CN1280613A - 编码哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶的分离的核酸分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分离的或重组的哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶、多肽和肽,尤其是人、小鼠和大鼠乙酰肝素酶、编码它们的基因序列,及其在例如化学化合物、蛋白质、多肽、小分子及大分子的测定及表征中的应用,这些物质能抑制转移、血管发生、血管成形术诱导的再狭窄、动脉粥样硬化、炎症、促进创伤愈合和以其它方式调节与硫酸乙酰肝素的乙酰肝素酶切割有关的生理过程。本发明进一步涉及改变、修饰或以其它方式调节哺乳动物乙酰肝素酶在细胞中表达水平的方法。本发明的另一方面涉及能结合和/或抑制哺乳动物乙酰肝素酶的免疫活性分子,尤其是单克隆抗体。本发明的再另一方面涉及乙酰肝素酶作为促进创伤愈合过程的药剂的应用。

Description

编码哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶的分离的核酸分子及其应用
发明领域
本发明涉及分离的或重组的哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶、多肽和肽，尤其是人血小板乙酰肝素酶、编码它们的基因序列，及其在例如化学化合物、蛋白质、多肽、小分子及大分子的测定及表征中的应用，这些物质能抑制转移、血管发生、血管成形术诱导的再狭窄、动脉粥样硬化、炎症、促进创伤愈合和以其它方式调节与硫酸乙酰肝素的乙酰肝素酶(heparanase)切割有关的生理过程。本发明进一步涉及改变、修饰或以其它方式调节哺乳动物之乙酰肝素酶在细胞中表达水平的方法。本发明的另一方面涉及能结合和／或抑制哺乳动物之乙酰肝素酶的免疫活性分子，尤其是单克隆抗体。本发明的再另一方面涉及乙酰肝素酶作为抑制新血管形成过程的药剂的应用。概要
在叙述的最后收集了本说明书用数字提及的出版物的书目细节。
本说明书具有用程序PatentIn 2．0版制备的核苷酸和氨基酸序列信息，示于书目后。序列表中每一核苷酸或氨基酸序列表示为数字指示&#60210&#62，其后为序列标识(例如&#60210&#621、&#60210&#622等)。序列的长度、类型(DNA、蛋白质(PRT)等)和每种核苷酸或氨基酸序列的来源生物分别用数字指示范围&#60211&#62、&#60212&#62和&#60213&#62提供的信息表示。本说明书提及的核苷酸和氨基酸序列表示为数字指示范围&#60400&#62之后为序列标识(例如&#60400&#621、&#60400&#622等)中提供的信息。
此处提及的核苷酸序列的名称由IUPAC-IUB生物化学命名委员会所推荐，其中A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，T代表胸腺嘧啶，Y代表嘧啶残基，R代表嘌呤残基，M代表腺嘌呤或胞嘧啶，K代表鸟嘌呤或胸腺嘧啶，S代表鸟嘌呤或胞嘧啶，W代表腺嘌呤或胸腺嘧啶，H代表除鸟嘌呤之外的核苷酸，B代表除腺嘌呤之外的核苷酸，V代表除胸腺嘧啶之外的核苷酸，D代表除胞嘧啶之外的核苷酸，N代表任何核苷酸残基。
此处提及的氨基酸残基的名称示于表Ⅰ中。
在此使用时，术语“来源于”是指指定的整体可以从特定来源获得，虽然不必直接从该来源获得。
在本说明书中，除非内容另外需要，否则单词“包含(comprise)”或其变形如“comprises”或“comprising”可认为是指包含指定的步骤或组件或整体或者步骤或组件或整体群，而不排除其它任何步骤或组件或整体或者组件或整体群。
发明背景
血液运载的恶性肿瘤和白细胞的组织侵入包括其对血管内皮腔表面的粘附、通过血管内皮细胞层、及随后经历一组分泌的和／或细胞表面的蛋白酶和糖苷酶活性的底部基板下和胞外基质(ECM)的降解(Nakajima等人，1983；Schmitt等人，1992；Vlodavsky等人，1992)。
研究显示，尽管毛细管内皮对转移性肿瘤细胞的最初捕获是不依赖血小板的，但其后不久发生的血小板聚集能引起血小板活化和脱粒，导致裂隙形成和内皮细胞的收缩，使下面的基膜暴露于肿瘤细胞的粘附(Tanaka等人，1986；Crissman等人，1985；Yahalom等人，1985)。
基板和下面的结缔组织基质主要由纤连蛋白、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白和玻连蛋白的复杂网络组成，其中每一种都可与包埋于基质中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的硫酸乙酰肝素(HS)侧链相互作用(Yurchenco和Schittny，1990)。
HS链一般由被低度硫酸化或非硫酸化区域(主要是1→4连接于β-D-葡糖醛酸的N-乙酰化葡糖胺的二糖单位)隔开的成簇硫酸化二糖单位(主要是1→4连接于α-L-艾杜糖醛酸残基的N-硫酸化葡糖胺)组成(Turnbull和Gallagher，1990；1991)。
在进行本发明的工作中，发明者设法分离并表征了能切割包埋于基质中的HSPG之HS侧链的酶、蛋白质、多肽和肽及编码它们的基因序列。这样产生的基因序列提供了一种当在基质部位表达或向其转运时能帮助ECM解装配并有助于细胞迁移的工具。
本发明的基因序列进一步提供了开发大量治疗性和预防性药物化合物的方法，特别是用于抑制转移、新血管形成、血管发生、血管成形术诱导的再狭窄、动脉粥样斑块形成和炎症和／或促进创伤愈合。
发明概述
本发明的一方面提供一种分离的核酸分子，其包含编码能水解HS中糖苷键的多肽之核苷酸序列，或互补于编码该多肽的序列的核苷酸序列。
本发明的第二方面提供一种分离的核酸分子，其包含一种编码哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶(endoglucuronidase)多肽、尤其是乙酰肝素酶或其片段或衍生物的核苷酸序列，或互补于编码它们的序列的核苷酸序列。更具体而言，哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶多肽包含如&#60400&#621-11或&#60400&#6213或&#60400&#6215或&#60400&#6217或&#60400&#6219或&#60400&#6223中任一个或多个所示的氨基酸序列，或者与之至少40％相同。
本发明的另一方面提供一种分离的核酸分子，它与&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个或其同源物、类似物或衍生物所示的核苷酸序列或其互补序列至少40％相同。
本发明的再另一方面提供一种基因构建体，其表达重组内切葡糖醛酸糖苷酶活性，尤其是乙酰肝素酶活性或其活性部位。
本发明的另一方面提供一种重组哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶多肽，尤其是乙酰肝素酶或其片段或衍生物。
本发明的再另一方面涉及一种鉴定乙酰肝素酶活性调节剂的方法，该方法包括在一种潜在调节剂的存在下测定重组乙酰肝素酶活性，并且将该活性与不存在该潜在调节剂时的重组乙酰肝素酶活性相比较。
本发明的另一方面涉及哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶多肽尤其是哺动物乙酰肝素酶的抑制剂。本发明所包括的抑制剂分子尤其可用作转移、血管发生、创伤愈合、血管成形术诱导的再狭窄、动脉硬化、动脉粥样硬化、炎症或乙酰肝素酶活性升高的其它生理性或医学病症的抑制剂。
本发明的再另一方面涉及重组乙酰肝素酶或其活性片段或衍生物的应用，用于抑制参与组织发育、炎症、创伤愈合和肿瘤转移的调节的新血管形成及其相关过程。
本发明的重组多肽也可用于硫酸化分子如HSPG和硫酸乙酰肝素分子的测序，或用来辅助硫酸化蛋白聚糖、硫酸化寡糖和硫酸乙酰肝素分子结构的确定，其中用该重组多肽从中切割硫酸乙酰肝素部分。
本发明的另一方面提供一种能结合本发明的重组内切葡糖醛酸糖苷酶多肽的免疫活性分子，尤其是能结合和／或抑制乙酰肝素酶多肽催化活性的抗体分子。本发明的抗体分子尤其可用于生物样品中乙酰肝素酶表达的诊断，特别是当患者被怀疑患有与升高的乙酰肝素酶表达有关的病症时，如癌症、转移、血管发生、血管成形术诱导的再狭窄、动脉粥样硬化或炎症等。
本发明的另一方面提供一种重组内切葡糖醛酸糖苷酶多肽，尤其是重组乙酰肝素酶多肽或其免疫活性同源物、类似物或衍生物，在生物样品的乙酰肝素酶表达的诊断中尤其是在患者样品如血清的诊断测定中用作“标准”，其中患者疑患有与升高的乙酰肝素酶表达有关的病症，如上文所列。
本发明的再另一方面涉及一种诊断人或动物患者中增强的乙酰肝素酶表达的方法，该方法包括：在足以形成抗原：抗体复合物的时间内和条件下，使能结合乙酰肝素酶多肽的抗体分子与取自该患者的生物样品(如血清或分离的细胞)相接触，然后检测和／或定量所形成的复合物。根据本发明该方面的定量用包括重组乙酰肝素酶或其同源物、类似物或衍生物的标准蛋白质进行。
本发明的再另一方面涉及一种诊断人或动物患者中增强的乙酰肝素酶表达的方法，该方法包括：在足以发生杂交的时间内与条件下，使取自该患者、含有编码乙酰肝素酶的mRNA的生物样品或取自该患者、编码乙酰肝素酶的分离的mRNA样品与一种分离的核酸分子接触，该核酸分子包含能结合编码乙酰肝素酶的mRNA的核苷酸序列，然后检测和／或定量该杂交。
附图简述
图1是经SDS-PAGE后纯化人血小板乙酰肝素酶和去糖基化的纯化人血小板乙酰肝素酶的照片图示。用二硫赤藓糖醇还原纯化的血小板乙酰肝素酶，在10％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并用考马斯亮蓝R250染色。泳道1，分子量标准(磷酸化酶b(94kDa)，牛血清白蛋白(67kDa)，卵清蛋白(43kDa)，碳酸酐酶(30kDa)，大豆胰蛋白酶抑制剂(20kDa)和α-乳清蛋白(14kDa))；泳道2，人血小板乙酰肝素酶，泳道3，膜相关人血小板乙酰肝素酶。人血小板乙酰肝素酶a)不与酶(泳道4)、与b)N-糖苷酶F(泳道5)和c)N-聚糖酶F、O-糖苷酶和神经氨酸酶(泳道6)一起温育。
图2是表达载体pcDNA3(Invitrogen)的图示，显示巨细胞病毒IE启动子(PCMV)、BGH终止子(BGH pA)、SV40复制起点(SV40 ori)、新霉素抗性基因(Neomycin)、SV40终止子(SV40 pA)、细菌复制起点(ColE1)和氨苄青霉素抗性基因(Ampicillin)的定位。本发明的内切葡糖醛酸糖苷酶编码序列插入侧翼为T7和SP6启动子序列的多克隆位点(HindⅢ．．．ApaⅠ)中。
图3是一份照片图示，显示与放射性标记的&#60400&#6212中所示的全长人乙酰肝素酶cDNA杂交后，来源于非免疫心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾和胰组织的mRNA的Northern印迹杂交。组织来源标于每一泳道的上方。大小标记(kb)标于图的左侧。
图4是一份照片图示，显示与放射性标记的&#60400&#6212中所示的全长人乙酰肝素酶cDNA杂交后，来源于免疫脾、淋巴结、胸腺、外周血(PB)白细胞、骨髓和胎肝组织的mRNA的Northern印迹杂交。组织来源标于每一泳道的上方。大小标记(kb)标于图的左侧。
图5是一份基因组Southern印迹杂交的照片图示，显示人乙酰肝素酶基因的基因组构和拷贝数。用限制酶EcoRⅠ(泳道1和2)、BamHⅠ(泳道3和4)、HindⅢ(泳道5和6)或PstⅠ(泳道7和8)消化两个个体(标记为1和2的泳道)的基因组DNA，经1％(w／v)琼脂糖凝胶电泳分离，转移至尼龙膜上，与放射性标记的全长人乙酰肝素酶cDNA克隆(&#60400&#6212)杂交。所用的酶和DNA来源标于泳道上方。大小标记(kb)标于图的左侧。图右手侧的箭头表示个体2中存在而个体1中不存在的多态性1．4kb PstⅠ片段的位置。
图6是一份示意图，显示人(&#60400&#6213)、小鼠(&#60400&#6217)和大鼠(&#60400&#6219)乙酰肝素酶氨基酸序列的对比。用Computer Genetics Group的PILEUP程序对比人(hu．hep)、小鼠(mu．hep)和大鼠(rat．hep)乙酰肝素酶多肽的序列(Devereaux等人，1984)。相同的氨基酸被框出。数字是指图中所示每一序列的氨基酸位置。
图7是一份图示，显示与用血小板衍生的乙酰肝素酶获得的抗血清(交叉线形柱)相比，或与肽-KLH免疫之前从兔中获得的免疫前血清(水平交叉线形柱)相比，用源于人乙酰肝素酶残基423-437(&#60400&#6223)并与KLH偶联的15个氨基酸长的肽获得的抗血清的ELISA滴度(填满的柱)。数据显示所试每一血清稀释度(x轴)的光密度(y轴)。标有CON的样品是非血清的对照样品。
优选实施方案详述
本发明的一方面提供一种分离的核酸分子，其包含编码能切割HSPG之HS侧链的多肽的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
术语“分离的”意思是，指定的整体或整体群具有一种不同于天然存在的形式，优选地其中一种或多种污染物已经得到清除。
在此使用时，术语“切割”或类似术语包括HS的一个或多个糖苷键的水解。
本发明的核酸分子可以是RNA或DNA(例如cDNA)、单链或双链、线性或共价闭合的。核酸分子也可以是对应于完整基因或其基本部分或对应于其片段或衍生物的基因组DNA。核苷酸序列可以对应于天然存在的核苷酸序列，或者可能含有单个或多个核苷酸置换、缺失或添加。
更具体而言，分离的核酸分子可以是下列分子中的一种或多种：
(ⅰ)一种典型的基因组基因，它由转录和／或翻译调节序列和／或编码区和／或非翻译序列(即，内含子、5’-和3’-非翻译序列)组成；
(ⅱ)mRNA或cDNA，其对应于编码区或其部分或者一种或多种外显子序列，和该基因的5’-非翻译序列和／或3’-非翻译序列；
(ⅲ)一种结构区，其对应于编码区或其部分或者一种或多种外显子序列；和／或
(ⅳ)一种合成的或融合分子，其编码功能性内切葡糖醛酸糖苷酶多肽或乙酰肝素酶多肽或其同源物、类似物或衍生物。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，分离的核酸分子是cDNA分子。
在此使用时，术语“多肽”是指任一多聚体，其至少含有包括无酶活性肽分子或酶分子或者一种融合分子的酶活性蛋白质的氨基酸。“多肽”的提法也包括天然存在的分子和重组产生的分子两者。
在本发明的一个优选的实施方案中，分离的核酸分子的多肽产物是内切葡糖醛酸糖苷酶多肽或其同源物、类似物或衍生物。
在此使用时，术语“内切葡糖醛酸糖苷酶”是指至少能从硫酸化蛋白聚糖分子上切下硫酸化二糖或硫酸化多糖的任一肽、多肽、蛋白质或酶分子。
本领域的技术人员知晓内切葡糖醛酸糖苷酶包括乙酰肝素酶和内切糖苷酶两者，尤其是至少能从蛋白聚糖上水解或以其它方式切割一种或多种硫酸化二糖单位的那些。然而，不是所有的内切葡糖醛酸糖苷酶都对所有蛋白聚糖底物具有高活性，该类酶通常存在一定程度的底物特异性。
例如，鼠黑素瘤B16乙酰肝素酶切割肝素和HS，虽然不是以相同的效率(Graham和Underwood，1996)。另一方面，肿瘤产生的乙酰肝素酶不能降解内皮细胞表面HSPG(Hennes等人，1988)，而人血小板能降解内皮细胞表面HSPG、肿瘤衍生的HSPG、ECM结合的HSPC和在结构上更类似于肝素的其它结构(Hoogewerf等人，1995；Bartlett等人，1995 a，b；Yahalom等人，1984；Castellot Jr．等人，1982；Wasteson等人，1976；Wasteson等人，1977；Gamse等人，1978)，可能是借助于此处所述的乙酰肝素酶活性。
在此使用时，术语“乙酰肝素酶”是指至少能从与内皮细胞表面和／或胞外基质(ECM)和／或肿瘤细胞和／或肝素结合的HSPG上去除HS侧链的任一肽、多肽、蛋白质或酶分子，包括重组分子、分离的天然存在的同工型和融合多肽。
优选地，内切葡糖醛酸糖苷酶多肽是乙酰肝素酶或其同源物、类似物或衍生物，更优选地是至少能通过从中切割HS侧链降解内皮细胞表面HSPG的乙酰肝素酶多肽，甚至更优选地是至少能降解内皮细胞表面HSPG和ECM结合HSPG的乙酰肝素酶多肽，甚至更优选地是至少能切割内皮细胞表面HSPG、肿瘤衍生的HSPG、ECM结合HSPG和肝素样HS侧链包括肝素的乙酰肝素酶多肽。
如此处所例举的，本发明者曾经从人血小板中分离了乙酰肝素酶，测定了乙酰肝素酶多肽的N端氨基酸序列和胰蛋白酶消化的肽的氨基酸序列，并利用该氨基酸序列分离了编码血小板乙酰肝素酶的cDNA分子。
因此，在本发明的一个特别优选的实施方案中，提供了一种分离的核酸分子，其编码乙酰肝素酶多肽或互补于编码该多肽的分离的核酸分子，该多肽至少包含与&#60400&#621-11或&#60400&#6213或&#60400&#6215或&#60400&#6217或&#60400&#6219或&#60400&#6223中任一个所示序列至少40％相同的氨基酸序列。
优选地，与&#60400&#621-11或&#62400&#6213或&#60400&#6215或&#60400&#6217或&#60400&#6219或&#60400&#6223中任一个的百分相似性至少约为60％，更优选地至少约80％，甚至更优选地至少约90％。
在确定两种氨基酸序列是否落入这些百分比限度以内时，本领域的技术人员应当知道，进行序列的并排比较或多重对比是必要的。在这些比较或对比中，在不相同的残基的定位过程中将出现差异，这取决于用来进行对比的算法。在本文内容中，两种或多种氨基酸序列之间百分比同一性或相似性的提法分别是指，用如本领域技术人员所知的任一标准算法确定的所述序列之间相同和相似残基的数量。例如，可以用GAP程序计算氨基酸序列同一性或相似性，和／或可以用Computer Genetics Group，Inc．，University Research Park，Madison，Wisconsin，美国的PILEUP程序对比(Devereaux等人，1984)。GAP程序利用Needleman和Wunsch(1970)的算法使相同／相似残基的数量达到最大，并且使对比中序列空隙的数量和或长度减至最小。此外或另外，比较超过两种的氨基酸序列时，使用Thompson等人(1994)的ClustalW程序。
在一个备择实施方案中，本发明的分离的核酸分子编码乙酰肝素酶多肽或互补于编码该多肽的分离的核酸分子，该多肽至少包含与&#60400&#621-11或&#60400&#6213或&#60400&#6215或&#60400&#6217或&#60400&#6219或&#60400&#6223中任一个基本相同的氨基酸序列。
在此使用时，术语“基本相同”或类似术语包括与指定核苷酸序列或氨基酸序列至少约95％相同的任一序列，包括所述指定核苷酸序列或氨基酸序列的任一同源物、类似物或衍生物。
为了命名，&#60400&#621-11所示的氨基酸序列涉及由纯化乙酰肝素酶多肽衍生的胰蛋白酶消化肽的氨基酸序列。人乙酰肝素酶多肽的完整氨基酸序列示于&#60400&#6213中。用来产生如实施例8所述适于诊断用途的抗体之人乙酰肝素酶多肽衍生物的氨基酸序列示于&#60400&#6223中。变异人乙酰肝素酶多肽的完整氨基酸序列示于&#60400&#6215中。小鼠乙酰肝素酶多肽的部分氨基酸序列示于&#60400&#6217中。大鼠乙酰肝素酶多肽的部分氨基酸序列示于&#60400&#6219中。
在本文内容中，内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶多肽的“同源物”是指那些多肽、酶或蛋白质，它们虽然可能有任何氨基酸置换、添加或缺失，但具有与人乙酰肝素酶多肽相似的活性，并且与之至少40％相同。同源物可以从与此处例举的乙酰肝素酶多肽相同的种中或从不同种中分离或衍生。
此外，同源多肽的氨基酸可以替换为具有相似性质如疏水性、亲水性、疏水力、电荷或抗原性等的其它氨基酸。
“类似物”包括功能性或非功能性多肽，它们与人乙酰肝素酶至少有约40％的氨基酸同一性，尽管存在任何非天然存在的氨基酸类似物。
与在此所述的内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶多肽有关的术语“衍生物”，在下文中是指由乙酰肝素酶多肽衍生的突变体、部分或片段，它们也许具有或者也许不具有功能性蛋白质的活性。衍生物包括修饰的肽，其中配体与此处包括的一种或多种氨基酸残基相连接，如碳水化合物、酶、蛋白质、多肽或报道分子(如放射性核素或荧光化合物)。本发明特别涉及主题肽的糖基化、荧光、酰化或烷基化形式。另外，包含此处公开的氨基酸序列片段或部分的乙酰肝素酶衍生物也落入本发明的范围之内，如包含两个或多个拷贝主题多肽的同聚物或杂聚物。衍生肽的方法在本领域中众所周知。
置换包括其中基本多肽(即乙酰肝素酶)的氨基酸被替换为天然存在或非常规的不同氨基酸残基的氨基酸改变。这些置换可以分类为“保守的”，在此情况下，基本多肽所含的氨基酸残基被替换为有相似特性的另一种天然存在的氨基酸，例如GlyAla、ValIleLeu、AspGlu、LysArg、AsnGln或PheTrpTyr。
本发明所包括的置换也可以是“非保守的”，其中基本多肽中存在的氨基酸残基被替换为具有不同性质的一种氨基酸，如不同组别的天然存在的氨基酸(例如，用丙氨酸替换一种带电的或疏水性氨基酸)，或者另外，其中天然存在的氨基酸被替换为一种非常规的氨基酸。
氨基酸置换一般是单残基置换，但也可以是多残基置换，是群集的或分散的。
天然存在的氨基酸包括表1所列的氨基酸。本发明包括的非常规氨基酸包括但不限于表2所列的氨基酸。
氨基酸缺失通常是大约1-10个氨基酸残基的水平，而插入可以是任何长度的。可以对N端、C端进行缺失和插入，或者可能是内部缺失或插入。通常，氨基酸序列内的插入小于氨基端或羧基端融合，为1-4个氨基酸残基的水平。
本领域的技术人员应当知道，当提供了编码基本多肽的分离的核酸分子时，有多种产生该多肽的同源物、类似物或衍生物的方法，例如，尤其是DNA的定点诱变和应用诱变寡核苷酸引物的聚合酶链反应。
因此，本发明显然扩展到本发明的内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶多肽的任一和所有同源物、类似物或衍生物。
              表1氨基酸      三字母缩写    单字母缩写丙氨酸         Ala          A精氨酸         Arg          R天冬酰胺       Asn          N天冬氨酸       Asp          D半胱氨酸       Cys          C谷氨酰胺       Gln          Q谷氨酸         Glu          E甘氨酸         Gly          G组氨酸         His          H异亮氨酸       Ile          I亮氨酸         Leu          L赖氨酸         Lys          K甲硫氨酸       Met          M苯丙氨酸       Phe          F脯氨酸         Pro          P丝氨酸         Ser          S苏氨酸         Thr          T色氨酸         Trp          W酪氨酸         Tyr          Y缬氨酸         Val          V上述任一氨基酸 Xaa         X
                                  表2非常规氨基酸          代码      非常规氨基酸         代码α-氨基丁酸           Abu       L-N-甲基丙氨酸       Nmalaα-氨基-α-甲基丁酸   Mgabu     L-N-甲基精氨酸       Nmarg氨基环丙烷羧酸        Cpro      L-N-甲基天冬酰胺     Nmasn
                            L-N-甲基天冬氨酸     Nmasp氨基异丁酸            Aib       L-N-甲基半胱氨酸     Nmcys氨基降冰片基羧酸      Norb      L-N-甲基谷氨酰胺     Nmgln
                            L-N-甲基谷氨酸       Nmglu环己基丙氨酸          Chexa     L-N-甲基组氨酸       Nmhis环戊基丙氨酸          Cpen      L-N-甲基异亮氨酸     NmileD-丙氨酸              Dal       L-N-甲基亮氨酸       NmleuD-精氨酸              Darg      L-N-甲基赖氨酸       NmLysD-天冬氨酸            Dasp      L-N-甲基甲硫氨酸     NmmetD-半胱氨酸            Dcys      L-N-甲基正亮氨酸     NmnleD-谷氨酰胺            Dgln      L-N-甲基正缬氨酸     NmnvaD-谷氨酸              Dglu      L-N-甲基鸟氨酸       NmornD-组氨酸              Dhis      L-N-甲基苯丙氨酸     NmpheD-异亮氨酸            Dile      L-N-甲基脯氨酸       NmproD-亮氨酸              Dleu      L-N-甲基丝氨酸       NmserD-赖氨酸              Dlys      L-N-甲基苏氨酸       NmthrD-甲硫氨酸            Dmet      L-N-甲基色氨酸       NmtrpD-鸟氨酸              Dorn      L-N-甲基酪氨酸       NmtyrD-苯丙氨酸            Dphe      L-N-甲基缬氨酸       NmvalD-脯氨酸              Dpro      L-N-甲基乙基甘氨酸   NmetgD-丝氨酸              Dser      L-N-甲基叔丁基甘氨酸 NmtbugD-苏氨酸              Dthr      L-正亮氨酸           NleD-色氨酸              Dtrp      L-正缬氨酸           NvaD-酪氨酸              Dtyr     α-甲基氨基异丁酸     MaibD-缬氨酸              Dval     α-甲基-γ-氨基丁酸   MgabuD-α-甲基丙氨酸       Dmala    α-甲基环己基丙氨酸   MchexaD-α-甲基精氨酸       Dmarg    α-甲基环戊基丙氨酸   Mcpen
                              表2(续)非常规氨基酸          代码    非常规氨基酸             代码D-α-甲基天冬酰胺    Dmasn    α-甲基-α-萘基丙氨酸   ManapD-α-甲基天冬氨酸    Dmasp    α-甲基青霉胺           MpenD-α-甲基半胱氨酸    Dmcys    N-(4-氨基丁基)甘氨酸    NgluD-α-甲基谷氨酰胺    Dmgln    N-(2-氨基乙基)甘氨酸    NaegD-α-甲基组氨酸      Dmhis    N-(3-氨基丙基)甘氨酸    NornD-α-甲基异亮氨酸    Dmile    N-氨基-α-甲基丁酸      NmaabuD-α-甲基亮氨酸      Dmleu    α-萘基丙氨酸           AnapD-α-甲基赖氨酸      Dmlys    N-苄基甘氨酸            NpheD-α-甲基甲硫氨酸    Dmmet    N-(2-氨甲酰乙基)甘氨酸  NglnD-α-甲基鸟氨        Dmorn    N-(氨甲酰甲基)甘氨酸    NasnD-α-甲基苯丙氨酸    Dmphe    N-(2-羧乙基)甘氨酸      NgluD-α-甲基脯氨酸      Dmpro    N-(羧甲基)甘氨酸        NaspD-α-甲基丝氨酸      Dmser    N-环丁基甘氨酸          NcbutD-α-甲基苏氨酸      Dmthr    N-环庚基甘氨酸          NchepD-α-甲基色氨酸      Dmtrp    N-环己基甘氨酸          NchexD-α-甲基酪氨酸      Dmty     N-环癸基甘氨酸          NcdecD-α-甲基缬氨酸      Dmval    N-环十二烷基甘氨酸      NcdodD-N-甲基丙氨酸       Dnmala   N-环辛基甘氨酸          NcoctD-N-甲基精氨酸       Dnmarg   N-环丙基甘氨酸          NcproD-N-甲基天冬酰胺     Dnmasn   N-环十一烷基甘氨酸      NcundD-N-甲基天冬氨酸     Dnmasp   N-(2，2-二苯乙基)甘氨酸 NbhmD-N-甲基半胱氨酸     Dnmcys   N-(3，3-二苯丙基)甘氨酸 NbheD-N-甲基谷氨酰胺     Dnmgln   N-(3-胍基丙基)甘氨酸    NargD-N-甲基谷氨酸       Dnmglu   N-(1-羟乙基)甘氨酸      NthrD-N-甲基组氨酸       Dnmhis   N-(羟乙基)甘氨酸        NserD-N-甲基异亮氨酸     Dnmile   N-(咪唑乙基)甘氨酸      NhisD-N-甲基亮氨酸       Dnmleu   N-(3-吲哚乙基)甘氨酸    NhtrpD-N-甲基赖氨酸       Dnmlys   N-甲基-γ-氨基丁酸      NmgabuN-甲基环己基丙氨酸   Nmchexa  D-N-甲基甲硫氨酸        DnmmetD-N-甲基鸟氨酸       Dnmorn   D-N-甲基环戊基丙氨酸    Nmcpen
                                    表2(续)非常规氨基酸                 代码     非常规氨基酸               代码N-甲基甘氨酸                 Nala     D-N-甲基苯丙氨酸          DnmpheN-甲基氨基异丁酸             Nmaib    D-N-甲基脯氨酸            DnmproN-(1-甲基丙基)甘氨酸         Nile     D-N-甲基丝氨酸            DnmserN-(2-甲基丙基)甘氨酸         Nleu     D-N-甲基苏氨酸            DnmthrD-N-甲基色氨酸               Dnmtrp   N-(1-甲基乙基)甘氨酸      NvalD-N-甲基酪氨酸               Dnmtyr   N-甲基萘基丙氨酸          NmanapD-N-甲基缬氨酸               Dnmval   N-甲基青霉胺              Nmpenγ-氨基丁酸                  Gabu     N-(对羟苯基)甘氨酸        NhtyrL-叔丁基甘氨酸               Tbug     N-(硫代甲基)甘氨酸        NcysL-乙基甘氨酸                 Etg      青霉胺                    PenL-高苯丙氨酸                 Hphe     L-α-甲基丙氨酸           MalaL-α-甲基精氨酸              Marg     L-α-甲基天冬酰胺         MasnL-α-甲基天冬氨酸            Masp     L-α-甲基叔丁基甘氨酸     MtbugL-α-甲基半胱氨酸            Mcys     L-甲基乙基甘氨酸          MetgL-α-甲基谷氨酸              Mgln     L-α-甲基谷氨酸           MgluL-α-甲基组氨酸              Mhis     L-α-甲基高苯丙氨酸       MhpheL-α-甲基异亮氨酸            Mile     N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸  NmetL-α-甲基亮氨酸              Mleu     L-α-甲基赖氨酸           MlysL-α-甲基甲硫氨酸            Mmet     L-α-甲基正亮氨酸         MnleL-α-甲基正缬氨酸            Mnva     L-α-甲基鸟氨酸           MornL-α-甲基苯丙氨酸            Mphe     L-α-甲基脯氨酸           MproL-α-甲基丝氨酸              Mser     L-α-甲基苏氨酸           MthrL-α-甲基色氨酸              Mtrp     L-α-甲基酪氨酸           MtyrL-α-甲基缬氨酸              Mval     L-N-甲基高苯丙氨酸        NmhpheN-(N-(2，2-二苯基乙基)氨    Nnbhm     N-(N-(3，3-二苯基丙基)氨甲Nnbhe甲酰甲基)甘氨酸                       酰甲基)甘氨酸1-羧基-1-(2，2-二苯基乙      Nmbc基氨基)环丙烷
本发明的分离的核酸分子优选地由哺乳动物来源产生，如人或实验动物，尤其是如小鼠、兔或大鼠。在一个特别优选的实施方案中，分离的核酸分子来源于人。
在此使用时，术语“来源于”是指整体或整体群从特定来源的起源，但不排除该整体或整体群的其它可能的来源。
本发明显然扩展到主题核酸分子的所有组织来源，特别是其中分离的核酸分子包含基因组DNA。
编码内切葡糖醛酸糖苷酶多肽或乙酰肝素酶多肽的mRNA的优选组织来源包括肝、胎盘、脾、血小板、巨噬细胞和肿瘤细胞，例如但不限于尤其是黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞和B16肿瘤细胞。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，分离的核酸分子来源于人血小板、小鼠脾T细胞或大鼠MAT细胞。
本发明的另一方面涉及一种核酸分子，其编码一种内切葡糖醛酸糖苷酶多肽或互补于编码该多肽的核酸分子，其中该核酸分子至少在低严格条件下能与&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个所示核酸分子或其互补链杂交。
为了命名，&#60400&#6212所示核苷酸序列涉及编码人血小板乙酰肝素酶(即本发明所包括的一种内切葡糖醛酸糖苷酶)的cDNA。&#60400&#6214所示核苷酸序列涉及编码人血小板乙酰肝素酶的变异cDNA。&#60400&#6216所示核苷酸序列涉及激活的小鼠脾T细胞衍生的部分乙酰肝素酶cDNA片段，该片段是通过利用命名为BamHepN和mhep3的寡核苷酸的PCR产生的。&#60400&#6218所示核苷酸序列涉及大鼠MAT细胞衍生的部分乙酰肝素酶cDNA片段，该片段是通过利用命名为BamHepN和dT-Not的寡核苷酸的PCR产生的。
本领域的技术人员应当知道，通过在低严格条件下杂交可以分离&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个所示的人血小板乙酰肝素酶cDNA序列的变体。这些变体包括来源于人或其它哺乳动物的任何基因组序列、cDNA序列、mRNA或其它分离的核酸分子。也不排除其它变体。
优选地，核酸分子进一步包含一种核苷酸序列，该序列编码乙酰肝素酶多肽、更优选地具有上述催化活性的乙酰肝素酶多肽，或互补于编码上述多肽的核苷酸序列。
更优选地，根据本发明此方面的分离的核酸分子至少在中严格条件下能与&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个所示的核酸分子或其互补链杂交。
甚至更优选地，根据本发明此方面的分离的核酸分子至少在高严格条件下能与&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个所示的核酸分子或其互补链杂交。
为了定义严格性的水平，在此将低严格性定义为28℃下在6×SSC缓冲液、0．1％(w／v)SDS中进行杂交和／或洗涤。通常，通过降低SSC缓冲液浓度和／或提高SDS浓度和／或提高杂交(和／或洗涤)温度能提高严格性。中严格性包括42℃-65℃下在0．2×SSC-2×SSC缓冲液、0．1％(w／v)SDS中进行的杂交和／或洗涤，而高严格性包括在至少55℃的温度下在0．1×SSC-0．2×SSC缓冲液、0．1％(w／v)SDS中进行的杂交和／或洗涤。杂交及洗涤条件为本领域普通技术人员所周知。只是为了进一步阐明，在Ausubel等人(1987)的2．10．8-2．10．16页有影响核酸分子间杂交的参数的参考文献，其在此引用作为参考。
在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，分离的核酸分子进一步包含一种核苷酸序列，该序列与&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个或其互补链衍生的至少10个邻接核苷酸至少40％相同。
更优选地，分离的核酸分子进一步包含一种核苷酸序列，该序列与&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个所示序列或其互补链衍生的至少50个邻接核苷酸至少40％相同。
确定两种核苷酸序列是否处于这些百分比限度之内时，本领域的技术人员应当知道，进行序列的并排比较或多重对比是必要的。在这些比较或对比中，在不相同的残基的定位过程中可能出现差异，这取决于用来进行对比的算法。在本文内容中，两种或多种氨基酸序列之间百分比同一性的提法是指，如用本领域技术人员所知的任一标准算法确定的所述序列之间相同残基的数量。例如，可以对比核苷酸序列，并用ComputerGenetics Group，Inc．，University Research Park，Madison，Wisconsin，美国的BESTFIT程序或其它合适的程序计算其同一性(Devereaux等人，1984)。
本发明尤其是涉及一种核酸分子，其能编码一种哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶多肽，尤其是哺乳动物乙酰肝素酶多肽，例如来源于血小板的人乙酰肝素酶。本发明明确构想了此处具体描述的基因之外的来源于人血小板的其它基因。
编码哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶多肽(如人乙酰肝素酶多肽)或互补于编码该多肽的序列的基因序列可能对应于天然存在的序列，或者可能由于一个或多个核苷酸置换、缺失和／或添加而不同。因此，本发明扩展到任何内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶基因及其任何功能性基因、突变体、衍生物、部分、片段、同源物或类似物，或非功能性分子，但这些非功能性分子至少可用作如基因探针或该基因的酶学或化学合成中的引物序列，或者用于免疫活性重组分子的产生。
在一个特别优选的实施方案中，用此处例举的本发明的基因序列从属于相同或不同种的其它细胞、组织或器官类型中、或从另一种哺乳动物种尤其是实验哺乳动物如大鼠、小鼠或兔的细胞、组织或器官中鉴定并分离相似的基因。
根据该实施方案，来源于所述其它细胞、组织或器官的基因组DNA或mRNA或cDNA与有效量的包含&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个的第一种乙酰肝素酶编码基因序列或该第一种序列的至少10个邻接核苷酸衍生的互补序列、同源物、类似物或衍生物杂交，然后检测该杂交。
为此目的，核苷酸序列的“同源物”是指一种分离的核酸分子，它与本发明的核酸分子或其互补核苷酸序列基本相同，尽管在该序列内存在一种或多种核苷酸置换、插入、缺失或重排。
此处所述核苷酸序列的“类似物”是指与本发明的核酸分子或其互补核苷酸序列基本相同的分离的核酸分子，尽管存在在所述分离的核酸分子中通常不存在的任何非核苷酸组分，例如碳水化合物、放射化学试剂包括放射性核苷酸、报道分子，例如但不限于尤其是DIG、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
此处所述核苷酸序列的“衍生物”是指任一分离的核酸分子，其具有与该序列或其部分的显著序列相似性。通常，可以对本发明的核苷酸序列进行诱变，以产生单个或多个核苷酸置换、缺失和／或插入。本发明的核苷酸序列的核苷酸插入衍生物包括5’端和3’端融合，以及一个或多个核苷酸或核苷酸类似物的序列内插入。插入的核苷酸序列变体是向该序列核苷酸序列中的预定位点引入的一个或多个核苷酸或核苷酸类似物的变体，尽管对得到的产物进行适当筛选时随机插入也是可能的。缺失变体的特征在于一个或多个核苷酸从核苷酸序列中的去除。置换的核苷酸变体是已经除去序列中的至少一个核苷酸并在其位置插入不同核苷酸或核苷酸类似物的变体。
在一个特别优选的实施方案中，用一种能产生可识别信号的报道分子(例如放射性同位素，如32p或35S或生物素化分子)标记编码乙酰肝素酶的基因序列。
优选地，第一种基因序列包含由&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中的任一个或其互补链、同源物、类似物或衍生物衍生的至少50个邻接核苷酸，甚至更优选地至少100个邻接核苷酸，甚至更优选地至少500个邻接核苷酸。
这样鉴定的相关基因序列可以是重组形式、位于病毒颗粒、噬菌体颗粒、酵母细胞、动物细胞或植物细胞中。
本发明构想的一种备择方法包括，使由此处例举的乙酰肝素酶编码序列衍生的两种核酸“引物分子”与一种至少包含编码有关基因序列或其功能部分的核苷酸序列的核酸“模板分子”杂交，其中第一引物包含由&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个或其同源物、类似物或衍生物衍生的邻接核苷酸，第二引物包含与&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218或其同源物、类似物或衍生物互补的邻接核苷酸，服从第一和第二引物彼此不互补的附加条件。用聚合酶链反应这种本领域技术人员众所周知的技术酶学扩增模板分子的特定核酸分子拷贝。
在一个优选实施方案中，每种核酸引物分子至少10个核苷酸长，更优选地至少20个核苷酸长，甚至更优选地至少30个核苷酸长，再更优选地至少40个核苷酸长，甚至再更优选地至少50个核苷酸长。
此外，核酸引物分子包含任何核苷酸腺嘌呤、胞嘧啶核苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或肌苷或其功能性类似物或衍生物的组合，它们至少能被引入多核苷酸分子中而对该引物与模板分子在所用环境中的杂交没有抑制作用。
此外，一种或两种核酸引物分子可以含于其它核酸引物分子的水性混合液中，例如简并引物序列的混合物，它们由于一个或多个核苷酸置换或缺失而彼此不同。此外，一种或两种核酸引物分子可以是基本上纯的形式。
核酸模板分子可以是重组形式、在病毒颗粒、噬菌体颗粒、酵母细胞、动物细胞或植物细胞中。优选地，核酸模板分子来源于人或实验动物种。
本领域的技术人员应当知道，基本的聚合酶链反应方法有许多公知的变化，当给出&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个所示的核苷酸序列时，可用来分离编码内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶多肽的有关基因序列。例如，McPherson等人(1991)叙述了这些聚合酶链反应的变化。本发明扩展到所有这些变化在利用此处例举的核苷酸序列分离编码内切葡糖醛酸糖苷酶或编码乙酰肝素酶的有关基因序列中的应用。
可以将根据任一其它实施方案的分离的核酸分子克隆到质粒或噬菌体分子中，例如便于引物分子或杂交探针的制备，或重组基因产物的产生。这些重组质粒、粘粒、噬菌体分子或其它重组分子的产生方法为本领域的普通技术人员所周知，并且能在不进行过度实验的情况下完成。因此，本发明进一步扩展到任何重组质粒、噬菌体、粘粒或其它重组分子，其包含&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个所示的核苷酸序列或其互补序列、同源物、类似物或衍生物。
本发明的核酸分子也可用于发展表达本发明的内切葡糖醛酸糖苷酶多肽的基因构建体，从而用于重组多肽在分离的细胞或转化的组织中产生。
本发明的第三方面提供一种含有分离的核酸分子的基因构建体，该核酸分子编码哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶多肽、尤其是如此处所述的哺乳动物乙酰肝素酶多肽，或者互补于编码该多肽的核酸分子。
在一个最优选的实施方案中，基因构建体是一种表达载体。
术语“表达载体”是指一种基因构建体，其中通过使分离的核酸分子与对于发生基于细胞的表达所必需的适当调节序列(如启动子和终止子)有效连接，以可表达的形式提供该分子。在本文内容中，表达载体包括这样的基因构建体，其中编码内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶多肽的分离的核酸分子以有义方向与合适的启动子有效连接，以便于在向细胞中导入该表达载体时重组多肽的表达。表达载体也包括这样的基因构建体，其中分离的核酸分子以反义方向与合适的启动子有效连接，以便于抑制性核酸分子如反义分子、核酶或minizyme的转录。
因此，本发明的一个实施方案提供了一种表达载体，当被导入细胞系或病毒颗粒中并且在适于基因表达或者至少发生转录的条件下，它可用于重组内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶多肽或者反义分子、核酶或minizyme的产生。这些条件取决于适当细胞系和表达载体的选择，包括调节表达的启动子和终止子序列的选择，而这是本领域的技术人员所周知的。
此处“启动子”的提法应采用最广义的定义，包括典型基因组基因的转录调节序列，其包括在真核细胞中正确转录起始所必需的TATA盒，含或不含CCAAT盒序列，或者另外，在原核细胞中正确表达所必需的Pribnow盒。
启动子可能包括其它调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，它们改变了发育和／或外部刺激引起的或以组织特异方式的基因表达。优选的启动子可能含有一种或多种特异调节元件的其它拷贝，以进一步增强表达和／或改变空间表达和／或时间表达模式。例如，赋予铜诱导性的调节元件可以与引导结构基因或重组基因表达的异源启动子序列邻接，从而将铜诱导性赋予该基因的表达。
在本文内容中，术语“启动子”也用来描述合成分子或融合分子，或赋予激活或增强细胞中表达的衍生物。
启动子通常，但不是必须，位于表达受该启动子调节的结构基因的上游或5’侧。此外，包含启动子的调节元件通常位于基因转录起始位点的2kb内。
使基因或分离的核酸分子有效地处于启动子序列的控制下，意思是定位该基因或分离的核酸分子，使其表达受启动子序列控制。启动子通常位于所控制的基因的5’(上游)。在异源启动子／结构基因组合物的构建中，一般优选的是使启动子位于距基因转录起始位点一定距离处，该距离大致等同于启动子与它在天然位置所控制的基因(即衍生出启动子的基因)之间的距离。如本领域所知，能调节该距离的某些变化而不丧失启动子功能。同样，通过将调节序列元件定位于其天然位置，即衍生出该元件的基因，能确定该元件相对于置于其控制之下的异源基因的优选定位。另外，如本领域所知，也能发生该距离的某种变化。
本领域的技术人员应当认识到，启动子的选择将取决于所转化的细胞的性质，当重组酶表达时，需要本发明的基因构建体中所含的结构基因或其它基因。此外，本领域中众所周知，表达载体中所用的启动子序列也将依所需的表达水平及表达是组成型的还是调节型的而不同。
对于在真核细胞中的表达，基因构建体除本发明的核酸分子之外一般还包含启动子和任选地用来便于该核酸分子表达的其它调节序列。启动子可以由编码哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶(如乙酰肝素酶)的基因组克隆衍生，或者另外，它可能是由另一种遗传来源衍生的异源启动子。适于基因在真核细胞中表达的启动子序列在本领域中众所周知。
适用于真核表达载体中的启动子包括能调节在哺乳动物细胞、昆虫细胞如Sf9(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))细胞、酵母细胞和植物细胞中表达的启动子。用于在真核细胞中表达的优选的启动子尤其是包括多角体启动子、SV40早期启动子和巨细胞病毒(CMV-IE)启动子。
表达载体准备用于重组蛋白质产生时，进一步筛选启动子，使得它能调节细胞中的表达，以能对多肽进行任何翻译后修饰，这对于主题重组多肽具有功能性可能是必需的，如N联糖基化。本领域的技术人员可以轻易地确定适于这些目的的细胞。作为例子，可以用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行N端糖基化和此处产生的重组多肽的信号序列切割。此外，也可以按照标准方法用杆状病毒表达载体如GibcoBRL供应的pFastBac载体在Sf9(草地夜蛾)细胞中表达重组内切葡糖醛酸糖苷酶多肽。
适用于该目的的许多表达载体已被描述，并且易于获得。在一个特别优选的实施方案中，表达载体基于澳大利亚Victoria的Medos CompanyPty Ltd所提供的pcDNA3载体，它包含CMV启动子和BGH终止子序列，当编码本发明的重组内切葡糖醛酸糖苷酶多肽的分离核酸序列以相对于CMV启动子的有义方向插入该载体多克隆位点时，它们调节该多肽在真核细胞中的表达。只是为了例证，图2显示pcDNA3载体的图谱。
此处构思的适于表达的真核细胞的实例包括哺乳动物、酵母、昆虫、植物细胞或细胞系如COS、VERO、Hela、小鼠C127、中国仓鼠卵巢(CHO)、WI-38、幼仓鼠肾(BHK)、MDCK或Sf9(昆虫)细胞系。这些细胞系易于为本领域的技术人员所获得。
在原核细胞(如大肠杆菌)中表达的前提是具有有效核糖体结合位点的强启动子的应用。适于在细菌细胞(如大肠杆菌)中表达的典型启动子包括但不限于：lacz启动子、温度敏感型λL或λR启动子、T7启动子或IPTG-诱导型tac启动子。用于在大肠杆菌中表达本发明的核酸分子的许多其它载体系统在本领域中众所周知，如Ausubel等人(1987)所述。
曾经描述了含有适当启动子序列、用于在细菌中表达的许多载体，尤其是如pKC30(λL：Shimatake和Rosenberg，1981)、pKK173-3(tac：Amann和Brosius，1985)、pET-3(T7：Studier和Moffat，1986)或pQE系列表达载体(Qiagen，CA)。
合适的原核细胞尤其是包括棒状杆菌属(Corynebacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)的种和假单胞杆菌属的(Pseudomonas)种。适于该目的的细菌株在相关领域中众所周知(Ausubel等人，1987)。
术语“终止子”是指位于转录单位末端的发出转录终止信号的DNA序列，尤其是3’-非翻译DNA序列。至于用于原核细胞中转录的终止子，终止子一般包含聚腺苷酸化信号，它有利于聚腺苷酸化序列向初级转录物3’末端的添加。它们可分离自细菌、真菌、病毒、动物和／或植物。在原核及真核细胞中有活性的终止子是已知的并在文献中有描述。特别适用于本发明基因构建体的终止子的实例包括BGH聚腺苷酸化序列。
此处所述的基因构建体可进一步包含对应于细菌复制起点的基因序列和／或选择性标记基因如抗生素抗性基因，它适于该基因构建体在原核或真核细胞、组织或生物中的保持及复制。这些序列在本领域中众所周知。
选择性标记基因包括当表达时能赋予细胞对一种化合物抗性的基因，当缺乏该选择性标记基因的表达时，该化合物将阻止或减缓细胞增殖或导致细胞死亡。此处构想的优选选择性标记基因包括但不限于抗生素抗性基因，如提供对氨苄青霉素、头孢氨噻肟、庆大霉素、G-418、潮霉素、利福平、卡那霉素、新霉素、壮观霉素、四环素或其衍生物或有关化合物的抗性或可能对细胞有毒的其它任一化合物的抗性的基因。
复制起点或选择性标记基因可与那些编码重组内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶多肽的基因序列在空间上分离。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，表达载体准备用于重组哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶多肽的产生。因此，在这些实施方案中，关键是以相对于与之有效连接的启动子序列的有义方向放置编码该多肽的核苷酸序列。
优选地，产生的重组多肽是有功能的。本领域的技术人员应当认识到，尽管本发明的核酸分子来源于哺乳动物细胞，但在原核或真核细胞系中表达所编码的有功能的重组多肽是可能的。无需过多的实验即可容易地确定用于功能性重组内切葡糖醛酸糖苷酶多肽表达的适当细胞系。然而优选地，用真核细胞系表达重组多肽，更优选地用哺乳动物细胞系如上述任一种细胞系。
优选地，产生的重组多肽包含与&#60400&#621-11或&#60400&#6213或&#60400&#6215或&#60400&#6217或&#60400&#6219或&#60400&#6223中任一个或多个或其同源物、类似物或衍生物至少40％相同的氨基酸序列，更优选地包括对其任何翻译后加工，尤其是一种或多种糖基化氨基酸。
在一种备择实施方案中，作为与第二种多肽的“符合读框”之融合多肽产生了重组内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶多肽，第二种多肽是例如可检测的报道多肽，如β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、萤光素酶或其它酶或半抗原肽，如聚赖氨酸聚组氨酸或其它多肽分子。
“符合读框”意思是，将编码第一种多肽的核苷酸序列置于(即克隆或连接)与编码第二种多肽的核苷酸序列相邻的同一开放阅读框内，而在它们之间没有插入的终止密码子，使得当连接的核酸分子表达时，产生一种融合多肽，其包含与第一种和第二种多肽的单独氨基酸序列总和相应的氨基酸序列。
为了产生融合多肽，克隆编码内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶多肽或其同源物、类似物或衍生物的核酸分子，使之与编码第二种多肽的第二种核酸分子相邻，它们之间任选地由编码一种或多种氨基酸(例如：尤其是聚赖氨酸或和组氨酸)的间隔核酸分子隔开，使得第一个编码区和第二个编码区在同一开放阅读框之内，而在两个编码区之间没有插入的终止密码子。翻译时，这样产生的多肽包含第一个和第二个编码区的多肽产物的融合体。在基因构建体中应用间隔核酸分子时，希望该间隔区至少编码一种可切割的氨基酸序列，以利于第一个和第二个编码区的融合多肽产物的分离，例如凝血酶切割位点。
编码融合多肽的基因构建体进一步含有至少一个起始密码子和一个终止密码子，它们能被准备表达的细胞翻译机制所识别。
优选地，可进一步修饰编码融合多肽的基因构建体，使之包含编码靶向(targeting)信号的基因序列，其位置与编码内切葡糖醛酸糖苷酶或编码乙酰肝素酶的核苷酸序列的编码区符合读框，以将表达的重组内切葡糖醛酸糖苷酶多肽或乙酰肝素酶多肽导向胞外基质。更优选地，编码靶向信号的基因序列符合读框地位于编码内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶多肽的核苷酸序列编码区的5’端或3’端，但最优选地位于5’端。
融合多肽的产生方法为本领域的技术人员所周知。
为了产生本发明的重组内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶多肽，利用本领域技术人员公知的方法尤其是如电穿孔法、氯化钙转化或PEG融合，将此处所述的表达载体引入合适的细胞系中，产生转化的细胞或转染的细胞。随后在足以发生基因构建体所编码重组多肽的表达的时间内和条件下，温育转化或转染的细胞。表达载体进一步含有选择性标记基因时，可在一种培养基上温育转化的或转染的细胞系，该培养基至少含有一种该选择性标记基因提供对其抗性的化合物，从而便于筛选含有该表达载体并且至少表达选择性标记基因的细胞。
利用本发明所述的用于血小板乙酰肝素酶纯化的方法(实施例1)或其修改方法，可以从产生所述多肽的细胞中部分纯化如此产生的重组多肽，或将其纯化为基本上均质。
此外，以融合多肽表达重组多肽时，也能够根据其性质(例如大小、溶解度、电荷等)纯化融合多肽。此外，也可以根据该融合多肽非内切葡糖醛酸糖苷酶部分的性质，如底物亲和性纯化该融合多肽。纯化后，可以切割融合多肽，释放出本发明的完整内切葡糖醛酸糖苷酶多肽。
分离的或纯化的重组内切葡糖醛酸糖苷酶多肽，尤其是重组乙酰肝素酶，可用于希望抑制新血管形成和与调节组织发育、炎症、创伤愈合和／或肿瘤转移有关的过程的任何用途。
另外，分离的或纯化的重组内切葡糖醛酸糖苷酶多肽，尤其是重组乙酰肝素酶，可用来辅助硫酸化分子结构和／或序列的测定，尤其是至少含有硫酸化蛋白聚糖、硫酸化寡糖或硫酸乙酰肝素残基或侧链的硫酸化分子。利用重组多肽的功能性质，可在足以从其上切割硫酸化寡糖部分的时间和条件下，在本发明的重组多肽的存在下消化多种硫酸化分子，必要时可以用质谱法、红外光谱法、核磁共振(NMR)波谱法或紫外光谱法或本领域技术人员所知的其它方法进行超微结构测定。
另外，重组内切葡糖醛酸糖苷酶多肽，尤其是重组乙酰肝素酶，可用于免疫活性分子的制备，如抗体或其功能性衍生物，包括Fab或SCABS(单链抗体)、与酶、放射性或荧光标记物偶联的抗体。本发明扩展到重组及合成的抗体和抗体杂合体。此处认为“合成抗体”包括抗体的片段和杂合体。
多克隆和单克隆抗体都可通过用本领域技术人员众所周知的方法以适当的重组多肽或其表位或其肽片段免疫而获得。
因此，本发明显然扩展到能结合哺乳动物重组内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶多肽的免疫活性分子。
更优选地，免疫活性分子是一种抗体分子。抗体分子可以是单克隆或多克隆的，并可用于发展酶联免疫吸附测定(ELISA)或其它免疫测定，以用于人或动物细胞和组织中乙酰肝素酶表达增强的快速诊断，从而辅助与此有关的病症尤其是如血管发生、血管成形术诱导的再狭窄、动脉粥样斑块形成和炎症的诊断。此处所述的本发明扩展到免疫活性分子的所有这些应用和对于其实施需要这些免疫测定的诊断测定。
多种免疫测定技术可以如美国专利号4，016，043、4，424，279和4，018，653中所述。只是作为实例，将抗重组血小板乙酰肝素酶的抗体固定于一种固体底物上，使取自待测存在乙酰肝素酶表达增强的动物之生物样品(如血清或分离的血小板)与结合的分子接触。在足以使抗体-抗原复合物形成的适当时间的温育后，加入用能产生可检测信号的报道分子标记的第二抗体并温育，保持抗体-抗原-标记的抗体三级复合物形成的足够时间。洗掉任何未反应的物质，通过观察报道分子产生的信号确定三级复合物的存在。通过对可见信号的简单观察，结果可以是定性的，或者可以通过与含有已知量的乙酰肝素酶的对照样品比较而定量。该测定的诸多变化包括同时测定，其中向结合抗体同时加入样品和标记抗体，或者包括反向测定，其中首先结合标记抗体和待测样品，温育，然后同时加入结合抗体中。这些技术为本领域技术人员所周知，细小变化的可能性将是显然的。
固体底物一般是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持体可以是试管、珠、盘或微量板的形式，或是适于进行免疫测定的其它任何表面。结合方法在本领域中众所周知，通常包括向不可溶载体上共价交联结合或物理吸附分子。
在本说明书中使用时，“报道分子”意思是一种分子，由于其化学性质它产生一种允许抗原-结合抗体检测的可分析识别的信号。检测可以是定性的或定量的。此类测定中最常用的报道分子是酶、荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)。在酶免疫测定中，一般用戊二醛或过碘酸盐使酶与第二抗体偶联。然而，易于认识到，存在本领域技术人员易于利用的多种不同偶联技术。常用的酶尤其是包括辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等。为了被相应酶水解后产生可检测的颜色变化，通常选择与特异酶一起使用的底物。使用产生荧光产物的荧光底物也是可能的。
此外，荧光化合物(如荧光素和罗丹明)可以与抗体化学偶联而不改变其结合能力。当被特定波长的光照射激活时，荧光染料标记的抗体吸收光能，诱导分子的激发态，随后是可用光学显微镜视觉检测的特征颜色的发射。在EIA中，使荧光标记的抗体与第一抗体-半抗原复合物结合。洗掉未结合的试剂后，使剩余的复合物暴露于适当波长的光下，观察到的荧光表明目标半抗原的存在。免疫荧光和EIA技术在本领域中都是完善的，对于本方法是特别优选的。然而，也可使用其它报道分子如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。熟练技术人员应当明白如何改变该方法以适合需要的目的。
免疫活性分子在纯化本发明的重组乙酰肝素酶中也是有用的。利用抗体对蛋白质进行亲和纯化的方法为本领域技术人员所周知。
在另一个实施方案中，以相对于与之有效连接的启动子序列的反义方向放置本发明的分离的核酸分子，使得该核酸分子表达时，反义分子或核酶分子转录。
在本发明的内容中，反义分子是一种RNA分子，它由一种核基因的互补链转录，该基因正常转录后产生能翻译为多肽的“有义”分子。因此反义分子互补于有义mRNA或其部分。尽管本发明的反义分子的作用方式不限于任何具体机制，但反义RNA分子具有通过与有义mRNA碱基配对形成双链mRNA的能力，这可阻止有义mRNA的翻译及随后多肽基因产物的合成。
核酶是合成的RNA分子，它含有与两个区互补的杂交区，每一个区至少有目标有义mRNA中的5个邻接核苷酸碱基。另外，核酶具有高度特异的内切葡糖醛酸糖苷酶活性，其自催化地切割目标有义mRNA。Haeloff和Gerlach(1988)提出了并且在国际专利申请号WO89／05852中含有核酶功能的完整描述。本发明扩展到核酶，其能定向于编码此处所述的哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶多肽、尤其是人乙酰肝素酶的有义mRNA，由此与该有义mRNA杂交并切割它，使其不再能翻译为合成功能性多肽产物。
根据该实施方案，本发明提供一种核酶或反义分子，其包含一种能与内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶mRNA的一部分形成氢键复合物的邻接核苷酸碱基序列，该部分为由&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个或其互补序列衍生的至少约10-20个邻接核苷酸，优选地由&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个或其互补序列衍生的至少约20-50个邻接核苷酸，或者更优选地由&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个或其互补序列衍生的至少约50-100个邻接核苷酸，或者再更优选地全长或基本上全长的内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶mRNA序列。
据本领域所知，可以对本发明的反义和／或核酶分子进行某些修饰尤其是包括核苷酸置换，而不破坏该分子抑制内切葡糖醛酸糖苷酶基因、尤其是人乙酰肝素酶基因表达的效能。因此本发明的范围之内包括任何核苷酸序列变体、同源物、类似物或编码它们的基因的片段，唯一的要求是该核苷酸序列变体当转录时产生一种能与所述有义mRNA分子杂交的反义和／或核酶分子。
本发明的核酶和反义分子尤其可用于预防和治疗处理与人或动物细胞中乙酰肝素酶表达增强有关的病症，尤其是如转移、血管发生、血管成形术诱导的再狭窄、动脉粥样斑块形成和炎症。根据该实施方案，可以在足以降低或防止内源乙酰肝素酶尤其是在炎症部位、肿瘤部位处、在胞外基质中或内皮表面表达的时间内和条件下，对人或动物患者施用主题反义或核酶分子或表达它们的基因构建体。
对于直接向患者施用的“裸露”反义或核酶分子，本领域的技术人员应当知道，包含修饰的核苷酸残基、核苷酸类似物或其它取代基可能是必要的，以降低或抑制或防止该分子被细胞核酸酶降解，从而提高其施用后的半衰期。这些修饰的核酸分子为本领域技术人员所周知。
对于表达此处所述主题反义或核酶分子的基因构建体，本领域技术技术应当知道，其对于向患者施用后表达反义或核酶分子是至关重要的，以达到降低乙酰肝素酶表达的本发明的有利效果。
本发明的再另一方面涉及一种鉴定乙酰肝素酶活性调节剂的方法，该方法包括在潜在调节剂存在下测定重组乙酰肝素酶活性，并将该活性与不存在该潜在调节剂时重组乙酰肝素酶的活性相比较。
在此使用时，术语“调节剂”是指任一化学化合物、分子或大分子，它能改变内切葡糖醛酸糖苷酶多肽、尤其是乙酰肝素酶多肽的酶活性，包括该酶活性的激动剂和拮抗剂两者。
优选地，本发明的方法进一步包括第一步：在足以产生可测定量的功能性重组内切葡糖醛酸糖苷酶多肽或乙酰肝素酶多肽的时间内和条件下，在细胞中表达该多肽。
术语“可测定的量”是指重组多肽的表达水平，它对于用对重组多肽酶功能特异的任一标准酶测定法测定该多肽的活性是足够的。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，调节剂是一种拮抗剂分子。根据该实施方案，在该调节剂存在下检测到的重组乙酰肝素酶活性显著低于在基本相似的反应条件下无该调节剂时检测到的活性。
如体外或体内所测定的，内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶活性的优选调节剂能抑制或降低该酶活性，与不存在该调节剂时检测到的酶活性相比，至少降低约20％，更优选地至少约50％，甚至更优选地至少约80％。
在一个备择实施方案中，内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶活性的调节剂能抑制或使该酶活性降低到足以显著降低新血管形成的水平和／或平滑肌细胞增殖的水平，或者另外，使内皮细胞表面HSPG和／或胞外基质HSPG的降解水平降低至少约20％，更优选地至少约50％，甚至更优选地至少约80％。
本发明的另一方面构思了哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶多肽酶活性、尤其是哺乳动物乙酰肝素酶的抑制剂。
在此使用时，术语“抑制剂”是指如前所述的酶活性的任一调节剂或核酸分子，如能降低哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶多肽、尤其是乙酰肝素酶多肽在细胞、组织或器官中表达水平的核酸分子，其中表达的降低导致可测定内切葡糖醛酸糖苷酶或乙酰肝素酶活性水平的降低。
本发明的抑制剂分子可以是乙酰肝素酶多肽的不可切割的底物或带负电的分子，尤其是如硫酸化寡糖、磺酸酯、磷酸酯或膦酸酯，或者能结合并抑制乙酰肝素酶多肽活性的抗体分子或催化抗体分子，或者核酸抑制分子，如能抑制乙酰肝素酶多肽在细胞中在核酸水平表达的核酶、minizyme或反义分子，唯一的条件是该抑制分子至少能降低乙酰肝素酶多肽在创伤部位、肿瘤细胞、胞外基质或内皮表面的活性。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，抑制剂分子是乙酰肝素酶多肽的不可切割的底物或底物类似物，如硫酸化寡糖、磺酸酯或包含它们的HSPG。更优选地，抑制剂是用前述对内切葡糖醛酸糖苷酶活性调节剂的鉴定方法可以鉴定的抑制剂。
根据其抑制乙酰肝素酶的能力，此处所述的抑制剂分子可用于广泛的预防和治疗用途。本发明包括的抑制剂分子尤其可用作转移、血管发生、创伤愈合、血管成形术诱导的再狭窄、动脉硬化、动脉粥样硬化、炎症或乙酰肝素酶活性增高的其它生理性或医学病症的抑制剂。
通过注射、口服(例如含药品的食物)或局部施用，向人或动物患者施用至少含有一种或多种此处所述抑制分子作为活性成分的药物组合物，可达到本发明的有利效果。
组合物可以方便地为单位剂量的形式，并且可以用本领域众所周知的任何方法制备。这些方法包括使活性成分与组成一种或多种助剂的载体相结合的步骤。通常，组合物的制备方法是，使活性成分与液体载体或磨碎的固体载体或此两者均匀且紧密地结合，然后必要时使产品成形。
适于口服的本发明的组合物可以是离散的单位，如含有预定量的活性成分的胶囊、香袋或片剂；为粉末或颗粒形式；为水性或非水性液体中的溶液或悬液形式。活性成分也可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂。
片剂可以通过任选地与一种或多种助剂一起压缩或模制而制备。通过用适当的机器压缩易流形式(如粉末或颗粒)的活性成分，任选地与粘合剂(例如惰性稀释剂、防腐崩解剂(例如淀粉乙醇酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠))、表面活性剂或分散剂混合，制备压缩的片剂。通过在适当机器中模制用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物之混合物可以制备模制的片剂。
片剂或粉末或颗粒可任选地被包被或刻痕，并且可经配制以便提供活性成分的缓慢或控制性的释放，例如使用不同比例的羟丙基甲基纤维素提供希望的释放曲线。此外，可包含增甜剂或饮食配方，以改进对于特定动物患者的适口性。任选地，这些固体组合物具有肠溶衣，以使在肠部分而不在胃中释放。
也可以以在甘油、液体聚乙二醇和／或其混合物中制备的分散剂和在油中的形式施用活性化合物。在普通贮存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂来防止微生物的生长。
适于肠胃外施用的药物形式包括用于无菌注射溶液或分散剂的临时制备的无菌水溶液(水溶性的)或分散剂和无菌粉末。所有情况中，该形式必须是无菌的，并且必须是具有易注射性的液体。它在生产和贮存条件下必须稳定，并且必须在免受微生物(如细菌和真菌)的污染作用下保存。载体可以是含有如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质、其适当混合物和植物油。例如，通过使用包被如卵磷脂、在分散剂中通过保持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂能保持适当的流动性。用多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，能进行微生物作用的预防。在许多情况中，优选地包括等渗剂，例如糖或氯化钠。例如，通过在组合物中使用延缓吸收的药剂，能实现注射组合物的延长的吸收。
无菌注射液的制备方法是，根据需要，将所需量的活性化合物掺入含有以上列举的其它不同成分的适当溶剂中，随后过滤除菌。通常，分散剂的制备方法是将不同的已灭菌的活性成分掺入含有基本分散介质和以上列举的其它所需成分的无菌载体中。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，由此产生活性成分粉末及来自预先无菌过滤的溶液之任何其它希望成分。
本发明的药物组合物中使用的载体、赋形剂和／或稀释剂对于人类或兽医用途应当是可接受的。这些载体、赋形剂和／或稀释剂为本领域的技术人员所周知。适于兽医应用的载体和／或稀释剂包括任一和所有溶剂、分散介质、水溶液、包被、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。除非任一常规介质或试剂与活性成分不相容，否则构思了其在组合物中的应用。补充的活性成分也能掺入组合物中。
本发明的组合物可以包含本领域中常规的其它试剂。例如，适于口服的组合物可以包含其它试剂如饮食配方、粘合剂、增甜剂、增稠剂、调味剂、崩解剂、包被剂、防腐剂、润滑剂和／或延时剂。合适的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、天冬苯丙二肽酯或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。合适的调味剂包括薄荷油、冬绿油、樱桃、橙或覆盆子香料。合适的包被剂包括丙烯酸和／或异丁烯酸和／或其酯、蜡、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、紫胶或谷蛋白的聚合物或共聚物。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
参照下列非限制性实施例进一步描述本发明。
            实施例1
哺乳动物乙酰肝素酶的纯化与表征
按照Freeman和Parish国际专利申请号PCT／AU97／00453的方法纯化人血小板乙酰肝素酶。图1显示了经SDS-PAGE显示的纯度证据。所有样品都在电泳前用二硫苏糖醇还原。
经SDS-PAGE分析(图1)和凝胶过滤测定，纯化的人血小板乙酰肝素酶具有50kDa的分子量。用从Boehringer Mannheim(悉尼，澳大利亚)获得的重组N-糖苷酶F对酶的N-去糖基化导致分子量降低为40kDa(图1)。这符合由cDNA序列预测的编码6个推断N-糖基化位点的去糖基化成熟酶42kDa的分子量(见实施例3)。O-糖苷酶和神经氨酸酶同时处理后未观察到N-去糖基化物质表观大小的进一步降低(图1)。通过在还原条件下凝胶过滤及SDS-PAGE分析测定，纯化的膜结合酶也具有天然分子量和50kDa的亚基分子量(图1)。
        实施例2
N端和胰蛋白酶消化序列的测定
使用Hellman等人(1995)的方法，对纯化的人血小板乙酰肝素酶经SDS-PAGE所获得的50kDa带进行原位胰蛋白酶消化，导致11种肽的分离，用Perkin Elmer Applied Biosystems Procise 494蛋白质测序仪进行氨基酸测序。切下50kDa带，被动转移到PVDF尼龙膜上，用Messer等人(1997)的方法获得N端序列。
胰蛋白酶消化产生的肽的氨基酸序列和N端序列示于表3中(即表3中分别对应于肽1-11的&#60400&#621-11)。
肽和N端序列与氨基酸序列数据库的比较表明，其与任何已知蛋白质没有非常明显或一致的同源性。肽2和肽3除了肽2长度上多一个残基之外彼此相同。肽1和肽8除了肽1长度上多两个残基之外彼此相同。肽5和肽7是与肽4和肽6相关的较小序列。对于所有肽来说这些序列非常可靠，只有少数残基可疑。肽10的一个有趣的特征是残基2与残基3处多态性的证据。这并不意外，因为血小板乙酰肝素酶是从合并的许多人类供体的血小板制品中制备的。
        实施例3
人乙酰肝素酶cDNA的克隆
一种称为克隆c1的cDNA克隆(ATCC号514661)从美国Maryland的美国典型培养物保藏中心获得。对于可能编码如前面实施例所述获得的人血小板乙酰肝素酶之一种或多种氨基酸序列(&#60400&#621-11)的核苷酸序列，用BLAST搜索EST数据库来鉴定该cDNA克隆。本发明者显示c1克隆包含能编码至少四种人血小板乙酰肝素酶肽序列或与之密切相关序列、尤其是&#60400&#621、2、9及10所示序列的核苷酸序列。这些数据强烈提示，克隆c1至少编码人血小板乙酰肝素酶多肽的一部分。
本发明者的随后实验显示，c1克隆长度大约为1．1kb，包含编码乙酰肝素酶C末端的&#60400&#6212的核苷酸774-1711。
c1克隆已经完全测序，并用来为mRNA 5’末端的PCR扩增设计引物。从λgt11人胎盘cDNA文库(ATCC号HL1008)中扩增长度约为800bp、被称为cλ的片段。测序cλ片段，显示其含有与部分cDNA克隆重叠的3’序列，尤其是&#60400&#6212的核苷酸1-816。
用cλ片段通过杂交筛选从λgt11人胎盘cDNA文库中获得两种推断的全长克隆(称为c2和c9)。克隆c9编码全长乙酰肝素酶多肽，然而它含有&#60400&#6212的核苷酸1144-1258的115bp缺失。克隆c2包含&#60400&#6212的核苷酸1-1481，因此距终止密码子169bp之内被截短。
推断出乙酰肝素酶的全长cDNA和氨基酸序列(&#60400&#6212和&#60400&#6213)。&#60400&#6212所示的乙酰肝素酶开放阅读框为1629个核苷酸长，编码543个氨基酸的蛋白质。&#60400&#6212所示的核苷酸序列在位点1679-1684含有推断的聚腺苷酸化信号。
在装配的全长cDNA序列所编码的氨基酸序列中，检测到11种分离的胰蛋白酶消化肽和分离的酶的N端序列中的8种(即&#60400&#621-3、&#60400&#626、&#60400&#628-11)。这8种胰蛋白酶消化肽中的7种与cDNA序列所编码的氨基酸序列基本上相同(即&#60400&#621-3和&#60400&#628-11)。发现肽6是cDNA序列中的不完全序列，而未发现肽4、5和7有这种情况。这些肽序列是来源于乙酰肝素酶制剂中的蛋白质杂质还是代表乙酰肝素酶的不同剪接变体仍有待于观察。
成熟的分离的酶似乎是一种截短形式，含有从推断的起始密码子起位于下游158氨基酸残基的N端，因为当开放阅读框从&#60400&#6212的核苷酸46延伸到1674时，成熟蛋白质由&#60400&#6212的核苷酸517-1674所编码。编码成熟的分离的蛋白质(假定没有C端加工)的预测cDNA大小为42．2kDa，这符合人血小板酶被N-去糖基化时获得的40kDa的表观大小(图1)。
在&#60400&#6213所示未成熟多肽位点158的赖氨酸残基形成成熟人乙酰肝素酶多肽的N端。推断的N联糖基化位点存在于未成熟全长多肽的Asn162、Asn178、Asn200、Asn217、Asn238和Asn459处。
                  实施例4
        人乙酰肝素酶mRNA的组织分布
通过对不同人组织的Northern印迹来分析人乙酰肝素酶mRNA的表达。
多种人组织印迹(Clonetech，Palo Alto，CA)的Northern分析的进行方法是，使用厂商指定的Expresshyb溶液(Clonetech)，用随机引物(Megaprime DNA标记系统，Amersham)标记的全长人乙酰肝素酶cDNA探查膜。在室温下用1×SSC洗膜40分钟，随后在60℃下用0．1×SSC洗40分钟，并对X光片曝光。
在非免疫组织中，在胎盘中检测到根据分离的乙酰肝素酶cDNA克隆的预期大小(～2kb)的信息，而在心脏、脑、肺、肝、骨骼肌、肾或胰中未检测到(图3)。在胎盘中也检测到4．4kb的第二信息，但是水平低于2kb信息的水平。在其它所有组织中也检测到较弱地4．4kb信息，可能代表另一种剪接变体或有关基因的产物(见下)。在免疫组织中，在脾、淋巴结、胸腺、外周血白细胞、骨髓和胎肝中都检测到2kb和4．4kb信息(图4)。在PBL中见到mRNA的最高水平，在脾、淋巴结、骨髓和胎肝中有较低水平，在胸腺中只有弱表达。2kb和4．4kb信息的表达水平在每种免疫组织中似乎相似，提示两种信息都来源于相同基因或者可能来源于受到协同调节的不同基因。
                    实施例5
       人乙酰肝素酶基因的Southern印迹分析
用多种限制酶限制酶切10μg人基因组DNA，在1％琼脂糖凝胶上分离，然后转移到Hybond-N尼龙滤膜(Amersham，Arlington Heights，IL)上。用以随机引物标记的全长人乙酰肝素酶cDNA探查印迹，于42℃下在50)％甲酰胺、6×SSC、0．5％SDS、5×Denhardt溶液和100μg／ml鲑精DNA中杂交。在室温下用1×SSC洗膜40分钟，随后在65℃下用0．1×SSC洗40分钟，并对X光片曝光。
用多种限制酶消化取自两个个体的人基因组DNA并用全长人乙酰肝素酶cDNA探查，其Southern分析显示一种简单的杂交带型，这与人乙酰肝素酶基因是单拷贝基因相一致(图5)。因此，通过Northern分析观察到的4．4kb信息可能是一种剪接变体而不是有关基因的产物。
                     实施例6
         小鼠和大鼠乙酰肝素酶cDNA的克隆
(1)RNA的分离和第一链cDNA的合成
总细胞RNA的制备方法包括，在1ml Trizol试剂(Gibco-BRL)中匀浆100mg组织或107个细胞，之后回收水性级分，并用异丙醇沉淀RNA。按照使用说明书，使用第一链cDNA合成系统(PharmaciaBiotech)，通过用寡糖dT引物(dT-Not，表2)引发，从5μg总RNA中产生第一链cDNA。
(2)聚合酶链反应
在100ng每种寡核苷酸引物、1．25mM dNTP、50mM KCl、10mMTris-Cl pH8．3和1．5mM MgCl2的存在下，用1单位Taq DNA聚合酶(Bresatec)对10ng第一链cDNA进行反应，共40个扩增循环。
(3)核苷酸测序
用Applied Biosystems 377测序仪通过自动测序测定PCR产物或cDNA克隆的序列。
(4)cDNA的克隆
如厂商所述，将PCR产物直接亚克隆到具有T-尾的载体pCR2．1(Invitrogen)中。
(5)利用生物信息学对小鼠乙酰肝素酶的鉴定及利用PCR的cDNA克隆
利用BLASTN用人乙酰肝素酶核酸序列筛查dbest(公开的EST，GenBank)数据库来鉴定小鼠乙酰肝素酶EST(表4)。用ENTRE(NCBI)得到EST核苷酸序列，并由重叠的EST装配出邻接序列。编译的EST序列覆盖了小鼠乙酰肝素酶cDNA的3’末端，并对应于人乙酰肝素酶mRNA聚腺苷酸化尾的核苷酸1004。
小鼠乙酰肝素酶cDNA的核苷酸序列向5’末端延伸513个碱基。实现方法是，使用寡核苷酸BamHepN(对应于人乙酰肝素酶cDNA的核苷酸517-534)和mhep3(对应于小鼠乙酰肝素酶cDNA的核苷酸1234-1250(表5)，对由从活化129小鼠脾T细胞分离的总RNA制备的第一链cDNA进行PCR。
对小鼠乙酰肝素酶cDNA片段直接测序，确定其长度为1368个核苷酸(核苷酸1-513与由EST编译的相同)，并且编码该分子C端部分的386个氨基酸(对应于人乙酰肝素酶的氨基酸158-543，其包含预测的成熟蛋白质)。
鼠乙酰肝素酶cDNA的核苷酸序列和衍生的氨基酸序列分别示于&#60400&#6216和&#60400&#6217中。
预测的氨基酸序列在Asn37、Asn154和Asn296处含有3个推断的N联糖基化位点，和残基352-371所包含的推断的跨膜区。用PILEUP(NCBI)对小鼠与人的乙酰肝素酶氨基酸序列的对比显示80．8％的同一性(图5)。
通过将PCR片段亚克隆到载体pCR2．1中，产生小鼠乙酰肝素酶cDNA片段的一个克隆(命名为muhep-pCR2．1／1)。该克隆的核苷酸序列与对PCR产物直接测序所测定的序列相同。
(6)通过PCR对大鼠乙酰肝素酶cDNA克隆的克隆
通过用BamHepN寡核苷酸和poly-dT引物(dT-Not)(表5)对来源于大鼠MAT肿瘤细胞系的第一链DNA进行cDNA末端3’快速扩增(RACE)-PCR，产生大鼠乙酰肝素酶cDNA片段。
大鼠乙酰肝素酶cDNA的核苷酸序列和衍生的氨基酸序列分别示于&#60400&#6218和&#60400&#6219中。对大鼠乙酰肝素酶cDNA直接测序，确定其长度为1168个核苷酸，并且编码该分子C端部分的386个氨基酸(对应于人乙酰肝素酶的氨基酸158-543，其包含成熟蛋白质)。
预测的氨基酸序列在Asn37和Asn296处含有2个推断的N联糖基化位点，并且象人和小鼠的乙酰肝素酶一样，含有残基352-371所包含的推断的跨膜区。大鼠乙酰肝素酶氨基酸序列与人和小鼠序列的对比分别显示79．7％和93．7％的同一性(图6)。
通过将PCR片段亚克隆到载体pCR2．1中，产生大鼠乙酰肝素酶cDNA片段的一个克隆(命名为rahep-pCR2．1／1)。该克隆的核苷酸序列与对PCR产物直接测序所测定的序列相同。
                   实施例7
      哺乳动物乙酰肝素酶的杆状病毒表达
(1)大鼠和小鼠乙酰肝素酶
用限制酶EcoRⅠ(小鼠克隆)和BamHⅠ／EcoRⅠ(大鼠克隆)，从其各自的克隆载体(rahep-pCR2．1／1和muhep-pCR2．1／1)上切下大鼠和小鼠乙酰肝素酶(N端编码序列)。将切下的片段克隆到质粒pFastBac(GibcoBRL)中的多角体启动子之前，并转移到细菌株DH10Bac中。制备BacmidDNA(整合到DH10Bac基因组中的pFastBac)，用来转染Sf9(草地夜蛾)昆虫细胞。72小时温育后，收获上清液和细胞，用于检测酶活性。
表6列出了对于2-3种不同样品，与未转染的细胞相比由转染细胞观察到的活性。
在1／3的表达N端截短序列的大鼠和小鼠克隆中观察到边缘乙酰肝素酶活性。
(2)人N端和全长乙酰肝素酶
用限制酶EcoRⅠ从其各自具有T尾的克隆载体(NH2-pCR2．1和完整pCR2．1)中切下两种人构建体。将切下的片段克隆到质粒pFastBac(Gibco BRL)中多角体启动子之前，并转移到细菌株DH10Bac中。制备Bacmid DNA(整合到DH10Bac基因组中的pFastBac)，用来转染Sf9(草地夜蛾)昆虫细胞。72小时温育后，收获上清液和细胞，用于检测酶活性。
表7列出了对于2-5种不同样品，与未转染的细胞相比由转染细胞观察到的活性。
在3／5的含有全长人乙酰肝素酶序列的克隆中观察到空白的乙酰肝素酶活性。在2／5的含有N端截短序列的克隆中检测到边缘乙酰肝素酶活性。总之，杆状病毒表达数据提示，全长乙酰肝素酶序列是获得活性乙酰肝素酶的最佳表达所必需的。
                    实施例8
        哺乳动物乙酰肝素酶在COS-7细胞中的表达
(1)大鼠和小鼠乙酰肝素酶
用限制酶EcoRⅠ(小鼠克隆)和BamHⅠ／EcoRⅠ(大鼠克隆)，从其各自的克隆载体(rahep-pCR2．1／1和muhep-pCR2．1／1)中切下只编码乙酰肝素酶蛋白质成熟形式(即，与人乙酰肝素酶基因成熟蛋白质编码区同源的序列)的大鼠和小鼠乙酰肝素酶cDNA。将切下的片段克隆到质粒pcDNA3(Invitrogen)中巨细胞病毒(CMV)启动子之前。从大肠杆菌DH5α中制备质粒DNA，然后用来按下列方法转染COS-7哺乳动物细胞。
按照所述的DEAE-葡聚糖法，用乙酰肝素酶表达构建体或者单独用pcDNA3载体瞬时转染COS-7细胞(每75cm2瓶30-50％汇合)。使细胞与转染混合液(1ml／5cm2皿)温育4小时，该转染混合液由5-10μg／mlDNA、0．4mg／ml DEAE-葡聚糖(Pharmacia)和1mM氯奎(Sigma)溶于含10％(v∶v)Nuserum(Flow Laboratories)的Dulbecco改良Eagles培养基(DME)(Flow Laboratories)中组成。然后除去转染混合液，用10％的二甲亚砜(v∶v)磷酸缓冲盐溶液(PBS，7．6mM Na2HPO4／3．25mMNaH2PO4／145mM NaCl)，pH 7．4处理2分钟；在用于测定前洗涤并返回完全添加的培养基中48-72小时。COS-7细胞维持于补加有10％热灭活的胎牛血清、100U／ml青霉素、100mg／ml链霉素、2mM谷氨酰胺(Commonwealth Serum Laboratories)和0．05mM 2-巯基乙醇(2ME)(Koch-Light Ltd．)的DME中。72小时温育后，收获上清液和细胞并用于检测酶活性。
表8显示与模拟转染的细胞相比，从转染的细胞中观察到的乙酰肝素酶活性。这些数据表明，在表达小鼠或大鼠乙酰肝素酶蛋白质的转染细胞中没有明显的乙酰肝素酶活性。
(2)人N端和全长乙酰肝素酶
用限制酶EcoRⅠ从其各自的具有T尾的克隆载体(NH2-pCR2．1，含有编码&#60400&#6213的氨基酸158-543的人乙酰肝素酶cDNA；和完整pCR2．1，含有编码&#60400&#6213的氨基酸1-543的人乙酰肝素酶cDNA)上切下两种人构建体。将切下的片段克隆到质粒pcDNA3(Invitrogen)中巨细胞病毒(CMV)启动子之前。从大肠杆菌DH5α中制备质粒DNA，然后用来按上述方法转染COS-7哺乳动物细胞。72小时温育后，收获上清液和细胞并用于检测酶活性。
表9显示与未转染的细胞相比从转染的细胞中观察到的活性。这些数据表明，在表达全长人乙酰肝素酶序列的COS-7细胞中存在显著的乙酰肝素酶活性(10倍于背景水平)，然而在只表达蛋白质成熟加工形式的细胞中观察到很小的活性或没有活性，如同对于COS-7细胞中大鼠和小鼠蛋白质所观察到的。不拘于任何理论或作用模式，这些数据提示，人乙酰肝素酶的氨基酸1-157以及可能大鼠和鼠乙酰肝素酶的相应区，在促使重组蛋白质在哺乳动物细胞中正确表达和／或转运和／或加工方面有重要的功能性作用。
                      实施例9
根据图6所示氨基酸序列数据的比较，鉴定出许多序列差异，它们能用来为产生乙酰肝素酶特异性抗体而制备肽。仅作为例子，合成15个氨基酸的肽，其含有人与小鼠／大鼠乙酰肝素酶序列之间的序列差异，并含有便于在免疫兔之前使肽与蛋白质载体偶联的C端半胱氨酸残基。下面显示该肽的氨基酸序列，其横跨全长人乙酰肝素酶序列的残基423-437：VQGSKRRKLRVYLHC(&#60400&#6223)
按照说明书，用Imject马来酰亚胺活化的匙孔戚形血蓝蛋白(KLH)(Pierce，Rockford，IL)使15个氨基酸的肽经其C端半胱氨酸残基与KLH偶联。溶解于PBS中的KLH-肽偶联物(0．2mg／ml)在弗氏完全佐剂(FCA)中以偶联溶液与FCA 1∶1的比例乳化。用0．2mg KLH-肽在四个部位皮下免疫兔，以4周的间隔但是用弗氏不完全佐剂而不是FCA重复免疫两次，最后一次免疫2周后将兔放血，收集血清。
发展ELISA测定法用于测定抗人乙酰肝素酶抗体。该测定法包括在96孔塑料微量板中固定如前所述从人血小板中纯化的人血小板乙酰肝素酶(5μg／ml于PBS中，15小时，4℃)(25μl／孔)。然后通过加入200μl／孔含1％(w／v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS，4℃下2小时，封闭非特异结合部位。用200μl／孔的PBS／0．05％吐温20(PBST)洗涤三次后，加入50μl／孔抗血清在PBS／1％BSA中的连续稀释液，4℃下温育2小时。用PBST洗三次后，加入50μl／孔溶于PBS／1％BSA中的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的绵羊抗兔Ig，4℃下1小时，再用PBST洗板三次，通过加入发色HRP底物2，2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二铵盐(ABTS)测定结合的HRP，在37℃温育30分钟后用ELISA酶联仪于405nm测定显色。
图7比较了用抗肽抗血清获得的ELISA结果与抗纯化人血小板乙酰肝素酶的多克隆兔抗体的反应性。如图7所示，抗肽抗血清显示相对于天然酶的相当高的反应性，与抗天然酶的抗血清大约1／10240的滴度相比，其产生大约1／640的终点滴度。通过比较，在用肽-KLH偶联物免疫前从兔获得的血清显示，与人乙酰肝素酶的反应性可以忽略。
                      表3
从人血小板乙酰肝素酶蛋白水解消化物中分离的肽的序列肽            序列                 注释
         1  5  101．(10aa)a   LYGPDVGQPR         可靠序列2．(12aa)    VFQVVESTRPGK       可靠序列3．(11aa)    VFQVVESTRPG        可靠序列(除残基12之外与肽2相同)4．(7aa)     LPYQVQD            主要是可靠序列(?残基4)5．(7aa)     AGCQFIP            肽4的较小序列6．(9aa)     LPYLFINLV          可靠序列7．(8aa)     QNDPEDQL           肽6的较小序列8．(8aa)     LYGPDVGQ           可靠序列(但不完全)
                            与肽1相同。9．(12aa)    YLLRPLGPHEIN       主要是可靠序列
                            (?残基3)10．(11aa)  V(Y／A)(L/A)HNTNTDNP主要是可靠序列，尽管后一残基中信号降低
                            (向前的残基4)。残基2和3处的多态性11．(17aa)b  KKFKXSTYSRRSVDVLY  酶的氨基端序列a肽中的氨基酸(aa)数b蛋白水解消化前完整乙酰肝素酶的氨基端序列
              表4
Genbank中与小鼠乙酰肝素酶相应的EST
EST保藏号         来源组织
620141             脾脏
1177651            乳腺
476953             胚胎
522550             皮肤
1092868            膈膜
                      表5
克隆的小鼠和大鼠乙酰肝素酶cDNA中使用的寡核苷酸
寡核苷酸                        序列
BamHepN(&#60400&#6220)    5’-AAAAAAGTTCAAGAACAGC-3’
mhep3(&#60400&#6221)      5’-1CGAAGCTCTGGAACTCG-3’
dT-Not(&#60400&#6222)     5’-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAAT-3’
                            表6
用哺乳动物cDNA克隆转染的草地夜蛾细胞中的重组乙酰肝素酶表达
乙酰肝素酶cDNA    乙酰肝素酶活性(pmol／小时／106细胞)
小鼠                0．44    0．60    0．47
大鼠                0．40    0．55    0．27
对照                0．27    0．42
                          表7
用全长及截短型人乙酰肝素酶cDNA克隆转染的草地夜蛾细胞中的重组乙酰肝素酶活性
基因片段    乙酰肝素酶活性(pmol／小时／106细胞)人(NH2截短型)    0．46    0．39    0．50    0．57    0．43人(全长)         0．22    0．97    1．12    0．76    0．39对照             0．27    0．42
                          表8
用小鼠及大鼠乙酰肝素酶cDNA克隆转染的COS-7细胞中的重组乙
                   酰肝素酶活性
乙酰肝素酶cDNA    乙酰肝素酶活性(pmol／小时／106细胞)
小鼠                  30．3
大鼠                  25．0
对照                  27．0
                          表9
用全长及截短型人乙酰肝素酶cDNA克隆转染的COS-7细胞中的重组乙酰肝素酶活性
基因片段         乙酰肝素酶活性(pmol/小时／106细胞)
人(NH2截短型)            24．6
人(全长)                217．8
对照                     27．0
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                序列表&#60110&#62 国立澳大利亚大学&#60130&#62 类肝素酶／pct／mro&#60140&#62 PCT国际申请&#60150&#62 AU PP0062&#60151&#62 1997-10-28&#60150&#62 AU PP0812&#60151&#62 1997-12-09&#60160&#62 23&#60170&#62 PatentIn Ver．2．0&#60210&#62 1&#60211&#62 10&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：肽&#60400&#62 1Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg1               5                  10&#60210&#62 2&#60211&#62 12&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：肽&#60400&#62 2Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly Lys1                5                          10&#60210&#62 3&#60211&#62 11&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：肽&#60400&#62 3Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly1                5                      10&#60210&#62 4&#60211&#62 7&#60212&#62  PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：肽&#60400&#62 4Leu Pro Tyr Gln Val Gln Asp1                5&#60210&#62 5&#60211&#62 7&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：肽&#60400&#62 5Ala Gly Cys Gln Phe Ile Pro1               5&#60210&#62 6&#60211&#62 9&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：肽&#60400&#62 6Leu  Pro Tyr Leu Phe  Ile Asn Leu Val1                5&#60210&#62 7&#60211&#62 8&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：肽&#60400&#62 7Gln Asn Asp Pro Glu Asp Gln Leu1               5&#60210&#62 8&#60211&#62 8&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：肽&#60400&#62 8Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln1               5&#60210&#62 9&#60211&#62 12&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：肽&#60400&#62 9Tyr Leu Leu Arg Pro Leu Gly Pro His Glu Ile Asn1               5                  10&#60210&#62 10&#60211&#62 11&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：肽&#60400&#62 10Val Tyr Leu His Asn Thr Asn Thr Asp Asn Pro1               5                  10&#60210&#62 11&#60211&#62 16&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：肽&#60400&#62 11Lys Lys Phe Lys Xaa Ser Thr Tyr Ser Arg Arg Ser Val Asp Val Leu1               5                  10          15&#60210&#62 12&#60211&#62 1713&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人&#60220&#62&#60221&#62 CDS&#60222&#62 (46)．．(1674)&#60220&#62&#60221&#62 成熟肽&#60222&#62 (517)．．(1674)&#60400&#62 12ccgctgcgcg gcagctggcg gggggagcag ccaggtgagc ccaag atg ctg ctg cgc 57
                                              Met Leu Leu Arg
                                                      -155tcg aag cct gcg ctg ccg ccg ccg ctg atg ctg ctg ctc ctg ggg ccg   105Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu Leu Leu Leu Gly Pro
       -150                -145                -140ctg ggt ccc ctc tcc cct ggt gcc ctg ccc cga cct gcg caa gca cag   153Leu Gly Pro Leu Ser Pro Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ala Gln Ala Gln
   -135                -130                -125gac gtc gtg gac ctg gac ttc ttc acc cag gag ccg ctg cac ctg gtg   201Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro Leu His Leu Val-120                -115                -110agc ccc tcg ttc ctg tcc gtc acc att gac gcc aac ctg gcc acg gac    249Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ala Thr Asp-105               -100                 -95                 -90ccg cgg ttc ctc atc ctc ctg ggt tct cca aag ctt cgt acc ttg gcc    297Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu Arg Thr Leu Ala
            -85                 -80                 -75aga ggc ttg tct cct gcg tac ctg agg ttt ggt ggc acc aag aca gac    345Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly Thr Lys Thr Asp
        -70                 -65                 -60ttc cta att  ttc gat ccc aag aag gaa tca acc ttt gaa gag aga agt   393Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe Glu Glu Arg Ser
    -55                 -50                 -45tac tgg caa tct caa gtc aac cag gat att tgc aaa tat gga tcc atc    441Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys Tyr Gly Ser Ile
-40                 -35                 -30cct cct gat gtg gag gag aag tta cgg ttg gaa tgg ccc tac cag gag    489Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp Pro Tyr Gln Glu-25                 -20                 -15                 -10caa ttg cta ctc cga gaa cac tac cag aaa aag ttc aag aac agc acc    537Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe Lys Asn Ser Thr
             -5              -1   1               5tac tca aga agc tct gta gat gtg cta tac act ttt gca aac tgc tca    585Tyr Ser Arg Ser Ser Va1 Asp Val Leu Tyr Thr Phe Ala Asn Cys Ser
     10                  15                  20gga ctg gac ttg atc ttt ggc cta aat gcg tta tta aga aca gca gat    633Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu Arg Thr Ala Asp
 25                  30                  35ttg cag tgg aac agt tct aat gct cag ttg ctc ctg gac tac tgc tct    681Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu Asp Tyr Cys Ser40                  45                  50                  55tcc aag ggg tat aac att tct tgg gaa cta ggc aat gaa cct aac agt    729Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro Asn Ser
             60                  65                  70ttc ctt aag aag gct gat att ttc atc aat ggg tcg cag tta gga gaa    777Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser Gln Leu Gly Glu
         75                  80                  85gat ttt att caa ttg cat aaa ctt cta aga aag tcc acc ttc aaa aat    825Asp Phe Ile Gln Leu His Lys Leu Leu Arg Lys Ser Thr Phe Lys Asn
     90                  95                 100gca aaa ctc tat ggt cct gat gtt ggt cag cct cga aga aag acg gct    873Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg Arg Lys Thr Ala
105                 110                 115aag atg ctg aag agc ttc ctg aag gct ggt gga gaa gtg att gat tca    921Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile Asp Ser120                 125                 130                 135gtt aca tgg cat cac tac tat ttg aat gga cgg act gct acc agg gaa    969Val Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr Ala Thr Arg Glu
            140                 145                 150gat ttt cta aac cct gat gta ttg gac att ttt att tca tct gtg caa    1017Asp Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile Ser Ser Val Gln
        155                 160                 165aaa gtt ttc cag gtg gtt gag agc acc agg cct ggc aag aag gtc tgg    1065Lys Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly Lys Lys Val Trp
    170                 175                 180tta gga gaa aca agc tct gca tat gga ggc gga gcg ccc ttg cta tcc    1113Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly G1y Ala Pro Leu Leu Ser
185                 190                 195gac acc ttt gca gct ggc ttt atg tgg ctg gat aaa ttg ggc ctg tca    1161Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser200                 205                 210                 215gcc cga atg gga ata gaa gtg gtg atg agg caa gta ttc ttt gga gca  1209Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val Phe Phe Gly Ala
            220                 225                 230gga aac tac cat tta gtg gat gaa aac ttc gat cct tta cct gat tat  1257Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro Leu Pro Asp Tyr
        235                 240                 245tgg cta tct ctt ctg ttc aag aaa ttg gtg ggc acc aag gtg tta atg  1305Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr Lys Val Leu Met
    250                 255                 260gca agc gtg caa ggt tca aag aga agg aag ctt cga gta tac ctt cat  1353Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg Val Tyr Leu His
265                 270                 275tgc aca aac act gac aat cca agg tat aaa gaa gga gat tta act ctg  1401Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly Asp Leu Thr Leu280                 285                 290                 295tat gcc ata aac ctc cat aat gtc acc aag tac ttg cgg tta ccc tat  1449Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Tyr
            300                 305                 310cct ttt tct aac aag caa gtg gat aaa tac ctt cta aga cct ttg gga  1497Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu Arg Pro Leu Gly
        315                 320                 325cct cat gga tta ctt tcc aaa tct gtc caa ctc aat ggt cta act cta  1545Pro His Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn Gly Leu Thr Leu
    330                 335                 340aag atg gtg gat gat caa acc ttg cca cct tta atg gaa aaa cct ctc  1593Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met Glu Lys Pro Leu
345                 350                 355cgg cca gga agt tca ctg ggc ttg cca gct ttc tca tat agt ttt ttt  1641Arg Pro G1y Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe Phe360                 365                 370             375gtg ata aga aat gcc aaa gtt gct get tgc atc tgaaaataaa atatactagt 1694Val Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile
            380                 385cctgaaaaaa aaaaaaaaa                                              1713&#60210&#62 13&#60211&#62 543&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62  13Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu Leu
   -155                -150                -145Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro Gly Ala Leu Pro Arg Pro-140                -135                -130Ala Gln Ala Gln Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro-125               -120               -115                -110Leu His Leu Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn
          -105                 -100                 -95Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu
        -90                 -85                 -80Arg Thr Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly
    -75                 -70                 -65Thr Lys Thr Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe
-60                 -55                 -50Glu Glu Arg Ser Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys-45                 -40                 -35                 -30Tyr Gly Ser Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp
            -25                 -20                 -15Pro Tyr Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe
        -10                  -5              -1   1Lys Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe
 5                   10                  15Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu20                  25                  30              35Arg Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu
             40                  45                  50Asp Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn
         55                  60                  65Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser
     70                  75                  80Gln Leu Gly Glu Asp Phe Ile Gln Leu His Lys Leu Leu Arg Lys Ser
 85                  90                  95Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg100                 105                 110                 115Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu
            120                 125                 130Val Ile Asp Ser Val Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr
        135                 140                 145Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile
    150                 155                 160Ser Ser Val Gln Lys Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly
165                 170                 175Lys Lys Val Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala180                 185                 190                 195Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys
            200                 205                 210Leu Gly Leu Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val
        215                 220                 225Phe Phe Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro
    230                 235                 240Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr
245                 250                 255Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg260                 265                 270                 275Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly
            280                 285                 290Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu
        295                 300                 305Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu
    310                 315                 320Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn
325                 330                 335Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met340                 345                 350                 355Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser
            360                 365                 370Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile
        375                 380                 385&#60210&#62 14&#60211&#62 1723&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人&#60220&#62&#60221&#62 CDS&#60222&#62 (52)．．(1647)&#60400&#62 14ggcgggccgc tgcgcggcag ctggcggggg gagcagccag gtgagcccaa g atg ctg  57
                                                     Met Leu
                                                          1ctg cgc tcg aag cct gcg ctg ccg ccg ccg ctg atg ctg ctg ctc ctg   105Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu Leu Leu Leu
      5                  10                  15ggg ccg ctg ggt ccc ctc tcc cct ggc gcc ctg ccc cga cct gcg caa   153Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ala Gln
 20                  25                  30gca cag gac gtc gtg gac ctg gac ttc ttc acc cag gag ccg ctg cac   201Ala Gln Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro Leu His35                  40                  45                  50ctg gtg agc ccc tcg ttc ctg tcc gtc acc att gac gcc aac ctg gcc   249Leu Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ala
             55                  60                  65acg gac ccg cgg ttc ctc atc ctc ctg ggt tct cca aag ctt cgt acc   297Thr Asp Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu Arg Thr
         70                  75                  80ttg gcc aga ggc ttg tct cct gcg tac ctg agg ttt ggt ggc acc aag   345Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly Thr Lys
     85                  90                  95aca gac ttc cta att ttc gat ccc aag aag gaa tca acc ttt gaa gag   393Thr Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe Glu Glu
100                 105                 110aga agt tac tgg caa tct caa gtc aac cag gat att tgc aaa tat gga   441Arg Ser Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys Tyr Gly115                 120                 125                 130tcc atc cct cct gat gtg gag gag aag tta cgg ttg gaa tgg ccc tac   489Ser Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp Pro Tyr
            135                 140                 145cag gag caa ttg cta ctc cga gaa cac tac cag aaa aag ttc aag aac   537Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe Lys Asn
        150                 155                 160agc acc tac tca aga agc tct gta gat gtg cta tac act ttt gca aac   585Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe Ala Asn
    165                 170                 175tgc tca gga ctg gac ttg atc ttt ggc cta aat gcg tta tta aga aca   633Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu Arg Thr
180                 185                 190gca gat ttg cag tgg aac agt tct aat gct cag ttg ctc ctg gac tac   681Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu Asp Tyr195                 200                 205                 210tgc tct tcc aag ggg tat aac att tct tgg gaa cta ggc aat gaa cct   729Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro
            215                 220                 225aac agt ttc ctt aag aag gct gat att ttc atc aat ggg tcg cag tta   777Asn ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser Gln Leu
        230                 235                 240gga gaa gat ttt att caa ttg cat aaa ctt cta aga aag tcc acc ttc   825Gly Glu Asp Phe Ile Gln Leu His Lys Leu Leu Arg Lys Ser Thr Phe
    245                 250                 255aaa aat gca aaa ctc tat ggt cct gat gtt ggt cag cct cga aga aag   873Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg Arg Lys
260                 265                 270acg gct aag atg ctg aag agc ttc ctg aag gct ggt gga gaa gtg att    921Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile275                 280                 285                 290gat tca gtt aca tgg cat cac tac tat ttg aat gga cgg act gct acc    969Asp Ser Val Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr Ala Thr
            295                 300                 305agg gaa gat ttt cta aac cct gat gta ttg gac att ttt att tca tct    1017Arg Glu Asp Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile Ser Ser
        310                 315                 320gtg caa aaa gtt ttc cag gtg gtt gag agc acc agg cct ggc aag aag    1065Val Gln Lys Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly Lys Lys
    325                 330                 335gtc tgg tta gga gaa aca agc tct gca tat gga ggc gga gcg ccc ttg    1113Val Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Pro Leu
340                 345                 350cta tcc gac acc ttt gca gct ggc ttt atg tgg ctg gat aaa ttg ggc    1161Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly355                 360                 365                 370ctg tca gcc cga atg gga ata gaa gtg gtg atg agg caa gta ttc ttt    1209Leu Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val Phe Phe
            375                 380                 385gga gca gga aac tac cat tta gtg gat gaa aac ttc gat cct tta cct    1257Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro Leu Pro
        390                 395                 400gat tat tgg cta tct ctt ctg ttc aag aaa ttg gtg ggc acc aag gtg    1305Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr Lys Val
    405                 410                 415tta atg gca agc gtg caa ggt tca aag aga agg aag ctt cga gta tac    1353Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg Val Tyr
420                 425                 430ctt cat tgc aca aac act gac aat cca agg tat aaa gaa gga gat tta   1401Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly Asp Leu435                 440                 445                 450act ctg tat gcc ata aac ctc cat aat gtc acc aag tac ttg cgg tta   1449Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu Arg Leu
            455                 460                 465ccc tat cct ttt tct aac aag caa gtg gat aaa tac ctt cta aga cct   1497Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu Arg Pro
        470                 475                 480ttg gga cct cat gga tta ctt tcc aaa tct gtc caa ctc aat ggt cta   1545Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn Gly Leu
    485                 490                 495act cta aag atg gtg gat gat caa acc ttg cca cct tta atg gaa aaa   1593Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met Glu Lys
500                 505                 510cct ctc cgg cca gga agt tca ctg ggt tgc cag ctt tct cat ata gtt   1641Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Cys Gln Leu Ser His Ile Val515                 520                 525                 530ttt ttg tgataagaaa tgccaaagtt gctgcttgca tctgaaaata aaatatacta    1697Phe Leugtcctgacac tgaaaaaaaa aaaaaa                                      1723&#60210&#62 15&#60211&#62 532&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 15Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu Leu1               5                   10                 15Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro G1y Ala Leu Pro Arg Pro
         20                  25                  30Ala Gln Ala Gln Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro
     35                  40                  45Leu His Leu Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn
 50                  55                  60Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu65                  70                  75                  80Arg Thr Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly
             85                  90                  95Thr Lys Thr Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe
        100                 105                 110Glu Glu Arg Ser Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys
    115                 120                 125Tyr Gly Ser Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp
130                 135                 140Pro Tyr Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe145                 150                 155                 160Lys Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe
            165                 170                 175Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu
        180                 185                 190Arg Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu
    195                 200                 205Asp Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn
210                 215                 220Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser225                 230                 235                 240Gln Leu Gly Glu Asp Phe Ile Gln Leu His Lys Leu Leu Arg Lys Ser
            245                 250                 255Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg
        260                 265                 270Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu
    275                 280                 285Val Ile Asp Ser Val Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr
290                 295                 300Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile305                 310                 315                 320Ser Ser Val Gln Lys Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly
            325                 330                 335Lys Lys Val Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala
        340                 345                 350Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys
    355                 360                 365Leu Gly Leu Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val
370                 375                 380Phe Phe Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro385                 390                 395                 400Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr
            405                 410                 415Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln G1y Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg
        420                 425                 430Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly
    435                 440                 445Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu
450                 455                 460Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu465                 470                 475                 480Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn
            485                 490                 495Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met
        500                 505                 510Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Cys Gln Leu Ser His
    515                 520                 525Ile Val Phe Leu
530&#60210&#62 16&#60211&#62 1380&#60212&#62 DNA&#60213&#62Mus 肌肉&#60220&#62&#60221&#62 CDS&#60222&#62 (1)．．(1140)&#60400&#62 16acc tac tca aga agc tca gtg gac atg ctc tac agt ttt gcc aag tgc   48Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Met Leu Tyr Ser Phe Ala Lys Cys1               5                  10                  15tcg ggg tta gac ctg atc ttt ggt cta aat gcg tta cta gga acc cca   96Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu Gly Thr Pro
         20                  25                  30gac tta cgg tgg aac agc tcc aac gcc cag ctt ctc ctt gac gac tgc   144Asp Leu Arg Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu Asp Tyr Cys
     35                  40                  45tct tcc aag ggt tat aac atc tcc tgg gaa ctg ggc aat gag ccc aac   192Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro Asn
 50                  55                  60agt ttc tgg aag aaa gct cac att ctc atc gat ggg ttg cag tta gga   240Ser Phe Trp Lys Lys Ala His Ile Leu Ile Asp Gly Leu Gln Leu Gly65                  70                  75                  80gaa gac ttt gtg gag ttg cat aaa ctt cta caa agg tca gct ttc caa   288Glu Asp Phe Val Glu Leu His Lys Leu Leu Gln Arg Ser Ala Phe Gln
             85                  90                  95aat gca aaa ctc tat ggt cct gac atc ggt cag cct cga ggg aag aca   336Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Ile Gly Gln Pro Arg Gly Lys Thr
        100                 105                 110gtt aaa ctg ctg agg agt ttc ctg aag gct ggc gga gaa gtg atc gac   384Val Lys Leu Leu Arg Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile Asp
    115                 120                 125tct ctt aca tgg cat cac tat tac ttg aat gga cgc atc gct acc aaa   432Ser Leu Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Ile Ala Thr Lys
130                 135                 140gaa gat ttt ctg agc tct gat gtg ctg gac act ttt att ctc tct gtg   480Glu Asp Phe Leu Ser Ser Asp Val Leu Asp Thr Phe Ile Leu Ser Val145                 150                 155                 160caa aaa att ctg aag gtc act aaa gag atc aca cct ggc aag aag gtc   528Gln Lys Ile Leu Lys Val Thr Lys Glu Ile Thr Pro Gly Lys Lys Val
            165                 170                 175tgg ttg gga gag acg agc rca gct tac ggt ggc ggt gca ccc ttg ctg   576Trp Leu G1y Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Pro Leu Leu
        180                 185                 190tcc aac acc ttt gca gct ggc ttt atg tgg ctg gat aaa ttg ggc ctg    624Ser Asn Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu
    195                 200                 205tca gcc cag atg ggc ata gaa gtc gtg atg agg cag gtg ttc ttc gga    672Ser Ala Gln Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val Phe Phe Gly
210                 215                 220gca ggc aac tac cac tta gtg gat gaa aac ttt gag cct tta cct gat    720Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Glu Pro Leu Pro Asp225                 230                 235                 240tac tgg ctc tct ctt ctg ttc aag aaa ctg gta ggt ccc agg gtg tta    768Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Pro Arg Val Leu
            245                 250                 255ctg tca aga gtg aaa ggc cca gac agg agc aaa ctc cga gtg tat ctc    816Leu Ser Arg Val Lys Gly Pro Asp Arg Ser Lys Leu Arg Val Tyr Leu
        260                 265                 270cac tgc act aac gtc tat cac cca cga tat cag gaa gga gat cta act    864His Cys Thr Asn Val Tyr His Pro Arg Tyr Gln Glu Gly Asp Leu Thr
    275                 280                 285ctg tat gtc ctg aac ctc cat aat gtc acc aag cac ttg aag gta ccg    912Leu Tyr Val Leu Asn Leu His Asn Val Thr Lys His Leu Lys Val Pro
290                 295                 300cct ccg ttg ttc agg aaa cca gtg gat acg tac ctt ctg aag cct tcg    960Pro Pro Leu Phe Arg Lys Pro Val Asp Thr Tyr Leu Leu Lys Pro Ser305                 310                 315                 320ggg ccg gat gga tta ctt tcc aaa tct gtc caa ctg aac ggt caa att    1008Gly Pro Asp Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn Gly Gln Ile
            325                 330                 335ctg aag atg gtg gat gag cag acc ctg cca gct ttg aca gaa aaa cct    1056Leu Lys Met Val Asp Glu Gln Thr Leu Pro Ala Leu Thr Glu Lys Pro
        340                 345                 350ctc ccc gca gga agt gca cta agc ctg cct gcc ttt tcc tat ggt ttt    1104Leu Pro Ala Gly Ser Ala Leu Ser Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Gly Phe
    355                 360                 365ttt gtc ata  aga gat  gcc aaa att gct gct tgt ata tgaaaataaa       1150Phe Val Ile Arg Asp Ala Lys Ile Ala Ala Cys Ile
370                 375                 380aggcatacgg tacccctgag acaaaagccg aggggggtgt tattcataaa acaaaaccct  1210agtttaggag gccacctcct tgccgagttc cagagcttcg ggagggtggg gtacacttca  1270gtattacatt cagtgtggtg ttctcctcta agaagaatac tgcaggtggt gacagttaat  1330agcactgtgt ggcaaatgac gcttagccct ttgcatgcaa aaaaaaaaaa             1380&#60210&#62 17&#60211&#62 380&#60212&#62 PRT&#60213&#62 Mus肌肉&#60400&#62 17Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Met Leu Tyr Ser Phe Ala Lys Cys1               5                  10                  15Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu Gly Thr Pro
         20                  25                  30Asp Leu Arg Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu Asp Tyr Cys
     35                  40                  45Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro Asn
 50                  55                  60Ser Phe Trp Lys Lys Ala His Ile Leu Ile Asp Gly Leu Gln Leu Gly65                  70                  75                  80Glu Asp Phe Val Glu Leu His Lys Leu Leu Gln Arg Ser Ala Phe Gln
             85                  90                  95Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Ile Gly Gln Pro Arg Gly Lys Thr
        100                 105                 110Val Lys Leu Leu Arg Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile Asp
    115                 120                 125Ser Leu Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Ile Ala Thr Lys
130                 135                 140Glu Asp Phe Leu Ser Ser Asp Val Leu Asp Thr Phe Ile Leu Ser Val145                 150                 155                 160Gln Lys Ile Leu Lys Val Thr Lys Glu Ile Thr Pro Gly Lys Lys Val
            165                 170                 175Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Pro Leu Leu
        l80                 185                 190Ser Asn Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu
    195                 200                 205Ser Ala Gln Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val Phe Phe Gly
210                 215                 220Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Glu Pro Leu Pro Asp225                 230                 235                 240Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Pro Arg Val Leu
            245                 250                 255Leu Ser Arg Val Lys Gly Pro Asp Arg Ser Lys Leu Arg Val Tyr Leu
        260                 265                 270His Cys Thr Asn Val Tyr His Pro Arg Tyr Gln Glu Gly Asp Leu Thr
    275                 280                 285Leu Tyr Val Leu Asn Leu His Asn Val Thr Lys His Leu Lys Val Pro
290                 295                 300Pro Pro Leu Phe Arg Lys Pro Val Asp Thr Tyr Leu Leu Lys Pro Ser305                 310             315                     320Gly Pro Asp Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn Gly Gln Ile
            325             330                     335Leu Lys Met Val Asp Glu Gln Thr Leu Pro Ala Leu Thr Glu Lys Pro
        340             345                     350Leu Pro Ala Gly Ser Ala Leu Ser Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Gly Phe
    355             360                     365Phe Val Ile Arg Asp Ala Lys Ile Ala Ala Cys Ile
370             375                     380&#60210&#62 18&#60211&#62 1191&#60212&#62 DNA&#60213&#62 Rattus sp&#60220&#62&#60221&#62 CDS&#60222&#62 (1)．．(1140)&#60400&#62 18acc tac tca cga agc tcg gtg gac atg ctc tac agt ttt gct aag tgc    48Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Met Leu Tyr Ser Phe Ala Lys Cys1               5                  10                  15tcg agg tta gac ctg atc ttt ggt cta aat gcg tta cta aga acc cca    96Ser Arg Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu Arg Thr Pro
         20                  25                  30gac ttg cgg tgg aac agc tcc aac gcc cag ctt ctg ctc aac tac tgc    144Asp Leu Arg Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu Asn Tyr Cys
     35                  40                  45tct tcc aag ggt tat aac atc tgc tgg gaa ctg ggc aac gag ccc aac    192Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Cys Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro Asn
 50                  55                  60agt ttc tgg aag aaa gct cac att tcc atc gat ggg ttg cag cta gga    240Ser Phe Trp Lys Lys Ala His Ile Ser Ile Asp Gly Leu Gln Leu Gly65                  70                  75                  80gaa gac ttt gtg gag ttg cat aaa ctt cta caa aag tca gct ttc caa    288Glu Asp Phe Val Glu Leu His Lys Leu Leu Gln Lys Ser Ala Phe Gln
             85                  90                  95aac gca aaa ctc tat ggt cct gac att ggt cag cct cga ggg aag aca    336Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Ile Gly Gln Pro Arg Gly Lys Thr
        100                 105                 110gtt aag ctg ctg aga agc ttc ctg aag gct ggt gga gaa gtg att gac    384Val Lys Leu Leu Arg Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile Asp
    115                 120                 125tct ctc acc tgg cat cac tac tac ttg aat gga cga gtt gcg acc aaa    432Ser Leu Thr Trp His His Tyr Tlr Leu Asn Gly Arg Val Ala Thr Lys
130                 135                 140gaa gat ttt ctg agc tct gat gtc ctg gac act ttt atc cta tct gtg    480Glu Asp Phe Leu Ser Ser Asp Val Leu Asp Thr Phe Ile Leu Ser Val145                150                  155                 160caa aaa att ctg aag gtg act aag gag atg aca cct ggc aag aag gtc    528Gln Lys Ile Leu Lys Val Thr Lys Glu Met Thr Pro Gly Lys Lys Val
            165                 170                 175tgg ttg gga gag acg agc tct gcc tac ggc ggc gga gcg ccc ttg ctg    576Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Pro Leu Leu
        180                 185                 190tcc gat acc ttt gca gct ggc ttt atg tgg ctg gat aaa ttg ggc ctg    624Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu
    195                 200                 205tca gcc cag ctg ggg ata gaa gtc gtg atg agg cag gtg ttt ttc gga    672Ser Ala Gln Leu Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val Phe Phe Gly
210                 215                 220gca ggc aac tac cac tta gtg gac gaa aac ttc gag ccc ttg ccc gat    720Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Glu Pro Leu Pro Asp225                 230                 235                 240tac tgg ctc tct ctc ctg ttc aag aaa ctg gta ggt ccc aag gtg tta    768Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Pro Lys Val Leu
            245                 250                 255atg tca aga gtg aaa ggc cca gac aga agc aaa ctc cga gtg tac ctc    816Met Ser Arg Val Lys Gly Pro Asp Arg Ser Lys Leu Arg Val Tyr Leu
        260                 265                 270cac tgc acg aac gtc tat cac cca agg tat cgg gaa gga gat tta act    864His Cys Thr Asn Val Tyr His Pro Arg Tyr Arg Glu Gly Asp Leu Thr
    275                 280                 285ctg tac gtc ctg aac ctc cat aat gtc acc aag cac ttg aag ctg ccg    912Leu Tyr Val Leu Asn Leu His Asn Val Thr Lys His Leu Lys Leu Pro
290                 295                 300cct ccg atg ttc agc aga ccg gtg gat aag tac ctg ctg aag cct ttc    960Pro Pro Met Phe Ser Arg Pro Val Asp Lys Tyr Leu Leu Lys Pro Phe305                 310                 315                 320ggt tct gac gga ctg ctt tcc aaa tcc gtc caa ctg aac ggt caa acc    1008Gly Ser Asp Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn Gly Gln Thr
            325                 330                 335ctg aag atg gtc gat gag cag acc ctg cca gct cta aca gaa aaa cct    1056Leu Lys Met Val Asp Glu Gln Thr Leu Pro Ala Leu Thr Glu Lys Pro
        340                 345                 350ctc ccc gca gga agc tca cta agc gtg ccc gcc ttt tcc tat ggg ttt    1104Leu Pro Ala Gly Ser Ser Leu Ser Val Pro Ala Phe Ser Tyr Gly Phe
    355                 360                 365ttt gtc ata aga aat gcc aaa atc gca gct tgt ata tgaaaataaa         1150Phe Val Ile Arg Asn Ala Lys Ile Ala Ala Cys Ile
370                 375                 380aggcttacag tacccctgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a                      1191&#60210&#62 19&#60211&#62 380&#60212&#62 PRT&#60213&#62 Rattus sp．&#60400&#62 19Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Met Leu Tyr Ser Phe Ala Lys Cys1               5                  10                  15Ser Arg Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu Arg Thr Pro
         20                  25                  30Asp Leu Arg Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu Asn Tyr Cys
     35                  40                  45Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Cys Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro Asn
 50                  55                  60Ser Phe Trp Lys Lys Ala His Ile Ser Ile Asp Gly Leu Gln Leu Gly65                  70                  75                  80Glu Asp Phe Val Glu Leu His Lys Leu Leu Gln Lys Ser Ala Phe Gln
             85                  90                  95Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Ile Gly Gln Pro Arg Gly Lys Thr
        100                 105                 110Val Lys Leu Leu Arg Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile Asp
    115                 150                 125Ser Leu Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Val Ala Thr Lys
130                 135                 140Glu Asp Phe Leu Ser Ser Asp Val Leu Asp Thr Phe Ile Leu Ser Val145                 150                 155                 160Gln Lys Ile Leu Lys Val Thr Lys Glu Met Thr Pro Gly Lys Lys Val
            165                 170                 175Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Pro Leu Leu
        180                 185                 190Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu
    195                 200                 205Ser Ala Gln Leu Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val Phe Phe Gly
210                 215                 220Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Glu Pro Leu Pro Asp225                 230                 235                 240Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Pro Lys Val Leu
            245                 250                 255Met Ser Arg Val Lys Gly Pro Asp Arg Ser Lys Leu Arg Val Tyr Leu
        260                 265                 270His Cys Thr Asn Val Tyr His Pro Arg Tyr Arg Glu Gly Asp Leu Thr
    275                 280                 285Leu Tyr Val Leu Asn Leu His Asn Val Thr Lys His Leu Lys Leu Pro
290                 295                 300Pro Pro Met Phe Ser Arg Pro Val Asp Lys Tyr Leu Leu Lys Pro Phe305                 310                 315                 320Gly Ser Asp Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn Gly Gln Thr
            325                 330                 335Leu Lys Met Val Asp Glu Gln Thr Leu Pro Ala Leu Thr Glu Lys Pro
        340                 345                 350Leu Pro Ala Gly Ser Ser Leu Ser Val Pro Ala Phe Ser Tyr Gly Phe
    355                 360                 365Phe Val Ile Arg Asn Ala Lys Ile Ala Ala Cys Ile
370                 375                 380&#60210&#62 20&#60211&#62 18&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：寡核苷酸&#60400&#62 20aaaaagttca agaacagc                18&#60210&#62 21&#60211&#62 17&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：寡核苷酸&#60400&#62 21cgaagctctg gaactcg                  17&#60210&#62 22&#60211&#62 28&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：寡核苷酸&#60400&#62 22aactggaaga attcgcggcc gcaggaat&#60210&#62 23&#60211&#62 15&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列的描述：肽&#60400&#62 23Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg Val Tyr Leu His Cys1               5                  10                  15

Claims (50)

1．一种分离的核酸分子，其包含与&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中的任一个或其互补序列至少有80％同一性的核苷酸序列，并且其编码一种具有哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽。
2．权利要求1的分离的核酸分子，其中内切葡糖醛酸糖苷酶活性是乙酰肝素酶。
3．权利要求2的分离的核酸分子，其包含&#60400&#6212所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
4．权利要求2的分离的核酸分子，其包含&#60400&#6216所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
5．权利要求2的分离的核酸分子，其包含&#60400&#6218所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
6．一种分离的核酸分子，其包含编码一种哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶多肽的核苷酸序列，该多肽包含与选自下列的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列：
(ⅰ)&#60400&#621-&#60400&#6211或&#60400&#6223中任一个所示的氨基酸序列；
(ⅱ)&#60400&#6213所示的氨基酸序列；
(ⅲ)&#60400&#6217所示的氨基酸序列；
(ⅳ)&#60400&#6219所示的氨基酸序列；
(ⅴ)能从HSPG上除去HS侧链的(ⅰ)-(ⅳ)中任一个的同源物、类似物或衍生物；和
(ⅵ)能从HSPG上除去HS侧链的&#60400&#6215的同源物、类似物或衍生物。
7．权利要求6的分离的核酸分子，其中内切葡糖醛酸糖苷酶活性是乙酰肝素酶。
8．权利要求7的分离的核酸分子，其编码&#60400&#6213所示的氨基酸序列或&#60400&#6213的氨基酸残基158-543。
9．权利要求7的分离的核酸分子，其编码&#60400&#6217所示的氨基酸序列。
10．权利要求7的分离的核酸分子，其编码&#60400&#6219所示的氨基酸序列。
11．一种鉴定编码哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶多肽的核酸分子的方法，其至少包括下列步骤：
(ⅰ)在足以发生杂交的时间内和条件下，使来源于哺乳动物细胞、组织或器官的基因组DNA、mRNA或cDNA与杂交有效量的一种或多种探针或引物分子杂交，该分子包含长度至少为10个的邻接核苷酸，由&#60400&#6212或&#60400&#6214或&#60400&#6216或&#60400&#6218中的任一个衍生而来；和
(ⅱ)检测该杂交。
12．权利要求11的方法，其进一步包括分离杂交的核酸分子的步骤。
13．权利要求11的方法，其中检测杂交的步骤包括聚合酶链反应形式。
14．权利要求11的方法，其中检测杂交的步骤包括引物延伸。
15．权利要求11的方法，其中检测杂交的步骤包括检测与探针或引物共价结合的报道分子。
16．一种表达载体，其包含与启动子序列有效连接的权利要求1的分离的核酸分子。
17．权利要求16的表达载体，其中启动子是多角体启动子或CMV启动子。
18．一种表达载体，其包含与启动子序列有效连接的权利要求6的分离的核酸分子。
19．权利要求18的表达载体，其中启动子是多角体启动子或CMV启动子。
20．一种表达载体，其包含编码哺乳动物乙酰肝素酶多肽的分离的核酸分子，该多肽具有&#60400&#6213、&#60400&#6215、&#60400&#6217或&#60400&#6219中任一个所示的氨基酸序列，或其能从HSPG上除去HS侧链的同源物、类似物或衍生物，该核酸分子与启动子序列有效连接。
21．权利要求20的表达载体，其中启动子是多角体启动子或CMV启动子。
22．一种分离的乙酰肝素酶肽，其包含&#60400&#621-11或&#60400&#6223中任一个所示的氨基酸序列。
23．一种重组或分离的多肽，其具有内切葡糖醛酸糖苷酶活性，并且包含与&#60400&#6213、&#60400&#6213的氨基酸158-543、&#60400&#6217或&#60400&#6219中的任一个或其能从HSPG上除去HS侧链的同源物、类似物或衍生物至少80％相同的氨基酸序列。
24．权利要求23的重组或分离的多肽，其中内切葡糖醛酸糖苷酶活性包括乙酰肝素酶活性。
25．权利要求24的分离的或重组多肽，其包含&#60400&#6213或&#60400&#6213的氨基酸158-543所示的氨基酸序列。
26．权利要求24的分离的或重组多肽，其包含&#60400&#6217所示的氨基酸序列。
27．权利要求24的分离的或重组多肽，其包含&#60400&#6219所示的氨基酸序列。
28．权利要求24的分离的或重组多肽，其包含&#60400&#6213所示的氨基酸序列的成熟蛋白质区。
29．一种能与分离的或重组内切葡糖醛酸糖苷酶多肽结合的抗体分子，该多肽包含与&#60400&#621-11、&#60400&#6213、&#60400&#6217或&#60400&#6219或&#60400&#6223中任一个至少80％相同的氨基酸序列。
30．一种鉴定乙酰肝素酶活性调节剂的方法，其包括在一种潜在调节剂的存在下测定权利要求23的重组内切葡糖醛酸糖苷酶活性，并且将该活性与不存在该潜在调节剂时重组乙酰肝素酶的活性相比较。
31．权利要求30的方法，其中乙酰肝素酶活性的调节剂是乙酰肝素酶活性的抑制剂。
32．权利要求31的方法，其中乙酰肝素酶活性的抑制剂是乙酰肝素酶的不可切割的底物或底物类似物。
33．权利要求31的方法，其中乙酰肝素酶活性的抑制剂是硫酸化寡糖、磺酸酯或含有它的HSPG。
34．权利要求31的方法，其中乙酰肝素酶活性的抑制剂是一种能与分离的或重组内切葡糖醛酸糖苷酶多肽结合的抗体分子，该多肽包含与&#60400&#621-11、&#60400&#6213、&#60400&#6217或&#60400&#6219或&#60400&#6223中任一个至少80％相同的氨基酸序列。
35．硫酸化寡糖、磺酸酯或含有它的HSPG的应用，其用于抑制一种乙酰肝素酶多肽，该多肽包含与&#60400&#6213、&#60400&#6217或&#60400&#6219中任一个至少80％相同的氨基酸序列，或其能从HSPG上去除HS侧链的同源物、类似物或衍生物。
36．一种人或动物患者中生理性或医学病症的治疗方法，其中该患者的乙酰肝素酶活性升高，该方法包括在足以降低该患者乙酰肝素酶活性的时间内和条件下施用一种乙酰肝素酶多肽抑制剂，该多肽具有与&#60400&#6213、&#60400&#6217或&#60400&#6219中任一个至少80％相同的氨基酸序列。
37．权利要求36的方法，其中与升高的乙酰肝素酶活性相关的生理性或医学病症选自转移、血管发生、创伤愈合、血管成形术诱导的再狭窄、动脉硬化、动脉粥样硬化和炎症。
38．一种促进人或动物患者创伤愈合的方法，该方法包括向该患者施用可促进创伤愈合量的重组或分离的乙酰肝素酶多肽，该多肽包含与&#60400&#6213、&#60400&#6217或&#60400&#6219中任一个至少80％相同的氨基酸序列，或其能从HSPG上释放HS侧链的同源物、类似物或衍生物，或施用含有该多肽、同源物、类似物或衍生物的药物组合物。
39．权利要求38的方法，其中创伤愈合的促进与组织发育和组织修复有关。
40．一种诊断与乙酰肝素酶过量表达有关的生理性或医学病症的方法，该方法包括下列步骤：在足以形成抗原：抗体复合物的时间内和条件下，使权利要求29的抗体与取自疑患有该病症的人或动物患者的生物样品接触，然后检测该复合物的形成。
41．权利要求40的方法，其中生理性或医学病症选自癌症、转移、血管发生、血管成形术诱导的再狭窄、动脉粥样硬化和炎症。
42．权利要求40的方法，其中生物样品是血清、胎盘、外周血白细胞、脾、淋巴结、骨髓或胎肝或其衍生物。
43．一种诊断人或动物患者中与乙酰肝素酶过量表达有关的生理性或医学病症的方法，该方法包括下列步骤：
(ⅰ)在足以发生杂交的时间内与条件下，使源于表达乙酰肝素酶的细胞或组织的含有mRNA的生物样品与一种探针或引物接触，该探针或引物包含与&#60400&#6212、&#60400&#6214、&#60400&#6216或&#60400&#6218中任一个或其互补核苷酸序列的至少10个连续核苷酸至少有80％同一性的核苷酸序列；和
(ⅱ)检测和／或定量该杂交。
44．权利要求43的方法，其中生理性或医学病症选自癌症、转移、血管发生、血管成形术诱导的再狭窄、动脉粥样硬化和炎症。
45．权利要求44的方法，其中生物样品包括胎盘、外周血白细胞、脾、淋巴结、骨髓或胎肝或其衍生物。
46．权利要求44的方法，其中检测和／或定量杂交的步骤包括：以聚合酶链反应的形式将对患者获得的杂交信号与对健康个体获得的杂交信号相比较。
47．权利要求44的方法，其中探针或引物包括与核苷酸序列共价结合的报道分子，并且其中检测和／或定量杂交的步骤包括：将与取自患者的生物样品结合的报道分子的量跟与取自健康个体的等同生物样品结合的报道分子的量相比较。
48．一种细胞，其含有根据权利要求1-10中任一项的核酸分子或根据权利要求16-21中任一项的表达载体。
49．根据权利要求49的细胞，它是昆虫细胞或哺乳动物细胞。
50．根据权利要求49的细胞，其中昆虫是草地夜蛾，或者哺乳动物细胞是COS细胞。
CN98811662A 1997-10-28 1998-10-28 编码哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶的分离的核酸分子及其应用 Pending CN1280613A (zh)

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