JP2005508653A - 新規サイトヒン遺伝子およびこれの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、NIMH Grant No. 38623 の下に、政府の支援と共になされた。これ故に、米国政府は、本発明における所定の権利を持つ。
アルツハイマー病(AD)は、認知機能の進行性で容赦ない喪失により特徴付けられる神経変性疾患である(1)。ADは、最もよく見られる後発性の痴呆であり、世界の先進国の何百万人の人々に影響を及ぼしている。約4,000,000人のアメリカ人がアルツハイマー病に苦しみ、その年間コストは約$100,000,000,000であり、ADを、3番目に最もコストのかかる加齢疾患にしている。この疾患は、男性における約2倍女性においてよく起こり、老齢者における痴呆の65%よりも多くを数える。早期の同定がADのような進行性の病状においては決定的であり、これはより早期の処置が、認知機能の保存において、より遅い処置よりもより有効であることがあるからである。更に、早期の検出は、処置および介護の選択肢に触れさせる時間を許容することがある。しかしながら現在までに、アルツハイマー病に関しての治癒は得られておらず、認知の衰えは不可避である。
本発明は、該タウ遺伝子座内の新規遺伝子サイトヒン(saitohin、STH)の同定、およびこのSTH遺伝子のサイトヒン−R(STH−R)対立遺伝子がアルツハイマー病(「AD」)を進展させる増大したリスクと関連しているという観測に基づいている。これらの知見を元に、本発明の目的は、STH−QおよびSTH−R両方の対立遺伝子を包含するサイトヒン(STH)をコード化する単離された核酸配列、および、STHをコード化する核酸配列に相補的な第2の核酸配列へ、高ストリンジェント条件下にハイブリダイゼーションする単離された核酸配列を提供することである。
本発明は、染色体17上に位置され、微小管関連タンパク質であるタウをコード化する遺伝子のイントロン内にある新規遺伝子サイトヒン(STH)を指向するものである。本明細書中で開示されるように、このサイトヒン遺伝子は、ヒトの集団においては、少なくとも2つの形態または対立遺伝子中に存在する。1つの形態においては、本明細書中で「サイトヒン−Q(STH−Q)」として言及され、この126番目のヌクレオチドはAであり、これは結果的に、STHタンパク質のこのSTH−Qアイソフォーム(isoform)の7番目の位置にてQ(グルタミン)になっている。STHの第2の形態においては、本明細書中で「サイトヒン−R(STH−R)」として言及され、この126番目のヌクレオチドはGであり、これは結果的に、STHタンパク質のこのSTH−Rアイソフォームの7番目の位置にてR(アルギニン)になっている。
(a)STHを標的とするベクターを生成し;
(b)このSTHを標的とするベクターを、非ヒト動物の受容細胞中へ導入して、処理された受容細胞を産生し;
(c)この処理された受容細胞を、非ヒト動物の芽細胞中へ導入して、処理された芽細胞を産生し;
(d)この処理された芽細胞を、偽妊娠非ヒト動物中へ導入し;
(e)この移植された芽細胞を、発達が終結するようにさせ;
(f)ゲノムがそれの内因性STH遺伝子中にノックアウト分断を含む遺伝子導入非ヒト動物を同定し;および
(g)該遺伝子導入非ヒト動物を育てて、野生型に比べて抑制されたSTHタンパク質発現を呈する遺伝子導入非ヒト動物を得る
段階を含んでもよい。
[1.はじめに]
2月に、ヒトゲノムプロジェクトが、染色体17q21上のタウ遺伝子座を重複するゲノムクローンに関する配列決定を完結させ、発現された配列tag(EST)(寄託#AA325304)が、図6に示されるタウ遺伝子のエクソン9の下流約2.5kbのタウ・イントロン中で同定された。この位置は本発明者らにとって特に興味あるものであったが、これは、FTDにおける突然変異の殆どが、このイントロンおよび隣接するタウのエクソンの中もしくは周辺にあるからである(3)。該ESTは、マラトン(Marathon)小脳cDNAライブラリー(Clontech)中、およびヒトオリゴ樹状膠腫細胞株(これはタウを発現する)中に発現されているのが見出された。しかしながら、COS7細胞から単離されたmRNAは、RT−PCR産物を得るのには上手く行かず、これにより、該mRNAがCOS7細胞中に発現されなかったことが示唆された(データーは示されていない)。
[A.サイトヒン(STH)遺伝子のクローニング]
ヒトオリゴ樹状膠腫細胞株からのRNAを使用して、この推定の遺伝子の5’および3’末端が、Gene Racer kit(Invitrogen)を用いてクローンされた。この全長のクローンの配列は、新しい遺伝子サイトヒン(STH)[故サイトウ・ツナオ博士および彼の研究室に因んで名付けられた]を解明し、これは、イントロンがなく、タウに比べてセンス方向であった。
STHを更に特徴付けるために、本発明者らは、Human Tissue Rapid−ScanaPanel(Origene)を使用して、24のヒト組織における遺伝子発現を解析した(図8)。STHおよびタウは共通の遺伝子座を分け合うので、本発明者らは、STHおよびタウが協調して発現され得るであろうと仮定した。これ故に、タウの発現も試験された。代わりにスプライシングされたそのエクソン10の上流のSTHの位置がそれの発現に影響を及ぼすであろうかどうかを決定するために、エクソン10を有する(図8、パネルA、上方のバンド)およびエクソン10を有さない(図8、パネルA、下方のバンド)タウのアイソフォームも試験された。タウおよびSTHは一般的な組織での発現において有意に重複しているので、更なる研究が、中枢神経系(CNS)発現パターンを決定し、STHおよびタウが脳中で協調して発現されるかどうかを突き止めるために、Human Brain Rapid−ScanaPanel(Origene)を使用して実行された。
対立遺伝子分類ゲル(図5)に関して、QQ、QRおよびRR遺伝子型のHinFI−消化PCR産物が、既知のプロトコールに従って調製された。特に、該被験者のゲノムDNAが、製造者プロトコール(Qiagen)に従って、ゲノムDNA抽出キットを使用して、凍結脳組織から抽出された。このサイトヒンDNA配列はその後、プライマーF−CelIおよびR−CelIを使用する、サイトヒンに関する前記PCRプロトコールを使用して、ADおよび正常なコントロールの被験者からのゲノムDNAから増幅された。このPCR産物の配列決定は、ヌクレオチド多型A→Gを同定し、これは7番目の位置のアミノ酸をグルタミン(Q)からアルギニン(R)へと変え、これによって新しいHinFI制限酵素部位を創出した。遺伝子型の分類に関しては、該PCR産物は、3時間37℃にて、5単位のHinFI{5’−GANTC−3’}制限酵素(New England Biolabs)で消化され、その後臭化エチジウムを有する2.0%アガロース・ゲル上で行われた。
サイトヒン・モノクローナル抗体11F11(IgG2B)、TS6(IgM)、および10B3(IgM)が、前記のように(12)マウスをSTHの組み換えおよび合成両方のペプチドで免疫することにより、生成された。該QQ、QRおよびRR遺伝子型を有する正常(NC)およびアルツハイマー病(AD)被験者の脳タンパク質サンプルが、1XTBS(2mMのPMSF)中で均一化され、タンパク質が、大きさによる分画により部分的に精製された。引き続いて、これらの調製されたサンプルは、37℃にて30分間尿素サンプル緩衝液中でインキュベートされ、その後15%SDS−PAGEゲル上で走らされた(図9)。ECL−ウェスタン・ブロット解析が、以前に記載されたプロトコール(12)を使用して行われた。
該STH遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列解析(図7)は、STHが、遺伝子、タンパク質、シグナル配列、またはモチーフに対して明確な相同性を持たないように思われる128アミノ酸のタンパク質をコード化する(14)ことを解明した。しかしながら、該タウ遺伝子座内のSTHの位置は、それの機能へと洞察を提供し得るであろう。STHおよびタウの両方が同様の発現パターンを分かち合うので、タウおよびSTHは、コリン・アセチルトランスフェラーゼ\胞状アセチルコリン・トランスポーター遺伝子座の例(15)においてと同様に、一緒に機能し得るであろう。マウスのゲノムは、サイトヒンのオープン・リーディング・フレームに100%同じ配列を含有し、このことは、この遺伝子が、齧歯類およびヒトの間で保存されていることを強く示唆する。マウスのゲノムは、該STHオープン・リーディング・フレームに100%同じ配列を含有し、このことは、この遺伝子が、齧歯類およびヒトの間で保存されていることを強く示唆する。
本明細書中で開示される実験および結果に基づけば、幾つかのことがSTHについて分かる。STHは、該タウ遺伝子座中に巣くった(nested)遺伝子である。それはタウの発現パターンに非常に似た発現パターンを持ち、これらの2つのタンパク質が共同して発現され、経路中一緒に機能するかも知れないことを示唆する。このような状況のよく研究された例は、コリン・アセチルトランスフェラーゼ(CHAT)/胞状アセチルコリン・トランスポーター(VCHAT)遺伝子座である。該VCHAT遺伝子は、該CHAT遺伝子のエクソン1および2の間のイントロン内にある。該VCHATおよびCHAT遺伝子は、協調して発現され、それぞれ神経伝達物質アセチルコリン(ACH)の小胞中への取り込み、およびACH合成中に含まれる(15)。魅力的な仮説が、STHおよびタウが、正常状態で一緒に機能するだけではなく、疾患状態でも一緒に機能するかも知れないことを浮かび上がらせ始めている。
1.Beers and Berkow, eds., The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th ed. (Whitehouse Station, NJ: Merck Research Laboratories, 1999) 1395-1398, 1442-48。
Claims (59)
- サイトヒン(STH)をコード化する、単離された核酸配列。
- DNA、cDNA、またはRNAである、請求項1に記載の核酸配列。
- サイトヒン−Q(STH−Q)対立遺伝子である、請求項1に記載の核酸配列。
- 図1において説明されるヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の核酸配列。
- 図3において説明されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化する、請求項1に記載の核酸配列。
- 高ストリンジェント条件下に、図1において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片に相補的な第2の核酸配列へとハイブリダイゼーションする、単離された核酸配列。
- サイトヒン−R(STH−R)対立遺伝子である、請求項1に記載の核酸配列。
- 図2において説明されるヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の核酸配列。
- 図3において説明されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化する、請求項1に記載の核酸配列。
- 高ストリンジェント条件下に、図2において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片に相補的な第2の核酸配列へとハイブリダイゼーションする、単離された核酸配列。
- 精製されたサイトヒンタンパク質。
- サイトヒン−Q(STH−Q)アイソフォームである、請求項11に記載のタンパク質。
- 図3において説明されるアミノ酸配列を含む、請求項11に記載のタンパク質。
- 図1において説明されるヌクレオチド配列によりコード化される、請求項11に記載のタンパク質。
- サイトヒン−R(STH−R)アイソフォームである、請求項11に記載のタンパク質。
- 図4において説明されるアミノ酸配列を含む、請求項11に記載のタンパク質。
- 図2において説明されるヌクレオチド配列によりコード化される、請求項11に記載のタンパク質。
- 高ストリンジェント条件下に、図1において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片に相補的な第2の核酸配列へとハイブリダイゼーションする核酸配列によりコード化される、精製されたタンパク質。
- 高ストリンジェント条件下に、図2において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片に相補的な第2の核酸配列へとハイブリダイゼーションする核酸配列によりコード化される、精製されたタンパク質。
- サイトヒン(STH)タンパク質に特異的な抗体。
- 前記STHタンパク質がSTH−Qアイソフォームである、請求項20に記載の抗体。
- 前記STHタンパク質がSTH−Rアイソフォームである、請求項20に記載の抗体。
- サイトヒン(STH)タンパク質に特異的な抗体を産生する方法であって、
(a)哺乳類をSTHタンパク質で免疫し;および
(b)該哺乳類の組織から、または該哺乳類の組織を使用して作られたハイブリドーマから抗体を精製する
段階を含む方法。 - 請求項23に記載の方法により産生される抗体。
- 前記STHタンパク質がSTH−Qアイソフォームである、請求項23に記載の方法。
- 前記STHタンパク質がSTH−Rアイソフォームである、請求項23に記載の方法。
- サイトヒン(STH)をコード化する核酸配列を含むベクター。
- 前記核酸配列がサイトヒン−Q(STH−Q)対立遺伝子である、請求項27に記載のベクター。
- 前記核酸配列が図1において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片を含む、請求項27に記載のベクター。
- 前記核酸配列が、高ストリンジェント条件下に、図1において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片に相補的な核酸配列へとハイブリダイゼーションする、請求項27に記載のベクター。
- 前記核酸配列がサイトヒン−R(STH−R)対立遺伝子である、請求項27に記載のベクター。
- 前記核酸配列が、図2において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片を含む、請求項27に記載のベクター。
- 前記核酸配列が、高ストリンジェント条件下に、図2において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片に相補的な核酸配列へとハイブリダイゼーションする、請求項27に記載のベクター。
- 請求項27に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項28に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項31に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- サイトヒン(STH)タンパク質を作る方法であって、
(a)宿主細胞中へ、STHをコード化する核酸配列を導入し;
(b)該核酸配列が発現されてSTHタンパク質を産生するような条件下に、該宿主細胞を維持し;および
(c)該STHタンパク質を回収する
段階を含む方法。 - 前記STHタンパク質がSTH−Qアイソフォームである、請求項37に記載の方法。
- 前記STHタンパク質がSTH−Rアイソフォームである、請求項37に記載の方法。
- ゲノムがそれの内因性STH遺伝子中で分断を含む、遺伝子導入非ヒト動物。
- 前記分断が前記STH遺伝子中のノックアウト突然変異である、請求項40に記載の遺伝子導入動物。
- サイトヒン(STH)タンパク質を過剰に発現する遺伝子導入非ヒト動物。
- 前記STHタンパク質がサイトヒン−Qアイソフォームである、請求項42に記載の遺伝子導入動物。
- 前記STHタンパク質がサイトヒン−Rアイソフォームである、請求項42に記載の遺伝子導入動物。
- 被験者がアルツハイマー病(AD)を持っているか、またはADを進展させるリスクが増大しているかどうかを決定する方法であって、サイトヒン(STH)の1つ以上の対立遺伝子の存在に関して、該被験者の診断サンプルをアッセイすることを含み、ここでSTH−R対立遺伝子の存在の検出が、該被験者がADを持っているか、またはADを進展させるリスクが増大していることを指し示す方法。
- 前記診断サンプルが、STHをコード化する核酸へとハイブリダイゼーションする少なくとも1つの核酸プローブを使用してアッセイされる、請求項45に記載の方法。
- 前記核酸プローブがDNAまたはRNAである、請求項45に記載の方法。
- 前記核酸プローブが検出可能なマーカーで標識された、請求項47に記載の方法。
- 前記診断サンプルが、STHタンパク質の1つ以上のアイソフォームの発現に関してアッセイすることにより、STHの1つ以上の対立遺伝子の存在に関してアッセイされる、請求項45に記載の方法。
- 前記診断サンプルが、STHと反応性の物質を使用してアッセイされる、請求項45に記載の方法。
- 前記物質が検出可能なマーカーで標識される、請求項50に記載の方法。
- 前記物質が抗体である、請求項50に記載の方法。
- 前記抗体が検出可能なマーカーで標識される、請求項52に記載の方法。
- アルツハイマー病(AD)を持っているか、またはこれを進展させるかも知れない被験者の予後を査定する方法であって、サイトヒン(STH)の1つ以上の対立遺伝子の存在に関して、該被験者の診断サンプルをアッセイすることを含み、ここで、該被験者の該診断サンプル中の2つのSTH−R対立遺伝子の存在が、該被験者に関してのより悲観的な予後を指し示す方法。
- 前記診断サンプルが、STHをコード化する核酸へとハイブリダイゼーションする少なくとも1つの核酸プローブを使用してアッセイされる、請求項54に記載の方法。
- 前記診断サンプルが、STHタンパク質の1つ以上のアイソフォームの発現に関してアッセイすることにより、STHの1つ以上の対立遺伝子の存在に関してアッセイされる、請求項54に記載の方法。
- 前記診断サンプルが、STHと反応性の物質を使用してアッセイされる、請求項54に記載の方法。
- 被験者がアルツハイマー病(AD)を持っているか、またはADを進展させるリスクが増大しているかを決定するためのキットであって、サイトヒン(STH)の1つ以上の対立遺伝子の存在を検出する試薬、および該被験者がアルツハイマー病(AD)を持っているか、またはADを進展させるリスクが増大しているかを決定するためのキットを使用することに関しての説明書を含むキット。
- 更に容器を含む、請求項58に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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