽包含在SPEX基于酪氨酸的结构域中的突变，甚至更加优选地是包含在基于酪氨酸的结构域中替代或缺失突变酪氨酸残基的突变。优选地，包含基于酪氨酸的结构域突变的SPEX多肽的特征是抑制SPEX信号转导和/或调节淋巴细胞代谢。基于酪氨酸结构域不是突变(即野生型)的SPEX多肽可以用于活性比较，优选如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11等所列出的。
SPEX突变体多肽的一些实施方案列于下面的表3。分别提供了代表性hSPEX和mSPEX序列的目的酪氨酸残基编号。
表3
代表性的基于酪氨酸的SPEX结构域的突变体
 相对于hSPEX SEQ ID NO：21的残基编号 226 257 282
 相对于mSPEX SEQ ID NO：63的残基编号  245   274   299
 SEQ ID NO：21突变体#1突变体#2突变体#3突变体#4突变体#5突变体#6突变体#7  YYYFYFFF   YYFYFYFF   YFYYFFYF
一些优选的SPEX突变体多肽包含显性负SPEX突变体多肽，其中多肽抑制野生型SPEX多肽的活性(例如通过直接相互作用，例如导致缺陷多聚体的多聚体的形成，或者通过间接作用，例如作为配体或野生型SPEX多肽激活剂的抑制剂起作用)。预期上面表3中从突变体#1到#7的每一个都包含显性负SPEX突变体多肽。SPEX突变体多肽可用于例如调节淋巴细胞SPEX信号途径代谢或免疫应答的方法中。例如，突变体会与SPEX受体的配体竞争或作为SPEX活性的显性负抑制剂起作用。
非天然存在多肽
在任选的实施方案中，本发明的多肽包含非天然存在的多肽。非天然多肽的实例包括：(a)包含在自然界或目的生物体中没有发现的氨基酸的多肽，所述氨基酸例如合成的氨基酸或氨基酸模拟物；(b)包含连接到多肽的、在自然界中不与多肽结合的化学部分的多肽，所述化学部分例如放射性同位素或荧光标记物；(c)包含纯化氨基酸序列(例如纯化的截短序列)的多肽，其中所述氨基酸序列的全长序列在自然界中存在；(d)不包括天然存在多肽部分的多肽，例如内部缺失；(e)包含连接在一起的两个或更多氨基酸序列(相同或不同序列)融合的多肽，其中在自然界中没有发现所述氨基酸序列连在一起；(f)或者从在自然界中正常情况下与多肽结合的天然存在物质的环境中取出的纯化多肽。使用本领域已知的技术，包括在宿主细胞中重组克隆和从中纯化，可以从例如哺乳动物或其它细胞类型(例如细菌、酵母、昆虫、植物)中纯化SPEX多肽。多肽可以是化学合成的，其技术在本领域是众所周知的。
多肽融合物
一个实施方案提供了包含与第二个多肽有效连接的至少第一个SPEX氨基酸序列的多肽，其中在自然界中没有发现第一个和第二个多肽的连接(本文称作“SPEX多肽融合物”)。本文公开了对可用于制造SPEX融合的SPEX氨基酸序列(例如在表1和表2中公开的多肽，本文公开的SPEX变体和本文公开的SPEX突变体)。术语“SPEX融合物”和“SPEX融合序列”一般指SPEX融合多肽和SPEX融合多核苷酸。本发明的SPEX融合多肽是分离的，并且优选是纯化的。通常，包含SPEX融合物的多肽组分可以以任何所需的次序连接。SPEX融合多肽可用于例如促进(增强或增加)SPEX目的多肽的溶解性、纯化、表达、检测、选择和抗原性。
一个实施方案提供了包含有效连接到异源多肽的第一个SPEX多肽的多肽，其中异源多肽与第一个SPEX多肽不同，并且在自然界正常情况下没有发现异源多肽和第一个SPEX多肽的有效连接。例如“异源多肽”包括SPEX和非SPEX序列和来源于相同或不同物种的序列。
在一些实施方案中，有效地连接是可裂解的。例如SPEX融合多肽可以包括用于分离SPEX多肽和异源多肽的肽酶裂解位点。可裂解的肽序列在本领域是众所周知的并且可按照本发明公开内容通过有效连接(例如通过克隆或目的氨基酸序列的从头合成)掺入到SPEX融合多肽中。用于此种裂解的酶包括tyrpsin、肠激酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、因子Xa、弗林蛋白酶等。
SPEX融合多肽的优选的有效连接包括将融合的每一多肽与一个或多个其它多肽进行连接的肽键(酰胺键)。优选地，通过单一多肽键将融合的每个多肽与融合的另一个多肽连接。
产生融合多肽的优选的方法是使用遗传工程技术产生连续的多肽(即表达经过改造而将各个多肽编码区组合在一起的多核苷酸，各多肽通过肽键或氨基酸连接序列连接)。SPEX融合多肽还可以通过从头化学合成(例如固相多肽合成)来制造。任选地，融合的多肽可以通过氨基酸间隔序列有效连接。间隔序列可用于例如分割开融合多肽中的功能结构域(例如避免立体阻碍)。此种间隔序列在本领域是已知的并且一般包括多重甘氨酸、丙氨酸和/或脯氨酸残基。
另外，化学交联接头也可用于有效连接多肽。多肽的化学交联在本领域是已知的并且可以用于产生本发明SPEX融合多肽。在化学交联试剂中通常的反应或功能基团包括iuccinimidyl酯、马来酰亚胺和碘乙酰胺(用于化学交联的试剂盒是商业可得的，例如从Molecular Probes、Eugene、OR获得)。通常的多肽反应基团包括氨基、羧基、巯基、芳基、羟基和糖类。一些特异的化学交联试剂包括：DSP(二硫代(双琥珀酰亚胺基丙酸酯))、DTSSP 3，3’-二硫代(双磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)、DSS(二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、BS3(二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯)、DST(二琥珀酰亚胺酒石酸酯)、磺基-DST(二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯)、EDC(1-乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐)、DTME：二硫代双马来酰亚胺乙烷、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-2-二硫代吡啶丙酸酯)。
其它有用的化学交联剂包括异双功能交联剂，其中所述的异双功能交联剂包含两个或多个不同反应基团的并且一般允许与连续缀合特异的蛋白质基团，从而降低了不需要的聚合或自缀合。能与初级或次级胺起反应的异双功能交联剂包括亚氨酸酯和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，例如琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯(SMCC)和琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)。能与巯基反应的交联剂包括马来酰亚胺、卤代乙酰(haloacetyl)和吡啶基二硫化物。碳二亚胺交联剂将羧基偶联到初级胺或酰肼上，导致形成酰胺键或腙键。一种广泛使用的碳二亚胺交联剂是1-乙基-3-(3-二甲胺基丙胺)-碳二亚胺盐酸(EDAC)，它通常用于偶联羧酸和胺并且是零长度交联剂。这些交联剂可以从例如Pierce化学试剂公司(Rockford，Ill.)和Sigma(St.Louis，MO)获得。光反应交联剂也是一般的异双功能交联剂。在UV照射后，这些试剂与亲核物质反应或形成C-H插入产物。用于在多肽之间导入可逆、基本上不可逆和可裂解的化学交联剂的多种方法在本领域也是众所周知的，并且可以根据本发明公开内容，用于产生SPEX融合多肽。
具有非常慢的解离动力学的两个分子之间的非共价相互作用也可以用作有效的连接。例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、NEUTRAVIDIN生物素结合蛋白质和CAPTAVIDIN生物素结合蛋白质可以通过高亲和力(但非共接结合)有效地连接多达4分子生物素酰化的靶分子。
此外，异源序列任选地包含任何想要的生物活性因子，例如抗体、细胞因子(例如白细胞介素、干扰素、NF-κB、IL-2R链(Tac抗原))、肽激素(例如EGF、TGFα、TGFβ)、趋化因子、激酶、磷酸酶、膜易位序列或因子、核易位序列、膜锚着点、毒素(例如蓖麻毒素、白喉毒素的活性部分)、标记物、识别标签等等。
一个实施方案提供了包含有效连接到异源多肽的SPEX多肽的多肽，其中异源多肽基本可溶于水溶液，优选在水溶液中比SPEX多肽更加可溶。在例如协助表达、结合研究和产生抗体中需要将SPEX多肽与更加可溶的异源多肽有效连接。优选的基本可溶的异源多肽包括人IgG1恒定区，更加优选地是人IgG1铰链CH2和CH3结构域。在一个实施方案中促进溶解性的异源多肽包括SEQ ID NO：97。另一个实施方案提供了包含与异源多肽有效连接的、在SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：86中列出的SPEX多肽的多肽，所述异源多肽包括人IgG1恒定区，优选人IgG1铰链区CH2和CH3结构域。A蛋白以高亲和力结合IgG1的恒定区。因此，可以使用A蛋白亲和层析纯化SPEX-人IgG1融合物。
其它考虑的增强溶解性的多肽的实例包括硫氧还蛋白(TRX)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、A蛋白、DsbA和大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)或它们的可溶片段。另一个实例包括HAT表位，它是来源于鸡乳酸脱氢酶蛋白质的19个氨基酸序列(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)。不与组氨酸残基相邻的HAT序列比连续的His残基(例如6xHis标签)具有更少的总电荷。结果，HAT多肽融合物与6xHis标签融合物相比表现出增加的溶解性，同时仍然对固定的金属离子具有强亲和力。HAT序列的结合特性允许在天然条件下(例如近似中性pH(pH7))以及变性条件下对蛋白质进行咪唑梯度和pH梯度的纯化。一个备选的实施方案提供了与非肽有机溶解因子有效连接的SPEX多肽，优选所述因子通过共价键与SPEX多肽连接。
所考虑的可检测标记或标记物的实例包括抗体识别部分，例如FLAG表位DYKDDDDK(SEQ ID NO：101)、c-myc表位EQKLISEEDL(SEQ IDNO：102)、可见标记物(例如绿色荧光蛋白、荧光素酶、生物素/抗生物素蛋白)、酶标记物(例如辣根过氧化物酶)、放射性标记(例如125I、14C、3H、33P、35S和32P)和它们的组合(例如放射性和酶标记的抗体)。
所考虑的纯化标签或辅助物包括GST、MBP、TRX、钙调蛋白结合肽(CBP)、6-His标签(或多聚His)、FLAG、c-myc标签、放射性标记、荧光标记物和血凝素(HA)。这些和其它部分提供了分别在固定化谷胱甘肽、麦芽糖、苯胂氧化物、钙调蛋白和金属螯合树脂上方便地纯化相应的SPEX融合物。这类部分通常在商业可得的纯化系统中使用。融合蛋白质还可以改造成在位于SPEX多肽和异源多肽序列之间包含蛋白酶切位点，以致于在纯化后可从异源部分酶切下SPEX多肽。可获得多种商业可得试剂盒以便于产生包含目的插入物的融合多核苷酸、从插入物表达产物和纯化产物。这些试剂盒可提供在目的产物和融合的异源多肽之间置入可裂解接头的载体，以致于可以切割和纯化融合的产物部分(例如CREATOR相容表达系统，Clontech)。按照本发明公开内容，这些试剂盒可以用于产生SPEX融合序列(多核苷酸和多肽)。
多肽的制造
按照本发明公开内容，可使用本领域众所周知的多种用于制备或产生多肽的技术产生本发明的SPEX多肽。例如，从天然来源中(例如淋巴细胞或脾或胸腺组织)纯化。在另一个实例中，SPEX多肽可以通过在宿主细胞中产生来制造，所述宿主细胞包括细菌(例如K12)、真核细胞、酵母、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、中国仓鼠细胞(例如CHO)、鼠和人细胞(例如使用重组SPEX表达系统转移的细胞)。在另一个实例中，使用从头合成的方法产生SPEX多肽。在优选的实施方案中，使用本领域已知的用于蛋白质分离和纯化的方法纯化SPEX多肽，根据本发明，所述方法可用于分离或纯化本发明SPEX多肽。例如，按照本发明，本领域技术人员能够使用本文公开的抗SPEX抗体通过亲和分离来分离或纯化包括其特异片段和结构域在内的SPEX多肽。
在World Intellectual Property Organization(WIPO)Handbook onIndustrial Property Information and Documentation，Standard ST.25：Standard for the Presentation of Nucleotide and Amino Acid SequenceListings in Patent Applications(1998)，包括附录2的表1至6，此后称作“1998年的WIPO标准ST.25”中提供了有用的氨基酸(和核苷酸)的实例，本文引入为参考。
多核苷酸
本发明的一个实施方案提供了多核苷酸(本文称作“SPEX多核苷酸”)，包含编码SPEX多肽的核酸序列或核酸序列的互补序列。核酸序列的互补序列能够与编码的核酸序列杂交。优选SPEX多核苷酸包含纯化多核苷酸。
SPEX可用于例如制造SPEX多肽(例如体外或细胞多肽表达，其中SPEX多肽是优选纯化的)。SPEX多核苷酸也可用于包括将SPEX表达产物施用于细胞的方法中，其中SPEX多核苷酸包含用于表达的元件。编码SPEX多肽的核酸序列的互补序列(“SPEX互补序列”)可用于例如适合检测SPEX表达产物的测定法或诊断试剂盒中。本诊断试剂盒反过来可用于检测淋巴细胞类型或用于细胞纯化或分选方法中。
在一个实施方案中，SPEX多核苷酸包括哺乳动物SPEX多核苷酸，优选鼠SPEX(mSPEX)多核苷酸和更加优选为人SPEX(hSPEX)多核苷酸。一个实施方案提供了包含编码表1或表2列出多肽(或备选地，如上面所公开的SPEX变体多肽)的核酸序列的多核苷酸。
优选地是本发明的多核苷酸包含纯化的多核苷酸，该纯化形式基本上没有污染物质(除了溶质、赋形剂、稳定剂、缓冲液等等)并且取自SPEX天然存在的物质环境中。优选纯化的多核苷酸基本上没有用于聚合酶链式反应(PCR)扩增和/或测序的单链寡核苷酸序列。
表4提供了SPEX结构域与一些优选的多核苷酸之间对应的实例以及由多核苷酸编码的多肽。各序列通过序列标识符列出。
表4
SPEX多核苷酸的一些实施方案
  SPEX序列/结构域  hSPEX  mSPEX
核酸SEQID NO   氨基酸SEQ IDNO 核酸SEQID NO   氨基酸SEQ IDNO
  信号序列  22   1  64/91   43/87
  Ig样结构域  24   3  66/92   45/88
  跨膜区  26   5  68   47
  基于酪氨酸的结构域  28   7  70   7
  基于酪氨酸的结构域  30   9  72   9
  基于酪氨酸的结构域  32   11  74   11
  细胞外结构域(加工的)  33   12  75/90   54/86
  细胞外结构域(未加工的)  34   13  76/89   55/85
  细胞外(加工的)和跨膜结构域  35   14  77   56
  细胞外(未加工的)和跨膜结构域 36 15 78 57
  基于酪氨酸的区域  37   16  79   58
  细胞内结构域  38   17  80   59
  跨膜和细胞内结构域  39   18  81   60
  通过COOH的Ig-样结构域  40   19  82   61
  SPEX(无信号序列)  41   20  83   62
  SPEX(包括信号序列)  42   21  84   63
在上面表4中具有一个以上序列标识符(例如对于鼠SPEX Ig样结构域所列出的“45/88”)是指在特定的生物中鉴定的不同的特异等位基因。
如本文所定义，包括在正常情况下与SPEX基因相联的邻近基因组5’和3’区域的SPEX多核苷酸的最大长度在自然界中是40,000碱基对(不算载体序列，见下)。为了处于本发明的边界范围内，SPEX多核苷酸序列的基因组克隆必需不超过40,000碱基对(对于单链核酸的碱基)。优选具有40,000碱基对或更少的基因组克隆从正常情况下在自然界中发现与SPEX基因相关的其它邻近基因组序列中分离出来。如本文进一步的定义，SPEX多核苷酸的最小长度是18个残基(例如基本上由编码SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：96列出多肽的核酸所组成的多核苷酸)。
在优选的实施方案中，SPEX多核苷酸以优选的长度范围为特征。例如，本发明技术人员注意到对于使用多核苷酸的每个应用或系统有一个一般长度或长度范围使得在应用中有效使用多核苷酸。因此，根据本发明本领域技术人员能够选择在所选应用中最适宜的核酸长度。下面的表5提供了使用SPEX多核苷酸的实施方案的实例和对于所选应用或系统优选长度的SPEX多核苷酸。
表5
SPEX多核苷酸的代表性长度范围
使用的应用或系统：   SPEX多核苷酸优选范围：(适当的核苷酸或碱基对)
SPEX多核苷酸(不算载体序列)   18-40,000(最小至最大)更优选99-15,000更优选150-7,000最优选600-2,000
用于质粒载体的SPEX插入物   优选24-15,000更优选150-5,000最优选630-1,500
  用于病毒载体的SPEX插入物   优选24-25,000
 更优选180-10,000最优选810-1,800
 在酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或粘粒中的SPEX多核苷酸插入物  优选500-40,000更优选10,000-35,000还更优选20,000-30,000
关于上面的表5，长度范围在指单链多核苷酸时是核苷酸而在指双链核苷酸时是碱基对。在表5中公开的优选的SPEX多核苷酸长度范围是相对于每个组成或应用而提高效率的建议，但并非是绝对的。通常，给定载体系统的转化效率随着在载体中所使用的插入物大小的增加而降低。
一个实施方案提供了在本文称做“SPEX融合多核苷酸”的多核苷酸，该多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含有效连接到另一多肽的至少第一个SPEX氨基酸序列，其中在自然界中没有发现第一和第二多肽的连接。例如，包含编码SPEX融合多肽的核酸序列的多核苷酸。本实施方案对于大量产生SPEX融合多肽特别有用。
一些优选的SPEX融合多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：97所列多肽有效连接的一个或多个SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQID NO：85或SEQ ID NO：86所列氨基酸序列的核酸序列。本融合多核苷酸可用于产生SPEX多肽的细胞外结构域，其中融合物在水溶液中基本上是可溶的，优选比单独的SPEX多肽更可溶。
用于多核苷酸序列裂解、杂交和连接的组合物和方法在本领域是众所周知的，其中组合物和方法可用于产生本发明的SPEX融合多核苷酸是有用的。需要的话，SPEX融合多核苷酸可以包括用于分离SPEX融合多核苷酸片段的限制性位点。
间插序列
在一个实施方案中，多核苷酸进一步包含有效连接到SPEX核酸序列的间插序列(例如内含子)。为了例如提高转录和增加mRNA表达产物的稳定性(特别是在哺乳动物表达系统中)可能需要与SPEX多核苷酸有效连接的内含子。一般地，内含子有效连接到SPEX核酸序列的第一和第二片段之间。因此，本发明的一个实施方案提供了包含SPEX多核苷酸和内含子序列的多核苷酸，其中内含子有效连接到核酸序列的核酸上游。优选的内含子序列选自一个或多个SPEX基因组内含子序列。任选地，内含子序列选自一个或多个异源内含子序列或SPEX内含子和异源内含子的组合。
有用的内含子的实例包括SV40小t抗原内含子和来源于CMV IE基因的内含子A。这些内含子序列可以分别从Promega(Madison，WI)和Invivogen(San Diego，CA)商业获得。优选在编码序列和内含子序列的连接处(即剪接连接处)包含在加工(例如在剪接反应，如从hnRNA到mRNA的加工)中用于除去内含子序列的适宜剪接位点。在一些实施方案中，SPEX多核苷酸包括含有适宜剪接连接处的任何内含子。
简并性遗传密码变体
本领域技术人员知道遗传密码的简并性并且因此能够使用简并密码子制造出编码本发明同一SPEX多肽的多种核酸序列。关于标准遗传密码和其使用的表格以及普通氨基酸的符号和其缩写或代码见Biochemistry，第3版，Stryer编，Freeman Publisher(1988)，91-115页和内封底，本文引入为参考。按照本发明，根据欲表达的所需SPEX多肽序列和标准遗传密码的知识，可以制造出适宜的SPEX多核苷酸。
序列修饰技术
对SPEX序列的修饰可以在例如多聚物的化学合成(包括多核苷酸和多肽合成)或通过多核苷酸的诱变(多样化)和任选地编码的多肽变体的表达中产生。改变多核苷酸序列的优选的方法是通过定点诱变。化学合成、诱变、定点诱变和多核苷酸的表达的方法在本领域是众所周知的。用于证实所需多核苷酸和多肽序列的产生的方法在本领域也是已知的。按照本发明公开内容和本领域的知识，这些方法可以应用于制造和证实SPEX序列变体。
载体
在一些实施方案中，需要SPEX多核苷酸进一步包含载体序列。因此，本发明提供了包含有效连接到编码SPEX多肽的核酸序列或其互补序列的载体序列的纯化多核苷酸。编码SPEX多肽的核酸或其互补序列在本文称作“SPEX插入物”。如本文所使用，“SPEX载体”包括与“SPEX插入物”有效连接的“载体序列”。SPEX载体序列可用于例如表达SPEX mRNA、SPEX多肽或SPEX杂交序列(例如“反义”核酸)。需要的话，可以用可检测标记标记SPEX表达产物。例如，可检测标记可以在合成中掺入。SPEX载体可用于作为方便的克隆工具(例如穿梭载体)或者用于产生商业量的SPEX核酸。适宜的SPEX插入物包括本文表格和章节中列出的SPEX多核苷酸、它们的互补序列或本文公开的编码的SPEX多肽(例如在上面表1和表2公开的SPEX多肽)。
SPEX载体的优选用途是给予细胞SPEX表达产物。例如，可通过将SPEX载体导入细胞向细胞给予SPEX多肽，其中细胞使用细胞机器合成了SPEX表达产物。SPEX多肽的表达可用于例如调节淋巴细胞的代谢、免疫应答和/或SPEX信号转导。
如本文所使用，SPEX插入物除了包括编码区以外，还可以包括非翻译区、克隆序列、间插序列、剪接序列或其它序列(受上文公开内容所限制)。优选SPEX载体是纯化的。SPEX载体包括环状或线性核酸。
SPEX载体序列优选地包括用于调节表达、复制或载体和/或SPEX插入物的其它活性的一个或多个控制元件。控制元件包括一个或多个：亲和力标签、分支点、细胞定位信号、增强子、诱导子、内部核糖体进入位点(IRES)、内含子、Kozak序列、聚腺苷酸化位点(poly A位点)、启动子、纯化标签、阻抑物、选择标记、信号序列、沉默基因、剪接受体、剪接供体、起始密码子(起动密码子、翻译起始位点，ATG)、终止密码子、TATA盒、终止子和转录起始位点(例如Shine-Dalgarno序列)。控制元件可能包含于载体序列和/或SPEX插入物中(任选地一个或多个控制元件可以位于另一个分开的载体上并且以顺式起作用)。多种载体系统可以从商业来源、学术来源和其他来源获得，并且可以使用本领域众所周知的技术根据本发明公开内容方便地与SPEX插入物有效连接。
在一些优选的实施方案中，SPEX载体能够被表达。SPEX产物从SPEX多核苷酸(优选SPEX载体)的表达包括：RNA从DNA的转录、多肽从RNA的翻译或者转录和翻译两者。在一个实施方案中，表达包括转录编码SPEX多肽的SPEX核酸序列形成SPEX mRNA。优选编码SPEX多肽的核酸序列如含于载体中一样处于“读码框中”。大多数表达载体是可得的或者容易改造来将插入物整合入合成目的多肽的正确阅读框中。简并密码子的表提供了在氨基酸残基和核苷酸密码子之间的优选的对应，核酸密码子在多肽合成中确定每个氨基酸残基并且可用于用测序分析预测或证实SPEX插入物处于所需阅读框中。
启动子和增强子
优选地是SPEX载体包含用于增强SPEX插入物表达的启动子和/或增强子。通常，启动子和增强子是调节来自模板核苷酸的转录物表达的控制元件。增强子和启动子之间的基本区别是操作性的并且不是绝对的。一般来讲，启动子元件位于RNA聚合酶II(或其它聚合酶)起始位点周围并且决定转录方向。启动子元件通常包括核酸的7-20个碱基并且包含一个或多个转录激活子和/或阻抑物的识别位点。一般地，每个启动子中的构件的功能是定位RNA合成的起始位点。这类构件的众所周知的实例是TATA盒。通常，增强子元件能够在距离转录起始位点一定距离处调节(一般是刺激)转录。增强子可以位于与转录起始位点的同一核酸上(顺式)或者在另一个核酸上(反式)。在包括启动子的实施方案中，应当理解术语“有效连接”指启动子在处于与插入物有关的位置和/或方向，以控制RNA聚合酶的起始和转录物的表达。
启动子和/或增强子元件能够调节转录起始的频率。一般地，它们位于转录起始点上游30-110bp的区域，虽然已知多种启动子还包含起始位点下游(例如在所转录的核酸内)的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，以至于当元件相对于另一个元件是倒转的或者去除后还保留着启动子功能。例如，在tk启动子中(来源于单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因)，启动子元件之间的间距在活性开始降低之前可以增加至达50bp。另一个实例包括lac操纵子。取决于启动子，似乎单个元件能够协作地或独立地起作用以激活转录。
在一些实施方案中，不认为用来控制SPEX插入物表达的特定启动子是关键的，只要对于在意图的实施方案中它能够在靶环境中以所需或足够的水平(例如以可检测水平或相对于天然产生的SPEX的过表达水平)表达多核苷酸即可。因此，例如对于在人细胞内的表达，优选多核苷酸编码区临近或处于能够在人细胞中表达的启动子的控制之下。一般来讲，此种启动子可以包括人或病毒的启动子。有用的病毒启动子包括来源于HSVtk、SV40早期转录单位、巨细胞病毒(CMV)、小鼠乳腺瘤病毒长末端重复(MMTV-LTR)、鼠肉瘤病毒(MSV-LTR)和劳斯肉瘤病毒(RSV-LTR)的启动子。来源于人或其它哺乳动物基因的有用的启动子包括来源于β-肌动蛋白和延伸因子1-α(EF-1α)的启动子。可获得具有适合在多种环境中表达或调节表达的启动子和增强子元件的多种载体。一些优选的环境包括人细胞，优选淋巴细胞，并且更优选T细胞或B细胞。
通过采用具有众所周知特性的启动子，可优化SPEX多核苷酸的表达水平和方式。例如，选择在特定细胞具有显著更高活性的启动子(例如酪氨酸激酶(黑素瘤)、α-甲胎蛋白和白蛋白(肝肿瘤)、CC10(肺肿瘤)和前列腺特异抗原(前列腺肿瘤)启动子)允许SPEX多核苷酸的组织特异表达。因此，在优选的实施方案中，选择启动子和/或载体用来在特定目的环境中驱动优化的转录。
非细胞表达环境
非细胞表达环境，常常已知为“体外表达(系统)”，一般包含用于转录和/或翻译反应容器中含有的模板多核苷酸的细胞裂解物或因子。优选地，体外表达系统至少经过部分提炼以除去抑制剂和/或提高试剂浓度，并且更优选其基本上是纯化的。体外表达系统是商业可得的(例如SP6转录试剂盒，T7转录试剂盒，SINGLE TUBE PROTEIN SYSTEM 3和REDNOVA LYSATE KIT，每一个均来自Novagen，Madison，WI，并且RAPIDTRANSLATION SYSTEM(RTS)可从Roche，Indianapolis，IN获得)。当在细胞表达环境中SPEX目的表达产物对宿主细胞有毒性时，优选非细胞表达系统。一个实施方案提供了适合用于体外表达系统的SPEX表达载体。
SPEX宿主细胞
有用的细胞表达环境包括原核和真核宿主细胞。术语“宿主细胞”是指包含SPEX多肽(优选SPEX载体)的细胞，其中通过人为操作将SPEX多核苷酸导入细胞以形成SPEX宿主细胞(例如为了表达的目的将重组的非天然存在的SPEX多核苷酸转移入细胞)。因此，一个实施方案提供了包含SPEX载体的宿主细胞。本“宿主细胞”在本文称作“SPEX宿主细胞”。优选地，SPEX载体包括SPEX表达载体并且优选能够产生SPEX表达产物。
在优选的实施方案中，在缺乏适于表达的转化的SPEX多核苷酸时(例如重组SPEX表达载体)，SPEX宿主细胞没有SPEX表达。如本文所使用，没有通过人工导入SPEX多核苷酸而表达SPEX的细胞具有“天然SPEX表达”。从通过人工转化进入细胞的SPEX多核苷酸进行SPEX的表达在本文称作“外源SPEX表达”或“重组SPEX表达”。外源SPEX表达意味包括从经人工指导的过程整合进入宿主细胞基因组中的SPEX多核苷酸表达SPEX。在任选的实施方案中，SPEX宿主细胞可以具有天然的SPEX表达；然而，优选外源SPEX多核苷酸的表达产物比天然SPEX产物具有更大的丰度(即优选地是重组SPEX多核苷酸是过表达的)。
一些实施方案提供了包含与SPEX插入物有效连接的载体序列的多核苷酸，其中载体序列包含一个或多个用于在宿主细胞的控制元件表达SPEX插入物，优选细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞中的一种或多种。可以从学术来源、商业来源或其它来源获得可用于表达本发明SPEX插入物的多种载体和宿主细胞。有用宿主细胞的一些额外的实例包括：大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)和大肠杆菌K12株(细菌细胞)；酿酒酵母(Schizosaccharomyces cerevisiae)(S.cerevisiae)、栗酒裂殖酵母(S.pombe)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(P.pastoris)酵母细胞；草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)9(Sf9)、Sf21、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(通常称作High Five细胞)和S2(果蝇)昆虫细胞和哺乳动物细胞，包括HEK-293(人肾脏)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、Bowes黑素瘤细胞(人黑素瘤)、HeLa(卵巢癌)、CHU2(人口腔肿瘤)和HBEC-90(人脑内皮)、33.1.1(小鼠前B细胞)、K46(小鼠B淋巴瘤)、TR2(小鼠oligodendritic)。一些优选的哺乳动物细胞包括：淋巴细胞、T细胞、B细胞、幼T细胞、幼B细胞、分化T细胞、分化B细胞和天然杀伤细胞。这些细胞和其它细胞可以从例如Invitrogen、Novagen、CLONTECH和美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)获得。
在一些实施方案中，需要在多于一种的宿主细胞中表达SPEX插入物。因此，在一些实施方案中优选使用具有适宜在多种宿主细胞类型中表达SPEX插入物的控制元件的载体系统。例如TRIEX多系统表达载体(TRIEX MULTISYSTEM EXPRESSION VECTORS)(CALBIOCHEM，La Jolla，CA)包括优化了的用于在大肠杆菌、杆状病毒和哺乳动物细胞类型表达的转录和翻译信号。
在细菌中表达
用于克隆SPEX插入物的有用的细菌细胞克隆载体包括pUC8、pUC9、pBR322、pBR329、pBC-SK、pBC-KS、LAMBDA ZAP II(可以从学术来源、Promega(Madison，WI)或Stratagene(La Jolla，CA)获得)。优选宿主细胞包含能够在给定的细胞环境中起作用的复制起点。例如细菌载体可包含大肠杆菌复制起点(ori)。
pET载体系列(Novagen(Madison，WI)、Promega、Stratagene)包含T7启动子并且T7基因10翻译起始信号，用于驱动SPEX插入物在包含T7因子的细菌细胞中高水平表达。pET载体系统可以通过转染进入缺乏T7RNA聚合酶的细菌细胞中(例如BL21(DE3))而成为可诱导的。通过转染表达所丢失的T7聚合酶的载体或者剪除对天然T7表达的阻抑来诱导表达。
pL表达系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)还提供了细菌表达系统的严紧诱导转录控制。pL载体包含强pL启动子并能够驱动SPEX插入物的表达。pL启动子被大肠杆菌宿主表达的λcI阻遏物蛋白控制。cI阻遏物基因被改造进入细菌染色体中，处于严紧调节的trp启动子控制之下。可以通过加入色氨酸诱导SPEX多核苷酸的表达。
pBAD载体(Invitrogen)可以用于araBAD启动子驱动的有效连接的SPEX插入物的诱导表达，所述启动子可通过向培养基中分别加入阿拉伯糖或葡萄糖来调节，以刺激或抑制SPEX插入物的转录。包含在细菌系统中驱动表达的一个或多个控制元件的额外的载体包括：Trc/Tac启动子载体(CLONTECH，Palo Alto，CA)、λPR启动子载体(Pharmacia，Peapack，NJ)和基于噬菌体T5启动子的载体(QIAGEN，Valencia，CA)。实施方案提供了有效连接到每个载体或任一载体的SPEX插入物，载体通常包含用于在细菌细胞中表达SPEX插入物产物的一个或多个控制元件。
在酵母中表达
一些实施方案提供了包含与SPEX插入物有效连接的载体序列的多核苷酸，其中载体序列包含用于在酵母细胞中表达的一个或多个控制元件。优选能够在酵母中表达的SPEX表达载体包含酵母复制起点(例如ColE1)。
pESC载体(Stratagene)包含用于在酵母细胞(优选酿酒酵母)中表达的GAL1和GAL10控制元件。pESC载体装置包括使用选择特征表达一种或多种不同的表达产物，所述特征包括：FLAG表位、c-myc表位(标签)和HIS3、TRP1、LEU2或URA3选择标记。
pYES载体装置(Invitrogen)包含GAL1启动子并且可用于在酵母细胞(优选酿酒酵母)中表达SPEX插入物。ESP酵母蛋白质表达和纯化系统(Invitrogen)包含栗酒裂殖酵母nmt1启动子并且可用于在酵母细胞(优选栗酒裂殖酵母)中表达SPEX插入物。ESP载体装置包括使用可选择特征表达一种或多种不同的表达产物，所述特征包括：FLAG表位、c-myc表位(标签)和HIS3、TRP1、LEU2或URA3选择标记。一些ESP载体还包含通过GST亲和层析方便地纯化酵母表达的SPEX-GST融合多肽的谷胱甘肽S转移酶(GST)肽标签。SpECTRA栗酒裂殖酵母表达系统(Invitrogen)包含用于构建能够在酵母中表达的SPEX载体的额外载体。巴斯德毕赤酵母表达系统(Invitrogen)包含用于构建能够在酵母(优选巴斯德毕赤酵母)和细菌(优选大肠杆菌)中表达的SPEX表达载体的载体。
在昆虫细胞中表达
一些实施方案提供了包含与SPEX插入物有效连接的载体序列的多核苷酸，其中载体序列包含用于在昆虫细胞中表达SPEX插入物的一个或多个控制元件。
DES(果蝇表达系统，Invitrogen)被优化用于在果蝇细胞(优选S2细胞)表达SPEX插入物。DES载体pAc5.1/V5-His和pMT/V5-His提供分别由Ac5.1或V5启动子启动的表达，并且包含用于检测和/或纯化的His标签。pMT/BiP/V5-His载体还提供用于所分泌表达多肽的BiP果蝇分泌信号序列。
INSECTSELECT系统(Invitrogen)可用于在广泛的昆虫细胞系表达SPEX插入物，优选用于表达分泌蛋白质，所述细胞系包括Sf9、Sf21、HIGHFIVE和S2。
在哺乳动物细胞中表达
一些实施方案提供了包含与SPEX插入物有效连接的载体序列的多核苷酸，其中载体序列包含用于在哺乳动物细胞(优选人细胞)中表达SPEX插入物的一个或多个控制元件。
腺病毒和逆转录病毒可用于在哺乳动物中表达SPEX插入物。ViraPower腺病毒表达系统包括例如E1和E3缺失的、基于pAd-DEST腺病毒的载体，该载体具有人CMV表达启动子，或者为了方便插入所选启动子而不具有启动子。腺病毒颗粒的包装描述于制造商的文献(Invitrogen)。在另一个实例中，ViraPower慢病毒表达系统被优化用于稳定转导分裂和非分裂细胞(Invitrogen)。
pShooter载体(Invitrogen)包含EF-1α或CMV启动子并且可以进一步包含能够表达SPEX多肽并将所表达SPEX多肽指向特异细胞区室的信号序列。例如，pEF/myc/cyto载体包EF-1α启动子和c-myc标签。信号序列不包含于用于获得胞质表达的本载体中。pEF/myc/nuc载体包含EF-1α启动子、c-myc标签和能够指导所表达的SPEX多肽到哺乳动物细胞核的核定位序列(来源于SV40)。pEF/myc/mito载体包含EF-1α启动子、c-myc标签和能够指导所表达的SPEX多肽到哺乳动物细胞核的线粒体定位序列(来源于COX VIII cDNA)。另一组pShooter载体包含替代EF-1α启动子的CMV启动子。pShooter载体能够驱动广范的哺乳动物类型中表达，包括大部分人细胞和组织。
pSG5载体(Stratagene)能够驱动SPEX插入物在广范的细胞类型中表达，包括哺乳动物(包括人)和细菌细胞类型。哺乳动物的表达是通过SV40早期启动子驱动，细菌的表达是通过T7启动子驱动。pSG5载体优选进一步包含ori、氨苄青霉素抗性基因和噬菌体f1起点(例如允许用于诱变和测序的ssDNA的拯救)。
pIRES-hrGFP-1载体(Stratagene)能够使用CMV启动子表达SPEX插入物和标记基因(在该实例中为人源化的绿色荧光蛋白(hrGFP))。载体包含提供从一条表达的mRNA中表达SPEX插入物和标记基因两者的内部核糖体进入位点(IRES)。因此，作为融合mRNA表达了SPEX和标记基因并且作为分开的多肽被表达。如果需要的话，其它SPEX表达载体可以进一部包含IRES。
在一些实施方案中，SPEX载体构建体还包含编码另一个表达产物的片段。例如，载体包含选择标记、检测标记和/或纯化标记。实例包括编码amp、neo、hygro、zeo、puro、mycophenolic、kan、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型蓝色荧光蛋白(ECFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、DsRed2、HcRed1、myc标签、FLAG标签和GST标签的片段。在一些实施方案中，选择其提供的标记处于与SPEX插入物形成有效连接融合物的载体。一些载体还提供内部核糖体进入位点(IRES)。见例如Palmenberg等的美国专利号4,937,190，本文引用作为参考。在一个实施方案中，IRES利于两个蛋白质(至少一个包含SPEX多肽)在使用单一转录载体(STV)的在动物细胞中表达。
SPEX的细胞内表达一般涉及将SPEX表达构建体导入所选择的细胞，在细胞中细胞因子驱动表达。用于将表达载体导入细胞的方法是本领域已知的(例如磷酸钙沉淀、基于脂质体的转染、基于肽的膜易位、电穿孔等等)。见Lane的美国专利6,312,956和Felgner等的美国专利6,165,720，它们在本文全文引入为参考。
下面的表7提供了SPEX载体的优选的实施方案，并且表6提供了这些SPEX载体构建体的优选特征和用途。
表6
优选的SPEX表达载体
  SPEX载体名称   大小(kb)   SPEX插入物   载体主链描述
主链名称 主链来源   RE位点插入物/主链
PSPEX-YFP 5.7   957bp SPEX基因(SEQ ID NO：106) PEYEP-N1 CLONTECH Bgl II/Bam H1
  SPEXYFP-BABEPURO 6.8   1.7bp pSPEX-YFP片段(SEQ ID NO：107) pBABEpuro   Nucleic AcidsRes.(1990)18：3587-3596 Not1 fill Bgl II/SnaBI、BamHI
pSPEX-Bgl II 5.4   1276bp SPEX基因(SEQ ID NO：109) pCR 2.1 topO Invitrogen Bgl II/Bam H1
  pSPEX-BglII-BABEpuro 6.4   1276bp SPEX基因(SEQ ID NO：109) pBABEpuro Invitrogen Bgl II/Bam H1
pSPEXCAL 6.7   957bp SPEX基因(SEQ ID NO：106) pCAL-C Stratagene Bgl II/Bam H1
pSPEXCAL2 6.4   486bp SPEX细胞外结构域(SEQ ID NO：110) pCAL-C Stratagene Bam H1/BamH1
pSPEXCAL3 6.2   464bp SPEX片段(SEQ ID NO：111) pCAL-C Stratagene   Not I、Bgl II/Hind III
pSPEXdeltaN 4.5   609bp SPEX gene(细胞内结构域)(SEQ ID NO：108) pCR 2.1 topO Invitrogen BamHI、EcoRI/BamHI、EcoRI
  pSPEXIgtopO 4.45   538bp SPEX细胞外结构域(SEQ ID NO：112) pCR 2.1 topO Invitrogen Bgl II/Bam H1
p1017SPEX 9.3   1276bp SPEX基因(SEQ ID NO：109) p1017   Int.Immunol.(1990)2：173-180 Bgl II/Bam H1
  SPEXYFP-MIGR1 NOT 6.5   1722bp SPEX SEQ(SEQ ID NO：107)   pMIGR1-NOTLinker   Blood(1998)92：3780   Not I、Bgl II/Hind III
pSPEX-Ig 8   538bp SPEX细胞外结构域(SEQ ID NO：112) pL-Selectin-Fc Kpn I/Bam HI
  pSPEXIg.BtopO 4.5   537bp mSPEXb细胞外结构域(SEQ IDNO：113) pCR 2.1 topO Invitrogen Bgl II/Bam H1
上面表6中的每一个载体使用本领域技术人员已知的标准克隆方法产生。“主链名称”指“载体序列”。
表7
一些SPEX载体的优选用途
  SPEX载体名称   优选用途
PSPEX-YFP   SPEX-YFP融合蛋白的表达。YFP是黄色荧光蛋白检测标记
  SPEXYFP-BABEPURO   用于SPEX表达的逆转录载体
  pSPEX-Bgl II   SPEX多核苷酸的克隆
  pSPEX-BglII-BABEpuro   用于SPEX表达的逆转录载体
  pSPEXCAL   SPEX多肽的细菌表达
  pSPEXCAL2   SPEX多肽的细菌表达
  pSPEXCAL3   SPEX多肽的细菌表达
  pSPEXdeltaN   编码SPEX细胞内结构域的载体
pSPEXIgtopO   SPEX细胞外结构域-IgG1嵌合体的克隆和表达
p1017SPEX   利用Lck(胸腺特异的启动子)在胸腺细胞中表达SPEX多肽
  SPEXYFP-MIGR1NOT   用于SPEX表达的逆转录载体在淋巴细胞中表达SPEX。
pSPEX-Ig   SPEX细胞外结构域-IgG1融合物的表达，提供具有增强溶解性的SPEX细胞外结构域。
pSPEXIg.B topO   SPEX细胞外结构域的克隆以使与IgG1在框内融合。
抗体
本发明的一个实施方案提供了与SPEX多肽起免疫反应的抗体。术语“抗体”意思是包括任何形式的抗体，它包括完整的抗体分子和/或抗体分子的免疫活性部分。抗体或其活性片段是本领域众所周知的，例如IgG、IgM、IgE、多克隆、单克隆、Fab、Fab’、F(ab’)2、F(v)、单链抗体(SCA)、单链Fab、人源化、杂合抗体等等。本发明提供的抗体与SPEX多肽的一个或多个部分起免疫反应。优选抗体是分离的。还更优选的抗体包括重组、嵌合或其它非天然存在的抗体。
抗SPEX抗体可用于例如调节SPEX信号转导活性、淋巴细胞激活或代谢和免疫应答。抗SPEX抗体还可以用于诊断和试剂盒中的检测试剂，所述试剂盒可用于检测、纯化和/或分选SPEX表达淋巴细胞群。
优选的抗体是抗SPEX单克隆抗体，优选人或人源化抗SPEX单克隆抗体。其它优选的抗SPEX抗体特异地与hSPEX多肽、mSPEX多肽或mSPEXb多肽(上文公开的鼠SPEX的等位基因)之一起免疫反应。预期与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：11起免疫反应的抗SPEX抗体能够与包含SPEX基于酪氨酸结构域的所有鼠和人SPEX多肽起免疫反应(备选地，与具有基于酪氨酸结构域或细胞内结构域的哺乳动物SPEX多肽起免疫反应)。其它代表性抗SPEX抗体能够与表1和表2、表3和表4中列出的SPEX多肽起免疫反应。在一些实施方案中，抗SPEX抗体与一个SPEX多肽起免疫反应，但不与另一个SPEX多肽起免疫反应。例如，抗SPEX抗体与表1中第1列和/或第2列中列出的SPEX多肽起免疫反应，但是不与表1中第3列中列出的SPEX多肽起免疫反应。在另一个实例中，抗SPEX抗体与表2第1列中列出的SPEX多肽起免疫反应，但不与表2第2列中列出的SPEX多肽起免疫反应。
以下表8提供了一些优选的抗SPEX抗体的抗原免疫反应和通过序列标识符列出的代表性序列。
表8
优选的抗SPEX抗体与下面抗原的免疫反应
SPEX抗原   代表性hSPEX多肽抗原(SEQ ID NO)   代表性mSPEX多肽抗原(SEQ ID NO)   任选地不(SEQ ID NO)起免疫反应
  细胞外结构域   12，13   54，55，85，86   16、17、18、58、59、60
  细胞外/跨膜   14，15   56，57   16、17、58、59
  Ig样结构域   3   45，88   16、17、18、58、59、60
  SPEX   20，21   62，63
  代表性SPEX融合多肽 98 99，100 16、17、18、58、59、60
  细胞内结构域   7，9，11，16，17，18   7，9，11，58，59，60   3、45、12、13、54、55
细胞内/跨膜 18 60   3、45、12、13、54、55、14、15、56、57
一个实施方案提供了能够与SPEX多肽细胞外结构域起免疫反应并且能够调节淋巴细胞增殖或其它代谢的抗体，优选是单克隆抗体。更优选地，抗体包含人源化的单克隆抗体。在一个实施方案中，将能够与SPEX细胞外结构域优选地是Ig样结构域起免疫反应的抗体施用于包含表达的SPEX多肽的淋巴细胞能够抑制淋巴细胞的增殖和/或分化。
任选地抗SPEX抗体可以包括另一个表位的结合结构域，例如不同的SPEX表位或甚至非SPEX表位(例如能够与一个或多个不同表位结合的多价抗体)。
在一个实施方案中，抗SPEX抗体与人SPEX多肽起免疫反应，但基本上不与鼠SPEX多肽起免疫反应。任选地，抗SPEX抗体与鼠SPEX多肽起免疫反应，但基本上不与人SPEX多肽起免疫反应。此种抗体可用于例如区分人和鼠SPEX多肽序列。
产生针对特异抗原的抗体的方法在本领域是已知的。本发明提供了对于生产抗SPEX抗体有用的SPEX抗原(即免疫原)。因此，根据本发明公开内容，本领域普通的技术人员能够生产本发明的抗-SPEX抗体。抗体通常在例如动物(例如兔、小鼠、仓鼠、绵羊、山羊、马、牛)；细胞，原代细胞培养物(例如细菌、植物、藻类、昆虫、哺乳动物、鼠、杂交瘤和人细胞)；通过噬菌体展示；和通过克隆到抗体支架载体中的表位和将基因转移到多种中细胞类型(例如细菌、植物、藻类、昆虫、哺乳动物、鼠和人)中的任一种中生产。因此，本发明还提供了能够产生抗SPEX抗体的细胞。
在一些实施方案中，抗SPEX抗体包含检测标签。可检测标签的实例包括放射性同位素(例如125I)、荧光分子(例如SMCC-活化的BSA-荧光素，Prozyme，San Leandro，CA)、生物素酰化、myc标签、FLAG标签和酶(例如过氧化物酶)。检测标签和标记或者抗体与目的检测标签的缀合在本领域是已知的。一般地，检测标签通过共价键与抗体结合。很多用于标记的检测性抗体的商业产品是可得的。优选的是标记不干扰抗体可变部分的结构和/或功能。在抗体分子或其活性片段的备选区域进行标记是本领域众所周知的。
在一些实施方案中，需要抗SPEX抗体与一个SPEX多肽起免疫反应，但不与另一个SPEX多肽起免疫反应。具有本特性的单克隆和多克隆抗SPEX抗体可以通过例如在生产抗SPEX抗体中使用表位特异SPEX抗原来制备。如果需要的话，可以对抗体群体进行筛选以除去或者取出群体中具有不需要的免疫反应性的的分子(即通过在含有不需要的抗原(undersirable antigen)的基质上进行扣除筛选)。
筛选SPEX结合配偶体的方法
一个实施方案提供了筛选候选分子以鉴定一种或多种SPEX结合配偶体的方法，包括：1)将候选分子与SPEX多肽接触；2)测定候选分子与SPEX多肽是否形成结合复合体，其中结合复合体的形成表明候选分子是SPEX结合配偶体，和3)重复步骤1)和2)直到鉴定出SPEX结合配偶体。优选的候选结合配偶体包括小分子有机化合物和多肽。优选的SPEX多肽结合靶包括SPEX基于酪氨酸的结构域(例如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11)或SPEX Ig样结构域(例如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：88)。
根据本发明和本领域的知识，对于候选分子和SPEX多肽是否形成结合复合物的测定可以通过使用本领域众所周知的多种结合测定法进行，因此本发明不限于具体的测定法。例如，可以通过与单独的SPEX多肽相比用抗SPEX抗体捕获的结合复合物的分子量增加来检测结合复合物。SPEX多肽可以改造成包含亲和标签或检测标记，以至于可通过在凝胶中分子量或迁移的变化或者直接检测复合物中的SPEX多肽来鉴定结合复合物。一些候选分子可具有已知的可检测特性，例如抗体免疫反应位点(表位)、荧光特性或亲和标签(天然的或改造的)，以至可在具有SPEX多肽的结合复合物中直接检测候选分子。
分离SPEX多肽的方法
一个实施方案提供了从含有SPEX多肽的生物样品中纯化SPEX多肽的方法，其中包括将生物样品与具有结合抗SPEX抗体的亲和基质接触，以产生包含SPEX多肽和连接到基质的抗体的免疫复合物；将生物样品的剩余物从基质上分离下来；将SPEX多肽从抗SPEX抗体上分离下来，并收集SPEX多肽，由此得到纯化的SPEX多肽。
调节淋巴细胞活性的方法
一个实施方案提供了调节表达SPEX受体的淋巴细胞代谢(优选是增殖或活化)的方法，包括将淋巴细胞与能够与SPEX多肽细胞外结构域起免疫反应的抗SPEX抗体(优选单克隆抗体)相接触。一些实施方案公开了SPEX受体活性调节，优选抑制表达SPEX受体的淋巴细胞的代谢和更优选抑制表达SPEX受体的淋巴细胞的增殖。在本文的一些实施方案中公开了与SPEX多肽细胞外结构域(优选Ig样结构域)起免疫反应的抗体会抑制SPEX活性，从而释放SPEX诱导的代谢抑制，因此抗体提供了表达SPEX的淋巴细胞代谢的相应增加。有用的抗体包括大鼠抗SPEX抗体PK3、PK18和PK23(或它们的免疫反应片段)。优选的抗体包括与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的人源化抗体或人抗体。优选的淋巴细胞包括B细胞和T细胞。在一些优选的实施方案中，抗体与SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：85列出的氨基酸序列起免疫反应。淋巴细胞可以是体外培养的或体内的。例如通过将抗体或其免疫反应片段施用(例如通过注射)于人或非人动物，使淋巴细胞与抗体在体内接触。
鉴定和克隆mSPEX cDNA
阳性选择是一种发育过程，其中作为胸腺基质表达的MHC/自身肽复合物的T细胞抗原受体(TCR)识别结果，不成熟的胸腺细胞接受成熟信号。体外将不成熟的胸腺细胞暴露于低浓度的药理激活剂佛波酯(例如PMA)和/或离子霉素诱导双阳性(DP)胸腺细胞的存活和分化并且提供了胸腺细胞体内阳性选择的可接受模型系统。
使用核酸微点阵，本发明者鉴定了在胸腺细胞的阳性选择过程中相对于未刺激的胸腺细胞的核酸表达的变化。将TCRα-链缺乏的胸腺细胞(鼠)在存在或缺乏0.2ng/ml PMA和0.2mg/ml离子霉素的培养基中培养，分别提供活化的和非活化的胸腺细胞。TCRα-链缺乏的胸腺细胞由于遗传突变在发育的DP阶段受到阻断。在刺激后，这些细胞基因表达的特征是发育成胸腺细胞。将细胞孵育6小时后，用RNeasy RNA和Oligotex mRNA试剂盒(Qiagen)分离聚腺苷酸化RNA。按照制造商的使用说明(IncyteGenomics)使用Mouse 1.02 Array将聚腺苷酸化RNA进行比较cDNA点阵分析。微点阵的信号分析使用GEMTools分析软件(Incyte Genomics)进行。
基于刺激胸腺细胞与非刺激胸腺细胞的序列表达比率，本发明者选择了两条序列进行进一步研究。从每个标记的cDNA分别与EST AA184189和AA177302标准化杂交信号中测定表达比率，其中EST包含在MouseArray中。对于分别与EST AA184189和EST AA177302杂交的序列，在刺激的胸腺细胞中每个序列的表达增加了9.1倍和6.6倍。在Mouse 1.02Array中这些EST来源于叫做Soares小鼠3NbMS文库的鼠文库，该文库来自4周龄C57BL/6J小鼠的脾脏。
使用BLAST软件(NCBI)将EST的序列与鼠核酸序列数据库(每个EST对应着鼠序列数据库中的一个普通序列)比较，本发明者确定ESTAA184189和AA177302是连锁的。因此EST AA184189和AA177302被确定为更加完整的核酸的一部分。使用最靠近5’端的EST(AA177302)，本发明者通过cDNA末端快速扩增(SMART RACE cDNA扩增试剂盒，Clontech)使用从刺激的胸腺细胞制备的cDNA作为反应的模板克隆了全长基因。
此基因在本文命名为小鼠脾脏表达基因(mSPEX基因)。代表性的mSPEX核酸列于SEQ ID NO：105并且包括SEQ ID NO：84列出的编码区。对GenBank的BLAST检索揭示SPEX cDNA编码新的蛋白质。mSPEX核酸编码的代表性mSPEX多肽列于SEQ ID NO：63。在细胞加工过程中一般将信号序列(例如SEQ ID NO：43)切掉以形成SEQ ID NO：62列出的代表性的成熟mSPEX多肽。使用mSPEX多肽与蛋白质数据库(NCBI)的Pfam家族的序列比较，本发明者在预测的多肽细胞外部分鉴定出免疫球蛋白样结构域；然而，本发明者观察到SPEX不与具体的含免疫球蛋白超家族成员具有紧密同源性。
鉴定和克隆hSPEX cDNA
使用mSPEX序列与GenBank数据库中的人序列进行序列比较，本发明者确定人EST AI792952和AA931122与mSPEX多核苷酸匹配并且人EST对应于GenBank数据库中的单一人类克隆。包含人克隆以及大量污染克隆(AI792952)的细菌穿刺购自IMAGE Consortium(LawrenceLivermore National Laboratory，Livermore，CA)。从穿刺中纯化与mSPEX同源的人基因序列、并亚克隆和测序。代表性的hSPEX核酸序列列于SEQID NO：104并且包括SEQ ID NO：42列出的编码区。代表性的hSPEX多肽由SEQ ID NO：21中列出的hSPEX核酸序列编码。信号序列(例如SEQID NO：1)一般在hSPEX蛋白质的细胞内加工过程中被切掉以形成SEQID NO：20中列出的代表性的成熟hSPEX多肽。
抗mSPEX单克隆抗体
制备了包含融合蛋白质编码区的分离的表达载体构建体(本文称作p-mSPEX-Ig)，所述融合蛋白质具有mSPEX细胞外结构域(包含SPEX信号序列)和人IgG1铰链区CH2和CH3结构域。将p-mSPEX-Ig载体转染进培养物中的293细胞中。如通过使用抗人IgG1抗体为探针的Western印迹所评估的，p-mSPEX-Ig转染的293细胞表达和分泌mSPEX-Ig融合蛋白质。通过A蛋白亲和层析从转染的293细胞的上清液中纯化mSPEX-Ig融合蛋白质。
在鼠尾基部用在CFA中乳化的纯化重组mSPEX-Ig对鼠进行免疫以产生单克隆抗体。用于产生针对特定抗原的抗体(包括单克隆抗体)的方法和技术是本领域众所周知的。在两周后收获中间髂骨淋巴结并通过标准方法与YB2/0细胞融合。然后使用经转染表达细胞表面mSPEX-YFP融合蛋白质(YFP是黄色荧光蛋白的缩写)的DPK和293细胞，通过FACS筛选所产生的与mSPEX起特异免疫反应的抗体。连续筛选直到在筛选过程中鉴定出一个或多个抗mSPEX的单克隆抗体。YFP标签能够证实转染的细胞在细胞表面表达mSPEX-YFP融合蛋白质并且能够将细胞抗体结合的相对水平与mSPEX-YFP融合蛋白质的表达相关联。具体而言，用分离的表达载体构建体转染用于筛选方法的DPK和293细胞，所述构建体产生自将mSPEX基因插入物克隆到pEYEP-N1载体(Clontech)。pEYEP-N1载体提供YFP标签并且mSPEX插入物从pEYEP-N1的表达导致了包含与YFP标签有效连接的mSPEX多肽的融合蛋白的表达。从该筛选中得到了PK3、PK18和PK233个杂交瘤。任选地将杂交瘤再次克隆并且使用标准方法纯化抗体。
因此产生特异与mSPEX的细胞外结构域起免疫反应的单克隆抗体。如本文所提到，与mSPEX的细胞外结构域起免疫反应的单克隆抗体是PK3、PK18和PK23。
抗hSPEX单克隆抗体
除了以下两步外，使用实施例3中公开的方法制备了特异地与hSPEX多肽细胞外结构域起免疫反应的单克隆抗体：1)制备包含融合蛋白质编码区和人IgG1铰链区CH2和CH3结构域的p-hSPEX-Ig表达载体，其中融合蛋白质具有mSPEX细胞外结构域(包含SPEX信号序列)，并且将该表达载体用于在大鼠中产生单克隆抗体；和2)将编码hSPEX多肽细胞外结构域的hSPEX多核苷酸克隆到pEYEP-N1载体上并且在DPK和293细胞中表达，以便使用上面公开的FACS-YFP方法筛选单克隆抗体。所产生的单克隆抗体特异与hSPEX的细胞外结构域起免疫反应。
MAP激酶信号途径刺激SPEX表达
在存在或缺乏PMA和离子霉素刺激和存在或缺乏MEK抑制剂(10μM U0126)的条件下培养的DP胸腺细胞中比较了mSPEX和hSPEXmRNA的表达。在一个实验中，通过MEK抑制剂抑制了大约70％用PMA和离子霉素刺激所观察到的SPEX mRNA表达的增加(在鼠和人两种细胞中)。这些数据与导致刺激SPEX mRNA表达的MAP激酶信号途径一致。
细胞内mSPEX的分离
使用基质结合的抗mSPEX单克隆抗体，通过亲和层析在还原和非还原条件下从鼠脾细胞全细胞裂解物中分离了mSPEX蛋白质。在足以使裂解物中mSPEX多肽与抗体结合的条件下将基质结合的抗体与细胞裂解物接触，由此形成包括基质、抗hSPEX抗体和hSPEX多肽的反应复合物(免疫反应缓冲液和诸如孵育时间和温度之类的其它条件是本领域众所周知的，并且在此处是适用的)。洗涤基质以除去非mSPEX污染物。将mSPEX多肽从基质-抗体-mSPEX复合物中释放出来并且以纯化形式收集mSPEX多肽。通过在SDS-PAGE凝胶上电泳，并使用银染色检测样品的生物内容物，证实纯化mSPEX多肽的存在。如通过银染色检测的mSPEX多肽基本上是样品中唯一存在的物质，其显现35kDa和37kDa两条带。通过转染细胞的表位标签和通过使用抗mSPEX单克隆抗体的Western印迹证实双带中的每一个条带都同为mSPEX。
细胞内hSPEX的分离
使用基质结合的抗hSPEX单克隆抗体，通过亲和层析在还原和非还原条件下从人脾细胞细胞培养裂解物中分离了hSPEX蛋白质。在足以使裂解物中hSPEX多肽与抗体结合的条件下将基质结合的抗体与细胞裂解物接触，由此形成包括基质、抗hSPEX抗体和hSPEX多肽的反应复合物。洗涤基质以除去非hSPEX污染物。将hSPEX多肽从基质-抗体-hSPEX复合物中释放出来并且以纯化形式收集hSPEX多肽。通过在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，并使用银染色检测样品中的生物内容物，证实纯化hSPEX多肽的存在。如通过银染色所检测的hSPEX多肽基本上是样品中唯一存在的物质。通过使用抗hSPEX单克隆抗体的Western印迹证实了hSPEX多肽的同一性。
SPEX蛋白质的组织分布
通过细胞内mRNA的Northern印迹分析，在鼠脑、心、肾、肝、肺、肌肉、皮肤、小肠、脾、胃、睾丸和胸腺组织检查了SPEX基因表达的组织分布。通过Northern分析，在鼠脑和睾丸中基本上没有检测到SPEXmRNA。在心、肾、肌肉和皮肤组织观察到SPEX的低水平表达。在肝、肺、小肠和胃组织观察到SPEX的中等水平表达。在胸腺和脾脏组织观察到SPEX的高水平表达，与胸腺组织相比在脾脏组织中的表达约为两倍。
在鼠B淋巴细胞、CD4+胸腺细胞和CD8+胸腺细胞中评估了胸腺中SPEX mRNA表达的分布。通过对胸腺细胞CD4、CD8和SPEX进行3色染色并且通过流式细胞术分析表达模式测定了SPEX在胸腺细胞中的表达。SPEX mRNA的表达在CD4 T细胞中比CD8 T细胞中高。在一个实验中，CD4T细胞SPEX mRNA表达与CD8 T细胞SPEX mRNA的表达之比大约2∶1。在CD4T细胞中SPEX蛋白质的表达也比CD8细胞谱系高，尽管两种细胞群均表达SPEX蛋白质。这些数据与参与T细胞谱系定型的SPEX信号途径一致。
通过对脾脏细胞进行3色染色并且通过流式细胞术分析表达模式评估了SPEX mRNA在B细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞中的表达。同样，SPEX在B和T细胞上表达，表达水平以由最高到最低依次是B细胞、CD4T细胞、CD8细胞的典型次序。
用抗SPEX抗体调节T细胞应答
该实例通过将T细胞与抗mSPEX抗体接触检测T细胞代谢的调节。通过磁珠排除从AND TCR转基因小鼠的淋巴结纯化CD4 T细胞。这些T细胞具有关于CD4和CD8表达的良好特征化的抗原特异性。在本测定中，在存在或缺乏SPEX特异单克隆抗体的条件下，将CD4 T细胞与抗原呈递细胞(APC)和抗原混合。将每个混合物的培养物孵育不同的选择时期并检测或测定T细胞应答。抗体处理混合物与没有抗体的混合物相比，T细胞增殖率的变化是施用与SPEX细胞外结构域起免疫反应的抗体所导致的T细胞代谢调节的证据。
上述测定法中的APC是根据本领域已知的标准技术从受照射的BALB.K小鼠脾细胞中制备的。APC具有恰当向AND T细胞呈递抗原的MHC分子，具有mSPEXb等位基因，并表达mSPEXb多肽；但是不具有SPEX等位基因或者表达mSPEXb之外的mSPEX多肽。所使用的抗体是抗mSPEX抗体PK18，该抗体不与mSPEXb多肽起免疫反应。PK18抗体与mSPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应。因此，从BALB.K小鼠制备的APC不与PK18抗体起免疫反应。在存在多种浓度抗原(在该实施例中为来源于鸽子细胞色素c的肽)的情况下，在PK18抗-SPEX单克隆抗体存在或缺乏下混合T细胞和APC，并且培养不同的时期。通过在开始培养后多种时间阶段的3H胸苷的摄入测量增殖。
用抗SPEX抗体抑制T细胞活化
该实施例阐述了通过将包含SPEX多肽的T细胞与能够与SPEX多肽起免疫反应的抗体接触来抑制T细胞活化的方法。分别从rom B10.BR(其具有mSPEX多肽)和BALB.K(其具有mSPEXb多肽)小鼠纯化LN T细胞。在3H-TdR(氚标记的胸苷)存在下在96孔板中培养T细胞，其中96孔板用等量的抗CD3和大鼠Ig或等量的抗CD3和单克隆抗体PK18包被。已知抗CD3抗体是T细胞活化的刺激剂。PK18抗体与B10.BR T细胞的mSPEX多肽起免疫反应，但是不与BALB.K T细胞的mSPEXb多肽起免疫反应。
结果示于图3。在图3中，掺入到与抗CD3和大鼠Ig反应的T细胞的3H-TdR表示为空心符号。在图3中，掺入能够与抗CD3和PK18反应的T细胞的3H-TdR表示为实心符号。数据表示为三次培养的平均的3H-TdR掺入平均值(+/-标准差(SD))减去单独T细胞培养中3H-TdR掺入的cpm(其小于1500cpm)。3H-TdR向T细胞的掺入与T细胞的增殖和T细胞活化两者均相关。
图3中系列1和2(两个不同的实验)表明当T细胞接触与B10小鼠T细胞mSPEX起免疫反应的抗体PK18时，来源于B10小鼠T细胞的活化受到了抑制。图3中系列3和4(两个不同的实验)表明当T细胞不接触与BALB.K小鼠T细胞的mSPEXb起免疫反应的抗体PK18时，来源于BALB.K小鼠的T细胞的活化没有受到明显的调节。
PK18抗体与mSPEXb多肽的细胞外结构域起免疫反应。因此，在图3中描述的数据证明了通过将包含SPEX多肽的T细胞与能够与SPEX多肽(优选是SPEX多肽的细胞外结构域，并且更优选SPEX多肽Ig样结构域)起免疫反应的抗体接触来抑制T细胞活化的方法。
用抗SPEX抗体抑制B细胞的活化
该实施例证明了通过将包含SPEX多肽的B细胞与能够与SPEX多肽起免疫反应的抗体接触来抑制B细胞活化的方法。除了B细胞纯化自B10.BR和BALB.K小鼠以外，重复实施例10。发现通过将B10的B细胞(而不是BALB小鼠的B细胞)与PK18抗体接触抑制了B细胞的活化。因此，数据证明通过将包含SPEX多肽的B细胞与能够与SPEX多肽(优选SPEX多肽的细胞外结构域，并且更优选SPEX多肽Ig样结构域)起免疫反应的抗体接触来抑制B细胞活化的方法。
鼠抗mSPEX单克隆抗体
用重组的可溶SPEX-Ig融合蛋白质(包含上面讨论的SPEX的细胞外结构域)免疫(在CFA中50μg)和加强免疫(在IFA中50μg，3-5次)BALB/c小鼠。免疫原来源于B6小鼠(含有mSPEX等位基因，不是mSPEXb等位基因)，并因此在BALB/c小鼠中产生等位基因特异的抗体。通过标准方法从免疫动物的脾细胞产生杂交瘤。通过与亲本和表达SPEX-YFP融合蛋白的转染细胞的差异的结合筛选单克隆抗体。筛选出PJ16、PJ19和PJ196三个单克隆抗体用于额外的分析。每个抗体的同种型是IgG1κ.。PJ19、PJ16和PJ196抗体具有与PK系列大鼠单克隆抗体(见上文)相同的染色模式，包括与B6细胞(而不BALB/C来源的细胞)表达的mSPEX(但不与mSPEXb)特异免疫反应，所述BALB/c来源细胞表达mSPEXb而不是mSPEX。
除了本文提供的实施方案以外，根据前面的说明书，对于本领域技术人员而言，本发明的多种改变是显而易见的，并且处于权利要求书的范围内。
                              序列表
<110>诺瓦提斯公司
     斯克里普斯研究所
<120>SPEX组合物和使用方法
<130>TSRI 810.1
<150>US 60/467,206
<151>2003-04-30
<160>113
<170>Windows 4.0版FastSEQ
<210>1
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>1
Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val
 1               5                  10                  15
Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly
            20                  25                  30
<210>2
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>2
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His
 1               5                  10                  15
Ser Ile Leu Ala
            20
<210>3
<211>65
<212>PRT
<213>人
<400>3
Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala Asn Arg
 1               5                  10                  15
Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val Lys Leu
            20                  25                  30
Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser Phe Phe
        35                  40                  45
Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser Tyr Arg
    50                  55                  60
Cys
65
<210>4
<211>42
<212>PRT
<213>人
<400>4
Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Thr Leu
 1               5                  10                  15
Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser Lys Asp Glu
            20                  25                  30
Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser
        35                  40
<210>5
<211>21
<212>PRT
<213>人
<400>5
Leu Leu Pro Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys
 1               5                  10                  15
Leu Phe Cys Cys Leu
            20
<210>6
<211>44
<212>PRT
<213>人
<400>6
Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg
 1               5                  10                  15
Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr Glu Ala
            20                  25                  30
Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu
        35                  40
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>7
Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro
 1               5
<210>8
<211>23
<212>PRT
<213>人
<400>8
Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser Glu Val Tyr Ser Asn Pro
 1               5                  10                  15
Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro
            20
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>9
Gly Ile Val Tyr Ala Ser Leu Asn His
 1               5
<210>10
<211>14
<212>PRT
<213>人
<400>10
Ser Val Ile Gly Leu Asn Ser Arg Leu Ala Arg Asn Val Lys
 1               5                  10
<210>11
<211>13
<212>PRT
<213>人
<400>11
Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser
 1               5                  10
<210>12
<211>127
<212>PRT
<213>人
<400>12
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His
 1               5                  10                  15
Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr
            20                  25                  30
Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr
        35                  40                  45
Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn
    50                  55                  60
Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn
65                  70                  75                  80
Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser
                85                  90                  95
His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg
            100                 105                 110
Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser
        115                 120                 125
<210>13
<211>157
<212>PRT
<213>人
<400>13
Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val
 1               5                  10                  15
Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu
            20                  25                  30
Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile
        35                  40                  45
Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala
    50                  55                  60
Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val
65                  70                  75                  80
Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser
                85                  90                  95
Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser
            100                 105                 110
Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser
        115                 120                 125
Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser
    130                 135                 140
Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser
145                 150                 155
<210>14
<211>148
<212>PRT
<213>人
<400>14
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His
 1               5                  10                  15
Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr
            20                  25                  30
Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr
        35                  40                  45
Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn
    50                  55                  60
Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn
65                  70                  75                  80
Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser
                85                  90                  95
His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg
            100                 105                 110
Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu
        115                 120                 125
Leu Pro Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu
    130                 135                 140
Phe Cys Cys Leu
145
<210>15
<211>178
<212>PRT
<213>人
<400>15
Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val
 1               5                  10                  15
Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu
            20                  25                  30
Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile
        35                  40                  45
Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala
    50                  55                  60
Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val
65                  70                  75                  80
Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser
                85                  90                  95
Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser
            100                 105                 110
Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser
        115                 120                 125
Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser
    130                 135                 140
Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro
145                 150                 155                 160
Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys
                165                 170                 175
Cys Leu
<210>16
<211>67
<212>PRT
<213>人
<400>16
Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu
 1               5                  10                  15
Gly Ser Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly
            20                  25                  30
Ile Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Leu Asn Ser Arg
        35                  40                  45
Leu Ala Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys
    50                  55                  60
Val Arg Ser
65
<210>17
<211>111
<212>PRT
<213>人
<400>17
Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg
 1               5                  10                  15
Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr Glu Ala
            20                  25                  30
Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser Glu Val
    50                  55                  60
Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Leu Asn Ser Arg Leu Ala Arg Asn
                85                  90                  95
Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser
            100                 105                 110
<210>18
<211>132
<212>PRT
<213>人
<400>18
Leu Leu Pro Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys
 1               5                  10                  15
Leu Phe Cys Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser
            20                  25                  30
Asp Thr Ala Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser
        35                  40                  45
Glu Gln Thr Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser
    50                  55                  60
Glu Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln
65                  70                  75                  80
Glu Gly Ser Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro
                85                  90                  95
Gly Ile Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Leu Asn Ser
            100                 105                 110
Arg Leu Ala Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile
        115                 120                 125
Cys Val Arg Ser
    130
<210>19
<211>239
<212>PRT
<213>人
<400>19
Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala Asn Arg
 1               5                  10                  15
Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val Lys Leu
            20                  25                  30
Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser Phe Phe
        35                  40                  45
Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser Tyr Arg
    50                  55                  60
Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser Lys Asp
                85                  90                  95
Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro Leu Gly
            100                 105                 110
Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys Cys Leu
        115                 120                 125
Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg
    130                 135                 140
Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr Glu Ala
145                 150                 155                 160
Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly Ile Tyr
                165                 170                 175
Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser Glu Val
            180                 185                 190
Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val Tyr Ala
        195                 200                 205
Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Leu Asn Ser Arg Leu Ala Arg Asn
    210                 215                 220
Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser
225                 230                 235
<210>20
<211>259
<212>PRT
<213>人
<400>20
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His
 1               5                  10                  15
Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr
            20                  25                  30
Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr
        35                  40                  45
Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn
    50                  55                  60
Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn
65                  70                  75                  80
Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser
                85                  90                  95
His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg
            100                 105                 110
Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu
        115                 120                 125
Leu Pro Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu
    130                 135                 140
Phe Cys Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp
145                 150                 155                 160
Thr Ala Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu
                165                 170                 175
Gln Thr Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu
            180                 185                 190
Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu
        195                 200                 205
Gly Ser Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly
    210                 215                 220
Ile Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Leu Asn Ser Arg
225                 230                 235                 240
Leu Ala Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys
                245                 250                 255
Val Arg Ser
<210>21
<211>289
<212>PRT
<213>人
<400>21
Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val
 1               5                  10                  15
Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu
            20                  25                  30
Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile
        35                  40                  45
Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala
    50                  55                  60
Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val
65                  70                  75                  80
Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser
                85                  90                  95
Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser
            100                 105                 110
Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser
        115                 120                 125
Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser
    130                 135                 140
Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro
145                 150                 155                 160
Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys
                165                 170                 175
Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala
            180                 185                 190
Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr
        195                 200                 205
Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly
    210                 215                 220
Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser
225                 230                 235                 240
Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val
                245                 250                 255
Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Leu Asn Ser Arg Leu Ala
            260                 265                 270
Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg
        275                 280                 285
Ser
<210>22
<211>90
<212>DNA
<213>人
<400>22
atgaagacat tgcctgccat gcttggaact gggaaattat tttgggtctt cttcttaatc 60
ccatatctgg acatctggaa catccatggg                                  90
<210>23
<211>60
<212>DNA
<213>人
<400>23
aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata aagagacaat ctgaacactc catcttagca 60
<210>24
<211>201
<212>DNA
<213>人
<400>24
ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg aaatactgtg ctaacaggcc tcatgtgact 60
tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta aaacttgaag atagacaaac aagttggaag 120
gaagagaaga acatttcatt tttcattcta cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat 180
gggtcatacc gctgttctgc a                                           201
<210>25
<211>120
<212>DNA
<213>人
<400>25
aattttcagt ctaatctcat tgaaagccac tcaacaactc tttatgtgac agatgtaaaa 60
agtgcctcag aacgaccctc caaggacgaa atggcaagca gaccctggct cctgtatagt 120
<210>26
<211>63
<212>DNA
<213>人
<400>26
ttacttcctt tggggggatt gcctctactc atcactacct gtttctgcct gttctgctgc 60
ctg                                                               63
<210>27
<211>132
<212>DNA
<213>人
<400>27
agaaggcacc aaggaaagca aaatgaactc tctgacacag caggaaggga aattaacctg 60
gttgatgctc accttaagag tgagcaaaca gaagcaagca ccaggcaaaa ttcccaagta 120
ctgctatcag aa                                                     132
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人
<400>28
actggaattt atgataatga  ccct                                       24
<210>29
<211>69
<212>DNA
<213>人
<400>29
gacctttgtt tcaggatgca ggaagggtct gaagtttatt ctaatccatg cctggaagaa 60
aacaaacca                                                         69
<210>30
<211>27
<212>DNA
<213>人
<400>30
ggcattgttt atgcttccct gaaccat                                     27
<210>31
<211>42
<212>DNA
<213>人
<400>31
tctgtcattg gactgaactc aagactggca agaaatgtaa aa                    42
<210>32
<211>39
<212>DNA
<213>人
<400>32
gaagcaccaa cagaatatgc atccatatgt gtgaggagt                        39
<210>33
<211>381
<212>DNA
<213>人
<400>33
aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata aagagacaat ctgaacactc catcttagca 60
ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg aaatactgtg ctaacaggcc tcatgtgact 120
tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta aaacttgaag atagacaaac aagttggaag 180
gaagagaaga acatttcatt tttcattcta cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat 240
gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact 300
ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca gaacgaccct ccaaggacga aatggcaagc 360
agaccctggc tcctgtatag t                                           381
<210>34
<211>471
<212>DNA
<213>人
<400>34
atgaagacat tgcctgccat gcttggaact gggaaattat tttgggtctt cttcttaatc 60
ccatatctgg acatctggaa catccatggg aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata 120
aagagacaat ctgaacactc catcttagca ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg 180
aaatactgtg ctaacaggcc tcatgtgact tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta 240
aaacttgaag atagacaaac aagttggaag gaagagaaga acatttcatt tttcattcta 300
cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag 360
tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca 420
gaacgaccct ccaaggacga aatggcaagc agaccctggc tcctgtatag t          471
<210>35
<211>444
<212>DNA
<213>人
<400>35
aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata aagagacaat ctgaacactc catcttagca 60
ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg aaatactgtg ctaacaggcc tcatgtgact 120
tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta aaacttgaag atagacaaac aagttggaag 180
gaagagaaga acatttcatt tttcattcta cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat 240
gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact 300
ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca gaacgaccct ccaaggacga aatggcaagc 360
agaccctggc tcctgtatag tttacttcct ttggggggat tgcctctact catcactacc 420
tgtttctgcc tgttctgctg cctg                                        444
<210>36
<211>534
<212>DNA
<213>人
<400>36
atgaagacat tgcctgccat gcttggaact gggaaattat tttgggtctt cttcttaatc 60
ccatatctgg acatctggaa catccatggg aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata 120
aagagacaat ctgaacactc catcttagca ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg 180
aaatactgtg ctaacaggcc tcatgtgact tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta 240
aaacttgaag atagacaaac aagttggaag gaagagaaga acatttcatt tttcattcta 300
cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag 360
tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca 420
gaacgaccct ccaaggacga aatggcaagc agaccctggc tcctgtatag tttacttcct 480
ttggggggat tgcctctact catcactacc tgtttctgcc tgttctgctg cctg       534
<210>37
<211>201
<212>DNA
<213>人
<400>37
actggaattt atgataatga ccctgacctt tgtttcagga tgcaggaagg gtctgaagtt 60
tattctaatc catgcctgga agaaaacaaa ccaggcattg tttatgcttc cctgaaccat 120
tctgtcattg gactgaactc aagactggca agaaatgtaa aagaagcacc aacagaatat 180
gcatccatat gtgtgaggag t                                           201
<210>38
<211>333
<212>DNA
<213>人
<400>38
agaaggcacc aaggaaagca aaatgaactc tctgacacag caggaaggga aattaacctg 60
gttgatgctc accttaagag tgagcaaaca gaagcaagca ccaggcaaaa ttcccaagta 120
ctgctatcag aaactggaat ttatgataat gaccctgacc tttgtttcag gatgcaggaa 180
gggtctgaag tttattctaa tccatgcctg gaagaaaaca aaccaggcat tgtttatgct 240
tccctgaacc attctgtcat tggactgaac tcaagactgg caagaaatgt aaaagaagca 300
ccaacagaat atgcatccat atgtgtgagg agt                              333
<210>39
<211>396
<212>DNA
<213>人
<400>39
ttacttcctt tggggggatt gcctctactc atcactacct gtttctgcct gttctgctgc 60
ctgagaaggc accaaggaaa gcaaaatgaa ctctctgaca cagcaggaag ggaaattaac 120
ctggttgatg ctcaccttaa gagtgagcaa acagaagcaa gcaccaggca aaattcccaa 180
gtactgctat cagaaactgg aatttatgat aatgaccctg acctttgttt caggatgcag 240
gaagggtctg aagtttattc taatccatgc ctggaagaaa acaaaccagg cattgtttat 300
gcttccctga accattctgt cattggactg aactcaagac tggcaagaaa tgtaaaagaa 360
gcaccaacag aatatgcatc catatgtgtg aggagt                           396
<210>40
<211>717
<212>DNA
<213>人
<400>40
ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg aaatactgtg ctaacaggcc tcatgtgact 60
tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta aaacttgaag atagacaaac aagttggaag 120
gaagagaaga acatttcatt tttcattcta cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat 180
gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact 240
ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca gaacgaccct ccaaggacga aatggcaagc 300
agaccctggc tcctgtatag tttacttcct ttggggggat tgcctctact catcactacc 360
tgtttctgcc tgttctgctg cctgagaagg caccaaggaa agcaaaatga actctctgac 420
acagcaggaa gggaaattaa cctggttgat gctcacctta agagtgagca aacagaagca 480
agcaccaggc aaaattccca agtactgcta tcagaaactg gaatttatga taatgaccct 540
gacctttgtt tcaggatgca ggaagggtct gaagtttatt ctaatccatg cctggaagaa 600
aacaaaccag gcattgttta tgcttccctg aaccattctg tcattggact gaactcaaga 660
ctggcaagaa atgtaaaaga agcaccaaca gaatatgcat ccatatgtgt gaggagt    717
<210>41
<211>777
<212>DNA
<213>人
<400>41
aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata aagagacaat ctgaacactc catcttagca 60
ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg aaatactgtg ctaacaggcc tcatgtgact 120
tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta aaacttgaag atagacaaac aagttggaag 180
gaagagaaga acatttcatt tttcattcta cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat 240
gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact 300
ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca gaacgaccct ccaaggacga aatggcaagc 360
agaccctggc tcctgtatag tttacttcct ttggggggat tgcctctact catcactacc 420
tgtttctgcc tgttctgctg cctgagaagg caccaaggaa agcaaaatga actctctgac 480
acagcaggaa gggaaattaa cctggttgat gctcacctta agagtgagca aacagaagca 540
agcaccaggc aaaattccca agtactgcta tcagaaactg gaatttatga taatgaccct 600
gacctttgtt tcaggatgca ggaagggtct gaagtttatt ctaatccatg cctggaagaa 660
aacaaaccag gcattgttta tgcttccctg aaccattctg tcattggact gaactcaaga 720
ctggcaagaa atgtaaaaga agcaccaaca gaatatgcat ccatatgtgt gaggagt    777
<210>42
<211>870
<212>DNA
<213>人
<400>42
atgaagacat tgcctgccat gcttggaact gggaaattat tttgggtctt cttcttaatc 60
ccatatctgg acatctggaa catccatggg aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata 120
aagagacaat ctgaacactc catcttagca ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg 180
aaatactgtg ctaacaggcc tcatgtgact tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta 240
aaacttgaag atagacaaac aagttggaag gaagagaaga acatttcatt tttcattcta 300
cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag 360
tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca 420
gaacgaccct ccaaggacga aatggcaagc agaccctggc tcctgtatag tttacttcct 480
ttggggggat tgcctctact catcactacc tgtttctgcc tgttctgctg cctgagaagg 540
caccaaggaa agcaaaatga actctctgac acagcaggaa gggaaattaa cctggttgat 600
gctcacctta agagtgagca aacagaagca agcaccaggc aaaattccca agtactgcta 660
tcagaaactg gaatttatga taatgaccct gacctttgtt tcaggatgca ggaagggtct 720
gaagtttatt ctaatccatg cctggaagaa aacaaaccag gcattgttta tgcttccctg 780
aaccattctg tcattggact gaactcaaga ctggcaagaa atgtaaaaga agcaccaaca 840
gaatatgcat ccatatgtgt gaggagttaa                                  870
<210>43
<211>29
<212>PRT
<213>小鼠
<400>43
Met Lys Thr Val Pro Ala Met Leu Gly Thr Pro Arg Leu Phe Arg Glu
 1               5                  10                  15
Phe Phe Ile Leu His Leu Gly Leu Trp Ser Ile Leu Cys
            20                  25
<210>44
<211>27
<212>PRT
<213>小鼠
<400>44
Glu Lys Ala Thr Lys Arg Asn Asp Glu Glu Cys Pro Val Gln Leu Thr
 1               5                  10                  15
Ile Thr Arg Asn Ser Lys Gln Ser Ala Arg Thr
            20                  25
<210>45
<211>68
<212>PRT
<213>小鼠
<400>45
Gly Glu Leu Phe Lys Ile Gln Cys Pro Val Lys Tyr Cys Val His Arg
 1               5                  10                  15
Pro Asn Val Thr Trp Cys Lys His Asn Gly Thr Ile Cys Val Pro Leu
            20                  25                  30
Glu Val Ser Pro Gln Leu Tyr Thr Ser Trp Glu Glu Asn Gln Ser Val
        35                  40                  45
Pro Val Phe Val Leu His Phe Lys Pro Ile His Leu Ser Asp Asn Gly
    50                  55                  60
Ser Tyr Ser Cys
65
<210>46
<211>56
<212>PRT
<213>小鼠
<400>46
Ser Thr Asn Phe Asn Ser Gln Val Ile Asn Ser His Ser Val Thr Ile
 1               5                  10                  15
His Val Thr Glu Arg Thr Gln Asn Ser Ser Glu His Pro Leu Ile Thr
            20                  25                  30
Val Ser Asp Ile Pro Asp Ala Thr Ash Ala Ser Gly Pro Ser Thr Met
        35                  40                  45
Glu Glu Arg Pro Gly Arg Thr Trp
    50                  55
<210>47
<211>24
<212>PRT
<213>小鼠
<400>47
Leu Leu Tyr Thr Leu Leu Pro Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ala
 1               5                  10                  15
Cys Val Cys Leu Leu Cys Phe Leu
            20
<210>48
<211>37
<212>PRT
<213>小鼠
<400>48
Lys Arg Ile Gln Gly Lys Glu Lys Lys Pro Ser Asp Leu Ala Gly Arg
 1               5                  10                  15
Asp Thr Asn Leu Val Asp Ile Pro Ala Ser Ser Arg Thr Asn His Gln
            20                  25                  30
Ala Leu Pro Ser Gly
        35
<210>49
<211>8
<212>PRT
<213>小鼠
<400>49
Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro
 1               5
<210>50
<211>21
<212>PRT
<213>小鼠
<400>50
Trp Ser Ser Met Gln Asp Glu Ser Glu Leu Thr Ile Ser Leu Gln Ser
 1               5                  10                  15
Glu Arg Asn Asn Gln
            20
<210>51
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>51
Gly Ile Val Tyr Ala Ser Leu Asn His
 1               5
<210>52
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠
<400>52
Cys Val Ile Gly Arg Asn Pro Arg Gln Glu Asn Asn Met Gln
 1               5                  10
<210>53
<211>13
<212>PRT
<213>小鼠
<400>53
Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser
 1               5                  10
<210>54
<211>151
<212>PRT
<213>小鼠
<400>54
Glu Lys Ala Thr Lys Arg Asn Asp Glu Glu Cys Pro Val Gln Leu Thr
 1               5                  10                  15
Ile Thr Arg Asn Ser Lys Gln Ser Ala Arg Thr Gly Glu Leu Phe Lys
            20                  25                  30
Ile Gln Cys Pro Val Lys Tyr Cys Val His Arg Pro Asn Val Thr Trp
        35                  40                  45
Cys Lys His Asn Gly Thr Ile Cys Val Pro Leu Glu Val Ser Pro Gln
    50                  55                  60
Leu Tyr Thr Ser Trp Glu Glu Asn Gln Ser Val Pro Val Phe Val Leu
65                  70                  75                  80
His Phe Lys Pro Ile His Leu Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Ser Cys Ser
                85                  90                  95
Thr Asn Phe Asn Ser Gln Val Ile Asn Ser His Ser Val Thr Ile His
            100                 105                 110
Val Thr Glu Arg Thr Gln Asn Ser Ser Glu His Pro Leu Ile Thr Val
        115                 120                 125
Ser Asp Ile Pro Asp Ala Thr Asn Ala Ser Gly Pro Ser Thr Met Glu
    130                 135                 140
Glu Arg Pro Gly Arg Thr Trp
145                 150
<210>55
<211>180
<212>PRT
<213>小鼠
<400>55
Met Lys Thr Val Pro Ala Met Leu Gly Thr Pro Arg Leu Phe Arg Glu
 1               5                  10                  15
Phe Phe Ile Leu His Leu Gly Leu Trp Ser Ile Leu Cys Glu Lys Ala
            20                  25                  30
Thr Lys Arg Asn Asp Glu Glu Cys Pro Val Gln Leu Thr Ile Thr Arg
        35                  40                  45
Asn Ser Lys Gln Ser Ala Arg Thr Gly Glu Leu Phe Lys Ile Gln Cys
    50                  55                  60
Pro Val Lys Tyr Cys Val His Arg Pro Asn Val Thr Trp Cys Lys His
65                  70                  75                  80
Asn Gly Thr Ile Cys Val Pro Leu Glu Val Ser Pro Gln Leu Tyr Thr
                85                  90                  95
Ser Trp Glu Glu Asn Gln Ser Val Pro Val Phe Val Leu His Phe Lys
            100                 105                 110
Pro Ile His Leu Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Ser Cys Ser Thr Asn Phe
        115                 120                 125
Asn Ser Gln Val Ile Asn Ser His Ser Val Thr Ile His Val Thr Glu
    130                 135                 140
Arg Thr Gln Asn Ser Ser Glu His Pro Leu Ile Thr Val Ser Asp Ile
145                 150                 155                 160
Pro Asp Ala Thr Asn Ala Ser Gly Pro Ser Thr Met Glu Glu Arg Pro
                165                 170                 175
Gly Arg Thr Trp
            180
<210>56
<211>175
<212>PRT
<213>小鼠
<400>56
Glu Lys Ala Thr Lys Arg Asn Asp Glu Glu Cys Pro Val Gln Leu Thr
 1               5                  10                  15
Ile Thr Arg Asn Ser Lys Gln Ser Ala Arg Thr Gly Glu Leu Phe Lys
            20                  25                  30
Ile Gln Cys Pro Val Lys Tyr Cys Val His Arg Pro Asn Val Thr Trp
        35                  40                  45
Cys Lys His Asn Gly Thr Ile Cys Val Pro Leu Glu Val Ser Pro Gln
    50                  55                  60
Leu Tyr Thr Ser Trp Glu Glu Asn Gln Ser Val Pro Val Phe Val Leu
65                  70                  75                  80
His Phe Lys Pro Ile His Leu Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Ser Cys Ser
                85                  90                  95
Thr Asn Phe Asn Ser Gln Val Ile Asn Ser His Ser Val Thr Ile His
            100                 105                 110
Val Thr Glu Arg Thr Gln Asn Ser Ser Glu His Pro Leu Ile Thr Val
        115                 120                 125
Ser Asp Ile Pro Asp Ala Thr Asn Ala Ser Gly Pro Ser Thr Met Glu
    130                 135                 140
Glu Arg Pro Gly Arg Thr Trp Leu Leu Tyr Thr Leu Leu Pro Leu Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Val Cys Leu Leu Cys Phe Leu
                165                 170                 175
<210>57
<211>204
<212>PRT
<213>小鼠
<400>57
Met Lys Thr Val Pro Ala Met Leu Gly Thr Pro Arg Leu Phe Arg Glu
 1               5                  10                  15
Phe Phe Ile Leu His Leu Gly Leu Trp Ser Ile Leu Cys Glu Lys Ala
            20                  25                  30
Thr Lys Arg Asn Asp Glu Glu Cys Pro Val Gln Leu Thr Ile Thr Arg
        35                  40                  45
Asn Ser Lys Gln Ser Ala Arg Thr Gly Glu Leu Phe Lys Ile Gln Cys
    50                  55                  60
Pro Val Lys Tyr Cys Val His Arg Pro Asn Val Thr Trp Cys Lys His
65                  70                  75                  80
Asn Gly Thr Ile Cys Val Pro Leu Glu Val Ser Pro Gln Leu Tyr Thr
                85                  90                  95
Ser Trp Glu Glu Asn Gln Ser Val Pro Val Phe Val Leu His Phe Lys
            100                 105                 110
Pro Ile His Leu Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Ser Cys Ser Thr Asn Phe
        115                 120                 125
Asn Ser Gln Val Ile Asn Ser His Ser Val Thr Ile His Val Thr Glu
    130                 135                 140
Arg Thr Gln Asn Ser Ser Glu His Pro Leu Ile Thr Val Ser Asp Ile
145                 150                 155                 160
Pro Asp Ala Thr Asn Ala Ser Gly Pro Ser Thr Met Glu Glu Arg Pro
                165                 170                 175
Gly Arg Thr Trp Leu Leu Tyr Thr Leu Leu Pro Leu Gly Ala Leu Leu
            180                 185                 190
Leu Leu Leu Ala Cys Val Cys Leu Leu Cys Phe Leu
        195                 200
<210>58
<211>65
<212>PRT
<213>小鼠
<400>58
Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Trp Ser Ser Met Gln Asp Glu Ser
 1               5                  10                  15
Glu Leu Thr Ile Ser Leu Gln Ser Glu Arg Asn Asn Gln Gly Ile Val
            20                  25                  30
Tyr Ala Ser Leu Asn His Cys Val Ile Gly Arg Asn Pro Arg Gln Glu
        35                  40                  45
Asn Asn Met Gln Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg
    50                  55                  60
Ser
65
<210>59
<211>102
<212>PRT
<213>小鼠
<400>59
Lys Arg Ile Gln Gly Lys Glu Lys Lys Pro Ser Asp Leu Ala Gly Arg
 1               5                  10                  15
Asp Thr Asn Leu Val Asp Ile Pro Ala Ser Ser Arg Thr Asn His Gln
            20                  25                  30
Ala Leu Pro Ser Gly Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Trp Ser Ser
        35                  40                  45
Met Gln Asp Glu Ser Glu Leu Thr Ile Ser Leu Gln Ser Glu Arg Asn
    50                  55                  60
Asn Gln Gly Ile Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Cys Val Ile Gly Arg
65                  70                  75                  80
Asn Pro Arg Gln Glu Asn Asn Met Gln Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala
                85                  90                  95
Ser Ile Cys Val Arg Ser
            100
<210>60
<211>126
<212>PRT
<213>小鼠
<400>60
Leu Leu Tyr Thr Leu Leu Pro Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ala
 1               5                  10                  15
Cys Val Cys Leu Leu Cys Phe Leu Lys Arg Ile Gln Gly Lys Glu Lys
            20                  25                  30
Lys Pro Ser Asp Leu Ala Gly Arg Asp Thr Asn Leu Val Asp Ile Pro
        35                  40                  45
Ala Ser Ser Arg Thr Asn His Gln Ala Leu Pro Ser Gly Thr Gly Ile
    50                  55                  60
Tyr Asp Asn Asp Pro Trp Ser Ser Met Gln Asp Glu Ser Glu Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Leu Gln Ser Glu Arg Asn Asn Gln Gly Ile Val Tyr Ala Ser
                85                  90                  95
Leu Asn His Cys Val Ile Gly Arg Asn Pro Arg Gln Glu Asn Asn Met
            100                 105                 110
Gln Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser
        115                 120                 125
<210>61
<211>250
<212>PRT
<213>小鼠
<400>61
Gly Glu Leu Phe Lys Ile Gln Cys Pro Val Lys Tyr Cys Val His Arg
 1               5                  10                  15
Pro Asn Val Thr Trp Cys Lys His Asn Gly Thr Ile Cys Val Pro Leu
            20                  25                  30
Glu Val Ser Pro Gln Leu Tyr Thr Ser Trp Glu Glu Asn Gln Ser Val
        35                  40                  45
Pro Val Phe Val Leu His Phe Lys Pro Ile His Leu Ser Asp Asn Gly
    50                  55                  60
Ser Tyr Ser Cys Ser Thr Asn Phe Asn Ser Gln Val Ile Asn Ser His
65                  70                  75                  80
Ser Val Thr Ile His Val Thr Glu Arg Thr Gln Asn Ser Ser Glu His
                85                  90                  95
Pro Leu Ile Thr Val Ser Asp Ile Pro Asp Ala Thr Asn Ala Ser Gly
            100                 105                 110
Pro Ser Thr Met Glu Glu Arg Pro Gly Arg Thr Trp Leu Leu Tyr Thr
        115                 120                 125
Leu Leu Pro Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Val Cys Leu
    130                 135                 140
Leu Cys Phe Leu Lys Arg Ile Gln Gly Lys Glu Lys Lys Pro Ser Asp
145                 150                 155                 160
Leu Ala Gly Arg Asp Thr Asn Leu Val Asp Ile Pro Ala Ser Ser Arg
                165                 170                 175
Thr Asn His Gln Ala Leu Pro Ser Gly Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp
            180                 185                 190
Pro Trp Ser Ser Met Gln Asp Glu Ser Glu Leu Thr Ile Ser Leu Gln
        195                 200                 205
Ser Glu Arg Asn Asn Gln Gly Ile Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Cys
    210                 215                 220
Val Ile Gly Arg Asn Pro Arg Gln Glu Asn Asn Met Gln Glu Ala Pro
225                 230                 235                 240
Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser
                245                 250
<210>62
<211>277
<212>PRT
<213>小鼠
<400>62
Glu Lys Ala Thr Lys Arg Asn Asp Glu Glu Cys Pro Val Gln Leu Thr
 1               5                  10                  15
Ile Thr Arg Asn Ser Lys Gln Ser Ala Arg Thr Gly Glu Leu Phe Lys
            20                  25                  30
Ile Gln Cys Pro Val Lys Tyr Cys Val His Arg Pro Asn Val Thr Trp
        35                  40                  45
Cys Lys His Asn Gly Thr Ile Cys Val Pro Leu Glu Val Ser Pro Gln
    50                  55                  60
Leu Tyr Thr Ser Trp Glu Glu Asn Gln Ser Val Pro Val Phe Val Leu
65                  70                  75                  80
His Phe Lys Pro Ile His Leu Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Ser Cys Ser
                85                  90                  95
Thr Asn Phe Asn Ser Gln Val Ile Asn Ser His Ser Val Thr Ile His
            100                 105                 110
Val Thr Glu Arg Thr Gln Asn Ser Ser Glu His Pro Leu Ile Thr Val
        115                 120                 125
Ser Asp Ile Pro Asp Ala Thr Asn Ala Ser Gly Pro Ser Thr Met Glu
    130                 135                 140
Glu Arg Pro Gly Arg Thr Trp Leu Leu Tyr Thr Leu Leu Pro Leu Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Val Cys Leu Leu Cys Phe Leu Lys
                165                 170                 175
Arg Ile Gln Gly Lys Glu Lys Lys Pro Ser Asp Leu Ala Gly Arg Asp
            180                 185                 190
Thr Asn Leu Val Asp Ile Pro Ala Ser Ser Arg Thr Asn His Gln Ala
        195                 200                 205
Leu Pro Ser Gly Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Trp Ser Ser Met
    210                 215                 220
Gln Asp Glu Ser Glu Leu Thr Ile Ser Leu Gln Ser Glu Arg Asn Asn
225                 230                 235                 240
Gln Gly Ile Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Cys Val Ile Gly Arg Asn
                245                 250                 255
Pro Arg Gln Glu Asn Asn Met Gln Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser
            260                 265                 270
Ile Cys Val Arg Ser
        275
<210>63
<211>306
<212>PRT
<213>小鼠
<400>63
Met Lys Thr Val Pro Ala Met Leu Gly Thr Pro Arg Leu Phe Arg Glu
 1               5                  10                  15
Phe Phe Ile Leu His Leu Gly Leu Trp Ser Ile Leu Cys Glu Lys Ala
            20                  25                  30
Thr Lys Arg Asn Asp Glu Glu Cys Pro Val Gln Leu Thr Ile Thr Arg
        35                  40                  45
Asn Ser Lys Gln Ser Ala Arg Thr Gly Glu Leu Phe Lys Ile Gln Cys
    50                  55                  60
Pro Val Lys Tyr Cys Val His Arg Pro Asn Val Thr Trp Cys Lys His
65                  70                  75                  80
Asn Gly Thr Ile Cys Val Pro Leu Glu Val Ser Pro Gln Leu Tyr Thr
                85                  90                  95
Ser Trp Glu Glu Asn Gln Ser Val Pro Val Phe Val Leu His Phe Lys
            100                 105                 110
Pro Ile His Leu Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Ser Cys Ser Thr Asn Phe
        115                 120                 125
Asn Ser Gln Val Ile Asn Ser His Ser Val Thr Ile His Val Thr Glu
    130                 135                 140
Arg Thr Gln Asn Ser Ser Glu His Pro Leu Ile Thr Val Ser Asp Ile
145                 150                 155                 160
Pro Asp Ala Thr Asn Ala Ser Gly Pro Ser Thr Met Glu Glu Arg Pro
                165                 170                 175
Gly Arg Thr Trp Leu Leu Tyr Thr Leu Leu Pro Leu Gly Ala Leu Leu
            180                 185                 190
Leu Leu Leu Ala Cys Val Cys Leu Leu Cys Phe Leu Lys Arg Ile Gln
        195                 200                 205
Gly Lys Glu Lys Lys Pro Ser Asp Leu Ala Gly Arg Asp Thr Asn Leu
    210                 215                 220
Val Asp Ile Pro Ala Ser Ser Arg Thr Asn His Gln Ala Leu Pro Ser
225                 230                 235                 240
Gly Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Trp Ser Ser Met Gln Asp Glu
                245                 250                 255
Ser Glu Leu Thr Ile Ser Leu Gln Ser Glu Arg Asn Asn Gln Gly Ile
            260                 265                 270
Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Cys Val Ile Gly Arg Asn Pro Arg Gln
        275                 280                 285
Glu Asn Asn Met Gln Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val
    290                 295                 300
Arg Ser
305
<210>64
<211>87
<212>DNA
<213>小鼠
<400>64
atgaagacag tgcctgccat gcttgggact cctcggttat ttagggaatt cttcatcctc 60
catctgggcc tctggagcat cctttgt                                     87
<210>65
<211>81
<212>DNA
<213>小鼠
<400>65
gagaaagcta ctaagaggaa tgatgaagag tgtccagtgc aacttactat tacgaggaat 60
tccaaacagt ctgccaggac a                                           81
<210>66
<211>210
<212>DNA
<213>小鼠
<400>66
ggagagttat ttaaaattca atgtcctgtg aaatactgtg ttcatagacc taatgtgact 60
tggtgtaagc acaatggaac aatctgtgta ccccttgagg ttagccctca gctatacact 120
agttgggaag aaaatcaatc agttccggtt tttgttctcc actttaaacc aatacatctc 180
agtgataatg ggtcgtatag ctgttctaca                                  210
<210>67
<211>162
<2l2>DNA
<213>小鼠
<400>67
aacttcaatt ctcaagttat taatagccat tcagtaacca tccatgtgac agaaaggact 60
caaaactctt cagaacaccc actaataaca gtatctgaca tcccagatgc caccaatgcc 120
tcaggaccat ccaccatgga agagaggcca ggcaggactt gg                    162
<210>68
<211>72
<212>DNA
<213>小鼠
<400>68
ctgctttaca ccttgcttcc tttgggggca ttgcttctgc tccttgcctg tgtctgcctg 60
ctctgctttc tg                                                     72
<210>69
<211>111
<212>DNA
<213>小鼠
<400>69
aaaaggatcc aagggaaaga aaagaagcct tctgacttgg caggaaggga cactaacctg 60
gttgatattc cagccagttc caggacaaat caccaagcac tgccatcagg a          111
<210>70
<211>24
<212>DNA
<213>小鼠
<400>70
actggaattt atgataatga tccc                                        24
<210>71
<211>63
<212>DNA
<213>小鼠
<400>71
tggtctagca tgcaggatga atctgaattg acaattagct tgcaatcaga gagaaacaac 60
cag                                                               63
<210>72
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<400>72
ggcattgttt atgcttcttt gaaccat                                     27
<210>73
<211>42
<212>DNA
<213>小鼠
<400>73
tgtgttattg gaaggaatcc aagacaggaa aacaacatgc ag                    42
<210>74
<211>39
<212>DNA
<213>小鼠
<400>74
gaggcaccca cagaatatgc atccatttgt gtgagaagt                        39
<210>75
<211>453
<212>DNA
<213>小鼠
<400>75
gagaaagcta ctaagaggaa tgatgaagag tgtccagtgc aacttactat tacgaggaat 60
tccaaacagt ctgccaggac aggagagtta tttaaaattc aatgtcctgt gaaatactgt 120
gttcatagac ctaatgtgac ttggtgtaag cacaatggaa caatctgtgt accccttgag 180
gttagccctc agctatacac tagttgggaa gaaaatcaat cagttccggt ttttgttctc 240
cactttaaac caatacatct cagtgataat gggtcgtata gctgttctac aaacttcaat 300
tctcaagtta ttaatagcca ttcagtaacc atccatgtga cagaaaggac tcaaaactct 360
tcagaacacc cactaataac agtatctgac atcccagatg ccaccaatgc ctcaggacca 420
tccaccatgg aagagaggcc aggcaggact tgg                              453
<210>76
<211>540
<212>DNA
<213>小鼠
<400>76
atgaagacag tgcctgccat gcttgggact cctcggttat ttagggaatt cttcatcctc 60
catctgggcc tctggagcat cctttgtgag aaagctacta agaggaatga tgaagagtgt 120
ccagtgcaac ttactattac gaggaattcc aaacagtctg ccaggacagg agagttattt 180
aaaattcaat gtcctgtgaa atactgtgtt catagaccta atgtgacttg gtgtaagcac 240
aatggaacaa tctgtgtacc ccttgaggtt agccctcagc tatacactag ttgggaagaa 300
aatcaatcag ttccggtttt tgttctccac tttaaaccaa tacatctcag tgataatggg 360
tcgtatagct gttctacaaa cttcaattct caagttatta atagccattc agtaaccatc 420
catgtgacag aaaggactca aaactcttca gaacacccac taataacagt atctgacatc 480
ccagatgcca ccaatgcctc aggaccatcc accatggaag agaggccagg caggacttgg 540
<210>77
<211>525
<212>DNA
<213>小鼠
<400>77
gagaaagcta ctaagaggaa tgatgaagag tgtccagtgc aacttactat tacgaggaat 60
tccaaacagt ctgccaggac aggagagtta tttaaaattc aatgtcctgt gaaatactgt 120
gttcatagac ctaatgtgac ttggtgtaag cacaatggaa caatctgtgt accccttgag 180
gttagccctc agctatacac tagttgggaa gaaaatcaat cagttccggt ttttgttctc 240
cactttaaac caatacatct cagtgataat gggtcgtata gctgttctac aaacttcaat 300
tctcaagtta ttaatagcca ttcagtaacc atccatgtga cagaaaggac tcaaaactct 360
tcagaacacc cactaataac agtatctgac atcccagatg ccaccaatgc ctcaggacca 420
tccaccatgg aagagaggcc aggcaggact tggctgcttt acaccttgct tcctttgggg 480
gcattgcttc tgctccttgc ctgtgtctgc ctgctctgct ttctg                 525
<210>78
<211>612
<212>DNA
<213>小鼠
<400>78
atgaagacag tgcctgccat gcttgggact cctcggttat ttagggaatt cttcatcctc 60
catctgggcc tctggagcat cctttgtgag aaagctacta agaggaatga tgaagagtgt 120
ccagtgcaac ttactattac gaggaattcc aaacagtctg ccaggacagg agagttattt 180
aaaattcaat gtcctgtgaa atactgtgtt catagaccta atgtgacttg gtgtaagcac 240
aatggaacaa tctgtgtacc ccttgaggtt agccctcagc tatacactag ttgggaagaa 300
aatcaatcag ttccggtttt tgttctccac tttaaaccaa tacatctcag tgataatggg 360
tcgtatagct gttctacaaa cttcaattct caagttatta atagccattc agtaaccatc 420
catgtgacag aaaggactca aaactcttca gaacacccac taataacagt atctgacatc 480
ccagatgcca ccaatgcctc aggaccatcc accatggaag agaggccagg caggacttgg 540
ctgctttaca ccttgcttcc tttgggggca ttgcttctgc tccttgcctg tgtctgcctg 600
ctctgctttc tg                                                     612
<210>79
<211>195
<212>DNA
<213>小鼠
<400>79
actggaattt atgataatga tccctggtct agcatgcagg atgaatctga attgacaatt 60
agcttgcaat cagagagaaa caaccagggc attgtttatg cttctttgaa ccattgtgtt 120
attggaagga atccaagaca ggaaaacaac atgcaggagg cacccacaga atatgcatcc 180
atttgtgtga gaagt                                                  195
<210>80
<211>306
<212>DNA
<213>小鼠
<400>80
aaaaggatcc aagggaaaga aaagaagcct tctgacttgg caggaaggga cactaacctg 60
gttgatattc cagccagttc caggacaaat caccaagcac tgccatcagg aactggaatt 120
tatgataatg atccctggtc tagcatgcag gatgaatctg aattgacaat tagcttgcaa 180
tcagagagaa acaaccaggg cattgtttat gcttctttga accattgtgt tattggaagg 240
aatccaagac aggaaaacaa catgcaggag gcacccacag aatatgcatc catttgtgtg 300
agaagt                                                            306
<210>81
<211>378
<212>DNA
<213>小鼠
<400>81
ctgctttaca ccttgcttcc tttgggggca ttgcttctgc tccttgcctg tgtctgcctg 60
ctctgctttc tgaaaaggat ccaagggaaa gaaaagaagc cttctgactt ggcaggaagg 120
gacactaacc tggttgatat tccagccagt tccaggacaa atcaccaagc actgccatca 180
ggaactggaa tttatgataa tgatccctgg tctagcatgc aggatgaatc tgaattgaca 240
attagcttgc aatcagagag aaacaaccag ggcattgttt atgcttcttt gaaccattgt 300
gttattggaa ggaatccaag acaggaaaac aacatgcagg aggcacccac agaatatgca 360
tccatttgtg tgagaagt                                               378
<210>82
<211>750
<212>DNA
<213>小鼠
<400>82
ggagagttat ttaaaattca atgtcctgtg aaatactgtg ttcatagacc taatgtgact 60
tggtgtaagc acaatggaac aatctgtgta ccccttgagg ttagccctca gctatacact 120
agttgggaag aaaatcaatc agttccggtt tttgttctcc actttaaacc aatacatctc 180
agtgataatg ggtcgtatag ctgttctaca aacttcaatt ctcaagttat taatagccat 240
tcagtaacca tccatgtgac agaaaggact caaaactctt cagaacaccc actaataaca 300
gtatctgaca tcccagatgc caccaatgcc tcaggaccat ccaccatgga agagaggcca 360
ggcaggactt ggctgcttta caccttgctt cctttggggg cattgcttct gctccttgcc 420
tgtgtctgcc tgctctgctt tctgaaaagg atccaaggga aagaaaagaa gccttctgac 480
ttggcaggaa gggacactaa cctggttgat attccagcca gttccaggac aaatcaccaa 540
gcactgccat caggaactgg aatttatgat aatgatccct ggtctagcat gcaggatgaa 600
tctgaattga caattagctt gcaatcagag agaaacaacc agggcattgt ttatgcttct 660
ttgaaccatt gtgttattgg aaggaatcca agacaggaaa acaacatgca ggaggcaccc 720
acagaatatg catccatttg tgtgagaagt                                  750
<210>83
<211>831
<212>DNA
<213>小鼠
<400>83
gagaaagcta ctaagaggaa tgatgaagag tgtccagtgc aacttactat tacgaggaat 60
tccaaacagt ctgccaggac aggagagtta tttaaaattc aatgtcctgt gaaatactgt 120
gttcatagac ctaatgtgac ttggtgtaag cacaatggaa caatctgtgt accccttgag 180
gttagccctc agctatacac tagttgggaa gaaaatcaat cagttccggt ttttgttctc 240
cactttaaac caatacatct cagtgataat gggtcgtata gctgttctac aaacttcaat 300
tctcaagtta ttaatagcca ttcagtaacc atccatgtga cagaaaggac tcaaaactct 360
tcagaacacc cactaataac agtatctgac atcccagatg ccaccaatgc ctcaggacca 420
tccaccatgg aagagaggcc aggcaggact tggctgcttt acaccttgct tcctttgggg 480
gcattgcttc tgctccttgc ctgtgtctgc ctgctctgct ttctgaaaag gatccaaggg 540
aaagaaaaga agccttctga cttggcagga agggacacta acctggttga tattccagcc 600
agttccagga caaatcacca agcactgcca tcaggaactg gaatttatga taatgatccc 660
tggtctagca tgcaggatga atctgaattg acaattagct tgcaatcaga gagaaacaac 720
cagggcattg tttatgcttc tttgaaccat tgtgttattg gaaggaatcc aagacaggaa 780
aacaacatgc aggaggcacc cacagaatat gcatccattt gtgtgagaag t          831
<210>84
<211>921
<212>DNA
<213>小鼠
<400>84
atgaagacag tgcctgccat gcttgggact cctcggttat ttagggaatt cttcatcctc 60
catctgggcc tctggagcat cctttgtgag aaagctacta agaggaatga tgaagagtgt 120
ccagtgcaac ttactattac gaggaattcc aaacagtctg ccaggacagg agagttattt 180
aaaattcaat gtcctgtgaa atactgtgtt catagaccta atgtgacttg gtgtaagcac 240
aatggaacaa tctgtgtacc ccttgaggtt agccctcagc tatacactag ttgggaagaa 300
aatcaatcag ttccggtttt tgttctccac tttaaaccaa tacatctcag tgataatggg 360
tcgtatagct gttctacaaa cttcaattct caagttatta atagccattc agtaaccatc 420
catgtgacag aaaggactca aaactcttca gaacacccac taataacagt atctgacatc 480
ccagatgcca ccaatgcctc aggaccatcc accatggaag agaggccagg caggacttgg 540
ctgctttaca ccttgcttcc tttgggggca ttgcttctgc tccttgcctg tgtctgcctg 600
ctctgctttc tgaaaaggat ccaagggaaa gaaaagaagc cttctgactt ggcaggaagg 660
gacactaacc tggttgatat tccagccagt tccaggacaa atcaccaagc actgccatca 720
ggaactggaa tttatgataa tgatccctgg tctagcatgc aggatgaatc tgaattgaca 780
attagcttgc aatcagagag aaacaaccag ggcattgttt atgcttcttt gaaccattgt 840
gttattggaa ggaatccaag acaggaaaac aacatgcagg aggcacccac agaatatgca 900
tccatttgtg tgagaagtta a                                           921
<210>85
<211>179
<212>PRT
<213>小鼠
<400>85
Met Lys Thr Val Pro Ala Met Leu Gly Thr Pro Arg Leu Phe Arg Glu
 1               5                  10                  15
Phe Phe Ile Leu His Leu Gly Leu Trp Ser Ile Leu Cys Glu Lys Ala
            20                  25                  30
Thr Lys Arg Asn Asp Glu Glu Cys Glu Val Gln Leu Asn Ile Lys Arg
        35                  40                  45
Asn Ser Lys His Ser Ala Trp Thr Gly Glu Leu Phe Lys Ile Glu Cys
    50                  55                  60
Pro Val Lys Tyr Cys Val His Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys His
65                  70                  75                  80
Asn Gly Thr Ile Trp Val Pro Leu Glu Val Gly Pro Gln Leu Tyr Thr
                85                  90                  95
Ser Trp Glu Glu Asn Arg Ser Val Pro Val Phe Val Leu His Phe Lys
            100                 105                 110
Pro Ile His Leu Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Ser Cys Ser Thr Asn Phe
        115                 120                 125
Asn Ser Gln Val Ile Asn Ser His Ser Val Thr Ile His Val Arg Glu
    130                 135                 140
Arg Thr Gln Asn Ser Ser Glu His Pro Leu Ile Thr Val Ser Asp Ile
145                 150                 155                 160
Pro Asp Ala Thr Asn Ala Ser Gly Pro Ser Thr Met Glu Glu Arg Pro
                165                 170                 175
Gly Arg Thr
<210>86
<211>150
<212>PRT
<213>小鼠
<400>86
Glu Lys Ala Thr Lys Arg Asn Asp Glu Glu Cys Glu Val Gln Leu Asn
 1               5                  10                  15
Ile Lys Arg Asn Ser Lys His Ser Ala Trp Thr Gly Glu Leu Phe Lys
            20                  25                  30
Ile Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Val His Arg Pro His Val Thr Trp
        35                  40                  45
Cys Lys His Asn Gly Thr Ile Trp Val Pro Leu Glu Val Gly Pro Gln
    50                  55                  60
Leu Tyr Thr Ser Trp Glu Glu Asn Arg Ser Val Pro Val Phe Val Leu
65                  70                  75                  80
His Phe Lys Pro Ile His Leu Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Ser Cys Ser
                85                  90                  95
Thr Asn Phe Asn Ser Gln Val Ile Asn Ser His Ser Val Thr Ile His
            100                 105                 110
Val Arg Glu Arg Thr Gln Asn Ser Ser Glu His Pro Leu Ile Thr Val
        115                 120                 125
Ser Asp Ile Pro Asp Ala Thr Asn Ala Ser Gly Pro Ser Thr Met Glu
    130                 135                 140
Glu Arg Pro Gly Arg Thr
145                 150
<210>87
<211>29
<212>PRT
<213>小鼠
<400>87
Met Lys Thr Val Pro Ala Met Leu Gly Thr Pro Arg Leu Phe Arg Glu
 1               5                  10                  15
Phe Phe Ile Leu His Leu Gly Leu Trp Ser Ile Leu Cys
            20                  25
<210>88
<211>68
<212>PRT
<213>小鼠
<400>88
Gly Glu Leu Phe Lys Ile Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Val His Arg
 1               5                  10                  15
Pro His Val Thr Trp Cys Lys His Asn Gly Thr Ile Trp Val Pro Leu
            20                  25                  30
Glu Val Gly Pro Gln Leu Tyr Thr Ser Trp Glu Glu Asn Arg Ser Val
        35                  40                  45
Pro Val Phe Val Leu His Phe Lys Pro Ile His Leu Ser Asp Asn Gly
    50                  55                  60
Ser Tyr Ser Cys
65
<210>89
<211>537
<212>DNA
<213>小鼠
<400>89
atgaagacag tgcctgccat gcttgggact cctcggttat ttagggaatt cttcatcctc 60
catctgggcc tctggagcat cctttgtgag aaagctacta agaggaatga tgaagagtgt 120
gaagtgcaac ttaatattaa gaggaattcc aaacactctg cctggacagg agagttattt 180
aaaattgaat gtcctgtgaa atactgtgtt catagacctc atgtgacttg gtgtaagcac 240
aatggaacaa tctgggtacc ccttgaagtt ggtcctcagc tatacactag ttgggaagaa 300
aatcgatcag ttccggtttt tgttctccat tttaaaccaa tacatctcag tgataacggg 360
tcgtatagct gttctacaaa cttcaattct caagttatta atagccattc agtaaccatc 420
catgtgagag aaaggactca aaactcttca gaacacccac taataacagt atctgacatc 480
ccagatgcca ccaatgcctc aggaccatcc accatggaag agaggccagg caggact    537
<210>90
<211>450
<212>DNA
<213>小鼠
<400>90
gagaaagcta ctaagaggaa tgatgaagag tgtgaagtgc aacttaatat taagaggaat 60
tccaaacact ctgcctggac aggagagtta tttaaaattg aatgtcctgt gaaatactgt 120
gttcatagac ctcatgtgac ttggtgtaag cacaatggaa caatctgggt accccttgaa 180
gttggtcctc agctatacac tagttgggaa gaaaatcgat cagttccggt ttttgttctc 240
cattttaaac caatacatct cagtgataac gggtcgtata gctgttctac aaacttcaat 300
tctcaagtta ttaatagcca ttcagtaacc atccatgtga gagaaaggac tcaaaactct 360
tcagaacacc cactaataac agtatctgac atcccagatg ccaccaatgc ctcaggacca 420
tccaccatgg aagagaggcc aggcaggact                                  450
<210>91
<211>87
<212>DNA
<213>小鼠
<400>91
atgaagacag tgcctgccat gcttgggact cctcggttat ttagggaatt cttcatcctc 60
catctgggcc tctggagcat cctttgt                                     87
<2l0>92
<211>204
<212>DNA
<213>小鼠
<400>92
ggagagttat ttaaaattga atgtcctgtg aaatactgtg ttcatagacc tcatgtgact 60
tggtgtaagc acaatggaac aatctgggta ccccttgaag ttggtcctca gctatacact 120
agttgggaag aaaatcgatc agttccggtt tttgttctcc attttaaacc aatacatctc 180
agtgataacg ggtcgtatag ctgt                                        204
<210>93
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Xaa＝任何氨基酸
<223>合成的
<400>93
Ile Xaa Tyr Xaa Xaa Leu
 1               5
<210>94
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>94
Ile Val Tyr Ala Ser Leu
 1               5
<210>95
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Xaa＝任何氨基酸
<223>合成的
<400>95
Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Ile
 1               5
<210>96
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>96
Thr Glu Tyr Ala Ser Ile
 1               5
<210>97
<211>232
<212>PRT
<213>人
<400>97
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210>98
<211>521
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>融合多肽
<400>98
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu
225                 230                 235                 240
Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp
                245                 250                 255
Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile
            260                 265                 270
Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu
        275                 280                 285
Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys
    290                 295                 300
Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser
305                 310                 315                 320
Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro
                325                 330                 335
Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln
            340                 345                 350
Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val
        355                 360                 365
Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro
    370                 375                 380
Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile
385                 390                 395                 400
Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys
                405                 410                 415
Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp
            420                 425                 430
Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser
        435                 440                 445
Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu
    450                 455                 460
Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu
465                 470                 475                 480
Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val
                485                 490                 495
Ile Gly Leu Asn Ser Arg Leu Ala Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr
            500                 505                 510
Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser
        515                 520
<210>99
<211>538
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>融合多肽
<400>99
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Met Lys Thr Val Pro Ala Met Leu
225                 230                 235                 240
Gly Thr Pro Arg Leu Phe Arg Glu Phe Phe Ile Leu His Leu Gly Leu
                245                 250                 255
Trp Ser Ile Leu Cys Glu Lys Ala Thr Lys Arg Asn Asp Glu Glu Cys
            260                 265                 270
Pro Val Gln Leu Thr Ile Thr Arg Asn Ser Lys Gln Ser Ala Arg Thr
        275                 280                 285
Gly Glu Leu Phe Lys Ile Gln Cys Pro Val Lys Tyr Cys Val His Arg
    290                 295                 300
Pro Asn Val Thr Trp Cys Lys His Asn Gly Thr Ile Cys Val Pro Leu
305                 310                 315                 320
Glu Val Ser Pro Gln Leu Tyr Thr Ser Trp Glu Glu Asn Gln Ser Val
                325                 330                 335
Pro Val Phe Val Leu His Phe Lys Pro Ile His Leu Ser Asp Asn Gly
            340                 345                 350
Ser Tyr Ser Cys Ser Thr Asn Phe Asn Ser Gln Val Ile Asn Ser His
        355                 360                 365
Ser Val Thr Ile His Val Thr Glu Arg Thr Gln Asn Ser Ser Glu His
    370                 375                 380
Pro Leu Ile Thr Val Ser Asp Ile Pro Asp Ala Thr Asn Ala Ser Gly
385                 390                 395                 400
Pro Ser Thr Met Glu Glu Arg Pro Gly Arg Thr Trp Leu Leu Tyr Thr
                405                 410                 415
Leu Leu Pro Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Val Cys Leu
            420                 425                 430
Leu Cys Phe Leu Lys Arg Ile Gln Gly Lys Glu Lys Lys Pro Ser Asp
        435                 440                 445
Leu Ala Gly Arg Asp Thr Asn Leu Val Asp Ile Pro Ala Ser Ser Arg
    450                 455                 460
Thr Asn His Gln Ala Leu Pro Ser Gly Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp
465                 470                 475                 480
Pro Trp Ser Ser Met Gln Asp Glu Ser Glu Leu Thr Ile Ser Leu Gln
                485                 490                 495
Ser Glu Arg Asn Asn Gln Gly Ile Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Cys
            500                 505                 510
Val Ile Gly Arg Asn Pro Arg Gln Glu Asn Asn Met Gln Glu Ala Pro
        515                 520                 525
Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser
    530                 535
<210>100
<211>411
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>融合多肽
<400>100
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Met Lys Thr Val Pro Ala Met Leu
225                 230                 235                 240
Gly Thr Pro Arg Leu Phe Arg Glu Phe Phe Ile Leu His Leu Gly Leu
                245                 250                 255
Trp Ser Ile Leu Cys Glu Lys Ala Thr Lys Arg Asn Asp Glu Glu Cys
            260                 265                 270
Glu Val Gln Leu Asn Ile Lys Arg Asn Ser Lys His Ser Ala Trp Thr
        275                 280                 285
Gly Glu Leu Phe Lys Ile Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Val His Arg
    290                 295                 300
Pro His Val Thr Trp Cys Lys His Asn Gly Thr Ile Trp Val Pro Leu
305                 310                 315                 320
Glu Val Gly Pro Gln Leu Tyr Thr Ser Trp Glu Glu Asn Arg Ser Val
                325                 330                 335
Pro Val Phe Val Leu His Phe Lys Pro Ile His Leu Ser Asp Asn Gly
            340                 345                 350
Ser Tyr Ser Cys Ser Thr Asn Phe Asn Ser Gln Val Ile Asn Ser His
        355                 360                 365
Ser Val Thr Ile His Val Arg Glu Arg Thr Gln Asn Ser Ser Glu His
    370                 375                 380
Pro Leu Ile Thr Val Ser Asp Ile Pro Asp Ala Thr Asn Ala Ser Gly
385                 390                 395                 400
Pro Ser Thr Met Glu Glu Arg Pro Gly Arg Thr
                405                 410
<210>101
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>101
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
 1               5
<210>102
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>102
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
 1               5                  10
<210>103
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>103
Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp
 1               5
<210>104
<211>990
<212>DNA
<213>人
<400>104
actggggtag gtaaactgac ccaactctgc agcactcaga agacgaagca aagccttcta 60
cttgagcagt ttttccatca ctgatatgtg caggaaatga agacattgcc tgccatgctt 120
ggaactggga aattattttg ggtcttcttc ttaatcccat atctggacat ctggaacatc 180
catgggaaag aatcatgtga tgtacagctt tatataaaga gacaatctga acactccatc 240
ttagcaggag atccctttga actagaatgc cctgtgaaat actgtgctaa caggcctcat 300
gtgacttggt gcaagctcaa tggaacaaca tgtgtaaaac ttgaagatag acaaacaagt 360
tggaaggaag agaagaacat ttcatttttc attctacatt ttgaaccagt gcttcctaat 420
gacaatgggt cataccgctg ttctgcaaat tttcagtcta atctcattga aagccactca 480
acaactcttt atgtgacaga tgtaaaaagt gcctcagaac gaccctccaa ggacgaaatg 540
gcaagcagac cctggctcct gtatagttta cttcctttgg ggggattgcc tctactcatc 600
actacctgtt tctgcctgtt ctgctgcctg agaaggcacc aaggaaagca aaatgaactc 660
tctgacacag caggaaggga aattaacctg gttgatgctc accttaagag tgagcaaaca 720
gaagcaagca ccaggcaaaa ttcccaagta ctgctatcag aaactggaat ttatgataat 780
gaccctgacc tttgtttcag gatgcaggaa gggtctgaag tttattctaa tccatgcctg 840
gaagaaaaca aaccaggcat tgtttatgct tccctgaacc attctgtcat tggactgaac 900
tcaagactgg caagaaatgt aaaagaagca ccaacagaat atgcatccat atgtgtgagg 960
agttaagtct gttttctgac ctcccaacag                                  990
<210>105
<211>1250
<212>DNA
<213>小鼠
<400>105
agatctctag ggaggaagag gaagtttgcc cttacctgac acgtgctggg aatgaagaca 60
gtgcctgcca tgcttgggac tcctcggtta tttagggaat tcttcatcct ccatctgggc 120
ctctggagca tcctttgtga gaaagctact aagaggaatg atgaagagtg tccagtgcaa 180
cttactatta cgaggaattc caaacagtct gccaggacag gagagttatt taaaattcaa 240
tgtcctgtga aatactgtgt tcatagacct aatgtgactt ggtgtaagca caatggaaca 300
atctgtgtac cccttgaggt tagccctcag ctatacacta gttgggaaga aaatcaatca 360
gttccggttt ttgttctcca ctttaaacca atacatctca gtgataatgg gtcgtatagc 420
tgttctacaa acttcaattc tcaagttatt aatagccatt cagtaaccat ccatgtgaca 480
gaaaggactc aaaactcttc agaacaccca ctaataacag tatctgacat cccagatgcc 540
accaatgcct caggaccatc caccatggaa gagaggccag gcaggacttg gctgctttac 600
accttgcttc ctttgggggc attgcttctg ctccttgcct gtgtctgcct gctctgcttt 660
ctgaaaagga tccaagggaa agaaaagaag ccttctgact tggcaggaag ggacactaac 720
ctggttgata ttccagccag ttccaggaca aatcaccaag cactgccatc aggaactgga 780
atttatgata atgatccctg gtctagcatg caggatgaat ctgaattgac aattagcttg 840
caatcagaga gaaacaacca gggcattgtt tatgcttctt tgaaccattg tgttattgga 900
aggaatccaa gacaggaaaa caacatgcag gaggcaccca cagaatatgc atccatttgt 960
gtgagaagtt aaacctgcca ctgagccagg cagcctacac tgcatgagtg cctgtcaata 1020
cctctgtctg gaccttcagt ttcaaataac cttcaacctg gaaagtttca attaagatgc 1080
tctgtgctgg tgctgcgtct taaaggtcca tgaagtattt agttaaaatt tctcctgaaa 1140
actttgggag agttttgtac aagacagact cttccctggg aaaactcata ttacgaatag 1200
cagaataata gggcttttaa aattgaccat gtcgcaccat gtcgtaccca            1250
<210>106
<211>957
<212>DNA
<213>小鼠
<400>106
ggcccgggat ctatgaagac agtgcctgcc atgcttggga ctcctcggtt atttagggaa 60
ttcttcatcc tccatctggg cctctggagc atcctttgtg agaaagctac taagaggaat 120
gatgaagagt gtccagtgca acttactatt acgaggaatt ccaaacagtc tgccaggaca 180
ggagagttat ttaaaattca atgtcctgtg aaatactgtg ttcatagacc taatgtgact 240
tggtgtaagc acaatggaac aatctgtgta ccccttgagg ttagccctca gctatacact 300
agttgggaag aaaatcaatc agttccggtt tttgttctcc actttaaacc aatacatctc 360
agtgataatg ggtcgtatag ctgttctaca aacttcaatt ctcaagttat taatagccat 420
tcagtaacca tccatgtgac agaaaggact caaaactctt cagaacaccc actaataaca 480
gtatctgaca tcccagatgc caccaatgcc tcaggaccat ccaccatgga agagaggcca 540
ggcaggactt ggctgcttta caccttgctt cctttggggg cattgcttct gctccttgcc 600
tgtgtctgcc tgctctgctt tctgaaaagg atccaaggga aagaaaagaa gccttctgac 660
ttggcaggaa gggacactaa cctggttgat attccagcca gttccaggac aaatcaccaa 720
gcactgccat caggaactgg aatttatgat aatgatccct ggtctagcat gcaggatgaa 780
tctgaattga caattagctt gcaatcagag agaaacaacc agggcattgt ttatgcttct 840
ttgaaccatt gtgttattgg aaggaatcca agacaggaaa acaacatgca ggaggcaccc 900
acagaatatg catccatttg tgtgagaagt gcagatccac cggtcgccac catggtg    957
<210>107
<211>1722
<212>DNA
<213>小鼠
<400>107
ggatctcgag ctcaagcttc gaattctgca gtcgacggta ccgcgggccc gggatctatg 60
aagacagtgc ctgccatgct tgggactcct cggttattta gggaattctt catcctccat 120
ctgggcctct ggagcatcct ttgtgagaaa gctactaaga ggaatgatga agagtgtcca 180
gtgcaactta ctattacgag gaattccaaa cagtctgcca ggacaggaga gttatttaaa 240
attcaatgtc ctgtgaaata ctgtgttcat agacctaatg tgacttggtg taagcacaat 300
ggaacaatct gtgtacccct tgaggttagc cctcagctat acactagttg ggaagaaaat 360
caatcagttc cggtttttgt tctccacttt aaaccaatac atctcagtga taatgggtcg 420
tatagctgtt ctacaaactt caattctcaa gttattaata gccattcagt aaccatccat 480
gtgacagaaa ggactcaaaa ctcttcagaa cacccactaa taacagtatc tgacatccca 540
gatgccacca atgcctcagg accatccacc atggaagaga ggccaggcag gacttggctg 600
ctttacacct tgcttccttt gggggcattg cttctgctcc ttgcctgtgt ctgcctgctc 660
tgctttctga aaaggatcca agggaaagaa aagaagcctt ctgacttggc aggaagggac 720
actaacctgg ttgatattcc agccagttcc aggacaaatc accaagcact gccatcagga 780
actggaattt atgataatga tccctggtct agcatgcagg atgaatctga attgacaatt 840
agcttgcaat cagagagaaa caaccagggc attgtttatg cttctttgaa ccattgtgtt 900
attggaagga atccaagaca ggaaaacaac atgcaggagg cacccacaga atatgcatcc 960
atttgtgtga gaagtgcaga tccaccggtc gccaccatgg tgagcaaggg cgaggagctg 1020
ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 1080
agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 1140
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccacctt cggctacggc 1200
ctgcagtgct tcgcccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 1260
atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 1320
acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 1380
atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 1440
cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 1500
cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 1560
atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagctacca gtccgccctg 1620
agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 1680
gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaaagcg gc                    1722
<210>108
<211>609
<212>DNA
<213>小鼠
<400>108
ggatccaagg gaaagaaaag aagccttctg acttggcagg aagggacact aacctggttg 60
atattccagc cagttccagg acaaatcacc aagcactgcc atcaggaact ggaatttatg 120
ataatgatcc ctggtctagc atgcaggatg aatctgaatt gacaattagc ttgcaatcag 180
agagaaacaa ccagggcatt gtttatgctt ctttgaacca ttgtgttatt ggaaggaatc 240
caagacagga aaacaacatg caggaggcac ccacagaata tgcatccatt tgtgtgagaa 300
gttaaacctg ccactgagcc aggcagccta cactgcatga gtgcctgtca atacctctgt 360
ctggaccttc agtttcaaat aaccttcaac ctggaaagtt tcaattaaga tgctctgtgc 420
tggtgctgcg tcttaaaggt ccatgaagta tttagttaaa atttctcctg aaaactttgg 480
gagagttttg tacaagacag actcttccct gggaaaactc atattacgaa tagcagaata 540
atagggcttt taaaattgac catgtcgcac catgtcgtac ccaaagggcg aattctgcag 600
atcagatct                                                         609
<210>109
<211>1276
<212>DNA
<213>小鼠
<400>109
agatctctag ggaggaagag gaagtttgcc cttacctgac acgtgctggg aatgaagaca 60
gtgcctgcca tgcttgggac tcctcggtta tttagggaat tcttcatcct ccatctgggc 120
ctctggagca tcctttgtga gaaagctact aagaggaatg atgaagagtg tccagtgcaa 180
cttactatta cgaggaattc caaacagtct gccaggacag gagagttatt taaaattcaa 240
tgtcctgtga aatactgtgt tcatagacct aatgtgactt ggtgtaagca caatggaaca 300
atctgtgtac cccttgaggt tagccctcag ctatacacta gttgggaaga aaatcaatca 360
gttccggttt ttgttctcca ctttaaacca atacatctca gtgataatgg gtcgtatagc 420
tgttctacaa acttcaattc tcaagttatt aatagccatt cagtaaccat ccatgtgaca 480
gaaaggactc aaaactcttc agaacaccca ctaataacag tatctgacat cccagatgcc 540
accaatgcct caggaccatc caccatggaa gagaggccag gcaggacttg gctgctttac 600
accttgcttc ctttgggggc attgcttctg ctccttgcct gtgtctgcct gctctgcttt 660
ctgaaaagga tccaagggaa agaaaagaag ccttctgact tggcaggaag ggacactaac 720
ctggttgata ttccagccag ttccaggaca aatcaccaag cactgccatc aggaactgga 780
atttatgata atgatccctg gtctagcatg caggatgaat ctgaattgac aattagcttg 840
caatcagaga gaaacaacca gggcattgtt tatgcttctt tgaaccattg tgttattgga 900
aggaatccaa gacaggaaaa caacatgcag gaggcaccca cagaatatgc atccatttgt 960
gtgagaagtt aaacctgcca ctgagccagg cagcctacac tgcatgagtg cctgtcaata 1020
cctctgtctg gaccttcagt ttcaaataac cttcaacctg gaaagtttca attaagatgc 1080
tctgtgctgg tgctgcgtct taaaggtcca tgaagtattt agttaaaatt tctcctgaaa 1140
actttgggag agttttgtac aagacagact cttccctggg aaaactcata ttacgaatag 1200
cagaataata gggcttttaa aattgaccat gtcgcaccat gtcgtaccca aagggcgaat 1260
tctgcagatc agatct
1276
<210>110
<211>486
<212>DNA
<213>小鼠
<400>110
ggatcttgga gaaagctact aagaggaatg gagaaagcta ctaagaggaa tgatgaagag 60
tgtccagtgc aacttactat tacgaggaat tccaaacagt ctgccaggac aggagagtta 120
tttaaaattc aatgtcctgt gaaatactgt gttcatagac ctaatgtgac ttggtgtaag 180
cacaatggaa caatctgtgt accccttgag gttagccctc agctatacac tagttgggaa 240
gaaaatcaat cagttccggt ttttgttctc cactttaaac caatacatct cagtgataat 300
gggtcgtata gctgttctac aaacttcaat tctcaagtta ttaatagcca ttcagtaacc 360
atccatgtga cagaaaggac tcaaaactct tcagaacacc cactaataac agtatctgac 420
atcccagatg ccaccaatgc ctcaggacca tccaccatgg aagagaggcc aggcaggact 480
agatcc                                                            486
<210>111
<211>464
<212>DNA
<213>小鼠
<400>111
agatcttgga gaaagctact aagaggaatg atgaagagtg tccagtgcaa cttactatta 60
cgaggaattc caaacagtct gccaggacag gagagttatt taaaattcaa tgtcctgtga 120
aatactgtgt tcatagacct aatgtgactt ggtgtaagca caatggaaca atctgtgtac 180
cccttgaggt tagccctcag ctatacacta gttgggaaga aaatcaatca gttccggttt 240
ttgttctcca ctttaaacca atacatctca gtgataatgg gtcgtatagc tgttctacaa 300
acttcaattc tcaagttatt aatagccatt cagtaaccat ccatgtgaca gaaaggactc 360
aaaactcttc agaacaccca ctaataacag tatctgacat cccagatgcc accaatgcct 420
caggaccatc caccatggaa gagaggccag gcaggactag atct                  464
<210>112
<211>538
<212>DNA
<213>小鼠
<400>112
atgaagacag tgcctgccat gcttgggact cctcggttat ttagggaatt cttcatcctc 60
catctgggcc tctggagcat cctttgtgag aaagctacta agaggaatga tgaagagtgt 120
ccagtgcaac ttactattac gaggaattcc aaacagtctc caggacagga gagttattta 180
aaattcaatg tcctgtgaaa tactgtgttc atagacctaa tgtgacttgg tgtaagcaca 240
atggaacaat ctgtgtaccc cttgaggtta gccctcagct atacactagt tgggaagaaa 300
atcaatcagt tccggttttt gttctccact ttaaaccaat acatctcagt gataatgggt 360
cgtatagctg ttctacaaac ttcaattctc aagttattaa tagccattca gtaaccatcc 420
atgtgacaga aaggactcaa aactcttcag aacacccact aataacagta tctgacatcc 480
cagatgccac caatgcctca ggaccatcca ccatggaaga gaggccaggc aggactgc   538
<210>113
<211>537
<212>DNA
<213>小鼠
<400>113
atgaagacag tgcctgccat gcttgggact cctcggttat ttagggaatt cttcatcctc 60
catctgggcc tctggagcat cctttgtgag aaagctacta agaggaatga tgaagagtgt 120
gaagtgcaac ttaatattaa gaggaattcc aaacactctg cctggacagg agagttattt 180
aaaattgaat gtcctgtgaa atactgtgtt catagacctc atgtgacttg gtgtaagcac 240
aatggaacaa tctgggtacc ccttgaagtt ggtcctcagc tatacactag ttgggaagaa 300
aatcgatcag ttccggtttt tgttctccat tttaaaccaa tacatctcag tgataacggg 360
tcgtatagct gttctacaaa cttcaattct caagttatta atagccattc agtaaccatc 420
catgtgagag aaaggactca aaactcttca gaacacccac taataacagt atctgacatc 480
ccagatgcca ccaatgcctc aggaccatcc accatggaag agaggccagg caggact    537

Claims (12)

1.纯化的多肽，所述多肽包含：
a)列于SEQ ID NO：3、7、9、11、45或88的任一氨基酸序列；或
b)与SEQ ID NO：3、7、9、11、45或88中任一序列具有95％或更高同一性、并且包含免疫球蛋白样结构域结构的氨基酸序列。
2.纯化的免疫原性多肽，其基本上由SEQ ID NO：3、7、9、11、45或88中任一序列的8-40个连续氨基酸残基组成。
3.纯化的多核苷酸，其包含编码SPEX多肽的核酸序列或该核酸序列的互补序列。
4.纯化的多核苷酸，其包含编码SEQ ID NO：3、7、9、11、45或88所列任一多肽序列的核酸序列或该核酸序列的互补序列。
5.纯化的多核苷酸，其包含编码SPEX基于酪氨酸的结构域的核酸序列或该核酸序列的互补序列。
6.纯化的多核苷酸，其包含：
a)编码SPEX多肽的核酸序列或该核酸序列的互补序列；和
b)与所述核酸序列有效连接的载体序列。
7.纯化的SPEX表达载体，其包含与载体序列有效连接的编码SPEX多肽的核酸序列，所述载体序列具有一个或多个用于SPEX多肽表达的控制元件。
8.包含SPEX表达载体的纯化宿主细胞，其中所述表达载体包含与载体序列有效连接的编码SPEX表达产物的核酸序列，该载体序列具有用于表达SPEX产物的一个或多个控制元件。
9.与SPEX多肽起免疫反应的分离的抗体。
10.鉴定SPEX结合配偶体的方法，其包括：
a)将候选结合配偶体与SPEX多肽接触；
b)检测是否形成包含SPEX多肽的结合复合物；
c)当形成结合复合物时，选择候选结合配偶体作为SPEX结合配偶体。
11.从含有SPEX多肽的生物样品中分离SPEX多肽的方法，其包括：
a)将生物样品与结合抗SPEX抗体的亲和基质接触，以产生包含SPEX多肽和结合到基质上的抗SPEX抗体的复合物；
b)将基质与生物样品的残余物分开；
c)将SPEX多肽与抗SPEX抗体分开；并
d)收集分离的SPEX多肽。
12.调节表达SPEX多肽的淋巴细胞代谢的方法，其包括将淋巴细胞与能够与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗SPEX抗体接触。
CNA2004800146309A 2003-04-30 2004-04-29 Spex组合物和使用方法 Pending CN1795205A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46720603P 2003-04-30 2003-04-30
US60/467,206 2003-04-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1795205A true CN1795205A (zh) 2006-06-28

Family

ID=33418441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2004800146309A Pending CN1795205A (zh) 2003-04-30 2004-04-29 Spex组合物和使用方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20040248257A1 (zh)
EP (1) EP1622935A2 (zh)
JP (1) JP2006524489A (zh)
CN (1) CN1795205A (zh)
AU (1) AU2004234532A1 (zh)
BR (1) BRPI0409948A (zh)
CA (1) CA2523025A1 (zh)
MX (1) MXPA05011595A (zh)
WO (1) WO2004096976A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112877353A (zh) * 2021-01-19 2021-06-01 东北林业大学 一种表达载体及其制备方法和应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004000221A2 (en) * 2002-06-20 2003-12-31 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modulating lymphocyte activity
US8546541B2 (en) 2002-06-20 2013-10-01 Washington University Compositions and methods for modulating lymphocyte activity
US7341843B2 (en) * 2003-04-11 2008-03-11 Allergan, Inc. Botulinum toxin A peptides and methods of predicting and reducing immunoresistance to botulinum toxin therapy
US8188232B1 (en) 2004-11-15 2012-05-29 Washington University In St. Louis Compositions and methods for modulating lymphocyte activity
US20090311280A1 (en) * 2004-12-09 2009-12-17 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Novel tnf receptor regulatory domain
US8349320B2 (en) 2004-12-09 2013-01-08 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Compositions and methods for modulating responses mediated or associated with BTLA activity
US8303952B2 (en) 2009-06-08 2012-11-06 Washington University Methods for inducing in vivo tolerance

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002502589A (ja) * 1998-02-09 2002-01-29 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ４５個のヒト分泌タンパク質
US6783961B1 (en) * 1999-02-26 2004-08-31 Genset S.A. Expressed sequence tags and encoded human proteins
AU2002257088A1 (en) * 2001-03-12 2002-09-24 Incyte Genomics, Inc. Immunoglobulin superfamily proteins
US20040097711A1 (en) * 2002-03-12 2004-05-20 Henry Yue Immunoglobulin superfamily proteins
WO2004000221A2 (en) * 2002-06-20 2003-12-31 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modulating lymphocyte activity
WO2004039394A1 (en) * 2002-10-25 2004-05-13 Genentech, Inc. Novel composition and methods for the treatment of immune related diseases

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112877353A (zh) * 2021-01-19 2021-06-01 东北林业大学 一种表达载体及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0409948A (pt) 2006-04-25
US20040248257A1 (en) 2004-12-09
WO2004096976A3 (en) 2005-04-07
WO2004096976A2 (en) 2004-11-11
EP1622935A2 (en) 2006-02-08
JP2006524489A (ja) 2006-11-02
CA2523025A1 (en) 2004-11-11
MXPA05011595A (es) 2005-12-15
AU2004234532A1 (en) 2004-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1229391C (zh) 涉及α6β4整联蛋白的人胃肠上皮肿瘤抗原的抗体
CN1310942C (zh) 校正基因
CN1197966C (zh) 肿瘤坏死因子受体相关因子的调节剂、及其制备和用途
CN1543476A (zh) 用于将蛋白定向到胞外体的方法和化合物
CN1561394A (zh) 人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林及有关蛋白的突变蛋白
CN101065501A (zh) 确定基因毒性的方法
CN1836048A (zh) 可转导的dna结合蛋白
CN101048509A (zh) 用于产生蛋白质的体系和方法
CN1493597A (zh) 分离树突状细胞膜蛋白基因
CN101065401A (zh) 骨保护素变异蛋白
CN1592793A (zh) 肝细胞癌－相关基因和多肽,以及检测肝细胞癌的方法
CN1264980C (zh) 新型肿瘤抗原蛋白sart－3及其肿瘤抗原肽
CN1628179A (zh) 肝细胞癌相关基因和蛋白
CN1795205A (zh) Spex组合物和使用方法
CN1784424A (zh) 编码人癌胚抗原的合成基因及其用途
CN1241940C (zh) 新型胶原蛋白样蛋白clac、其前体和它们的编码基因
CN1630664A (zh) 胱冬酶－8结合蛋白及其制备和使用
CN1359421A (zh) 新型多肽及其dna
CN1932016A (zh) 影响sre活性的多核苷酸及其编码多肽和用途
CN1886506A (zh) 在nk细胞中表达的蛋白质
CN1169954C (zh) 编码具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白的多核苷酸
CN1900279A (zh) 诱导细胞凋亡的多核苷酸及其编码的多肽和用途
CN1281962C (zh) 作为肝癌标志物的肿瘤相关分泌蛋白及其用途
CN1545552A (zh) 基因和蛋白质及它们的用途
CN1704426A (zh) 一种癌症基因及其医药用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20060628