JP2003517812A

JP2003517812A - ＰｒＰ様遺伝子

Info

Publication number: JP2003517812A
Application number: JP2000616348A
Authority: JP
Inventors: スタンレイビー．プルシナー; パトリックトレンブライ; リチャードムーア; デビッドウェスタウェイ; レロイイー．フッド; インヨルリー
Original assignee: ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア; ガバニングカウンシルオブザユニバーシティーオブトロント; ザユニバーシティーオブワシントン
Priority date: 1999-05-11
Filing date: 2000-05-11
Publication date: 2003-06-03
Also published as: EP1181365A4; WO2000068382A1; KR20020026430A; EP1181365A1; WO2000068382A9; CA2373507A1; AU5132100A; US20010021771A1; BR0010479A; US6277970B1; CN1355845A; IL146332A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、ドッペル（Doppel）（「Dpl」）タンパク質をコードする核酸、Dplペプチド、ならびにDpl核酸および／またはペプチドを利用するアッセイ法を提供する。関連した局面において、本発明は、ヒトDplポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターおよび宿主細胞を特徴とする。また、本発明は、ヒトDplポリペプチドと特異的に結合する抗体、ヒトDplポリペプチドの産生のための方法、Dplを発現する細胞を同定するための方法、培養下またはインビボにおいて細胞機能およびプリオン感染性を改変する目的でDpl遺伝子およびDplポリペプチドを用いるための方法、ならびにDplコード配列、調節配列、およびDpl発現レベルの変化を検出することによる変性疾患のリスクのある個体の同定にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は核酸とそのような核酸にコードされるタンパク質、およびそれらの核
酸ならびに／またはタンパク質の使用を含むアッセイ法に関する。

【０００２】発明の背景プリオンは、ヒト及び動物において中枢神経系の海綿状脳症を引き起こす感染
性病原体である。プリオンは、細菌、ウイルスおよびウイロイドとは異なる。現
在の有力な仮説は、プリオンタンパク質の感染性には核酸成分は必要でないとい
うものである。さらに、1つの種の動物（例えばヒト）に感染するプリオンは、
別の種（例えばマウス）に容易に感染しないと考えられる。

【０００３】プリオンおよびこれによって引き起こされる疾患の研究における重要な段階は
、プリオンタンパク質（「PrP」）と命名されたタンパク質の発見および精製で
あった［Boltonら、Science 218:1309〜11（1982）；Prusinerら、Biochemistry
21:6942〜50（1982）；McKinleyら、Cell 35:57〜62（1983）］。その後、プリ
オンタンパク質をコードする完全な遺伝子のクローニング、塩基配列決定、およ
びトランスジェニック動物における発現がなされた。PrP^Ｃは単一コピーの宿主
遺伝子によってコードされ［Baslerら、Cell 46:417〜28（1986）］、通常は神
経細胞の外表面に認められる。プリオン病は、PrP^ＣがPrP^ＳＣと呼ばれる変異型
に変換されることによって起こるという仮説が有力である。

【０００４】動物およびヒトの感染性神経変性疾患の感染および発病にはいずれもプリオン
タンパク質（PrP^ＳＣ）のスクレイピー型アイソフォームが必要であることが示
された。これについては、プルシナー（Prusiner, S.B）、「プリオン病の分子
生物学（Molecular biology of Prion Disease）」、Science、252:1515〜1522
（1991）を参照されたい。動物で最も頻度の高いプリオン病は、ヒツジおよびヤ
ギのスクレイピー、ならびにウシの牛海綿状脳症（BSE）である［Wilesmith, J
およびWells, Microbiol. Imunol. 172:21〜38（1991）］。ヒトでは以下の4種
類のプリオン病が確認されている：(1)クールー、(2)クロイツフェルト・ヤコブ
病（CJD）、(3)ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（GSS）、およ
び(4)致死性家族性不眠症（FFI）［Gajdusek, D.C., Science 197:943〜960（19
77）；Medoriら、N. Eng. J. Med. 326:444〜449（1992）］。ヒトのプリオン病
が散発性、遺伝性および感染性の疾患として出現する理由は、当初は謎であった
が、現在ではPrPの細胞遺伝学的な由来によって説明されている。

【０００５】 CJD症例のほとんどは散発的であるが、約10％〜15％はヒトPrP遺伝子の変異に
よって生じる常染色体優性遺伝疾患として遺伝する（Hsiaoら、Neurology 40：1
820〜1827（1990）；Goldfarbら、Science 258：806〜808（1992）；Kitamotoら
、Proc. R. Soc. Lond. 343：391〜398（1994））。医原性CJDは、死体脳下垂体
由来のヒト成長ホルモン、さらには硬膜移植片により引き起こされる（Brownら
、Lancet 340：24〜27）。CJDと、スクレイピーに感染したヒツジ肉の摂取など
の感染原因とを関連づけるための多くの試みにもかかわらず、医原的に誘発され
た疾患の場合を除いて、現在まで同定されたものはない（Harries-Jonesら、J.
Neurol. Neurosurg. Psychiatry 51：1113〜1119（1988））。一方、ニューギニ
ア高地のフォレ（Fore）族および近隣種族を数十年にわたって打ちのめしてきた
クールーは、儀式として行われる食人風習に伴う感染によって蔓延したと考えら
れている（Alpers, M. P.、「神経系の遅発性伝染病（Slow Transmissible Dise
ases of the Nervous System）」、第1巻、S.B. PrusinerおよびW.J. Hadlow編
（New York；Academic Oress）、pp. 66〜90（1979））。

【０００６】実験用霊長類へのCJDの初期の伝染には、ウイリアムハドロー（William Hadlo
w）によるクールーとスクレイピーとの間の類似性の認識に始まる多くの歴史が
ある。1959年に、ハドロー（Hadlow）は、クールーで死亡した患者由来の抽出物
を非ヒトの霊長類へ接種し、長い潜伏期間の後に、該動物に予想された疾患が観
察されることを示した（Hadlow.W.J.（1959）Lancet 2:289〜290）7年後、ガイ
ドユセック（Gajdusek）、ギブス（Gibbs）およびアルパース（Alpers）は、18
ヶ月〜21ヶ月にわたる潜伏期間の後の、チンパンジーへのクールーの伝染性を示
した（Gajdusekら（1966）Nature 209:794〜796）。クールーの神経病理学とCJD
の神経病理学との類似性（Klatzoら（1959）Lab Invest. 8:799〜847）により、
チンパンジーにおける同様の実験が促され、疾患の伝染性が1968年に報告された
（Gibbs.Jr.ら（1968）Science 161:388〜389）。その後25年間の間、CJD、クー
ルー、およびGSSの約300の症例が、様々な類人猿およびサルに伝染された。

【０００７】このような実験の犠牲、不足、及びしばしば認められる残忍さは、この研究を
制限し、従って知識の蓄積を制限した。信頼のおける伝染データのほとんどが非
ヒト霊長類を用いた研究に派生すると言われる一方で、明らかにより不規則では
あるが、ヒトプリオン病の症例のいくつかは齧歯類にも伝染する（Gibbs, Jr.ら
、「神経系の遅発性伝染性疾患（Slow Transmissible Diseases of the Nervous
System）」、第2巻、S.B. PrusinerおよびW.J. Hadlow編（New York；Academic
Press）、pp. 87〜110（1979）；Takeishiら、「ヒトおよび動物のプリオン病
（Prion Diseases of Humans and Animals）」、Prusinerら編（London：Ellis
Horwood）、pp. 129〜134（1992））。

【０００８】 PrP^ＣのPrP^ＳＣへの変換を解明する意義は、ウシプリオンが変異型クロイツフ
ェルト・ヤコブ病（vCJD）を発症したヒトに伝染していた可能性を受けて強まっ
ている。シャゾット（G. Chazot）ら、Lancet 347：1181（1996）；ウィル（R.G
. Will）ら、Lancet 347：921〜925（1996）。以前の研究で、スクレイピーの感
染性を失わずにPrP^ＳＣのN末端を切断しうること（プルシナー（S.B. Prusiner
）ら、Biochemistry 21：6942〜6950（1982）；プルシナー（S.B. Prusiner）ら
、Cell 38：127〜134（1984））、および同様に、PrP^ＳＣのN末端を切断しても
そのPrP^ＳＣへの変換が可能であること（M. Rogersら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90：3182〜3186（1993））が示されている。

【０００９】最近の研究により、PrP^ＣのPrP^ＳＣへの構造転換を分子レベルで可視化する能
力が進歩している。例えば、N末端部分は比較的明確な構造をとらず柔軟である
が、C末端部分の内部にある構造要素の安定化を助ける。ダン（D.G. Donne）ら
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：13452〜13457（1997）。さらに、免疫学的
研究によってPrP^ＳＣではN末端エピトープが潜在性であることが示されており、
このことはプリオンの伝播時にこの領域が重大なコンフォメーション変化を受け
るという見解を裏づける。ペレツ（Peretz）ら、J. Mol. Biol. 273：614〜622
（1997）。

【００１０】これらの進歩にもかかわらず、病原性転換過程の構造生物学的な理解は多くの
点で不完全なままとなっている。例えば、コンフォメーション変化が起こるため
にPrP^Ｃのどの構造領域が必要または十分であるかは正確にはわかっていない。
また、PrP^ＳＣのどの領域が感染性にとって必要または十分であるかもわかてい
ない。これまでの証拠はプリオン系統に関する現象および種間障壁が選択的なPr
Pコンフォメーションに符号化されていることを示しているが、これらのコンフ
ォメーションの正確な構造的決定因子は厳密には同定されていない。テリング（
Telling）ら、Science 274：2079〜2082（1996）；ビレター（Billeter）ら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 94：7281〜7285（1997）。最近の研究で、PrP^ＣのPr
PScへのコンフォメーション変化を促進すると想定されている推定上の因子であ
るタンパク質Xと相互作用すると思われる、マウスPrP（MoPrP）の4つの残基が同
定されている。テリング（Telling）ら、Cell 83：79〜90（1995）。この4つの
アミノ酸がすべて集まり、組換えPrIP 90-231およびPrIP 29-231の四次構造にお
いて、タンパク質Xの結合部位と推定されるものを形成する。ダン（D.G. Donne
）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：13452〜13457（1997）；ジェームズ（T
.L. James）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：10086〜10091（1997）。しか
し、PrP^Ｃと結合するタンパク質に関していくつか報告はあるものの、タンパク
質Xの実体は依然として不明である。さらに、リフォールディングした組換えPrP
分子の構造はPrP^Ｃと類似している可能性はあるが、PrP^ＳＣの構造解明もまだ不
十分なままである。

【００１１】 PrPの機能を明らかにするための1つの戦略は、PrPに類似したタンパク質の同
定、およびこのようなタンパク質の機能の解明によるものである。プリオン関連
遺伝子の同定および検討は、神経変性疾患の一般的生物学および進行に洞察をも
たらすほか、プリオン媒介性疾患を引き起こす機構上の変化にも洞察をもたらす
と思われる。このため、当技術分野には、構造および／または機能が類似したタ
ンパク質をコードする遺伝子の同定および検討に対する需要が存在する。

【００１２】発明の概要本発明は、ドッペル（Doppel）（「Dpl」）タンパク質をコードする核酸、Dpl
ペプチド、ならびにDpl核酸および／またはペプチドを利用するアッセイ法を提
供する。1つの特定の局面において、Dplタンパク質は、配列番号：1のヌクレオ
チド配列およびその縮重配列によってコードされる。加えて本発明は、Dplプロ
モーターを含む単離された核酸配列、さらにはストリンジェントな条件下で配列
番号：1とハイブリダイズする核酸配列を特徴とする。関連した局面において、
本発明は、ヒトDplポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターおよび宿
主細胞を特徴とする。また、本発明は、ヒトDplポリペプチドと特異的に結合す
る抗体、ヒトDplポリペプチドの産生のための方法、Dplを発現する細胞を同定す
るための方法、培養下またはインビボにおいて細胞機能およびプリオン感染性を
改変する目的でDpl遺伝子およびDplポリペプチドを用いるための方法、ならびに
Dplコード配列、調節配列、およびDpl発現レベルの変化を検出することによる変
性疾患のリスクのある個体の同定にも関する。

【００１３】本発明の第1の目的は、ヒトDplの発現（例えば、組換え宿主細胞における）に
用いるため、および、例えば、ヒトDplポリペプチド結合化合物（特にヒトDplポ
リペプチドを介した活性に影響を及ぼすような化合物、このような化合物はDpl
活性の調節に用いうる）の同定に用いるために、ヒトDplポリペプチドをコード
する単離された核酸を提供することである。

【００１４】本発明のもう1つの目的は、Dpl遺伝子機能に関する非ヒトトランスジェニック
動物モデル、特に、Dpl遺伝子の過剰発現または異所性発現を特徴とする「ノッ
クイン」Dpl非ヒトトランスジェニック動物の作製に用いるために、ヒトDplポリ
ペプチドをコードする単離された核酸を提供することである。

【００１５】特に、DplはPrP遺伝子座の産物と協同的に相互作用するように思われ、Dpl遺
伝子座における変異により、スクレイピー型のPrPであるPrP^ＳＣに感染した動物
の潜伏期は短縮する。プリオン媒介性疾患が要する潜伏期を調節すること、さら
にはプリオン感染症の測定可能な症状発現に要する潜伏期を調節する化合物を同
定することを目的とするアッセイ法においてDNA発現産物を用いるための、Dplを
コードするDNAも開示される。

【００１６】また、本発明は、DplをコードするDNAと、またはドッペル（Doppel）をコード
するDNAに対して相補的なDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るDNA配列も特徴とする。このようなDNA配列の長さは好ましくは少なくとも25ヌ
クレオチド、より好ましくは50ヌクレオチドである。Dplのペプチド断片、例え
ばアッセイ法において有用なものの長さは、好ましくは少なくとも10アミノ酸、
より好ましくは少なくとも30アミノ酸である。

【００１７】本発明は、宿主動物および遺伝的に異なる動物の両方からの配列を有するキメ
ラ型Dpl遺伝子、ならびにこのような遺伝子を含むトランスジェニック動物も特
徴とする。

【００１８】本発明の1つの目的は、新規Dplタンパク質およびその機能的同等物をコードす
るヌクレオチド配列を提供することである。

【００１９】もう1つの目的は、Dplをコードするヌクレオチド配列を発現するように遺伝的
に操作された細胞系を提供することである。

【００２０】もう1つの目的は、Dplタンパク質またはそのペプチドと選択的に結合する抗体
を提供することである。

【００２１】もう1つの目的は、化合物または化合物のライブラリーを、Dplヌクレオチド配
列によって発現されるタンパク質の活性を活性化または遮断する能力に関してア
ッセイしうる方法を提供することである。

【００２２】本発明の1つの利点は、Dplの活性および／または発現を強める変異がプリオン
感染を促進し、それによって接種物によるプリオン感染性を動物アッセイ法、例
えばトランスジェニックHuPrPマウスアッセイ法において早期に同定することが
可能になることである。

【００２３】本発明の1つの局面は、（1）ヒトDpl、（2）ヒトDplおよびヒトPrP、（3）Dpl
およびPrPに関するヒト／マウスキメラ型遺伝子、（4）ウシDpl、（5）ウシDpl
およびウシPrP、（6）DplおよびPrPに関するウシ／マウスキメラ型遺伝子、（7
）内因性Dplおよび／またはPrP遺伝子が除去された（1〜6）の組み合わせ、（7
）ヒツジDpl、（8）ヤギDpl、（9）オオジカDpl、ならびに（10）シカDplを発現
する、トランスジェニックマウスである。本発明において用いうるトランスジェ
ニックマウスは、1996年10月15日に発行された米国特許第5,565,186号、1998年6
月9日に発行された第5,763,740号、1998年8月4日に発行された第5,789,655号、
および1998年8月11日に発行された第5,792,901号に記載されており、これらは参
照として本明細書に組み入れられる。

【００２４】本発明の上記およびその他の目的、利点および特徴は、本開示を読むことによ
り、当業者には明らかになると考えられる。

【００２５】好ましい態様の詳細な説明本DNA分子、タンパク質、および使用の方法について記載する前に、本発明は
特定の記載された分子に限定されることなく、当然ながら変更されうることが理
解されねばならない。また、本明細書で用いられた専門用語は特定の態様の説明
のみを目的としていて、限定することを意図したものではなく、本発明の範囲は
添付する特許請求の範囲によってのみ制限されうることが理解されねばならない
。

【００２６】別に特記しない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が属す
る技術分野の当業者が一般に理解しているものと同一の意味を有する。本発明の
実施または試験においては、本明細書に記載したものと同様または同等の任意の
材料および方法を利用することができるが、好ましい方法および材料は以下に記
載する。本明細書に記載した刊行物はすべて、その文献に関して引用される方法
および／または材料を説明または開示する目的で、参照として本明細書に組み入
れられる。

【００２７】本明細書において考察された刊行物は、本出願の提出日の以前の開示のみのた
めに提供される。本明細書中のいかなる記載も、先行発明の価値により、そのよ
うな出願に本発明が先行する権利を持たないことを認めたものと解釈されるべき
ではない。さらに、実際の出願日と提供された出願日が異なる場合、別個に確認
される必要がありうる。

【００２８】定義本明細書で用いる「核酸」という用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド
およびその断片もしくは一部のほか、そのペプチド核酸（PNA）、断片、一部ま
たはアンチセンス分子、ならびにゲノムまたは合成物に由来するDNAまたはRNAの
ことを指し、これは1本鎖でも2本鎖でもよく、センス鎖でもアンチセンス鎖でも
よい。特定の核酸配列（例えば、Dplポリペプチドをコードする核酸）に言及す
るために「核酸」が用いられる場合、「核酸」は、詳述されるポリペプチドと機
能的に同等なポリペプチドをコードする核酸、例えば、縮重変異体である核酸、
または詳述されるポリペプチドの生物的活性のある変異体もしくは断片をコード
する核酸を含む意味をもつ。同様に、本明細書で用いる「ポリペプチド」は、オ
リゴペプチド、ペプチドまたはタンパク質のことを指す。「ポリペプチド」が、
天然のタンパク質分子のアミノ酸配列に言及するために本明細書で用いられる場
合には、「ポリペプチド」などの用語は、アミノ酸配列が詳述されるタンパク質
分子に関連した完全な自然のままのアミノ酸配列に制限されることを意味するも
のではない。

【００２９】「アンチセンス核酸」とは、所定の核酸配列の転写または翻訳にかかわる核酸
配列（例えば、Dplポリペプチドをコードする核酸のプロモーター）を含む、所
定の核酸配列（例えば、Dplポリペプチドをコードする核酸配列）に対して相補
的なヌクレオチド配列を有する核酸のことを意味し、本アンチセンス核酸はDpl
ポリペプチドをコードする核酸配列とハイブリダイズしうる。特に関心がもたれ
るのは、Dplをコードする核酸の転写および／またはスプライシングおよび／ま
たは翻訳を、インビトロまたはインビボで阻害しうるアンチセンス核酸である。

【００３０】本明細書で用いる「ペプチド核酸」とは、リジンなどのアミノ酸残基およびア
ミノ基が付加されたオリゴマーを含む分子のことを指す。これらの低分子は抗遺
伝子薬（anti-gene agent）とも呼ばれ、核酸の相補（テンプレート）鎖に結合
することによって転写伸長を停止させる（Nielsenら、Anticancer Drug Des 8：
53〜63（1993））。

【００３１】「ポリペプチド」とは、その長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）
の有無とは無関係に、アミノ酸の任意の連鎖のことを意味する。

【００３２】本明細書で用いる場合、「Dplポリペプチド」とは、i）天然のDplポリペプチ
ド、ii）Dplポリペプチドの生物的活性のある断片、iii）Dplポリペプチドの生
物的活性のあるポリペプチド類似体、もしくはiv）Dplポリペプチドの生物的活
性のある変異体、のアミノ酸配列を有する組換えまたは非組換えポリペプチドの
アミノ酸配列のことを指す。本発明のDplポリペプチドは、任意の種、例えば、
哺乳動物または非哺乳動物（例えば、爬虫類、両生類、鳥類（例えば、ニワトリ
））、特にヒト、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウシ、ヒツジ、ブタ
、マウスまたはウマを含む哺乳動物、好ましくはラットまたはヒトからのものを
、天然、合成、半合成または組換えを問わずに任意の供給源から入手可能である
。「ヒトDplポリペプチド」とは、ヒトから入手した単離されたヒトDplポリペプ
チドのアミノ酸配列のことを指し、アミノ酸配列が詳述されるタンパク質分子に
関連した完全な自然のままのアミノ酸配列に制限されることを意味するものでは
ない。

【００３３】本明細書で用いる「抗原性アミノ酸配列」とは、単独または担体分子との組み
合わせで哺乳動物における抗体産生応答を誘発しうるアミノ酸配列のことを意味
する。

【００３４】ヒトDplポリペプチドの「変異体」とは、1つまたは複数のアミノ酸が変化した
アミノ酸配列と定義される。変異体は、例えばロイシンからイソロイシンへの置
換のように、置換されたアミノ酸が類似した構造的または化学的特性を有する「
保存的」変化を有しうる。さらに稀には、変異体は、例えばグリシンからトリプ
トファンへの置換のような「非保存的」変化を有しうる。同様の軽微な変化には
アミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方も含まれうる。生物的または免疫
学的活性を失うことなく置換、挿入または挿入しうるアミノ酸残基の内容および
その数を決定する際の手引きは、当技術分野で周知のコンピュータプログラム、
例えばDNAスター（DNAStar）ソフトウエアを用いて得ることができる。

【００３５】「欠失」とは、天然のDplポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配
列と比べて、それぞれ1つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチド残基が存在
しない、アミノ酸またはヌクレオチド配列の変化と定義される。

【００３６】「挿入」または「付加」とは、天然のDplポリペプチドのアミノ酸配列または
ヌクレオチド配列と比べて、それぞれ1つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオ
チド残基の追加が生じる、アミノ酸またはヌクレオチド配列の変化のことである
。

【００３７】「置換」は、天然のDplポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列
と比べて、それぞれ1つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチドが異なるアミ
ノ酸またはヌクレオチドによって置換されることに起因する。

【００３８】「生物的活性のある」という用語は、天然のDplポリペプチドの構造的、調節
的または生化学的な機能を有するヒトDplポリペプチドのことを指す。同様に「
免疫学的活性のある」とは、適切な動物または細胞において特定の免疫応答を誘
発し、特異性抗体と結合する、天然、組換えもしくは合成性のヒトDplポリペプ
チド、またはその任意のオリゴペプチドの能力を定めたものである。

【００３９】本明細書で用いる「誘導体」という用語は、ヒトDplポリペプチドをコードす
る核酸またはコードされるヒトDplポリペプチドの化学的修飾物のことを指す。
このような修飾の例には、水素のアルキル、アシルまたはアミノ基による置換が
考えられる。核酸誘導体は、天然のDplポリペプチドの本質的な生物特性を保っ
ているポリペプチドをコードするものと考えられる。

【００４０】本明細書で用いる「単離された」という用語は、その化合物が天然にみられる
環境とは異なる環境にある、関心対象の化合物（例えば、核酸またはポリペプチ
ド）を説明する意味をもつ。「単離された」とは、関心対象の化合物が実質的に
豊富に存在する試料中、および／または関心対象の化合物が部分的もしくは実質
的に精製された試料中にある化合物を含む意味をもつ。

【００４１】本明細書で用いる「実質的に精製された」という用語は、天然の環境から除去
されており、天然に付随する他の成分を除いた部分が少なくとも60％、好ましく
は75％、最も好ましくは90％である化合物（例えば、核酸またはポリペプチドの
いずれか）のことを指す。

【００４２】「ストリンジェンシー」は一般に、ほぼTm-5℃（プローブのTmの5℃以下）か
らTmの約20℃〜25℃以下の範囲で得られる。当業者には理解されると思われるが
、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、同一な核酸配列の同定もし
くは検出のため、または類似または関連した核酸配列の同定もしくは検出のため
に操作可能である。

【００４３】本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション」という用語は、「核酸の鎖が相
補鎖と塩基対形成によって接合する任意の過程」を含むものとする（Coombs、バ
イオテクノロジー辞典（Dictionary of Biotechnology）、Stockton Press、New
York NY（1994））。ポリメラーゼ連鎖反応において行われる増幅は、ディーフ
ェンバック（Dieffenbach）ら、「PCRプライマー、実験マニュアル（PCR Primer
, a Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor Press、Plainview NY（1995
）に記載されている。

【００４４】「形質転換」とは、新たなDNA（すなわち、細胞にとって外因性であるDNA）を
組み入れた後に細胞において誘導される、永続的または一過的な遺伝的変化、好
ましくは永続的な遺伝的変化のことを意味する。遺伝的変化は、宿主細胞のゲノ
ムへの新たなDNAの組み込み、または新たなDNAをエピソーム因子として一時的も
しくは安定的に維持することによって実現しうる。細胞が哺乳動物細胞である場
合には、永続的な遺伝的変化は一般に、細胞のゲノムへのDNAの導入によって実
現される。

【００４５】「構築物」とは、特定のヌクレオチド配列の発現のために作製された、または
他の組換えヌクレオチド配列の構築に用いようとする組換え核酸、一般には組換
えDNAのことを意味する。

【００４６】「機能的に結合した」とは、DNA配列および調節配列が、適切な分子（例えば
、転写活性化タンパク質）がその調節配列に結合した際に遺伝子発現が可能とな
るような様式で連結していることを意味する。

【００４７】「機能的に挿入された」とは、関心対象のヌクレオチド配列が、導入した関心
対象のヌクレオチド配列の転写および翻訳を指令する（すなわち、例えば、Dpl
配列によってコードされるポリペプチドなどの産生を促進する）ヌクレオチド配
列に隣接して位置することを意味する。

【００４８】「Dpl関連疾患」とは、Dpl機能の変化（例えば、異常なDplの発現、またはDpl
発現もしくはDplタンパク質の欠陥に起因するもの）と関連のある生理的状態ま
たは疾患のことを意味する。このようなDpl関連疾患には、必ずしも制限的では
ないものの、プリオン様疾患、または神経毒性および／もしくは神経変性が関与
する他の類似の疾患が含まれる。

【００４９】「導入遺伝子」という用語は、本明細書において、哺乳動物、特に生きている
動物の哺乳動物細胞のゲノム中に人為的に挿入された、またはされようとする遺
伝物質を説明するために用いられる。

【００５０】「トランスジェニック生物」とは、その細胞の一部に染色体外因子として存在
するか、またはその生殖系列DNA中に安定的に組み込まれた、非内因性（すなわ
ち異種）核酸配列を有する、非ヒト生物（例えば、単細胞生物（例えば、酵母）
）、哺乳動物、非哺乳動物（例えば、センチュウまたはショウジョウバエ）を意
味する。

【００５１】「トランスジェニック動物」とは、細胞の一部に染色体外因子として存在する
か、またはその生殖系列DNA中（すなわち大部分またはすべての細胞のゲノム配
列中）に安定的に組み込まれた、非内因性（すなわち、異種）核酸配列を有する
、非ヒト動物、通常は哺乳動物を意味する。異種核酸は、例えば宿主動物の胚ま
たは胚性幹細胞の遺伝的操作により、このようなトランスジェニック動物の生殖
系列に導入される。マウスは好ましいトランスジェニック動物である。

【００５２】標的遺伝子の「ノックアウト」とは、好ましくは標的遺伝子の発現が検出不能
または意味のない程度となるような、標的遺伝子の機能低下をもたらす遺伝子の
配列の改変のことを意味する。Dpl遺伝子のノックアウトとは、発現が検出不能
であるか、または意味のないレベルで存在するに過ぎないほどにDpl遺伝子の機
能が実質的に低下していることを意味する。本発明の「ノックアウト」トランス
ジェニック体は、Dpl遺伝子のヘテロ接合型ノックアウトまたはDpl遺伝子のホモ
接合型ノックアウトを有するトランスジェニック動物でありうる。「ノックアウ
ト体」には、例えば標的遺伝子の改変を促進する物質に対する動物の曝露、標的
遺伝子部位の組換えを促進する酵素（例えばCre-lox系におけるCre）の導入、ま
たは出生後に標的遺伝子を改変させるためのその他の方法を用いた際に標的遺伝
子の改変を生じうる条件的ノックアウト体も含まれる。

【００５３】標的遺伝子の「ノックイン」とは、例えば標的遺伝子の追加的コピーの導入に
よる、または標的遺伝子の内因性コピーの発現増強をもたらす調節配列の機能的
挿入による、標的遺伝子の発現の変化（例えば、発現の上昇（異所性を含む）ま
たは低下）が生じる宿主ゲノムの改変のことを意味する。本発明の「ノックイン
体」は、Dpl遺伝子のヘテロ接合型ノックインまたはDpl遺伝子のホモ接合型ノッ
クインを有するトランスジェニック動物でありうる。「ノックイン体」には条件
的ノックイン体も含まれる。

【００５４】「Prnp^０／０またはPrnp-Abl」という用語は、PrP遺伝子が除去されたトラン
スジェニック動物のことを指し、「0/0」は両方の対立遺伝子がともに除去され
、「o/+」は一方のみが除去されたことを示す。特にこれによって言及される動
物は、一般にはPrP遺伝子が除去されたトランスジェニック動物、すなわちPrPノ
ックアウトマウスである。PrP遺伝子が破壊されているため、マウスPrPタンパク
質は発現されない。

【００５５】「プリオン」という用語は、ヒトおよびウシを含む動物において疾患(海綿状
脳症)を引き起こすことが既知である感染性粒子を意味する。「プリオン」は
、「タンパク質」および「感染」の単語が省略された用語であり、かつその粒子
は、限定するわけではないが、PrP遺伝子によりコードされた大部分のPrP^Sc分子
を含む。プリオンは、細菌、ウイルス、およびウイロイドからは区別される。公
知のプリオンは、動物に感染することを含み、ヒツジおよびヤギのスクレイピー
、神経系の伝播性変性疾患に加え、ウシの海綿状脳症(BSE)または「狂牛病」、
およびネコの海綿状脳症を引き起こす。ヒトに作用することが既知である4種の
プリオン疾患は、(1)クールー、(2)クロイツフェルト−ヤコブ病(CJD)、(3)ゲル
ストマン−ストロイスラー−シャインカー病(GSS)、および(4)致死性家族性不眠
症(FFI)である。本明細書において使用されるように、プリオンとは、使用され
る任意の動物、特にヒト、ウシおよびその他の家畜動物において、これらの疾患
または他の疾患の全てまたはいずれかを惹起する全てのプリオン型を含む。

【００５６】「PrP遺伝子」および「Prnp遺伝子」という用語は、タンパク質（例えば、199
6年10月15日に発行された米国特許第5,565,186号の図3〜5に示されたもの）、な
らびに本明細書に「病原性の変異および多型」との小見出しを付けて一覧を示す
ような多型物および変異物を発現する遺伝物質を説明するために、本明細書にお
いて互換的に用いられる。PrP遺伝子は、本明細書で説明する「宿主」および「
被験」動物を含む任意の動物、ならびにそのいずれかおよびすべての多型物およ
び変異物から得ることができ、この用語には、まだ発見されていない他のこのよ
うなPrP遺伝子も含まれることが認識される必要がある。

【００５７】「人工的なPrP遺伝子」という用語は、本明細書において、「キメラ型PrP遺伝
子」のほか、宿主動物（マウスなど）のゲノムに含められた際に、例えばヒト、
ウシまたはヒツジなどの遺伝的に異なる被験動物のみを通常は感染させるプリオ
ンに対する感染性をその哺乳動物が獲得するような、組換えによって構築された
その他の遺伝子も包含するために用いられる。一般に、人工的な遺伝子には、異
なるコドン、好ましくは遺伝的に別種の哺乳動物（ヒトなど）の対応するコドン
との置換によって天然の配列の1つまたは複数（しかし全体ではなく、一般的に
は40個未満）のコドンが遺伝的に改変されている哺乳動物のPrP遺伝子のコドン
配列が含まれる。遺伝的に改変された哺乳動物は、遺伝的に異なる哺乳動物のみ
を感染させるプリオンに関して試料を解析するために用いられる。人工的な遺伝
子の実例は、マウスのすべてのコドンがヒト、ウシまたはヒツジの異なるコドン
によって置換されてはいないという条件の下で、米国特許第5,565,186号の図3、
4および5に示した通りのマウスのコドンの同じ位置が、図に示したヒト、ウシお
よびヒツジのコドンから選択された1つまたは複数のコドンによって異なる形態
に置換された配列をコードするマウスPrP遺伝子である。本発明の人工的なPrP遺
伝子は、遺伝的に別種の動物のコドンを含むだけでなく、CJDなどの遺伝性プリ
オン病に関連したコドンおよびコドン配列、ならびに天然のPrP遺伝子とは関連
しないもののそれが動物に挿入されると通常は遺伝的に別種の動物のみを感染さ
せるプリオンに対する感染性が該動物に付与されるようなコドンおよびコドン配
列も含まれる。

【００５８】「キメラ型遺伝子」「キメラ型PrP遺伝子」などの用語は、1つまたは複数のコ
ドンがヒト、ウシまたはヒツジなどの遺伝的に別種の被験動物からの対応するコ
ドンによって置換された、マウスなどの宿主動物のコドンを含む人工的に構築さ
れた遺伝子を意味するために、本明細書では互換的に用いられる。1つの特殊な
例においては、キメラ型遺伝子は、宿主動物種（マウスなど）となる哺乳動物の
PrP遺伝子の開始配列および終止配列（すなわち、N末端コドンおよびC末端コド
ン）を含み、また第2の種（ヒトなど）の被験哺乳動物のPrP遺伝子の対応部分の
ヌクレオチド配列も含む。キメラ型遺伝子を、宿主の種となる哺乳動物のゲノム
に挿入すると、第2の種の哺乳動物のみを通常は感染させるプリオンに対する感
染性が哺乳動物に付与される。本明細書で開示する好ましいキメラ型遺伝子は、
マウスPrP遺伝子の開始および終止配列、ならびにそれによって発現するタンパ
ク質に9残基の相違が生じるような様式でマウスPrP遺伝子とは異なる対応するヒ
ト配列によって置換された非末端配列領域を含むMHu2Mである。

【００５９】「宿主動物」および「宿主哺乳動物」という用語は、その動物の体内に通常は
存在しない遺伝的材料を含むように、そのゲノムを遺伝学的および人工的に操作
された動物を説明するために用いられる。例えば、宿主動物には、本発明の人工
的遺伝子の挿入によってまたは遺伝的に別種の被験動物の天然のPrP遺伝子の挿
入によって、その内因性のPrP遺伝子が改変されたマウス、ハムスターおよびラ
ットが含まれる。

【００６０】「宿主動物」および「宿主哺乳動物」という用語は、その動物の体内に通常は
存在しない遺伝的材料を含むように、そのゲノムを遺伝学的および人工的に操作
された動物を説明するために用いられる。例えば、宿主動物には、その内因性の
Dpl遺伝子が改変されたマウス、ハムスターおよびラットが含まれる。好ましい
様態においては、それらの宿主動物はさらに、人工的遺伝子の挿入によってまた
は遺伝的に別種の被験動物の天然のPrP遺伝子の挿入によって改変されたPrP遺伝
子をもつ。

【００６１】「被験動物」および「被験哺乳動物」という用語は、宿主動物のPrP遺伝子と
被験動物のPrP遺伝子との間に相違があるという点で宿主動物と遺伝的に別種の
動物を説明するために用いられる。被験動物は、それに対する感染性を被験動物
が一般に有するようなプリオンが任意の試料に含まれているか否かを判定するた
めの解析試験を実施したいと考える対象となる任意の動物であってよい。例えば
、被験動物は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌまたはニワトリで
あってもよく、その被験動物のみを通常は感染させるプリオンが特定の試料に含
まれるか否かを判定することができる。これは、被験動物のPrP遺伝子配列を宿
主動物に導入することによって行われる。

【００６２】「遺伝的に別種の動物」および「遺伝的に別種の哺乳動物」という用語は、宿
主動物の天然のPrPコドン配列と遺伝的に別種の被験動物との相違点が、17個ま
たはそれ以上のコドン、好ましくは20またはそれ以上のコドン、最も好ましくは
28〜40コドンであるような動物を説明するために用いられる。したがって、マウ
スのPrP遺伝子は、ヒト、ウシまたはヒツジのPrP遺伝子に関しては遺伝的に異な
るが、ハムスターのPrP遺伝子に関しては遺伝的に異なっていない。

【００６３】「除去されたPrP遺伝子」「破壊されたPrP遺伝子」「除去されたPrP遺伝子」
などの用語は、その遺伝子の機能を失わせるような様式で改変された（例えば、
ヌクレオチドの付加および／または除去）、内因性PrP遺伝子を意味する目的で
本明細書では互換可能に用いられる。非機能的なPrP遺伝子の実例およびそうし
たものを作製する方法は、「ビューラー（Bueler）,ら、Nature 356、577〜582
（1992）」に説明されており、この文献は参照として本明細書に組み入れられる
。両対立遺伝子は好ましくは破壊される。

【００６４】「除去されたDpl遺伝子」「破壊されたDpl遺伝子」などの用語は、その遺伝子
の機能を失わせるような様式で改変された（例えば、ヌクレオチドの付加および
／または除去）、内因性Dpl遺伝子を意味する目的で本明細書では互換可能に用
いられる。

【００６５】「雑種動物」「トランスジェニック雑種動物」などの用語は、Dpl活性が改変
された第1の動物と、(1)除去された内因性PrP遺伝子、(2)キメラ型もしくは人工
的なPrP遺伝子、および／または(3)遺伝的に異なる動物からのPrP遺伝子を含む
第2の動物との交雑によって得られる動物を意味する目的で、本明細書において
互換的に用いられる。例えば、雑種マウスは、Dpl導入遺伝子のノックインを有
するマウスと、(1)ウシPrP遺伝子（これは多数のコピーが存在してもよい）を単
独で、または(2)キメラ型PrP遺伝子とともに含むマウスとの交雑によって得られ
る。もう1つの例では、Dpl活性が調節不全の状態にあるPrP^０／０マウスと、誘
導可能な外因性ヒトPrP遺伝子を有するマウスとの交配によって雑種マウスが得
られる。雑種という用語には、結果として得られる子孫が遺伝的に異なる種のみ
を通常は感染させるプリオンに対する感染性を有し、感染の症状が約350日また
はそれ未満、好ましくは250日またはそれ未満で観察可能であるという条件で、2
つの雑種の同系交配による子孫を含む任意の雑種の子孫が含まれる。

【００６６】「潜伏期」という用語は、プリオンが動物に接種されてから動物が感染に起因
する疾患の検出可能な徴候を最初に発症する時点までの時間を意味するものとす
る。短縮された潜伏期とは、好ましくは約200日±50日またはそれ未満、より好
ましくは約50日±20日またはそれ未満である。

【００６７】「抗体」という用語は、抗原に結合することが可能であるような免疫グロブリ
ンタンパク質を意味している。本明細書において使用される抗体は、関心対象の
エピトープ、抗原、または抗原性断片に結合することが可能な、抗体全体に加え
、任意の抗体断片(例えば、F(ab')₂、Fab'、Fab、Fv)を含むことを意味する。

【００６８】本発明の抗体は、Dplタンパク質に対して免疫反応性または免疫特異的であり
、このためそれと特異的および選択的に結合する。Dplに対する抗体は免疫特異
的であること、すなわち関連物質とは実質的に交差反応しないことが好ましい。
「抗体」という用語にはすべての種類の抗体（例えば、モノクローナル抗体）が
含まれるが、本発明の抗体は本明細書に記載のファージディスプレイ法を用いて
作製することが好ましい。本発明の好ましい抗体は精製された抗体である。精製
された抗体とは、天然に付随する他のタンパク質、糖質および脂質を実質的に含
まないものを意味する。このような抗体は、Dplタンパク質（またはその抗原性
断片）と「選好的に結合する」、すなわち、抗原的に関連のない他の分子を実質
的に認識せず、それと結合しない。

【００６９】「特異的に活性化する」とは、本明細書で用いる場合、Dplまたはその断片も
しくは類似体を活性化して本明細書に記載のDpl媒介性生物イベントを惹起する
が、生物試料などの試料中の他の分子とは実質的に結合しない作用物質（agent
）のことを意味する。

【００７０】「特異的に阻害する」とは、本明細書で用いる場合、Dplまたはそのポリペプ
チド、断片もしくは類似体の活性化を阻害する作用物質のことを意味する。作用
物質は、それが結合するタンパク質の生物活性をインビボまたはインビトロで活
性化または阻害することが好ましい。

【００７１】「実質的な上昇」とは、対照レベル（活性化因子の非存在下で対照アッセイ法
を行う場合）の少なくとも約2倍、好ましくは対照アッセイ法の少なくとも約5倍
、より好ましくは少なくとも約10倍である、活性または他の測定可能な表現型特
性の上昇のことを意味する。

【００７２】「実質的な低下」または「実質的な減少」とは、対照レベルの約80％である、
好ましくは対照レベルの約50％に減少した、またはより好ましくは対照レベルの
約10％もしくはそれ未満に減少した、活性または他の測定可能な表現型特性の低
下または減少のことを意味する。

【００７３】「スクリーニング法」および「アッセイ法」という用語は、候補化合物を、1
）Dpl活性および／または2）プリオン感染症の潜伏期の活性化因子または抑制因
子として作用する能力に関してスクリーニングする方法を説明するために用いら
れる。

【００７４】「治療」「治療すること」および「治療する」などの用語は、本明細書では一
般に、望ましい薬学的および／または生理的効果を得ることを意味して用いられ
る。この効果は疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に防止する点で予防
的であってもよく、ならびに／または、疾患および／もしくはその疾患に起因す
る有害効果を部分的または完全に治癒させる点で治療的であってもよい。本明細
書で用いる「治療」には、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療が含
まれ、これには、 (a)疾患もしくは症状に対する素因はあるが、まだそれを有するとは診断され
ていない対象における、疾患または症状の発生を予防する段階； (b)疾患の症状を抑制する段階、すなわちその発症を停止させる段階；または (c)疾患を緩和させる段階、すなわちその疾患の症状を緩解させる段階が含ま
れる。

【００７５】発明の一般的な局面本明細書に開示するものは、すべての既知のプリオンタンパク質（PrP）と25
％程度の同一性がある、Dpl（Dpl）と命名された179残基の新規タンパク質であ
る。PrP様遺伝子を同定するためのデータベース検索では情報が得られず、ハイ
ブリダイゼーションによる検討はこのような取り組みには有益でなかったため（
Westawayら、Nucleic Acids Res. 14：2035〜2044（1986））、PrP遺伝子を含む
大規模なコスミドクローンのシークエンシングを行った（Leeら、Genome Res. 8
：1022〜1037（1998））。関連した機能をもつ大部分の脊椎動物遺伝子はクラス
ター化して整列してはいなかったが、いくつかの関連遺伝子はクラスター化して
いた。ヒト、ヒツジおよびマウスPrP遺伝子の周辺の領域の検討では、そのほか
のオープンリーディングフレーム（ORF）は同定されなかった。Prnp^b/b（ILN／J
）マウスから単離したコスミドクローンのシークエンシングをPrPの下流に展開
した場合のみに、新規ORFが見いだされた。

【００７６】「Prnd」と呼ばれるDpl遺伝子座は、PrP遺伝子Prnpの16Kb下流にあり、1.7Kb
および2.7Kbの2つの主要な転写物のほか、Prnpとの遺伝子間スプライシングによ
って生じるいくつかの通常でないキメラ型転写物を生成する。PrPとDplとの間に
ポリシストロン性mRNAも同定されている。PrPと同じく、Dpl mRNAは胚発生時に
発現されるが、PrPとは異なり、CNSでは低レベル、精巣では高レベルで発現され
る。晩発性運動失調およびプルキンエ細胞変性を発症する2つのPrnp^０／０系統
のCNSではDplは調節不全の状態にあるが、運動失調を発症しないPrnp^０／０系統
ではそうではない。Dplには神経毒性がある可能性があり、これはPrnp^０／０マ
ウスの一部の系統が神経変性を発症する理由の説明になる。また、Dplは神経で
ない他の種類の細胞にも有毒である可能性がある。

【００７７】さらに、DplとPrPとの間にかなりの相同性があることから、これらの2つのタ
ンパク質には共通した生物特性がある可能性が示唆され、このため、Dplはプリ
オンを生物学的に理解するための新たな要素を含む可能性がある。PrP様遺伝子
の最初の候補としてPrndを同定することにより、本発明者らは、Prn遺伝子ファ
ミリーの範囲を定めることを開始した。興味深いことに、Dplの過剰発現により
、いくつかの変異型および外来性PrPと同様に、マウスCNSに神経変性が生じた。
さらに、DplおよびPrPは共通の受容体タンパク質に対するリガンドとして競合す
ることによって直接的または間接的に相互作用する可能性がある。本明細書に述
べる本発明は、これらの仮説を検証するための手段を提供する。

【００７８】 Dpl核酸「Dpl遺伝子」および「Prnd」という用語は、Dplのコード領域を指して総称と
して用いられる。また、「Dpl遺伝子」および「Prnd」には、特定のDplポリペプ
チドをコードするオープンリーディングフレーム、イントロン、ならびに転写さ
れる領域を越えて最大約1kbの範囲にわたるがさらに両方向に及ぶ可能性もある
、発現の調節に関与する隣接5'および3'非コードヌクレオチド配列も含まれるも
のとする。DplをコードするDNA配列はcDNAでもゲノムDNAでもよく、それらの断
片でもよい。遺伝子は染色体外での維持または宿主への組み込みのための適切な
ベクターに導入しうる。

【００７９】本明細書で用いる「cDNA」という用語は、天然の成熟mRNA種に認められる配列
要素と並び方が共通しているすべての核酸を含むものとし、ここでいう配列要素
はエクソン（例えば、コードされるポリペプチドのオープンリーディングフレー
ムをコードする配列）ならびに3'および5'非コード領域である。通常、mRNA種で
は、核RNAのスプライシングによって介在イントロンが除去されてエクソンが隣
接しており、Dplポリペプチドをコードする連続的なオープンリーディングフレ
ームを形成する。

【００８０】その他の供給源の他のゲノムDpl配列には非隣接性オープンリーディングフレ
ーム（例えば、タンパク質コード領域にイントロンが介在する場合）がある場合
もあるが、ヒトゲノムDpl配列にはコード配列に介在するイントロンは存在しな
い。関心対象のゲノム配列は、天然の染色体内に通常存在するイントロンのすべ
てを含め、一覧に示した配列によって規定される通り、開始コドンと停止コドン
との間に存在する核酸を含む。これはさらに成熟mRNAに認められる3'および5'非
翻訳領域も含みうる。これはさらに、転写領域の5'または3'末端のいずれかにあ
る約1kbであるがさらに長い可能性もある隣接ゲノムDNAを含む、プロモーター、
エンハンサーなどの特定の転写および翻訳調節配列も含みうる。ゲノムDNAは、1
00kbpまたはより小さな断片として、隣接染色体配列を実質的に含まずに単離す
ることができる。

【００８１】この5'領域の配列、ならびにさらに5'上流配列および3'下流配列は、Dplが発
現される組織中での発現をもたらす、エンハンサー結合部位を含むプロモーター
要素のために用いうる。本発明のDplプロモーター要素の配列は、任意の種（例
えば、哺乳動物または非哺乳動物（例えば、爬虫類、両生類、鳥類（例えば、ニ
ワトリ））、特にヒト、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウシ、ヒツジ
、ブタ、マウスまたはウマを含む哺乳動物、好ましくはラットまたはヒト）のヌ
クレオチド配列に基づくことが可能であり、天然、合成、半合成または組換えを
問わずに任意の供給源から単離または製造することができる。

【００８２】 Dplの組織特異的発現は、発現パターンの決定のため、および天然型の発現パ
ターンを模倣するプロモーターの提供のために有用である。プロモーター領域に
天然にみられる多型は、発現における自然な変化、特に疾患に関連する可能性の
あるものを判定するために有用である。または、実験的に規定された系における
発現の改変の影響を明らかにするためにプロモーター領域内に変異を導入するこ
ともできる。転写因子の結合に関与する特定のDNAモチーフを同定するための方
法は当技術分野で知られており、例えば既知の結合モチーフとの配列類似性、ゲ
ルシフト（gel retardation）試験などがある。例えば、ブラックウェル（Black
well）ら、Mol Med 1：194〜205（1995）；モートロック（Mortlock）ら、Genom
e Res. 6：327〜33（1996）ならびにジョウリン（Joulin）ら、Eur J Biochem 2
32：620〜626（1995）を参照されたい。

【００８３】 1つの態様において、プロモーターはDplの発現を調節するために用いられる。
以下に考察する通り、Dplは胚の心臓組織、および成体脳におけるニューロンの
サブセットで発現される。このため、Dplプロモーターによって指令される発生
的に時間が定められた発現を利用して、Dplプロモーターと機能的に結合した異
種遺伝子の発現を促すことができる。Dplプロモーターから発現させることが可
能な関心対象の遺伝子の例には、必ずしも制限的ではないものの、マーカー遺伝
子（例えば、Dplを発現する神経細胞を標識するためのもの）およびレポーター
遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、CATなど）が含まれる。このようなマーカー
およびレポーター遺伝子は、Dplの通常の生理的機能の解明、Dplの調節のための
機構の同定、および／またはDplの発現を調節する生物的活性物質（例えば候補
薬剤）の検索などに役立てるために用いることができる。

【００８４】調節配列は、特に種々の組織および発生段階におけるDpl発現の転写および翻
訳調節に必要なシス作用性配列を同定するため、ならびに発現を調節または媒介
するシス作用性配列およびトランス作用性因子を同定するために用いうる。この
ような転写または翻訳制御領域は、培養細胞または胚、胎児もしくは成体組織に
おける野生型もしくは改変型Dplまたは関心対象のその他のタンパク質の発現を
促進するため、および遺伝子治療のためにDpl遺伝子と機能的に結合させうる。D
plの転写または翻訳調節領域を、Dplプロモーター活性を調節し、それによってD
plの発現を調節する細胞外シグナル分子を同定するために用いることもできる。

【００８５】本発明に用いられる核酸組成物は、適宜、Dplポリペプチドの全体または一部
をコードしうる。Dpl配列は、疾患状態と関連したDplの形態、および／またはタ
ンパク質の天然の変異体に向けられたものでもよい。断片は、従来の方法に従っ
たオリゴヌクレオチドの化学合成、制限酵素消化、PCR増幅などによってDNA配列
から入手しうる。ほとんどの場合、DNA断片は少なくとも約10個の連続したヌク
レオチドであり、少なくとも約15nt、通常は少なくとも約18nt〜約20nt、より一
般的には少なくとも約25nt〜約50ntであると考えられる。この種の小さなDNA断
片は、PCR、ハイブリダイゼーションスクリーニングなどのためのプライマーと
して有用である。比較的大きなDNA断片、すなわち100ntよりも大きいものは、コ
ードされるポリペプチドの産生のために有用である。PCRなどの増幅反応に用い
るためには、一対のプライマーが用いられると考えられる。プライマー配列の厳
密な組成は本発明にとって決定的に重要ではないが、ほとんどの用途に関して、
プライマーは当技術分野で知られているストリンジェントな条件下で本配列とハ
イブリダイズすると考えられる。少なくとも約50nt、好ましくは少なくとも約10
0ntの増幅産物が生成されると考えられるプライマーの対を選択することが好ま
しい。プライマー配列の選択のためのアルゴリズムは一般に知られており、市販
のソフトウエアパッケージとして販売されている。増幅プライマーはDNAの相補
鎖とハイブリダイズし、お互いに向かって伸長を開始すると考えられる。

【００８６】 Dpl遺伝子は実質的に純粋なものとして、一般には完全な哺乳動物染色体以外
の形で単離および入手される。通常、このDNAは、Dpl配列またはその断片を含ま
ない他の核酸配列を実質的に含まない形で得られると考えられ、一般には少なく
とも約50％、通常は少なくとも約90％の純度であり、典型的には「組換え体」で
ある、すなわち天然にみられる染色体には通常は付随していない1つまたは複数
のヌクレオチドが隣接していると考えられる。

【００８７】本DNA配列はさまざまな形式で用いられる。それらを、プリオン様タンパク質
をコードするその他の遺伝子を同定するため、または種々の種におけるDpl相同
体を同定するためのプローブとして用いてもよい。哺乳動物の相同体は互いに実
質的な配列類似性があり、すなわち少なくとも75％、通常は少なくとも90％、さ
らに一般的には少なくとも95％の配列同一性を有する。配列類似性は、保存的モ
チーフ、コード領域、隣接領域などのより長い配列のサブセットでありうる参照
配列に基づいて算出しうる。参照配列の長さは通常は少なくとも約18ntであり、
より一般的には少なくとも約30ntであり、比較される完全な配列の長さであって
もよい。配列解析のためのアルゴリズムは当技術分野で知られており、アルトシ
ュル（Altschul）ら（1990）J Mol Biol 215：403〜10に記載されたBLASTなどが
ある。

【００８８】配列類似性を有する核酸は、例えば50℃および6×SSC（0.9M食塩水／0.09Mク
エン酸ナトリウム）で処理し、55℃で1×SSC（0.15M塩化ナトリウム／0.015Mク
エン酸ナトリウム）での洗浄を行って結合を残存させるような、低ストリンジェ
ンシトな条件下でのハイブリダイゼーションによって検出される。配列同一性は
、例えば、50℃またはそれ以上および0.1×SSC（15mM食塩水／0.15mMクエン酸ナ
トリウム）などの高ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによ
って決定しうる。プローブ、特にDNA配列の標識プローブを用いることにより、
相同的または関連した遺伝子を単離することができる。相同遺伝子の由来は、例
えば、特にヒトなどの霊長類種、ラットおよびマウスなどの齧歯類、イヌ、ネコ
、ウシ、ヒツジ、ウマ、酵母、ショウジョウバエ、センチュウなどの任意の種で
ありうる。

【００８９】また、DplをコードするDNAを、生物標本における遺伝子の発現を同定するため
に用いることもできる。ゲノムDNAまたはRNAなどの特定のヌクレオチド配列の存
在に関して細胞をプローブ検索する様式は文献で十分に確立されており、本明細
書で詳述する必要はない。mRNAは細胞試料から単離される。mRNAは、逆転写酵素
を用いて相補DNA鎖を形成させ、続いて本DNA配列に対して特異的なプライマーを
用いるポリメラーゼ連鎖反応による増幅を行うRT-PCRによって増幅しうる。また
は、mRNA試料をゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース、ナイロンなど
の適切な支持体に移行させ、続いて対象DNAの断片をプローブとする検索を行う
。オリゴヌクレオチド連結アッセイ法、インサイチューハイブリダイゼーション
、および固体チップ上に配列されたDNAプローブとのハイブリダイゼーションな
どの他の技法を用いることも可能である。Dpl配列とハイブリダイズするmRNAが
検出されることは、その試料中でDplが発現されていることを意味する。

【００９０】種々の目的のために、特に、例えば遺伝子切断用の鉄またはクロムその他のキ
レート化金属イオンなどの核酸切断剤と併用することによって細胞内で用いよう
とする場合に、Dpl核酸配列を改変してもよい。

【００９１】プロモーター強度、コードされるタンパク質の配列などを選択的に変化させる
ために、隣接プロモーター領域およびコード領域を含むDpl遺伝子座を、当技術
分野で知られた種々の方法で変異させてもよい。このような変異のあるDNA配列
または産物は、本明細書で提供される配列と実質的に同一であると考えられ、す
なわちそれぞれヌクレオチドまたはアミノ酸が少なくとも1つ異なり、ヌクレオ
チドまたはアミノ酸が少なくとも2つは異なってよいが、約10個を超えて異なる
ことはないと考えられる。配列の変化としては置換、挿入または欠失が可能であ
る。欠失にはさらに、ドメインまたはエキソンの欠失などの比較的大規模な変化
が含まれうる。関心対象のその他の改変には、FLAGシステム、HAなどを用いるエ
ピトープタギング（epitope tagging）が含まれる。細胞内局在の検討には、緑
色蛍光タンパク質（GFP）との融合タンパク質を用いうる。このような変異遺伝
子は、Dplポリペプチドと他のポリペプチド（例えば、Dplと共発現されるNkx-6.
1など）との構造-機能相関を検討するため、またはその機能もしくは調節に影響
を及ぼすタンパク質の特性を変化させるために用いうる。例えば、この種の改変
されたDpl配列は、トランスジェニック動物の作製に用いることができる。

【００９２】クローニングされた遺伝子のインビトロ変異誘発のための技法は周知である。
変異のスキャニングのための手順の例には、ガスチン（Gustin）ら、Biotechniq
ues 14：22（1993）、バラニー（Barany）、Gene 37：111〜23（1985）、コリセ
リ（Colicelli）ら、Mol Gen Genet 199：537〜9（1985）およびプレントキ（Pr
entki）ら、Gene 29：303〜13（1984）がある。部位特異的変異誘発のための方
法は、サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（
Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、CSH Press 1989、pp. 15.3〜15
.108、ワイナー（Weiner）ら、Gene 126：35〜41（1993）、セイヤーズ（Sayers
）ら、Biotechniques 13：592〜6（1992）、ジョーンズ（Jones）ら、Biotechni
ques 12：528〜30（1992）、バートン（Barton）ら、Nucleic Acids Res 18：73
49〜55（1990）、マロッティ（Marotti）ら、Gene Anal Tech 6：67〜70（1989
）、ならびにチュー（Zhu）Anal Biochem 177：120〜4（1989）に記載がある。

【００９３】例えば末端部が宿主動物のもので中央部が遺伝的に異なる被験動物のものであ
り、中央部がこのような宿主の罹患状態のものと合致するように設計された特定
の改変を含むといった、宿主動物の部分を含むDpl遺伝子。さらに、本発明は、
人工的遺伝子を含む、または遺伝的に異なる動物からのDpl遺伝子の発現が修飾
されたトランスジェニック動物、互いに異なるトランスジェニック動物同士の子
孫または内因性プリオンタンパク質遺伝子が除去されたトランスジェニック動物
との間の子孫である雑種トランスジェニック動物、標準化されたプリオン標本、
ならびに試料中の病原性プリオンを検出するために上記の標本および遺伝的に改
変された動物を用いるアッセイ法を含む。

【００９４】この人工的遺伝子は、それが動物（マウスなど）のゲノムに挿入された場合に
、通常は遺伝的に異なる特定の種の動物（ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ
、ネコまたはイヌなど）のみを感染させるプリオンに対する感染性をその動物が
獲得するような配列を含む。人工的Dpl遺伝子は、人工的ポリヌクレオチド配列
、すなわちいかなる天然のDpl遺伝子にも存在しないコドン配列を部分的または
全体的に含んでもよい。または、人工的遺伝子は、その置換物が好ましくは遺伝
的に異なる動物からの対応するDpl遺伝子である、すなわち、そのDpl遺伝子が宿
主動物のDpl遺伝子と20個またはそれ以上のコドンに関して異なるような、1カ所
またはそれ以上のコドン置換を有する宿主動物のコドン配列を含んでもよい。例
えば増強されたプロモーター、および／または遺伝的に異なる動物の天然のPrP
遺伝子の多数のコピーを用いた遺伝子の過剰発現によって得ることができる、Pr
P遺伝子の発現レベルが上昇したトランスジェニック動物も開示の対象である。
雑種トランスジェニック動物には、2つのトランスジェニック動物の交配、特に
、遺伝的に異なる動物のプリオンタンパク質遺伝子の全体を含むトランスジェニ
ック動物（例えば、ヒトプリオンタンパク質遺伝子を含むマウスなど）と、内因
性のプリオンタンパク質遺伝子が破壊された動物（例えば、プリオンタンパク質
遺伝子が除去されたマウスなど）との交配によって得られる動物が含まれる。雑
種には特に、キメラ型プリオンタンパク質遺伝子を有するトランスジェニック動
物と、内因性のプリオンタンパク質遺伝子が除去された動物との交雑も含まれる
。

【００９５】 Dplトランスジェニック動物 Dplをコードする核酸は、遺伝的に改変された非ヒト動物、または細胞系にお
ける部位特異的遺伝子改変を作製するために用いられる。「トランスジェニック
」という用語は、Dpl遺伝子活性の欠失もしくはその他のノックアウトを有する
、または宿主細胞内に安定的に伝達された外因性Dpl遺伝子を有する遺伝的に改
変された動物、Dpl遺伝子機能が改変された、またはレポーター遺伝子と機能的
に結合した外因性Dplプロモーターを有する「ノックイン体」を包含するものと
する。特に関心がもたれるのは、Dplのホモ接合型およびヘテロ接合型のノック
アウト体である。

【００９６】 Dpl遺伝子座が改変される相同組換えによってトランスジェニック動物を作製
することもできる。または、核酸構築物をゲノム中にランダムに挿入する。安定
的組み込みのためのベクターには、プラスミド、レトロウイルスおよびその他の
動物ウイルス、YACなどが含まれる。特に関心が持たれるのは、好ましくはハツ
カネズミ属（マウスなど）、ドブネズミ属（ラットなど）、アナウサギ属（ウサ
ギなど）、ならびにハムスター（Mesocricetus）属（ハムスターなど）からなる
群より選択される属に所属する哺乳動物である、トランスジェニック哺乳動物で
ある。より好ましくは、動物は、Dpl遺伝子の発現もしくは機能に欠陥がある、
または何らかの他の変化を含んでいるマウスである。

【００９７】「ノックアウト」動物とは、内因性Dplの機能が実質的に低下または消失する
ように、好ましくは標的遺伝子の発現が検出不能または意味のない程度となるよ
うに、遺伝的に操作されたものである。「ノックアウト」は、さまざまな手法を
用いて実現することができる。天然のDpl相同体の全体または一部に関する染色
体欠失を誘導してもよい。非コード領域、特にプロモーター領域、3'調節配列、
エンハンサーの欠失、またはDpl遺伝子の発現を活性化する遺伝子の欠失。天然
のDpl遺伝子の発現を阻止するアンチセンス構築物の導入によって機能的ノック
アウトを実現することも可能である（例えば、Liら、Cell 85：319〜329（1996
）を参照）。

【００９８】 Dpl遺伝子の機能に関する条件的ノックアウト体を作製することもできる。条
件的ノックアウト体とは、標的遺伝子の改変を促進する物質への動物の曝露、標
的遺伝子部位の組換えを促進する酵素（例えばCre-lox系におけるCre）の導入、
または標的遺伝子を改変させるためのその他の方法を行った際に、Dpl遺伝子の
機能が欠陥を示すトランスジェニック動物のことである。

【００９９】例えば、Cre-loxP組換えシステムを用いて、Dpl遺伝子機能の条件的ノックア
ウトを有するトランスジェニック動物を作出することができる（例えば、Kilby
ら、Trends Genet 9：413〜421（1993）を参照）。Creは、loxPと呼ばれる2つの
認識配列の間のDNAを切り出す酵素である。このシステムは、Dplの条件的ノック
アウト体を作製するためにさまざまな方式で用いうる。例えば、1つ目はloxP部
位に隣接したDpl配列に関してトランスジェニック性であり、2つ目はCreに関し
てトランスジェニック性であるという、2つの独立したトランスジェニックマウ
スを作出することができる。Cre導入遺伝子は、誘導可能な、もしくは発生的に
調節されるプロモーターの制御下（Guら、Cell 73：1155〜1164（1993）；Guら
、Science 265：103〜106（1994））または組織特異的もしくは細胞種特異的プ
ロモーター（例えば、ニューロン特異的プロモーターまたは脳組織特異的プロモ
ーター）の制御下に置くことができる。続いて、Dplトランスジェニック体をCre
トランスジェニック体と交配させ、発生中にDplを発現する細胞のみにおいてDpl
遺伝子に欠損がある子孫を作出する。

【０１００】外因性Dplを有するトランスジェニック動物を作製してもよい。例えば、トラ
ンスジェニック動物は、標的遺伝子の追加的コピーの導入により、または標的遺
伝子の内因性コピーの発現増強をもたらす調節配列の機能的挿入により、標的遺
伝子の発現の変化（例えば、発現の上昇（異所性を含む）または低下）が生じる
変化を宿主細胞ゲノムが含むような、Dpl遺伝子の「ノックイン」を含んでもよ
い。「ノックイン」トランスジェニック体は、Dpl遺伝子のヘテロ接合型ノック
インまたはDpl遺伝子のホモ接合型ノックインを有するトランスジェニック動物
でありうる。「ノックイン体」には条件的ノックイン体も含まれる。

【０１０１】トランスジェニック動物を作出するために宿主細胞ゲノムに導入される外因性
遺伝子は通常、宿主動物とは異なる種、または宿主動物のコード鎖もしくは非コ
ード鎖が改変されたものに由来する。導入される遺伝子は、野生型遺伝子でも、
天然にみられる多型でも、または、例えばコードもしくは非コード領域における
欠失、置換または挿入に関して以前に記載したものなどの遺伝的に操作された配
列でもよい。導入される配列はDplポリペプチドをコードしてもよく、レポータ
ー遺伝子と機能的に結合したDplプロモーターを用いてもよい。導入される遺伝
子がコード配列である場合には、それは通常、宿主動物における発現のために必
要なプロモーター（これは構成性でも誘導性でもよい）およびその他の調節配列
と機能的に結合している。

【０１０２】関心対象の具体的な構築物には、Dplの発現、ドミナントネガティブDpl変異体
の発現さらにはDpl遺伝子の過剰発現を阻止すると考えられる、アンチセンスDpl
またはDpl配列に基づくリボザイムが含まれる。対応するNgn遺伝子の発現のアッ
プレギュレーションが容易に検出される表現型の変化をもたらすと考えられる場
合には、Dpl遺伝子座にlacZなどの検出マーカーを導入してもよい。レポーター
遺伝子またはDplのコード領域とともにDpl遺伝子のプロモーター領域を用いる構
築物にも関心がもたれる。切断型または改変型（例えば変異型）Dplを有する構
築物もまた、関心がもたれる。

【０１０３】改変された細胞または動物は、Dpl、ならびにCNSおよび胚発生に関与する他の
タンパク質の機能および調節の検討に有用である。このような改変された細胞ま
たは動物は、例えば、Dplによる影響を受ける神経毒性および／または神経変性
過程の機能および調節の検討、さらにはプリオンファミリーの遺伝子のインビボ
での検討にも有用である。このため、本発明のトランスジェニック動物は、Dpl
の欠陥と関連のある表現型に一定の役割を果たす可能性がある、Dplの下流にあ
る標的ならびにDplの受容体と考えられるものを同定する上でも有用である。

【０１０４】胚発生に対する、またはDplの欠陥に関連のある疾患もしくは状態に付随する
症状（例えば、神経毒性に伴う症状）に対する候補薬物の効果を判定するために
、動物を機能的試験、薬物スクリーニングなどに用いることができる。ポリペプ
チドをコードする種々の領域のDNA結合、転写調節などにおける役割を明らかに
するために、Dpl遺伝子の内部に一連の小さな欠失および／または置換を作製し
てもよい。通常なら産生されないDplタンパク質を細胞内で発現させることによ
り（例えば、異所性発現）、細胞の挙動の変化を誘導することが可能である。ま
た、これらの動物は、神経変性の機構的モデル、特に脳におけるPrP^Scプラーク
などのプラーク形成にかかわる機序の探求にも有用である。

【０１０５】相同組換えのためのDNA構築物は、望ましい遺伝的改変を有するDpl遺伝子の少
なくとも一部を含むと考えられ、標的遺伝子座と相同な領域を含むと考えられる
。ランダム組み込みのためのDNA構築物には、組換えを媒介するための相同領域
は必要でない。陽性および陰性選択のためのマーカーを含めることが好都合であ
る。相同組換えによって標的遺伝子に改変を有する細胞を作製するための方法は
当技術分野で周知である。哺乳動物のトランスフェクションのための種々の技法
については、ケオウン（Keown）ら、Methods in Enzymology 185：527〜537（19
90）を参照されたい。

【０１０６】胚性幹（ES）細胞については、ES細胞系を用いてもよく、マウス、ラット、モ
ルモットなどの宿主から胚細胞を新たに採取してもよい。この種の細胞は、適切
な線維芽細胞フィーダー層上で増殖させるか、白血球抑制因子（LIF）などの適
切な増殖因子の存在下で増殖させる。ES細胞が形質転換を受けたところで、それ
らをトランスジェニック動物の作出のために用いることができる。形質転換の後
に、細胞を適切な培地中にあるフィーダー層上に播く。作製物を含む細胞は、選
択培地を用いることによって検出しうる。コロニーが増殖するまで十分な時間を
おいた後、それらを摘出し、相同組換えまたは作製物の組み込みの発生に関して
分析する。続いて、陽性のコロニーを胚操作および胚盤胞への注入のために用い
る。胚盤胞は4〜6週齢の過排卵性の雌から採取する。ES細胞をトリプシン処理し
、改変された細胞を胚盤胞の胞胚腔に注入する。注入後、胚盤胞を偽妊娠させた
雌の各々の子宮角に戻す。その後、雌を出産させ、この結果得られた同腹仔を、
作製物を有する変異細胞の存在に関してスクリーニングする。胚盤胞およびES細
胞に異なる表現型を付与することにより、キメラ型の子孫を容易に検出すること
ができる。

【０１０７】キメラ動物を改変遺伝子の存在に関してスクリーニングし、改変を有するキメ
ラ動物（通常、キメラ雄）を野生型動物と交配させてヘテロ接合型の子孫を得て
、ヘテロ接合型の子孫を交配させて、ホモ接合型の子孫を得る。遺伝子の変化に
よって発生中の何らかの時点で致死性が生じる場合には、組織または器官を同種
異系もしくはコンジェニック系グラフトまたは移植片として、またはインビトロ
培養系において維持することができる。

【０１０８】一方または両方の遺伝子が除去されたマウスにおいて顕性の形態学的欠陥が生
じることにより、DplおよびPrP^Ｃの機能を正確に特定する道が開かれると考えら
れる。プルキンエ細胞の変性におけるDplの過剰発現の役割、または代替的には
、既存のPrn BACおよびYACクローン（Westawayら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91、6418〜6422（1994））に存在する密接なつながりのある遺伝子のそれは、
異種プロモーター要素を用いることによって評価できる。Dplを過剰発現する、
またはPrnDのヌル型もしくは変異型の対立遺伝子を有するマウスのプリオン感染
に対する感受性を検討することは興味深いと考えられる。

【０１０９】遺伝子機能の検討に、非哺乳動物モデル、特に生物学的および遺伝学的な特徴
が詳細に示されているセンチュウ（C. elegans）、ショウジョウバエおよびS.セ
レビシエ（S. cerevisiae）などの生物を用いることができる。例えば、Dpl遺伝
子またはDpl遺伝子のプロモーター領域のセンチュウ相同体内にトランスポゾン
（Tc1）挿入を作製することが可能である。このDpl遺伝子配列は、プリオン様タ
ンパク質の機能に関与する生理的および生化学的経路を解明することを目的とし
て規定の遺伝子病変をノックアウトまたは相補するために用いうる。下等真核生
物において多数のヒト遺伝子が変異を相補することが示されている。

【０１１０】 Dplポリペプチドの生産 Dplをコードする核酸は、完全長Dplポリペプチドまたはその断片、特に機能性
ドメイン、DNA結合部位などに対応する断片、および本ポリペプチドと他のタン
パク質またはその一部との融合物を含めたものを合成するために用いることがで
きる。発現のためには、誘導性でも構成性でもよく、転写および翻訳開始領域な
らびに転写および翻訳終結領域をもたらし、コード領域が転写開始領域の転写制
御下において機能的に結合した位置にあるような発現カセットを用いることがで
きる。発現宿主において機能的である種々の転写開始領域を用いることができる
。

【０１１１】発現の目的に応じて、従来の様式に従って、原核生物または真核生物において
ペプチドを発現させることもできる。タンパク質の大規模生産のためには、大腸
菌、枯草菌（B.subtilis）、S.セレビシエなどの単細胞生物、または例えばCOS7
細胞などの脊椎動物、特に哺乳動物などの高等生物の細胞を発現宿主細胞として
用いることもできる。多くの状況では、タンパク質が天然型のフォールディング
および翻訳後修飾の恩典を受ける哺乳動物細胞において遺伝子を発現させること
が望ましいと考えられる。低分子ペプチドを研究室で合成することも可能である
。

【０１１２】発現宿主を用いてタンパク質を大量に入手しうる場合には、従来の様式に従っ
てタンパク質を単離および精製することもできる。溶解物は発現宿主から調製す
ることができ、溶解物はHPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィ
ニティクロマトグラフィー、または他の精製法を用いて精製される。精製された
タンパク質は一般に少なくとも約80％の純度を有し、好ましくは少なくとも約90
％の純度を有し、最大100％の純度でありうる。純粋であるとは、その他のタン
パク質や細胞片を含まないことを意味する。

【０１１３】 Dplポリペプチドは抗体の産生のために用いることができ、この場合、短い断
片では特定のポリペプチドに対して特異的な抗体が得られ、長い断片またはタン
パク質全体ではポリペプチドの表面全体にわたる抗体の産生が可能となる。抗体
は、疾患状態と関連する可能性のあるDplの形態または天然にみられる対立遺伝
子変異体を含む、野生型または変異型のDplタンパク質に対して産生させること
ができる。例えば、Dpl遺伝子を発現している細胞による免疫処置、膜内に挿入
されたDplタンパク質を有するリポソームによる免疫処置などによって、これら
のドメインに対応する単離ペプチドまたは天然型タンパク質に対する抗体を産生
させてもよい。

【０１１４】抗体は、発現されたポリペプチドまたはタンパク質をそれ自体または例えばKL
H、pre-S HBsAg、他のウイルス性もしくは真核生物性のタンパク質などの既知の
免疫原性担体との複合体の形成によって免疫原として用いる、従来の方法に従っ
て調製される。一連の注射が行われるような、種々のアジュバントを適宜用いう
る。モノクローナル抗体については、1回またはそれ以上の追加免疫注射を行っ
た後に、脾臓を単離して、細胞融合によってリンパ球を不死化し、続いて高親和
性の抗体結合に関してスクリーニングを行う。続いて、望ましい抗体を産生する
不死化細胞、すなわちハイブリドーマを増殖させる。より詳細な説明については
、「モノクローナル抗体：実験マニュアル（Monoconal Antibodies：A Laboraro
ry Manual）」、ハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane）編、Cold Spring Har
bor Laboratories、Cold Spring Harbor、New York、1988を参照されたい。必要
に応じて、抗体の親和性をさらに高めるために、重鎖および軽鎖をコードするmR
NAを単離し、大腸菌内でのクローニングによる変異誘発を施して重鎖および軽鎖
を混合してもよい。抗体産生のための方法としてのインビボ免疫処置に代わる選
択肢には、通常はインビトロ親和性成熟（affinity maturation）とともに行わ
れる、ファージ「ディスプレー」ライブラリーに対する結合が含まれる。

【０１１５】 Dplの対立遺伝子変異体および他の種における相同体の単離本発明に用いられるDpl遺伝子を用いて、その他の哺乳動物のDpl遺伝子を同定
し、その機能を特徴づけることができる。関心対象のDpl遺伝子には、哺乳動物
（例えば、ヒト、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウシ、ネコ、イヌな
ど）および非哺乳動物（例えば、ニワトリ、爬虫類など）のものが非制限的に含
まれる。既知の遺伝子配列との相同性に基づいて未知の遺伝子の同定、単離、シ
ークエンシングおよび特徴決定を行うための方法は当技術分野で周知である（例
えば、Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning
：A Laboratory Manual）」、CSH Press 1989を参照されたい）。

【０１１６】薬物スクリーニング本発明の動物モデル、さらにはDplポリペプチドをインビトロで用いる方法は
、Dplの発現に影響を及ぼす（例えば、Dplプロモーターの機能に影響を及ぼすこ
とによる）またはDplポリペプチドと相互作用する候補薬剤を同定するために用
いることができる。関心対象の薬剤には、Dplの活性および／または発現を高め
る、抑制する、調節する、または他の形で影響を及ぼすものが含まれうる。Dpl
の活性および／または発現を変化させる薬剤は、例えば、Dpl活性の上昇と関連
のある疾患（例えば、神経変性疾患）の治療または研究のため；不適切な神経伸
長、またはDplの発現、活性および／もしくはコンフォメーションの変化によっ
て変化するその他の状態といった種々の変性または発生上の状態の治療のため；
ならびにPrP^ＳＣの形成をインビトロまたはインビボを促進するために用いるこ
とができる。候補薬剤には、合成分子（例えば、低分子薬、ペプチド、または他
の合成的に製造された分子もしくは化合物のほか、組換え的に産生された遺伝子
産物）、さらには天然にみられる化合物（例えば、ポリペプチド、内因性因子、
植物抽出物など）が含まれる。

【０１１７】薬物スクリーニングアッセイ法本発明において特に関心がもたれるのは、Dplの発現および／または機能に影
響を及ぼす活性がある薬剤の同定である。このような薬剤は、例えば、亢進した
および／もしくは不適切な神経伸長、またはDpl活性の変化と関連する可能性の
あるその他の状態の治療薬の開発のための候補である。薬物スクリーニングによ
り、罹患細胞においてDpl機能の相補または増強をもたらす薬剤が同定される。
その反対に、Dpl機能を抑制または阻害する薬剤は、神経変性または神経毒性、
特にプルキンエ細胞におけるものを調節するための手段となる可能性がある。特
に関心がもたれるのは、ヒト細胞に対する毒性が低い薬剤に関するスクリーニン
グアッセイ法である。

【０１１８】本明細書で用いる「薬剤」という用語は、例えばタンパク質または医薬品など
の、Dplタンパク質の生理的機能を変更または模倣する能力を有する任意の分子
を説明するものである。一般的には、種々の濃度に対するさまざまな反応を得る
ために、複数のアッセイ混合物がさまざまな試薬濃度で平行して検討される。典
型的には、これらの濃度のうち1つが陰性対照、すなわちゼロ濃度または検出レ
ベル未満の役割を果たす。

【０１１９】候補薬剤は、典型的には有機分子、好ましくは分子量が50を超えて約2500ダル
トン未満である低分子有機分子であるが、多くの化学的分類を含む。候補薬剤は
、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合のために必要な官能基を含み、
典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基
を、好ましくは少なくとも官能化学基のうち2つを含む。候補薬剤はしばしば、
上記の官能基の1つまたはそれ以上が置換された、環状炭素または複素環式構造
および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。候補薬剤は、ペプチド、
糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体ま
たは配合物を非制限的に含む生体分子中にも見いだされる。

【０１２０】候補薬剤は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む、極めて多岐にわ
たる供給源から入手しうる。例えば、無作為化されたオリゴヌクレオチドおよび
オリゴペプチドの発現を含む、極めて多岐にわたる有機化合物および生体分子の
ランダムまたは指向された合成のためには、多くの手段が利用可能である。また
は、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態にある天然化合物のライブラリー
が利用可能または容易に作製しうる。そのほかにも、天然または合成的に作製さ
れたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段に
よって容易に改変され、コンビナトリアルライブラリーを作製するために使用す
ることもできる。構造類似体を作製するために、既知の薬理作用物質に対してア
シル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの定方向的またはランダムな化
学修飾を施すこともできる。

【０１２１】インビボでの候補薬剤のスクリーニング薬剤を、Dplの発現もしくは機能に影響を及ぼす能力、またはDplの発現もしく
は機能の変化と関連のある望ましくない表現型（例えば、ある症状）を緩和する
能力に関してスクリーニングすることが可能である。1つの好ましい態様では、
候補薬剤のスクリーニングを、本明細書に記載のトランスジェニック動物におい
てインビボで行う。スクリーニングアッセイ法に用いるのに適したトランスジェ
ニック動物にはDpl発現の変化を有する任意のトランスジェニック動物が含まれ
、これには例えば、外因性および安定的に伝達されたヒトDpl遺伝子配列、レポ
ーター遺伝子（例えば、β-ガラクトシダーゼ、CAT、または発現を容易にアッセ
イしうるその他の遺伝子）と機能的に結合した（ヒトは除く）Dplプロモーター
配列から構成されるレポーター遺伝子、またはDpl遺伝子のホモ接合型もしくは
ヘテロ接合型のノックアウトを有する、トランスジェニック動物が含まれうる。
トランスジェニック動物は遺伝的改変に関してホモ接合型でもヘテロ接合型でも
よく、配列を発現のために動物のゲノムに導入する場合には、導入配列の多数の
コピーを含んでもよい。Dplプロモーターの活性に影響を及ぼす薬剤を同定する
ことがインビボスクリーニングアッセイ法の目的である場合には、Dplプロモー
ターをレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）と機能的に結合させた上で
、非ヒト宿主動物のゲノムまたは培養哺乳動物細胞系のゲノムに組み込むことが
できる。

【０１２２】候補薬剤をDplの発現が改変された非ヒトトランスジェニック動物に投与し、
候補薬剤の効果を判定する。候補薬剤は、望ましい結果を生じさせる目的で薬剤
の送達のために望ましいおよび／または適した任意の様式で投与することができ
る。例えば、候補薬剤は、注射（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、または望まし
い影響を達成しようとする組織中への直接的な注射による）、経口的、または他
の任意の望ましい手段によって投与することができる。通常、インビボスクリー
ニングでは、多数の動物にさまざまな量または濃度の候補薬剤を投与すると考え
られ（薬剤を投与しないものから、動物に首尾よく送達しうる上限量に達する薬
剤量まで）、さまざまな剤形の薬剤の送達を含めることもある。薬剤は単独で投
与することもでき、特に薬剤の併用が相乗効果をもたらすと思われる場合には、
2つまたはそれ以上の薬剤を併用することもできる。

【０１２３】トランスジェニック動物に対する薬剤投与の効果は、Dplの機能を適宜評価す
ることにより（例えば、レポーターまたは融合遺伝子の発現を検討することによ
り）、またはDplの発現と関連のある表現型を評価することによってモニタリン
グを行える。例えば、スクリーニングに用いるトランスジェニック動物がDpl発
現に欠陥を含んでいる場合には（例えば、遺伝子のノックアウトのため）、Dpl
欠損トランスジェニックマウスおよび／または野生型マウスにおいて生じるレベ
ルと対比して対照マウスにおける神経変性の程度を判定することにより（例えば
、投与マウスにおける運動失調の程度を評価することによる）、候補薬剤の効果
を評価することができる。齧歯類における神経学的障害をアッセイするための方
法は当技術分野で周知である。Dplプロモーターの活性に影響を及ぼす薬剤を同
定することがインビボスクリーニングアッセイ法の目的であり、非ヒトトランス
ジェニック動物（または培養哺乳動物細胞系）がレポーター遺伝子と機能的に結
合したDplプロモーターを含む場合には、例えば、Dplプロモーターの発現をモニ
タリングし（レポーター遺伝子の検出による）、Dplプロモーター活性の変化と
神経活性および／または変性との相関を調べることによって、Dplプロモーター
活性に対する候補薬剤の効果をスクリーニングすることができる。代替的または
追加的に、Dpl mRNAまたはタンパク質レベルの検出（定性的または定量的）によ
ってDplプロモーター活性を評価することも可能である。望ましい様式で、候補
薬剤がDpl発現に影響を及ぼす場合、および／またはDplに関連した表現型に影響
を及ぼす場合には、候補薬剤はDpl関連疾患またはPrP関連疾患の治療に用いるの
に適した薬剤として同定される。

【０１２４】インビトロでの候補薬剤のスクリーニング Dplトランスジェニック動物における薬剤のスクリーニングに加えて、標識イ
ンビトロタンパク質-タンパク質結合アッセイ法、タンパク質-DNA結合アッセイ
法、電気泳動移動度シフトアッセイ法、タンパク質結合に関するイムノアッセイ
法を含む、さまざまなインビトロアッセイ法をこの目的に用いることもできる。
例えば、大量のDplタンパク質の産生を提供することにより、このタンパク質と
結合し、その作用を修飾または模倣するリガンドまたは基質の同定が可能となる
。精製されたタンパク質は三次元結晶構造の決定に用いてもよく、これは分子間
相互作用のモデル化、転写調節などのために用いることができる。

【０１２５】スクリーニングアッセイ法は、分子の1つまたは複数を直接的または間接的に
検出可能なシグナルを提供する標識と結合させる結合アッセイ法であってもよい
。種々の標識があり、これには放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特
異的結合分子、磁気粒子などの粒子といったものが含まれる。特異的結合分子に
は、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシンなどの対が
含まれる。特異的結合のメンバーについては、通常、既知の手順に従い、相補的
なメンバーを検出用の分子によって標識する。

【０１２６】本明細書に記載のスクリーニングアッセイ法に他のさまざまな試薬を含めても
よい。アッセイ法が結合アッセイ法である場合には、これらには、最適なタンパ
ク質-タンパク質結合の促進および／または非特異的もしくは背景的相互作用の
軽減のために用いられる、塩、アルブミンなどの中性タンパク質、界面活性剤な
どが含まれる。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌薬
などの、アッセイ法の効率を改善する試薬を用いてもよい。成分の混合物は、必
要な結合がもたらされる任意の順序で添加される。インキュベーションは任意の
適した温度、典型的には4℃から40℃の間で行われる。インキュベーション期間
は最適な活性に関して選択されるが、迅速な高スループットスクリーニングが促
進されるように最適化してもよい。典型的には0.1から1時間の間で十分と考えら
れる。

【０１２７】関心対象のその他のアッセイ法は、Dplの機能を模倣する薬剤を検出する。例
えば、機能的Dplを欠く細胞に候補薬剤を添加し、Dpl活性を再生する能力を機能
アッセイ法でスクリーニングする。1つの特定の態様においては、調節不全の状
態にあるDpl活性を模倣する薬剤を、プリオン病の潜伏期を短縮する能力に関し
てアッセイする。

【０１２８】多くの哺乳動物遺伝子では、酵母および下等動物に相同体がある。このような
相同体の生理的役割および他のタンパク質との相互作用を研究することにより、
生物的機能の解明が容易になる。遺伝的相補性に基づくモデル系に加えて、酵母
も、チェン（Chien）ら（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：9578〜9582に
記載されたツーハイブリッドシステムを通じて、タンパク質-タンパク質相互作
用を検討するための強力なツールになることが示されている。ツーハイブリッド
システムによる分析は、Dplタンパク質による転写活性化を探索し、Dplと相互作
用するポリペプチドをコードするcDNAを同定する上で特に関心がもたれる。Dpl
との結合は、特定の標的タンパク質の機能／活性に影響を及ぼす、またはそれ自
体が機能的に修飾される可能性があり、正常または特定の疾患状態の両方に関連
する可能性がある。

【０１２９】同定された候補薬剤望ましい薬理活性を有する化合物は、生理的に許容される担体中にある形で、
正常なDpl機能の欠損に起因する、またはそれによって一部が修飾される状態（
例えば、調節不全の状態にあるDplレベルと関連のある神経疾患）の治療のため
に、宿主に投与することができる。本化合物を、Dpl機能を増強するために用い
てもよい。治療用薬剤は、経口的、局所的、皮下、腹腔内、ウイルス感染による
もの、静脈内などの非経口的なものなど、種々の方法で投与することができる。
吸入投与には特に関心が持たれる。導入の様式に応じて、本化合物は種々の方法
で製剤化することができる。製剤中の治療的活性を有する化合物の濃度は重量に
して約0.1〜100％の範囲でさまざまであってよい。

【０１３０】医薬組成物は、顆粒剤、錠剤、丸剤、坐剤、カプセル剤、懸濁剤、軟膏剤、ロ
ーション剤などのさまざまな形態で調製することができる。治療的に活性な化合
物を含む組成物を構成するために、経口的または局所的使用に適した医薬品級（
pharmaceutical grade）の有機または無機担体および／または希釈液を用いるこ
とができる。当技術分野で知られた希釈液には、水性媒体、植物性および動物性
の油ならびに脂肪が含まれる。補助的薬剤として、安定化剤、湿潤剤および乳化
剤、浸透圧を変化させるための塩、または適切なpH値を確保するための緩衝液、
ならびに皮膚浸透促進剤を用いることができる。

【０１３１】薬理遺伝学薬理遺伝学とは、個体の遺伝子型と、個体が治療薬を代謝するか、またはそれ
に反応する能力との間の関連づけのことをいう。代謝または標的感受性における
差は、生理活性薬の投与量と薬物の血中濃度との間の関係を変化させることによ
って、重大な毒性または治療の失敗をもたらすおそれがある。この数年で、代謝
酵素または薬物標的における多型と反応および毒性の双方との間に明確な関係が
あることが数多くの研究によって立証されている。これらの関係は、治療薬の投
与を個別化するために用いることができる。

【０１３２】多型性対立遺伝子の遺伝子型判定は、ある個体が特定の治療計画（therapeuti
c regimen）に対して良好に反応すると思われるか否かを評価するために用いら
れる。また、多型配列は、治療薬候補の投与量および特異性を判定するための薬
物スクリーニングアッセイ法にも用いられる。候補となるDpl多型を、例えば神
経疾患の治療における有効性に対する影響があるか否かを判定するための標的療
法によってスクリーニングする。薬物スクリーニングアッセイ法は上記の通りに
行う。典型的には2種またはそれ以上の異なる配列多型を、治療に対する反応性
に関して検討する。

【０１３３】特定の配列多型がさまざまな薬剤の有効性と相関する場合には、診断的スクリ
ーニングを行うことができる。診断法についてはこれまでのセクションで詳細に
述べた。特定の多型の存在が検出され、罹患した個体に対する有効な治療戦略を
開発するために用いられる。

【０１３４】 Dpl関連疾患の検出 Dplのレベルおよび／またはDplの種々のコンフォメーションの存在の検出は、
Dplと関連のある神経変性疾患を診断するための手段となりうる。特に、Dplの発
現および／またはDplのコンフォメーション変化の検出は、遺伝性小脳皮質萎縮
、強直間代発作を伴う全般てんかん（GTCS）、脊髄小脳失調症6型などの、プル
キンエ細胞の変性がかかわる疾患と関連している可能性がある。本開示を読むこ
とによって当業者には明らかであると思われるが、Dplのレベルおよび／または
このタンパク質の異なるコンフォメーションの測定は、他の神経変性疾患にも用
いうる可能性がある。

【０１３５】 Dpl関連疾患の診断は、生検材料、血液試料、頬の内側の擦過試料などの患者
からの任意の好都合な試料に関するタンパク質、DNAもしくはRNA配列および／ま
たはハイブリダイゼーション分析によってなされる。Dplと関連する可能性のあ
る疾患の患者から得た核酸試料を、Dplにおける病因多型（predisposing polymo
rphism）の存在に関して分析する。典型的な患者の遺伝子型には、少なくとも1
つの染色体上に素因となる変異が少なくとも1つあると考えられる。遺伝子産物
の活性または発現に影響を及ぼし、Dpl関連疾患（例えば、神経変性疾患）に対
する感受性を高める多型性Dpl配列が存在すれば、病因多型とみなす。病因多型
の有無に関してDNAまたはmRNAを分析し、非罹患個体からの配列と比較すること
によって個人のスクリーニングを行う。

【０１３６】スクリーニングは、タンパク質の機能的または抗原的な特徴に基づくものでも
よい。Dplタンパク質における病因多型を検出するために設計されたイムノアッ
セイ法をスクリーニングに用いてもよい。多種多様な変異によって特定の単一の
疾患表現型が生じる場合には、機能的タンパク質アッセイ法がスクリーニング用
ツールとして有効なことが明らかになっている。

【０１３７】 Dplコード領域または制御領域における配列多型の候補が疾患と関連するか否
かを判定するために生化学試験を行うこともできる。例えば、Dplの発現に影響
を及ぼすプロモーターまたはエンハンサー配列の変化により、神経変性疾患、例
えばプリオン媒介性疾患に対する素因が生じる可能性がある。当技術分野で知ら
れた種々の方法によって、候補となる変異型対立遺伝子の発現レベルを正常な対
立遺伝子の発現レベルと比較する。プロモーターまたはエンハンサーの強度を判
定するための方法には、発現された天然型タンパク質の定量化、好都合な定量化
を可能とするβ-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼなどのレポーター遺伝子を備えたベクター中への変異
型調節要素の挿入などが含まれる。コードされるDplタンパク質の活性は、野生
型タンパク質との比較によって判定しうる。

【０１３８】特定の配列の有無に関して核酸を分析するための方法は数多くある。大量のDN
Aを入手しうる場合には、ゲノムDNAを直接用いる。または、関心対象の領域を適
したベクター中にクローニングし、十分に分析を行える量になるまで増殖させる
。Dpl遺伝子を発現する細胞はmRNAの供給源として用いることができ、それを直
接アッセイしてもよく、または分析のためにcDNAに逆転写してもよい。十分に分
析を行える量を得るために、核酸をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの従来の
技法によって増幅してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応の用法はサイキ（Saiki）
ら（1985）Science 239：487に記載されており、現在の技法の概説はサムブルッ
ク（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Clonin
g：A Laboratory Manual）」、CSH Press 1989、pp.14.2〜14.33になされている
。多型に対して特異的なプライマーを用いることにより、多型が存在するか否か
を判定するために増幅を用いることもできる。または、多型を検出する手段とし
てオリゴヌクレオチド連結を用いる種々の方法も当技術分野では知られており、
例えば、ライリー（Riley）ら（1990）N.A.R. 18：2887〜2890、およびデラハン
ティ（Delahunty）ら（1996）Am. J. Hum. Genet. 58：1239〜1246を参照された
い。

【０１３９】増幅反応に検出可能な標識を含めてもよい。適した標識には、フルオレセイン
イソチオシアネート（FITC）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン
、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）、2',7'-ジメト
キシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（JOE）、6-カルボキシ-X-ロ
ーダミン（ROX）、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（H
EX）、5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）またはN,N,N',N'-テトラメチル-6-
カルボキシローダミン（TAMRA）などの蛍光色素、^３２P、^３３P、^３５S、^３Hな
どの放射性標識などが含まれる。標識は、増幅されたDNAがアビジン、特異性抗
体などの高親和性結合パートナーを持つビオチン、ハプテンなどと結合し、結合
パートナーが検出可能な標識と結合する2段階システムでもよい。標識をプライ
マーの一方または両方と結合させてもよい。または、標識が増幅産物中に取り込
まれるように、増幅に用いるヌクレオチドのプールを標識する。

【０１４０】試料となる核酸、例えば増幅またはクローニングされた断片は、当技術分野で
知られた数多くの方法のうちの1つによって分析される。ジデオキシ法または他
の方法によって核酸のシークエンシングを行い、塩基の配列を中立的Dpl配列（
例えば、非罹患個体からのDpl配列）と比較してもよい。サザンブロット法、ド
ットブロット法などにより、変異型配列とのハイブリダイゼーションを、その有
無を判定するために用いることも可能である。変異型配列の存在を検出するため
の手段として、米国特許第5,445,934号または国際公開公報第95／35505号に記載
された、固体支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイに対す
る対照および変異型配列のハイブリダイゼーションパターンを用いてもよい。DN
A配列の変異によって生じるコンフォメーションの変化を電気泳動移動度の変化
として検出するためには、一本鎖立体構造多型（SSCP）分析、変性勾配ゲル電気
泳動（DGGE）、ミスマッチ切断検出およびゲル基質におけるヘテロ二本鎖分析が
用いられる。または、多型によって制限エンドヌクレアーゼの認識部位が創出ま
たは破壊される場合には（制限断片長多型、RFLP）、試料をそのエンドヌクレア
ーゼで消化し、断片が消化されたか否かを判定するために産物をサイズ分画にか
ける。分画は、ゲルまたはキャピラリー電気泳動法により、特にアクリルアミド
またはアガロースゲルを用いて行われる。

【０１４１】米国特許第5,445,934号または国際公開公報第95／35505号に記載された、固体
支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイに対する対照および
変異型配列のハイブリダイゼーションパターンを、変異型配列の存在を検出する
ための手段として用いることもできる。本発明の1つの態様では、アレイ上の離
散的な位置がDpl遺伝子座のmRNAまたはゲノムDNAの少なくとも一部に対して相補
的であるようなオリゴヌクレオチドのアレイが提供される。このようなアレイは
、そのそれぞれがDpl遺伝子座由来のmRNA、cDNA、ゲノムDNAなどの核酸と特異的
にハイブリダイズしうる一連のオリゴヌクレオチドを含みうる。通常、このよう
なアレイは少なくとも2種の異なる多型配列を含むと考えられ、すなわち遺伝子
座におけるユニークな位置にある多型を通常は少なくとも約5種、より一般的に
は少なくとも約10種含むことができ、さらには50〜100種もの異なる多型を含み
うる。アレイ上のオリゴヌクレオチド配列の長さは通常、提供される多型配列の
長さと思われる少なくとも12ntであると考えられるが、長さ100〜200ntの断片が
生じるように隣接領域まで延長してもよい。アレイの例としては、ハシア（Haci
a）ら（1996）Nature Genetics 14：441〜447、ロックハート（Lockhart）ら（1
996）Nature Biotechnol. 14：1675〜1680、およびデ・リシ（De Risi）ら（199
6）Nature Genetics 14：457〜460を参照されたい。

【０１４２】 Dpl多型に対して特異的な抗体を、スクリーニングイムノアッセイ法に用いる
こともできる。中立的Dplの減少もしくは増加および／またはDpl疾患関連多型が
存在することは、疑われる疾患がDplと関連していることの指標となる。Dpl関連
疾患の疑いがある患者から試料を採取する。本明細書で用いる試料には、組織生
検標本、生物性液体、器官または組織の培養物に由来する液体、および生理的組
織から抽出した液体のほか、このような液体の誘導物および画分が含まれる。試
料中の細胞の数は、一般に少なくとも約10³個、通常は少なくとも10⁴個、より一
般的には少なくとも約10⁵個であると考えられる。固形組織の場合には細胞を分
離してもよく、組織切片を分析してもよい。または、細胞の可溶化物を調製する
こともできる。

【０１４３】診断はさまざまな方法によって行いうる。種々の方法はいずれも、Dplにおけ
る病因多型が存在する疑いのある患者の細胞における正常または異常Dplの有無
もしくは量の変化を判定するものである。例えば、従来の方法に従って行われる
細胞または組織切片の染色を検出に用いることができる。関心対象の抗体を細胞
試料に添加し、エピトープとの結合が十分に起こるまでの時間、通常は少なくと
も約10分間にわたってインキュベートする。直接的検出のために抗体を放射性同
位体、酵素、蛍光剤、化学発光剤またはその他の標識によって標識してもよい。
または、シグナルを増幅するために第2段階の抗体または試薬を用いる。このよ
うな試薬は当技術分野で周知である。例えば、一次抗体をビオチンと結合させ、
西洋ワサビペルオキシダーゼが結合したアビジンを第2段階の試薬として添加す
ることができる。最終的な検出には、ペルオキシダーゼの存在下で色調変化をき
たす基質を用いる。抗体結合の有無は、分離した細胞のフローサイトメトリー、
顕微鏡検査、X線検査、シンチレーション計数などを含む種々の方法によって判
定しうる。

【０１４４】 1つの代替的な診断法は、可溶化物における抗体とDplとの結合のインビトロ検
出に依拠する。試料またはその画分におけるDpl結合濃度の測定は、種々の特異
的アッセイ法によって行いうる。従来のサンドイッチ式アッセイ法を用いてもよ
い。例えば、サンドイッチアッセイ法ではまず、Dpl特異的抗体を不溶性表面ま
たは支持体に付着させる。本発明の試薬および全体的方法との適合性がある限り
、結合の詳細な様式は特に重要ではない。それらのプレートとの結合は共有的で
も非共有的でもよいが、非共有的であることが好ましい。

【０１４５】不溶性支持体は、それに対してポリペプチドが結合可能であって、可溶性材料
から容易に分離され、その他の点で全体的方法との適合性がある任意の組成物で
ありうる。このような支持体の表面は充実性固体でも多孔性でもよく、任意の好
都合な形態でありうる。受容体が結合する適した不溶性支持体の例には、磁性ビ
ーズなどのビーズ、膜およびマイクロタイタープレートが含まれる。これらは典
型的にはガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、多糖、ナイロンまたは
ニトロセルロース製である。少量の試薬および試料を用いて多数のアッセイ法を
同時に行えることから、マイクロタイタープレートが特に好都合である。

【０１４６】続いて、患者試料の可溶化物を、抗体を含む別々にアッセイ可能な支持体（例
えば、マイクロタイタープレートの別々のウェル）に添加する。対照として利用
するために、既知の濃度の正常および／または異常Dplを含む一連の標準物質を
、試料またはそのアリコートと並行してアッセイすることが好ましい。好ましく
は、各試料および標準物質は、それぞれに関する平均値が得られるように複数の
ウェルに添加される。インキュベーション期間は結合が起こるために十分である
必要があり、一般には約0.1〜3時間で十分である。インキュベーション後には一
般に、不溶性支持体から非結合型成分を洗い流す。一般に、洗浄用媒体としては
適切なpH、一般にpH7〜8の希薄非イオン性界面活性剤媒体を用いる。試料中に存
在する非特異的に結合したタンパク質を十分に洗い流すためには、十分な容量を
用いて、1回から6回の洗浄を行う。

【０１４７】洗浄の後に、二次抗体を含む溶液を適用する。この抗体はDplと、存在する他
の成分からそれを区別しうるような十分な特異性をもって結合すると考えられる
。結合の直接的または間接的な定量化が容易になるように、二次抗体を標識して
もよい。第2の受容体結合の直接的測定を可能とする標識の例には、³Hまたは¹²⁵ Iなどの放射性標識、蛍光剤、色素、ビーズ、化学発光剤、コロイド粒子などが
含まれる。結合の間接的測定を可能とする標識の例には、その基質が有色性また
は蛍光性の産物をもたらすような酵素が含まれる。1つの好ましい態様では、抗
体を、適切な基質を添加した後に検出可能な産物シグナルを生じうる共有結合性
の酵素によって標識する。複合体として用いるために適した酵素の例には、西洋
ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
などが含まれる。このような抗体-酵素複合体は、市販されていない場合には、
当業者に知られた技法によって容易に作製しうる。インキュベーション期間は、
標識されたリガンドが利用可能な分子と結合するために十分である必要がある。
一般には、約0.1〜3時間、通常は1時間で十分である。

【０１４８】第2の結合段階の後に、不溶性支持体から非特異的に結合した材料を再び洗い
流す。従来の方法により、結合した複合体によって生じるシグナルを検出する。
酵素複合体を用いる場合には、検出可能な産物が形成されるように適切な酵素基
質を提供する。

【０１４９】その他のイムノアッセイ法も当技術分野で知られており、診断法として有用な
可能性がある。オクタロニープレートは、抗体結合の簡便な判定法となる。Dpl
に対して特異的な検出システムを必要に応じて用い、サンドイッチアッセイ法に
関して述べた標識法をうまく用いることにより、タンパク質ゲルまたはフィルタ
ー上のタンパク質スポットに対してウエスタンブロット法を行うことも可能であ
る。

【０１５０】関心がもたれるその他の診断アッセイ法は、Dplタンパク質の機能的特性に基
づくものである。このようなアッセイ法は、極めて数多くの異なる変異が単一の
共通の表現型につながるタンパク質機能の変化をもたらす場合には特に有用であ
る。例えば、機能的アッセイ法は、Dpl遺伝子産物によって媒介される転写変化
に基づくものでありうる。また、例えば、コンフォメーションの変化、Dplタン
パク質の挿入、欠失もしくは切断に起因するサイズの変化、または細胞内局在の
変化を検出するための他のアッセイ法も可能である。

【０１５１】タンパク質切断試験では、Dpl遺伝子またはその転写物から増幅されたPCR断片
を、タンパク質産物を産生させるためのインビボ転写／翻訳反応のためのテンプ
レートとして用いる。切断が機能喪失と関連する可能性がある場合には、多型遺
伝子が切断型タンパク質をコードするか否かを判定するために、ゲル電気泳動に
よる分離を行う。

【０１５２】 CJDなどのプリオン媒介性疾患に対する素因と遺伝的連鎖がある多型に対して
、特にマイクロサテライトマーカーまたは一塩基多型の使用により、診断的スク
リーニングを行うことも可能である。マイクロサテライト多型自体は表現型とし
て発現されないが、それが疾病素因をもたらす配列と連鎖していることもしばし
ばである。しかし、場合によっては、マイクロサテライト配列自体が遺伝子の発
現に影響を及ぼすこともある。マイクロサテライト連鎖解析は単独で行ってもよ
く、上記の直接的な多型検出と組み合わせてもよい。遺伝子型判定のためのマイ
クロサテライトマーカーの使用には十分な文献的裏付けがある。例えば、マンス
フィールド（Mansfield）ら（1994）Genomics 24：225〜233、ツィーグル（Zieg
le）ら（1992）Genomics 14：1026〜1031、ディブ（Dib）ら、前記を参照された
い。

【０１５３】本方法において有用なマイクロサテライト座は U (R)_ｎ U' という一般式で表され、ここでUおよびU'は特定の遺伝子座を一意的に特定する
非反復性隣接配列であり、Rは反復モチーフであり、nは反復数である。反復モチ
ーフの長さは少なくとも2ヌクレオチドであり、最大で7ヌクレオチド、通常は2
〜4ヌクレオチドの長さである。反復は単純なものでも複雑なものでもよい。隣
接配列UおよびU'は、ヒトゲノムにおいてそのマイクロサテライト遺伝子座を一
意的に特定する。UおよびU'の長さは少なくとも約18ヌクレオチドであり、反復
のいずれかの側に数百塩基から最大約1kbにわたって伸長しうる。UおよびU'の内
部にある配列を増幅プライマー用として選択する。プライマー配列の厳密な構成
は本発明にとって特に重要というわけではないが、それらはストリンジェントな
条件下でそれぞれ隣接配列UおよびU'とハイブリダイズする必要がある。増幅プ
ライマーの選択基準は以前に考察した通りである。遺伝子座におけるサイズの差
に関する分解能を最大限に高めるためには、増幅産物全体の長さが100〜500ヌク
レオチドの間となるように、反復配列に近接したプライマー配列を選択すること
が好ましい。

【０１５４】特定の遺伝子座における反復数nは集団において多型性であるため、増幅プラ
イマーの間に位置するDNAの長さには個体差が生じる。この数は、少なくとも1回
の反復から約100回またはそれ以上の反復に至るまでさまざまであると考えられ
る。

【０１５５】プライマーは、この反復を含むゲノムDNAの領域を増幅するために用いられる
。前記の通り、増幅反応において検出可能な標識を含めることが好都合と考えら
れる。数組のプライマーを同一の反応チューブ内で併用する多重増幅を行うこと
も可能である。これは、分析に用いうる試料DNAの量が限られている場合に特に
有益である。プライマーのそれぞれの組を異なる蛍光色素で標識するのが好都合
である。

【０１５６】増幅の後に、産物のサイズ分画を行う。分画はゲル電気泳動により、特に変性
アクリルアミドまたはアガロースゲルを用いて行うことができる。好都合なシス
テムは、変性ポリアクリルアミドゲルを自動DNAシークエンサーと組み合わせて
用いるものであり、これについてはハンカピラー（Hunkapillar）ら（1991）Sci
ence 254：59〜74を参照されたい。自動シークエンサーは、多重増幅または別々
のPCR反応の産物をまとめたものに対して特に有用である。キャピラリー電気泳
動も分画のために用いうる。キャピラリー電気泳動に関する概説は、ランダース
（Landers）ら（1993）BioTechniques 14：98〜111に記載されている。増幅産物
のサイズは、プライマーによって特定される遺伝子座に存在する反復の数に比例
する。このサイズは集団において多型性であると考えられ、このため、その遺伝
子座に対する対立遺伝子マーカーとなる。

【０１５７】 PrP関連疾患の診断および治療的処置本明細書に記載する2つのPrP^０／０系統のようにDpl活性の発現が亢進した動
物では、プリオン感染症の症状が生じるまでの潜伏期の短縮も認められる。この
観察所見に基づき、本発明は、Dplの発現が変化した動物を用いて試料のプリオ
ン感染性を判定するためのアッセイ法を提供する。本方法は、試験を行おうとす
る試料を本発明のDplトランスジェニック哺乳動物または雑種哺乳動物に接種し
、プリオンに一般に伴う疾患の症状を発症するかどうかを判定するのに十分な期
間にわたってその哺乳動物を観察することによって、試料がプリオンに感染して
いるか否かを判定する。動物は、1）通常の内因性Dpl変異、例えば遺伝的スクリ
ーニングで同定されたDpl遺伝子座における変異；2）トランスジェニック動物に
おいて生じるDpl変異、例えば、Dpl遺伝子産物の発現上昇をもたらすPrP遺伝子
座の欠失；および／または3）Dplポリペプチドをコードする外因性導入遺伝子の
導入のために、Dplの発現レベルが上昇しているものでもよい。

【０１５８】本発明のDpl動物を、動物の死因を明らかにするための方法に用いることもで
きる。このような方法には、死亡した動物からの抽出脳組織などの体液または組
織を本発明のDplトランスジェニック動物または雑種動物に接種し（および好ま
しくは標準化されたプリオン標本を対照動物に接種し）、動物がプリオン感染症
の症状を発症するかどうかを判定するためにトランスジェニック動物または雑種
動物（および対照動物）を観察することが含まれる。

【０１５９】 1つの好ましい態様において、Dpl活性が変化した本発明の動物は、PrP遺伝子
座に関して改変されたゲノムも有する。動物の例には、（1）米国特許第5,698,7
63号に開示されたような、内因性PrP遺伝子が除去された動物；（2）米国特許第
5,792,901号および米国特許出願第08／935,363号に開示されたような、除去され
た内因性PrP遺伝子および遺伝的に異なる種からの外因性PrP導入遺伝子を有する
動物；ならびに（3）米国特許出願第09／052,963に開示されたような、除去され
た内因性PrP遺伝子および誘導可能なPrP導入遺伝子を有する動物が非制限的に含
まれる。

【０１６０】好ましい宿主動物はマウスおよびハムスターであり、トランスジェニック動物
の作出に関してかなりの知識が得られていることからみて、マウスが最も好まし
い。その他の可能な宿主動物には、ハツカネズミ属（マウスなど）、ドブネズミ
属（ラットなど）、アナウサギ属（ウサギなど）、ならびにハムスター（Mesocr
icetus）属（ハムスターなど）およびモルモット属（モルモットなど）から選択
される属に所属するものが含まれる。一般に、交雑および維持が容易であり、正
常の成体重量が1kg未満であるような哺乳動物を使用することができる。宿主PrP
遺伝子は、ウシ属、ヒツジ属、イノシシ属およびヒト属から選択される属に所属
する被験動物からの遺伝的に異なるPrP遺伝子からのコドンを含むように変更す
ることができる。好ましくは、マウスの宿主PrP遺伝子は、ヒト、ウシまたはヒ
ツジのPrP遺伝子からのコドンを含むように変更されるが、中でもウシが最も好
ましい。ウシが好ましい理由は、本発明の重要な目的が、ウシの群れの中の統計
的に有意な数のウシの検査を行い、「狂牛病」として知られるBSEの原因となる
プリオンにウシが感染しているかどうかを判定することを目的として動物を用い
ることであるためである。

【０１６１】また、本発明は、プリオンによる感染の結果として発症する疾患の治療におけ
る薬剤の有効性を試験するための方法であって、プリオン（好ましくは標準化さ
れたプリオン標本）に感染したトランスジェニック動物または雑種動物に被験薬
剤を投与すること、ならびに、その薬剤がその疾患の治療または進行の遅延化に
有用であるか否かを判定するためにその哺乳動物を観察および／または検査する
ことを含む方法も提供する。このような方法は米国特許第5,792,901号および米
国特許出願第08／935,363号に記載されており、これらはいずれもこの目的のた
めに参照として本明細書に組み入れられる。

【０１６２】本発明は、Dplの発現をダウンレギュレートする、および／またはDpl活性を低
下させる化合物の投与によってプリオン病を治療するための方法も提供する。Dp
l活性の上昇はプリオン病の潜伏期の短縮をもたらし、PrP^ＣはDpl上昇型の表現
型をレスキューしうる（それらが経路において相互作用または競合する可能性を
示唆する）ことから、Dpl活性の低下により、例えばPrPScに反応して起こるニュ
ーロンの変性を防止することによっって、プリオン病の進行を遅延または停止さ
せることができる。

【０１６３】 Dplをコードする核酸の治療的使用 Dplをコードする核酸は、細胞の形質転換、好ましくは安定的な形質転換を実
現するために細胞に導入することができる。Dplをコードする核酸の細胞への導
入は、当技術分野で周知の方法に従って行うことができる（例えば、エレクトロ
ポレーション、マイクロインジェクション、組換え（好ましくは複製能欠損）ウ
イルスによるリポフェクション感染、および当技術分野で周知のその他の手段の
使用による）。Dplをコードする核酸は、望ましいレベルのDplポリペプチド発現
を促すプロモーター（例えば、CMV、SV40、アデノウイルスに由来するプロモー
ター、または組織特異的もしくは細胞種特異的プロモーター）と機能的に結合し
ていることが好ましい。Dplをコードする核酸を含む形質転換細胞は、例えば、D
plをコードする構築物中に存在する、またはDplをコードする構築物との同時ト
ランスフェクションを行うプラスミドに存在する選択マーカー遺伝子の発現によ
って、選択および／または濃縮することができる。典型的には、選択マーカーは
テトラサイクリン、ハイグロマイシン、ネオマイシンなどの抗生物質に対する耐
性を付与する。他のマーカーにはチミジンキナーゼなどが含まれうる。

【０１６４】形質転換細胞がDplをコードする核酸を発現する能力は、当技術分野で知られ
た種々の方法によって評価可能である。例えば、Dplの発現を、関連遺伝子に由
来するDNAプローブとハイブリダイズするmRNAを検出するためのノーザンブロッ
ト法によって検討することができる。望ましい遺伝子を発現する細胞をさらに単
離し、当技術分野で周知の方法を用いるインビトロ培養によって増殖させること
ができる。DplをコードするDNAによる形質転換のために選択される宿主細胞は、
エクスビボ療法の目的（例えば、Dplペプチドの産生）、細胞の移植部位、およ
び当業者が理解すると考えられる種々の要因に応じてさまざまであると考えられ
るその他の要因に応じてさまざまであると考えられる。

【０１６５】標的細胞における発現を目的とする関心対象の核酸のインビボ送達のための方
法は当技術分野で知られている。例えば、インビボでの遺伝子送達の方法には通
常、DNAを標的細胞に導入するための生物的手段（例えば、関心対象のDNAを含む
ウイルス）またはDNAを標的細胞に導入するための機械的手段（例えば、細胞へ
のDNAの直接注入、リポソーム融合、「遺伝子銃」を用いる空気圧注入など）の
いずれかを用いる。

【０１６６】標的組織を感染させ、十分な数の細胞の形質転換を行い、望ましいレベルのDp
lの産生を得るために有効なDNAの量および／または感染性ウイルス粒子の数は、
インビトロ形質転換の効率および標的細胞の形質転換に対する感受性などの要因
に基づいて容易に決定することができる。一般に、DNAの量は、動物モデルにお
ける望ましい遺伝子の送達および発現のために有効なDNAの量から推定すること
ができる。例えば、ヒトにおける送達のためのDNAの量はラットで有効なDNAの量
のおよそ100倍である。

【０１６７】 DplをコードするDNAをインビボまたはエクスビボのどちらで導入するかにかか
わらず、DNA（またはDNAを発現する細胞）は、他の遺伝子および他の薬剤と組み
合わせて投与することができる。さらに、DplをコードするDNA（またはDpl DNA
を発現する組換え細胞）は、例えば、Dpl産生低下と関連するがDpl機能の変化自
体とは関連のない疾患に対して治療的に用いることができる。

【０１６８】実施例以下の実施例は、本発明の実施および使用の方式に関する完全な開示および説
明を当業者に提供するために記載されており、発明とみなしている内容の範囲を
制限するものではなく、示した実験が実施したすべてまたは唯一の実験に過ぎな
いことを表現または意味するものでもない。使用する数字（例えば、量、温度な
ど）に関して正確であるように努力は払っているが、ある程度の実験的誤差およ
び偏差は許容されるべきである。別に特記しない限り、各部分は総重量にしめる
部分重量であり、分子量は平均分子量であり、温度は℃で示され、圧力は大気圧
またはその近傍圧である。

【０１６９】実施例1： Prnd遺伝子座の同定ヒト、ヒツジ、およびマウスPrP遺伝子の「a」対立遺伝子であるPrnpaを含む
ファージおよびコスミド分子クローンに関する以前の大規模シークエンシング研
究では、PrPと直接隣接した部分またはイントロン配列の内部のいずれにも、ほ
かのコード領域に関する証拠は示されなかった（Leeら、Genome Res. 8：1022〜
1037（1998））。しかし、さらに3'側に伸びているマウスPrnp^bコスミドクロー
ンI／LnJ-4（Westawayら、Neuron 7：59〜68（1991））のシークエンシング、お
よび「XGrail 1.3c」プログラム（Uberbacherら、ORNL／TM 11741（1991））を
用いた分析により、nt 36119〜36,751にコード領域の候補が示された（図1A）。

【０１７０】コスミドおよびYACクローンを標準的な手順によって増殖させたが、これは以
前に記載されている（D. Westaway、Cell 76：117〜29（1994））。129Sv／J BA
Cクローン321L17が、ミレニアムファーマシューティカルズ（Millenium Pharmac
euticals）社から寄贈を受けたライブラリーから同定された。

【０１７１】このORFの予想されるアミノ酸配列（図2）には、哺乳動物、有袋動物および両
生類のPrPとの相同性が認められる。本発明者らは、この推定される遺伝子をPrn
d（プリオン遺伝子複合体、下流（prion gene complex, downstream）からとっ
たもの）と呼び、タンパク質産物を「Dpl」（下流、プリオンタンパク質様（dow
nstream, prion protein-like）からとったもの：ドイツ語の「二重（double）
」）を呼ぶ。

【０１７２】サザンブロット分析により、マウスゲノムではPrndの推定コード領域が単一コ
ピーの配列であることが示された。Prnd ORFがI／LnJマウスに特異な特徴である
可能性を否定するために、本発明者らは、C57B6由来のYACクローン（Westawayら
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：6418〜6422（1994））および129／SvJ BAC
クローン321L17からの対応する染色体領域のシークエンシングを行った。その両
方から同一のORFが示された。さらに、関連のあるORFがラットおよびヒトに存在
しており、ヒトPrnD遺伝子はPRNPの27kb 3'側に位置する。これらのデータは、P
rnD遺伝子がすべての哺乳動物に存在することが明らかになると考えられること
を示している。

【０１７３】実施例2： Prnd遺伝子座の構造 Prnd cDNAを、この領域から転写されるmRNAのスプライシングを示すため、お
よび適切なコードエクソンの範囲を明確にするために単離した。野生型の成体マ
ウス脳cDNAを開始材料として用いて、評価の高いアプローチであるcDNAライブラ
リースクリーニングおよびcDNA末端の迅速増幅（RACE）を行った。

【０１７４】 PrnD RNAのRACEクローニング 5' RACE分析のために、アダプタープライマーAP1およびPrndアンチセンス鎖プ
ライマーDW112、（0.2μM）を用い、パーキンエルマー（Perkin-Elmer）2400型サーモサイクラー
、ならびに94℃ 20秒に続いて94℃ 5秒および72℃ 360秒を5サイクル；94℃ 5秒
および70℃ 360秒を5サイクル；および94℃ 5秒および68℃ 360秒を30サイクル
行う「タッチダウン」PCR条件を用いて、「マラソン（Marathon）」マウス脳cDN
A（Clontech、Palo Alto、CA）を増幅した。Taqポリメラーゼを「TaqStart」抗
体（Clontech、Palo Alto、CA）とともに用いた。サイズ分画を行った反応産物
をトリシン緩衝液中に再懸濁し、入れ子状（nested）プライマーのセット：AP2
汎用プライマーおよびPrndプライマーORFP-R2（0.2μM）、を用いて2回目のPCRを行った（94℃ 60秒に続いて、94℃ 10秒、57℃ 20秒、72
℃ 150秒を20サイクル）。キナーゼ標識した内部プライマーDW95 とのハイブリダイゼーションによる確認の後に、PCR反応産物を直接、またはプラスミドベクターpCR2.1TOPO（Invitrogen）中にクローニングした後にシークエ
ンシングを行った。3' RACE産物についても、入れ子状プライマーを用いて、同様の戦略を採用した。

【０１７５】 Prnd mRNAのRT-PCR 酸-フェノール法およびオリゴdTラテックス（Quiagen）上に選択されたポリA
によって全RNAを調製した。第1鎖のcDNAの合成は、製造者（Stratagene、La Jol
la、CA）による推奨の通りに、オリゴdTによるプライミングを行ったポリA+ RNA
またはランダムヘキサマープライマー（記載の通り）およびMuLV逆転写酵素を用
いて行った。逆転写酵素の存在下または非存在下でインキュベートしたcDNA合成
反応物の2ngのアリコートを直接、または限外濾過による濃縮および脱塩の後に
増幅した。後者の場合には、cDNA第1鎖の合成反応物40μl（160ngのcDNAに相当
）を450μlの水で希釈し、分子量カットオフ値50,000の「Eluticon」微量濃縮装
置（Owl Scientific）に入れた。14,000×gで回転させた後に、膜を500μlの水
で洗い、回転させ、反転させて10μlの水で溶出した。1回のPCR反応につき、こ
の調製物の2.5μlを用いた。または、全RNAの10μgを総容量50μl中でスーパー
スクリプト（Superscript）逆転写酵素（Life Technologies）を用いて逆転写し
、1回の増幅反応について2.5μlを用いた。「ホットスタート（Hot-start）」増
幅（Platinum Taq"、Life TechnologiesまたはAdvantage KlenTaq、Clontech）
を、以下に述べる標準的な反応緩衝液中で行った。プライマーのセットは以下の
通りとした：

【０１７６】 Prndエクソン1aからPrnDエクソン2まで： 94℃ 180秒に続いて、94℃ 15秒、65℃ 30秒、72℃ 75秒を40サイクル、プラ
チナ（Platinum）Taqポリメラーゼおよび最終濃度2mMのMgCl₂を使用。

【０１７７】遺伝子間エクソン2からPrnDエクソン2まで：およびDW96（0.5uM）。 95℃ 300秒に続いて、95℃ 10秒、55℃ 20秒、72℃ 150秒を45サイクル、プラ
チナTaqポリメラーゼおよび最終濃度2.5mMのMgCl₂を使用。

【０１７８】 Prnpエクソン2からPrnDエクソン2まで： 5'UT.3（Westaway、Neuron 7：59〜68（1991））およびDW96（0.2uM）。 95℃ 300秒に続いて、94℃ 15秒、60℃ 30秒、72℃ 120秒を40サイクル、プラ
チナTaqポリメラーゼ、ならびにそれぞれ2.5mMおよび4％の最終濃度でMgCl₂およ
びDMSOを使用。

【０１７９】ラットPrnpエクソン2からPrnDの3'末端まで（ESTAI136375による定義）：（マウス遺伝子配列とのミスマッチ部には下線を施している）。94℃ 120秒に続
いて、94℃ 15秒および72℃ 240秒を40サイクル。β-アクチン：これらは製造者
（Statagene、La Jolla、CA）による推奨の通りに用いた。

【０１８０】 RACEおよびRT-PCR分析の結果を用いて公的データベースからESTマッチを検索
したところ、多数のものがマウス、ヒトおよびラットから検索された（図1B）。
Balb／C精巣cDNAライブラリーからは1.5Kbおよび1.7KbのPrnD cDNAが検索された
。これらのクローンは、ノーザンブロット上で観察された主要なDpl mRNA種に対
応していた。さらに大きい2.7Kbの転写物もノーザンブロット上に認められ、3'
RACEからは、このmRNA種の原因になりうると思われる、エクソン2の選択的スプ
ライシングに関する明確な証拠が得られた。

【０１８１】 2つの主要なcDNAクローンの検討により、それらが3'末端のポリA部分および選
択的スプライシングを受ける5'エクソン由来の部分配列を含むことから、それら
がほぼ完全長であることが示された。5' RACE分析はこれらのクローンの配列と
よく一致し、このことから、それぞれ1aおよび1bと命名された短い5'エクソンか
らnt 34,124またはnt 34,277で始まり、エクソン2すなわちPrnd ORFのすぐ5'側
に位置するnt 36,204の共通のスプライスアクセプターまでに至るスプライシン
グイベントが示された（図1B、図2A、2B）。これは、エクソン1bからエクソン2
までのスプライシングによって生じるマウスDpl EST AA796652の配列とも一致す
る（図1B）。

【０１８２】種々のプライマーを用いたRT-PCR反応によれば、PrnD 5'非翻訳領域エクソン
の5'境界はほぼ30ヌクレオチドの区域内に位置していた（図2A）。さらに正確な
マッピングを行うために、プライマー伸長反応およびヌクレアーゼ保護アッセイ
法を用いた。プライマーDW197 、ハイブリダイゼーション温度65℃）およびDWJ23a 、ハイブリダイゼーション温度55℃を用いるプライマー伸長反応を、6000Ci／mm
olのγ-^３２P-ATP（「キナーゼマックス（Kinase Max）」、Ambion Inc：NEN）
を用いてプライマーを比放射能AE 9×10^７dpm／pmoleとなるように標識したこと
を除き、以前の通り（Westawayら、1987）に行った。ヌクレアーゼ保護アッセイ
法（「マルチNPA（Multi-NPA）」、Ambion Inc.）のためには、同じ方法で標識
した42量体のオリゴヌクレオチドを用いた。

【０１８３】これらのマッピング実験の結果はよく一致しており、RACE cDNAおよびEST gbA
A796652（マウス乳腺由来）によって規定される5'末端の13〜18ヌクレオチド上
流にmRNA開始部位のクラスターの範囲が定められた。これらの指定はヒトPrnd c
DNAの構造とも一致していた。2つの選択的スプライスドナーの使用に起因するこ
の5'非コード性エクソンの選択的3'境界を理由として、それは「エクソン1a／1b
」と命名された。注目されることに、同様の並び方がウシPrP遺伝子で認められ
ている（Horuichiら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 233：660〜654（1997）
）。エクソン1aまたは1bはどちらも染色体ORFとインフレームの関係にあるATGコ
ドンを含まないため、これらのcDNA（および以下に述べる他のもの）は、Prndに
関する開始コドンがヌクレオチド36,212のスプライスアクセプターの3'側にある
ことを示している。このATGは保存的であり、真核生物mRNAの開始に関するコザ
ック共通配列とよく一致している（Kozak、Nucleic Acids Res. 15：8125〜8148、1987）。PrnD開始部位の位置は
、ATGコドンがエクソン3のスプライスアクセプターの10ヌクレオチド3'側にある
（Westawayら、Cell 51：651〜662（1987））、Prn-p自体と同様の様式で構成さ
れている。

【０１８４】独立した由来をもつcDNAの内部構造から、Prnd mRNAの3'UTRは別々のエクソン
の内部にコードされていて選択的スプライシングを受けることが示された（図1B
）。このため、ORF終止コドンの28ヌクレオチド3'側（36,779の位置）にある1つ
のスプライスドナーおよび37,472の位置にあるさらに下流のもう1つが38,006付
近の位置にスプライスアクセプターをもたらすが、これはノーザンブロット（下
記）によって検出された〜1.7kbおよび2.7kbのRNAに関する説明になると推定さ
れる。I／LnJ-4コスミドでは、polyA部分を含むcDNAクローンが39,099および39,
315の位置を終端とすることが明らかになった。さらに3'側の部位の前にもコン
センサス・ポリアデニル化シグナルAATAAAが存在するが、5'部位からは同様のモ
チーフが欠失している。注目されるのは、配列CTTAAAがポリA尾部の27ヌクレオ
チド5'側に位置することである。この3'遺伝子構造は、（i）3'UTRコード配列の
内部にあるイントロンは稀である、（ii）37,472および38,006の位置にあるスプ
ライス部位は、一般に認められた共通配列（正確なイントロン境界の位置を厳密
に決定することはヌクレオチドの冗長性から困難であり、境界はこれらの座標か
ら+1または+2ずれる可能性がある）または系統多型とは異なる、および（iii）
、イントロン2はPrndのタンパク質コードエクソンと推定される範囲をPrnpの場
合のように末端エクソンではなく、内部エクソンとして定めている、という点で
通常のものではない。サイズが575または1,268ヌクレオチド（スプライスドナー
部位の選択に依存する）であることから、このエクソンは内部エクソンの99％は
400塩基長未満であるという規則に反する（Berget、J. Biol. Chem. 270：2411
〜2414（1995））。

【０１８５】実施例3： Prnd遺伝子座からの転写物の発現全RNA（50gをローディング）またはオリゴdTで選択されたRNA（7gをローディ
ング）を用い、ILn／J-4コスミドに由来する570bpのPrnD ORF断片の全体を用い
て、ノーザンブロット分析を行った。全RNAはトリゾール（Trizol）試薬（Gibco
）を製造者の指示に従って用いて作製した。ポリA+ RNAはオリゴテックス（Olig
otex）mRNAキット（Qiagen）を用いて単離した。製造者（Ambion Inc.、Woodlan
d、TX）の推奨の通りに、RNA試料をグリオキサール試料用緩衝液中にて50℃で30
分間加熱し、1.2％アガロースゲル上での電気泳動にかけた。ターボブロッター
（turboblotter）（Schleicher and Schuell）を用いてRNAを5×SSC 10mM NaOH
中で2時間にわたってハイボンド（Hybond）N+（Amersham）に移行させ、5×SSC
で洗浄し、UV固定（Statagene、La Jolla、CA）を行った後に、プレハイブリダ
イゼーション（6×SSC、1％SDS、3％（w／v）デキストラン硫酸、10μg／mlの超
音波処理ニシン精子DNA）を65℃で1時間行った上で、プライマーRM1 およびDW96を129Sv／JゲノムDNAテンプレートとともに用いて生成された540bpの
Dpl ORF PCR a-dCTP32ランダムプライムプローブ（Feinbergら、Anal. Biochem.
132：6〜13（1983））を添加した。膜を16時間ハイブリダイズさせた後に室温
下で2×SSC／1％（w／v）SDSで5分間すすぎ洗いし、65℃の2×SSC／1％（w／v）
SDS中で30分間洗浄し、さらに65℃の1×SSC／1％（w／v）SDS中で30分間洗浄し
た。ブロットを-80℃で3日間露出させた。これにより、野生型マウスの精巣およ
び心臓のポリA+ RNAに約1.7kbおよび2.7kbのPrnd mRNAが認められた。脳ではPrn
d mRNAは検出されなかった。

【０１８６】 RT-PCRを用いたところ、成体脳cDNAおよび14日齢の胚において、エクソン1aか
らエクソン2までのスプライシングによって生じる野生型マウスにおけるmRNAを
検出することができた（図3）。いくつかの成体脳試料では、その1つがエクソン
1bの組み入れを反映している、別のcDNA種が検出された。Dpl mRNAの発現に関す
る一部の証拠はPrnd ESTマッチの組織由来から導き出すことができる（図1B）。
すなわち、マウスESTのAA796652、AA104098およびAA190150はそれぞれ成体乳腺
、胚の心臓および成体脾臓に由来していた。以上を総合すると、Prnd mRNAは胚
および末梢組織で発現され、成体CNSにおける発現は低レベルである。

【０１８７】 DNA配列データから予想された通り、内部でDplが最初に認められたILn／J-4コ
スミド導入遺伝子の高コピー数の配列を有するTg(MoPrP-B)2091マウスの脳RNAに
おいても同様の電気泳動移動度が認められた。上記の通り、wt対照マウス脳試料
では対応する産物は検出不能であった。

【０１８８】実施例4： Dpl配列のコンピュータ解析 SWISSPROTおよびTREMBL（A. Bairochら、Nucleic Acids Res. 19 Suppl：2247
〜9（1991）；Stoesserら、Biochemistry 37：7185〜7193.（1998））配列デー
タベースの重複しないさまざまな組み合わせを、整列化プログラムFASTA_3（Pea
rsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：2444〜2448（1988））およびPSI_BLA
ST（S.F. Altschulら、Nucleic Acids Res. 25：3389〜402（1997）を用いて、
ヒトおよびマウスDplの配列に関して検索した。Dplタンパク質は多くのPrP配列
と、低いながらも有意な相同性（〜160残基にわたる同一性が24〜26％）を示す
（FASTA_3スコアE()＝0.00015、ここでE()は偶然による配列一致の期待数である
；イヌPrPとの整列化に関するPSI-BLAST E()＝2×10(-41)）。

【０１８９】膜貫通区域の可能性があるものが、TopPred 2（G. von Heijne、J Mol Bid. 2
25：487〜94（1992））およびTMPred（例えば、D.S. Millicanら、Endocr Res.
24：387〜90（1998）を参照）を用いて予想された。ヒトおよびMoDopに関するN
末端シグナルペプチド切断部位は、SignalPプログラム（H. Nielsen、Int J Neu
ral Syst. 8：581〜99（1997））を用いて示された位置にあることが予想された
。このプログラムは真核生物シグナルペプチドの位置を〜70％の精度で決定する
。しかし、II型N末端膜貫通区域の50％はシグナルペプチドとして過剰に予想さ
れる。GPI結合部位（wと表記）およびこれに続く2つの残基の位置（w+1およびw+
2）には明確な残基選好性および忌避性があり、例えば、wの位置にはセリンおよ
びアスパラギン酸に対する選好性があり（Y. Furukawa、Biochim Biophys Acta
1328：185〜96（1997）；P. Harrison、未発表データ）、切断されたC末端シグ
ナルペプチドには大部分が疎水性残基である連鎖（8〜31残基長）が必要である
。この領域は、親水性の高い2〜8残基の区域によってw+2と隔てられている。Dpl
配列には両方のシグナルが認められる。DplのGPIアンカー結合部位である可能性
が非常に高いもの（{w、w+1、w+2} G155A（GまたはA））が、GPIアンカーに関す
る文献の検討、C末端でのDplとPrPとの間の配列相同性、および配列データベー
スから選択されたGPIアンカータンパク質の代表的なセット（P. Harrison、未発
表データ）から決定された（図2および5。多数の配列の整列化によって推定され
たGPIアンカー部位（{w、w+1、w+2}＝G157LR）は、w+1は大きな脂肪族疎水性基
または芳香族基であることがほとんどなく（97％；63例中61例）、w+2は荷電性
基（または大きな脂肪族疎水性基または芳香族基）であることがほとんどない（
98％；63例中62例）ため（P. Harrison、未発表データ）ため、可能性が低い（
図2））。この領域における可能性のあるその他の結合部位は同様の理由から除
外することができ、その結果、推定した部位である{w、w+1、w-t-2}＝G155A（G
またはA）のみが残る。

【０１９０】実施例5：キメラ型Prnp／PrnD mRNA RACEおよびcDNAクローニングと並行して、PrnDの5'エクソンの可能性があるも
のを同定するために遺伝子探索プログラム「GRAIL」も用いた。I／LnJ-4コスミ
ド配列の関連領域の分析ではエクソン1a／1bは検出されなかったが、その代わり
にPrnp ORFとPrnD ORFとの間にセンス鎖エクソンと推定されるものが2つ検出さ
れた（nt 29,589〜29,672；「Grailエクソン6」およびnt 29,798〜29,832；「Gr
ailエクソン7」）。「grailエクソン6」中に位置するプライマーを用いて野生型
成体マウス脳RNAからcDNAを増幅することができ、ヌクレオチド29,671にあるコ
ンセンサス・スプライスドナーからPrnDエクソン2のスプライスアクセプターま
でのスプライシングがDNAシークエンシングによって確かめられた（図4）。

【０１９１】これらのRT-PCR分析により、grailエクソン6は新たな5'エクソンであることが
明確にされたが（図4、遺伝子間エクソン2）、本発明者らがPrnDエクソン1a／lb
（または「Grailエクソン7」）を含むcDNAを同定できなかったことから、エクソ
ン1aの5'側にある保存配列がPrnDプロモーターを構成することが示唆された。続
いて、「Grailエクソン6」を含むPrnD mRNAがさらに別の5'プロモーターから生
じる可能性を検討した。Prnpプロモーターは23Kbしか離れていないところに位置
し、正しい転写方向に位置しているため、これもPrnDプロモーターの有力な候補
であった。野生型マウスからの脳cDNAのRT-PCR分析で、Prnpエクソン2に位置す
る5'プライマーおよびPrnDエクソン2に位置する3'プライマーを用いて産物を得
た（図4）。これらのcDNAの配列解析により、それらのキメラ的性質、すなわち
エクソン2のPrnp転写単位の内部に始まり、エクソン2aで始まるPrnD転写単位の
内部で終止することが確認された（図5）。いくつかのcDNAは、Prnpエクソン2と
PrnDエクソン2aとの間に介在する形で「Grail 6」エクソンを含んでおり、それ
によってこのエクソンの5'境界がヌクレオチド29,671にあるコンセンサス・スプ
ライスアクセプター部位であることが明確に定められた。その他のcDNAは、cDNA
のサブセットにおいて、ヌクレオチド25,482と26004との間に位置する別のエク
ソン（遺伝子間エクソン2）を含んでいた。これらの2つの遺伝子間エクソンの選
択的な利用により、種々のキメラ型mRNAが生じる（図5）。

【０１９２】高等哺乳動物の染色体遺伝子における遺伝子間スプライシングに関する前例は
1つしかないため（Magrangeasら、J. Biol. Chem. 273：16005〜16010（1998）
）、本発明者らは、第2の種において本発明者らの観察所見を確認しようと考え
た。ラットPrnpエクソン2、およびマウスPrnDエクソン3の3'境界と相同なEST AI
136375の配列を用いることにより、ラット組織に関するRT-PCR実験を行った。

【０１９３】予想された通り、脳および精巣の双方において、遺伝子間エクソンの2つの順
列を含む類似のキメラ型cDNAが検出された。この2つの遺伝子間エクソンはマウ
スとラットとの間でほとんど保存されておらず（非提示）、PrnD ORFとインフレ
ームの関係にあるATGコドンも認められないことから、本発明者らは、それらが
タンパク質コード機能を果たさないと推測している。

【０１９４】実施例6： Dplを発現する細胞系の樹立 Dplの活性および／または細胞相互作用をさらに十分に検討するため、樹立さ
れた神経細胞系にDpl導入遺伝子を導入した。

【０１９５】哺乳動物Dpl発現ベクターの調製オリゴヌクレオチドプライマーの対を用いたB6-9 YACクローンの増幅によって、PrnD cDNAカセットを調製した。こ
の対の5'プライマーはエクソン2aのスプライスアクセプター部位を変化させる。
EcoRIおよびXbaで消化した後に、この結果得られたcDNAカセットをゲル精製し、
哺乳動物発現ベクターpcDNA3.0（Invitrogen）中にクローニングした。

【０１９６】安定なDpl細胞系の樹立 pcDNA3.0_Dpl（1〜5g）を0.1mLのOpti-MEM（Life Technologies）に添加し、1
5Lのリポエクトアミン（LipofectAMlNE）試薬（Life Technologies）と混合した
後に室温で40分間インキュベートした。10％ウシ胎児血清［FBS］（Life Techno
logies）を添加した高グルコースDMEM（Life Technologies）中で培養したNeuro
-2a細胞［N2a］（ATCC）を、6cm培養皿中で集密度が60％となるまで増殖させた
。細胞をハンクス平衡塩類溶液［HBBS］で2回洗浄し、各培養皿に2mLのOpti-MEM
を添加した。ゆっくりと混合しながら各培養皿に脂質／DNA混合物を滴下し、細
胞を37℃で5時間インキュベートした。細胞にはPrnD挿入物を含まないpcDNA3.0
によるトランスフェクションも行い、DNAを含まないOpti-MEM／脂質混合物を陰
性対照とした。続いて細胞に20％FBSを含む1mLのDMEMを与え、37℃で一晩インキ
ュベートした。細胞をトリプリン処理し、10％FBSおよび1mg／mLのG418を含むDM
EMとともに10cmプレートに播いた。個々のコロニーを選択し、選択から2週間増
殖させ、10％FBSおよび0.3mg／mLのG418を含むDMEM中で維持した。

【０１９７】細胞系からのRNAの調製集密度が〜80％となるまで75cmフラスコ内で細胞を増殖させ、12mLのHBBS中で
3回洗浄した。細胞を剥がして5mLの氷冷HBBS中に入れ、1,000×g、4℃での5分間
の遠心処理によってペレット化した。細胞を1mLの氷冷HBBS中に再懸濁し、RNA非
含有微量遠心管（Ambion）に移して、14,000rpm、4℃での1分間の遠心処理によ
ってペレット化した。ペレットを新たに調製した0.6mLの変性溶液（4Mチオ硫酸
グアニジウム、25mMクエン酸ナトリウム、pH 7.0、0.5％サルコシル、0.1M β-
メルカプトエタノール）中に再懸濁した。次に60Lの2M酢酸ナトリウム、pH4.0、
0.6mLの酸性フェノールおよび0.13mLのクロロホルム：イソアミルアルコール（2
4：1）を添加し、チューブの内容物を振盪によって十分に混ぜ合わせた。試料を
氷上で20分間インキュベートした後、14,000rpm、4℃での遠心処理を20分間行っ
た。水相を新たなRNA非含有微量遠心管に移して、0.6mLの氷冷イソプロパノール
を添加した。チューブを浸透によって混合し、-20℃で1時間インキュベートした
。続いてチューブを14,000rpm、4℃で20分間遠心し、イソプロパノールを除去し
た。ペレットを75％エタノール中で洗浄し、DEPC処理したddH_２Oを加え、-20℃
で20分間インキュベートした。続いてチューブを14,000rpm、4℃で20分間遠心し
、エタノールを除去した。風乾させた後、ペレットを30LのDEPC処理ddH_２O中に
再懸濁し、1Lを260nmでの吸光度によるRNA濃度の測定に用い、試料を直ちにドラ
イアイス上で急速凍結して-80℃で保存した。

【０１９８】 Dpl細胞系のノーザンブロット分析 RNA試料を氷上で解凍させ、DEPC-ddH_２Oを用いて2g／Lとした。各試料の5Lを
分析した。ノーザンマックス（NorthernMax）キット（Ambion）を用いて、ホル
ムアミドを含む1％アガロースゲル上で全RNAを分画した。続いて、同じくノーザ
ンマックスキットを用いて、ゲルをナイトランプラス（Nytran-plus）膜（S&S）
に移行させた。プライマーDW95およびDW96を用いるPrnD cDNAカセットのPCR増幅
によって400bpのDpl ORF断片を調製し、デカプライムII（DECAprime II）キット
（Ambion）を用いてランダムプライミングを行った。エクスプレスハイブ（Expr
essHyb）溶液（Clontech）を用いて膜のハイブリダイゼーションを行い、-80℃
で72時間かけてX線フィルムに露出させた。

【０１９９】実施例7： Prnp^０／０マウスにおけるDplの調節および失調行動 Prnp^０／０系統におけるPrnd発現の変化は、マウスの2種類のPrPノックアウト
系統に認められる運動失調の原因であることが明らかにされた（Sakaguchiら、N
ature 380：528〜531（1996））。Prnp^０／０マウスの異なる系統から調製したc
DNAは、半定量的RT-PCR分析において異なる挙動を示すことが示された。この違
いは、除去される対立遺伝子の設計構造およびPrP欠損表現型の両方に対応して
いた。独立に生じた4つの対立遺伝子の構造を図6に示したが、これらは2つの主
要な分類にあてはまる：すなわち、晩発性運動失調を発症させず、PrPエクソン3
の内部に内部挿入／欠失をもたらすもの（Buelerら、Nature 356：577〜582（19
92）；Mansonら、Mol. Neurobiol. 8：121〜127（1994））、および、PrP ORF全
体に加えて、エクソン3のスプライスアクセプター部位を含むエクソン3の5'側の
〜1Kbの領域も除去される2つの対立遺伝子である。このため、完全なスプライス
アクセプターを有するZrch Prnp^０／０マウス（Buelerら、Nature 356：577〜58
2（1992））は全くシグナルを示さなかったが、エクソン3のスプライスアクセプ
ター部位が除去されているRcmおよびNgsk系統のPrnp^０／０マウスでは、野生型
マウスと対比してキメラ型mRNAの著明な増加が認められた。cDNA標本間にわずか
な違いがある可能性を否定するために、代替的なプライマーセットを用いて行っ
た対照PCR反応を用いた。

【０２００】ノーザンブロット分析により、脳におけるDpl mRNAの発現レベルは、運動失調
を発症する2つのPrnp^０／０系統で劇的に上昇することが示された。したがって
、脳におけるPrnD mRNAの過剰発現はNgskおよびRcm Prnp^０／０マウスにおける
運動失調の発症と関連しており、一方、Zrch Prnp^０／０マウスの脳における低
レベルのPrnD mRNAには小脳機能不全が伴わない。以下の表はこれらの結果をま
とめたものである。

【０２０１】

【表１】 Prnp^０／０マウスの諸系統における小脳性運動失調およびDpl発現

【０２０２】 NgskおよびRcm系統のPrnp^０／０マウスではPrndの著明な過剰発現が生じてお
り、これはいずれも運動失調を発症する。同じく興味深いのは、Prndを過剰発現
しないZrch Prnp^０ ^／０マウスではプルキンエ細胞が健常に保たれているという
所見である。これらの所見は、Prndの過剰発現がプルキンエ細胞に対して有毒で
あることを示唆する。キメラ型mRNAの発現はPrnpプロモーターに依存するため、
このプロモーターがプルキンエ細胞で活性を有しており（Nishidaら、印刷中）
、Prnp／Prnd遺伝子間領域内にあるSal I制限部位のPrnpイントロン2または3'の
いずれかにプルキンエ細胞特異的エンハンサー因子と推定されるものが存在する
と推測されていること（Fischerら、EMBO J. 15：1255〜1264（1996））は興味
深い。

【０２０３】実施例8： Dplタンパク質の予想される特徴入手しうるDplペプチド配列の比較によって、高度に保存されたタンパク質が
明らかとなり、Dplが選択圧にさらされる機能的遺伝子産物であるという証拠が
得られた（図7および8）。マウスおよびラットのDplタンパク質は90％を上回る
同一性を有しているが、マウスとヒトのDpl ORFの配列同一性は76％である。マ
ウスとヒトとの間の配列の違いの大部分（94％、32／34）は保存的アミノ酸置換
である。DplとマウスPrPとの間の相同性は20〜24％の範囲にあると推定されてお
り、これはニワトリと哺乳動物のPrPの間に認められるもの（31〜34％）よりも
わずかに低い（Gabrielら、ニワトリプリオンタンパク質の候補の分子クローニ
ングおよび構造解析（Molecular cloning and structural analysis of a candi
date chicken prion protein）、ヒトおよび動物におけるプリオン病（Prion Di
seases of Humans and Animals）、S. B. Prusiner、J. Collinge、J. Powellお
よびB. Anderton編（London：Ellis Horwood）、pp. 407〜431（1992）；Harris
ら、Proc Nat Acad Sci USA 88：7664〜7668（1991））。この3つの種からのDpl
はいずれもN末端シグナルペプチド切断部位と予想される部位を有しており、こ
のことはそれらがPrP^Ｃと同じように分泌経路で合成されることを示している（
図9）。PrPは、N末端シグナルペプチド切断部位と予想される部位に隣接してア
ルギニンおよびリジンに富む塩基性残基のクラスターを有しており、Dplも残基2
5〜38の間に7つの残基（50％）が塩基性であるという同様の特徴を有している。

【０２０４】 Dplには、PrPに存在し、インビボで銅（II）イオンと結合すると考えられてい
る、確かなHis／Pro／Glyに富むオクタリピート領域がない（Brownら、Nature 3
90：684〜687（1997）；Stockelら、Biochemistry 37：7185〜7193（1998）；Vi
lesら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96：2042〜-2047）。しかし、マウスDplは
コドン41〜46の間に、ニワトリPrPのコドン103〜108のPSSGGSモチーフと非常に
類似した短いPSSGGQモチーフを有する。本発明者らはDplまたはPrPのどちらが元
の分子なのか、すなわちDplがPrPの最近の遺伝子重複によって生じたのか、それ
ともその逆なのかについて確証を得ていないため、この観察所見の意義は明確で
ない。いずれにせよ、このモチーフが除去された反復の痕跡であるか、または増
幅されてPrP内部の反復構造を形成するに至ったプロトタイプ単位であると論じ
ることは可能と思われる。

【０２０５】 Dplには、すべての既知のPrP配列で完全に保存されていてマウスPrPのコドン1
12〜119に対応するAGAAAAGAモチーフと明らかな相同性のある領域が存在しない
（Bamboroughら、Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 61：495〜509（1996
）；Schatzlら、J. Mol. Biol. 245：362〜374（1995））。PrPのこの領域はER
膜におけるPrPの空間配置に極めて重要なことが示されており（Hegdeら、Scienc
e 279：827〜834（1998））、合成ペプチド106〜126に曝露させた初代培養物に
対して合成PrPペプチド106〜126に神経毒性があることも示されているため（For
loniら、Nature 362：543〜546（1993））、この違いはDplとPrPとの間の大きな
機能的相違を示す可能性がある。

【０２０６】 PrPは、C末端のセリン231に結合する形でグリコシルホスファチジルイノシト
ール（GPI）アンカーを有する（Stahlら、Cell 51：229〜240（1987））。PrPと
共通してDplは疎水性C末端領域を有し、本発明者らはこれがGPIアンカーまたは
単一の膜貫通ドメインの付加に適合しうると推測している。DplにはハムスターP
rPのコドン231に対応するセリン残基がないが、本発明者らはGPIがグリシン155
に結合すると推測している。グリシンでのGPIの結合はα-葉酸受容体に関して示
されている（W. YanおよびM. Ratnam、Biochemistry 34：14594〜600（1995）。
ウサギPrP配列の検討で残基231にセリンがないことが示され、ウサギPrPにGPIが
アンカリングしないか、またはセリンではなくグリシン残基にGPIがアンカリン
グしている可能性が示唆されたことは興味深い。

【０２０７】 2つの進化的に関連したタンパク質の表面の残基が保存されていることは、機
能的に重要な要素の有用な指標でもある（Lichtargeら、J. Molec. Biol. 257：
342〜358（1996））。PrPは、N-x-（SまたはT）の形態にある2つのコンセンサス
N結合型グリコシル化部位を有する。MoPrPのヘリックスBにあるN181と類似して
いるN結合型グリコシル化部位はDplで維持されているが、ヘリックスCにある部
位は失われている（図8および9）。これがヘリックスB上の唯一の保存された露
出残基であることは、この複合型グリコシル化に何らかの機能的意義があること
を示す。もう1つのコンセンサスN結合型グリコシル化部位は、露出された表面ル
ープにおける、この部分のアミノ末端側の13残基に認められる（MoDop N-72：NV
T）。少数のNグリコシル化タンパク質（〜23％）は1つまたは複数の非グリコシ
ル化コンセンサス部位を有し、Nグリコシル化タンパク質でグリコシル化されて
いないのはコンセンサス部位の〜10％に過ぎず（G. von Heijne、J Mol Biol. 2
25：487〜94（1992））、このことはこの部位もグリコシル化されり可能性が高
いことを示している。

【０２０８】 GRASPアルゴリズム（Nichollsら、タンパク質11：281〜296（1991））を用い
て評価した静電表面電位はDplとPrPで明瞭に異なる。PrPには分子の反対面に正
および負に荷電したパッチ状部分があり（R. Riek、Nature 382：180〜2）、膜
結合のための方向付けが示唆される。DplではPrPに認められる正に荷電したパッ
チは保たれているが、これらの領域の境界は同じではなく、同様の負に荷電した
パッチは存在せず（非提示データ）、その代わりに中性／正に荷電した領域があ
る。一般に、Dplの表面は、コンフォメーション的に異質でないと考えられる領
域（すなわち、残基121〜231）においてPrPの場合よりも正の荷電が強い。この
荷電表面の配置は、その相互作用が明らかになれば、多量体化に一定の役割を果
たす可能性が高いと思われる。DplおよびPrPが共通の受容体との結合をめぐって
競合するか否かは今後確かめる必要がある。

【０２０９】野生型動物のCNSにおけるPrnD mRNAの発現は低レベルであるため、本発明者ら
は、構成性サイトメガロウイルスプロモーターの制御下でPrnD cDNAを発現する
トランスフェクト細胞においてDplタンパク質に関する証拠を探索した。トラン
スフェクションを受けていないN2A細胞およびCMV／Dplプラスミドを含む安定的
なトランスフェクションを受けた系を選択マーカーの存在下で増殖させ、RNAを
目的として回収し、それをノーザンブロット分析によって評価した。1.7kbおよ
び2.8kbのPrnD mRNAは陽性対照（精巣RNA）では検出されたが、非トランスフェ
クトN2A細胞では検出不能であった。8種の安定的トランスフェクト細胞系のうち
5つは、発現プラスミドに由来する予想された0.9kb mRNAが高いレベルを示した
。

【０２１０】実施例9：ウエスタンブロット法によるDplの検出 mRNAが豊富に存在する2つのクローンを、Dpl-2合成ペプチドに対する抗血清を
用いるウエスタンブロット法による以降の分析のために選択した。残基71〜84に
対応する15残基のDplペプチド2 をFMOC化学合成によって合成し、遊離スルフヒドリル基を介してマレイミド活性
化KLHを結合させた。この結合型ペプチドをRIBIと混合した後、ウサギへの皮下
注射を行った。

【０２１１】細胞を10cm培養皿中で集密度がほぼ80％となるまで増殖させ、10mL HBBSで3回
洗浄した。続いて細胞を剥がして5mLのHBBS中に入れ、1,000×g、4℃で5分間遠
心してペレット化した。ペレットを0.1mLの細胞可溶化緩衝液（20mM Tris-HCl、
pH8.0. 150mM NaCl、0.5％Triton X-l00、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、
完全ミニプロテアーゼインヒビター（Complete mini protease inhibitor ）1錠
（Boehringer Mannheim））中に再懸濁し、滅菌した微量遠心管に移して、4℃で
10分間攪拌した。試料を14,000rpm、4℃で10分間遠心してペレット化し、上清を
清浄な微量遠心管に移した。製造者（Bio-Rad）による推奨の通りにブラッドフ
ォードアッセイ法によってタンパク質濃度を測定した。試料を4×レムリ緩衝液
中に置き、-80℃で保存した。

【０２１２】いずれの系も見かけの分子量が30〜36KDaの強い不均一分散シグナルを呈した
。非トランスフェクト細胞およびPrnD mRNAを発現しないクローンでは、類似の
シグナルはみられなかった。ゲルローディングの基準化は抗アクチン抗血清によ
るプローブ検索によって確認した。完全長、ならびにN末端およびC末端がプロセ
シングを受けたDplの予想サイズはそれぞれ20.4および14.9KDaであるため、本発
明者らはDplが高度にグリコシル化されていると推測している。この結論はN結合
型グリコシル化部位に関して2つのコンセンサス部位が存在することと一致して
おり、20KDaポリペプチド鎖のサイズが糖質鎖の付加によって33〜35KDaへと増加
するPrP^Ｃそれ自体の場合とも非常に類似している。

【０２１３】実施例10： PrP導入遺伝子の過剰発現によるDpl欠損のレスキュー導入遺伝子配列によってコードされるMoPrP-Aの高レベル発現によるNgsk Prnp ^０／０マウスのレスキューは、これらのマウスにおけるDplの過剰発現を高レベ
ルのPrP^Ｃによって克服しうることを示す（Nishidaら、印刷中）。野生型MoPrP-
Aの過剰発現によってレスキューされたこれらのTg(P)Ngsk／Prnp^０／０マウスに
おいて、Dpl ORFを含まないシリアンハムスターCosTetベクター（Scottら、Prot
ein Sci. 1：986〜997（1992））を用いて導入遺伝子を構築した。Tg(P)Ngsk／P
rnp^０／０マウスにおけるPrnD mRNAのレベルは、この導入遺伝子を持たないNgsk
Prnp^０／０同腹仔のものと変わらなかった。したがって、小脳変性がPrnDの過
剰発現に直接起因するのであれば、PrPの過剰発現による「レスキュー」は転写
機構によって進行するはずである。すなわち、PrP^Ｃはおそらく直接的な物理的
相互作用または共通の受容体に対する競合によってDplの毒性作用を取り除くと
考えられる。

【０２１４】本発明をその特定の態様を参照しながら説明してきたが、当業者には、発明の
真の精神または範囲を逸脱することなく、さまざまな変更を加えうること、およ
び同等物と置換しうることは理解されるはずである。さらに、特定の状況、材料
、物質の組成物、工程、工程の1つまたは複数の段階を本発明の目的、精神およ
び範囲に適合させるために多くの変更を加えることも可能である。このような変
更はすべて本明細書に添付される特許請求の範囲に含まれるものとする。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図1Aは、Dpl（PrnD）遺伝子座のゲノム構造およびコード領域を
示した概略図である。図1Bは、Dplのスプライス変異体のほか、この領域に同定
されたESTを示している。

【図２Ａ〜２Ｅ】マウスDpl遺伝子のヌクレオチド配列および対応するア
ミノ酸配列である。

【図３】エクソン1の選択的スプライシングドナー部位を示した概略図で
ある。

【図４】 Prn遺伝子領域の構造の概要であり、最も量の多いPrnpおよびPrn
DスプライスmRNA（細い線）を図の上部に示している。キメラ型cDNAを太い線で
示し、RT-PCRに用いたオリゴヌクレオチドプライマーの位置（矢印）を染色体遺
伝子の上部に示している。

【図５】さまざまな種類のDpl cDNAの構造を示した概略図であり、すべて
のcDNAに共通しているPrnpのエクソン2およびPrnDのエクソン2の配列をそれぞれ
斜線領域および白抜き領域として示している。

【図６】 Prnp^０／０マウスの4つの系統におけるPrP遺伝子の破壊に関する
構造を示した概略図である。大きな黒い矢印は、エクソン3スプライスアクセプ
ターが除去される、晩発性運動失調症の発症と関連のある対立遺伝子を示してい
る。小さい縦向きの矢印は、NgskおよびRcm対立遺伝子において除去されるエク
ソン3スプライスアクセプターの位置を示している。白抜き領域はPrPコード領域
であり、グレーの領域はPrP UTRである。酵素は以下の通りである：E、Eco RI；
X、Xba I；K、Kpn I。

【図７および図８】ヒト（配列番号：2）、マウス（配列番号：3）および
ラット（配列番号：4）Dplという複数の配列を整列化したものであり、同一性お
よび保存性がみられる領域を示した代表的なPrP分子も示している。

【図９】 DplおよびPrPタンパク質の構造の概略図であり、それぞれの予想
される特徴の位置を示している。PrPに認められる3つのαヘリックスをグレーの
領域として示し、3つのDplヘリックスと予想されるものをA、BおよびCとして示
している。＋記号を付した白抜き領域は塩基性残基のクラスターを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者プルシナースタンレイビー．アメリカ合衆国カリフォルニア州サンフランシスコパチェコストリート 400 (72)発明者トレンブライパトリックアメリカ合衆国カリフォルニア州サンフランシスコサリーストリート 291 (72)発明者ムーアリチャードアメリカ合衆国カリフォルニア州サンフランシスコ８スアベニュー＃３ 1256 (72)発明者ウェスタウェイデビッドカナダ国オンタリオ州エトバイコークロイドマナーロード 146 (72)発明者フッドレロイイー．アメリカ合衆国ワシントン州シアトルノースイーストウィンデメアロード 6411 (72)発明者リーインヨルアメリカ合衆国ワシントン州シアトルアパートメント 219 ノースイーストマリーゲイツドライブ 4200 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA29 AA40 BB20 CB01 CB17 CB26 DA12 DA13 DA14 DA36 FA18 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 HA11 4B065 AA01X AA57X AA87X AA90Y AB01 BA01 CA24 CA25 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA00 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】単離されたドッペル（doppel）（Dpl）ポリペプチド。
【請求項２】配列番号：2、配列番号：3、および配列番号：4からなる群
より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載のヒトDplポリペプチド。
【請求項３】請求項1記載のDplポリペプチドをコードする核酸配列を含む
、単離核酸配列またはその相補体。
【請求項４】配列番号：1の核酸配列を含む、請求項3記載の単離核酸配列
。
【請求項５】請求項3記載の核酸配列を含む、組換え発現ベクター。
【請求項６】請求項1記載の核酸配列を含む、単離組換え宿主細胞。
【請求項７】内因性Dpl遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子が改変された
ゲノムを含む、トランスジェニック動物。
【請求項８】改変がDpl遺伝子からの発現増強をもたらす、請求項7記載の
トランスジェニック動物。
【請求項９】少なくとも1つの内因性PrP対立遺伝子が除去されたゲノムを
動物がさらに含む、請求項7記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】ゲノムの内部に遺伝的に異なる種からの外因性PrP遺伝子
が機能的に挿入されている、請求項9記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】請求項1記載のヒトDplポリペプチドと特異的に結合する、
単離された抗体。
【請求項１２】以下の段階を含む、プリオン感染性の検出を容易にするた
めの方法：検査しようとする動物から試料組織を入手する段階；請求項7記載のトランスジェニック動物に試料を接種する段階；およびプリオン病の症状に関してトランスジェニック動物を観察する段階。