KR20020026430A - ＰｒＰ-유사 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Doppel("Dpl") 단백질을 코드화하는 핵산, Dpl 펩티드, 및 Dpl 핵산 및 펩티드를 이용하는 분석법을 제공한다. 관련 양태로서, 본 발명은 인간 Dpl 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 숙주 세포를 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 인간 Dpl 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 인간 Dpl 폴리펩티드의 제조 방법, Dpl을 발현하는 세포의 확인 방법, 배양물 또는 생체내에서 세포 작용 및 프리온 감염성을 변경시키기 위한 Dpl 유전자 및 Dpl 폴리펩티드의 사용 방법, 및 Dpl 코딩 및 조절 서열 및 Dpl 발현 수준의 변화를 검출함에 의해 프리온 장애에 대해 위험한 개체의 확인에 관한 것이다.

Description

ＰｒＰ-유사 유전자{PrP-LIKE GENE}

프리온은 인간 및 동물에서 중추신경계 해면상뇌증을 일으키는 감염성 병원체이다. 프리온은 박테리아, 바이러스 및 비로이드와는 전혀 다르다. 현재 지배적인 가설은 핵산 성분이 프리온 단백질의 감염성에 비필수적이라는 것이다. 더욱이, 어떤 종의 동물(예를 들어, 인간)을 감염시키는 프리온은 다른 종의 동물(예를 들어, 마우스)을 쉽게 감염시키지 않는다.

프리온 및 그것들이 일으키는 질환에 대한 연구에서 주요한 단계는 프리온 단백질("PrP")로 나타낸 단백질을 발견하고 정제하는 것이었다[Bolton et al.,Sci ence218:1309-11(1982); Prusiner et al.,Biochemistry21:6942-50(1982); McKin ley et al.,Cell35:57-62(1983)]. 완전한 프리온 단백질-코드화 유전자가 클론되고 서열화되어 트랜스제닉 동물에서 발현되어 왔다. PrP^C는 단일-카피 숙주 유전자에 의해 코드화되고[Basler et al., Cell 46:417-28(1986)], 정상적으로는 뉴런의 외표면에서 발견된다. 프리온 질환이 PrP^C의 PrP^Sc로 명명된 변형된 형태로의 전환에기인한다는 것이 선도적인 가설이다.

프리온 단백질의 스크래피 동형(PrP^Sc)이 동물 및 인간의 전염성 신경변성 질환의 전염 및 발병에 필수적임이 틀림없다. Prusiner, S. B., "Molecular biology of 프리온 disease,"Science252:1515-1522(1991) 참조. 가장 흔한 동물 프리온 질환은 양 및 염소의 스크래피 및 소해면상뇌증(BSE)이다[Wilesmith, J. and Wells,Microbiol. Immunol. 172:21-38(1991)]. 4가지 인간 프리온 질환은 (1) kuru, (2) 크로이츠펠트-야콥병(CJD), (3) 거스만-스트라슬러-쉐인케르병(GSS) 및 (4) 치사성 가족불면증(FFI)으로 확인되었다[Gajdusek, D. C.,Science197:943-960(1977); Me dori et al., N. Engl. J. Med. 326:444-449(1992)]. 산발성, 유전성 및 감염성 병으로서 인간 프리온 질환의 표현은 처음에 어떤 수수께끼를 제시했으며, 이것은 PrP의 세포 유전자 기원에 의해 설명되었다.

대부분의 CJD 케이스는 산발성이지만, 약 10 내지 15%는 인간 PrP 유전자에서의 돌연변이에 기인하는 상염색체 우성 유전질환으로서 유전된다[Hsiao et al.,Neurology40:1820-1827(1990); Goldfarb et al., Sceince 258:806-808(1992); Kit amoto et al.,Proc. R. Soc. Lond.343:391-398]. 의원성 CJD는 사체의 뇌하수체 뿐만 아니라 경막 이식편으로부터 유도된 인간 성장 호르몬에 기인한다[Brown et al.,Lancet340:24-27(1992)]. 스크래피 감염된 양고기의 소비와 같은 감염원과 CJD를 연결하려는 많은 시도에도 불구하고, 의원적으로 유도된 질환의 경우를 제외하고는 지금까지 아무것도 확인되지 않았다[Harries-Jones et al.,J. Neurol.Neurosurg. Psy chiatry51:1113-1119(1988)]. 한편, 수십년 동안 뉴기니 고지의 Fore 및 이웃 부족들을 유린했던 kuru는 의례적인 카니발리즘 동안의 감염에 의해 퍼져나간 것으로 여겨진다[Alpers, M. P.,Slow Transmissible Diseases of the Nervous System,Vol. 1, S. B. Prusiner and W. J. Hadlow, eds. (New York: Academic P ress), pp. 66-90(1979)].

실험 영장류로의 CJD의 초기 전염은 kuru와 스크래피 사이의 유사성에 대한 William Hadlow의 인지와 함께 시작된 풍부한 역사를 가진다. 1959년에 Hadlow는 kuru로 사망한 환자로부터 제조된 추출물을 비-인간 영장류에 접종하고 장기간의 잠복기간 후 그 동물을 일어날 것으로 예측된 질환에 대해 관찰하는 것을 제안했다 [Halow, W. J.,Lancet2:289-290(1959)]. 7년 후, Gajdusek, Gibbs 및 Al pers는 18 내지 21개월 범위의 잠복기간 후 침팬지에서 kuru의 전염성을 증명했다[Gajduse k et al.,Nature209:794-796(1966)]. kuru의 신경병리학과 CJD의 신경병리학의 유사성[Klatzo et al.,Lab Invest.8:799-847(1959)]은 침팬지를 사용한 유사한 실험을 허용했으며, 질환의 전염이 1968년에 보고되었다[Gibbs, Jr. et al.,Scien ce161:388-389(1968)]. 마지막 25년에 걸쳐서 약 300 케이스의 CJD, kuru 및 GSS가 여러 꼬리 없는 원숭이 및 원숭이에 전염되었다.

그러한 실험의 비용, 희귀성 및 종종 알게된 비인도성은 이런 작업을 제한해 왔으며, 그로 인해 지식의 축적에도 한계가 있었다. 가장 신뢰할만한 전염 데이타는 비-인간 영장류를 사용한 연구로부터 나온다고 말해져 오고 있지만, 인간 프리온 질환 중 어떤 케이스는 분명히 보다 덜 규칙적이나 설치류에도 전염되어 왔다[Gibbs, Jr. et al.,Slow Transmissible Diseases of the Nervous Systems,Vol.2, S. B. Prusiner and W. J. Hadlow, eds.(New York: Academic Press), pp. 87-110(1 979); Tateishi et al.,Prion Diseases of Humans and Animals, Prusiner et al., eds.(London: Ellis Horwood), pp. 129-134(1992)].

PrP^C의 PrP^Sc로의 전환을 이해하는 것의 중요성이 변종 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD)을 나타낸 인간에게 소 프리온이 전염되었을 가능성에 의해 높아지고 있다[ G. Chazot et al.,Lancet347:1181(1996); R. G. Will, et al.,Lancet347:921-925(1996)]. 더 초기의 연구들은 PrP^Sc의 N-말단이 스크래피 감염성의 손실 없이 절단될 수 있으며[S. B. Prusiner, et al.,Biochemistry21:6942-6950(1982); S. B. Prusiner, et al.,Cell38:127-134(1984)], 상응하여 PrP^Sc의 N-말단의 절단이 PrP^Sc로의 그것의 전환을 허용한다는 것을 밝혔다[M. Rogers, et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:3182-3186(1993)].

최근의 연구들은 분자 수준에서 PrP^C의 PrP^Sc로의 구조적 변화를 가시화하는 능력을 진전시키고 있다. 예를 들어, N-말단 부분은 비교적 비구조적이고 유연하지만, C-말단 부분 내의 구조적 요소를 안정화하는 것을 돕는다[D. G. Donne et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 94:13452-13457(1997)]. 더욱이, 면역학적 연구는 N-말단 에피토프가 PrP^Sc에 숨어있다는 것을 증명했으며, 이것은 이 영역이 프리온 증식 동안 난해한 형태적 변화를 겪는다는 생각을 지지한다[Peretz et al.,J. Mol.Biol.273:614-622(1997)].

이들 진전에도 불구하고, 병원성 전환 과정에 대한 구조적 생물학의 이해는 많은 방식에 있어 불완전하게 남아있다. 예를 들어, PrP^C의 구조적 영역이 형태적 변화가 일어나는데 필수적인지 또는 충분하지는 정확하게 알려지지 않았다. 또한, PrP^Sc의 영역이 감염성에 필수적인지 또는 충분한지도 알려지지 않았다. 증거는 프리온 균주 현상 및 종 장벽이 다른 PrP 형태들에 의해 코드화되지만, 이들 형태의 정확한 구조적 결정소는 아직 정확하게 확인되지 않고 있음을 나타낸다[Telling et al.,Science274:2079-2082(1996); Billeter, et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 94:7281-7285(1997)]. 최근 연구들은 PrP^C에서 PrP^Sc로의 형태적 변화를 용이하게 하기 위해 요구되는 추정 인자인 단백질 X와 상호작용한다고 여겨지는 마우스 PrP(MoPrP)의 4개 잔기를 확인했다[Telling et al., Cell 83:79-90(1995)]. 4개 아미노산 모두는 함께 재조합 PrIP 90-231 및 PrIP 29-231의 3차 구조에 추정 단백질 X 결합 부위를 형성하게 된다[D. G. Donne et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 94:13452-13457(1997); T. L. James et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 94:10086 -10091(1997)]. 그러나, PrP^C를 결합시키는 단백질에 대한 몇몇 보고에도 불구하고 단백질 X의 확인은 여전히 알기 어렵다. 마지막으로, 재접혀진 재조합 PrP 분자의 구조가 PrP^C를 닮을 수 있음에도, PrP^Sc에 대한 구조적 해답은 여전히 부족하다.

PrP 작용을 측정하기 위한 한 전략은 PrP와 유사한 단백질의 확인, 및 그러한 단백질의 작용의 해명을 통한 것이다. 프리온-관련 유전자의 확인 및 연구는 일반적인 생물학 및 신경변성 장애의 진행에서 통찰력을 제공할 수 있으며, 뿐만 아니라 프리온-매개 장애를 가져오는 메카니즘적 변경에서도 통찰력을 제공할 수 있다. 따라서, 본 분야에서 유사한 구조 및/또는 작용을 갖는 단백질을 코드화하는 유전자의 확인 및 연구에 대한 필요가 있다.

본 발명은 핵산, 그러한 핵산에 의해 코드화되는 단백질, 및 이들 핵산 및/또는 단백질의 사용을 포함하는 분석법에 관한 것이다.

도 1A는 Dpl(PrnD) 유전자 유전자좌의 게놈 구조 및 코딩 영역을 예시하는 도식적 다이아그램이다.

도 1B는 Dpl의 스플라이스 변이체 및 이 영역에서 확인된 EST를 예시한다.

도 2A 내지 도 2E는 마우스 Dpl 유전자의 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열이다.

도 3은 엑손 1의 다른 스플라이스 도너 부위를 예시하는 도식적 다이아그램이다.

도 4는 도면 상단에 나타낸 가장 풍부한 형태인PrnP및PrnD스플라이스된 mRNA(얇은 선)를 갖는Prn유전자 영역의 구조적 개관이다. 염색체 유전자 위에 나타낸 RT-PCR에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머(화살표)의 위치를 갖는 키메라 cDNA는 굵은 선으로 나타냈다.

도 5는 각각 굵게 음영진 사선 및 빈 박스로 나타낸 모든 cDNA에 공통인 Dpl cDNA 변이체인PrnP엑손 2 및PrnD엑손 2 서열의 구조를 예시하는 도식적 다이아그램이다.

도 6은PrnP ^0/0마우스의 4개 라인에서 PrP 유전자 분열의 구조를 예시하는도식적 다이아그램이다. 큰 검은색 화살표는 엑손 3 스플라이스 수용체를 결실하며 후발성 운동실조의 발생에 관련된 대립유전자를 나타낸다. 작은 수직 화살표는 Ngs k 및 Rcm 대립유전자에서 결실된 엑손 3 스플라이스 수용체의 위치를 나타낸다. 빈 박스는 PrP 코딩 영역이며 회색 박스는 PrP UTR이다. 효소는 다음과 같다: E, Eco RI; X, Xab I; K, Kpn I.

도 7 및 도 8은 동일 및 보존 영역을 나타내는 인간(SEQ ID NO:1), 마우스(S EQ ID NO:3) 및 래트(SEQ ID NO:4) Dpl과 대표적 PrP 분자의 다중 서열 정렬을 예시한다.

도 9는 각각의 예상된 특징의 위치를 나타내는 Dpl 및 PrP 단백질 구조의 도해이다. PrP에서 발견된 3개의 알파 헬릭스는 3개의 예상된 Dpl 헬릭스를 표시하는 A, B 및 D를 갖는 회색 박스로 나타냈다. + 기호를 갖는 흰색 박스는 염기성 잔기의 무리를 나타낸다.

(발명의 개요)

본 발명은 Doppel("Dpl") 단백질을 코드화하는 핵산, Dpl 펩티드, 및 Dpl 핵산 및/또는 펩티드를 이용하는 분석법을 제공한다. 특정 양태로서, Dpl 단백질은 SEQ ID NO:1의 핵산 서열 및 그것의 축퇴 서열에 의해 코드화된다. 이에 더하여, 본 발명은 Dpl 프로모터를 포함하는 분리된 핵산 서열, 및 긴축 조건하에서 SEQ ID NO:1에 혼성화하는 핵산 서열을 특징으로 한다. 관련 양태로서, 본 발명은 인간 Dpl 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 및 숙주 세포를 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 인간 Dpl 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 인간 Dpl 폴리펩티드의 제조 방법, Dpl을 발현하는 세포의 확인 방법, 배양물 또는 생체내에서의 세포 작용 및 프리온 감염성을 변경시키기 위한 Dpl 유전자 및 Dpl 폴리펩티드의 사용 방법, 및 Dpl 코딩 및 조절 서열 그리고 Dpl 발현 수준의 변화를 측정함에 의해 퇴행성 장애에 대해 위험한 상태에 있는 개체의 확인과 관련이 있다.

본 발명의 일차적 목적은 인간 Dpl의 발현(예를 들어, 재조합 숙주 세포에서의) 및, 예를 들어 인간 Dpl 폴리펩티드 결합 화합물(Dpl 활성을 조절하는데 사용될 수 있는, 특히 인간 Dpl 폴리펩티드-매개 활성에 영향을 미치는 화합물)의 확인에 사용하기 위한 분리된 인간 Dpl 폴리펩티드-코드화 핵산을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Dpl 유전자 작용에 대한 비-인간 트랜스제닉 동물 모델, 특히 Dpl 유전자의 과잉 또는 변위 발현을 특징으로 하는 "녹-인(knock-in)" Dpl 비-인간 트랜스제닉 동물의 생성에 사용하기 위한 분리된 인간 Dpl 폴리펩티드 -코드화 핵산을 제공하는 것이다.

특히, Dpl은 PrP 유전자좌의 생성물과 상승적 상호작용을 한다고 여겨지며, Dpl 유전자좌에 있는 돌연변이는 PrP의 스크래피형인 PrP^Sc으로 감염된 동물의 잠복기간을 감소시킨다.

또한, 본 발명은 긴축 조건하에서 Dpl을 코드화하는 DNA에 또는 Doppel을 코드화하는 DNA에 상보하는 DNA에 혼성화하는 DNA 서열을 특징으로 한다. 그러한 DNA 서열은 바람직하게는 적어도 25 뉴클레오티드 길이, 더 바람직하게는 50 뉴클레오티드 길이이다. Dpl의 펩티드 단편, 예를 들어 분석에 유용한 것들은 바람직하게는 적어도 10 아미노산 길이, 더 바람직하게는 적어도 30 아미노산 길이이다.

또한, 본 발명은 숙주 동물 및 유전적으로 분화한 동물로부터 유래하는 서열을 갖는 키메라 Dpl 유전자, 및 그러한 유전자를 함유하는 트랜스제닉 동물을 특징으로 한다.

본 발명의 목적은 신규한 Dpl 단백질을 코드화하는 핵산 서열 및 그것의 작용 동등물을 제공하는 것이다.

다른 목적은 Dpl을 코드화하는 핵산 서열을 발현하도록 유전적으로 조작된 셀라인을 제공하는 것이다.

다른 목적은 Dpl 단백질 또는 그것의 펩티드에 선택적으로 결합하는 항체를 제공하는 것이다.

다른 목적은 화합물 또는 화합물의 라이브러리가 Dpl 뉴클레오티드 서열에 의해 발현된 단백질의 활성을 활성화하거나 또는 차단하는 그것들의 능력에 대해 분석될 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 이점은 Dpl 활성 및/또는 발현을 증가시키는 돌연변이가 프리온 감염을 가속하고, 그로 인해 동물 분석, 예를 들어 트랜스제닉 HuPrP 마우스 분석에서 접종으로부터 더 이른 프리온 감염성의 확인을 허용하는 것이다.

본 발명의 한 양태는 (1) 인간 Dpl; (2) 인간 Dpl 및 인간 PrP; (3) Dpl 및 PrP에 대한 인간/마우스 키메라 유전자; (4) 소 Dpl; (5) 소 Dpl 및 소 PrP; (6) Dpl 및 PrP에 대한 소/마우스 키메라 유전자; (7) (1) 내지 (6) 애블레이트된 내인성 Dpl 및/또는 PrP 유전자와의 조합; (7) 양 Dpl; (8) 염소 Dpl; (9) 고라니 Dpl; 및 (10) 사슴 Dpl을 발현하는 트랜스제닉 마우스이다. 본 발명에 사용될 수 있는 트랜스제닉 마우스가 1996, 10, 15일자로 발행된 미국 특허 5,565,186, 1998, 6, 9일자로 발행된 5,763,740, 1998, 8, 4일자로 발행된 5,789,655, 및 1998, 8, 11자로 발행된 5,792,901에 설명되어 있으며, 이것들은 참고자료로서 본원에 포함된다.

이것들과 본 발명의 다른 목적, 이점 및 특징이 명세서의 숙독시 당업자들에게 명백할 것이다.

(바람직한 구체예의 상세한 설명)

본 DNA 분자, 단백질, 및 사용 방법을 설명하기 전에, 본 발명이 물론 다양할 수 있는 설명된 특정 분자에 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 구체예를 설명하는 것이 목적이며, 본 발명의 범위가 단지 첨부된 청구항에 의해서만 한정될 것이므로, 한정하는 것으로 의되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.

달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 당업자에 의해 통상 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에 설명된 것들과 유사하거나 또는 동등한 어떤 방법 및 물질이 본 발명의 실행 및 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 이제 설명된다. 본원에 언급된 모든 공보는 인용된 공보와 관련된 방법 및/또는 물질을 개시 및 설명하기 위해 참고자료로서 본원에 포함된다.

본원에 논의된 공보는 본 출원의 제출일 전의 그것들의 명세서에 대해서만 제공된다. 본원의 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의하여 그러한 공보를 선행하기 위한 권리가 주어지지 않는다는 승인으로서 구성되어서는 않된다. 더욱이, 제공된 공보의 일자는 실제의 공보 일자와 다를 수 있으며, 이것은 각각 확인될 필요가 있을 수 있다.

(정의)

본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산"은 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드및 그것들의 단편 또는 부분, 뿐만 아니라 그것들의 펩티드 핵산(PNA), 단편, 부분 또는 안티센스 분자, 및 단일 또는 이중 스트랜드일 수 있으며 센스 또는 안티센스 스트랜드를 나타낼 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA와 관련있다. "핵산"은 특이적 핵산 서열(예를 들어, Dpl 폴리펩티드-코드화 핵산)과 관련하여 사용되며, "핵산"은 기재된 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드, 예를 들어 축퇴성 변이체인 핵산 또는 기재된 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 단편을 코드화하는 핵산을 코드화하는 핵산을 포함한다는 의미이다. 유사하게, 본원에 사용된 바와 같은 "폴리펩티드"는 올리고뉴클레오티드, 펩티드 또는 단백질과 관련있다. "폴리펩티드"는 자연 발생적 단백질 분자의 아미노산 서열과 관련하여 본원에 기재되며, "폴리펩티드" 및 유사한 용어는 기재된 단백질 분자에 관련된 완전한 자생 아미노산 서열로 아미노산 서열을 한정한다는 의미는 아니다.

"안티센스 핵산"은 주어진 핵산 서열의 전사 또는 번역에 관련된 핵산 서열(예를 들어, Dpl 폴리펩티드를 코드화하는 핵산의 프로모터)을 포함하는 주어진 핵산 서열(예를 들어, Dpl 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열)에 상보하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 의미하며, 안티센스 핵산은 Dpl 폴리펩티드-코드화 핵산 서열에 혼성화할 수 있다. 특히 관심있는 것은 시험관내 또는 생체내에서 Dpl-코드화 핵산의 전사 및/또는 스플라이싱 및/또는 번역을 억제할 수 있는 안티센스 핵산이다.

본원에 사용된 바와 같은 "펩티드 헥산"은 리신과 같은 아미노산 잔기 및 아미노기가 첨가되어 있는 올리고머를 포함하는 분자와 관련있다. 또한 항-유전자 제제를 나타내는 이들 작은 분자는 핵산에 대한 그것들의 상보성(템플레이트) 스트랜드에 결합함에 의해 전사체 신장을 정지시킨다[Nielsen et al.,Anticancer Dr ug. Des8:53-63(1993)].

"폴리펩티드"는 길이 또는 번역-후 변형(예를 들어, 글리코실화)와는 무관한 아미노산의 어떤 사슬을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 "Dpl 폴리펩티드"는 i) 자생 Dpl 폴리펩티드, ii) Dpl 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편, iii) Dpl 폴리펩티드의 생물학적 활성 폴리펩티드 유사체, 또는 iv) Dpl 폴리펩티드의 생물학적 활성 변이체의 아미노산 서열을 갖는 재조합 또는 비재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련있다. 본 발명의 Dpl 폴리펩티드는 천연, 합성, 반합성 또는 재조합의 어떤 공급원으로부터의 어떤 종, 예를 들어 포유류 또는 비-포유류(예를 들어, 파충류, 양서류, 조류(예를 들어, 닭)), 특히 인간, 설치류(예를 들어, 뮤린 또는 래트), 소, 양, 돼지, 뮤린 또는 말을 포함하는 포유류, 바람직하게는 래트 또는 인간으로부터 얻어질 수 있다. "인간 Dpl 폴리펩티드"는 인간으로부터 얻어진 분리된 인간 Dpl 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련있으며, 기재된 단백질 분자와 관련된 완전한 자생 아미노산 서열로 아미노산 서열을 한정한다는 의미는 아니다.

본원에 사용된 바와 같은 "항원성 아미노산 서열"은 단독으로 또는 담체 분자와 관련하여 포유류에서 항체 반응을 유도할 수 있는 아미노산 서열을 의미한다.

인간 Dpl 폴리펩티드의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산에 의해 변경된 아미노산 서열로서 정의된다. 변이체는 치환된 아미노산이 유사한 구조적 또는 화학적 성질을 갖는, 예를 들어 루이신을 이소루이신으로 대체하는 "보존성" 변화를 가질 수 있다. 더욱 드물게는, 변이체는 예를 들어 글리신을 트립토판으로 대체하는 "비보존성" 변화를 가질 수 있다. 또한, 유사한 부차적 변이는 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 둘다를 포함할 수 있다. 생물학적 또는 면역학적 활성을 없애지 않고, 어느 그리고 얼마나 많은 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지 측정하는 가이던스는 본 분야에 잘 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 DNAStar 소프트웨어를 사용하는 것임을 알 수 있다.

"결실"은 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기가 자연 발생적 Dpl 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 비교하여 각각 결여되어 있는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서의 변화로서 정의된다.

"삽입" 또는 "추가"는 자연 발생적 Dpl 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 비교하여 각각 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기의 추가를 가져오는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서의 변화이다.

"치환"은 자연 발생적 Dpl 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 비교하여 각각 상이한 아미노산 또는 뉴클레오티드에 의한 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 대체에 기인한다.

용어 "생물학적 활성"은 자연 발생적 Dpl 폴리펩티드의 구조적, 조절 또는 생화학적 작용을 갖는 인간 Dpl 폴리펩티드와 관련있다. 마찬가지로, 또한 "면역학적 활성"은 적절한 동물 또는 세포에서 특이적 면역 반응을 유도하고 특이적 항체와 결합하기 위한 자연적, 재조합 또는 합성 인간 Dpl 폴리펩티드, 또는 그것의 어떤 올리고펩티드의 능력으로 정의한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "유도체"는 인간 Dpl 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 또는 코드화된 인간 Dpl 폴리펩티드의 화학적 변형과 관련있다. 그러한 변형의 실례는 알킬, 아실 또는 아미노기에 의한 수소의 대체이다. 핵산 유도체는 천연 Dpl 폴리펩티드의 본질적인 생물학적 특징을 보유하는 폴리펩티드를 코드화한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "분리된"은 화합물이 자연적으로 생기는 환경과는 다른 환경에 있는 관심의 화합물(예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드)을 설명한다. "분리된"은 관심의 화합물에 대해 실질적으로 부화된 및/또는 또는 관심의 화합물이 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 샘플내에 있는 화합물을 포함한다는 의미이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 정제된"은 화합물의 자연적인 환경으로부터 이전되고, 자연적으로 관련된 다른 성분이 적어도 60%, 바람직하게는 75%, 가장 바람직하게는 90% 없는 화합물(예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드)와 관련있다.

"긴축도"는 전형적으로 약 Tm-5℃(프로브의 Tm 보다 5℃ 아래) 내지 Tm 보다 약 20℃에서 25℃ 아래의 범위에서 생긴다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 혼성화 긴축도는 동일한 핵산 서열을 확인 또는 검출하기 위해, 또는 유사하거나 관련된 핵산 서열을 확인 또는 검출하기 위해 조작될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "혼성화"는 "그 과정에 의해 핵산의 스트랜드가 염기쌍을 통해 상보성 스트랜드와 결합하는 어떤 과정"을 포함해야 한다[Coomb s,Dictionary of Biotechnology,Stockton Press, New York NY(1994)]. 중합 사슬 반응 기법에서 수행되는 바와 같은 증폭이 Dieffenbach et al.,PCR Primer, a Lab oratory Manual,Cold Spring Harbor Press, Plainview NY(1995)에 설명되어 있다.

"형질전환"은 새로운 DNA(즉, 세포에서 외인성 DNA)의 결합 후 세포에서 유도된 영구적인 또는 일시적인 유전적 변화, 바람직하게는 영구적인 유전적 변화를 의미한다. 유전적 변화는 새로운 DNA와 숙주 세포의 게놈의 결합에 의해, 또는 에피솜 요소로서 새로운 DNA의 일시적이거나 또는 안정한 보존에 의해 달성될 수 있다. 세포는 포유류 세포이며, 영구적인 유전적 변화는 일반적으로 세포의 게놈으로의 DNA의 도입에 의해 달성된다.

"구성물"은 재조합 핵산, 일반적으로 재조합 DNA를 의미하며, 특이적 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 위하여 생성되거나, 또는 다른 재조합 뉴클레오티드 서열의 구성에 사용될 수 있다.

"작동가능하게 연결된"은 DNA 서열 및 조절 서열(들)이 적합한 분자(예를 들어, 전사 활성인자 단백질)이 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 허락하는 방식으로 연결된다는 것을 의미한다.

"유효하게 삽입된"은 관심의 뉴클레오티드 서열이 도입된 관심의 뉴클레오티드 서열의 전사 및 번역을 지시하는 인접한 뉴클레오티드 서열에 위치된다는 것을 의미한다(즉, 예를 들어 Dpl 서열에 의해 코드화되는 폴리펩티드의 생성을 용이하게 한다).

"Dpl 관련 장애"는 변화된 Dpl 작용(예를 들어, 이상 Dpl 발현 또는 Dpl 발현 또는 Dpl 단백질에서의 결함으로 인한)에 관련된 생리학적인 상태 또는 질환을 의미한다. 그러한 Dpl 관련 장애는 이것들에 한정되는 것은 아니나 프리온-유사 장애 또는 신경독성 및/또는 신경변성을 포함하는 다른 유사한 장애를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "트랜스젠"은 포유류, 특히 살아있는 동물의 포유류 세포의 게놈에 있어 왔거나 또는 인공적으로 삽입되려고 하는 유전 물질을 설명한다.

"트랜스제닉 유기체"는 세포의 어떤 부분에 있거나, 또는 생식 계통 DNA에 안정하게 통합된 염색체외 요소로서 존재하는 비-내인성(즉, 이종성) 핵산 서열을 갖는 비-인간 유기체(예를 들어, 단세포생물(예를 들어, 이스트), 포유류, 비포유류(예를 들어, 선충류 또는 초파리))를 의미한다.

"트랜스제닉 동물"은 그것의 세포의 어떤 부분에 있는, 또는 그것의 생식 계통 DNA(대부분 또는 모든 그것의 세포의 게놈 서열에 있는)에 안정하게 통합된 염색체외 요소로서 존재하는 비-내인성(즉, 이종성) 핵산 서열을 갖는 비-인간 동물, 보통 포유류를 의미한다. 이종성 핵산은, 예를 들어 숙주 동물의 배 또는 배간세포의 유전적 조작에 의해 그러한 트랜스제닉 동물의 생식 계통에 도입된다.

표적 유전자의 "녹-아웃(knock-out)"은 표적 유전자의 작용의 감소를 가져오는, 바람직하게는 검출할 수 없거나 또는 미미한 표적 유전자 발현을 가져오는 유전자 서열의 변경을 의미한다. Dpl 유전자의 녹-아웃은 Dpl 유전자의 작용이 실질적으로 감소되고 있으며, 따라서 Dpl 발현이 검출할 수 없거나 또는 단지 미미한수준으로 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명의 "녹-아웃" 트랜스제닉은 Dpl 유전자의 이형접합 녹-아웃 또는 Dpl 유전자의 동형접합 녹-아웃을 갖는 트랜스제닉 동물일 수 있다. 또한, "녹-아웃"은 표적 유전자의 변경이, 예를 들어 동물을 표적 유전자 변경을 촉진하는 물질에 노출하거나, 표적 유전자 부위(예를 들어, Cre-lox 시스템의 Cre)에서 재조합을 촉진하는 효소를 도입하거나, 또는 출생후적으로 표적 유전자 변경을 지시하는 다른 방법에 의해 일어날 수 있는, 조건부 녹-아웃을 포함한다.

표적 유전자의 "녹-인"은, 예를 들어 표적 유전자의 추가 카피의 도입에 의하거나, 또는 표적 유전자의 내인성 카피의 증진된 발현을 제공하는 조절 서열을 유효하게 삽입함에 의한, 표적 유전자의 변경된 발현(예를 들어, 증가(변위를 포함함) 또는 감소된 발현)을 가져오는 숙주 세포 유전자의 변경을 의미한다. 본 발명의 "녹-인" 트랜스제닉은 Dpl 유전자의 이형접합 녹-인 또는 Dpl 유전자의 동형접합 녹 -인을 갖는 트랜스제닉 동물일 수 있다. 또한, "녹-인"은 조건부 녹-인을 포함한다.

용어 "PrnP^0/0" 또는 Prnp-Ab1"은 단지 1개만이 애블레이트된 것을 나타내는 o/+와는 달리, 2개의 대립유전자가 모두 애블레이트된 것을 나타내는 "^0/0"을 갖는 애블레이트된 PrP 유전자를 갖는 트랜스제닉 동물과 관련있다. 구체적으로, 관련되는 동물은 일반적으로 애블레이트된 PrP 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스, 즉 PrP 녹-아웃 마우스이다. 이 PrP 유전자가 분열되므로, 마우스 PrP 단백질은 발현되지않는다.

용어 "프리온"은 암소 및 인간을 포함하는 동물에서 질환(해면상뇌증)을 일으킨다고 공지된 감염성 입자를 의미해야 한다. 용어 "프리온"은 단어 "단백질"과 "감염"의 단축형이며, PrP 유전자에 의해 코드화되는 PrP^Sc분자에 대해서만 독점적이지 않다면, 이 입자들은 대부분 포함된다. 프리온은 박테리아, 바이러스 및 비로이드와는 전혀 다르다. 공지된 프리온은 동물을 감염시켜 양 및 염소의 신경 시스템의 전염성, 퇴행성 질환인 스크래피 뿐만 아니라 소해면상뇌증(BSE) 또는 "미친 암소" 질환 및 고양이의 고양이해면상뇌증을 일으키는 것들을 포함한다. 인간에게 영향을 미친다고 공지된 4가지 프리온 질환은 (1) kuru, (2) 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), (3) 거스만-스트라슬러-쉐인케르병(GSS) 및 (4) 치사성 가족불면증(FFI)이다. 본원에 사용된 바와 같은 프리온은 사용된 동물 - 및 특히 인간, 암소 및 다른 가축에서 모든 이들 질환 또는 이들 질환 중 어떤 것, 또는 다른 질환을 일으키는 모든 형태의 프리온을 포함한다.

본원에서 용어 "PrP 유전자" 및 "PrnP 유전자"는 교환가능하게 사용되며, 단백질을 발현하는 유전 물질(예를 들어, 1996, 10, 15일자로 발행된 미국 특허 5,56 5,186의 도 3에서 도 5에 나타낸 것들), 및 "병원성 돌연변이 및 다형성"의 부제하에 본원에 기재된 것들과 같은 다형성 및 돌연변이를 설명한다. PrP 유전자는 본원에 설명된 "숙주" 및 "시험" 동물, 및 어떤 그리고 모든 다형성 및 돌연변이를 포함하는 어떤 동물로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 이제부터 발견될 다른 그러한PrP 유전자를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "인공 PrP 유전자"는 용어 "키메라 PrP 유전자" 뿐만 아니라 다른 재조합적으로 구성된 유전자를 포함하며, 이것은 숙주 동물의 게놈에 포함되었을 때 포유류를 자연적으로는 단지 유전적으로 분화한 시험 동물, 예를 들어 인간, 소 또는 양만을 감염시키는 프리온에 감염되기 쉽게 만들 것이다. 일반적으로, 인공 유전자는 다른 코돈 - 바람직하게는 유전적으로 분화한 포유류(인간과 같은)의 상응하는 코돈으로 대체되는 천연 서열의 하나 이상(전부는 아니며, 일반적으로 40 미만)의 코돈으로 유전적으로 변경되는 포유류의 PrP 유전자의 코돈 서열을 포함할 것이다. 분석에 사용되는 유전적으로 변경된 포유류는 유전적으로 분화한 포유류만을 감염시키는 프리온에 대해 샘플링된다. 인공 유전자의 예는, 같은 위치에 마우스 코돈을 대신하는 인간, 암소 및 양에 대한 도면에 나타낸 코돈으로부터 선택된 하나 이상의 상이한 대체 코돈을 가지지만, 단 마우스 코돈 전부가 상이한 인간, 암소 또는 양 코돈으로 대체되는 것은 아닌, 미국 특허 5,565,186의 도 3, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같은 서열을 코드화하는 마우스 PrP 유전자이다. 본 발명의 인공 PrP 유전자는 유전적으로 분화한 동물의 코돈 뿐만 아니라, CJD와 같은 유전적 프리온 질환에 관련된 코돈 및 코돈 서열, 그리고 어떤 자생 PrP 유전자와도 관련되지 않지만 그것이 동물에 삽입되었을 때 동물을 자연적으로는 유전적으로 분화한 동물만을 감염시키는 프리온에 감염되기 쉽게 만드는 코돈 및 서열을 포함할 수 있다.

본원에서 용어 "키메라 유전자", "키메라 PrP 유전자" 등은 교환가능하게 사용되며, 인간, 암소 또는 양과 같은 유전적으로 분화한 시험 동물로부터의 상응하는 코돈으로 대체되는 하나 이상의 코돈을 갖는 쥐와 같은 숙주 동물의 코돈을 함유하는 인공적으로 구성된 유전자를 의미한다. 한 특정한 예에서, 키메라 유전자는 숙주 종(예를 들어, 쥐)의 포유류의 PrP 유전자의 출발 및 종결 서열(즉, N- 및 C-말단 코돈)로 이루어지며, 또한 2차 종(예를 들어, 인간)의 시험 동물의 PrP 유전자 중 상응하는 부분의 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 키메라 유전자는 숙주 종의 포유류의 게놈에 삽입되었을 때 이 포유류를 자연적으로는 2차 종의 포유류만을 감염시키는 프리온에 감염되기 쉽게 만들 것이다. 본원에 개시된 바람직한 키메라 유전자는 마우스 PrP 유전자의 출발 및 종결 서열, 및 9개의 잔기가 다른 단백질이 발현되는 방식으로 마우스 PrP 유전자와는 다른 상응하는 인간 서열로 대체되는 비-종결 서열 영역을 함유하는 MHu2M이다.

용어 "숙주 동물" 및 "숙주 포유류"는 동물내에 자연적으로는 존재하지 않는 유전 물질을 포함시키기 위해서 유전적으로 및 인공적으로 조작된 게놈을 가지는 동물을 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, 숙주 동물은 본 발명의 인공 유전자의 삽입에 의해, 또는 유전적으로 분화한 시험 동물의 자생 PrP 유전자의 삽입에 의해 변경된 내인성 PrP 유전자를 갖는 마우스, 햄스터 및 래트를 포함한다.

용어 "숙주 동물" 및 "숙주 포유류"는 동물내에 자연적으로 존재하지 않는 유전 물질을 포함시키기 위해서 유전적으로 및 인공적으로 조작된 게놈을 가지는 동물을 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, 숙주 동물을 변경된 내인성 Dpl 유전자를 갖는 마우스, 햄스터 및 래트를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 이들 숙주동물은 또한 인공 유전자의 삽입에 의해, 또는 유전적으로 분화한 시험 동물의 자생 PrP 유전자의 삽입에 의해 변경된 PrP 유전자를 갖는다.

용어 "시험 동물" 및 "시험 포유류"는 숙주 동물의 PrP 유전자와 시험 동물의 PrP 유전자 사이의 차이의 점에서 숙주 동물과는 유전적으로 분화한 동물을 설명하기 위해 본원에 사용된다. 시험 동물은 어떤 동물일 수 있으며, 이것에 대해 주어진 샘플이 시험 동물이 일반적으로 감염되기 쉬운 프리온을 함유하는지의 여부를 측정하기 위한 분석 시험을 행하여야 한다. 예를 들어, 시험 동물은 인간, 암소, 양, 돼지, 말, 고양이, 개, 칠면조 또는 닭일 수 있으며, 이것은 특정한 샘플이 정상적으로는 시험 동물만을 감염시키는 프리온을 포함하는지의 여부가 측정될 수 있다. 이것은 숙주 동물안에 시험 동물의 PrP 유전자 서열을 포함시키고, 정상적으로는 시험 동물만을 감염시키는 프리온으로 숙주 동물을 접종함에 의해 행해진다.

용어 "유전적으로 분화한 동물" 및 "유전적으로 분화한 포유류"는 17 이상의 코돈, 바람직하게는 20 이상의 코돈, 가장 바람직하게는 28 내지 40 코돈 까지의 유전적으로 분화한 시험 동물과는 다른 숙주 동물의 자생 PrP 코돈 서열을 포함하는 동물을 설명하기 위해 사용된다. 따라서, 마우스 PrP 유전자는 인간, 암소 또는 양의 PrP 유전자와 관련해서는 유전적으로 다른 종류지만, 햄스터의 PrP 유전자와 관련해서는 유전적으로 다른 종류가 아니다.

본원에서 용어 "애블레이트된 PrP 유전자", "분열된 PrP 유전자" 등은 교환가능하게 사용되며, 유전자를 효력 없게 만들기 위해서 어떤 방식으로 변경(예를들어, 뉴클레오티드의 첨가 및/또는 제거)된 내인성 PrP 유전자를 의미한다. 비-작용성 PrP 유전자의 예 및 그것의 제조 방법이 본원에 참고자료로 포함되는 Bueler et al.,Nature356:577-582(1992)에 설명되어 있다. 바람직하게는 유전자의 2개 대립유전자가 모두 분열된다.

본원에서 용어 "애블레이트된 Dpl 유전자", "분열된 Dpl 유전자" 등은 교환가능하게 사용되며, 유전자를 효력 없게 만들기 위해서 어떤 방식으로 변경(예를 들어, 뉴클레오티드의 첨가 및/또는 제거)된 내인성 Dpl 유전자를 의미한다.

본원에서 용어 "혼성체 동물", "트랜스제닉 혼성체 동물" 등은 교환가능하게 사용되며, 변경된 Dpl 활성을 갖는 제 1 동물과 (1) 애블레이트된 내인성 PrP 유전자, (2) 키메라 또는 인공 PrP 유전자 및/또는 (3) 유전적으로 분화한 동물로부터의 PrP 유전자를 포함하는 제 2 동물의 이종-교배로부터 얻어진 동물을 의미한다. 예를 들어, 혼성체 마우스는 Dpl 트랜스젠 녹-인을 갖는 마우스를 (1) 소 PrP 유전자(높은 카피수로 존재할 수 있는)를 단독으로, 또는 (2) 키메라 PrP 유전자를 함께 함유하는 마우스와 이종-교배시킴으로써 얻어진다. 다른 예에서, 혼성체 마우스는 조절되지 않는 Dpl 활성을 갖는 PrP^0/0마우스와 유도성 외인성 인간 PrP 유전자를 갖는 마우스를 이종-교배시킴으로써 얻어질 수 있다. 용어 혼성체는, 만약 결과의 자손이 유전적으로 분화한 종만을 정상 감염시키는 프리온으로 감염되기 쉽고 그 감염의 증상이 약 350일 미만, 바람직하게는 250일 미만에서 관찰가능하다면, 2가지 혼성체의 동계교배 자손을 포함하는 혼성체의 어떤 자손을 포함한다.

용어 "잠복기간"은 프리온으로 동물을 접종하는 것에서부터 동물에게서 최초로 감염에 기인하는 질환의 검출가능한 증상이 발생된 때까지의 시간을 의미해야 한다. 감소된 잠복기간은 바람직하게는 약 200일±50일 미만, 더 바람직하게는 약 50일±20일 미만이다.

용어 "항체"는 항원을 결합시킬 수 있는 면역글로불린 단백질을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 항체는 전체 항체 및 에피토프, 항원 또는 관심의 항원 단편을 결합시킬 수 있는 어떤 항체 단편(예를 들어, F(ab')₂, Fab', Fab, Fv)을 포함한다는 의미이다.

본 발명의 항체는 면역반응성 또는 면역특이적이며, 따라서 Dpl 단백질에 특이적으로 그리고 선택적으로 결합한다. Dpl에 대한 항체는 바람직하게는 면역특이적이다 - 즉, 관련 물질과는 실질적으로 교차-반응하지 않는다. 용어 "항체"는 모든 종류의 항체(예를 들어, 단일항체)를 포함하지만, 본 발명의 항체는 바람직하게는 본원에 설명된 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성된다. 본 발명의 바람직한 항체는 정제된 항체이다. 정제된 항체는 그것에 자연적으로 관련된 다른 단백질, 탄수화물 및 지질이 충분히 없는 항체를 의미한다. 그러한 항체는 Dpl 단백질(또는 그것의 항원 단편)에 "우선적으로 결합"한다. 즉, 다른 항원적으로 관련되지 않은 분자를 실질적으로 인지하여 결합하지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 "특이적으로 활성화한다"는 본원에 설명된 바와 같은 Dpl-매개된 생물학적 사건을 개시하도록 Dpl 또는 그것의 단편 또는 유사체를활성화하지만, 샘플, 예를 들어 생물학적 샘플에 있는 다른 분자는 실질적으로 결합시키지 않는 제제를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 "특이적으로 억제한다"는 Dpl 또는 그것의 폴리펩티드, 단편 또는 유사체의 활성화를 억제하는 제제를 의미한다. 바람직하게, 이 제제는 그것이 결합한 단백질의 생체내 또는 시험관내에서의 생물학적 활성을 활성화하거나 또는 억제한다.

"실질적인 증가"는 대조군 분석에 비하여 활성에 있어 대조군 수준(대조군 분석은 활성인자의 부재하에 수행된다)에 비하여 적어도 대략 2-배 증가, 바람직하게는 적어도 대략 5-배 증가, 더 바람직하게는 적어도 대략 10-배 증가를 특징으로 하는 활성 또는 다른 측정가능한 표현형의 증가를 의미한다.

"실질적인 감소" 또는 "실질적인 축소"는 대조군 수준의 대략 80%, 바람직하게는 대조군 수준의 대략 50%까지 감소되거나, 또는 더 바람직하게는 대조군 수준의 대략 10% 미만까지 감소되는 것을 특징으로 하는 활성 또는 다른 측정가능한 표현형의 감소 또는 축소를 의미한다.

용어 "스크리닝 방법" 및 "분석 방법"은 1) Dpl 활성 및/또는 2) 프리온 감염 잠복기간의 활성인자 또는 억제인자로서 작용하는 능력에 대해 후보 화합물을 스크리닝하는 방법을 설명하기 위해 사용된다.

본원에 사용되는 용어 "치료", "치료하는", "치료하다" 등은 일반적으로 원하는 제약학적 및/또는 생물학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 이 효과는 질환 또는 그것의 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지함에 의한 예방, 및/또는 질환 및/또는질환에 기인하는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유에 의한 치료일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "치료"는 포유류, 특히 인간에서 질환의 어떤 치료를 커버하며,

(a) 질환 또는 증상에 걸리기 쉽지만 아직 그것을 가지는 것으로 진단되지 않은 환자에게서 질환 또는 증상의 발생을 방지하는 것;

(b) 질환 증상의 억제, 즉 그것의 발생에 주의를 기울이는 것; 또는

(c) 질환 증상의 경감, 즉 질환을 퇴행시키는 것

을 포함한다.

(본 발명의 일반적 양태)

본원에 설명된 것은 신규한 모든 공지된 프리온 단백질(PrP)에 ~25%의 동일성을 갖는 Dpl(Dpl)로 나타낸 179 잔기 단백질이다. PrP-유사 유전자를 확인하기 위한 데이타베이스의 검색이 정보를 제공하는데 실패하고 혼성화 연구가 그러한 노력안에서 결과가 좋지 않았기 때문에(Westaway et al.,Nucleic Acids Res.14:203 5-2044(1986)), PrP 유전자를 함유하는 큰 코스미드 클론의 서열화가 착수되었다(L ee et al.,Genome Res.8:1022-1037(1998)). 대부분의 관련 기능의 척추동물 유전자는 무리에 배치되지 않고, 일부의 관련 유전자만 배치된다. 인간, 양 및 마우스 PrP 유전자를 둘러싸는 영역의 연구에서, 추가의 오픈 리딩 프레임(ORF)은 확인되지 않았다. 단지, Prnp^b/b(ILN/J) 마우스로부터 분리된 코스미드 클론의 서열화가 확장되었을 때의 PrP의 하류만이 발견된 신규 ORF였다.

"Prnd"로 명명된 Dpl 유전자좌는 PrP 유전자Prnp의 16Kb 하류이며, 1.7 및 2.7Kb의 주요한 2개 전사체 뿐만 아니라Prnp와의 유전자간 스플라이싱에 의해 생성된 어떤 예외적인 키메라 전사체를 생성한다. 또한, PrP와 Dpl 사이의 폴리시스트론 mRNA가 확인되었다. 유사 PrP인 Dpl mRNA는 PrP와는 달리 배발생 동안 발현되며, CNS에서는 낮은 수준으로 발현되지만 고환에서는 높은 수준으로 발현된다. Dpl은 후발성 운동실조 및 Purkinje 세포 변성을 발생시키는 2개 Prnp^0/0계통의 CSN에서 조절되지 않지만, 운동실조를 발생시키지 않는 Prnp^0/0계통에서는 아니다. Dpl은 어떤 계통의 Prnp^0/0마우스가 왜 신경변성을 발생시키는지를 설명하는 신경독성일 수 있다. 또한, Dpl는 다른 비 신경 세포 종류에서도 독성일 수 있다.

더욱이, Dpl과 PrP 사이의 실질적인 상동성은 이들 2가지 단백질이 어떤 생물학적 성질을 공유하며, 이로써 Dpl이 프리온 생물학을 이해하기 위한 새로운 요소를 포함할 수 있음을 시사한다. PrP-유사 유전자의 제 1 후보로서Prnd를 확인함에 의하여, 우리는 Prn 유전자 패밀리를 정의하기 시작했다. 흥미롭게도, 유사한 어떤 돌연변이 및 외래 PrP인 Dpl의 과발현이 마우스의 CNS에서 신경변성을 생성한다. 이에 더하여, Dpl 및 PrP는 공통 리셉터 단백질에 대한 리간드로서 경쟁함에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용할 수 있다. 본원에 설명된 발명은 이들 가설을 시험하기 위한 수단을 제공한다.

Dpl 핵산

용어 "Dpl 유전자" 및 "Prnp"는 일반적으로 Dpl의 코딩 영역을 나타내기 위해 사용된다. 또한, "Dpl 유전자" 및 "Prnp"는 특이적 Dpl 폴리펩티드, 인트론, 및 전사된 영역의 범위를 넘어서 약 1kb까지 그러나 어느 한쪽 방향에서는 더 가능한 발현의 조절에 관여되는 5' 및 3' 비-코딩 뉴클레오티드 서열을 코드화하는 오픈 리딩 프레임을 의미하도록 의도된다. Dpl을 코드화하는 DNA 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA, 또는 그것의 단편일 수 있다. 이 유전자는 염색체외 보존 또는 숙주로의 통합을 위해 적합한 벡터안에 도입된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "cDNA"는 자생의 성숙한 mRNA 종에서 발견된 서열 요소의 배열을 공유하는 모든 핵산을 포함하도록 의도되며, 여기에서 서열 요소는 엑손(예를 들어, 코드화된 폴리펩티드의 오픈 리딩 프레임을 코드화하는 서열), 및 3' 및 5' 비-코딩 영역이다. 정상적으로, mRNA 종은 Dpl 폴리펩티드를 코드화하는 연속하는 오픈 리딩 프레임을 만들기 위한 핵 RNA 스플라이싱에 의해 개재 인트론이 제거된 연속하는 엑손을 갖는다.

다른 공급원의 다른 게놈 Dpl 서열이 비-연속하는 오픈 리딩 프레임(예를 들어, 인트론이 단백질 코딩 영역을 가로막고 있는)을 갖는 반면, 인간 게놈 Dpl 서열은 코딩 서열을 가로막고 있는 인트론을 갖지 않는다. 관심의 게놈 서열은 자생 염색체에 정상적으로 존재하는 모든 인트론을 포함하는 기재된 서열에 정의된 바와 같은 개시 코돈과 정지 코돈 사이에 존재하는 핵산을 포함한다. 그것은 성숙한 mRN A에서 발견된 3' 및 5' 미번역 영역을 더 포함할 수 있다. 그것은 미번역 영역의 5' 및 3' 단부에 약 1kb 그러나 가능한 그 이상의 측면 게놈 DNA를 포함하는, 프로모터, 인핸서 등과 같은, 특이적 전사 및 번역 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 이게놈 DNA는 100kbp 또는 더 작은 단편, 및 실질적으로 측면 염색체 서열이 없는 단편으로서 분리될 수 있다.

이런 5' 영역의 서열, 및 추가의 5' 상류 서열 및 3' 하류 서열은 Dpl이 발현되는 조직에서의 발현을 제공하는 인핸서 결합 부위를 포함하는 프로모터 요소로 이용될 수 있다. 본 발명의 Dpl 프로모터 요소의 서열은 어떤 종(예를 들어, 포유류 또는 비-포유류(예를 들어, 파충류, 양서류, 조류(예를 들어, 닭)), 특히 인간, 설치류(예를 들어, 뮤린 또는 래트), 소, 양, 돼지, 뮤린 또는 말을 포함하는 포유류, 바람직하게는 래트 또는 인간)의 뉴클레오티드 서열에 기초할 수 있고, 천연, 합성, 반합성 또는 재조합의 어떤 공급원으로부터 분리 또는 생성될 수 있다.

Dpl의 조직 특이적 발현은 발현의 패턴을 측정하고, 발현의 자생 패턴을 모방하는 프로모터를 제공하는데 유용하다. 프로모터 영역의 자연 발생적 다형성은 발현의 자연적 변이, 특히 질환에 관련될 수 있는 것들을 측정하는데 유용하다. 또는 달리, 실험적으로 정의된 시스템에서 발현을 변경하는 효과를 측정하기 위해 돌연변이가 프로모터 영역안에 도입될 수 있다. 전사 인자의 결합에 관여되는 특이적 DNA 모티프의 확인 방법이 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 공지된 결합 모티프에서 서열 유사성, 겔 지연 연구 등이다. 예를 들어, Blackwell et al.,Mol Med1:194-205(1995); Mortlock et al.,Genome Res.6:327-33(1996); 및 Joulin et al.,Eur J Biochem232:620-626(1995) 참조.

한 구체예에서, 프로모터는 Dpl 발현을 조절하는데 사용된다. 아래 설명된 바와 같이, Dpl은 배 심장 조직 및 성인 뇌의 뉴런의 부속조에서 발현된다. 따라서, Dpl 프로모터에 의해 지시된 발생의 시기가 지정된 발현이 Dpl 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 유전자의 발현을 용이하게 하기 위해 활용될 수 있다. Dpl 프로모터로부터 발현될 수 있는 관심의 유전자의 예는, 이것들에 한정되는 것은 아니지만, 마아커 유전자(예를 들어, Dpl을 발현하는 신경 세포를 마킹하기 위한) 및 리포터 유전자(예를 들어, 루시페라제, CAT 등)을 포함한다. 그러한 마아커 및 리셉터 유전자는 Dpl의 정상적 생리학적 기능의 해명, Dpl을 조절하는 메카니즘의 확인, 및/또는 Dpl발현을 조절하는 생물활성 제제(예를 들어, 제약학적 제제의 후보)에 대한 연구 등을 돕기 위해 사용될 수 있다.

조절 서열은 특히 상이한 발생의 조직 또는 단계에서, Dpl 발현의 전사 또는 번역 조절에 필요한 시스 작용 서열을 확인하고, Dpl 발현을 조절 또는 매개하는 시스 작용 서열 및 트랜스 작용 인자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 전사 또는 번역 제어 영역은, 배양된 세포에 있거나 또는 배, 태아 또는 성인 조직에 있는 야생형 또는 변경된 Dpl, 또는 관심의 다른 단백질의 발현을 촉진하기 위해서, 그리고 유전자 요법을 위해서 Dpl 유전자 또는 다른 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 또는, Dpl 전자 또는 번역 제어 영역은 Dpl 프로모터 활성을 조절하고, 이로써 Dpl 발현을 조절하는 세포외 신화 분자를 확인하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 사용된 핵산 조성물은 모든 Dpl 폴리펩티드 또는 그것의 부분을 적절하게 코드화할 수 있다. Dpl 서열은 질환 상태에 관련된 Dpl의 형태 및/또는 단백질의 자연 발생적 변이체로 지정될 수 있다. 단편이 종래의 방법에 따라서 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성함에 의해, 제한 효소 소화, PCR 증폭 등에 의해 DNA 서열로부터 얻어질 수 있다. 주로 DNA 단편은 적어도 10 연속 뉴클레오티드, 보통 적어도 약 15 nt, 더 보통은 적어도 약 18 nt 내지 20 nt, 더 보통은 적어도 약 25 nt 내지 약 50 nt로부터 얻어질 것이다. 그러한 작은 DNA 단편은 혼성화 스크리닝, PCR 등을 위한 프라이머로서 유용하다. 더 큰 DNA 단편, 즉 100 nt 이상의 것은 코드화된 폴리펩티드의 제조에 유용하다. PCR과 같은 증폭 반응에 사용하기 위해서는 한쌍의 프라이머가 사용될 것이다. 프라이머 서열의 정확한 조성은 본 발명에서 중요하지 않지만, 대부분의 적용에 있어 프라이머는 본 분야에 공지된 바와 같은 긴축 조건하에서 해당 서열에 혼성화할 것이다. 적어도 약 50 nt, 바람직하게는 적어도 약 100 nt의 증폭 생성물을 생성할 한쌍의 프라이머를 선택하는 것이 바람직하다. 프라이머 서열의 선택을 위한 알고리듬은 일반적으로 공지되어 있으며, 상업적 소프트웨어 패키지로 입수가능하다. 증폭 프라이머는 DNA의 상보성 스트랜드에 혼성화하며, 서로에 대하여 가장 중요할 것이다.

Dpl 유전자는 분리되어, 일반적으로 손상되지 않은 포유류 염색체와는 다른 바, 실질적인 순도로 얻어진다. 보통, DNA는 일반적으로 적어도 약 50%, 보통 적어도 약 90% 순도로, Dpl 서열 또는 그것의 단편을 포함하지 않는 다른 핵산 서열이 실질적으로 없는 상태로 얻어질 것이며, 전형적으로는 자연 발생적 염색체상에서 정상적으로는 DNA와 관련이 없는 하나 이상의 뉴클레오티드가 측면에 있는 "재조합"이다.

DNA 서열은 다양한 방식으로 사용된다. 그것들은 프리온-유사 단백질을 코드화하는 다른 유전자를 확인하거나, 또는 여러가지 종에서 Dpl 동족체를 확인하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 포유류 동족체는 서로에 대해 실질적인 서열 유사성, 즉 적어도 75%, 보통 적어도 90%, 더 보통은 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 서열 유사성은 보존된 모티프, 코딩 영역, 측면 영역 등과 같은 더 큰 서열의 부속조일 수 있는 기준 서열을 기초로 계산된다. 기준 서열은 보통 적어도 약 18 nt 길이, 더 보통은 적어도 약 30 nt 길이일 것이며, 비교되는 완전한 서열로 확장할 수 있다. Altschul et al.,J Mol Biol215:403-10(1990)에 설명된 BLAST와 같은, 서열 분석에 대한 알고리듬이 본 분야에 공지되어 있다.

서열 유사성을 갖는 핵산, 예를 들어 50℃ 및 6xSSC(0.9M 살린/0.09M 시트르산나트륨)와 1xSSC(0.15M 염화나트륨/0.015M 시트르산나트륨)로 55℃에서 세척될 때 결합을 유지하는 낮은 긴축 조건하에서의 혼성화에 의해 검출된다. 서열 동일성은, 예를 들어 50℃ 이상 및 0.1xSSC(15mM 살린/0.15mM 시트르산나트륨)의 높은 긴축 조건하에서의 혼성화에 의해 측정될 수 있다. 프로브를 사용함에 의하여, DNA 서열의 특정하게 표지된 프로브가 이종성 또는 관련된 유전자를 분리할 수 있다. 이종성 유전자의 공급원은 어떤 종, 예를 들어 영장류 종, 특히 인간, 래트 및 마우스와 같은 설치류, 개과, 고양이과, 소, 양, 말, 이스트,Drosophila,Caenhorab ditis등일 수 있다.

또한, Dpl-코드화 DNA는 생물학적 견본에서 유전자의 발현을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 게놈 DNA 또는 RNA인 특정한 뉴클레오티드 서열의 존재에 대해 세포를 프로브하는 방식은 문헌에 잘 수립되어 있으므로 여기에 퇴고할 필요는 없을것이다. mRNA는 세포 샘플로부터 분리된다. mRNA는 역전사효소를 사용하여 RT-PCR하여 상보성 DNA 스트랜드를 형성하고, 이어서 해당 DNA 서열에 특이적인 프라이머를 사용하는 중합효소 사슬 반응 증폭에 의해 증폭될 수 있다. 또는 달리, mRNA 샘플은 겔 전기영동에 의해 분류되고, 적합한 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스, 나일론 등으로 이전되고, 다음에 프로브로서 해당 DNA의 단편으로 프로브된다. 올리고뉴클레오티드 리게이션 분석, 원위치 혼성화, 및 고체 칩상에 정렬된 DNA 프로브에의 혼성화와 같은 다른 기법이 또한 사용될 수 있다. Dpl 서열에 혼성화한 mRNA의 검출은 샘플에서의 Dpl 유전자 발현을 암시한다.

Dpl 핵산 서열은 많은 목적을 위해 변형될 수 있으며, 특히 그것들은, 예를 들어 핵산 절단제, 예를 들어 유전자의 절단을 위해 철 또는 크롬과 같은 킬레이트 금속 이온 등에 결합됨에 의해 세포내적으로 사용될 것이다.

측면 프로모터 영역 및 코딩 영역을 포함하는 Dpl 유전자좌의 서열은 본 분야에 공지된 여러가지 방식으로 돌연변이 되어 프로모터 강도, 코드화된 단백질의 서열 등에 목표의 변화를 생성한다. 그러한 DNA의 돌연변이 서열 또는 생성물은 본원에 제공된 서열과 실질적으로 유사할 것이다. 즉, 각각 적어도 1 뉴클레오티드 또는 아미노산까지 다를 것이고, 적어도 2 그러나 약 10 미만의 뉴클레오티드 또는 아미노산까지 다를 수 있다. 서열 변화는 치환, 삽입 또는 결실이다. 결실은 도메인 또는 엑손의 결실과 같은 더 큰 변화를 추가로 포함할 수 있다. 관심의 다른 변형은, 예를 들어 FLAG 시스템, HA 등을 사용한 에피토프 태그화를 포함한다. 준세포 배치에 대한 연구에는 녹색 형광 단백질(GFP)와의 융합 단백질이 사용될 수 있다. 그러한 돌연변이 유전자는 Dpl 폴리펩티드와 다른 폴리펩티드(예를 들어, Dpl과 공동-발현되는 Nkx-6.1)의 구조-기능 관계를 연구하거나, 또는 단백질의 기능 또는 조절에 영향을 미치는 단백질의 성질을 변경시키는데 사용될 수 있다. 그러한 변형된 Dpl 서열은, 예를 들어 트랜스제닉 동물을 생성하는데 사용될 수 있다.

시험관내에서 클론된 유전자의 돌연변이를 유발하는 기법이 공지되어 있다. 돌연변이를 스캐닝하는 프로토콜의 예는 Grustin et al.,Biotechniques14:22(199 3); Barany,Gene37:111-23(1985); Colicelli et al.,Mol Gen Genet199:537-9(198 5); 및 Prentki et al.,Gene29:303-13(1984)에서 발견될 수 있다. 부위 특이적 돌연변이 유발의 방법은 Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, pp. 15.3-15.108(1989); Weiner et al.,Gene126:35-41 (1993); Say ers et al.,Biotechniques13:592-6(1992); Jones et al.,Biotechni ques12:528-30(1992); Barton et al.,Nucleic Acids Res18:7349-55(1990); Maro tti et al.,Gene Anal Tech6:67-70(1989); 및 Zhu,Anal Biochem177:120-4(1989 )에서 발견될 수 있다.

숙주 동물의 Dpl 유전자 포함 부분은 예를 들어 숙주 동물의 단부 부분이고, 유전적으로 분화한 시험 동물의 중간 부분에서 중간 부분은 질환 상태인 그러한 숙주의 그것과 일치하도록 지정된 특이적 변경을 포함한다. 더욱이, 본 발명은 유전적으로 분화한 동물로부터의 인공 유전자 또는 발현이 조절된 Dpl 유전자를 함유하는 트랜스제닉 동물, 상이한 트랜스제닉 동물과 애블레이트된 내인성 프리온 단백질 유전자를 갖는 트랜스제닉 동물의 또는 트랜스제닉 동물간의 자손인 혼성체 트랜스제닉 동물, 표준화된 프리온 제조물 및 이 제조물과 유전적으로 변경된 동물을 사용하는 샘플에서 병원성 프리온을 검출하는 분석 방법을 포함한다.

인공 유전자는 그것이 동물(마우스와 같은)의 게놈에 삽입될 때, 동물을 정상적으로는 유전적으로 분화한 동물(인간, 암소, 양, 돼지, 닭, 고양이 또는 개와 같은)인 특이적 종만을 감염시키는 프리온에 감염되기 쉽게 만드는 서열을 포함한다. 인공 Dpl 유전자는 인공 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 어떤 자생 Dpl 유전자 서열에 존재하지 않는 코돈 서열로 부분적으로 또는 완전히 이루어질 수 있다. 또는 달리, 인공 유전자는, Dpl 유전자가 20 이상의 코돈까지 숙주 동물의 Dpl 유전자와는 다르다는 것을 의미하는, 바람직하게는 유전적으로 분화한 동물로부터의 상응하는 Dpl 유전자 코돈이도록 만들어진, 하나 이상의 코돈 치환을 갖는 숙주 동물의 코돈 서열로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 증진된 프로모터 및/또는 유전적으로 분화한 동물의 높은 카피수의 천연 Dpl 유전자를 사용한 유전자의 과발현에 의해 얻어질 수 있는, 발현의 수준이 상승된 Dpl 유전자를 함유하는 트랜스제닉 동물이 또한 개시된다. 혼성체 트랜스제닉 동물은 2가지 트랜스제닉 동물간의 교배, 특히 유전적으로 분화한 동물의 전체 프리온 단백질 유전자를 함유하는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 인간 프리온 단백질 유전자를 함유하는 마우스)와 분열된 내인성 프리온 단백질 유전자를 갖는 동물(예를 들어, 애블레이트된 프리온 단백질 유전자를 갖는 마우스)간의 교배로부터 생기는 동물을 포함한다. 또한, 혼성체는 특이적으로 키메라 프리온 단백질 유전자를 갖는 트랜스제닉 동물과 애블레이트된 내인성 프리온 단백질 유전자를 갖는 동물을 교배시킨 것을 포함한다.

Dpl 트랜스제닉 동물

Dpl-코드화 핵산은 유전적으로 변형된 비-인간 동물 또는 셀라인의 부위 특이적 유전자 변형을 생성하는데 사용될 수 있다. 용어 "트랜스제닉"은 결실 또는 다른 Dpl 유전자 활성의 다른 녹-아웃, 숙주 세포에 안정하게 전이된 외인성 Dpl 유전자, 변경된 Dpl 유전자 발현을 갖는 "녹-인", 또는 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된 외인성 Dpl 프로모터를 갖는 유전적으로 변형된 동물을 포함하도록 의도된다. 특히 관심있는 것은 Dpl의 동형접합 및 이형접합 녹-아웃이다.

트랜스제닉 동물은 Dpl 유전자좌가 변경되는 상동성 재조합을 통해 만들어질 수 있다. 또는 달리, 핵산 구성물이 게놈안에 무작위적으로 통합된다. 안정한 통합을 위한 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스 및 다른 동물 바이러스, YAC 등을 포함한다. 관심의 것은 트랜스제닉 포유류, 바람직하게는 Mus(예를 들어, 마우스), Rattus(예를 들어, 래트), Oryctologus(예를 들어, 토끼) 및 Mesocricetus(예를 들어, 햄스터)로 구성된 군으로부터 선택된 속으로부터의 포유류이다. 더 바람직하게는, 동물은 결함이 있거나 또는 Dpl 유전자 발현 또는 작용에서 어떤 다른 변경을 함유하는 마우스이다.

"녹-아웃" 동물은 내인성 Dpl 작용을 실질적으로 감소시키거나 또는 제거하기 위해, 바람직하게는 표적 유전자 발현이 검출될 수 없거나 미미하도록 유전적으로 조작된다. 다른 접근법이 "녹-아웃"을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 자생 Dpl 동족체 모두 또는 일부의 염색체 결실이 유도될 수 있다. 비-코딩 영역, 특히 프로모터 영역, 3' 조절 서열, 인핸서가 결실되거나, 또는 Dpl 유전자의 발현을 활성화하는 유전자가 결실된다. 또한, 작용성 녹-아웃이 자생 Dpl 유전자의 발현을 차단하는 안티센스 구성물의 도입에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, Li et al.,Cell85:319-329(1996) 참조).

Dpl 유전자 작용의 조건부 녹-아웃이 또한 생성될 수 있다. 조건부 녹-아웃은 표적 유전자 변경을 촉진하는 물질에 동물을 노출하거나, 표적 유전자 부위(예를 들어, Cre-loxP 시스템의 Cre)에서 재조합을 촉진하는 효소를 도입하거나, 또는 표적 유전자 변경을 지시하는 다른 방법에 의하여 Dpl 유전자 기능의 결함을 나타내는 트랜스제닉 동물이다.

예를 들어, Dpl 유전자 작용의 조건부 녹-아웃을 갖는 트랜스제닉 동물이 Cr e-loxP 재조합 시스템을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, Kilby et al., Tren ds 유전자t 9:413-421(1993) 참조). Cre는 loxP로 명명된 2개 인식 서열 사이의 DNA를 절제하는 효소이다. 이 시스템은 Dpl의 조건부 녹-아웃을 만들기 위해 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 2개의 독립적인 트랜스제닉 마우스가 생성될 수 있다. 하나는 loxP 부위가 측면에 있는 Dpl 서열에 대한 트랜스제닉이고 두번째는 Cre에 대한 트랜스제닉이다. Cre 트랜스젠은 유도성 또는 발생적으로 조절된 프로모터의 제어하에 있거나(Gu et al., Cell 73:1155-1164(1993); Gu et al., Scie nce 265:103-106(1994)), 또는 조직-특이적 또는 세포 종류-특이적 프로모터(예를 들어, 뉴런-특이적 프로모터 또는 뇌조직-특이적 프로모터)의 제어하에 있을 수 있다. 다음에, Dpl 트랜스제닉은 Cre 트랜스제닉과 교배되어 발생 동안 Cre를 발현한 이들 세포에서 Dpl 유전자에 대해서만 결함이 있는 자손을 생성한다.

트랜스제닉 동물은 외인성 Dpl 유전자를 가지도록 만들어질 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 동물은 숙주 세포 게놈이, 예를 들어 표적 유전자의 추가의 카피의 도입에 의하거나 또는 표적 유전자의 내인성 카피의 증진된 발현을 제공하는 조절 서열을 유효하게 삽입함에 의한 Dpl 유전자의 변경된 발현(예를 들어, 증가된(변위를 포함함) 또는 감소된 발현)을 가져오는 변경을 함유하는 것과 같은, Dpl 유전자의 "녹-인"을 포함할 수 있다. "녹-인" 트랜스제닉은 Dpl 유전자의 이형접합 녹-인 또는 Dpl의 동형접합 녹-인을 갖는 트랜스제닉 동물일 수 있다. 또한, "녹-인"은 조건부 녹-인을 포함한다.

트랜스제닉 동물을 생성하도록 숙주 세포 게놈안에 도입된 외인성 유전자는 보통 숙주 동물과는 상이한 종으로부터 유래하거나, 또는 달리 그것의 코딩 또는 비-코딩 서열에서 변경된다. 도입된 유전자는 야생형 유전자, 자연 발생적 다형성, 또는 유전적으로 조작된 서열, 예를 들어 이미 설명된 코딩 또는 비-코팅 영역의 결실, 치환 또는 삽입을 갖는 것들일 수 있다. 도입된 서열은 Dpl 폴리펩티드를 코드화할 수 있거나, 또는 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된 Dpl 프로모터를 이용할 수 있다. 도입된 유전자는 코딩 서열인 반면, 그것은 보통 구성성 또는 유도성일 수 있는 프로모터, 및 숙주 동물의 발현에 필요한 다른 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.

관심의 특이적 구성물은 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 안티센스 Dpl 또는 Dpl 서열에 기초한 리보자임을 포함하며, 이것은 Dpl 발현 뿐만 아니라 우성 음성 Dpl 돌연변이의 발현 및 Dpl 유전자의 과발현을 차단한다.lac Z와 같은 검출가능한 마아커가 Dpl 유전자좌안에 도입될 수 있으며, 여기에서 상응하는 Ngn 유전자의 발현의 상향조절은 표현형에서 쉽게 검출되는 변화를 가져올 것이다. 리포터 유전자 또는 Dpl의 코딩 영역과 조합하여 Dpl 유전자의 프로모터 영역을 이용하는 구성물이 또한 관심 대상이다. 절단 또는 변경(예를 들어, 돌연변이된)된 Dpl을 코드화하는 서열을 갖는 구성물이 또한 관심 대상이다.

변형된 세포 또는 동물은 CNS 및 배 발생이 수반되는 Dpl 및 다른 단백질의 작용 또는 조절에 대한 연구에 유용하다. 또한, 그러한 변형된 세포 또는 동물은, 예를 들어 Dpl에 의해 영향받는 신경독성 및/또는 신경변성 과정의 작용 및 조절에 대한 연구, 및 생체내에서 유전자의 프리온 패밀리에 대한 연구에 유용하다. 따라서, 본 발명의 트랜스제닉 동물은 Dpl의 하류 표적 및 잠재적으로는 Dpl에 대한 리셉터를 확인하는데 유용하며, 이로써 Dpl의 결함에 관련된 표현형에서 어떤 역할을 할 수 있다.

또한, 동물은, 예를 들어 배 발생, 신경변성에 대한, 또는 Dpl 결함에 관련된 질환 또는 상태에 관련된 증상에 대한(예를 들어, 신경독성에 관련된 증상에 대한) 후보 약물의 효과를 측정하기 위한 작용성 연구, 약물 스크리닝 등에 사용될 수 있다. DNA 결합, 전사 조절 등에 있어 상이한 폴리펩티드-코드화 영역의 역할을 측정하기 위해, 일련의 작은 결실 및/또는 치환이 Dpl 유전자내에 만들어질 수 있다. Dpl 단백질이 정상적으로는 달리 생성되지 않는 세포에서 Dpl 단백질의 발현을 제공함에 의해(예를 들어, 변위 발현), 세포 행동의 변화를 유도할 수 있다. 또한,이들 동물은 신경변성의 메카니즘 모델, 특히 용균반 형성, 예를 들어 뇌의 PrP^Sc용균반에 관여되는 메카니즘을 탐구하는데 유용하다.

상동성 재조합을 위한 DNA 구성물은 원하는 유전적 변형을 갖는 Dpl 유전자 중 적어도 일부를 포함할 것이며, 재조합을 매개하기 위한 상동성 영역을 포함할 것이다. 편리하게는, 양성 및 음성 선택을 위한 마아커가 포함된다. 상동성 재조합을 통한 표적 유전자 변형을 갖는 세포를 생성하는 방법이 본 분야에 공지되어 있다. 포유류 세포를 트랜스펙션하는 여러가지 기법에 대해서는 Keown et al.,Metho d in Enzymology185:527-537(1990) 참조.

배간(SE)세포에 있어서, ES 셀라인이 사용될 수 있거나, 또는 배세포가 숙주, 예를 들어 마우스, 래트, 기니아피그 등으로부터 신선하게 얻어질 수 있다. 그러한 세포는 적합한 섬유아세포-공급층상에서, 또는 백혈병 억제 인자(LIF)와 같은 적합한 성장 인자의 존재하에 성장된다. ES 세포가 형질전환되었을 때, 그것들은 트랜스제닉 동물을 생성하는데 사용될 수 있다. 형절전환 후, 세포는 적합한 배지에서 공급층위에 플레이트된다. 구성물을 함유하는 세포가 선택적 배지를 사용함에 의해 검출될 수 있다. 콜로니들이 성장하기 위한 충분한 시간 후, 그것들은 채집되어 상동성 재조합의 발생 또는 구성물의 통합에 대해 분석된다. 다음에, 양성인 콜로니들은 배 조작 및 배반포 주입을 위해 사용될 수 있다. 배반포는 4 내지 6주된 인공배란 암컷으로부터 얻어진다. ES 세포는 트립신화되고, 변형된 세포가 배반포의 포배강안에 주입된다. 주입 후, 배반포는 가임신 암컷의 각 자궁각으로 되돌려보내진다. 다음에, 암컷은 출산예정일에 이르러 구성물을 갖는 돌연변이 세포에 대해 스크리닝된 결과의 새끼를 낳는다. 상이한 배반포 및 ES 세포의 표현형이 제공됨에 의하여, 키메라 자손이 쉽게 검출될 수 있다.

키메라 동물은 변형된 유전자의 존재에 대해 스크리닝된다. 변형을 갖는 키메라 동물(정상적으로는 키메라 수컷)은 야생형 동물과 교미되어 이형접합체를 생성하고, 이 이형접합체는 교미되어 동형접합체를 생성한다. 만약 유전자 변경이 발생의 어떤 시기에서 치사성을 일으킨다면, 조직 또는 기관은 동종 또는 유사 유전자형 이식편 또는 이식조직으로서 보존되거나, 또는 시험관내에서는 배양물중에 보존될 수 있다.

단일 또는 이중 유전자 애블레이트된 마우스에 있는 현성 형태학적 결함의 생성은 Dpl 및 PrP^C작용의 정확한 부여를 위한 방식을 가능하게 할 수 있다. Pu rkinje 세포 변성에서 Dpl 과발현의 역할, 또는 달리 현존PrnBAC 및 YAC 클론내에 존재하는 근접하여 연결된 유전자(We staway et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6418-6422(1994))의 역할은 이종성 프로모터 요소에 의하여 평가될 수 있다. 프리온의 감염에 대해 Dpl을 과발현하거나 또는 PrnD의 비대립유전자 또는 돌연변이 대립유전자를 숨기는, 마우스의 감수성을 시험하는 것이 흥미로울 것이다.

또한, 유전적 작용에 대한 조사는, 특히C. elegans,D. melanogaster및S. cerevisiae와 같은 생물학적으로 및 유전적으로 잘-특성화된 유기체를 사용하는 비-포유류 모델을 이용할 수 있다. 예를 들어, 선충 동족체의 Dpl 유전자 또는 Dpl유전자의 프로모터 영역에 트랜스포존(Tc1) 삽입이 만들어질 수 있다. 프리온-유사 단백질의 작용에 관여되는 생리학적 또는 생화학적 경로를 측정하기 위해서, Dpl 유전자 서열이 정의된 유전적 병소를 녹-아웃하거나 또는 보완하는데 사용될 수 있다. 인간 유전자가 하등 진핵 모델에서 돌연변이를 보완할 수 있다는 것이 잘 공지되어 있다.

Dpl 폴리펩티드의 제조

Dpl-코드화 핵산이 전-길이 Dpl 폴리펩티드 또는 그것의 단편, 특히 작용 도메인; DNA 결합 부위 등에 상응하고; 해당 폴리펩티드와 다른 단백질 또는 그것의 일부의 융합을 포함하는 단편을 합성하는데 사용될 수 있다. 발현에 있어서, 유도성 또는 구성성일 수 있는 전사 및 번역 개시 영역을 제공하는 발현 카세트가 사용될 수 있으며, 여기에서 코딩 영역은 전사 개시 영역, 및 전사 및 번역 종결 영역의 전사 제어 하에서 작동가능하게 연결된다. 발현 숙주에서 작용성인 여러가지 전사 개시 영역이 사용될 수 있다.

폴리펩티드는 발현 목적에 따라서, 종래의 방식에 따라 원핵생물 및 진핵생물에서 발현될 수 있다. 단백질의 대규모 제조에 있어,E. coli,B. subtilis,S. cerevisiae와 같은 단세포생물, 또는 척추동물, 특히 포유류와 같은 고등생물의 세포, 예를 들어 COS 7 세포가 발현 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 많은 상황에서, 포유류 세포에서 Dpl 유전자를 발현하는 것이 바람직하며, 특히 여기에서는 코드화된 폴리펩티드가 자생적 접힘 및 번역-후 변형으로부터 이득을 얻는다. 또한, 작은 펩티드는 실험실에서 합성될 수 있다.

다량의 폴리펩티드의 이용성에 있어서, 발현 숙주를 사용함에 의하여, 폴리펩티드가 종래의 방법에 따라 분리되어 정제된다. 여액이 발현 숙주로부터 제조될 수 있으며, HPLC, 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 또는 다른 정제 기법에 의해 정제된다. 정제된 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 약 80% 순도, 바람직하게는 적어도 약 90% 순도일 것이며, 100%를 포함해서 100% 순도까지일 수 있다. 순도는 다른 단백질, 뿐만 아니라 세포 파편이 없는 상태를 의미하도록 의도된다.

Dpl 폴리펩티드는 항체의 제조를 위해 사용될 수 있으며, 여기에서 짧은 단편은 특정 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체를 제공하고, 더 큰 단편 또는 전체 단백질은 폴리펩티드의 표면을 덮는 항체를 생성한다. 항체는 질환 상태에 관련된 Dp l의 형태 또는 자연 발생적 대립유전자 변이체를 포함하는, Dpl의 야생형 또는 변이체 형태에서 길러질 수 있다. 항체는, 예를 들어 세포 발현 Dpl를 사용한 면역화, 멤브레인에 삽입된 Dpl 폴리펩티드를 갖는 리포솜을 사용한 면역화에 의해, 이들 도메인에 상응하는 분리된 폴리펩티드, 또는 자생 폴리펩티드에서 길러질 수 있다.

항체는 발현된 폴리펩티드 또는 단백질이 단독으로 또는 공지의 면역원 담체, 예를 들어 KLH, 예비-S HBsAg, 다른 바이러스성 또는 진핵 단백질 등과 함께 면역원으로서 사용되는 종래의 방식에 따라 제조된다. 여러가지 보조제가 일련의 주입에 있어서 적절하게 사용될 수 있다. 단일클론 항체에 있어서, 한번 이상의 추가투여 후, 비장이 분리되고, 림프구가 세포 융합에 의해 불멸화되고, 다음에 높은친화성 항체 결합에 대해 스크리닝된다. 다음에, 원하는 항체를 생성하는 불멸화된 세포, 즉 하이브리도마가 확장될 수 있다. 더 이상의 설명은 Monoclonal Antibodie s: A Laboratory Manual, Harlow and Lane eds., Cold Spring Harbor Laboratories , Cold Spring Harbor, New York, 1988 참조. 바람직하다면, mRNA 코드화 중쇄 및 경쇄가 분리되어E. coli의 클로닝에 의해 돌연변이되고, 경쇄와 중쇄가 혼합되어 항체의 친화성을 더 증진시킬 수 있다. 생체내에서는 항체를 기르는 방법으로서 면역화 대신, 보통 시험관내에서는 친화성 숙성과 공동으로, 파지 "디스플레이" 라이브러리에 결합시키는 것을 포함한다.

다른 종에서 Dpl 대립유전자 변이체 및 동족체의 분리

다른 포유류 Dpl 유전자가 확인될 수 있고, Dpl 유전자를 사용하여 특성화된 그것들의 작용이 본 발명에 사용된다. 관심의 Dpl 유전자는 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 포유류(예를 들어, 인간, 설치류(예를 들어, 뮤린 또는 래트), 소, 고양이과, 개과 등) 및 비-포유류(예를 들어, 닭, 파충류 등)을 포함한다. 공지된 유전자 서열에 대한 미공지된 유전자의 상동성을 기초로 미공지된 유전자를 확인, 분리, 서열화 및 특성화하는 방법이 본 분야에 잘 공지되어 있다(예를 들어, Sambr ook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CSH Press 1989 참조).

약물 스크리닝

본 발명은 동물 모델, 뿐만 아니라 시험관내에서 Dpl 폴리펩티드를 사용하는 방법이 Dpl 발현에 영향을 미치거나(예를 들어, Dpl 프로모터 작용에 영향을 미침으로써), 또는 Dpl 폴리펩티드와 상호작용하는 후보 제제를 확인하는데 사용될 수있다. 관심의 제제는 Dpl 활성 및/또는 발현을 증진, 억제, 조절 또는 다르게는 영향을 미치는 것들을 포함한다. Dpl 활성 및/또는 발현을 변경시키는 제제가, 예를 들어 여러가지 퇴행성 또는 발달성 상태, 예를 들어 부적합한 신경 생성 또는 Dpl 발현, 활성 및/또는 형태의 변화에 의해 변경되는 다른 상태를 치료하거나, 또는 생체내 또는 시험관내에서 PrP^Sc의 발생을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 후보 제제는 합성 분자(예를 들어, 작은 분자 약물, 또는 다른 합성적으로 생성된 분자 또는 화합물, 뿐만 아니라 재조합적으로 생성된 유전자 생성물) 뿐만 아니라 자연 발생적 화합물(예를 들어, 폴리펩티드, 내인성 인자, 식물 추출물 등)을 포함한다.

약물 스크리닝 분석

본 발명에서 특히 관심있는 것은 Dpl 발현 및/또는 작용에 영향을 미치는 활성을 갖는 제제의 확인이다. 그러한 제제는, 예를 들어 증가된 및/또는 부적합한 신경 생성, 또는 변경된 Dpl 활성에 관련될 수 있는 다른 상태에 대한 치료의 개발을 위한 후보이다. 약물 스크리닝은 영향을 받은 세포에서의 Dpl 작용을 대체 또는 증강하는 제제를 확인한다. 반대로, Dpl 작용을 후퇴 또는 억제하는 제제는, 특히 Purkinje 세포에서 신경변성 또는 신경독성을 조절하기 위한 수단을 제공할 수 있다. 특히 관심있는 것은 인간 세포에 대해 낮은 독성을 갖는 제제에 대한 스크리닝 분석이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "제제"는 Dpl의 발현 또는 생리학적 작용을 변경하거나 또는 모방하는 능력을 갖는 어떤 분자, 예를 들어 단백질 또는 제약학적 분자이다. 일반적으로, 여러가지 농도에서 다른 반응을 얻기 위해, 복수의 분석 혼합물이 상이한 제제 농도로 시험된다. 전형적으로, 이들 농도 중 하나는 음성 대조군, 즉 0 농도 또는 검출 수준 미만으로 사용한다.

후보 제제는 많은 화학적 부류를 포함하지만, 전형적으로 그것들은 유기 분자, 바람직하게는 50 달톤 이상 및 약 2,500 달톤 미만의 분자량을 갖는 작은 유기 화합물이다. 후보 제제는 단백질과의 구조적 상호작용에 필수적인 작용기, 특히 수소 결합을 포함하며, 전형적으로는 적어도 아민, 카르보닐, 히드록실 또는 카르복실기, 바람직하게는 적어도 2개의 화학적 작용기를 포함한다. 후보 제제는 주로 하나 이상의 상기 작용기로 치환된 탄소고리 또는 헤테로고리 구조 및/또는 방향족 또는 다방향족 구조를 포함한다. 또한, 후보 제제는, 이것들에 제한되는 것은 아니지만 펩티드, 당류, 지방산, 스테로이드, 푸린, 피리미딘, 유도체, 구조적 유사체 또는 그것들의 조합을 포함하는 생체분자들 중에서도 발견된다.

후보 제제는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위한 공급원으로부터 얻어진다. 예를 들어, 임의의 올리고뉴클레오티드 및 올리고펩티드의 발현을 포함하여, 많은 수단이 광범위한 유기 화합물 및 생체분자의 임의적 및 지정된 합성에 이용가능하다. 이에 더하여, 천연 또는 합성적으로 생성된 라이브러리 및 화합물은 종래의 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 쉽게 변형되며, 조합 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있다. 공지의 제약학적 제제는 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등과 같은 지정된 또는 임의의 화학적 변형이 행해져 구조적 유사체를 생성할 수 있다.

생체내에서 후보 제제의 스크리닝

제제는 Dpl 발현 또는 작용에 영향을 미치거나, 또는 Dpl 발현 또는 작용의 변경에 관련된 바람직하지 않은 표현현(예를 들어, 증상)을 완화하는 그것의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 후보 제제의 스크리닝은 본원에 설명된 트랜스제닉 동물의 생체내에서 수행된다. 스크리닝 분석에 사용하기에 적합한 트랜스제닉 동물은 Dpl 발현의 변경을 갖는 어떤 트랜스제닉 동물을 포함하고, 예를 들어 외인성이며 안정하게 전이된 인간 Dpl 유전자 서열, 리포터 유전자(예를 들어, β-갈락토시다제, CAT, 또는 발현에 대해 쉽게 분석될 수 있는 다른 유전자)에 작동가능하게 연결된 (제거된 인간) Dpl 프로모터 서열로 이루어진 리포터 유전자, 또는 Dpl 유전자의 동형접합 또는 이형접합 녹-아웃을 갖는 트랜스제닉 동물을 포함한다. 트랜스제닉 동물은 유전적 변경에 대해 동형접합 또는 이형접합일 수 있고, 서열이 발현을 위해 동물의 게놈안에 도입되는 경우, 도입된 서열의 다수의 카피를 함유할 수 있다. 생체내에서 스크리닝 분석은 Dpl 프로모터의 활성에 영향을 미치는 제제를 확인하기 위한 것이며, Dpl 프로모터는 리포터 유전자(예를 들어, 루시페라제)에 작동가능하게 연결되고, 비-인간 숙주 동물의 게놈에 통합되거나 또는 배양된 포유류 셀라인의 게놈에 통합될 수 있다.

후보 제제는 변경된 Dpl 발현을 갖는 비-인간, 트랜스제닉 동물에 투여될 수 있으며, 후보 제제의 효과가 측정된다. 후보 제제는 원하는 결과를 달성하기 위해서, 제제의 전달에 바람직한 및/또는 적합한 어떤 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 후보 제제는 주사(예를 들어, 정맥, 근육, 피하 주사, 또는 바람직한 효과가달성될 수 있는 조직에 직접 주사), 경구, 또는 어떤 다른 바람직한 수단에 의해 투여될 수 있다. 정상적으로, 생체내에서 스크리닝은 연속적으로 변하는 양 및 농도의 후보 화합물(제제가 없는 것에서부터 동물에 성공적으로 전달될 수 있는 양의 상한에 근접하는 제제의 양까지)을 받는 다수의 동물을 포함할 것이고, 상이한 조제의 제제의 전달을 포함할 것이다. 제제는 단독으로 투여되거나, 또는 2개 이상의 조합으로 투여될 수 있으며, 특히 조합된 제제의 투여는 상승 효과를 가져올 수 있다.

트랜스제닉 동물에 있어 제제 투여의 효과는 Dpl 작용을 적절하게 평가함에 의해(예를 들어, 리포터 또는 융합 유전자의 발현을 시험함에 의해), 또는 Dpl 발현에 관련된 표현형을 평가함에 의해 모니터될 수 있다. 예를 들어, 스크리닝에 사용된 트랜스제닉 동물이 Dpl 발현의 결함(예를 들어, 유전자의 녹-아웃에 기인하는 )을 함유하는 경우, 후보 제제의 효과는 Dpl 트랜스제닉 마우스 및/또는 야생형 마우스에서 생성된 수준과 비교하여 대조군 마우스의 신경변성의 수준을 측정함에 의해(예를 들어, 치료된 마우스에서 운동실조의 수준을 평가함에 의해) 평가될 수 있다. 설치류에서 신경학상의 결함을 분석하는 방법이 본 분야에 잘 공지되어 있다. 생체내에서 스크리닝 분석이 Dpl 프로모터의 활성에 영향을 미치는 제제를 확인하기 위한 것인 경우, 비-인간 트랜스제닉 동물(또는 배양된 포유류 셀라인)은 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된 Dpl 프로모터를 포함하며, Dpl 프로모터 활성에 있어 후보 제제의 효과가, 예를 들어 Dpl 프로모터로부터의 발현(리포터 유전자의 검출을 통해) 및 변경된 Dpl 프로모터 활성과 신경 활성 및/또는 변성의 상관관계를 모니터링함에 의해 스크리닝될 수 있다. 또는 달리, 또는 이에 더하여, Dpl 프로모터 활성은 Dpl mRNA 또는 단백질 수준의 검출(정량 또는 정성)에 의해 평가될 수 있다. 후보 제제가 바람직한 방식으로 Dpl 발현 및/또는 Dpl-관련 표현형에 영향을 미치는 경우, 후보 제제는 Dpl-관련 장애 또는 PrP-관련 장애의 치료요법에 사용하기에 적합한 제제로서 확인된다.

시험관내에서 후보 제제의 스크리닝

Dpl 트랜스제닉 동물안에서 제제의 스크리닝에 더하여, 표지화 시험관내 단백질-단백질 결합 분석, 단백질-DNA 결합 분석, 전기영동도 이동 분석, 단백질 결합에 대한 면역분석 등을 포함하는, 광범위한 시험관내 분석이 본 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 다량의 Dpl 단백질을 생성함에 의해서, 단백질에 결합하여 단백질의 작용을 조절하거나 또는 모방하는 리간드 또는 기질을 확인할 수 있다. 또한, 정제된 단백질이 분자간 상호작용, 전사 조절 등을 모델링하는데 사용될 수 있는 3-차원 결정 구조의 측정에 사용될 수 있다.

스크리닝 분석은 결합분석일 수 있으며, 여기에서 하나 이상의 분자가 표지에 결합될 수 있고, 표지는 검출 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공한다. 여러가지 표지는 방사성동위원소, 형광물질, 화학발광물질, 효소, 특이적 결합 분자, 입자, 예를 들어 자기 입자 등을 포함한다. 특이적 결합 분자는 바이오틴과 스트렙트아비딘, 디곡신과 안티디곡신 등의 쌍을 포함한다. 특이적 결합 구성원에 있어서, 상보성 구성원은 공지의 과정에 따라 검출을 제공하는 분자로 정상적으로 표지된다.

다양한 다른 시약이 본원에 설명된 스크리닝 분석에 포함될 수 있다. 분석이 결합 분석인 경우, 이들은 최적의 단백질-단백질 결합, 단백질-DNA 결합을 용이하게 하고, 및/또는 비-특이적 또는 바탕 상호작용을 감소시키기 위해 사용되는 염, 중성 단백질, 예를 들어 알부민, 세제 등과 같은 시약을 포함한다. 프로테아제 억제제, 뉴클레아제 억제제, 항-미생물제 등과 같은 분석 효율을 개선하는 시약이 사용될 수 있다. 성분들의 혼합물이 필요한 결합을 제공하기 위해서 첨가된다. 인큐베이션이 어떤 적합한 온도, 전형적으로는 4 내지 40℃에서 수행된다. 인큐베이션 시간은 최적 활성에 대해 선택되지만, 신속한 고-처리량 스크리닝을 용이하게 하도록 최적화될 수도 있다. 전형적으로는 0.1 내지 1시간이 충분할 것이다.

관심의 다른 분석은 Dpl 작용을 모방하는 제제를 검출하는 것이다. 예를 들어, 후보 제제가 작용성 Dpl이 부족한 세포에 첨가되고, 작용성 분석에서 Dpl 활성을 재생성하는 능력에 대해 스크리닝된다. 특정 구체예에서, 조절되지 않는 Dpl 활성을 모방하는 제제가 프리온 장애의 잠복기간을 감소시키는 능력에 대해 스크리닝된다.

많은 포유류 유전자는 이스트 및 하등 동물의 동족체를 갖는다. 그러한 동족체의 생리학적 역할 및 생체내 또는 시험관내에서 다른 단백질과의 상호작용에 대한 연구는 생물학적 작용의 이해를 용이하게 할 수 있다. 유전적 상보관계에 기초한 모델 시스템에 더하여, 이스트가 Chien et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 88:95 78-9582(1991)에 설명된 2개의 혼성체 시스템을 통한 단백질-단백질 상호작용을 연구하는데 있어 강력한 도구로 알려져 있다. 2개 혼성체 시스템 분석은 Dpl단백질에 의한 전사 활성화를 탐구하고, Dpl과 상호작용하는 폴리펩티드를 코드화하는 cD NA를 확인하는데 있어 특히 흥미롭다. Dpl과의 결합은 특정한 표적 단백질의 작용/활성에 영향을 미치거나, 또는 그 자체가 기능적으로 조절될 수 있고, 정상 또는 특이적 질환 상태에 대한 관련성을 가질 수 있다.

확인된 후보 제제

바람직한 제약학적 활성을 갖는 화합물이 정상 Dpl 작용의 결함에 기인하거나, 또는 일부분 조절되는 상태(예를 들어, 조절되지 않는 Dpl 수준에 관련된 신경학적 장애)의 치료를 위해 숙주세포에게 생리학적으로 허용되는 담체로 투여될 수 있다. 또한, 화합물은 Dpl 작용을 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 치료제는 경구적, 국부적, 비경구적, 예를 들어 피하, 복강내, 바이러스성 감염, 근육내 등의 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 흡입 치료가 특히 흥미롭다. 도입 방식에 따라서, 화합물은 다양한 방식으로 조제될 수 있다. 조제물에서 치료적 활성 화합물의 농도는 약 0.1 내지 100wt%로 변할 수 있다.

제약학적 조성물은 과립, 정제, 알약, 좌약, 캡슐, 현탁액, 연고, 로션 등 여러가지 형태로 제조될 수 있다. 경구 및 국부용에 적합한 제약학적 등급의 유기 또는 무기 담체 및/또는 희석제가 치료적 활성 화합물을 함유하는 조성물을 만드는데 사용될 수 있다. 본 분야에 공지된 희석제는 수성 매체, 식물 및 동물 기름 및 지방을 포함한다. 안정제, 습윤 및 유화제, 삼투압을 변화시키기 위한 염 또는 알맞은 pH 값을 확보하기 위한 완충액, 및 피부 침투 증진제가 보조제로서 사용될 수 있다.

약물유전학

약물유전학은 개체의 유전자형과 치료제에 대해 대사하거나 또는 반응하는 개체의 능력 사이를 연계한다. 대사 또는 표적 민감성의 차이는 생체활성 용량과 약물의 혈중농도 사이의 관계를 변경시킴으로써 심각한 독성 또는 치료적 실패를 초래할 수 있다. 지난 몇년 동안, 많은 연구는 대사 효소 또는 약물 표적의 다형성과 반응성 및 독성간의 양호한 관계를 수립했다. 이들 관계는 치료 용량 투여를 개별화하기 위해 사용될 수 있다.

다형성 대립유전자의 유전자형이 개체가 특정한 치료 섭생에 잘 반응할 것인지의 여부를 평가하는데 사용된다. 또한, 다형성 서열이 후보 치료제의 용량 및 특이성을 측정하기 위한 약물 스크리닝 분석에 사용된다. 후보 Dpl 다형성은, 예를 들어 신경학적 장애를 치료하는데 있어 유효성에 대한 영향이 있는지의 여부를 측정하기 위해 표적 치료요법으로 스크리닝된다. 약물 스크리닝 분석은 상기 설명된 바와 같이 수행된다. 전형적으로, 2개 이상의 상이한 서열 다형성이 치료요법에 대한 반응에 대해 시험된다.

특정한 서열 다형성이 상이한 약물 유효성과 서로 관련이 있는 경우, 진단적 스크리닝이 수행될 수 있다. 진단적 방법은 전술한 섹션에 상세하게 설명되어 있다. 특정한 다형성의 존재가 검출되고, 영향을 받은 개체를 위한 효과적인 치료적 전략을 개발하기 위해 사용된다.

Dpl 관련 장애의 검출

Dpl 수준 및/또는 상이한 Dpl 형태의 존재의 검출은 Dpl에 관련된 신경변성장애를 진단하기 위한 수단을 제공할 수 있다. 특히, Dpl 발현 변화 및/또는 Dpl 형태 변화의 검출이 유전성 소뇌피질성 위축증, 강직성-간대성 발작을 갖는 전신성 간질(GTCS), 척수소뇌성 실조증 유형 6 등과 같은, Purkinje 세포 변성을 수반하는 장애에 관련될 수 있다. Dpl 수준 및/또는 상이한 단백질 형태의 측정은 또한 다른 신경변성 장애에 대해서도 사용될 수 있으며, 본 명세서를 숙독함에 의해 당업자에게 명백해질 것이다.

Dpl-관련 장애의 진단은 단백질, DNA 또는 RNA 서열, 및/또는 환자로부터 얻어진 어떤 편리한 샘플, 예를 들어 생검 물질, 혈액 샘플, 뺨으로부터 긁어낸 것 등의 혼성화 분석에 의해 수행된다. Dpl에 관련될 수 있는 장애를 갖는 환자로부터의 핵산 샘플이 Dpl의 소인 다형성의 존재에 대해 분석된다. 전형적인 환자 유전자형은 적어도 1개의 염색체상에 적어도 1개의 소인 돌연변이를 가질 것이다. 유전자 생성물의 활성 또는 발현에 영향을 미치고, Dpl 관련 장애(예를 들어, 신경변성 장애)에 증가된 감수성을 부여하는 다형성 Dpl 서열의 존재가 소인 다형성으로 고려된다. 개체(들)은 영향을 받지 않은 개체로부터의 서열과 비교하여, 소인 다형성의 존재에 대해 그것들의 DNA 또는 mRNA를 분석함에 의해 스크리닝된다.

또한, 스크리닝은 단백질의 작용 또는 항원 특징을 기초로 한다. Dpl 단백질에 있는 소인 다형성을 검출하도록 지정된 면역분석이 스크리닝에 사용될 수 있다. 많은 분화한 돌연변이가 특정한 질환 표현형을 초래하는 경우, 작용성 단백질 분석이 효과적인 스크리닝 도구일 수 있다.

생화학적 연구들이 Dpl 코딩 영역 또는 제어 영역에 있는 후보 서열 다형성이 질환에 관련되는지의 여부를 측정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Dpl 발현에 영향을 미치는 프로모터 또는 인핸서 서열의 변화는 신경학적 장애, 예를 들어 프리온-매개 장애에 대한 소인을 가져올 수 있다. 후보 변이체 대립유전자의 발현 수준이 본 분야에 공지된 여러가지 방법에 의해 정상 대립유전자의 발현 수준과 비교된다. 프로모터 또는 인핸서 강도를 측정하는 방법은 발현된 천연 단백질의 정량; 편리한 정량을 제공하는 β-갈락토시다제, 루시페라제, 클로로암페니콜 아세틸트랜스페라제 등과 같은 리포터 유전자를 갖는 벡터안에 변이체 제어 요소의 삽입 등을 포함한다. 코드화된 Dpl 단백질의 활성은 야생형 단백질과의 비교에 의해 측정될 수 있다.

다수의 방법이 특이적 서열의 존재에 대한 핵산의 분석에 이용가능하다. 다량의 DNA가 이용가능한 경우, 게놈 DNA가 직접 사용된다. 또는 달리, 관심의 영역이 적합한 벡터안에 클론되어 분석에 충분한 양으로 성장된다. Dpl 유전자를 발현하는 세포는 mRNA의 공급원으로서 사용될 수 있으며, 이것은 직접 분석되거나 또는 분석을 위해 cDNA로 역번역될 수 있다. 핵산은 중합효소 사슬 반응(PCR)과 같은 종래의 기법에 의해 증폭되어 분석을 위해 충분한 양을 제공한다. 중합효소 사슬 반응의 사용이 Saiki et al.,Science239:487(1985); a review of current techniqu es may be found in Sambrook, et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp. 14.2-14.33에 설명된다. 또한, 증폭은 다형성에 대해 특이적인 프라이머를 사용함에 의해 다형성이 존재하는지의 여부를 측정하는데 사용될 수 있다. 또는 달리, 다형성을 검출하는 수단으로서 올리고뉴클레오티드 리게이션을이용하는 여러가지 방법이 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Riley et al.,Nu cl. Acid Res.18:2887-2890(1990); 및 Delahunty et al.,Am. J. Hum. 유전자t.58: 1239-1246(1996) 참조.

검출가능한 표지가 증폭 반응에 포함될 수 있다. 적합한 표지는 형광색소, 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민, 텍사스 레드, 피코에리트린, 알로피코시아닌, 6-카르복시플루오레세인(6-FAM), 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE), 6-카르복시-X-로다민(ROX), 6-카르복시-2' ,4',7',4,7-헥사클로로플루오레세인(HEX), 5-카르복시플루오레세인(5-FAM) 또는 N, N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA), 방사성활성 표지, 예를 들어³²P,³³P,³⁵S,³H 등을 포함한다. 표지는 2단계 시스템일 수 있으며, 여기에서는 증폭된 DNA가 높은 친화성 결합 파트너, 예를 들어 아비딘, 특이적 결합 항체 등을 갖는 바이오틴, 헵텐 등에 콘쥬게이트되고, 결합 파트너가 검출가능한 표지에 콘쥬게이트된다. 표지는 1개 또는 2개의 프라이머에 콘쥬게이트될 수 있다. 또는 달리, 표지를 증폭 생성물에 결합시키기 위해서, 증폭에 사용된 뉴클레오티드의 풀이 표지된다.

샘플 핵산, 예를 들어 증폭 또는 클론된 단편이 본 분야에 공지된 다수의 방법 중 하나에 의해 분석된다. 핵산은 디데옥시 또는 다른 방법, 및 어느 한쪽의 중성 Dpl 서열(예를 들어, 영향받지 않은 개체로부터의 Dpl 서열)과 비교된 염기 서열에 의해 서열화될 수 있다. 변이체 서열과의 혼성화가 또한 사우던 블롯, 도트블롯 등에 의해 그것의 존재를 측정하는데 사용될 수 있다. US 5,445,934 또는 WO 95/35505에 설명된 바와 같은, 고체 지지체상에 고착된 올리고뉴클리오티드 프로브의 정렬에 대한 제어 및 변이체 서열의 혼성화 패턴이 또한 변이체 서열의 존재를 검출하는 수단으로 사용될 수 있다. 단일 스트랜드 형태적 다형성(SSCP) 분석, 변성 구배 겔 전기영동(DGGE), 불일치 절단 검출, 및 겔 매트릭스에서 이형이중가닥 분석이 전기영동도의 변경으로서 DNA 서열 변이에 의해 만들어진 형태적 변화를 검출하는데 사용될 수 있다. 또는 달리, 다형성이 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 만들거나 또는 파괴하는 경우(제한 단편 길이 다형성, RFLP), 샘플은 이 엔도뉴클레아제로 소화되고, 생성물 크기가 분류되어 단편이 소화되었는지의 여부를 측정한다. 분류는 특히 아크릴아미드 또는 아가로스 겔의 겔 또는 모세관 전기영동에 의해 수행된다.

US 5,445,934 또는 WO 95/35505에 설명된 바와 같은, 고체 지지체상에 고착된 올리고뉴클리오티드 프로브의 정렬에 대한 제어 및 변이체 서열의 혼성화 패턴은 변이체 서열의 존재를 검출하는 수단으로 사용될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 정렬이 제공되며, 여기에서 정렬상의 불연속 위치는 Dpl 유전자좌의 mRNA 또는 게놈 DNA 중 적어도 일부에 상보성이다. 그러한 정렬은 일련의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 이것들 각각은 Dpl 유전자좌로부터의 핵산 서열, 예를 들어 mRNA, cDNA, 게놈 DNA 등에 특이적으로 혼성화한다. 보통 그러한 정렬은 적어도 2개의 상이한 다형성 서열, 즉 유전자좌내의 유일한 위치에 위치된 다형성을 포함할 것이며, 보통 적어도 약 5개, 더 보통은 적어도 약 10개, 그리고 많게는 50 내지 100개의 상이한 다형성을 포함할 수 있다. 정렬상의 올리고뉴클레오티드 서열은 보통 적어도 약 12 nt 길이일 것이고, 제공된 다형성 서열의 길이일 수 있거나, 또는 100 내지 200 nt 길이의 단편을 생성하도록 측면 영역으로 확장할 수 있다. 정렬의 예는, Hacia et al.,Nature Genetics14:441-447 (1996); Lockhart et al.,Nature Biotechnol.14:1675-1680(1996); 및 De Risi et al.,Nature Genetics14:457-460(1996) 참조.

Dpl 다형성에 특이적인 항체는 면역분석을 스크링하는데 사용될 수 있다. Dp l 및/또는 다형성에 관련된 Dpl 장애의 존재의 감소 또는 증가는 의심되는 장애가 Dpl-관련된 것이라는 것을 나타낸다. 샘플은 Dpl-관련 장애를 가질 것으로 의심되는 환자로부터 취해진다. 본원에 사용된 바와 같은 샘플은 조직 생검, 생물학적 유체, 기관 또는 조직 배양물 유도 유체, 및 생리학적 조직으로부터 추출된 유체, 뿐만 아니라 그러한 유체의 유도체 및 부분을 포함한다. 샘플에 있는 세포의 수는 일반적으로 적어도 약 10³, 보통 적어도 10⁴이상이며 보통 적어도 약 10⁵일 것이다. 세포가 분리될 수 있거나, 또는 고상 조직의 경우에는 조직 부분이 분석될 수 있다.

진단은 다수의 방법에 의해 수행될 수 있다. 상이한 방법들은 모두 Dpl에 소인 다형성을 가질 것으로 의심되는 환자 세포에서 정상 또는 비정상 Dpl의 부재 또는 존재, 또는 변경된 양을 측정한다. 예를 들어, 검출은 종래의 방법에 따라 수행되는, 세포 또는 조직학적 부분의 염색을 이용할 수 있다. 관심의 항체가 세포 샘플에 첨가되고, 에피토프와의 결합을 허용하는 충분한 시간, 보통 적어도 약 10분 동안 인큐베이션된다. 항체는 방사성동위원소, 효소, 형광물질, 화학발광물질, 또는 직접 검출을 위한 다른 표지로 표지될 수 있다. 또는 달리, 제 2 단계 항체 또는 시약이 신호를 증폭하기 위해 사용된다. 그러한 시약은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 제 1 항체가 바이오틴에 콘쥬게이트되고, 양고추냉이 퍼옥시다제 -콘쥬게이트된 아비딘이 제 2 단계 시약으로서 첨가될 수 있다. 최종 검출은 퍼옥시다제의 존재하에 색이 변화되는 기질을 사용한다. 항체 결합의 부재 또는 존재가 분리된 세포의 유동 세포계수법, 현미경검사, 방사선사진, 섬광계수 등을 포함하는, 여러가지 방법에 의해 측정될 수 있다.

만약 특정 질환 상태가 Dpl의 형태적 변화에 관련된다면, 진단은 단백질의 질환-관련형의 인식에 의존할 수 있다. 질환-관련형 단백질은 질환-관련 형태의 특징, 예를 들어 불용해성, 프로테아제 소화에 대한 내성, 에피토프 이용성의 변화 등을 사용하여 다른 형태의 Dpl로부터 구별될 수 있다.

다른 진단 방법은 여액에 있는 항체와 Dpl 사이의 결합의 시험관내 측정에 따른다. 샘플 또는 그것의 단편에서 Dpl 결합 농도의 측정은 여러가지 특이적 분석에 의해 달성될 수 있다. 종래의 샌드위치형 분석이 사용될 수 있다. 예를 들어, 샌드위치 분석은 먼저 불용성 표면 또는 지지체에 Dpl-특이적 항체를 부착시킬 수 있다. 구체적 결합 방식은 그것이 본 발명의 시약 및 모든 방법과 양립가능한 한 중요하지 않다. 그것들은 공유적으로 또는 비공유적으로, 바람직하게는 비공유적으로 플레이트에 결합될 수 있다.

불용성 지지체는 폴리펩티드가 결합될 수 있고, 가용성 물질로부터 쉽게 분리되며, 다르게는 모든 방법과 양립가능한 어떤 조성물일 수 있다. 그러한 지지체의 표면은 고체 또는 다공성이며, 어떤 편리한 모양일 수 있다. 리셉터가 결합되는 적합한 불용성 지지체의 예는 비드, 예를 들어 자기 비드, 멤브레인 및 마이크로타이터 플레이트를 포함한다. 이들은 전형적으로 유리, 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌), 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로스로 만들어진다. 마이크로타이터 플레이트는 많은 수의 분석이 소량의 시약 및 샘플을 사용하여 동시에 수행될 수 있기 때문에 특히 편리하다.

다음에, 환자 샘플 여액이 항체를 함유하는 개별적으로 분석가능한 지지체(예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 분리된 웰)에 첨가된다. 바람직하게는, 공지된 농도의 정상 및/또는 비정상 Dpl을 함유하는 일련의 표준물질이 대조군으로 사용하기 위해 샘플 또는 그것의 알리쿼트와 병행하여 분석된다. 바람직하게는, 각 샘플 및 표준물질은 복수의 웰에 첨가될 것이며, 이로써 각각에 대한 평균값이 얻어질 수 있다. 인큐베이션 시간은 결합하기에 충분해야 하며, 일반적으로 약 0.1 내지 3시간이 충분하다. 인큐베이션 후, 불용성 지지체는 일반적으로 비-결합 성분으로부터 세척된다. 일반적으로, 적절한 pH, 일반적으로 7 내지 8의 pH의 묽은 비-이온성 세제 매체가 세척 매체로서 사용된다. 샘플에 존재하는 비-특이적 결합 단백질을 완전히 세척하기에 충분한 부피로, 1 내지 6회 세척될 수 있다.

세척 후, 제 2 항체를 함유하는 용액이 사용된다. 항체는 존재하는 다른 성분으로부터 구별될 수 있는 충분한 특이성을 갖는 Dpl을 결합시킬 것이다. 제 2 항체는 결합의 직접적 또는 간접적 정량을 용이하게 하도록 표지될 수 있다. 제 2 리셉터 결합의 직접적 측정을 허락하는 표지의 예는³H 또는¹²⁵I와 같은 방사성표지, 형광물질, 염료, 비드, 화학발광물질, 콜로이드상 입자 등을 포함한다. 결합의 간접적 측정을 허락하는 표지의 예는 기질이 착색된 생성물 또는 형광 생성물을 제공할 수 있는 효소를 포함한다. 바람직한 구체에에서, 항체는 적합한 기질의 첨가 후 검출가능한 생성물 신호를 제공할 수 있는 공유적으로 결합된 효소로 표지된다. 콘쥬게이트에 사용하기에 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알카리성 포스파타제 말레이트 디히드로지나제 등을 포함한다. 상업적으로 입수가능하지 않은 경우, 그러한 항체-효소 콘쥬게이트는 당업자에게 공지된 기법에 의해서 쉽게 생성될 수 있다. 인큐베이션 시간은 표지된 리간드가 이용가능한 분자를 결합시키기에 충분해야 한다. 일반적으로, 약 0.1 내지 3시간이 충분하며, 보통 1시간이 충분하다.

제 2 결합 단계 후, 불용성 지지체는 비-특이적으로 결합된 물질이 없는 상태로 다시 세척된다. 결합된 콘쥬게이트에 의해 생성된 신호는 종래의 수단에 의해 검출된다. 효소 콘쥬게이트가 사용되는 경우, 적합한 효소 기질이 제공되어 검출가능한 생성물이 형성된다.

다른 면역분석이 본 분야에 공지되어 있으며, 진단적으로 사용될 수 있다. 오우크테를로니 플레이트는 항체 결합의 간단한 측정을 제공한다. 웨스턴 블롯은 바람직한 바 Dpl에 특이적인 검출 시스템을 사용하여, 편리하게는 샌드위치 분석에 대해 설명된 바와 같은 표지화 방법을 사용하여, 필터상의 단백질 겔 또는 단백질스팟에 대해 수행될 수 있다.

관심의 다른 진단적 분석은 Dpl 단백질의 작용성을 기초로 한다. 그러한 분석은 많은 수의 상이한 서열 변화가 공통의 표현형을 초래하는 경우 특히 유용하다. 예를 들어, 작용성 분석은 Dpl 유전자 생성물에 의해 매개되는 것에 더하여, 세포의 전사 레파토리의 변화를 기초로 할 수 있다. 다른 분석은, 예를 들어 형태적 변화, 삽입에 기인하는 크기 변화, 결실 또는 절단, 또는 Dpl 단백질의 준세포 배치의 변화를 검출할 수 있다.

단백질 절단 시험에서, Dpl 유전자 또는 그것의 전사체로부터 증폭된 PCR 단편이 생체내에서 단백질 생성물을 생성하는 전사/번역 반응을 위한 템플레이트로서 사용된다. 겔 전기영동에 의한 분리가 다형성 유전자가 절단된 단백질을 코드화하는지의 여부를 측정하기 위해 수행되며, 여기에서 절단은 작용의 손실과 관련될 수 있다.

또한, 진단적 스크리닝이, 특히 미세부수체 마아커 또는 단일 뉴클레오티드 다형성의 사용을 통해, CJD와 같은 프리온-매개 장애의 소인에 유전적으로 결합된 다형성에 대해 수행될 수 있다. 자주, 미세부수체 다형성 자체는 표현형으로 발현되지 않지만, 질환 소인을 가져오는 서열에는 결합된다. 그러나, 어떤 경우에는 미세부수체 서열 자체가 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다. 미세부수체 결합 분석은 단독으로, 또는 상기 설명된 바와 같은 다형성의 직접 검출과 조합하여 수행될 수 있다. 유전자형화를 위한 미세부수체의 사용이 잘 기록되어 있다. 예를 들어, M ansfield et al.,Genomics24:225-233(1994); Ziegle et al.,Genomics14:1026-1031(1992); Dib et al., 위와 같음. 참조.

본 방법에 유용한 미세부수체 유전자좌는 다음 일반식을 갖는다.

U(R)nU'

여기에서,

U 및 U'는 특정한 유전자좌를 유일하게 확인하는 비-반복 측면 서열이고, R은 반복 모티프이고, n은 반복수이다. 반복 모티프는 적어도 2 뉴클레오티드 길이, 7까지, 보통은 2 내지 4 뉴클레오티드 길이이다. 반복은 단순하거나 복잡할 수 있다. 측면 서열 U 및 U'는 인간 게놈내에 있는 미세부수체 유전자좌를 유일하게 확인한다. U 및 U'는 적어도 약 18 뉴클레오티드 길이이고, 어느 한쪽의 반복에서 약 1kb까지의 수백개 염기로 확장할 수 있다. U 및 U'내에서, 서열이 증폭 프라이머에 대해 선택된다. 프라이머 서열의 정확한 조성은 본 발명에서 중요하지 않지만, 그것들은 긴축 조건하에서 각각 측면 서열 U 및 U'에 혼성화한다. 증폭 프라이머의 선택에 대한 기준은 이미 논의된 바와 같다. 유전자좌에서의 크기 차이에 대한 분해능을 최대화하기 위해, 반복 서열과 가까운 프라이머 서열을 선택하는 것이 바람직하며, 이로써 전체 증폭 생성물은 100 내지 500 뉴클레오티드 길이 사이에 있다.

특이적 유전자좌에서 반복수 n은 집단의 다형성이며, 이로써 증폭 프라이머 사에 놓은 DNA 길이의 개체적 차이가 발생한다.

프라이머는 반복을 함유하는 게놈 DNA의 영역을 증폭하기 위해 사용된다. 편리하게는, 검출가능한 표지가 이미 설명된 바와 같이 증폭 반응에 포함될 것이다. 복합 증폭이 수행될 수 있으며, 몇가지 세트의 프라이머가 같은 반응 튜브에서 조합된다. 이것은 특히 한정된 양의 샘플 DNA가 분석에 이용가능할 때 유리하다. 편리하게는, 각각의 프라이머 세트는 상이한 형광색소로 표지된다.

증폭 후, 생성물은 크기 분류된다. 분류는 겔 전기영동, 특히 변성 아크릴아미드 또는 아가로스 겔에 의해 수행될 수 있다. 편리한 시스템은 자동 DNA 서열화기와 조합하여 변성 폴리아크릴아미드 겔을 사용한다. Hunkapillar et al.,Scienc e254:59-74(1991) 참조. 자동 서열화기는 특히 복합 증폭 또는 개별 PCR 반응의 모아진 생성물에 있어 유용하다. 또한, 모세관 전기영동이 분류를 위해 사용될 수 있다. 모세관 전기영동에 대한 리뷰는 Landers et al.,Bio Techiques14:98-111(1 993)에 있다. 증폭 생성물의 크기는 프라이머에 의해 특이화된 유전자좌에 존재하는 반복수(n)에 비례한다. 크기는 집단의 다형성이며, 따라서 그 유전자좌에 대한 대립유전자 마아커이다.

PrP-관련 장애의 진단 및 치료

또한, 본원에 설명된 2개 PrP^0/0계통과 같은 Dpl 활성의 증가된 발현을 갖는 동물이 프리온 감염의 증상 발생에 대해 감소된 잠복기간을 나타낸다. 이런 관찰을 기초로, 본 발명은 변경된 Dpl 발현을 갖는 동물을 사용하여 샘플의 프리온 감염성을 측정하기 위한 분석 방법을 제공한다. 방법은 샘플이 시험되는 샘플로 본 발명의 Dpl 트랜스제닉 또는 혼성체 포유류를 접종하고, 그것들이 정상적으로는 프리온에 관련된 질환의 증상을 발생시키는지의 여부를 측정하기에 충분한 기간 동안 포유류를 관찰함에 의해 프리온으로 감염되는지의 여부를 측정한다. 동물은 1) 자연적 내인성 Dpl 돌연변이, 예를 들어 유전적 스크리닝으로 확인된 Dpl 유전자좌의 돌연변이, 2) 트랜스제닉 동물에서 생성된 Dpl 돌연변이, 예를 들어 증가된 Dpl 유전자 생성물의 발현을 가져오는 PrP 유전자좌의 결실, 및/또는 3) Dpl 폴리펩티드를 코드화하는 외인성 트랜스젠의 도입으로 인한 증가된 수준의 Dpl 발현을 가질 것이다.

또한, 본 발명의 Dpl 동물은 동물 사망의 원인을 측정하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 그러한 방법은 사망한 동물로부터 추출된 뇌조직과 같은 체액 또는 조직으로 본 발명의 Dpl 트랜스제닉 또는 혼성체 동물을 접종하고(바람직하게는 표준화된 프리온 제제로 대조군 동물도 접종한다), 동물이 프리온 감염의 증상을 발생시키는지의 여부를 측정하기 위해 트랜스제닉 또는 혼성체 동물(및 대조군 동물)을 관찰하는 것을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 변경된 Dpl 활성을 갖는 본 발명의 동물은 또한 PrP 유전자좌와 관련하여 변경된 게놈을 갖는다. 동물의 예는 이것들에 한정되는 것은 아니지만, (1) 미국 특허 번호 5,698,763에 개시된 바와 같은 변경된 내인성 PrP 유전자를 갖는 동물; (2) 미국 특허 번호 5,792,901 및 U.S.S.N 08/935,363에 개시된 바와 같은, 변경된 내인성 PrP 유전자 및 유전적으로 분화한 동물로부터의 외인성 PrP 트랜스젠을 갖는 동물; 및 (3) U.S.S.N 09/052,963에 개시된 바와 같은, 변경된 외인성 PrP 유전자 및 유도성 PrP 트랜스젠을 갖는 동물을 포함한다.

바람직한 숙주 동물은 마우스 및 햄스터이며, 트랜스제닉 동물의 생성에 대한 중요한 지식을 나타낸다는 점에서 마우스가 가장 바람직하다. 다른 가능한 숙주동물은 Mus(예를 들어, 마우스), Rattus(예를 들어, 래트), Oryctologus(예를 들어, 토끼) 및 Mesocricetus(예를 들어, 햄스터) 및 Cavia(예를 들어, 기니아피그)로부터 선택된 속에 속하는 것들을 포함한다. 사육 및 보존하기 쉬운 정상적으로 다 자란 성인의 체중이 1kg 미만인 일반적인 포유류가 사용될 수 있다. 숙주 PrP 유전자는 Bos, Ovis, Sus 및 Homo로부터 선택된 속에 속하는 시험 동물로부터의 유전적으로 분화한 PrP 유전자로부터 코돈을 유도하기 위해 변화될 수 있다. 바람직하게는, 마우스 숙주 PrP 유전자가 인간, 암소 또는 양 PrP 유전자로부터 코돈을 유도하기 위해 변화되며, 암소가 가장 바람직하다. 암소는 바람직한 이유는 본 발명의 중요한 목적이, "미친 암소" 질환으로 알려진 BSE를 일으키는 프리온으로 암소가 감염되는지의 여부를 측정하기 위해, 한떼의 암소중에서 통계적으로 상당한 수의 암소를 시험하는데 이 동물을 사용하는 것이기 때문이다.

또한, 본 발명은 프리온(바람직하게는 표준화된 프리온 제제)으로 감염된 트랜스제닉 또는 혼성체 동물에 시험되는 약물을 투여하고, 포유류를 관찰 및/또는 시험하여 약물이 질환 또는 그것의 증상의 진행을 치료 또는 지연을 돕는지의 여부를 측정하는 것을 포함하는, 프리온 감염의 결과로서 발생된 질환의 치료에서 약물의 효능을 시험하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 미국 특허 번호 5,792,901 및 U.S.S.N 08/935,363에 설명되며, 이것들은 본 목적을 위해 참고자료로서 본원에 포함된다.

또한, 본 발명은 Dpl 발현을 하향조절하고 및/또는 Dpl 활성을 감소시키는 화합물의 투여에 의해 프리온 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 증가된 Dpl 활성은 프리온 질환의 잠복기간의 감소에 관련되고, PrP^C는 증가된 Dpl 표현형(그것들이 어떤 경로로 상호작용 또는 경쟁할 수 있는지를 시사하는)을 구조할 수 있으므로, 감소한 Dpl 활성은, 예를 들어 PrP^Sc에 반응하는 뉴런의 발생을 방지함에 의해, 프리온 장애의 진행을 지연 또는 정지시킬 수 있다.

Dpl-코드화 핵산의 치료적 사용

Dpl-코드화 핵산은 세포안에 도입되어 세포의 형질전환, 바람직하게는 안정한 형질전환을 달성할 수 있다. 세포안에 Dpl-코드화 핵산의 도입은 본 분야에 잘 공지된 방법(예를 들어, 전기천공, 미세주입, 재조합(바람직하게는 복제-결손) 바이러스를 사용한 리포펙션 감염, 및 본 분야에 잘 공지된 다른 수단의 사용을 통해)에 따라서 달성될 수 있다. 바람직하게는, Dpl-코드화 핵산은 바람직한 수준의 Dpl 폴리펩티드 발현을 용이하게 하는 프로모터(예를 들어, CMV, SV40, 아데노바이러스로부터 유도된 프로모터, 또는 조직-특이적 또는 세포 종류-특이적 프로모터)에 작동가능하게 연결된다. Dpl-코드화 핵산을 함유하는 형질전환된 세포는, 예를 들어 Dpl-코드화 구성물에 존재하거나, 또는 Dpl-코드화 구성물과 공동-트랜스펜션된 플라스미드상에 존재하는 선택성 마아커 유전자의 발현에 의하여 선택 및/또는 부화될 수 있다. 전형적으로 선택성 마아커는 테트라시클린, 히그로마이신, 네오마이신 등과 같은 항체에 대한 내성을 제공한다. 다른 마아커로는 티미딘 키나제 등이 있다.

Dpl-코드화 핵산을 발현하는 형질전환된 세포의 능력이 본 분야에 공지된 여러가지 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, Dpl 발현은 관련 유전자로부터 유도된 DNA 프로브와 혼성화한 mRNA를 검출하는 노던 블롯에 의해 시험될 수 있다. 바람직한 유전자를 발현하는 이들 세포는 본 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 시험관내의 배양물중에서 더 분리되고 확장될 수 있다. Dpl-코드화 DNA를 갖는 형질전환체에 대해 선택된 숙주 세포는 생체외에서의 치료요법(예를 들어, Dpl 펩티드 생성)의 목적, 세포 체내이식의 부위, 및 당업자에 의해 인정되는 다양한 인자에 따라 변하는 다른 인자에 따라 변할 것이다.

표적 세포의 발현을 위한 관심의 핵산의 생체내 전달 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 생체내에서 유전자 전달의 방법은 정상적으로는 표적 세포안에 DNA를 도입하는 생물학적 수단(예를 들어, 관심의 DNA를 함유하는 바이러스), 또는 표적 세포안에 DNA를 도입하는 기계적인 수단(예를 들어, 세포안에 DNA의 직접적 주사, 리포솜 융합, "유전자 총"을 사용한 공기적 주사 등)을 사용한다.

표적 조직의 감염, 충분한 수의 세포의 형질전환, 및 바람직한 수준의 Dpl의 생성에 효과적인 DNA의 양 및/또는 감염성 바이러스 입자의 수가 시험관내 형질전환의 효능 및 형질전환에 대한 표적 세포의 감수성과 같은 인자를 기초로 하여 쉽게 측정될 수 있다. 일반적으로, DNA의 양은 동물 모델에서 원하는 유전자의 전달 및 발현에 효과적인 DNA의 양으로부터 추정될 수 있다. 예를 들어, 인간에서 전달을 위한 DNA의 양은 래트에서 효과적인 DNA 양의 대략 100 배이다.

Dpl-코드화 DNA가 생체내 또는 생체외에서 도입되는지의 여부에 관계 없이, DNA(또는 DNA를 발현하는 세포)는 다른 유전자 및 다른 제제와 조합하여 투여될 수있다. 이에 더하여, Dpl-코드화 DNA(또는 Dpl DNA를 발현하는 재조합 세포)가, 예를 들어 Dpl 생성의 감소에 관련되지만, 원래 Dpl 작용의 변경에는 관련되지 않는 장애의 치료를 위해 사용될 수 있다.

다음 실시예들은 당업자에게 본 발명을 어떻게 만들고 사용하는지에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위하여 제시되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주한 것의 범위를 한정하거나, 또는 아래 실험들이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내도록 의도하는 것은 아니다. 사용된 수(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 확보하기 위해 노력했으나, 어떤 실험적 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 나타내지 않는다면, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.

실시예 1

Prnd 유전자좌의 확인

인간, 양, 및 마우스 PrP 유전자의 "a" 대립유전자인Prnp ^a를 포함하는 파지 및 코스미드 분자 클론에 대한 이전의 대규모 서열화 연구는 PrP에 아주 근접하거나 인트론 서열내에 있는 추가적 코딩 영역의 어떤 증거를 밝히는데 실패했다(Lee et al., Genome Res. 8:1022-1037(1998)). 그러나, 3' 방향으로 더 확장한 마우스 Prnp^b코스미드 클론 I/LnJ-4(Westaway et al., Neuron 7:59-68 (1991))의 서열화 및 "XGrail 1.3c" 프로그램(Uberbacher et al, ORNL/TM 11741 (1991))을 사용한 분석은 36,119 내지 36,751(도 1A)에서 후보 코딩 영역을 밝혔다.

코스미드 및 YAC 클론을 이전에 설명된 표준 과정에 의해 증식시켰다(D. Westaway, Cell 76:117-29 (1994)). 129Sv/J BAC 클론 321L17을 Millenium Pharmac euticals에 의해 제공된 라이브러리로부터 확인했다.

이 ORF의 예상 아미노산 서열(도 2)은 포유류, 유대류 및 조류 PrP와 상동성으로 나타난다. 우리는 추정 유전자를Prnd(프리온 유전자 복합체, 하류)로, 그리고 단백질 생성물을 "Dpl"(하류, 프리온 단백질-유사: 독일, "double")로 간주한다.

사우던 블롯 분석은Prnd의 추정 코딩 영역이 마우스 게놈에 있는 단일-카피 서열임을 나타냈다. I/LnJ 마우스의 특이질인PrndORF를 배제하기 위해, 우리는 C57B6-derived YAC 클론(Westaway et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6418-6422 (1994)) 및 129/SvJ BAC 클론 321L17로부터의 상응하는 염색체 영역을 서열화했다. 2개 모두 동일한 ORF로 밝혀졌다. 더욱이, 관련된 ORF가 래트 및 인간에도 존재하며, 인간PrnD유전자는PRNP에서 27kb 3'에 위치했다. 이들 데이타는PrnD유전자가 모든 포유류에 존재할 것임을 나타낸다.

실시예 2

Prnd 유전자좌의 구조

PrndcDNA를 분리하여 이 영역으로부터 번역된 mRNA의 스플라이싱을 증명하고, 적합한 코딩 엑손을 정의했다. cDNA 라이브러리 스크리닝의 상보성 접근 및 cDNA 말단(RACE)의 빠른 증폭을 출발 물질로서 야생형 성인 마우스 뇌 cDNA를 사용하여 착수했다.

PrnD RNA의 RACE 클로닝

5' RACE 분석에 있어서, "마라톤" 마우스 뇌 cDNA(Clontech, Palo Alto, Cal if.)를 어뎁터 프라이머 AP1 및Prnd안티센스 스트랜드 프라이머 DW112, 5'-CGGTTGGTCCACGGCGACCCGAA-3'(SEQ ID NO:6)(0.2㎕)를 사용하여 증폭했다. Perkin-Elmer 2400 열순환기 및 94℃ 20초, 94℃ 5초 및 72℃ 360초 5 사이클; 94℃ 5초 및 70℃ 360초 5 사이클; 그리고 94℃ 5 초 및 68℃ 360 초 30 사이클의 "터치다운" PCR 조건을 사용했다. Taq 중합효소를 "TaqStart" 항체(Clontech, Palo Alto, Calif.)와 함께 사용했다. 크기-분류된 반응 생성물을 트리신 완충액에 재현탁하고, PCR의 제 2 라운드를 네스트(nest) 프라이머 세트를 사용하여 수행했다: AP2 유니버셜 프라이머 및Prnd프라이머 ORFP-R2(0.2㎕), 5'-GCAGATCTCTTTGATCAGCC-3'(SEQ ID NO:7)(94℃ 60초, 그리고 94℃ 10초, 57℃ 20초, 72℃ 150초 20 사이클). 이어서 키나제-표지 내부 프라이머 DW95 5'-CAGATCCACCGAAGCTCGGG-3'(SEQ ID NO:8)와의 혼성화에 의해 확인하고, PCR 반응 생성물을 직접 서열화하거나, 또는 이어서 플라스미드 벡터 pCR2.1TOPO(Invitrogen)안에 클로닝했다. 유사한 전략을 3' RACE 생성물의 클로닝을 위해 채택했다. 네스트 프라이머는

DW111, 5'-TGGTGACCAGCTGCGTCAACGCCA-3' (SEQ ID NO:9) 및

DW192, 5'-TGGGAAGGCCCTGAGCGACAACCGTG-3' (SEQ ID NO:10)

을 사용했다.

Prnd mRNA의 RT-PCR

전체 RNA를 산-페놀 방법 및 올리고 dT-라텍스(Quiagen)상의 폴리A-선택에 의해 제조했다. 제 1-스트랜드 cDNA 합성을 제조자(Stratagene, La Jolla, Calif.)에 의해 추천된 바대로 올리고 dT 또는 무작위 6량체 프라이머(주지된 바와 같은)로 프라임된 polyA+ RNA 100ng 및 MuLV 역전사효소를 사용하여 수행했다. 플러스 또는 마이너스 역전사효소로 인큐베이션된 cDNA 합성 반응물 2ng 알리쿼트를 직접, 또는 한외여과에 의한 농축 및 탈염 후 증폭시켰다. 후자의 예에서, cDNA 제 1-스트랜드 합성 반응물 40ul(160ng cDNA와 동일)를 물 450ul로 희석하고, 50,000 분자량 컷-오프 "엘루티콘" 미소농축기(Owl Scientific)에 도입했다. 이어서 14,000xg로 회전시키고, 멤브레인을 물 500ul로 세척하고, 회전시키고, 전화하고, 물 10ul로 용출했다. 이 제조물 2.5ul을 PCR 반응 당 사용했다. 또는 달리, 전체 RNA 10ug을 증폭 반응 당 2.5ul씩 사용된 슈퍼스크립트 역전사효소(Life Technologies)를사용하여 전체 부피 50ul로 역-번역했다. "Hot-start" 증폭(백금 Taq", Life Technologies 또는 Advantage KlenTaq, Clontech)을 아래 주지된 바와 같은 표준 반응 완충액에서 수행했다. 프라이머 세트는 다음과 같다:

Prnd엑손 1a 에서PrnD엑손 2:

DW189=5'-GCTCCAAGCTTCAGAGGCCACAGTAGCA-3' (SEQ ID NO:11) 및

DW96, 5'-TTACTTCACAATGAACCAAACGAAAC-3' (SEQ ID NO:12) (1uM):

94℃ 180초; 94℃ 15초 40 사이클; 65℃ 30초; 72℃ 75초, 백금 Taq 중합효소 및 최종 농도 2mM의 MgCl₂사용.

유전자간 엑손 2 에서PrnD엑손 2: DW117, 5'-GAGTGGAGGTCTTCGCGCA-3' (SEQ ID NO:13) 및

DW96(0.5uM).

95℃ 300초, 그리고 95℃ 10초, 55℃ 20초, 72℃ 150초 45 사이클, 백금 Taq 중합효소 및 최종 농도 2.5mM의 MgCl₂사용.

Prnp엑손 2 에서PrnD엑손 2:

5'UT.3 (Westaway, Neuron 7:59-68(1991)) 및 DW96(0.2uM).

95℃ 300초, 그리고 94℃ 15초, 60℃ 30초, 72℃ 120초 40 사이클, 백금 Taq 중합효소 및 각각 최종 농도 2.5mM 및 4%로 MgCl₂및 DMSO 사용.

래트Prnp엑손 2 에서PrnD의 3' 단부(ESTAI136375에 의해 정의됨):

DW213 5'-TCAAAACTGAACCATTTCAACCCAACTGAAGTATTCTGCC-3' (SEQ ID NO:14) 및

DW214 5'-ACCCAGCGTTCTGGCCCGGTATTAGGATT-3' (SEQ ID NO:15) (마우스 유전자 서열에 대한 불일치에 밑줄). 94℃ 120초 이어서 94℃ 15초 40 사이클, 그리고 72℃ 240초. β-Actin: 이들을 제조자(Stratagene, La Jolla, Calif.)에 의해 추천된 바대로 사용했다.

RACE 및 RT-PCR 분석으로부터의 결과를 공식 데이타베이스로부터 EST 일치를 연구하는데 사용했고, 어떤 수를 마우스, 인간 및 래트(도 1B)로부터 회수했다. 1.5 및 1.7Kb의PrnDcDNA를 Balb/C 고환 cDNA 라이브러리로부터 회수했다. 이들 클론은 노던 블롯에 대해 관찰된 주요한 Dpl mRNA 종에 상응했다. 또한, 2.7Kb의 더 큰 전사체가 노던 블롯상에 나타났고, 3' RACE는 이 mRNA 종에 대해 고려될 수 있는 엑손 2의 다른 스플라이싱에 대한 양호한 증거를 제공했다.

2개 주요한 cDNA 클론의 시험은 그것들이 3' 단부에 폴리A 트랙 및 대신 스플라이싱된 5' 엑손으로부터의 부분적 서열을 함유하는 바, 그것들이 거의 전 길이임을 나타냈다. 5' RACE 분석은, nt 36,204에서 엑손 2PrndORF에 인접하여 놓인 공통 스플라이스 어셉터로 nt 34,124 또는 nt 34,277에서 출발하는, 각각 엑손 1a 및 1b로 표시된, 짧은 5' 엑손으로부터의 스플라이싱 사건을 나타내는 이들 클론의 서열에 가깝게 일치했다(도 1B, 도 2A, 2B). 이것은 또한 마우스 Dpl EST AA796652 서열과 일치했으며, 이것은 엑손 1b의 엑손 2로의 스플라이싱에 의해 발생했다(도. 1B).

Prnd5' 미번역 영역 엑손의 5' 경계를 상이한 프라이머를 사용한 RT-PCR 반응에 의해 대략 30 뉴클레오티드의 간격내에 위치시켰다(도 2A). 프라이머 확장 반응 및 뉴클레아제 보호 분석을 더 정확한 지도화를 위해 사용했다. 프라이머 DW197, (5'-CCAGCCGGTTCTTCATGGTGAATCTCGG-3'(SEQ ID NO:16) 혼성화 온도 65℃), 및 DW123a, (5'-CATGGTGAATCTCGGTTCTC-3'(SEQ ID NO:17) 혼성화 온도 55℃)를 사용하는 프라이머 확장 반응을 전과 같이(Westaway et al., 1987) 수행했다. 단, 프라이머를 6000Ci/mmol 감마 32P-ATP("Kinase Max", Ambion Inc: NEN)를 사용하여 AE 9x10⁷dpm/pmole의 특이적 활성으로 표지했다. 동일한 방식으로 표지된 42-mer 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제 보호 분석에 사용했다("Multi-NPA", Ambion Inc.).

이들 지도화 실험의 결과는 가깝게 일치했고, RACE cDNA 및 EST gbAA796652 (마우스 유방선으로부터)에 의해 규정된 5' 말단의 mRNA 출발-부위 13-18 뉴클레오티드 상류의 군을 규정한다. 또한, 이들 일치는 인간PrndcDNA의 구조와도 일치한다. 2개의 다른 스플라이스 도너의 사용에 기인하는 5'비-코딩 엑손의 다른 경계 때문에, 그것을 "엑손 1a/1b"로 표시한다. 특히, 유사한 정렬이 소 PrP 유전자에서 관찰되었다(Horuichi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 233:660-654 (1997)). 엑손 1a 또는 1b가 AT 염색체 ORF를 갖는 프레임내에 코돈을 함유하지 않으므로, 이들 cDNAs( 및 아래 설명된 다른 것들)는 Prnd에 대한 개시 코돈이 뉴클레오티드 36,212에 있는 스플라이스 어셉터에서 3'에 놓인다는 것을 나타낸다. 이런 ATG는 보존되고 진핵 mRNA의 개시를 위한 Kozak 공통(공통 GCCGCCa/gCCATGG; (SEQ ID NOS. 18, 19);PrnDAGATTCACCATGA)(SEQ ID NO:20)(Kozak, Nucleic Acids Res. 15:8125-8148 1987)에 거의 합치한다.PrnD출발 부위의 위치는 Prn-p 자체와유사한 방식으로 조직화되며, 여기에서 ATG 코돈은 엑손 3의 스플라이스 어셉터에서 10 뉴클레오티드 3'에 놓인다(Westaway et al., Cell 51:651-662 (1987)).

독립적으로 유도된 cDNA의 내부 구조는PrndmRNA 3'UTR가 개별 엑손내에서 코드화되며, 다른 스플라이싱이 행해진다는 것을 나타낸다(도 1B). 따라서, ORF 종결 코돈(위치 36,779)의 한 스플라이스 도너 28 뉴클레오티드 3' 및 37,472에 있는 다른 추가의 하류는 약 38,006에 있는 스플라이스 어셉터를 지원하며, 이것은 노던 블롯(아래)에 의해 검출된 약 1.7 및 2.7kb RNAs에 대한 설명을 시사한다. 폴리A 트랙을 함유하는 cDNA 클론이 I/LnJ-4 코스미드의 위치 39,099 및 39,315에 있는 종결인자에서 발견되었다. 더 이상의 3' 부위가 공통 폴리아데닐화 신호 AATAAA에 의해 우선되지만, 유사한 모티프는 5' 부위로부터 결여된다. 주지하면, 서열 CTTAAA은 폴리A 꼬리의 27 뉴클레오티드 5'에 위치된다. 3' 유전자 구성은 (i) 3'UTR 코딩 서열내의 인트론이 드물고, (ii) 위치 37,472 및 38,006이 수용된 공통(정확한 인트론 경계의 한정적 위치화가 뉴클레오티드 여분에 의해 복잡하게 되고, 이로서 경계가 이들 좌표로부터 +1 또는 +2까지 이동될 수 있는) 또는 계통 다형성과는 다르고, (iii) 인트론 2가Prnp의 경우에서처럼, 종결 엑손보다는 오히려, 내부적으로서Prnd의 추정 단백질 코딩 엑손을 규정하기 때문에 보기 드물다. 575 또는 1,268 뉴클레오티드(스플라이스 도너 부위의 선택에 따라)의 크기에 있어서, 이 엑손은 99%의 내부 엑손이 40 염기 길이 미만이라는 규칙과 모순된다(Berget, J. Biol. Chem. 270: 2411-2414 (1995)).

실시예 3

Prnd 유전자좌로부터 전사체의 발현

노던 블롯 분석을 전체(50g 로딩) 또는 올리고-dT 선택된 RNA(7g 로딩)을 사용하여 ILn/J-4 코스미드로부터 유도된 전체 570bpPrnDORF 단편을 사용하여 수행했다. 전체 RNA를 제조자의 지시에 따라 Trizol 시약(Gibco)으로부터 만들었다. 폴리 A+ RNA를 Oligotex mRNA 키트(Qiagen)를 사용하여 분리했다. RNA 샘플을 글리옥살 샘플 완충액중에서 50℃에서 30분간 가열하고, 제조자(Ambion Inc., Woodland, Tex)에 의해 추천된 바대로 1.2% 아가로스 겔 전기영동했다. RNA를 터보블롯터 (Schleicher and Schuell)를 사용하여 2시간 동안 5xSSC 10mM NaOH중에서 Hybond N+(Amersham)위로 옮기고, 5xSSC로 헹구고, UV 고정하고(Statagene, La Jolla, Calif.), 다음에 65℃에서 1시간 동안 예비혼성화(6xSSC, 1% SDS, 3%(w/v) 덱스트린 술페이트, 10ug/ml 초음파처리된 청어 정자 DNA) 한 후, 129Sv/J 게놈 DNA 템플레이트와 함께 프라이머 RM1 (5'-ATGAAGAACCGGCTGGGTAC-3')(SEQ ID NO:21) 및 DW96을 사용하여 생성된 540bp Dpl ORF PCR a-dCTP32 무작위-프라임 프로브(Feinberg et al., Anal. Biochem. 132:6-13 (1983))를 첨가했다. 멤브레인을 16시간 동안 혼성화한 후, 실온에서 5분간 2xSSC/1%(w/v) SDS로 헹구고, 65℃에서 30분간 2xSSC/1%(w/v) SDS로 세척하고, 다음에 65℃에서 30분간 1xSSC/1%(w/v) SDS로 세척했다. 블롯을 3일 동안 -80℃에 노출했다. 이것은 야생형 마우스의 고환 및 심장 폴리A+ RNA에 있는 대략 1.7 및 2.7kb의PrndmRNA를 밝혔다. 뇌에서는PrndmRNA가 검출되지 않았다.

RT-PCR을 사용하여, 엑손 1a에서 엑손 2까지를 스플라이싱함에 의해 생성된야생형 마우스에 있는 mRNA를 성인 뇌 cDNA 및 14-일된 배에서 검출할 수 있다(도 3). 엑손 1b의 세포함유물을 반영하는 것 중의 하나인 추가의 cDNA 종을 어떤 성인 뇌 샘플에서 검출했다. Dpl mRNA 발현의 어떤 예비적 증거가 Prnd EST 일치의 조직 기관으로부터 유도될 수 있다(도 1B): 마우스 EST AA796652, AA104098 및 AA190150를 각각 성인 유방선, 배 심장 및 성인 비장으로부터 유도했다. 요컨대, Prnd mRNA는 배, 말초조직에서 발현되며, 성인 CNS에서는 낮은 수준이다.

DNA 서열 데이터로부터 예상되는 바와 같이, 유사한 전기영동도를 갖는 종이 Tg(MoPrP-B)2091 마우스의 뇌 RNA에서 나타났고, Dpl이 최초로 인식된 ILn/J-4 코스미드 트랜스젠의 카피-수 정렬을 갖고 있다. 상응하는 생성물은 상이 주지된 바와 같은 wt 대조군 마우스 뇌 샘플에서는 검출되지 않았다.

실시예 4

Dpl 서열의 컴퓨터 분석

SWISSPROT 및 TREMBL의 여러 가지 비-과잉 조합(A. Bairoch et al., Nucleic Acids Res. 19 Suppl:2247-9 (1991); Stoesser, et al., Biochemistry 37:7185-7193. (1998)) 서열 데이터베이스가 정렬 프로그램 FASTA_3(Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448 (1988)) 및 PSI_BLAST(S. F. Altschul et al., Nucleic Acids Res.25:3389-402(1997))를 사용하여 인간 및 마우스 Dpl의 서열로 검색되었다. Dpl 단백질은 혈연이 멀지만, 많은 PrP 서열에 대해 상당한 상동성(약 60 잔기 이상에서 24-26% 동일성)을 나타낸다(FASTA_3 스코어 E()=0.00015, 여기에서 E()는 우연한 서열 일치의 예측된 수이다; 개 PrP와의 정렬에 대해 PSI-BLAST E()=2x10(-41)).

가능한 트랜스멤브레인 세그먼트를 TopPred 2(G. von Heijne, J Mol Biol. 225:487-94 (1992)) 및 TMPred(See e.g. D. S. Millican et al., Endocr Res. 24:387-90 (1998)를 사용하여 예측했다. 인간 및 MoDop에 대한 N-말단 신호 펩티드 절단 부위를 SignalP 프로그램(H. Nielsen, Int J Neural Syst. 8:581-99(1997))을 사용하여 나타낸 위치에 있을 것으로 예측했다. 이 프로그램은 약 70%의 정확성으로 진핵 신호 펩티드를 위치시킨다. 그러나, 50%의 II-형 N-말단 트랜스멤브레인 세그먼트는 신호 펩티드로서 과-예측된다. GPI 부착 부위(w로 표시) 및 연속하는 2 잔기 위치(w+1 및 w+2)가 잔기 선호도 및 혐오도(예를 들어 위치 w에서 세린 및 아스파르트산에 대한 선호도)를 구별하며(Y. Furukawa Biochim Biophys Acta 1328:185-96 (1997); P. Harrison, 미공개 데이터)로부터 절단된 C-말단 신호 펩티드에 있는 대부분의 소수성 잔기(8-31 잔기)의 스트레치를 요구한다. 이 영역은 더 큰 친수성의 2-8 잔기 세그먼트에 의해 w+2로부터 분리된다. 2개 신호는 모두 Dpl 서열에서 발견된다. Dpl을 위한 가장 가능성 있는 GPI-앵커 부착 부위(w, w+1, w+2=G155A(G 또는 A))를 GPI 앵커에 대한 문헌의 실험으로부터 측정했고, 대표적 세트의 GPI 앵커 단백질로부터의 C-말단에 있는 Dpl과 PrP 사이의 서열 상동성을 서열 데이터베이스(P. Harrison, 미공개 데이터)로부터 발췌했다(도 2 및 도 5). w+1이 거의 큰 지방족 소수성 또는 방향족이 아니고(97%; 61/63 실시예), w+2는 거의 하전되지 않기(또는 큰 지방족 소수성 또는 방향족이 아니기)(98%; 62/63) 때문에(P. Harrison, 미공개 데이터 ), 다중 서열 정렬(w, w+1, w+2=G157LR)에 의해 시사된 GPI 앵커 부위는 있을 것 같지 않다. 이 영역에서 다른 가능한 부착 부위는 유사한 이유로 감소될 수 있으며, 단지 제안된 부위 w, w+1, w+2=G155A(G 또는 A) 만이 남아있다.

실시예 5

키메라 Prnp/PrnD mRNA

RACE 및 cDNA 클로닝과 병행하여, 유전자-탐색 프로그램 "GRAIL"를 또한 가능한 Prnd의 5' 엑손을 확인하기 위해 사용했다. I/LnJ-4 코스미드 서열의 관련 영역의 분석은 엑손 1a/1b는 검출하지 않았지만, 대신에 Prnp과 PrnD ORFs 사이의 2개의 추정 센스-스트랜드 엑손(nt 29,589-29,672; "Grail 엑손 6" 및 nt 29,798-29,832; "Grail 엑손 7")을 검출했다. "grail 엑손 6"에 위치한 프라이머를 사용하여, cDNA를 성인 야생형 마우스 뇌 RNA로부터 증폭할 수 있으며, DNA 서열화는 PrnD 엑손 2 스플라이스 어셉터로 뉴클레오티드 29,671에 있는 공통 스플라이스 도너의 스플라이싱을 확인한다(도 4).

이들 RT-PCR 분석은 새로운 5' 엑손으로서 grail 엑손 6을 정의했지만(도 4, 유전자간 엑손 2), 엑손 1a에서 보존된 서열 5'에 적절한 PrnD 프로모터를 구성한다는 것이 암시되는 PrnD 엑손 1a/1b(또는 "Grail 엑손 7")를 포함하는 cDNA를 확인하는데는 실패했다. "Grail 엑손 6"을 포함하는 PrnD mRNAs가 5' 프로모터 이상으로부터 기원할 가능성을 시험했다. Prnp 프로모터가 단지 23Kb 떨어져서 위치되고, 정확한 전사 기원에 위치되므로, 이것은 또한 PrnD 프로모터에 대한 강력한 후보이다. Prnp 엑손 2 및 PrnD 엑손 2에 있는 3' 프라이머에 위치된 5' 프라이머를사용하여, 생성물을 야생형 마우스로부터의 뇌 cDNA의 RT-PCR 분석으로 얻었다(도 4). 이들 cDNA의 서열 분석은 키메라 성질을 확인했다. 즉, 엑손 2에 있는 Prnp 전사 단위내에서 출발하고, 엑손 2a에서 시작하는 PrnD 전사 단위내에서 마친다(도 5). 어떤 cDNA Prnp 엑손 2와 PrnD 엑손 2a 사이에 삽입된 "Grail 6" 엑손을 포함하며, 이로써 뉴클레오티드 29,671에 있는 공통 스플라이스 어셉터 부위로서 이 엑손의 5' 경계를 정의했다. 다른 cDNA는 cDNA의 부속조로서 뉴클레오티드 25,482과 26004 사이에 위치한 추가의 엑손(유전자간 엑손 2)을 포함한다. 이들 2개 유전자간 엑손의 다른 사용은 다양한 키메라 mRNA를 가져온다(도 5).

고등 포유류의 염색체 유전자의 유전자간 스플라이싱에 대해서는 단지 1가지 전례만이 있으므로(Magrangeas et al., J. Biol. Chem. 273: 16005-16010 (1998)), 우리는 제 2 종에서 우리의 관찰을 확인하기로 했다. 마우스 PrnD 엑손 3의 3' 경계에 상동인 래트 Prnp 엑손 2의 서열 및 EST A1136375를 사용하여, RT-PCR 실험을 래트 조직에 대해 수행했다.

예상한 바와 같이, 유전자간 엑손의 2개 치환을 포함하는 유사한 키메라 cDNA를 뇌 및 조직에서 검출했다. 2개 유전자간 엑손이 마우스와 래트(존재하지 않음) 사이에서 불량하게 보존되고, PrnD ORF를 갖는 프레임내에서 ATG 코돈을 나타내는데 실패했으므로, 우리는 그것들이 단백질 코딩 작용을 하지 않는다고 추론한다.

실시예 6

Dpl을 발현하는 셀라인의 수립

Dpl의 활성 및/또는 세포 상호작용을 더 연구하기 위해서, , Dpl 트랜스젠을 수립된 신경 셀라인으로 트랜스펙션했다.

포유류 Dpl-발현 벡터의 제조

PrnD cDNA 카세트를 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍

DW174=5'-CGGAATTCCAGCCTTTCCCTTGCCGATTCAC-3' 및

DW175=5'-GCTCTAGAACTGGGCTACCTCTGTCTACCT-3'

을 사용한 B6-9 YAC 클론의 증폭에 의해 제조했다.

이 쌍의 5' 프라이머는 엑손 2a 스플라이스 어셉터 부위를 변경한다. 이어서 EcoR1 및 Xba로 소화시키고, 결과의 cDNA 카세트를 겔-정제하고, 포유류 발현 벡터 pcDNA3.0(Invitrogen)로 클론했다.

안정한 Dpl 셀라인의 수립

pcDNA3.0_Dpl(1-5g)을 15L LipofectAMINE 시약(Life Technologies)과 혼합된 0.1mL Opti-MEM(Life Technologies)에 가하고, 다음에 실온에서 40분간 인큐베이션했다. 10% 태아 소 혈청[FBS](Life Technologies)으로 보충된 높은 글루코스 DMEM (Life Technologies)에서 배양된 Neuro-2a 세포[N2a](ATCC)를 6cm 디쉬에서 60% 합류성으로 성장시켰다. 세포를 Hank's 밸런스 염 용액[HBBS]으로 2번 세척하고, 2mL Opti-MEM를 각 디쉬에 가했다. 지질/DNA 혼합물을 온건하게 혼합하면서 각 디쉬에 적하하고, 세포를 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션했다. 또한, 세포를 Prn 삽입이 결여된 pcDNA3.0 및 음성 대조군으로서 DNA를 함유하지 않는 Opti-MEM/지질 혼합물로 트랜스펙션했다. 다음에, 세포에 20% FBS 및 1mg/mL G418를 함유하는 1mLDMEM를 공급하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 트립신화된 세포를 10% FBS 및 1mg/mL G418를 함유하는 DMEM과 함께 10cm 플레이트에 시드했다. 개별 콜로니를 선택하고, 선택 2주 후 확장하고, 10% FBS 및 0.3mg/mL G418을 함유하는 DMEM에 보존했다.

셀라인으로부터 RNA의 제조

셀을 75cm 플라스크에서 약 80%의 합류성으로 성장시키고, 12mL HBBS로 3번 세척했다. 셀을 5mL 얼음 냉각 HBBS로 스크랩하고, 4℃에서 5분간 1,000xg로 펠렛화했다. 세포를 1mL 얼음 냉각 HBBS에 재현탁하고, RNA-미함유 마이크로퍼지 튜브 (Ambion)로 옮겨 4℃에서 1분간 14,000xg로 펠렛화했다. 펠렛을 신선하게 제조된 변성 용액(4M 구아니디늄 티오술페이트, 25mM 시트르산나트륨, pH 7.0, 0.5% Sarkosyl, 0.1M β-메르캅토에탄올) 0.6mL에 재현탁했다. 다음에 60L 2M 나트륨 아세테이트, pH 4.0, 0.6mL 산 페놀, 및 0.13mL 클로로포름:이소아밀알콜(24:1)을 가하고, 튜브의 내용물을 격렬하게 흔들어서 혼합했다. 샘플을 20분간 얼음에서 인큐베이션하고, 다음에 4℃에서 20분간 14,000rpm으로 회전시켰다. 수성상을 새로운 RNA-미함유 마이크로퍼지 튜브로 옮기고, 0.6mL 얼음 냉각 이소프로판올을 가했다. 튜브를 흔들어서 혼합하고, 1시간 동안 -20℃에서 인큐베이션했다. 다음에, 튜브를 20분간 4℃에서 14,000rpm으로 원심분리하고, 이소프로판올을 제거했다. 펠렛을 75% 에탄올로 세척하고, DEPC 처리된 ddH₂O를 사용하여 메이크업하고, 20분간 -20℃에서 인큐베이션했다. 다음에, 튜브를 20분간 4℃에서 14,000rpm으로 회전하고, 에탄올을 제거했다. 공기 건조 후, 펠렛을 30L DEPC-ddH₂O에 재현탁하고, 260nm에서 흡관도에 의해 RNA 농도를 측정하기 위해서 1L를 남기고, 샘플을 즉시 드라이아이스상에서 스넵 냉동시켜 -80℃에 저장했다.

Dpl 셀라인의 노던 블롯 분석

RNA 샘플을 얼음에서 해동하고, DEPC-ddH₂O를 사용하여 2g/L로 만들었다. 5L의 각 샘플을 분석했다. 전체 RNA를 NorthernMax 키트(Ambion)를 사용하여 포름알데히드를 함유하는 1% 아가로서 겔상에서 분류했다. 다음에, 겔을 또 NorthernMax 키트를 사용하여 Nytran-plus 멤브레인(S&S)으로 옮겼다. 400bp Dpl ORF 단편을 프라이머 DW95 및 DW96를 사용하는 PrnD cDNA 카세트의 PCR 증폭에 의해 제조하고, DECAprime II 키트(Ambion)를 사용하여 무작위 프라임화했다. 멤브레인을 ExpressHyb 용액(Clontech)을 사용하여 혼성화하고, 72시간 동안 -80℃에서 X-레이 필름에 노출했다.

실시예 7

Prnp ^0/0 마우스에서 Dpl 조절 및 운동실조성 행동

Prnp^0/0계통에서 Prnd 발현의 변경을 마우스 계통의 2개 녹-아웃 계통에서 관찰된 운동실조의 원인을 측정했다(Sakaguchi et al., Nature 380: 528-531 (1996)). 상이한 계통의 Prnp^0/0마우스로부터 제조된 PrcDNA는 반-정량 RT-PCR 분석에서 다르게 행동하는 것을 나타났다. 그 차이는 애블레이트된 대립유전자 디자인의 구조 및 PrP 결함 표현형에 상응한다. 4개 독립적으로 발생된 대립유전자의 구조를 도 6에 나타냈고, 2개의 주 부류로 맞추었다. 후발성 운동실조를 발생시키지 않는 PrP 엑손 3내에 내부 삽입/결실을 만드는 것들(Bueler et al., Nature 356:577-582 (1992); Manson et al., Mol. Neurobiol. 8:121-127 (1994))과, 엑손 3 스플라이스 어셉터 부위를 포함하여 엑손 3에서 약 1KB 영역 5'를 제외하고, 전체 PrP ORF를 제거하는 2개의 대립유전자이다. 따라서, 손상되지 않은 스플라이스 어셉터를 갖는 Zrch Prnp^0/0마우스(Bueler et al., Nature 356:577-582 (1992))는 신호를 제공하지 않으며, 애블레이트된 엑손 3 스플라이스 어셉터 부위를 갖는 Rcm 및 Ngsk 계통의 Prnp^0/0마우스는 야생형 마우스와 관련된 키메라 mRNA의 효능있는 증가를 나타냈다. 다른 프라이머 세트로 수행된 대조군 PCR 반응을 cDNA 제조물간의 사소한 차이를 배제하기 위해 사용했다.

노던 블롯 분석은 뇌에서 Dpl mRNA의 발현 수준이 운동실조를 발생시키는 2개 Prnp^0/0계통에서 극적으로 증가한다는 것을 나타냈다. 따라서, 뇌에서 PrnD mRNA의 과발현은 Ngsk 및 Rcm Prnp^0/0마우스에서 운동실조의 발생에 연관되며, Zrch Prnp^0/0마우스의 뇌에서 PrnD mRNA의 낮은 수준은 소뇌 기능장애를 수반하지 않는다. 다음 표는 이들 결과를 요약한다:

Prnp^0/0마우스 계통에서의 소뇌 운동실조 및 발현

Prnp 0/0계통	나이든 마우스에서운동실조 및 소뇌변성	Prnp비대립유전자에서 엑손 3스플라이스 어셉터의 결실	뇌에서PrnDmRNA의과발현
Zrch	부재	무	무
Npu	부재	무	ND
Ngsk	존재	유	유

Prnd의 충분한 과발현은 Ngsk 및 Rcm 계통의 Prnp^0/0마우스에서 생기며, 이것들 모두 운동실조가 발생한다. Prnd를 과발현하지 않은 Purkinje 세포가 Zrch Prnp^0/0마우스에 건강하게 남아있다는 발견이 똑같이 두드러진다. 이들 발견은 Prnd의 과발현이 Purkinje 세포에 대해 독성임을 시사한다. 키메라 mRNA의 발현이 Prnp 프로모터에 좌우되기 때문에, 이 프로모터가 Purkinje 세포에서 활성임을 주지하는 것이 흥미로우며(Nishida et al., in press), 추정 Purkinje 세포-특이적 인핸서 요소가 Prnp/Prnd 유전자간 영역에 있는 Sal I 제한 부위의 Prnp 인트론 2 또는 3' 내에 존재한다고 추론된다(Fischer et al., EMBO J. 15:1255-1264 (1996)).

실시예 8

Dpl 단백질의 예상 특징

이용가능한 Dpl 단백질 서열의 비교는 Dpl이 선택 압력하에서 작용성 유전자 생성물이라는 증거를 제공하는 매우 보존된 단백질을 밝힌다(도 7 및 도 8). 마우스 및 래트 Dpl 단백질은 90% 이상의 동일성을 공유하며, 인간 Dpl ORF를 갖는 마우스는 76% 서열 동일성을 나타낸다. 마우스와 인간 사이의 대다수의 서열 차이(94%, 32/34)는 보존성 아미노산 대체이다. Dpl과 마우스 PrP 사이의 상동성은 닭과 포유류 PrP 사이에서 관찰된 것(31-34%) 보다 약간 낮은 20 내지 24%로 추정된다(Gabriel et al., Molecular cloning and structural analysis of a candidate chicken prion protein. In prion Diseases of Humans and Animals, S. B. Prusiner, J. Collinge, J. Powell and B. Anderton, eds. (London: Ellis Horwood), pp. 407-431 (1992); Harris et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA 88:7664-7668 (1991)). 이들 모든 종으로부터의 Dpl은 그것들이 분비 경로에서 PrPC와 유사하게 합성됨을 나타내는 예상된 N-말단 신호 펩티드 절단 부위를 갖는다(도 9). PrP는 예상된 N-말단 신호 펩티드 절단 부위에 인접한 알기닌 및 리신이 풍부한 염기성 잔기의 무리를 가지며, 7개 잔기(50%)가 염기성인 잔기 25와 38 사이와 유사한 특징을 공유한다.

Dpl은 PrP에 존재하고, 생체내에서 Cu(II) 이온을 결합시킨다고 생각되는 확신하는 His/Pro/Gly 풍부 8반복 영역이 결핍된다(Brown et al., Nature 390:684-687 (1997); Stockel et al., Biochemistry 37: 7185-7193 (1998); Viles et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2042-2047). 그러나, 마우스 Dpl은 닭 PrP 코돈 103-108에 있는 PSSGGS 모티프와 매우 유사한 코돈 41-46 사이의 짧은 PSSGGQ 모티프를 갖는다. 이런 관찰의 중요성은 우리가 Dpl 또는 PrP가 원래 분자인지의 여부, 즉 Dpl이 PrP의 최근 유전자 복제로부터 생성되었는지 또는 그 반대인지의 여부를 확신할 수 없기 때문에 모호하다. 어느 한 방식으로, 이 모티프가 결실되는 퇴화반복, 또는 달리 PrP 내에 반복 구조를 형성하기 위해 증폭되는 표현형 단위를 나타내는지가 논의될 수 있다.

Dpl은 모든 공지된 PrP 서열에서 완전하게 보존된 AGAAAAGA 모티프에 상당한 상동성을 갖지며 마우스 PrP 코돈 112-119에 상응하는 영역이 결핍된다(Bamborough et al., Cold Spring Harb. Symp. Ouant. Biol. 61: 495-509 (1996); Schatzl et al., J. Mol. Biol. 245: 362-374 (1995)). PrP의 이 영역이 ER 멤브레인에 있는 PrP topology에 중요하다고 알려져 있고(Hegde et al., Science 279:827-834 (1998)), 또한 합성 PrP 펩티드 106-126이 합성 펩티드 106-126에 노출된 주요한 배양물에서 신경독성으로 알려져 있기(Forloni et al., Nature 362:543-546 (1993)) 때문에, 이런 차이는 Dpl과 PrP 간의 상당한 작용 차이를 나타낼 수 있다.

PrP는 세린 231에서 그것의 C-말단에 부착된 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커를 갖는다(Stahl et al., Cell 51:229-240 (1987)). PrP와 공통으로, Dpl은 소수성 C-말단 영역을 가지며, 우리는 이것이 GPI 앵커에 더하여 또는 단독으로 트랜스멤브레인 도메인과 양립할 수 있다고 예상한다. Dpl에 햄스터 PrP 코돈 231에 상응하는 세린 잔기가 결핍되지만, 우리는 GPI가 글리신 155에 부착될 수 있다고 예상한다. 글리신에 GPI 부착은 알파-폴레이트 리셉터에 대해 증명되었다(W. Yan and M. Ratnam, Biochemistry 34:14594-600 (1995). 토끼 PrP 서열의 시험이 토끼 PrP가 GPI 앵커되지 않았거나, 또는 세린 보다는 글리신 잔기에 의한 GPI 앵커일 수 있음을 시사하는, 잔기 231에 세린을 가지지 않는다는 것을 나타낸다는 것을 주지하는 것은 흥미롭다.

2개의 진화론적으로 관련된 단백질의 표면위의 잔기의 보존이 또한 기능적으로 중요한 요소의 유용한 표시제이다(Lichtarge et al., J. Molec. Biol. 257:342-358 (1996)). PrP는 N-x-(S 또는 T) 형태로 2개의 연속하는 N-결합 글리코실화 부위를 갖는다. MoPrP에서 헬릭스 B 상의 N181에 유사한 N-결합 글리코실화 부위는 Dpl에서 유지되지만, 헬릭스 C상의 부위는 손실된다(도 8 및 도 9). 이것이 헬릭스 B 상의 유일한 보존된 노출 잔기라는 점이 이런 복합형 글리코실화의 어떤 기능적 중요성에 대해 논의된다. 추가의 보존된 연속하는 N-결합 글리코실화 부위는 노출된 표면 루프에 있는 발견된 이 위치(MoDop N-72: NVT)의 13 잔기 아미노 말단이다. 다수의 N-글리코실화 단백질(약 23%)는 하나 이상의 글리코실화되지 않은 연속 부위를 가지고, N-글리코실화 단백질에 있는 연속하는 부위 중 단지 약 10%만이 글리코실화되지 않으며(G. von Heijne, J Mol Biol. 225:487-94 (1992)), 또한 이 부위는 글리코실화될 가능성이 있다.

GRASP 알고리듬(Nicholls et al., Proteins 11:281-296 (1991))을 사용하여 평가한 정전적 표면 전위를 Dpl 및 PrP에 대해 구분한다. PrP는 분자의 반대쪽 면위에 양 및 음으로 하전된 패치를 가지며(R. Riek, Nature 382:180-2), 이것은 멤브레인 결합에 대한 배향을 시사한다. Dpl은 PrP에서 보여진 양으로 하전된 패치를 유지하지만, 이들 영역의 경계는 동일하지 않으며, 유사한 음으로 하전된 패치가 결핍되고(데이타 나타내지 않음), 대신에 중/양으로 하전된 영역을 갖는다. 일반적으로, Dpl의 표면은 더욱 양전하를 가지고, 이 영역에서 PrP의 경우에는 형태적으로 이형성이라고는 생각되지 않는다(즉, 잔기 121-231). 이런 하전된 표면의 배치는 상호작용이 발견되는 경우, 다중화에서 어떤 역할을 하는 것으로 여겨진다. Dpl와 PrP가 공통 리셉터에 결합하기 위해 경쟁하는지의 여부가 아직 수립되어야 한다.

PrnD mRNA가 야생형 동물의 CNS에서 낮은 수준으로 발현되므로, 우리는 구성성 시토메갈로바이러스 프로모터의 제어하에 PrnD cDNA를 발현하는 트랜스펙션된 세포에 있는 Dpl 단백질에 대한 증거를 조사했다. 트랜스펙션되지 않은 N2A 세포 및 CMV/Dpl 플라스미드를 함유하고 선택성 마아커의 존재하에 성장된 안정하게 트랜스펙션된 계통을 RNA를 위해 수집하고, 이것을 노던 블롯 분석에 의해 평가했다. 1.7 및 2.8kb PrnD mRNA가 양성 대조군(고환 RNA)에서 검출되었지만, 그것들은 트랜스펙션되지 않은 N2A 세포에서는 검출할 수 없었다. 8개의 안정한 트랜스펙션 계통 중, 5개가 발현 플라스미드로부터 유도된 예상된 0.9kb MRNA의 풍부한 수준을 나타냈다.

실시예 9

웨스턴 블롯에 의한 Dpl 검출

풍부한 mRNA를 갖는 2개의 클론을 Dpl-2 합성 펩티드에 대해 지정된 항혈청을 사용하는, 웨스턴 블롯팅에 의한 추가의 분석을 위해 선택했다. 잔기 71에서 84까지에 상응하는 15 잔기 Dpl 펩티드 2 (NH-CFGAEGNRYYAANYY-COOH)(SEQ ID NO:5)를 FMOC 화학에 의해 합성하고, 자유 술포히드릴기에 의하여 KLH 활성화된 말레이미드에 콘쥬게이트했다. 토끼에 피하 접종하기 전에, 콘쥬게이트 펩티드를 RIBI와 혼합했다.

세포를 10cm 디쉬에서 대략 80% 합류성으로 성장시키고, 10mL HBBS로 3번 세척했다. 다음에, 세포를 5mL HBBS에 스크랩하고, 4℃에서 5분간 1,000xg으로 펠렛화했다. 펠렛을 0.1mL 세포 융해 완충액(20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 150mM NaCl, 0.5% 트리톤 X-100, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 1 완전한 미니 프로테아제 억제제 정제(Boehringer Mannheim))에 재현탁하고, 멸균 마이크로퍼지 튜브로 옮겨 4℃에서 10분간 흔들었다. 샘플을 4℃에서 10분간 14,000rpm에서 펠렛화하고, 상청액을 깨끗한 마이크로퍼지 튜브로 옮겼다. 단백질 농도를 제조자(Bio-Rad)에 의해 추천되 바대로 브래드포드 분석에 의해 측정했다. 샘플을 4x Laemmli 완충액에서 육성하고, -80℃에 저장했다.

2개 계통이 모두 분명한 30-36KDa의 Mr과 함께 강한 이형분산 신호를 나타냈다. 비교가능한 신호는 트랜스펙션되지 않은 세포 및 PrnD mRNA를 발현하지 않은 클론에는 없었다. 정규화된 겔-로딩을 항-Actin 항혈청으로 프로브함에 의해 확인했다. 전 길이 및 N- 및 C-말단 진행 Dpl의 예상 크기가 각각 20.4 및 14.9KDa이므로, 우리는 Dpl이 매우 글리코실화된다고 추론한다. 이 결론은 N-결합 글리코실화 부위에 대한 2개의 연속하는 부위의 존재에 일치하며, 20KDa 폴리펩티드 사슬이 탄수화물 사슬의 첨가에 의해 33-35KDa의 크기로 증가되는 PrP^C자체의 경우에 매우 필적하는 것이다.

실시예 10

PrP 트랜스젠의 과발현에 의한 Dpl 결함의 레스큐

트랜스젠 정렬에 의해 코드화된 MoPrP-A의 높은 수준의 발현에 의한 Ngsk Prnp^0/0마우스의 레스큐는 이들 마우스에서 Dpl 과발현이 높은 수준의 PrP^C(Nishida et al, in press)에 의해 극복될 수 있는지를 논한다. 야생형 MoPrP-A의 과발현에 의해 구조된 이들 Tg(P)Ngsk/Prnp ^0/0마우스에서, 트랜스젠은 Dpl ORF를 함유하지 않는 시리안 햄스터 Cos.Tet 벡터를 사용하여 구성되었다(Scott et al.,Protein Sci.1:986-997 (1992)). Tg(P)Ngsk/Prnp ^0/0마우스에서PrnDmRNA의 수준은 이 트랜스젠이 결핍된 NgskPrnp ^0/0한배새끼와 다르지 않았다. 따라서, 만약 소뇌 변성이PrnD의 과발현에 직접적으로 기인한다면, PrP의 과발현에 의한 "레스큐"는 후전사 메카니즘에 의해 진행되어야 한다: 아마도, 공통 리셉터에 대한 직접적인 물리적 상호작용 또는 경쟁에 의해, PrP^C는 Dpl의 독성 효과를 적정하여 없앤다.

본 발명이 그것의 특정 구체예와 관련하여 설명되며, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는 여러 가지 변화가 만들어지며, 동등물이 치환될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 이에 더하여, 많은 변형이 본 발명의 목적, 정신 및 범위에 대해 특정한 상황, 물질, 물질의 조성, 과정, 과정 단계 또는 단계를 적합하게 함에 의해 만들어질 수 있다. 모든 그러한 변형은 본원에 첨부된 청구항의 범위내에 있도록 의도된다.

Claims (12)

1. 분리된 doppel(Dpl) 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 Dpl 폴리펩티드.
3. 제 1 항의 Dpl 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열 또는 그것의 보체.
4. 제 3 항에 있어서, SEQ ID NO:1의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
5. 제 3 항의 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
6. 제 1 항의 핵산 서열을 함유하는 분리된 재조합 숙주 세포.
7. 내인성 Dpl 유전자 중 적어도 하나의 대립유전자가 변경된 게놈을 포함하는 트랜스제닉 동물.
8. 제 7 항에 있어서, 변경이 Dpl 유전자로부터 증진된 발현을 가져오는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
9. 제 7 항에 있어서, 동물이 적어도 하나의 내인성 PrP 대립유전자가 변경된 게놈을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 게놈이 그것에 유효하게 삽입된 유전적으로 분화한 종으로부터의 외인성 PrP 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
11. 제 1 항의 인간 Dpl 폴리펩티드를 특이적으로 결합시키는 분리된 항체.
12. 시험되는 동물로부터 샘플 조직을 얻는 단계;

    샘플로 제 7 항의 트랜스제닉 동물을 접종하는 단계; 및

    프리온 질환의 증상에 대해 트랜스제닉 동물을 관찰하는 단계

    를 포함하는, 프리온 감염성의 검출을 용이하게 하는 방법.